RELATÓRIO FINAL - CNPq

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

Departamento de Física e Química

Laboratório de Cristalografia de Proteínas

Estudos inibitórios da enzima diidroorotato desidrogenase de Trypanossoma

cruzi e Homo sapiens.

Vigência: 01/08/2010 a 31/08/2010

Relatório final

Graduanda: Renata Filtrin Pessanha

Orientadora: Maria Cristina Nonato

RIBEIRÃO PRETO

2011

1

SUMÁRIO

1. RESUMO 2

2. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 3

3. OBJETIVOS 8

4. MATERIAIS DE MÉTODOS 9 4.1 Expressão da enzima HsDHODH 9 4.2 Purificação da enzima HsDHODH 9 4.3 Ensaio de inibição enzimática da enzima HsDHODH

com potenciais inibidores 10

4.3.1 Ensaio de inibição utilizando incubação 12 4.3.2 Ensaio de inibição sem incubação 12

4.4 Cristalização da proteína HsDHODH 12 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 17

5.1 Purificação da enzima HsDHODH 17 5.2 Ensaio de inibição enzimática da enzima HsDHODH com

potenciais inibidores 17

5.3 Cristalização da proteína HsDHODH 19

6. CONCLUSÃO 21

7. DIFICULDADES ENCONTRADAS 21

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 22

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1. RESUMO

A doença de Chagas é considerada um problema de saúde pública na América

Latina. Esta infecção, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, pode ser

transmitida durante a picada do inseto vetor barbeiro, por transfusão sanguínea e por

via congênita. Segundo o site da organização mundial de saúde atualizado em junho

de 2010, estima-se que 10 milhões de pessoas no mundo inteiro estão infectadas com

o parasita, sendo a maioria latino americanos.

Recentemente, a enzima diidroorotato desidrogenase de Trypanosoma cruzi

(TcDHODH) foi validada como alvo terapêutico para o desenvolvimento de fármacos

com atividade antichagásica. A diidroorotato desidrogenase (DHODH) pertence à via

de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas e catalisa a oxidação da molécula

L-diidroorotato em orotato através de um mecanismo dependente de FMN e

receptores de elétrons.

O presente projeto visou encontrar moléculas com potenciais inibitórios da

enzima TcDHODH e realizar a validação cruzada com a enzima DHODH humana

(HsDHODH). Ao mesmo tempo, a localização de moléculas inibidoras de HsDHODH

poderia identificar diferentes classes de inibidores para a enzima humana, alvo

validado para o desenvolvimento de fármacos doenças proliferativas, como a artrite

reumatoide, e doenças como o câncer, como utilizado atualmente.

Para tanto, foram realizados experimentos de expressão, purificação, atividade

e inibição para ambas as enzimas. Antecipando um ensaio de co-cristalização da

enzima HsDHODH em complexo com potenciais ligantes, foram realizados tentativas

de cristalização da enzima visando identificar condições para cristalizar a enzima na

presença de inibidores.

3

2. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

Em 1869, a descoberta da molécula de DNA pelo médico alemão Johann

Friedrich Miescher estabeleceu um marco sobre a percepção humana em relação à

biologia. Em sua primeira publicação, em 1871, descrevia que dentro dos núcleos

celulares existia uma molécula que não pertencia nenhum tipo de proteína conhecida

até aquele momento, a qual denominou de nucleína (DAHM, 2004). Estudos

subseqüentes foram realizados para determinar a estrutura dessa nova molécula, o

que auxiliou sobremaneira a compreensão da função da nucleína, hoje denominada de

DNA e de sua hereditariedade.

Atualmente, o desenvolvimento de projetos em genômica, transcriptômica e

proteômica vêm aprimorando o conhecimento sobre o papel das macromoléculas

biológicas, o modelo do perfil de expressão protéica e a correlação entre estrutura e

função possibilitando, assim, novas maneiras de entender os processos envolvidos no

metabolismo celular.

Nesse contexto, a proteína diidroorotato desidrogenase (DHODH) codificada

pelo gene pyr4 foi identificada e teve sua função avaliada para diferentes tipos de

organismos. A enzima DHODH participa da via metabólica de biossíntese de novo de

nucleotídeos pirimidínicos (NELSON; COX, 2000), cuja cascata de reações inicia-se

com a enzima carbamil fosfato sintetase e termina com a ação da enzima orotidilato

descarboxilase (figura 1).

