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UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE QUIacuteMICA
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas (Bioquiacutemica)
PAULO MARQUES PIERRY
Transcritocircmica comparativa de cepas de
Xylella fastidiosa
Versatildeo corrigida da Tese
Versatildeo original disponiacutevel em IQUSP
Satildeo Paulo
27032017
PAULO MARQUES PIERRY
Transcritocircmica comparativa de cepas de Xylella fastidiosa
Tese apresentada ao Instituto de Quiacutemica da
Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo
do Tiacutetulo de Doutor em Ciecircncias
(Bioquiacutemica)
Orientadora Profa Dra Aline Maria da
Silva
Satildeo Paulo
2017
Ficha CatalograacuteficaElaborada pela Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo do Conjunto das Quiacutemicas da USP
P622tPierry Paulo Marques Transcritocircmica comparativa de cepas de Xylellafastidiosa Paulo Marques Pierry - Satildeo Paulo2017 199 p + Cento e noventa e nove
Tese (doutorado) - Instituto de Quiacutemica daUniversidade de Satildeo Paulo Departamento deBioquiacutemica Orientador da Silva Aline Maria
1 Xylella fastidiosa 2 Fitopatoacutegenos 3Clorose Variegada dos Citros 4 Doenccedila de Pierce5 Transcritoma - RNA-Seq I T II da SilvaAline Maria orientador
Dedico
Aos meus pais e irmatildeo agrave Erika e a todos que me ajudaram
AGRADECIMENTOS
Agrave Profa Dra Aline Maria da Silva por todos os ensinamentos atenccedilatildeo e suporte
durante o Doutorado
Ao Profs Drs Steve Lindow e Michelle Igo da Universidade da Califoacuternia EUA
pelas discussotildees e informaccedilotildees sobre o cultivo de Xylella fastidiosa no meio miacutenimo PIM-6
Aos Profs Drs Sergio Verjovski-Almeida Eduardo Reis Walter Terra Cleacutelia
Ferreira Suely Gomes Regina Baldini e Glaucia Souza por permitirem a utilizaccedilatildeo de seus
equipamentos e por eventuais empreacutestimos de reagentes e materiais
A todos os professores que tive contato em disciplinas e seminaacuterios em todos os
Institutos da USP que frequentei
Agrave Dra Layla Farage e agrave Claudia Teixeira responsaacuteveis pelo Centro Avanccedilado de
Tecnologias em Genocircmica (CATG) do IQ-USP pela ajuda e discussotildees sobre os
procedimentos de sequenciamento dos transcritomas
Aos teacutecnicos dos laboratoacuterios do Departamento de Bioquiacutemica do IQ-USP pela valiosa
ajuda em diversos momentos e principalmente ao Alexandre Sanchez teacutecnico do nosso
laboratoacuterio e grande amigo agrave Doacuteris Arauacutejo e agrave Bianca Dazzani
Aos colegas de laboratoacuterio Oseacuteias Feitosa Ana Paula de Souza Luciana Antunes
Joaquim Martins Deibs Barbosa Paulo Zaini Roberta Verciano e Raquel Riyuzo pela
amizade conversas viagens discussotildees ajuda em experimentos e companhia durante o
Doutorado
Aos amigos e colegas bioinformatas Deibs Barbosa Joaquim Martins e Rodrigo
Guarischi pela ajuda e discussotildees sobre os meacutetodos de anaacutelises computacionais de dados de
RNA-Seq
Aos demais colegas da poacutes-graduaccedilatildeo pela troca de experiecircncias e disposiccedilatildeo em
colaborar
Aos funcionaacuterios do IQ-USP por proporcionarem um ambiente agradaacutevel de trabalho
Aos meus amigos de fora da USP pelo apoio incondicional durante todo meu
Doutorado
Agrave minha namorada Erika por todo o amor carinho apoio e maravilhosa companhia
em todos os anos que estamos juntos
Aos meus pais e famiacutelia por me proporcionarem todo o amor suporte e apoio para que
eu pudesse me dedicar inteiramente ao Doutorado
Ao CNPq CAPES FAPESP e NUBICUSP pelo apoio financeiro e agrave FAPESP pela
bolsa de Doutorado
RESUMO
Pierry Paulo Marques Transcritocircmica comparativa de cepas de Xylella fastidiosa 2017 199p Tese de Doutorado - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo Ciecircncias Bioloacutegicas (Bioquiacutemica) Instituto de Quiacutemica Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo O fitopatoacutegeno Xylella fastidiosa coloniza o luacutemen dos vasos do xilema de seus hospedeiros e
o aparelho bucal do inseto-vetor Eacute responsaacutevel por doenccedilas de extrema gravidade em videira
laranjeira e oliveira entre outras plantas de relevacircncia econocircmica Haacute evidecircncia de
especificidade entre cepas de X fastidiosa e as diferentes espeacutecies de plantas que colonizam
