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MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM
INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é a técnica de coloração bacteriana mais difundida em Microbiologia. A
técnica foi descrita em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram, quando este procurava
uma forma de caracterizar pneumococos do tecido pulmonar de pacientes mortos de pneumonia (Barbosa &
Torres, 1999). Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes
corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas
de Grampositivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas (Ministério da Saúde, 2001).
A técnica se baseia nas diferenças estruturais existentes entre os envoltórios celulares de bactérias
Gram positivas e Gram negativas, e originalmente consistia no tratamento sucessivo de um esfregaço
bacteriano fixado por calor com os reagentes violeta genciana, lugol, álcool-acetona e fucsina (Ministério da
Saúde, 2001). No entanto, a técnica sofreu algumas modificações ao longo do tempo: o reagente violeta
genciana foi substituído por outro tipo de cristal violeta: o violeta de metila; o álcool-acetona foi substituído
por álcool etílico 95% por ser mais seguro ao manuseio e não causar hiperdescoloração caso o operador
não fosse muito habilidoso; e a fucsina foi substituída pelo corante vermelho safranina devido à sua
distância do violeta no espectro de cores, o que permite diferenciar com maior nitidez tanto as bactérias
gram positivas das bactérias gram negativa quanto diferenciar ambos os tipos bacterianos da coloração de
fundo, que assume a cor vermelho-claro (Ministério da Saúde, 2001). A figura abaixo exemplifica o processo
de coloração de Gram.
Figura 1. Exemplificação do processo de coloração de Gram (extraído de
http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com.br/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html)
A coloração de Gram depende das particularidades estruturais do envoltório das bactérias Gram
positivas e Gram negativas. A parede das bactérias Gram positivas é formada principalmente por uma
camada espessa de peptideoglicano, que consiste em uma molécula única, gigante, formando um envoltório
completo ao redor da célula bacteriana (Barbosa & Torres, 1999). A parede celular das bactérias gram
negativas tem uma composição química mais complexa, sendo formada por uma camada fina de
peptideoglicano, que está firmemente ancorado à membrana externa por lipoproteínas. Entre o
peptideoglicano e a membrana externa situa-se o espaço periplasmático, região fundamental para a
sobrevivência da célula bacteriana Gram negativa, uma vez que age como tampão osmótico e também
apresenta muitas proteínas hidrolíticas, enzimas de degradação de substancias tóxicas, proteínas
especificas de ligação de solutos e proteínas respiratórias (Barbosa & Torres, 1999). As figuras 2 e 3
ilustram as diferenças estruturais entre bactérias Gram positiva e Gram negativas.
Figura 3. Parede de bactéria gram positiva (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of
Microorganisms, 2009)
Figura 2. Parede de bactéria gram negativa (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of
Microorganisms, 2009)
O mecanismo de coloração de Gram pode ser descrito da seguinte maneira: as bactérias Gram
positivas e as bactérias Gram negativas absorvem o corante primário cristal violeta de maneira idêntica,
tornando-se roxas. Quando o lugol é aplicado, com objetivo de fixar o corante primário nas células, forma-se
um complexo insolúvel violeta-iodo (complexo iodo-pararosanilina ou CV-I) no citoplasma das células
bacterianas. A etapa de descoloração é critica para a identificação bacteriana. A lavagem com álcool etílico
95% causa a desidratação das paredes celulares das bactérias Gram positivas, o que diminui a porosidade
e a permeabilidade do peptideoglicano, fazendo com que o complexo CV-I não possa sair das células, que
permanecem roxas. Já nas bactérias Gram negativas, a lavagem com álcool 95% causa a extração dos
lipídios da membrana externa, aumentando a porosidade, o que permite que o complexo CV-I seja removido
das células. A coloração com safrarina cora apenas as bactérias que foram descoradas com o álcool.
Portanto, as bactérias Gram negativas tornam-se vermelhas por serem coradas pela safranina, enquanto
que as bactérias Gram positivas permanecem violetas por não terem sofrido descoloração na etapa de
lavagem com álcool 95% (Departamento de Microbiologia ICB/UFMG).
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização do experimento foram utilizadas 5 culturas de bactérias, sendo 4 delas contendo
espécies conhecidas, a saber: E. coli (A), S. aureus (B), B. subtilis (C) e S. mutans (D); a quinta cultura (E)
possuía composição desconhecida e era necessário realizar a identificação da espécie ou espécies contidas
na cultura através de diferenciação pelo método de Gram.