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Figura 1. Via de síntese de novo de nucleotídeos pirimidínicos. Figura adaptada de Nelson e Cox (2008).

Como ilustrado na figura, a enzima DHODH atua no quarto passo dessa

sequência de reações, sendo a única reação de oxidação-redução. A enzima converte

a molécula L-diidroorotato (DHO) em orotato. Durante esse processo, a DHODH utiliza

como cofator a flavina mononucleotídeo (FMN, C17H21N4O9P1), não mostrada na figura

anterior, a qual enquanto é reduzida (transformando-se em FMNH2) oxida a molécula

diidroorotato. Para que ocorra a regeneração do FMN, há um auxílio de um segundo

substrato, sendo este variável de acordo com a origem biológica do organismo

(TAKASHIMA et al, 2002).

Devido a essa diferença celular, a enzima DHODH é classificada em duas

famílias. Na primeira, a enzima é encontrada no citosol de bactérias Gram-positivas,

em fungos anaeróbicos e em eucariotos unicelulares, como o caso de Trypanossoma

cruzi. Como segundo substrato, pode ser utilizado NAD+ como aceptor de elétrons, em

caso de proteínas tetraméricas com diferentes subunidades, ou moléculas solúveis em

água como o fumarato, no caso do T. cruzi (figura 2), proteína dimérica com as duas

subunidades iguais (CHELESKI et al, 2009).

5

Figura 2. Reação de oxidação-redução catalisada pela enzima DHODH de Trypanossoma cruzi. Sendo o

fumarato (segundo substrato) o agente oxidante do FMNH2.

Já na segunda família, encontrada em bactérias Gram-negativas e eucariotos

superiores, a enzima está associada à membrana plasmática da célula ou da

mitocôndria, sendo utilizada como agente oxidante do FMNH2 uma molécula de

ubiquinona (figura 3). Para a localização nas células humanas, a proteína da segunda

família possui um domínio protéico hidrofóbico em hélice na região N-terminal para

sua inserção na membrana interna da mitocôndria (LIU et al, 1999).

Outros estudos mostraram que uma porção da proteína está exposta ao

espaço intermembranoso da mitocôndria (CHEN; JONES, 1976), como há também a

sugestão que a DHODH possui atividade na matriz mitocondrial (LÖFFLER et al

1997), como mostrado na figura 4.

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Figura 3. Reação de oxidação-redução catalisada pela enzima DHODH de Homo sapiens. Sendo a

molécula de ubiquinona (segundo substrato) o agente oxidante do FMNH2.

Figura 4. Representação da localização da enzima diidroorotato desidrogenase em mitocôndrias animais

(RAWLS et al, 2000).

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A diferença entre a diidroorotato desidrogenase humana (HsDHODH) e a

enzima de origem protozoária reflete na baixa identidade seqüencial de

aproximadamente 28% compartilhada entre as enzimas (PINHEIRO et al, 2008).

Os nucleotídeos, além das unidades básicas das moléculas de RNA e DNA, são

essenciais em várias funções metabólicas como intermediários de reações, resposta

celular aos hormônios, co-fatores enzimáticos e proliferação celular (NELSON; COX,

2000). Desse modo, a inibição da enzima DHODH leva a limitação na produção de

nucleotídeos pirimidínicos, comprometendo assim a proliferação celular.

Baseados nesse princípio, estudos recentes identificaram a enzima como alvo

terapêutico no desenvolvimento de fármacos com atividade antiproliferativa, como

Brequinar (antineoplásico), para o tratamento de psoríase (WALSE et al, 2008), contra

artrite reumatóide, como Leflunomida (ARAVA®) e antiparasitária, como Melarone®

(anti-malária) (PINHEIRO et al, 2008).