mas as bases moleculares desta interaccedilatildeo satildeo desconhecidas O objetivo central deste trabalho
foi elucidar o repertoacuterio completo de genes expressos eou diferencialmente expressos por
diferentes cepas X fastidiosa em meios e tempos de cultivo distintos e relacionar as respostas
transcricionais a mecanismos de virulecircncia patogenicidade e especificidade ao hospedeiro
Foram sequenciados analisados e comparados os transcritomas de cepas de laranjeiras (9a5c
J1a12 U24d e Fb7) de cafeeiro (3124) de hibisco (Hib4) ameixeira (Pr8x) e de videira
(Temecula1) no iniacutecio e fim da fase a exponencial de crescimento populacional em meio rico
PWG e em meio miacutenimo PIM6 que mimetiza a seiva do xilema Foi observado que a maioria
dos genes de X fastidiosa eacute expressa ainda que dependendo da cepa e da condiccedilatildeo
experimental 40-80 dos transcritos sejam pouco abundantes Por outro lado foi verificado
um conjunto de transcritos muito abundantes uma parte deles comuns a todas as cepas e que
incluem os ncRNAs 6S e RNAse P aleacutem de transcritos de microcinas proteases lipases
proteiacutenas de resposta a estresse e proteiacutenas de funccedilatildeo desconhecida Aleacutem da definiccedilatildeo de
perfis transcricionais foram descritas as regiotildees 5rsquo e 3rsquo natildeo-traduzidas dos transcritos As
estruturas de 545 e 386 operons expressos respectivamente pelas cepas 9a5c e Temecula1
tambeacutem foram mapeadas e pela primeira vez foi obtido o perfil de sRNAs expressos por X
fastidiosa As anaacutelises de expressatildeo diferencial entre transcritomas das duas fases de
crescimento no mesmo meio indicam que o estresse gerado pela limitaccedilatildeo nutricional do meio
PIM6 exigiu mudanccedilas mais draacutesticas na expressatildeo gecircnica do que no meio PWG Foi tambeacutem
observado que diferentes cepas respondem de maneiras distintas a uma mesma condiccedilatildeo
indicando que genes ortoacutelogos satildeo regulados de formas diferentes Aleacutem disso a
transcritocircmica comparativa revelou diferenccedilas relevantes na regulaccedilatildeo gecircnica de cepas de
hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas agrave especificidade ao hospedeiro
Por fim as anaacutelises dos transcritomas evidenciaram vaacuterios genes candidatos que poderatildeo ser
futuramente investigados quanto ao seu papel na biologia e na virulecircncia de X fastidiosa
Palavras chave fitopatoacutegeno Xylella fastidiosa Clorose Variegada dos Citros Doenccedila de
Pierce transcritoma RNA-Seq
ABSTRACT
Pierry Paulo Marques Comparative transcriptomic of Xylella fastidiosa strains 2017 199p PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry Instituto de Quiacutemica Universidade de Sao Paulo Sao Paulo
The phytopathogen Xylella fastidiosa colonizes the lumen of xylem vessels from its hosts and
the mouth apparatus of the insect-vector It is responsible for severe diseases in grapevine
orange and olive trees among other plants of economic relevance There is evidence for
specificity between X fastidiosa strains and the different plant species they colonize but the
molecular bases of this interaction are unknown The main objective of this work was elucidate
the complete repertoire of expressed andor differentially expressed genes by different X
fastidiosa strains in distinct media and growth times and associate transcriptional responses to
virulence mechanisms pathogenicity and host specificity Transcriptomes of orange strains
(9a5c J1a12 U24d and Fb7) coffee (3124) hibiscus (Hib4) plum (Pr8x) and grapevine
(Temecula1) were sequenced analyzed and compared from cells at the beginning and end
stages of exponential growth phase in rich medium PWG and in minimum medium PIM6
which mimics xylem sap It was observed that the majority of X fastidiosa genes is expressed
although depending of the strain and experimental condition 40-80 of transcripts are less
abundant On the other hand it was verified a set of more abundant transcripts some of them
shared by all strains including 6S and RNAse P ncRNAs as well as transcripts for microcins
proteases lipases stress response proteins and proteins of unknown function Besides the
definition of transcriptional profiles 5rsquo and 3rsquo untranslated regions of transcripts were
described The structure of 545 and 386 expressed operons respectively for 9a5c and
