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Universidade de So Paulo
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de cana-de-acar
(Saccharum officinarum l.) tratadas com paraquat
Roberta Magalhes Chagas
Dissertao apresentada para obteno do ttulo
de Mestre emCincias. rea de Concentrao:
Fisiologia e Bioqumica de Plantas.
PIRACICABA
2007
2
Roberta Magalhes Chagas
Biloga
Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de cana-de-acar
(Saccharum officinarum L.) tratadas com paraquat
Orientadora: Profa. Dra. HELAINE CARRER
Dissertao apresentada para obteno do ttulo de
Mestre emCincias. rea de Concentrao:
Fisiologia e Bioqumica de Plantas.
PIRACICABA
2007
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP
Chagas, Roberta Magalhes Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de cana-de-acar
(Saccharum officinarum L.) tratadas com paraquat / Roberta Magalhes Chagas. - - Piracicaba, 2007.
82 p. : il.
Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2007. Bibliografia.
1. Cana-de-acar 2. Fotossntese 3. Herbicidas 4. Superxido dismutase I. Ttulo
CDD 633.61
Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor
3
Talvez possamos um dia nos arrepender do que fizemos...
Mas o arrependimento sinal de que no tivemos medo de tentar...
E da se as coisas no deram certo como deveriam...
E da se no era bem o que queramos?
E nossa vida segue... para tentarmos e errarmos muitas vezes...
Isso viver e aprender.
Oscar Wilde
4
Aos meus queridssimos pais, Jeov Filho e Vldia Magalhes
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Joaquim Albensio G. Silveira, meu mestre, no verdadeiro sentido da palavra. Sem o
seu apoio este trabalho no teria se concretizado. Obrigada pelos conselhos e contribuies
cruciais para este trabalho e para minha formao acadmica. Sempre lhe serei grata.
Profa. Dra. Helaine Carrer, pela orientao, confiana e apoio para a realizao deste trabalho,
pelas sugestes e crticas ao mesmo.
Ao Prof. Dr. Victor Vitorello, pela co-orientao e pronta disponibilizao de seu laboratrio e
casa de vegetao para desenvolvimento deste trabalho.
Ao Dr. Rafael Ribeiro, do IAC, pela inestimvel ajuda com as anlises de fluorescncia da
clorofila, bem como na anlise dos resultados obtidos.
CAPES, pela concesso da bolsa de estudo.
Aos amigos Josemir e Christine, da UFC, pelo auxlio nas atividades enzimticas.
CTC pela concesso dos toletes de cana-de-acar, e ao grupo de plantas daninhas, coordenado
pelo Prof. Christoffoletti, pela aplicao do herbicida em estudo.
Aos mestres do Programa de ps-graduao em Fisiologia e Bioqumica de plantas, pela
contribuio de conhecimentos em minha formao de mestre.
Aos colegas do Laboratrio de Biologia Molecular, em especial, ao amigo Adriano e aos demais
colegas, Carlos, Ftima, Eduardo, Valesca, Danila, Simone e Keini, pela amigvel convivncia.
Por fim, mas superiormente importante, Daniel Becker, pelo apoio incondicional e maravilhosa
companhia durante esses anos. minha avozinha, por suas oraes dirias, e meus queridos
pais, pelo suporte e afeto, mesmo distncia.
6
SUMRIO
RESUMO .......................................................................................................................... 8
ABSTRACT ............................................ ........................................................................ 9
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... 10
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... 12
ABREVIATURAS E DEFINIES ................................................................................ 13
1 INTRODUO ............................................................................................................ 14
2 REVISO BIBLIOGRFICA...................................................................................... 16
2.1 A cana-de-acar ....................................................................................................... 16
2.2 Ao do Paraquat em plantas ..................................................................................... 17
2.3 A fluorescncia da clorofila a .................................................................................... 19
2.4 O estresse oxidativo em plantas ................................................................................. 21
2.5 Algumas enzimas antoxidantes .................................................................................. 24
2.5.1 Superxido dismutase (SOD) ................................................................................. 25
2.5.2 Ascorbato Peroxidase (APX) .................................................................................. 25
2.6 Protenas induzidas sob condies de estresse .......................................................... 26
3 MATERIAIS E MTODOS......................................................................................... 28
3.1 Estratgia experimental e delineamento estatstico ................................................... 28
3.2 Material vegetal ......................................................................................................... 28
3.3 Conduo do experimento ......................................................................................... 28
3.4 Anlise da fluorescncia da clorofila a ...................................................................... 29
3.5 Concentrao de espcies reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS) ....................... 30
3.6 Contedo de clorofilas ............................................................................................... 31
3.7 Extrao e determinao das concentraes de protenas solveis e insolveis ........ 31
3.8 Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ........................... 32
3.8.1 Revelao do gel com nitrato de prata e coomassie blue ....................................... 33
3.9 Atividade de superxido dismutase ........................................................................... 34
3.9.1 Atividade de SOD por espectrofotometria ............................................................. 34
3.9.2 Atividade de SOD em gel ....................................................................................... 34
3.10 Atividade de ascorbato peroxidase .......................................................................... 35
3.11 Extrao de protenas totais para eletroforese bidimensional .................................. 35
7
3.12 Focalizao isoeltrica (IEF) e SDS-PAGE ............................................................ 38
4 RESULTADOS E DISCUSSO................................................................................... 39
4.1 Efeitos do tratamento sobre a fluorescncia da clorofila a ........................................ 39
4.2 Efeitos do tratamento sobre indicadores bioqumicos de resposta ao estresse
oxidativo......................................................................................................................
47
4.2.1 Peroxidao de lipdeos .......................................................................................... 49
4.2.2 Contedo de clorofilas totais, a e b ........................................................................ 51
4.2.3 Concentrao de protenas solveis e insolveis .................................................... 53
4.2.4 SDS-PAGE 12,5% de protenas solveis e insolveis ........................................... 55
4.2.5 Atividade da enzima Superxido Dismutase (SOD) ............................................... 56
4.2.6 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase (APX) ................................................ 60
4.3 Efeitos do tratamento sobre a expresso de protenas totais por gis 2-D ................. 61
5 CONCLUSES ............................................................................................................. 66
REFERNCIAS................................................................................................................ 67
ANEXOS ......................................................................................................................... 81
8
RESUMO
Alteraes fotossintticas e respostas oxidativas em plantas de cana-de-acar (Saccharum officinarum L.) tratadas com paraquat
Este trabalho teve como objetivo analisar os efeitos fisiolgicos do herbicida Paraquat, indutor de estresse oxidativo, em plantas de cana-de-acar (Saccharum officinarum L.). A escolha desta espcie como modelo fisiolgico deste estudo deveu-se a sua importncia econmica para o pas, em especial para o Estado de So Paulo. O Paraquat (PQ) um herbicida de contato que atua especificamente no Fotossistema II bloqueando o fluxo de eltrons e impedindo a reduo do NADPH, aceptor final de eltrons. Como consequncia, h a formao de radicais instveis, reativos com a molcula de oxignio (EROs), os quais causam danos em membranas, protenas e cidos nucleicos. A hiptese central foi a de que a atividade de peroxidase de ascorbato mais sensvel ao PQ do que a atividade de superxido dismutase, nas mesmas condies. O experimento principal consistiu da aplicao, via pulverizao foliar, de diferentes doses de PQ (0, 2, 4, 6 e 8 mM de Metil Violgeno, agente ativo), que permaneceu em contato por 24 e 48 horas. Aps 18 horas de exposio, observou-se sintomas visuais de toxocidade e uma reduo significativa da atividade fotossinttica, medida atravs de parmetros relacionados com a fluorescncia da clorofila a. O nvel de peroxidao de lipdeos, indicado pela concentrao de TBARS, foi aumentado, indicando danos nas membranas causados pela gerao de EROs. Um resultado importante foi o aumento da atividade especfica de SOD (Superxido Dismutase), primeira enzima de defesa contra EROs. Esse aumento foi gradativo com o aumento da dose e do tempo de exposio ao PQ. A isoforma mais evidente foi a SOD Cu/Zn, visualizada por atividade em gel nativo. Esta isoforma est presente preferencialmente em cloroplastos, organela alvo da ao do PQ. importante ressaltar que mesmo em doses quase letais, a atividade desta enzima manteve-se em nveis semelhantes ao controle. Entretanto, a atividade de APX (Ascorbato Peroxidase), enzima que faz a remoo de radicais H2O2, gerados pela SOD, foi reduzida abruptamnete a partir de 4 mM PQ, apesar de ter sido observado um aumento na dose inicial (2 mM). Este fato sugere que os danos oxidativos em cana-de-acar tratadas com PQ podem ser causados pelo excesso de radicais H2O2. Diferente da SOD, a APX considerada bastante susceptvel a certos tipos de estresse ambiental, logo perdendo sua atividade. Analisou-se tambm a expresso de protenas por SDS-PAGE e eletroforese 2-D. Em ambos resultados, foram observados diminuio na expresso de algumas protenas ocasionada pelo tratamento com PQ. Contudo, no foi possvel detectar claramente a induo de peptdeos nesse caso, provavelmente devido ao alto grau de degradao das estruturas celulares. O aumento da atividade de SOD em cloroplastos de folhas de cana-de-acar tratadas com PQ, deve ser mais estudado, pois esta pode ser uma enzima alvo para programas de melhoramento gentico visando obteno de plantas com resistncia ao PQ e a outros herbicidas com modo de ao no sistema fotossinttico.
Palavras-chave: Cana-de-acar; Estresse oxidativo; Paraquat; Fotossntese.
9
ABSTRACT
Changes in photosynthesis and oxidative responses in sugarcane plants (Saccharum
officinarum L.) treated with Paraquat
This work had the objective to analyze physiological effects of Paraquat herbicide, an oxidative stress inductor, in sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants. The choice to use this species as a physiological model for this study was due its recognized economical importance for our country, in special to the State of Sao Paulo. Paraquat (PQ) is a contact herbicide that acts specifically on Photosystem II by blocking the normal electron flux and the reduction reaction of NADPH, the electron acceptor molecule. As consequence, there is formation of instable radicals and highly reactive oxygen species (ROS), which cause damage to membranes, proteins and nucleic acids. The central hypothesis was that ascorbate peroxidase activity is more sensitive to PQ than the activity of superoxide dismutase in the same conditions. The main experiment consisted on the sprayed of different concentrations of PQ (0, 2, 4, 6 e 8 mM of Metil Violagen) that stayed in leaf contact for 24 and 46 hours. After 18 hours, it was observed visible symptoms of toxicity and the photosynthetic activity decreased, measured by chlorophyll a fluorescence. Also, the level of lipids peroxidation measured by the increase concentration of TBARS formation, indicate damage to cell membrane caused by the generation of ROS. An important result was the increase of SOD specific activity (superoxide dismutase) first enzyme related to defense against ROS. This gradation increase was correspondent to the exhibition period to PQ. The most evident SOD isoform by native PAGE was the SOD Cu/Zn. This isoform is located preferentially in chloroplasts, organelle target to the action of PQ. It is important to remark that even in almost lethal concentrations of PQ the chloroplast SOD activity still remains expressed beilng responsible for the removal of H O generated by SOD, which was reduced 2 2 abruptly after 4 mM treatment. Although, it has been observed increase with the initial dose (2 mM). This fact suggests that the oxidative damages in sugarcane treated with PQ can be caused by excess of H2O2. Differently of SOD, this enzyme is considered to be fragile to certain kinds of environmental adversities, loosing its activity Also the protein expression was analyzed by SDS-PAGE and 2-D electrophoresis. In both analyses, it was observed decrease of some protein expression caused by PQ. However, it was not possible to clearly detect peptides induction in this case, probably due to the elevated level of degradation of cell structures. The increase of chloroplast SOD activity in sugarcane leaves treated with PQ should be detailed investigated since it can be a molecular target for breeding programs with the goal to obtain plants with an acquired resistance to PQ or others herbicides with model action in the photochemical system.