Estendendo-se os recentes estudos, está a utilização da enzima DHODH de

Trypanossoma cruzi (TcDHODH) com alvo terapêutico para o planejamento de

fármacos para o tratamento da doença de Chagas (TAKASHIMA et al, 2002). Esta

doença causada por um protozoário flagelado, chamado Trypanossoma cruzi

circulante na corrente sanguínea, foi descoberta pelo brasileiro Carlos Chagas. A

forma de transmissão mais comum da doença é através de triatomíneos hematófagos,

popularmente conhecidos como barbeiro ou bicudo. A infecção também pode ser

transmitida pela placenta, pela via oral e pela via transfusional. A doença possui duas

fases. Na fase inicial, a fase aguda, há quantidade expressiva do parasito na corrente

sanguínea, no entanto, os sinais e sintomas podem desaparecer espontaneamente,

dificultando o diagnóstico da doença, podendo evoluir a doença para fase crônica ou

para fase aguda mais grave. Já durante a fase crônica, há poucos parasitos

circulantes e pode aparecer sob forma indeterminada, cujo paciente é assintomático e

não há comprometimento do trato digestório e do trato circulatório, ou na forma

cardíaca, em que há comprometimento do coração, ou na forma digestiva, em que há

comprometimento do trato digestivo e a forma associada, na qual há acometimento

tanto do trato digestório quanto do trato circulatório são exemplos

(http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/gve_7ed_web_atual_doenca_de_chagas

.pdf).

Considerada uma doença negligenciada pela indústria farmacêutica, a

descoberta da relevância da enzima DHODDH para a viabilidade do parasita

Trypanossoma cruzi abriu, sem dúvida, uma perspectiva inovadora para a busca de

macromoléculas com atividade antichagásica.

8

No presente projeto visamos identificar novas classes de moléculas com ação

inibitória contra a enzima DHODH de T. cruzi e humana. As moléculas com ação

seletivas para a enzima do parasito serão utilizadas como protótipo para o

desenvolvimento de potenciais fármacos contra a doença de Chagas e as moléculas

com ação contra a enzima humana serão investigadas com relação ao seu mecanismo

de inibição e seu potencial uso como agentes antiproliferativos.

3. OBJETIVOS

Dada a relevância da enzima DHODH para o metabolismo celular, esta enzima,

que participa da via metabólica de novo de nucleotídeos pirimidínicos, já é alvo

validado para o planejamento de fármacos tanto para o tratamento de doenças

proliferativas, cujo alvo é a enzima humana, como também para doenças parasitárias,

caso da doença de Chagas.

Ao longo dos últimos anos o laboratório tem trabalhado no desenvolvimento de

inibidores da enzima DHODH de Trypanossoma cruzi, através de ensaio in vitro na

presença de compostos naturais e seus análogos, e in silico através da aplicação de

técnicas de docagem.

A meta, neste projeto, foi realizar estudos inibitórios para a enzima diidroorotato

desidrogenase de T. cruzi na presença de ligantes identificados por técnicas de

docagem e explorar os resultados obtidos para a enzima de T. cruzi, contra a enzima

humana.

Pretendemos assim, através dos ensaios de inibição aliado a estudos

estruturais da enzima humana, validar moléculas com ação seletiva para a enzima de

T. cruzi, assim, como, identificar novas moléculas com potencial atividade contra a

enzima humana.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

Conforme relatados no primeiro manuscrito, a primeira etapa do projeto

consistiu na realização dos ensaios de expressão, purificação e cristalização, assim

como a realização dos ensaios de inibição contra a enzima HsDHODH.

4.1 Expressão da enzima HsDHODH

A expressão da enzima foi realizada sob as mesmas condições apresentadas

no relatório anterior, o qual as amostras de estoque de glicerol foram utilizadas para

preparar pré-inóculo (com 10mL de meio LB contendo antibiótico kanamicina a

30µg/mL), que foi posteriormente utilizada para inocular com diluição 1 : 100 em 1L de

cultura. A indução da expressão da proteína é realizada com 500 µM de IPTG a 25°C

por cinco horas.

Ao término da indução, a solução é dividida em tubos de centrífuga de 50mL

cada e centrifugada a 6000g, a 4°C por quinze minutos. O sobrenadante é descartado,

enquanto que as células isoladas são armazenadas a 20°C.

4.2 Purificação da enzima HsDHODH

No processo de purificação as células são mantidas a uma temperatura

aproximada de 4°C, evitando a desnaturação da proteína. As células são

ressuspensas em um tampão de lise contendo 10 mM de Imidazol, 1% de detergente

Triton X-100, e 1 mM de inibidor de protease PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila).

Para romper a membrana plasmática das células é utilizado o método da

sonicação no Microson™ Ultrasonic Cell por quinze vezes de trinta segundos cada a

10 watts. A amostra é centrifugada por vinte minutos, 10.000g e 4°C. O sobrenadante

é usado para a purificação.