O experimento de coloração consistiu dos seguintes procedimentos, que foram realizados com
todas as culturas bacterianas:
1. Cinco lâminas foram devidamente identificadas com uma letra (A,B,C,D e E). Foi, então,
feito um esfregaço com cada cultura separadamente e cada lâmina foi fixada pelo calor;
2. Cada esfregaço foi, então, coberto com violeta genciana durante 1 min, e posteriormente
lavado com água corrente;
3. O passo seguinte consistiu-se da aplicação de lugol sobre os materiais corados, e espera
de 1 min, com posterior lavagem com água corrente;
4. Foi, então, feita a lavagem com álcool até que não mais se observasse a saída de corante;
lavaram-se as lâminas, então, com água corrente.
5. As laminas foram contra coradas com fucsina por 20 seg. e depois lavadas com água.
Foram, então, secas e observadas ao microscópio óptico.
RESULTADOS E DISCUSSAO
Os resultados encontrados para cada cultura em relação à coloração de Gram e à
morfologia das células foram os seguintes:
A: E. coli é Gram negativa e possui forma de cocos;
B: S. aureus é Gram positiva e possui forma de cocos, mas foram encontrados
alguns poucos estafilococos;
C: B. subtilis é Gram positivo e possui forma de bacilo;
D: S. mutans é Gram positivos e possui forma de cocos;
E: A cultura desconhecida é uma mistura de cocos Gram positivos e Gram
negativos;
Os resultados encontrados para as culturas A, B, C e D testadas pelo Método de Gram estavam de
acordo com a literatura (Anvisa, 2008). Na cultura E, composta por bactérias desconhecidas, foi encontrado
um mistura de bactérias Gram positivas e Gram negativas, sendo que as Gram positivas estavam em maior
número. Pela coloração apresentada e pela morfologia celular foi possível identificar as bactérias
desconhecidas como sendo E. coli (coco Gram negativo) e S. mutans (cocos Gram positivos).
Em relação à morfologia celular, o esfregaço de B subtilis e S. mutans estavam de acordo com a
literatura em relação à morfologia (Anvisa, 2008; Souza, T.M.P.A). Para as outras culturas foram
encontradas algumas discrepâncias em relação à literatura:
Para E. coli o esfregaço feito mostrou cocos Gram negativos. A literatura aponta que E. coli
possui morfologia de bacilo (Anvisa, 2008).
Para S. aureus o esfregaço mostrou cocos Gram positivos. No entanto, a literatura aponta
que a espécie possui morfologia de estafilococo (Anvisa, 2008), gênero ao qual pertence.
As discrepâncias observadas entre a morfologia encontrada e aquela apontada pela literatura se
devem principalmente à falta de habilidade na preparação dos esfregaços no caso de S. aureus, o que
rompeu os cachos, mostrando células separadas e dando, portanto, a indicação errônea da morfologia
dessa espécie. Para E. coli a identificação errônea da morfologia se deve à dificuldade de discernimento
dos bacilos, uma vez que eles são bacilos mais arredondados e podem também ser classificados como
cocobacilos (Rangel, P.M, 2007), o que pode facilmente confundi-los com cocos.
BIBLIOGRAFIA
Anvisa. Curso de Capacitação dos Laboratórios de Microbiologia dos Hospitais Sentinelas e Lacen: Identificação bioquímica e avaliação do perfil de resistência microbiana. 2007. Disponivel em <http://s.anvisa.gov.br/wps/s/r/EL> Acesso em 07 mar. 2013.
Barbosa, Heloiza Ramos; Torres, Bayardo Baptista. Microbiologia Básica. 1 edição. São Paulo:Atheneu, 2001.
Departamento de Microbiologia. Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade Federal de Minas Gerais. Material de apoio coloração diferencial de Gram. Disponível em http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=19> Acesso em 07 mar. 2013.
MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., DUNLAP, P.V., CLARK, D.P. Brock: Biology of Microorganisms. 12th. ed. Pearson: Benjamin Cummings, San Francisco, Estados Unidos, 2009. 1061 p.
Microbiologia online. Microbiologia online com foco em coloração de Gram. 2010. Disponível em http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com.br/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html Acesso em 07 mar. 2013
Ministério da Saúde. Técnicas de coloração de Gram. Brasília: 2001. Disponível em <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf> Acesso em 07 mar. 2013.
Rangel, Patrícia Merenda. PERFIL GENÉTICO E MICROBIOLÓGICO DE CEPAS DE Escherichia coli ISOLADAS DE LEITE MASTÍTICO BOVINO. Jaboticabal: UNESP, 2007. 73p. Tese (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Jaboticabal, 2007.
Souza, Tricia Murielly Pereira Andrade de. ADERÊNCIA IN VITRO DE Streptococcus mutans À SUPERFÍCIE DE DOIS TIPOS DE BRAQUETES ORTODÔNTICOS. João Pessoa: UFPA, 2007, 57 p. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Odontologia, da Universidade Federal da Paraíba em cumprimento às exigências para conclusão.