Keywords: Sugarcane; Oxidative stress; Paraquat; Photosynthesis
10
LISTA DE FIGURAS
Pgina
Figura 1 Esquema ilustrativo da cadeia de eltrons entre os Fotossistemas II e I, no
cloroplasto e o local de ao do herbicida Paraquat .......................................
19
Figura 2 Vista parcial do stand experimental, montado em casa-de-vegetao, com as
mudas de cana-de-acar aos 30 dias aps plantio .........................................
29
Figura 3 Esquema da sequncia de extrao de protenas totais de folhas de plntulas
de cana-de-acar para corrida eletrofortica uni e bidimensional sob
condies desnaturantes ..................................................................................
37
Figura 4 A-Medidas da fluorescncia basal (Fo) e mxima (Fm) da clorofila e B-
eficincia quntica potencial do PSII..............................................................
39
Figura 5 Taxa aparente de transporte de eltrons (ETR) ............................................... 41
Figura 6 Eficincia quntica efetiva do FSII (PSII)..................................................... 43
Figura 7 A- Excesso relativo de energia no aparato fotoqumico (EXC) e B-
coeficiente de extino no fotoqumica (quenching) de energia (qN) ..........
44
Figura 8 Relao entre o coeficiente de extino no fotoqumica da fluorescncia
(qN) e o aumento do excesso relativo de energia (EXC) ................................
46
Figura 9 Aspecto visual de folhas de cana-de-aucar condio controle e tratadas com
4mM de Metil Violageno durante um perodo de 24 horas ............................
48
Figura 10 Determinao da concentrao de espcies reativas do cido
Tiobarbitrico (TBARS) .................................................................................
49
Figura 11 Determinaes do contedo de clorofilas totais (A), clorofila a (B),
clorofila b (C) e razo clorofila a/b (D) ..........................................................
51
Figura 12 Concentrao de protenas, frao solvel (A) e frao insolvel (B) .......... 53
Figura 13 Eletroforese desnaturante em mini-gel de poliacrilamida 12,5 % da frao
de protenas solveis (A e C) e insolveis (B e D) de folhas de plantas de
cana-de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil Violgeno
(Paraquat) aps 24 horas (A e B) e 48 horas (C e D) de aplicao..............
54
Figura 14 Atividade da enzima Superxido Dismutase em folhas de plantas de cana-
11
de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil Violgeno
(Paraquat) aps 24 horas e 48 horas de aplicao... ....................................
56
Figura 15 Revelao diferencial da atividade em gel nativo 12,5% da enzima
Superxido Dismutase folhas de plantas de cana-de-acar expostas a
diferentes concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 24 horas de
aplicao.......................................................................................................
57
Figura 16 Atividade em gel nativo 12,5% da enzima Superxido Dismutase folhas de
plantas de cana-de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil
Violgeno (Paraquat) aps 24 horas e 48 horas de aplicao.... .....................
58
Figura 17 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase em folhas de plantas de cana-
de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil Violgeno
(Paraquat) aps 24 horas e 48 horas de aplicao.....................................
60
Figura 18 Eletroforese bidimensional de folhas de cana-de-acar, condio controle
e condio tratada com 4mM Metil Violgeno aps perodo de 24 horas
de aplicao .................................................................................................
62
Figura 19 : Imagem do programa ImageMaster 2-D Platinum, software para anlise
das imagens obtidas por meio do escaneamento dos gis. Os pontos
vermelhos representam os spots detectados pelo programa em cada gel.....
62
Figura 20 Imagem do programa ImageMaster 2-D Platinum, mostrando uma
identificao numrica para cada spot dos respectivos tratamentos ............
63
Figura 21 Imagem do programa ImageMaster 2-D Platinum. Os pontos vermelhos
representam os spots presentes somente em um gel e os verdes so
aqueles spots comuns aos dois geis, ou seja, que foram relacionados por
meio do match, uma ferramenta de sobreposio de gis pelo programa..
64
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Relao dos spots do gel 2-D da amostra no-tratado (Controle), identificados
pelo programa ImageMaster 2-D Platinum, conforme mostrado na figura 20,
mostrando seus respctivos pontos isoeltricos (pI), massas moleculares
(MW), intensidade percentual normalizada (%Intens) e volume percentual
normalizado (%Vol) ..........................................................................................
82
Tabela 2- Relao dos spots do gel 2-D da amostra tratada com PQ 4mM, identificados
pelo programa ImageMaster 2-D Platinum, conforme mostrado na figura 20,
mostrando seus respctivos pontos isoeltricos (pI), massas moleculares
(MW), intensidade percentual normalizada (%Intens) e volume percentual
normalizado (%Vol) ..........................................................................................
83
13
LISTA DE ABREVIATURAS
APX Ascorbato Peroxidase
ATP Adenosina 5-trifosfato
CAT Catalase
CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Propane sulfonate
DNA Deoxyribonucleic acid
DTT Dithiothreitol
EROs Espcies reativas de oxignio
EST Expressed sequence tag
ETR Taxa aparente de transporte de eltrons (mol m-2 s-1)
EXC Excesso relativo de eltrons
Fm Fluorescncia mxima aps adaptao ao escuro (unid. rel.)
Fm Fluorescncia mxima na presena de luz (unid. rel.)
Fo Fluorescncia basal aps adaptao ao escuro (unid. rel.)
Fo Fluorescncia basal aps excitao do fotossistema I (unid. rel.)
Fv Fluorescncia varivel aps adaptao ao escuro (unid. rel.)
Fv/Fm Eficincia quntica potencial do fotossistema II
MF Matria fresca
NADPH Dinucleotdeo adenina fosfato nicotinamida (reduzido)
PAR Radiao fotossinteticamente ativa
PQ Paraquat
PSI/ PSII Fotossistema I /II
QA Quinona A
qN Coeficiente de extino no-fotoqumica da fluorescncia
qP Coeficiente de extino fotoqumica da fluorescncia
SDS-PAGE Sodium dodecylsulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SOD Superxido Dismutase
TBA 2-thiobarbituric acid
TCA Trichloroacetic acid
Tris Tris-hidrxiaminometano
PSII Eficincia quntica efetiva do fotossistema II
14
1 INTRODUO
A cana-de-acar (Saccharum officinarum L.), alm da significativa importncia
socioeconmica para o sistema agroindustrial do Estado de So Paulo e do Brasil, tem adquirido
considervel destaque no mbito cientfico e tecnolgico com os resultados do seqenciamento de
ESTs e da categorizao de milhares de genes (Projeto SUCEST/FAPESP), cujas funes j
esto em estudo. Alm de estudos de genmica funcional, a identificao de protenas e suas
propriedades, ou seja, a anlise protemica, um fator importante para a obteno de variedades e
hbridos com caractersticas agronmicas mais favorveis.
O uso de herbicidas em culturas comercialmente importantes como a cana-de-acar,
uma prtica bastante comum para minimizar perdas de safra por infestao de ervas daninhas.
Entretanto, o uso inadvertido ou excessivo de tais agroqumicos pode causar danos irreparveis na
cultura em questo. Dentre os compostos atualmente mais usados para este fim na cultura da cana-
de-acar, podemos citar: Velpar-K, Ametryn e o Paraquat ou Gramoxone (SINDAG, 2001).
Este ltimo em menor escala devido sua alta toxicidade para sade humana e seu rpido poder
destruidor em plantas, sendo tambm bastante difundido como um agente dessecante, facilitando a
colheita.
Um dos danos causados por determinados fatores de estresse, tanto de natureza bitica ou
abitica, a produo de radicais livres, essencialmente, as espcies reativas de oxignio (EROS).
Estes radicais so responsveis por danos, muitas vezes irreversveis, em componentes celulares,
caracterizando o chamado estresse oxidativo. O Paraquat, por exemplo, provoca a gerao de
AOS no cloroplasto e ocasiona danos estruturais em DNA, protenas, lipdios e pigmentos
(BENAVIDES et al., 2000; EKMEKCI ; TERZIOGLU, 2005). As plantas dispem de diferentes
estratgias de proteo contra os danos celulares e a possvel morte causada pelo excesso de
radicais livres.
O sistema de defesa antioxidativo enzimtico das plantas inclui diversas enzimas
antioxidantes nos diferentes compartimentos celulares. Dentre as principais enzimas podemos
citar as dismutases de superxido e as peroxidases de ascorbato, que atuam conjuntamente
removendo radicais superxidos e perxidos, respectivamente. Alm de um aparato enzimtico, a
alterao e/ou regulao de vias biossntticas de protenas constitui outra importante estratgia de
defesa.
15
Nas plantas, o Paraquat atua rapidamente, por contato, causando forte toxicidade aps
algumas horas de aplicao. Esse herbicida, pertencente ao grupo qumico dos bipiridlios, que
agem como inibidores do fotossistema I. O mecanismo de ao d-se por meio do bloqueio do
fluxo de eltrons da fotossntese, impedindo a reduo do NADP+ NADPH2. Dessa forma,
ocorre um acmulo de eltrons e de radicais txicos no cloroplasto, causando srios danos no
metabolismo celular. Esse radicais so instveis e rapidamente sofrem auto-oxidao, onde so
produzidos radicais superxidos, hidroxila, perxido e oxignio singleto. Estes, por sua vez, so
altamente reativos com os lipdeos das membranas celulares, promovendo sua peroxidao. Com
a degradao das membranas, h um vazamento do suco celular e a morte do tecido (VARGAS et
al., 1999). Portanto, a expresso induzida de protenas envolvidas com a desintoxicao desses
radicais e de outros derivados parece ser uma estratgia importante na atenuao dos efeitos
deletrios de tais produtos.