A purificação é realizada em cromatografia clássica por afinidade em coluna de

Ni-NTA agarose (Qiagen). A mesma é equilibrada com tampão 10 mM de Imidazol e

0,1% de Triton X-100. A amostra do sobrenadante é aplicada na coluna, sendo

coletado seu efluente para uma reaplicação. Nesta etapa, as caudas de histidinas

fusionadas à enzima interagem com os íons bivalentes carregados positivamente da

resina de níquel.

A proteína é eluida através da aplicação de um gradiente crescente de

imidazol.

10

A coluna é inicialmente lavada com gradiente de 10 mM, 25 mM, 50 mM e 100

mM de Imidazol, sempre contendo 0,1% de Triton X-100. Para verificar a pureza,

utiliza-se gel eletroforético SDS-PAGE em 12% de poliacrilamida corada com

Comassie Brilliant Blue.

As frações contendo a proteína de interesse são concentradas utilizando o

concentrador Ultrafree-10kDa (Millipore) e dialisadas com tampão 50 mM de Hepes,

pH 7,2 e 150 mM NaCl a 4°C.

Para a quantificação da concentração de proteína, é monitorada a presença de

FMN na proteína através do método desenvolvido pelo aluno de doutorado Ricardo

Augusto Pereira de Pádua do Laboratório de Cristalografia de Proteínas. O método se

baseia na leitura da absorvância em um leitor automático de microplacas Elx808 a

450nm. A curva de calibração original é feita em triplicata usando nove concentrações

diferentes de FMN – variando entre 1,52588 µM e 390,625 µM em poço de 300µL de

solução. A partir da curva de calibração, a quantificação do FMN é realizada através

da Lei de Lambert-Beer em que a sua concentração é diretamente proporcional a

absorvância. A concentração da proteína é estimada considerando a equivalência

estequiométrica de uma molécula de FMN para uma molécula de proteína.

4.3 Ensaio de inibição enzimática da enzima HsDHODH com potenciais

inibidores

Os ensaios de inibição enzimática foram realizados na presença de 32

compostos previamente selecionados por varredura in silico através da aplicação de

técnicas de docagem realizada pelo doutorando Matheus Pinto Pinheiro para a

inibição de diidroorotato desidrogenase de Trypanossoma cruzi.

Os ensaios de atividade na presença dos compostos foram realizados através

do monitoramento da formação de DCIPH2 a 600nm.A atividade enzimática da enzima

DHODH é avaliada de forma indireta, conforme representado na figura 5,

estequiometricamente equivalente à formação do produto da catálise. As medidas

foram realizadas usando um leitor de microplacas Elx808.

Os ensaios foram realizados de duas formas distintas. Em um primeiro, a

proteína HsDHODH foi previamente incubada com cada um dos 32 compostos

selecionados. A segunda estratégia, monitorou a capacidade inibitória dos compostos

sem prévia incubação. A atividade enzimática na presença dos inibidores também foi

realizada em quadruplicata.

11

Figura 5. Reações de oxidação-redução ocorridas durante o ensaio de atividade.

12

4.3.1 Ensaio de inibição utilizando incubação

Os primeiros ensaios de inibição foram realizados utilizando a estratégia de

incubar as moléculas com a proteína previamente aos ensaios de atividade.

As soluções de proteína (a 0,25mg/mL) foram incubadas com a as moléculas

(a 200µM) previamente diluídas em 100% de DMSO. Como controle da atividade

enzimática na ausência de ligantes, a proteína foi também incubada com

aproximadamente 5% de DMSO. Esse controle foi utilizado em quadruplicata antes e

logo após as atividades enzimáticas com os inibidores, a fim de verificar alguma perda

de atividade enzimática mesmo sem inibidor durante o experimento.

As soluções foram incubadas por 16 horas a 20ºC.

4.3.2 Ensaio de inibição sem incubação

Este ensaio preconizou utilizar as mesmas condições que o ensaio anterior,

entretanto, sem incubar a proteína com inibidores.

Para tanto, foram colocadas sob o leitor 1µL de proteína a 0,25mg/mL e uma

solução homogeneizada (preparada no mesmo momento) contendo as mesmas

condições finais do ensaio incubado, com 200µM de composto, 60µM DCIP, 100µM

coenzima Q0, 500µM DHO, 50mM Tris pH 8,15, 150mM KCl e 0,1 % Triton X-100.

