UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS CENTRO SUPERIOR DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA

TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL

ROTEIRO DE AULA PRÁTICA

Coliformes totais e fecais – Detecção em amostras de água através do teste de Presença-Ausência (P/A), segundo CETESB – L5.240

1. INTRODUÇÃO

Desde o início da bacteriologia sanitária, marcada pela observação de Escherich em 1885, de que o Bacillus coli (Escherichia coli) poderia ser usado como indicador de na avaliação da contaminação fecal da água – as bactérias do grupo coliforme tem sido extensivamente utilizadas na avaliação da qualidade das águas, sendo até hoje o parâmetro microbiológico básico incluído nas legislações relativas a águas para consumo humano.

Para a avaliação das condições sanitárias de uma água, utilizam-se bactérias do grupo coliforme, que atuam como indicadores de poluição fecal, pois estão sempre presentes no trato intestinal humano de outros animais de sangue quente, sendo eliminadas em grandes números pelas fezes. A presença de coliformes na água indica poluição, com o risco potencial da presença de organismos patogênicos, e uma vez que são mais resistentes na água do que as bactérias patogênicas de origem intestinal.

COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias constituído por bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares ou outros compostos ativos de superfície (surfactantes), com propriedades similares de inibição de crescimento, e que fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebisiela.

COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebisiela também apresentam essa capacidade.

2. OBJETIVOEste método tem como objetivo a detecção de coliformes (totais e fecais)

em amostras de água, através do teste de Presença-Ausência (P/A), com aplicação na avaliação da qualidade bacteriológica de águas destinadas a consumo humano.

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3. APARELHAGEM3.1. Equipamentos, vidrarias, outros. Balança, banho-maria (44,5°C), destilador de água ou aparelho de desionização, equipamentos para esterilização (autoclave, estufa de esterilização), incubadora bacteriológica termostatizada, medidor de pH, balões, frascos para o meio presuntivo, frasco para coleta da amostra, tubos de Durham, tubos de ensaio, alças de inoculação, bico de Bunsen ou similar, estantes, estojo para pipetas, tela de amianto, termômetros, tripé.

3.2. Meio de cultura3.2.1. Caldo P-A

Caldo lactosado........................... 39,0 gCaldo lauril................................... 52,5 gPúrpura de bromocresol.............. 0,0255 gÁgua destilada............................. 1000 mL

3.2.2. Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%Peptona....................................... 10,0 gLactose........................................ 10,0 gBile de boi desidratada................ 20,0 gVerde brilhante............................ 0,0133 gÁgua destilada............................. 1000 mL

3.2.3. Meio E.C.Triptose ou trypticase....................................... 20,0 gLactose............................................................. 5,0 gMistura de sais biliares ou sais biliares nº3..... 1,5 gFosfato dipotássio (K2HPO4).......................... 4,0 gFosfato monopotássio (KH2PO4).................... 1,5 gCloreto de sódio (NaCl).................................... 5,0 gÁgua destilada................................................. 1000 mL

4. PROCEDIMENTO

a) Antes de iniciar o exame, desinfetar a bancada de trabalho, usando desinfetante.

b) Dispor sobre a bancada de trabalho o material necessário para a execução do exame.

c) Identificar os frascos contendo 50 mL de P/A, com o número da amostra.d) Acender o Bico de Bunsen, para manter o ambiente asséptico.e) Homogeneizar a amostra, no mínimo 25 vezes, suavemente.f) Dosar 100 mL da amostra em proveta estéril e proceder à inoculação,

vertendo cuidadosamente esse volume da amostra no frasco contendo o caldo P-A, tomando cuidado para que não ocorra entrada de ar no tubo de Durham contido no interior do frasco.

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g) Após a inoculação das amostras, efetuar a incubação a 35 ± 0,5ºC, durante 24 h.

h) Após esse período de incubação, efetuar a 1ª leitura, considerando como resultado positivo à acidificação do meio (evidenciado pela mudança de sua coloração de púrpura para amarelo), com ou sem produção de gás. Se os resultados forem negativos, retornar os frascos à incubadora por mais 24 horas, efetuando após esse período, a leitura final conforme especificado acima.

i) Submeter as culturas com resultado presuntivo aos testes confirmativos, para a determinação de coliformes totais e para a diferenciação de coliformes fecais.

j) Com auxílio de uma alça de inoculação, devidamente flambada e resfriada, retirar um inóculo da cultura positiva em caldo P/A. Recomenda-se fazer uma leve agitação do frasco, para a dispersão das bactérias.

k) Imediatamente após a abertura contendo as culturas positivas em caldo P/A, flambar a boca do mesmo antes de colher os inóculos, repetir a operação antes do seu fechamento.

l) Transferir esse inóculo para um tubo contendo caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% e incubar a 35 ± 0,5ºC, durante 24-48 h e para um tubo contendo o meio E.C. e incubar a 44,5 ± 0,2°C, em banho-maria com agitação, durante 24 h.

m) Após os períodos determinados de incubação, efetuar as leituras, considerando resultado positivo para coliformes totais a produção de gás a partir da fermentação da lactose no meio caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%, coliformes fecais estão presentes se houver produção de gás no meio E.C.

5. RESULTADOSPara coliformes totais, o resultado final é emitido com base nos resultados

obtidos no caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%, sendo expresso como: Presença ou ausência de coliformes totais/ 100 mL.

Para coliformes fecais, o resultado final é baseado no meio E.C., sendo expresso como: Presença ou ausência de coliformes fecais/ 100 mL.

Responsáveis: Ádria, Cassiana e Gilberto

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