Atualmente, grande parte das pesquisas com plantas tem dedicado esforos procura e ao
desenvolvimento de novas variedades resistentes a estresses ambientais, quer seja de natureza
bitica ou abitica. No entanto, a habilidade de sobreviver em tais condies de estresse requer
mltiplas adaptaes das plantas. Tais adaptaes evolucionrias envolvem um grupo complexo
de parmetros, que ainda no foram totalmente descobertos. nesse ponto onde se ressalta a
importncia de estudos que focalizem nas respostas fisiolgicas, metablicas e moleculares das
plantas s diferentes formas de estresse. Com o avano das tcnicas bioqumicas e moleculares
nas ltimas dcadas estes estudos se intensificaram, fornecendo maiores informaes sobre a
fisiologia dos cultivares utilizados e auxiliando programas de melhoramento gentico de diversas
espcies agrcolas.
Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo analisar possveis alteraes no
metabolismo fotossinttico, bem como a expresso de enzimas relacionadas com a defesa
oxidativa em plantas de cana-de-acar tratadas com o herbicida Paraquat.
16
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 A cana-de-acar
A cana-de-acar (Saccharum sp.) uma planta pertencente ao gnero das gramneas
(Poaceae), juntamente com os gneros Zea e Sorghum. Seis espcies de Saccharum so,
atualmente, reconhecidas: S. officinarum, S. sinensi, S. barberi, S. edule, S, spontaneum e S.
robustum. O centro de origem deste gnero a regio leste da Indonsia e Nova Guin
(DANIELS; ROACH, 1987). Hoje, disseminado em todo o mundo, este gnero foi introduzido no
Brasil em 1553, e desde ento estabeleceu-se nas regies Centro-Oeste, Sudeste e Nordeste,
principalmente.
Historicamente a cana-de-acar um dos principais produtos agrcolas do Brasil,
cultivada desde a poca da colonizao. Atualmente, o Brasil o maior produtor mundial de cana-
de-acar, com uma rea plantada de 5,9 milhes de hectares. Na safra de 2004/05 foram
produzidas cerca de 415,7 milhes de toneladas, e na safra 2005/06 a produo foi de 463,8
milhes de toneladas, o que representou um crescimento de 5,1% em relo safra anterior. O
Estado de So Paulo lidera a produo do pas, onde foram produzidos 60,8% do total nacional. A
produo de lcool foi de aproximadamente 17 bilhes de litros e o acar algo ao redor de 27
milhes de toneladas (CNA, 2006).
A partir da industrializao desta cultura obtm-se produtos como: o acar, nas suas mais
variadas formas e tipos, o lcool (anidro e hidratado), o vinhoto e o bagao. A cana-de-acar ,
portanto, o principal tipo de biomassa energtica, base para todo o agronegcio sucroalcooleiro,
que, com as exportaes de acar, colaboram com o equilbrio da balana comercial. Alm disso,
o setor sucroalcooleiro, representado por 350 indstrias de acar e lcool no pas, responsvel
pela gerao de aproximadamente 1.000.000 empregos diretos e indiretos (MAPA, 2006).
Os 10 principais produtores so responsveis por 74% da produo mundial de acar, e o
Brasil ocupa um papel de liderana, tanto na produo como na exportao de acar. Esse
potencial competitivo do Brasil se deve a produtividade e rendimento industrial, pesquisas sobre
novas variedades, utilizao de novas tcnicas agrcolas e solos frteis, condies que garantem
ao pas os menores custos de produo do mundo.
O interesse no uso do etanol como combustvel tem-se revigorado ultimamente devido ao
aumento dos preos do petrleo e a necessidade de reduo de emisso de gases causadores do
17
efeito estufa. Principalmente aps a ratificao do protocolo de Kyoto, vrios pases esto
voluntariamente aderindo metas de reduo de gases, entre os quais se destacam Inglaterra,
Alemanha, Holanda, Japo. Da a importncia cada vez maior do lcool como combustvel, e o
Brasil ganha destaque nesse novo mercado j que as vantagens competitivas brasileiras do
binmio cana/acar tambm se aplicam cana/etanol.
Entretanto, um dos maiores problemas no cultivo da cana-de-acar a interferncia das
plantas daninhas que infestam campos de plantio, competindo com a cultura por luz, nutrientes,
gua e espao, provocando srias perdas na produtividade (VICTORIA FILHO;
CHRISTOFFOLETI, 2004). Alm disso, a infestao de plantas daninhas provoca um decrscimo
na longevidade do canavial, queda na qualidade industrial da matria-prima e dificuldades na
colheita e transporte da cana-de-acar (PROCPIO et al., 2003). Portanto, um manejo adequado
de ervas indesejveis nesta cultura de fundamental importncia para o setor agrcola, e este
controle realizado, principalmente, pelo uso de herbicidas. Dentre os defensivos agrcolas, os
herbicidas correspondem a 56% do volume comercializado no Brasil, sendo a cana-de-acar a
segunda cultura em consumo deste insumo no pas, ficando atrs apenas da soja (PROCPIO et
al., 2003)
Atualmente a cultura da cana-de-acar est alicerada em variedades que so hbridos
obtidos por um criterioso trabalho de seleo e melhoramento gentico entre espcies conhecidas,
obtendo caractersticas desejveis conforme regies e situaes especficas. A escolha da
variedade considerada um fator de produo e desenvolvimento tecnolgico de maior
importncia em uma usina sucroalcoleira (MATSUOKA, 2000). No presente trabalho adotou-se
como modelo experimental a variedade SP 80-3280, desenvolvida pelo Centro de Tecnologia
Canavieira (Piracicaba-SP) e amplamente comercializada como sendo uma variedade robusta,
produtiva e tolerante condies adversas de solo e clima. Tambm, esta variedade foi a
escolhida para realizao do projeto SUCEST, que disponibilizou 290 mil sequncias de DNA
desta espcie (VETTORE et al., 2001)
2.2 Ao do Paraquat em plantas
O Paraquat, cujo principio ativo o metil violgeno, um dos herbicidas mais
amplamente utilizados no mundo, aplicado no controle de ervas daninhas anuais e perenes em
uma grande variedade de culturas, incluindo cereais, oleaginosas, frutas e hortalias (SCHIMIDT
18
et al., 1994). considerado no-seletivo e de amplo espectro, o que significa que ele mata uma
ampla gama de gramneas anuais e ervas daninhas de folhas largas. importante ressaltar que o
Paraquat, pertencente famlia dos herbicidas Bipyridylium, age muito rapidamente, atingindo
diretamente o sistema fotossinttico da planta (EKMEKCI; TERZIOGLU, 2005)
O Paraquat considerado o herbicida mais txico sade humana nos ltimos 60 anos, e,
paradoxalmente, o terceiro mais usado no mundo usado rotineiramente em mais de 50 culturas
em 120 pases (CHEE et al.,1993).Tal fato pode ser atribudo ao seu custo menor quando
comparado com formulaes mais modernas e mais seletivas de outros herbicidas. Por razes de
envenenamento, o uso deste herbicida foi proibido em 13 pases, e o ltimo pas no mais us-lo
foi a Malsia em 2002.
No Brasil, dentre os compostos atualmente mais usados para o controle de ervas daninhas
na cultura da cana-de-acar esto os comerciais Velpar-K, Ametryn e Paraquat ou
Gramoxone (SMITH, 1997; SINDAG, 2001), sendo este ltimo bastante difundido, tambm,
como um agente dessecante, promovendo ressecamento e absciso de folhas, facilitando a colheita
(AGOSTINETTO et al., 2001; MAGALHES et al., 2002).
O mecanismo de ao deste herbicida d-se por meio do bloqueio do fluxo de eltrons na
cadeia transortadora da fotossntese, impedindo a reduo do NADP+ NADPH2, no fotossistema
I (Figura 1). Dessa forma, ocorre um acmulo de eltrons e de radicais txicos no cloroplasto,
causando srios danos no metabolismo celular. Esse radicais so instveis e rapidamente sofrem
auto-oxidao, onde so produzidos radicais superxidos, hidroxila, perxido e oxignio singleto,
os quais constituem as espcies reativas de oxignio, que, quando em excesso, so prejudiciais ao
metabolismo celular como um todo.
19
t
Figura 1- Esquema ilustrativo da cadeia de eltrons entre os Fotossistemao do herbicida Paraquat (www. molecadv.com)
2.3 A fluorescncia da clorofila a
Como j sabido, a captura e armazenamento de energia lum
superiores mediada por uma intricada associao entre complexos
e um transporte seqencial de eltrons do fotossistema II (PSII)
(Figura 1). A eficincia da utilizao da luz por cada fotossistema re
CO2 e gerao de ATP pelas reaes luminosas.
A energia luminosa absorvida no PSII excita as molculas d
passam para um estado instvel e rapidamente liberam parte de sua
sem a emisso de fton. Entretanto, a clorofila excitada pode
fluorescncia, reemitindo ftons e, assim, retornando ao estado basa
ser utilizada pelas reaes fotoqumicas ou ainda ser transferida
contato entre molculas de clorofilas (TAIZ; ZEIGER, 2004).
A emisso de fluorescncia fornece informaes sobre os pro
Sob condio de baixa luz, ao redor de 95% dos ftons absorvido
4,5% so transformados em calor e 0,5% so re-emitidos como l
centros de reao do PSII estiverem fechados por um bloqueio da fo
pode ser dissipada como calor e 2,5-5,0% via fluorescncia (B
OQUIST, 1993). Paraqua as II e I, no cloroplasto e o local de
inosa pelas folhas de plantas
de pigmentos captores de luz
para o fotossistema I (PSI)
gula as reaes de fixao de
e clorofilas ali presentes, que
energia ao meio como calor,
tambm perder energia por
l. Outra parte da energia pode
fracamente para o PSI, pelo
cessos fotoqumicos do PSII.
s so usados na fotoqumica,
uz fluorescente. Se todos os
tossntese, 95-97% da energia
OLHR-NORDENKAMPF;
20
A relao inversa entre fluorescncia e atividade fotossinttica foi primeiramente
observada e descrita por Kautsky e pode ser usada para estudar a atividade fotossinttica potencial
das folhas e para detectar os efeitos de estresses em plantas. Um sinal tpico de induo da
fluorescncia em luz contnua conhecido como "Efeito Kautsky", onde aps um pico ou um
mximo de fluorescncia, acontece uma atenuao (o denominado "quenching"). Normalmente a
extenso do "quenching" expressa por coeficientes que variam de 0 a 1, indicando a proporo
atenuada da fluorescncia mxima (KRAUSE ; WEIS, 1991). A fluorescncia basal ou mnima
(Fo) a fluorescncia medida quando todos os centros de reao esto abertos. A fluorescncia
mxima (Fm) a fluorescncia quando todos os centros de reao esto fechados. A fluorescncia
varivel (Fv) determinada pelo estado do centro de reao (aberto ou fechado), e definida
como a diferena entre Fm e Fo, ou seja, Fv =Fm-Fo. O estado dos centros de reao
influenciado por fatores ambientais de origem bitica e abitica.