Para referência, ao lugar do composto foi usado DMSO, tornando os reagentes

sob as mesmas concentrações.

A referência foi realizada também em quadruplicata antes e logo após a

realização do experimento de inibição sem incubação para garantir que qualquer

perda de atividade enzimática foi especificamente devido à presença dos ligantes.

4.4 Cristalização da proteína HsDHODH

Os ensaios de cristalização da proteína HsDHODH tiveram como objetivo o

aperfeiçoamento dos cristais já obtidos e apresentados no relatório parcial para que,

ao identificar inibidores da enzima, pudessem ser utilizadas para estudos dos

complexos proteína-ligante através de técnicas de difração de raios-X.

Os ensaios anteriores, usando kits de cristalização comerciáveis Crystal

ScreenTM e Crystal Screen 2TM (Hampton Research), PEG/Ion Screen TM (Hampton

Research) e NeXtal Tubes MBClass Suite (Qiagen), sugeriram potenciais condições

de cristalização. Nesta etapa, foram realizadas ensaios de cristalização com varredura

em um amplo intervalo de condições.

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Durante a varredura, diferentes condições foram testadas onde foram variadas:

a concentração de sais, como fosfato de sódio e cloreto de sódio (entre 0 e 0,3 M),

citrato de sódio e citrato de potássio (entre 0 e 0,5 M); a presença ou a ausência de

diferentes soluções tampões, assim como o pH tamponante (entre 5 e 8); o tipo e a

porcentagem de agente precipitante PEG 3350 (m/v), variou de 14% a 22%, ou PEG

4000 (m/v), que variou de 18% a 20%. As concentrações da proteína abrangeram

valores entre 2 e 3,75 mg/mL estimado pelo monitoramento de FMN no leitor de

microplacas Elx808 e 10mg/mL estimado pelo espectrofotômetro NanoDrop 200®.

Abaixo, algumas representações de placas de cristalização testadas (figuras 6 a 11).

5,0 5,5 6,0 \ 6,57 7,48 8,0 pH 14 % 16% 18% 20% PEG

Figura 6. Representação uma placa de cristalização contendo um intervalo de condições testadas.

Nestas condições em cada poço há dois componentes variáveis e um constante não representado. Neste

ensaio em específico, em todas as condições havia 0,2 M de citrato de sódio ou 0,2 M de citrato de lítio.

Para essas variações em cada coluna havia uma solução com p.H tamponante distinto e em cada linha

uma porcentagem diferente de PEG 3350 (m/v). Desse modo, ao final da placa, houve um teste de 24

condições.

14

0 0.1 0.2 \ 0.3 0.4 0.5 M 16 % 18% 20% 22% PEG


Nestas condições em cada poço há dois componentes variáveis. Nas colunas houve variação de

concentração de aditivo, seja ele citrato de sódio, citrato de lítio ou citrato de potássio, e nas linhas houve

variação de porcentagem de PEG 3350 (m/v). Desse modo, ao final da placa, houve um teste de 24

condições.

6,0 6,57 7,0 \ 6,0 6,57 7,0 pH 18% 20% 18% 20% PEG 2 mg/mL \ 3,5mg/mL [proteína]


Nestas condições variou-se a porcentagem de PEG 3350 (m/v), o p.H tamponante e a concentração da

proteína. Nas colunas houve variação de concentração de p.H e nas linhas variação de PEG. Em todas

as condições havia 0,3 M de citrato de lítio. Além desses intervalos, foi variado a concentração de

proteína, em que metade das condições possuíam 2mg/mL e outra metade 3,5mg/mL. Desse modo, ao

final da placa, houve um teste de 12 condições.

15

0,2 0,3 \ 0,2 0,3 \ 0,2 0,3 M C.L 16% 18% 20% 22% PEG 3,75 mg/mL \ 2,0 mg/mL \ 1,5 mg/mL [proteina] Figura 9. Representação uma placa de cristalização contendo um intervalo de condições testadas.

Nestas condições variou-se a porcentagem de PEG 3350 (m/v), a concentração de citrato de lítio e a

concentração da proteína. Nas colunas houve variação de concentração de citrato de lítio e nas linhas

variação de PEG. Além desses intervalos, foi variado a concentração de proteína em 3,75mg/mL,

2,0mg/mL e 1,5mg/mL de proteína. Desse modo, ao final da placa, houve um teste de 24 condições.