Temecula1 strains were also mapped and for the first time the expressed profile of sRNAs in
X fastidiosa was obtained The differential expression analyzes between transcriptomes of two
growth phases in the same medium indicate that the stress generated by nutritional limitation of
PIM6 medium required more drastic changes in gene expression than PWG medium It was
also observed that different strains respond in distinct manners to a same condition indicating
that orthologous genes are regulated in different ways Moreover comparative transcriptomics
revealed relevant differences in gene regulation of strain of distinct plant hosts that can be
related to host specificity Lastly transcriptomic analyzes pointed to several gene candidates
that could be further investigated for their roles in X fastidiosa biology and virulence
Keywords phytopathogen Xylella fastidiosa Citrus Variegated Chlorosis Pierceacutes Disease
transcriptome RNA-Seq
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALS Escaldadura da folha de amendoeira asRNA RNA anti-senso ATP adenosina trifosfato BLAST Basic Local Alignment Search Tool CAGe Cap Analysis of Gene Expression CATG Centro Avanccedilado de Tecnologias em Genocircmica IQ-USP c-di-GMP diguanilato ciacuteclico ou di-GMP ciacuteclico cDNA DNA complementar CDS sequecircncia codificadora CEFAP Centro de Facilidades de Apoio agrave Pesquisa ICB-USP CLS Escaldadura da folha de cafeeiro CVC Clorose Variegada dos Citros CWDE enzima degradadora de parede celular DEPC dicarbonato de dietila DNase desoxirribonuclease dNTP desoxirribonucleotiacutedeo 5rsquo trifosfato DO densidade oacuteptica DRS Direct RNA Sequencing DSF Diffusible Signaling Factor EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico EFSA European Food Safety Authority ESTs Expressed Sequence Tags FPKM Fragments per kilobase transcript per million reads FUNDECITRUS Fundo de Defesa da Citricultura GO Gene Ontology IMGER Integrated Microbial Genomes-Expert Review KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LPS lipopolissacariacutedeo MIAME Minimum Information about a Microarray Experiment MIRA Mimicking Intelligent Read Assembly mRNA RNA mensageiro NCBI National Center for Biotechnology Information ncRNA non coding RNA ou RNA natildeo codificador OLS Escaldadura da folha de oleandro ou espirradeira OMV vesiacutecula de membrana externa OQDS Siacutendrome do Raacutepido Decliacutenio das Oliveiras ORESTES Open Reading Frame Expressed Sequence Tags ORF open read frame pb pares de base PCR reaccedilatildeo em cadeia da polimerase PD Doenccedila de Pierce PE Paired-End
PET PE Tags PLS-peach Escaldadura da folha de pessegueiro PLS-plum Escaldadura da folha de ameixeira qPCR PCR quantitativo RBS ribosome binding site RLK quinases do tipo receptor RLP proteiacutenas do tipo receptor RNAP RNA polimerase RNase ribonuclease RPKM Reads per kilobase per million mapped reads rpm rotaccedilotildees por minuto rRNA RNA ribossomal RT-PCR PCR precedido por transcriccedilatildeo reversa RT-qPCR qPCR precedido de transcriccedilatildeo reversa SNP polimorfismo de um uacutenico nucleotiacutedeo sRNA small RNA ou pequeno RNA TE Tampatildeo Tris contendo EDTA TF transcription factor ou fator de transcriccedilatildeo Tris tris-(hidroximetil)-aminometano tRNA RNA transportador TSS Transcription Start Site UTR untranslated region ou regiatildeo natildeo traduzida UV ultravioleta VT Virtual Terminator
SUMAacuteRIO
1 Introduccedilatildeo 12 11 Regulaccedilatildeo gecircnica em bacteacuterias 12
111 Regulaccedilatildeo do iniacutecio da transcriccedilatildeo 13 1111 Fatores de transcriccedilatildeo 14 1112 Fatores Sigma (σ) 16 1113 Regulaccedilatildeo epigeneacutetica 20
112 Regulaccedilatildeo do teacutermino da transcriccedilatildeo e poacutes-transcricional 21 1121 Antiterminaccedilatildeo e atenuaccedilatildeo 22 1122 Riboswitches 23 1123 RNAs natildeo codificadores 26 1124 RNAs anti-senso 28 1125 Regulaccedilatildeo da estabilidade do transcrito 30
113 Mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular em bacteacuterias 33 12 Meacutetodos de anaacutelise de transcritomas 36
121 Microarranjos de DNA 37 122 RNA-Seq 40
13 Aspectos da biologia de Xylella fastidiosa 47 131 Doenccedilas causadas por X fastidiosa formas de transmissatildeo e controle 48 132 As epidemias de X fastidiosa 51 133 Variabilidade entre cepas e genomas de Xylella 53 134 Fatores de virulecircncia de X fastidiosa 59 135 Anaacutelises transcritocircmicas em X fastidiosa 66