A medida da fluorescncia das clorofilas do PSII, entretanto, muito varivel pois
extremamente influenciada pelo estado fisiolgico do vegetal, podendo, assim, ser utilizada como
tcnica para monitoramento de coberturas vegetais ou para predizer a fixao fotossinttica de
CO2 (RODRIGUES, 1998). A capacidade fotossinttica, entretanto, diminui em proporo ao
tamanho e severidade do dano sofrido pela planta. Dependendo do tipo de dano, pode haver
recuperao da capacidade fotossinttica em poucas horas ou dias ou mesmo a morte do tecido.
Em plantas sob condies de estresse, a menor eficincia fotossinttica pode ser causada
pela: 1) menor dissipao de energia atravs do transporte de eltrons, ocasionando um declnio
na eficincia quntica potencial do PSII, indicada pelo menor Fv/Fm, e taxa de transporte de
eltrons (ETR), sendo usualmente associados ao aumento na extino no-fotoqumica da
fluorescncia (qN) e no "pool" de zeaxantina (HAVAUX; NIYOGI, 1999); 2) incio dos
processos de fotoinibio quando a capacidade de fotoproteo excedida, sendo indicado pelo
declnio na relao Fv/Fm, acompanhado pelo aumento de Fo, devido reduo excessiva da
cadeia de transporte de eltrons (OSMOND, 1994).
Em situaes como descrito acima, a taxa de gerao de oxignio txico excedem a
capacidade dos mecanismos de desintoxicao do PSI (ASADA, 1994). Parte dos eltrons
envolvidos nos processos fotoqumicos so utilizados em outros processos que no a fixao de
carbono. Em condies onde a fixao de carbono limitada (ex.: baixa temperatura e fechamento
estomtico), drenos alternativos de eltrons, como a fotorrespirao, excetuando-se plantas com
21
metabolismo C4, e a reduo de oxignio molecular (durante a reao de Mehler) podem
aumentar suas atividades (FRACHEBOUD, 2001).
Segundo Krause e Weis (1991), a presena de condies ambientais estressantes levam ao
decrscimo caracterstico na eficincia quntica potencial do PSII, podendo ser detectada pela
queda na relao Fv/Fm, conforme j mencionado. Paralela queda da fotossntese devido
menor eficincia fotoqumica, pode ocorrer reduo na atividade de algumas enzimas do ciclo de
Calvin e mudanas nas rotas bioqumicas, como acmulo de aminocidos e cidos orgnicos
(WRIGHT et al., 1995).
Contudo, as plantas possuem um sistema de defesa antioxidativo composto de vrias
enzimas e biomolculas (ex: cido ascrbico, - tocoferol e carotenides) responsvel pela
remoo de radicais txicos acumulados devido alteraes metablicas, inclusive danos no
aparato fotossinttico (FOYER et al., 1994).
2.4 O estresse oxidativo em plantas
As plantas, dada sua caracterstica de seres ssseis, esto expostas a uma grande variedade
de estresses ambientais que alteram seu metabolismo e desenvolvimento, exibindo uma grande
variedade de respostas nos nveis molecular e celular (FLOWERS et al., 2000; ZHU, 2002).
Algumas dessas respostas so desencadeadas por sinais de estresse ambiental primrio, enquanto
que outras podem resultar de estresses secundrios ou de sinais secundrios. Entre os fatores de
estresse abiticos mais estudados esto: seca, alta salinidade, temperaturas extremas (tanto altas
como baixas), metais pesados, radiao ultra-violeta, deprivao de nutrientes, alta luminosidade,
defensivos qumicos e hipxia.
Ainda que algumas mudanas sejam claramente adaptativas, outras so simplesmente
conseqncias da injria causada pelo estresse (XIONG et al., 2002; ZHU, 2002). As respostas ao
estresse podem ser consideradas como desvios da norma metablica, onde a norma um estado
metablico expresso sob a condio no estressante. Nem todas as alteraes metablicas so
prejudiciais, e um grande desafio para o bioqumico distinguir entre as repostas que representam
sintomas acidentais ou injuriosos da condio estressante, e as respostas que so verdadeiramente
adaptativas, que favorecem o crescimento contnuo durante o estresse ou na recuperao.
Uma alterao metablica importante para as plantas quando em condies de estresse, o
aumento da produo de espcies reativas de oxignio (EROs) (APEL ; HIRT, 2004; FOYER ;
22
NOCTOR, 2005). A gerao de espcies reativas de oxignio constitui uma resposta primria da
planta ao estresse de natureza bitica e abitica, caracterizando um dano oxidativo (CHANDRU
et al., 2003; ASADA, 2006). Entretanto, algumas das reaes de produo de EROs esto
envolvidas no metabolismo normal do vegetal, como fotossntese e respirao (NOCTOR ;
FOYER, 1998; MITTLER, 2002; VRANOV et al., 2002).
Contudo, enquanto que em condies normais de crescimento, essas espcies qumicas
mantm-se em pequeno nvel, em condies estressantes h um rompimento da homeostase
celular, provocando o aumento na produo de EROs. Embora esse aumento seja uma ameaa
clula, essas espcies podem tambm agir como sinalizadores para a ativao da resposta ao
estresse e vias de defesa do vegetal (MITTLER, 2002; NEILL et al., 2002). Portanto, as EROs
podem ser vistas como indicadores celulares de estresse e como mensageiros secundrios
envolvidos na via de transduo de sinais na resposta ao estresse (MITTLER, 2002).
Dentre alguns dos fatores ambientais que podem gerar a produo de EROs e,
consequentemente, um estresse oxidativo nas plantas esto: as radiaes ultra-violetas, seca,
encharcamento, salinidade, temperaturas extremas, alta luminosidade, metais pesados e
defensivos agrcolas, como herbicidas (BOWLER et al., 1994; AZEVEDO et al., 1998). Alm
disso, dano fsico e mecnico, bem como o estresse bitico por ataque de patgenos podem ser
fatores geradores de EROs (LAMB ; DIXON, 1997).
As principais formas de EROs so: radical superxido (O2-), perxido de hidrognio
(H2O2), radical hidroxila (OH) e oxignio singlet (1O2). Os radicais superxido e perxido, em
geral, no so txicos, porm, quando em excesso e na presena de metais de transio, so
convertido em redicais hidroxilas altamente danosos via Reao de Fenton (CHANDRU et al.,
2003), conforme ser descrito posteriormente.
O oxignio molecular (O2) pouco reativo, mas tem capacidade de originar estados
intermedirios excitados e altamente reativos durante sua reduo at H2O (SCANDALIOS,
1993). Estas espcies reativas, quando incompletamente reduzidas podem causar danos a
organelas celulares, provocar a oxidao de molculas biolgicas como cidos nuclicos,
protenas e lipdeos, acarretando reduo no crescimento, colapso no metabolismo celular e
desencadear o processo de morte celular programada (CAVALCANTI, 2002; MITTLER, 2002;
NEILL et al., 2002). Alm de ocasionar mutaes no DNA celular (EPE, 1991)
23
As etapas subseqentes de reduo de um eltron no so dependentes de energia e podem
ocorrer espontaneamente ou necessitam de doadores apropriados de e-/H+ (eltrons/ prtons). Na
clula, ons metlicos de transio (Fe2+, Cu+) e semiquinonas podem agir como doadores de e-
(BLOKHINA et al., 2003). A aceitao do excesso de energia pela molcula de O2 pode levar
adicionalmente a formao do oxignio singlet (1O2), uma molcula altamente reativa se
comparado ao O2 (VRANOV et al., 2002; OP DEN CAMP et al., 2003). O 1O2 pode durar at
aproximadamente 4-6 s na gua e 100 s em ambientes no-polares. O oxignio singlet pode
ento transferir sua energia de excitao para outras molculas biolgicas ou reagir com elas,
formando ento endoperxidos ou hidroperxidos.
O radical superxido (O2-) um radical livre moderadamente reativo, com uma meia-vida
de aproximadamente 2-4 s. No entanto, o superxido no pode atravessar as membranas
biolgicas e prontamente dismutado a H2O2. Caso essa tal reao no acontea, o radical
superxido pode reduzir quinonas e complexos metlicos de transio de Fe3+ e Cu2+, afetando,
portanto a atividade de metalo enzimas. Os radicais hidroperoxilas (HO2-) que so formados a
partir do O2- por protonoo em solues aquosas pode atravessar as membranas biolgicas e
subtrair tomos de hidrognio de cidos graxos polinsaturados e hidroperxidos de lipdeos,
comeando ento, a auto-oxidao de lipdeos (NEILL et al., 2002).
O perxido de hidrognio (H2O2) moderadamente reativo, possui uma relativa longa vida
celular e pode atravessar distncias considerveis de seu local de produo (VRANOV et al.,
2002). O H2O2 tem capacidade de difundir-se livremente atravs das aquaporinas (HENZLER ;
STEUDLE, 2000). Dessa forma, as EROs produzidas nos cloroplastos e nas mitocndrias, por
exemplo, podem afetar outros compartimentos celulares. Tais caractersticas fazem deste radical
tambm um importante sinalizador intracelular, tendo um papel central em vrias vias de
sinalizao (como por exemplo, a da Resposta Hipersensitiva), que levam, principalmente, a
tolerncia cruzada (FOYER ; NOCTOR, 2003). Entre os processos induzidos pelo perxido de
hidrognio esto: formao de ligaes transversas na parede celular, fechamento estomtico,
expresso de genes relacionados a uma grande variedade de respostas ambientais, biognese de
peroxissomos, etc. Alm disso, o H2O2 pode tambm inativar enzimas, como as superxidos
dismutases (Cu/Zn e Fe SODs) e diversas enzimas do ciclo de Calvin (BOWLER et al., 1994),
induzir enzimas como as catalases e peroxidases, provocar danos aos cidos nuclicos e protenas
e realizar a peroxidao de lipdeos (NEILL et al., 2002).
24
A mais reativa das EROs o radical hidroxila que formado a partir do H2O2 pelas
chamadas reaes de Haber-Weiss ou de Fenton, pela utilizao de catalisadores metlicos como
o Fe2+ (HALLIWELL ; GUTTERRIDGE, 1989; CHANDRU et al.,2003). O radical OH pode
reagir potencialmente com todas as molculas biolgicas. Como as clulas no possuem
mecanismos enzimticos para eliminar essa espcie altamente reativa, a sua produo em excesso
leva, por fim, a morte da clula (VAN BRESEUGEN et al., 2001; VRANOV et al., 2002).