0,2 0.3 0.4 \ 0.5 0.6 0.7 M NaCl 0 0,05 0,1 0,2 M Tris


Nestas condições variou-se a concentração de Tris-HCl p.H 8,5 e a concentração de cloreto de sódio.

Nas colunas houve variação de concentração de cloreto de sódio e nas linhas variação de Tris-HCl.

Desse modo, ao final da placa, houve um teste de 24 condições.

16

0,2 0.3 0.4 \ 0.5 0.6 0.7 M NaCl 0 0,05 0,1 0,15 M


Nestas condições variou-se a concentração de fosfato de sódio p.H 7,0 e a concentração de cloreto de

sódio. Nas colunas houve variação de concentração de cloreto de sódio e nas linhas variação de fosfato

de sódio. Desse modo, ao final da placa, houve um teste de 24 condições.

Todos os ensaios foram realizados utilizando o método de difusão de vapor em

gota sentada, com 500µL de solução de cristalização no reservatório, com gotas na

proporção 2:2 e 1:2 (proteína : poço), mantidos à 22ºC.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Purificação da enzima HsDHODH

Amostras da proteína HsDHODH eluiram da coluna de Ni-NTA agarose

(Qiagen) na presença de 250 mM de imidazol e 0,1% de Triton X-100. Experimentos

em SDS-PAGE indicaram que o protocolo de purificação desenvolvido foi eficiente

para isolar a enzima de interesse com alto grau de pureza (figura 12).

Figura 12. SDS-PAGE (12% poliacrilamida). Padrão de massa molecular e perfil das eluições com 250

mM imidazol e 0,1% de Triton X-100.

5.2 Ensaio de inibição enzimática da enzima HsDHODH com potenciais

inibidores

Os ensaios de controle de atividade enzimática na presença de 5% de DMSO

indicaram que a proteína se mostra estável durante todo o tempo de realização dos

experimentos. A tabela 1 lista os resultados de inibição obtidos para os 32 compostos

testados.

66kDa

Padrão Molecular

Eluições a 250 mM de Imidazol e 0,1% de Triton X-100

97kDa

45kDa

30kDa

18

Composto Com incubação Sem incubação

Inibição Inibição

LCPSA460 24,06 ± 1,35 -29,43 ± 4,61

LCPSA407 18,18 ± 1,72 24,57 ± 6,07

LCPSA278 27,20 ± 2,37 -1,31 ± 1,42

LCPSA252 14,94 ± 2,96 -8,44 ± 2,30

LCPSA624 48,00 ± 0,88 20,98 ± 1,32

LCPSP046 45,57 ± 0,98 29,92 ± 1,06

LCPSP026 49,09 ± 0,88 -5,19 ± 2,07

LCPSP002 44,33 ± 0,89 -16,21 ± 2,36

LCPSP726 34,25 ± 2,07 26,13 ± 1,27

LCPSP028 46,15 ± 2,10 10,28 ± 1,39

LCPSP063 43,93 ± 2,86 4,60 ± 1,48

LCPSP012 -12,70 ± 6,92 -23,67 ± 1,71

LCPSP008 26,38 ± 4,05 5,65 ± 1,93

LCPIB776 40,65 ± 1,57 24,77 ± 1,85

LCPIB604 16,38 ± 3,37 -2,54 ± 1,61

LCPIB316 -13,93 ± 3,62 -1,14 ± 3,60

LCPSP3026 46,98 ± 0,79 -36,58 ± 2,76

LCPSP3027 19,74 ± 2,89 23,08 ± 1,23

LCPVL900 29,75 ± 1,02 10,54 ± 1,76

LCPVL898 35,18 ± 2,19 -82,09 ± 4,46

LCPVL480 55,38 ± 0,72 -102,74 ± 5,02

LCPVL161 47,69 ± 0,84 -12,52 ± 8,11

LCPVL682 32,85 ± 1,77 -63,21 ± 2,70

LCPVL604 35,96 ± 2,88 -8,02 ± 1,80

LCPEN490 16,09 ± 1,68 -91,33 ± 6,79

LCPEN048 17,34 ± 1,58 -115,47 ± 8,13

LCPEN166 38,41 ± 0,93 -68,47 ± 2,65

LCPEN889 17,51 ± 1,85 -50,94 ± 3,95

LCPEN355 -0,22 ± 1,63 -8,84 ± 2,48

LCPEN572 -6,48 ± 2,35 -105,68 ± 5,52

LCPEN484 23,82 ± 3,80 -65,47 ± 2,80

LCPEN352 20,30 ± 2,40 -8,06 ± 1,63

Tabela 1. Porcentagem de inibição da proteína HsDHODH na presença de diferentes compostos após

incubação e sem incubação

Os resultados apresentados indicaram que existem diferenças importantes

quando comparamos os experimentos realizados om incubação e sem incubação.