Apesar da possibilidade de utilizao pelas plantas do nvel de EROs para a monitorao
de seu estado intracelular de estresse, este nvel deve ser mantido sob um fino controle por causa
dos efeitos devastadores de um acmulo dessas espcies (ASADA, 1999; DAT et al., 2000;
MOLLER, 2001; MITTLER, 2002). Para que isto seja evitado as plantas possuem sistemas de
defesa antioxidantes enzimticos e no-enzimticos muito eficientes, que permitem a eliminao
dessas espcies ativas e a proteo contra os danos oxidativos. A partio entre estes dois sistemas
sob condies de estresse pode ser regulada pela concentrao de O2 no sistema (BLOKHINA et
al., 2003).
A distinta localizao subcelular e propriedades bioqumicas das enzimas antioxidantes,
seus diferentes padres de induo no nvel de enzima e expresso gnica, e a grande quantidade
de eliminadores no-enzimticos tornam o sistema antioxidante uma unidade muito flexvel e
verstil que pode controlar o acmulo e a detoxificao temporal e espacial das EROs
(VRANOV et al., 2002; DEL RIO et al., 2002). Segundo Henriques et al. (2001), a clula
apresenta algumas maneiras de proteo contra os efeitos deletrios das EROs: a preveno,
evitando a formao de radicais livres; a interceptao, por meio da ao neutralizadora de
enzimas antioxidantes, ou por molculas de baixa massa molecular, como vitaminas C e E,
carotenides, etc; e reparo, que minimizam os efeitos. Antioxidantes como o cido ascrbico
(AsA, vitamina C), glutationa (GSH), - tocoferol e carotenides ocorrem em altas concentraes
nas plantas (INZ ; MONTAGU, 1995; SLESAK et al., 2002).
2.5 Algumas enzimas antioxidantes
O sistema de defesa antioxidativo enzimtico das plantas inclui diversas enzimas
antioxidantes nos diferentes compartimentos celulares. Dentre as principais enzimas podemos
citar as dismutases de superxido (SOD; EC 1.15.1.1), as peroxidases de ascorbato (APX; EC
1.11.1.1) e as catalases (CAT; 1.11.1.6) que juntamente com outras enzimas do ciclo ascorbato-
25
glutationa promovem a eliminao das EROs (HERNNDEZ et al., 2001; CAVALCANTI et al.,
2004). O grau do estresse oxidativo em uma clula determinado pela quantidade de superxido,
H2O2 e radicais hidroxilas. Portanto, o balano das atividades da SOD, APX e CAT crucial na
supresso dos nveis txicos de EROs na clula (APEL ; HIRT, 2004). Nos ltimos anos, um
grande nmero de estudos tem focalizado no balano dessas atividades, nas diferentes organelas
celulares
2.5.1 Superxido Dismutase
Segundo Alscher e colaboradores. (2002), dentro da clula, as SODs constituem a primeira
linha de defesa contra EROs. Estas protenas pertencem ao grupo de metalo-enzimas que
protegem as clulas dos radicais superxidos, catalisando a dismutao do O2 - em O2 e H2O2
(WU et al., 1999; VAN BREUSEGEM et al., 2001). O radical O2 - produzido em qualquer
localizao intracelular onde exista um transporte de eltrons, e, portanto, a ativao do O2 pode
ocorrer em diferentes compartimentos celulares (ELSTNER, 1991), incluindo mitocndria,
cloroplastos, microssomos, glioxissomos, peroxissomos, apoplasto e no citosol. Portanto, no
surpresa o fato das SODs estarem presentes em praticamente todas as regies da clula. Alm
disso, foi provado que as membranas biolgicas so impermeveis a molculas de O2 -
carregadas, da a importncia da presena destas dismutases onde h a sua presena. As SODs so
classificadas, de acordo com o seu metal cofator, em trs grupos: FeSOD, presente nos
cloroplastos; MnSOD, presentes nas mitocndrias e peroxissomas; e as Cu/Zn-SODs, presentes
nos cloroplastos, peroxissomos, no citosol e possivelmente no espao extracelular (ALSCHER et
al., 2002; CAVALCANTI, 2002). Recentemente foi publicado a presena da isoforma FeSOD em
cloroplastos de milho (IANELLI et al., 1999). O nmero e o tipo de isoformas de SOD varivel
entre as espcies vegetais, bem como a abundncia relativa de cada isoforma. (ASADA, 1999)
2.5.2 Ascorbato Peroxidase
As APXs so consideradas as enzimas mais importantes na eliminao de H2O2 no citosol
e nos cloroplastos (INZ ; MONTAGU, 1995). Esta enzima utiliza o ascorbato como seu doador
de eltrons especficos para reduzir H2O2 a gua, constituindo parte do ciclo conhecido como
ciclo da ascorbato-glutationa ou ciclo Halliwell-Asada (INZ ; MONTAGU, 1995; SHIGEOKA
et al., 2002). De acordo com del Rio et al., (1998) e Polle (2001), este ciclo uma via eficiente de
26
clulas de planta que dispem de H2O2 em determinados compartimentos onde este metablito
produzido e no existe catalase presente, como por exemplo, no cloroplasto (MITTLER, 2002).
Este ciclo faz uso dos antioxidantes no enzimticos como o ascorbato e a glutationa em uma
srie de reaes catalisadas por quatro enzimas antioxidativas, e est bem demonstrado em
cloroplastos, citosol e mitocndrias de ndulos radiculares (FOYER; MULLINEAUX, 1994;
POLLE, 2001), e em peroxissomos e mitocndrias purificadas de folhas de ervilha (JIMNEZ et
al., 1997). As isoenzimas de APX so distribudas em pelo menos quatro compartimentos
celulares distintos: no estroma e ligadas membrana dos tilacides dos cloroplastos; ligada
membrana (mAPX) nos microcorpos, incluindo glioxissomos e peroxissomos; e no citosol
(cAPX) (SHIGEOKA et al., 2002). H ainda uma isoforma de APX ligada a membrana
mitocondrial (mitAPX) (LEONARDIS et al., 2000). Todas estas isoenzimas tm uma alta
especificidade pelo ascorbato como doador de eltrons.
2.6 Protenas induzidas sob condies de estresse
Conforme j mencionado anteriormente, uma alterao metablica importante em plantas
sob estresses a produo de espcies ativas de oxignio, que podem atuar como sinalizadores e
interagir com outras molculas desencadeando uma resposta contra o agente estressor. A ativao
de cascatas de expresso gnica, bem como a sntese de novas protenas, efetoras dessa resposta,
constituem importantes alteraes bioqumicas provocadas por um estresse
Um grande interesse vem sendo gerado na resposta das plantas ao estresse abitico,
principalmente devido s possveis aplicaes em programas de melhoramento gentico de
espcies cultivadas. Plantas transgnicas tolerantes aos mais variados estresses abiticos vm
sendo produzidas ultimamente (WANG et al., 2003). Esse sucesso vem sendo obtido pelo
aumento nos nveis celulares de protenas que controlam as quantidades de osmlitos, com
funes de transporte (H+ATPases e H+/ PPi ases) ou ativao de genes (fatores de transcrio ou
componentes de sinalizao) (ZHU, 2001).
O corrente entendimento das respostas das plantas ao estresse parece ser ainda incompleto
dado o grande nmero de genes/protenas envolvidas na percepo do estresse, transduo do
sinal e sntese de molculas efetoras que catalisam reaes para adaptao a regimes de estresse
tanto em termos de preveno ou reparo de danos. Isso extremamente importante, portanto, para
27
a obteno de informaes futuras a respeito da mudana na expresso gnica responsvel a
estresses.
A sntese de diversas protenas localizadas tanto em diferentes rgos da planta como em
diferentes locais na clula (ex: citosol, fraes de membrana, cloroplastos ou espaos
intercelulares) pode ser induzida ou reprimida por estresse ambiental, seja de natureza bitica ou
abitica. Na maioria dos casos, a funo desses polipeptdios ainda desconhecida. (YEN et al.,
1994; CHEN ; PLANT, 1999; PRZYMUSINKI et al., 2004).
Anlises genmicas em plantas tolerantes revelaram a existncia de possveis efetores que
diretamente modulam a percepo e resposta do estresse ou atenuam os seus efeitos, ou a
molculas que esto envolvidas na percepo do estresse, transduo de sinal ou modulao da
funo do efetor (ZHU, 2001; CHINNUSAMY et al., 2004). Como exemplos desses efetores da
tolerncia ao estresse esto enzimas-chave relacionadas com homeostase osmtica e remoo de
espcies ativas de oxignio (MAESTRI et al., 2002).
Apesar da lacuna existente a respeito da falta de informao no funcionamento da maioria
dos genes/proteinas de estresse, pesquisas empregando protenas de funo conhecida (choline
oxidase, P5CS - 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, BADH - betaine-aldehyde dehydrogenase,
etc) bem como aquelas com funo pouco conhecidas (LEA - late embriogenesis abundant, HSPs-
heat shock proteins, osmotin-like etc) tm fornecido uma contribuio importante no
planejamento de estratgias para melhorar a tolerncia ao estresse por meio da tecnologia dos
transgnicos. (GROVER et al., 1999). Este fato justifica a necessidade constante de identificao,
isolamento e caracterizao de um nmero crescente de protenas induzidas por estresse
ambiental.
Os trabalhos recentes sobre a importncia desses genes/protenas na concesso da
tolerncia ao estresse esto embasados em dois princpios: (a) Protenas de estresse so
sintetizadas no momento em que ocorre uma represso geral da maquinaria protica biossinttica
constitutiva e (b) Existe um nvel marcante de conservao na estrutura e outros aspectos de
genes/protenas de estresse. Conforme j discutido acima, o papel destes na tolerncia ao estresse
vem sendo experimentalmente verificado em instncias seletivas nos ltimos anos.
Visando a obteno de informaes esclarecedoras sobre os mecanismos de defesa
antioxidantes em plantas, a busca por protenas envolvidas nesse processo, bem como sua
28
identificao e funo desempenhada, ser de grande importncia, juntamente com o estudo da
expresso de genes candidatos, para a elucidao desses mecanismos.
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Estratgia experimental e delineamento estatstico
O propsito deste trabalho foi observar alteraes fisiolgicas e no padro das atividades
de enzimas antioxidantes, bem como na expresso de protenas, em folhas de plntulas de cana-
de-acar, submetidas diferentes concentraes de Praquat, cujo princpio atibo o Metil
Violgeno, e coletadas em tempos distintos. Para tanto, o delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em fatorial 5 x 3 (5 tratamentos x 3 repeties), sendo cada repetio,
composta, em mdia, de 4 plntulas (4 vasos contendo 1 kg substrato cada). Os dados foram
submetidos anlise de varincia (ANOVA) e as mdias comparadas atravs do teste de Tukey
com p 0,05.
3.2 Material Vegetal
Mudas de cana-de-acar (Saccharum officinarum L.), variedade SP 80-3280,
provenientes de toletes com gemas meristemticas, foram crescidas em substrato completo
Plantamax, da Eucatex, sob condies de casa-de-vegetao. Os toletes foram gentilmente
cedidos pelo Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), localizado em Piracicaba-SP.
3.3 Conduo do experimento
Os toletes, recm-coletados, foram colocados para germinar individualmente, em vasos de
15 cm de dimetro, durante 30 dias ou at a completa expanso do segundo par de fololos.
Durante esse perodo foi feito um monitorameno dirio de temperatura e umidade do ar, as quais
apresentaram valores mdios de 29,1 C 2,8 e 81,1 % 6,0 respectivamente. No referido
estgio de desenvolvimento (Figura 2) foi aplicado o herbicida Paraquat, via pulverizao foliar.
A aplicao foi feita com um pulverizador costal, pressurizado a CO2, com presso de 30 lb/pol2,
com consumo de 200 L/ha de calda. Foram aplicadas diferentes concentraes (0, 2, 4, 6 e 8 mM)
de Metil Violgeno.
29
Aps perodos de 24 e 48 horas de contato, as folhas foram, respectivamente, coletadas,
pesadas, congeladas em N2 lquido j na forma de p, e armazenadas em freezer -80C para
posteriores anlises.
Figura 2- Vista parcial do stand experimental, montado em casa-de-vegetao, com as mudas de cana-de-
acar aos 30 dias aps plantio
3.4 Anlise da fluorescncia da clorofila a
As avaliaes da fluorescncia da clorofila a das plantas de cana-de-acar aps 18 horas
de tratamento com Paraquat foram realizadas em fluormetro Portable Chlorophyll Fluorometer
(PAM 2000, Hinz Walz, Alemanha) equipado com uma unidade de controle de disparo de pulsos
saturantes. As anlises foram feitas seguindo a metodologia descrita por Schreiber et al. (1986) e
Genty et al. (1989), avaliando a emisso da fluorescncia da clorofila a pela superfcie superior
das folhas. Os parmetros foram obtidos em duas intensidades de PAR, mdia e alta, com
intensidades mdias de 100 e 325 mol.m-2.s-1 ftons, respectivamente. Os dados de todas as
medidas e o monitoramento contnuo durante as anlises foram analisados em planilhas e graficos
por meio do programa Excel 2003, considerando-se os resultados da mdia de trs leituras para
cada parmetro mensurado.
30
Antes do incio das anlises, as plantas foram mantidas no escuro por um perodo de 30
minutos para completa oxidao dos componentes do sistema de transporte de eltrons; a seguir,
os seguintes parmetros foram determinados: Fo, Fm, qN, PSII, Fv/Fm, EXC e ETR.
Os parmetros foram obtidos da leitura direta e calculados de acordo com as seguintes
frmulas (BILGER et al., 1995; WALZ, 1993) :
Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm
PSII = qP x Fv/Fm = qP x (Fm-Fo)/Fm
qP: Fm-Fs/Fm-Fo
qN: (Fm-Fm)/Fm
ETR= PSII *0,5*0,84 *PAR
EXC= (Fv/Fm - F/ Fm)/ Fv/Fm
em que :
Fo: fluorescncia mnima obtida com todos os centros de reao do PSII abertos enquanto a
membrana do tilacide est no estado no energizado, isto , adaptado ao escuro (qP=1 e qN=0);
Fm: fluorescncia mxima obtida quando todos os centros de reao do PSII esto fechados
(oxidados), isto , no estado adaptado ao escuro (qP=0 e qN=0);
Fv = (Fm-Fo): fluorescncia varivel mxima obtida em folhas adaptadas ao escuro;
Fs: fluorescncia no steady-state (equilbrio) (qP >0);
Fo: fluorescncia mnima obtida em folhas aps a iluminao actnica;
Fm: fluorescncia mxima obtida em folhas adaptadas luz;
Fv: fluorescncia varivel mxima obtida em folhas adaptadas luz.
qP: "quenching" fotoqumico ou atenuao fotoqumica da fotossntese;
qN: "quenching" no fotoqumico ou atenuao no-fotoqumica da fotossntese;
PSII : eficincia quntica efetiva do transporte de eltrons pelo PSII;
EXC : excesso relativo de eltrons na parte fotoqumica
3.5 Concentrao de espcies reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS)
A peroxidao de lipdios foi mensurada a partir da quantidade de malonaldedo (MDA)
do extrato de folhas, atravs de reao especfica deste, com o cido tiobarbitrico (TBA), onde,
31
na reao, foi gerado um cromforo de cor avermelhada. O mtodo utilizado foi descrito
inicialmente por Heath e Packer (1968) e adaptado por Peixoto (1998). Para a determinao, foi
reservado 1 g de tecido fresco, macerados em almofariz de porcelana, na presena de nitrognio
lquido, adicionados 2 mL da soluo de TCA a 1 % (p/v) e, em seguida, a mistura foi macerada
continuamente por mais 2 minutos. A mistura foi, ento, acondicionada em tubos tipo eppendorf
de 2 mL e centrifugada a 10.000 x g por 15 minutos. O sobrenadante foi coletado e o precipitado
descartado.
Para o ensaio, os extratos foram diludos, quando necessrio, sendo alquota de 500 L
transferidas para tubos de ensaio, aos quais foram adicionados 2 mL de reagente contendo TBA
0,5 % (p/v) dissolvido em TCA 20 % (p/v). Os tubos foram hermeticamente fechados e a mistura
de reao incubada em banho-maria a 95 C, por 1 hora, sendo resfriada, em seguida, em banho de
gelo. Quando necessrio, as amostras foram centrifugadas a temperatura ambiente (25 C) por 10
minutos a 9.000 x g, em centrfuga de bancada. As leituras foram realizadas a 25 C nas
absorbncias de 532 e 660 nm, respectivamente (esta, relativo reao no especfica). A segunda
leitura foi subtrada da primeira para obteno da leitura especfica e a quantidade do complexo
MDA-TBA formado foi calculado atravs do coeficiente de extino molar de 155 mM-1 cm-1
(HEATH; PACKER, 1968). Os resultados foram expressos em nmol g-1 MF.
3.6 Contedo de Clorofilas
A extrao do pigmento foi feita com Acetona 80%, considerando-se a seguinte
proporo: 500 mg de tecido fresco para 5 mL de soluo de Acetona 80%. Aps centrifugao
5000 x g, por 10 min, o sobrenadante foi coletado e lido em espectrofotometro a 663 e 645nm,
correspondente aos picos de absoro das clorifilas a e b, respectivamente. Para quantificar as
clorofilas a, b e total, segundo Arnon (1949), foram feitos os seguintes clculos: Clorofila a =
(12,7 x A663 - 2,69 x A645) x V/1000W; Clorofila b = (22,9 x A645 - 4,68 x A663) x V/1000W;
Clorofila total = (20,2 x A645 + 8,02 x A663) x V/1000W. Sendo, A= absorbncia dos extratos no
comprimento de onda determinado; V= volume final do extrato clorofila-acetona e W= matria
fresca em gramas do material vegetal utilizado.
3.7 Extrao e determinao das concentraes de protenas solveis e protenas
insolveis totais
32
As folhas foram maceradas em almofariz de porcelana, na presena de nitrognio lquido. Em
seguida, a uma quantidade de 1g de folhas, foi adicionado 2 mL de Acetona 80% e macerado por
mais 5 minutos. Aps centrifugao a 6000 g por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado. Ao
precipitado, adicionou-se 2,0 mL de tampo Tris 40 mM pH 7,8 contendo Manitol 350 mM,
EDTA 2 mM e PVPP3 % (p/v), macerando por mais 5 minutos. O macerado foi transferido para
Eppendorfs de 2mL e centrifugados a 10.000 g, por 20 minutos, temperatura de 4 C. O
sobrenadante, considerado a frao de protenas solveis totais, foi coletado e armazenado
temperatura de 20 C, para determinaes posteriores.
Para extrao da frao de protenas insolveis totais, o precipitado retornou para o
almofariz e foi novamente macerado com 2,0 mL de soluo de Lise contendo Uria 8M, Tiouria
1M, CHAPS 2%, DTT 50mM, por um perodo de 5 minutos. O macerado retornou, ento, para os
tubos tipo eppendorfs de 2 mL que foram centrifugados a 10000 g por 20 minutos, a 4 C. O
sobrenadante, considerado a frao de protenas insolveis totais, foi coletado e armazenado
temperatura de 20 C, para determinaes posteriores
A determinao do contedo de protenas solveis totais, na primeira frao protica, foi
realizada pelo mtodo descrito por Bradford (1976). O mtodo baseado na mudana da
colorao do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250 quando ligado a protenas. Os extratos
congelados foram lentamente descongelados em banho de gelo (4 C). As amostras foram
diludas no prprio tampo de extrao, na proporo de 1:10 (v/v). Alquotas de 100 L do
extrato diludo foram transferidas para tubos de ensaio e 2 mL do reagente de Bradford (105,26
mg de Coomassie brilliant blue G-250 + 50 mL de etanol 95 % + 100 mL c. fosfrico orto-
xaroposo 85 % + q.s.p. H2O p/ 1000 mL) foram adicionados ao meio de reao.
Aps leve agitao, os tubos foram incubados a 25 C por 15 minutos e ento realizada
leitura da reao a 595 nm em espectrofotmetro. A concentrao de protenas totais foi obtida
pela comparao das leituras, com as obtidas em curva padro onde a protena utilizada foi a
Albumina Srica Bovina. A concentrao de protenas solveis foi expressa em mg de protena g-1
MF.
3.8 Eletroforese desnaturante de protenas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A eletroforese das amostras foi realizada segundo metodologia desenvolvida por Laemmli
(1970), com modificaes. O mtodo se sustenta na idia de que as protenas podem ser separadas
33
pela massa molecular, atravs da induo do deslocamento pela aplicao de um campo eltrico
(LEHNINGER et al., 1995). A preparao do gel e a corrida eletrofortica foram conduzidas no
sistema MiniVE (Amersham Biosciences), com placas de 8 cm x 9 cm e espaadores com 1,0 mm
de espessura. O gel de aplicao foi preparado com 5,0 % de acrilamida (p/v) em tampo tris-HCl
0,5 M, pH 6,8, contendo SDS 0,1 % (p/v) e polimerizado com 0,15 % de persulfato de amnio
(p/v) e TEMED 0,1 % (v/v). O gel de separao foi preparado com 12,5 % de acrilamida (p/v) em
tampo tris-HCl 3,0 M, pH 8,8, contendo SDS 0,1 % (p/v), sendo polimerizado com persulfato de
amnio 0,15 % (p/v) e TEMED 0,05 % (v/v).