Estes resultados são compatíveis com alguns resultados observados para a enzima

TcDHODH, onde o tempo de incubação permite o ataque de moléculas pela enzima

(resultados não publicados).

19

Outro resultado importante é a obtenção de potenciais ligantes com atividade

inibitória significativa como LCPSA624, LCPSP046, LCPSP026, LCPSP002,

LCPSP028, LCPSP063, LCPSP3026, LCPVL480 e LCPVP161 que apresentaram

atividade inibitória acima de 40%.

Estudos estruturais a fim de avaliar o mecanismo de inibição da enzima serão

realizados.

5.3 Cristalização da proteína HsDHODH

Os ensaios de aperfeiçoamento dos cristais resultaram na obtenção de cristais

maiores e com menores imperfeições. As quatro melhores condições de apresentação

continham: 0,2M de citrato de lítio, 18% PEG 3350 (m/v), solução tampão Mês pH 6,57

com 3,75mg/mL de proteína em gota 2:2 (proteína : poço) (figura 13), 0,2M de citrato

de sódio, 16% PEG 3350 (m/v) com 10mg/mL de proteína em gota 1:2 (proteína :

poço) (figura 14), 0,3M de citrato de sódio, 16% PEG 3350 (m/v) com 10mg/mL de

proteína em gota 1:2 (proteína : poço) (figura 15), 0,3M de citrato de sódio, 16% PEG

3350 (m/v) com 10mg/mL de proteína em gota 2:2 (proteína : poço) (figura 16).

Durante esse processo, verificou-se que a maioria das gotas, após um grande

período de difusão de vapor, apresentou formação de gotículas, onde o cristal se

formava, enquanto que ao redor da gotícula a proteína acabava precipitando.

Provavelmente, o fato ocorria devido à presença de Triton X-100, que apesar de não

estar contido na solução de diálise, permanecia em solução junto à proteína, já que

esta possui uma cadeia hidrofóbica para inserção na membrana plasmática.

Figura 13. Cristais de HsDHODH na presença de 0,2M de citrato de lítio, 18% PEG 3350 (m/v), solução

tampão Mês pH 6,57, gota 2:2 (proteína : poço).

20

Figura 14. Cristais de HsDHODH na presença de 0,2M de citrato de sódio, 16% PEG 3350 (m/v), gota 1:2

(proteína : poço).



21



Alguns cristais foram submetidos à coleta de dados na fonte de radiação

Síncrotron no LNLS (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron), Campinas, MX-I. A

baixa qualidade no poder de difração indica a necessidade de uma melhor varredura

nas condições de cristalização. Estes ensaios já se encontram em andamento.

6. CONCLUSÃO

Durante o período de desenvolvimento do projeto (fevereiro de 2011 a julho de

2011), os trabalhos foram focados nos testes de inibição enzimática da enzima

HsDHODH e no desenvolvimento de condições de cristalização melhores para a

mesma enzima. Os compostos escolhidos para o teste de inibição foram baseados em

varredura in silico (“screening virtual”) de coleção de ligantes pelo aluno de doutorado

Matheus Pinto Pinheiro junto ao Laboratório de Cristalografia de Proteínas de Ribeirão

Preto (LCL-RP) como mencionado no projeto de pesquisa.

Os protocolos de expressão e purificação da enzima diidroorotato desidrogenase

humana continuaram a ser reproduzidos com sucesso. Os ensaios de cristalização

foram aperfeiçoados, mas a baixa qualidade dos dados de difração indicou que novas

varreduras deverão ser realizadas.

7. DIFICULDADES ENCONTRADAS

Uma dificuldade encontrada foi a conciliação do tempo para a realização do

experimento com as atividades escolares como já mencionado no relatório anterior

22

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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RELATÓRIO FINAL - CNPq