A concentrao de protenas totais nos extratos foi determinada segundo o mtodo de
Bradford (1976), obedecendo aos mesmos procedimentos descritos no
item de determinao da concentrao de protenas solveis totais (item 3.7). O extrato total das
amostras foi diludo no tampo de lise de modo que, ao final da diluio, todos os extratos
tivessem a mesma razo mg de protena mL-1. As amostras foram preparadas para corrida
adicionando azul de bromofenol a 0,4 % (p/v) em alquota retirada da diluio do extrato bruto. A
corrida foi realizada com amperagem constante de 20 mA para cada gel, e transcorreu por um
perodo de aproximadamente1 hora.
3.8.1 Revelao do gel com Nitrato de Prata e Comassie blue
As bandas proticas foram visualizadas pela revelao do gel com nitrato de prata,
segundo metodologia descrita por Blum et al. (1987). O mtodo tem por objetivo impregnar as
protenas localizadas na superfcie do gel, com ons prata fornecidos pelo nitrato de prata. Depois
da corrida, o gel foi retirado cuidadosamente da placa de vidro e mergulhado em soluo de etanol
40 % (v/v) e cido actico 10 % (v/v) para fixao da posio das protenas no gel. Em seguida,
foi lavado em soluo de etanol a 30 % (v/v), por 2 ciclos de 20 minutos, e tratado com tiossulfato
de sdio 0,02 % (p/v), por 1 minuto. O gel foi ento enxaguado em H2O deionizada, por 3 ciclos
de 20 segundos, e impregnado com soluo de nitrato de prata 0,2 % (p/v) e formaldedo 0,02 %
(v/v), por 20 minutos. Aps visualizao das bandas, o gel foi lavado com H2O deionizada, por 20
segundos, e a reao interrompida pelo tratamento do gel com soluo de glicina a 0,5 % (p/v),
durante 5 minutos, e mais 3 ciclos de 20 minutos de lavagem em H2O deionizada.
A revelao dos gis tambm foi feita por meio de uma soluo corante (Coomassie Brilliant
Blue R-250 0,025%, contendo Metanol 40% e cido Actico 7%). Aps corrida eletrofortica, os
34
gis foram imersos na soluo de corante por, no mnimo, 2 horas. Em seguida, foram tranferidos
para uma soluo descorante (Metanol 50% e cido Actico 25% em gua). Aps um perodo de
20 minutos sob agitao branda, a soluo descorante foi trocada e assim sucessivamente at a
descolorao completa do gel e visualizao ntida das bandas.
3.9 Atividade de superxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1)
3.9.1 Atividade de SOD por espectrofotometria
Esta atividade enzimtica foi determinada segundo metodologia adaptada de Peixoto
(1999) a partir de Del Longo et al. (1993) e Gianopolitis e Ries (1977). Por esse mtodo,
determinada a inibio da reduo do NBT (p-nitro blue tetrazolium) pelo extrato enzimtico,
evitando assim a formao do cromforo. Neste ensaio, uma unidade de atividade enzimtica
(UA) de SOD, considerada como a quantidade de enzima necessria para obter 50 % de inibio
da reduo do NBT pela SOD contida no extrato enzimtico.
As amostras utilizadas foram as mesmas para determinao do teor de protenas solveis
totais (item 3.7). Para tanto, os extratos foram lentamente descongelados em banho de gelo (4
C) e aps liquefao, diludos (conforme necessidade) no prprio tampo de extrao. Alquotas
de 100 L foram transferidas para tubos de ensaios protegidos da luz, contendo tampo fosfato de
potssio 50 mM, pH 7,8, EDTA 0,1 Mm, L-metionina 13 mM e NBT 75 M.
A reao foi iniciada pela adio de Riboflavina 2 M e a concomitante transferncia dos
tubos para uma cmara iluminada, por uma lmpada fluorescente circular de 30 Watts, por
perodo de 15 minutos. Em seguida, leituras de absorbncia a 560 nm foram tomadas em
espectrofotmetro (Spectronic 20 Genesys). Para efeito de correo nos clculos, o branco da
reao foi considerado como sendo os tubos que no continham extrato, expostos e no expostos
luz. A atividade foi determinada pelo clculo da quantidade de extrato que inibiu 50 % da reduo
de NBT (BEAUCHAMP ; FRIDOVICH, 1971) e expressa em UA g-1 MF min-1.
3.9.2 Atividade de SOD em gel
A atividade das diferentes isoformas de SOD em gel foi realizada por meio de uma corrida
eletrofortica de protenas em gel nativo e, em seguida, os gis foram revelados com inibidores
especficos de cada isoforma da enzima. Aps a corrida, os gis foram lavados em gua
35
deionizada e incubados numa soluo de Fosfato de Potssio 50mM, pH 7,8 + EDTA 1mM +
Riboflavina 0,05 mM + NBT 0,1mM, por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aps
lavagem com gua, um deles foi incubado por 20 minutos com uma soluo-tampo de Fosfato de
Potssio 100mM, pH 7,8 + KCN 2mM. O segundo gel foi incubado com a mesma soluo-tampo
contendo H2O2 5mM. O terceiro gel, que serviu de controle para a comparao, permaneceu em
gua deionizada. Os gis foram ento iluminados por 5 minutos ou at o aparecimento das bandas.
A FeSOD de cloroplastos inativada por H2O2 e resistente a Cianeto de potssio. A MnSOD,
presente em mitocndrias e peroxissomos, no inativada por H2O2 nem inibida por cianeto de
potssio. As Cu-ZnSODs so inativadas por cianeto e perxido de hidrognio e esto presentes
nos cloroplastos e no citosol (ALSCHER et al., 2002).
3.10 Atividade de peroxidases de ascorbato (APX) (EC 1.11.1.11)
A atividade de APX foi determinada de acordo com o mtodo de Nakano e Asada (1981),
modificado por Koshiba (1993), onde a presena de APX no extrato bruto diminui a concentrao
de perxido de hidrognio do meio, pela reduo do cido ascrbico fornecido. Para tanto, o
primeiro extrato obtido no item 3.7 foi utilizado. Diluies das amostras foram feitas quando
necessrio e alquotas de 100 L dos extratos diludos, transferidas para tubos de ensaio. Ao meio
de reao, 2,7 mL de tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 6,0, contendo cido L-ascrbico 0,8
mM. foram adicionados.
O experimento foi iniciado pela adio de H2O2 ao meio de reao, observando o
decrscimo da leitura no intervalo de 60 segundos, absorbncia de 290 nm em
espectrofotmetro modelo Pharmacia LKB Ultrospec III. Adicionalmente, leituras de tubos
controles, com e sem a amostra, na ausncia de perxido de hidrognio, foram realizadas. Para
efeito de clculo, foi considerado que o decrscimo de 1 unidade de absorbncia seria equivalente
a 1 unidade de atividade (UA). As atividades do extrato total foram determinadas pelo clculo da
quantidade de extrato que reduziu a leitura de absorbncia em 1 UA e expressos em UA g-1 MF
min-1.
3.11 Extrao de protenas totais para eletroforese bidimensional (2-D)
O extrato de protenas totais, para corrida eletrofortica, foi obtido seguindo metodologia
adaptada de Rabilloud (1996) e Molloy (1998). Da matria fresca de folhas congeladas, 500 mg
36
de uma amostragem composta de cada tratamento, foram macerados em almofariz de porcelana,
na presena de nitrognio lquido, por 5 minutos. Em seguida, 5 mL de uma soluo contendo
TCA 10 % (p/v), DTT 0,07 %(p/v) em acetona P.A. foram adicionados. As amostras foram
deixadas em repouso para precipitao natural, a 20 C, por 2 horas, e, em seguida, centrifugadas
a 30.000 x g a 4 C, por 40 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado duas
vezes com uma soluo contendo DTT 0,07 % (p/v) dissolvido em acetona P.A., por 30 minutos,
a 20 C. A mistura foi novamente centrifugada a 30.000 x g, por 10 minutos e o sobrenadante
descartado. Aps essa etapa, o precipitado foi ressuspendido em 3 mL de tampo de lise contendo
uria 7 M, tiouria 2 M, tris 40 mM, DTT 24 mM e CHAPS 0,1 %(p/v) e, novamente, as amostras
foram centrifugadas a 15.000 x g, a 4C, por 15 minutos. Desta vez, o sobrenadante foi coletado
(frao protica) e o precipitado, descartado (Figura 3).
37
MF folhas
TCA 10 % (p/v), DTT 0,07 %(p/v) em Acetona.
Precipitao natural por 2h, -20 C
Centrifugao a 30.000 x g, 40, 4C
Sobrenadante Descartado
Precipitado Sobrenadante Descartado
Lavagem (2x) com soluo 0,07%
DTT em Acetona, a -20C
Centrifugao a 30.000 x g, 10
minutos, 4C
Precipitado Descartado
Sobrenadante
SDS-PAGE e 2D
Ressuspenso em soluo 7 M uria/ 2 M
tiouria/ 40 mM tris/ 24 mM DTT /0,1 %
CHAPS (p/v)
Centrifugaos a 15.000 x g, 4C, 15 minutos
Precipitado
Figura 3- Esquema da sequncia de extrao de protenas totais de folhas de plntulas de cana-de-acar para
corrida eletrofortica uni e bidimensional sob condies desnaturantes
38
3.12 Focalizao isoeltrica (IEF) e SDS-PAGE As amostras de protenas extradas conforme a descrio anterior (~ 400 g) foram
homogeneizadas com 450 l de tampo de re-hidratao de gel (8M Ureia/ 1M Tioureia/ 10%
Glicerol/ 2% CHAPS/ 1% IPG Buffer pH 3-10/ 25mM DTT/ 0,001% Azul de bromofenol). As
amostras foram transferidas para Strip Holders e as tiras de focalizao (Imobiline dry strips
18cm, pH 3-10 NL) colocadas sobre os mesmos. Logo em seguida leo de silicone (IPG cover
fluid) foi despejado sobre ambos. A hidratao das tiras ocorreu durante 12-15h em sistema Ettan
IPGphor II (Amersham Biosciences), seguindo com a focalizao isoeltrica, a 20 C, em corrente
mxima de 50 A/gel, voltagem mxima de 8000 V e potncia
mxima de 0,2 W/gel. De acordo com Gorg et al (1988), os parmetros para IEF usando tiras de
18cm e pH 3-10 foram 500Vh; 1000Vh; 2000Vh; 3000Vh; 3500V (5h) ~ 24kVh.
Em seguida, as tiras de gis contendo as protenas focalizadas foram incubadas em soluo
de equilbrio (50 mM Tris, pH 8,8, 6M Ureia, 30% v/v Glicerol, 2% SDS e traos de Azul de
bromofenol) contendo 10 mg/mL de DTT, por 15 min, a 20C, e depois em soluo de equilbrio
contendo 25 mg/mL de iodoacetamida, por 15 min a 20C. Uma vez processada a segunda
incubao, as tiras foram posicionadas no topo de gis SDS-PAGE 12,5% para realizao da
segunda dimenso. A corrida foi realizada em sistema vertical (BioRad) seguido os seguintes
parmetros de corrida: 25mA/gel; Emax 250 V e Pmax 25 W. A durao da corrida foi de
aproximadamente 5 horas. Em seguida os gis foram revelados em soluo de Coomassie Blue,
conforme descrito no item 3.8.1.
39
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Efeitos do tratamento sobre a fluorescncia da clorofila a
As medidas de fluorescncia da clorofila so rpidamente obtidas e processadas, alm de
serem bastante precisas e no-destrutivas. Atualmente a principal ferramenta para anlise da
performance fotossinttica da planta e seu estado fisiolgico geral (SCHREIBER et al., 1998).
Fo X Fm A
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0 2 4 6 8Metil Violgeno (mM)
Fo
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Fm
Fo
Fm
Fv / Fm B
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 2 4 6 8Metil Violgeno (mM)
Fv/F
m
Figura 4- A-Medidas da fluorescncia basal (Fo) e mxima (Fm) da clorofila e B- eficincia quntica
potencial do PSII em plantas de cana-de-acar expostas a diferentes concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 18 horas de aplicao
Os resultados expostos na Figura 4A indicam um discreto aumento na fluorescncia basal
(Fo) seguido de uma queda na fluorescncia mxima, em especial na dose de 4mM Metil
Violgeno. O mesmo ocorreu com a eficincia quntica mxima do fotossistema II (Fv/Fm), ou
seja, uma drstica queda a partir da dose de 4mM Metil Violgeno (Figura 4B). Decrscimos de
Fv/Fm e da fluorescncia mxima (Fm) indicam dano no aparato fotossinttico (FRACHEBOUD,
2001; KRAUSE ; WEIS, 1991; LAISK et al., 1998).
O parmetro Fo reflete o estado da clorofila nos centros antena e pode ser considerado
uma medida da distribuio de energia inicial para o PSII, bem como a eficcia de captura da
mesma (SEPPANEN et al., 1998). A relao Fv/Fm reflete a mxima eficincia com que a luz,
absorvida pelo complexo antena do fotossistema II, convertida em energia qumica. Guidi et al.,
40
(2000) observaram que o declnio de Fv/Fm em folhas de Phaseolus vulgaris tratadas com PQ foi
acompanhado por um aumento fluorescncia mnima (Fo). Estes autores infeiram que o PQ foi
capaz de induzir danos ao PSII, excedendo a capacidade fotoprotetora da planta.
Em geral, a ocorrncia de estresses ambientais que afetam a eficincia do PSII levam ao
decrscimo de Fv/Fm (KRAUSE ; WEIS, 1991). No caso do presente estudo, as plantas foram
tratadas com um herbicida atuante no PSI, inibindo o fluxo normal de eltrons, ocasionando danos
no PSII tambm. Isto porque os principais transportadores existentes entre os dois fotossistemas
(Pheo, Qa, Qb, PQ, Cyt bf, PC) perdem sua capacidade funcional, gerando um acmulo
prejudicial de eltrons e o desbalano do gradiente de prtons entre estroma e lmen do
cloroplasto. Alm disso, radicais reativos de oxignio (EROs), especialmente o superxido (1O2),
foram detectadas no PSII. Estas espcies foram produzidas pela re-oxidao do PQ reduzido e
propagaram para os centros de reao do PSII, ocasionando uma perda da eficincia fotossinttica
(Fv/Fm) (IANNELLI et al., 1999) e, tambm, efeitos sobre as membranas celulares (SLOOTEN
et al., 1995).
O parmetro Fv/Fm uma estimativa da capacidade fotoqumica total e da eficincia do
PSII, ou seja, o nmero de complexos do PSII ativos. Valores tpicos desse parmetro em folhas
saudveis e iluminadas variam em torno de 0.8 ou um pouco abaixo desse valor (CRITCHLEY,
1998). Logo, o resultado da figura 4B evidencia que as plantas no-tratadas (0mM Metil
Violgeno) estavam em perfeitas condies fotossintticas. Uma dimunuio significativa deste
parmetro, tal como ocorreu na dose 4, sugere uma diminuio na eficincia quntica da evoluo
do O2 ou da fixao do CO2, alm de ser tambm um indicativo de fotoinibio (HIDEG et al.,
2000; KATO et al., 2003)
No presente estudo, a reduo do valor de Fv/Fm, em especial na dose 4, pode ser
atribudo ao aumento de Fo observado na mesma dose (Figura 4). Entretanto, mesmo com nveis
baixos, como na dose 4, a atividade funcional do PSII foi mantida, pois, conforme j
mencionando, uma reduo de Fv/Fm indica uma perda na eficincia fotoqumica primria de
folhas fotoinibidas. Essa diminuio atribuda ao PQ, que induz uma reduo na fluorescncia
varivel da clorofila, resultando numa reduo de Fm. Os valores de Fm, em todas as doses de
PQ, reduziram significativamente devido a uma menor taxa de transporte de eltrons, conforme o
grfico a seguir.
41
ETR
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0 2 4 6 8
Metil Violageno (mM)
ETR
baixa
mdia
Figura 5- Taxa aparente de transporte de eltrons em plantas de cana-de-acar expostas a diferentes
concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 18 horas de aplicao A taxa aparente de transporte de eltrons (ETR) foi afetada pelo tratamento com Metil
Violgeno, notadamente na dose intermediria de 4mM, em que os valores em mol eltrons.m-
2.s-1 alcanaram valores prximo de zero. importante ressaltar que as medidas de fluorescncia
da clorofila no claro, foram realizadas em duas intensidades distindas, conforme j mencionado na
metodologia. Os resultados das medidas de claro, obtidos em intensidades de PAR baixa e mdia,
asseguram que no h quaisquer interferncias desses valores de PAR na resposta fisiolgica das
plantas, ou seja, no existe possibilidade de haver uma induo de estresse por excesso de luz.
Portanto, as medidas obtidas representam o real estado fotossinttico das plantas em estudo. Este
parmetro est relacionado diretamente com a resposta do PSII a determinada intensidade de
PAR.
Ao penetrar nas folhas da plantas, a molcula de PQ tranforma-se num radical, na presena
de luz, e este ir reagir com o oxignio molecular formando espcies reativas de oxignio (EROs)
(ASADA; TAKAHASHI, 1987). Isso ir afetar a ETR nos tilacides dos cloroplastos, provocando
uma diminuio, como observado em feijoeiro por Schmitz-Eiberger ; Noga (2001). De maneira
similar, na figura 5, com exceo da dose inicial (2mM), o PQ ocasionou uma reduo na ETR.
Essa inibio do transporte fotossinttico de eltrons em folhas da cana-de acar deve,
tambm, ser associada aos danos gerados no PSI pelo tratamento com Paraquat. Em estudo com
batateiras submetidas alta temperatura, Havaux (1993) observou que os seguintes aspectos esto
42
interligados com a queda da ETR: a inibio da fotlise da gua (em temperaturas superiores a
32C), a reduo da eficincia de captao de energia pelos centros de reao do PSII, alteraes
no fluxo de eltrons aps QA (Tf > 42C) e danos no PSI (Tf > 45C).
A manuteno do fluxo de eltrons atravs do aparato fotossinttico, mesmo na ausncia
de quantidades suficientes de NADP+, aceptor de eltrons, essencial para a proteo do
cloroplasto do estresse oxidativo, que neste estudo foi induzido pelo tratamento com PQ. Existem
pelo menos duas diferentes vias que participam desse processo: fluxo cclico de eltrons e o ciclo
gua-gua. Este ciclo consite no seguinte: parte dos eltrons resultantes da fotlise da gua, no
PSII, so usados na gerao de redutores para o perxido de hidrognio (H2O2); a outra parte
segue para que haja a reduo univalente do O2 no PSI (ASADA, 2006). Os eltrons fluem da
gua, consumida no PSII, para a gua produzida na reduo do H2O2, no PSI.
De forma sucinta, no PSI, duas molculas de O2 so reduzidas, por dois eltrons do PSII, a
radicais superxidos (1O2). Estes radicais ento so convertidos em H2O2 e O2 em reao
catalisada pela Superxido Dismutase e o H2O2 reduzido, pela Ascorbato Peroxidase, gerando
gua. Ento, os eltrons oriundos da molcula de gua no PSII so doados para a reduo do O2. O
ciclo gua-gua tem funo fisiolgica de proteo de molculas alvo contra a ao de EROs,
ajustamento da fotoproduo da razo ATP/NADPH e dissipao do excesso de ftons (ASADA,
1999).
O fluxo de eltrons atravs do ciclo gua-gua foi estimado a partir da assimilao de CO2
e parmetros de fluorescncia da clorofila de folhas adaptadas em escuro (MAKINO et al., 2002).
Estes autores observaram que o fluxo de eltrons pelo ciclo gua-gua antes da fotoativao do
Ciclo de Calvin similar ao fluxo para assimilao de CO2, em steady state,, aps a fotoativao.
Tais observaes indicam que o ciclo gua-gua importante o suficiente para permitir o fluxo de
eltrons em steady state, tornando-se a principal via de eltrons antes da fotoativao. Dessa
forma, esta via parece ser indispensvel ao incio da fotossntese em folhas adaptadas ao escuro
sem haver danos fotooxidativos.
Um aumento no fluxo de eltrons atravs do ciclo gua-gua foi observado em plantas sob
condies de estresse por baixa disponibilidade de CO2 (MIYAKE; YOKOTA, 2000), baixas
temperaturas (HIROTSU et al., 2004; LI et al., 2005) e estresse salino (CHEN et al., 2004). Em
plantas C4, uma reduo de ETR e fixao de CO2 pode representar um aumento de eltrons para
o ciclo gua-gua devido a baixa atividade fotorrespiratria (FRYER et al.,, 1998).
43
PSII
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 2 4 6 8
Metil Violageno (mM)
PS
IIbaixa
mdia
Figura 6- Eficincia quntica efetiva do FSII em plantas de cana-de-acar expostas a diferentes
concentraes de Metil Violgeno (Paraquat) aps 18 horas de aplicao
Da mesma maneira que a eficincia quntica potencial (Fv/Fm) e a taxa de transporte de
eltrons (ETR), os resultados da eficincia quntica efetiva (PSII) evidenciam um decrscimo na
dose de 4mM Metil Violgeno para valores prximos de zero (Figura 6). Entretanto, diferente dos
resultados de ETR, os valores de PSII foram maiores em baixa intensidade de PAR (100
mol.m-2.s-1 ftons).
Este parmetr