2 Objetivos 72 3 Procedimentos experimentais 73
31 Manutenccedilatildeo e cultivo de Xylella fastidiosa 73 32 Extraccedilatildeo de RNA total 74 33 Purificaccedilatildeo de RNA total com DNase 75 34 Verificaccedilatildeo da eficiecircncia do tratamento com DNase 76 35 Preparaccedilatildeo de bibliotecas de cDNA para sequenciamento (RNA-Seq) 77
351 Quantificaccedilatildeo de RNA por meacutetodo fluorimeacutetrico 77 352 Depleccedilatildeo de rRNAs 77 353 Preparaccedilatildeo de bibliotecas de cDNA 78 354 Preparaccedilatildeo de bibliotecas de pequenos RNAs (sRNAs) 78 355 Quantificaccedilatildeo de bibliotecas de cDNA por qPCR absoluto 79
36 Sequenciamento de DNA no equipamento MiSeq (Illumina) 80 37 Anaacutelises bioinformaacuteticas e estatiacutesticas 81
4 Resultados e Discussatildeo 83 41 Curva de crescimento das cepas 9a5c e Temecula1 em meio PWG e PIM6 85 42 Obtenccedilatildeo dos transcritomas por RNA-Seq 88 43 Anaacutelise da qualidade das sequecircncias dos transcritomas 91 44 Mapeamento das sequecircncias dos transcritomas nos genomas de referecircncia 93 45 Anaacutelise de correlaccedilatildeo entre reacuteplicas bioloacutegicas e entre diferentes transcritomas 95 46 Identificaccedilatildeo de regiotildees natildeo-traduzidas (UTRs) e operons 101 47 Anaacutelise dos transcritomas baseada nos valores de FPKM 104
471 Panorama da expressatildeo gecircnica das cepas 9a5c e Temecula1 104 472 Descriccedilatildeo dos genes mais expressos 107 473 Anaacutelise de rotas metaboacutelicas expressas 114
48 Anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial 116 481 Comparaccedilotildees entre os transcritomas 116
482 Categorizaccedilatildeo funcional dos genes diferencialmente expressos 123 4821 Anaacutelise por ontologia gecircnica 123 4822 Anaacutelise por vias KEGG 128 4823 Anaacutelise de genes relacionados agrave virulecircncia e patogenicidade 130
49 Identificaccedilatildeo de pequenos RNAs (sRNAs) expressos pela cepa 9a5c 135 410 Curva de crescimento populacional de seis cepas de X fastidiosa 139 411 Obtenccedilatildeo dos transcritomas por RNA-Seq 141 412 Anaacutelises da qualidade das sequecircncias dos transcritomas 144 413 Mapeamento das sequecircncias dos transcritomas nos genomas de referecircncia 145 414 Anaacutelise de correlaccedilatildeo das reacuteplicas bioloacutegicas e entre diferentes transcritomas 146 415 Anaacutelise dos transcritomas baseada nos valores de FPKM 152
4151 Panorama da expressatildeo gecircnica das seis cepas 152 4152 Descriccedilatildeo dos genes mais expressos 156 4153 Anaacutelise de rotas metaboacutelicas expressas 163
416 Anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial 164 4161 Anaacutelise de genes relacionados agrave virulecircncia e patogenicidade 169
5 Consideraccedilotildees finais 176 6 Bibliografia 178 Apecircndices 200
12 Introduccedilatildeo
1 Introduccedilatildeo
11 Regulaccedilatildeo gecircnica em bacteacuterias
Microrganismos estatildeo sempre sujeitos a variadas mudanccedilas nas condiccedilotildees
ambientais tais como flutuaccedilotildees na disponibilidade de nutrientes ou na presenccedila de
agentes toacutexicos que podem afetar sua densidade celular eou causar estresses diversos
em suas ceacutelulas Para enfrentar tais adversidades e garantir sua sobrevivecircncia as ceacutelulas
devem ser capazes de responder prontamente alterando o conjunto de genes expressos
de modo a manter o funcionamento adequado de suas atividades celulares A raacutepida
adaptaccedilatildeo de microrganismos principalmente de bacteacuterias pode ser explicada pela
plasticidade de suas redes de regulaccedilatildeo transcricional (Balleza et al 2009)
A expressatildeo do repertoacuterio gecircnico eacute finamente controlada por meio de diversos
mecanismos reguladores promovendo a eficiecircncia metaboacutelica e energeacutetica dos
processos celulares sendo que nenhum produto celular deveraacute ser sintetizado se natildeo for
necessaacuterio naquele momento A mudanccedila da expressatildeo de genes na ceacutelula eacute
desencadeada pela percepccedilatildeo de sinais externos que podem ou natildeo ser internalizados
embora a maioria seja detectada por sensores proteicos localizados nas membranas
celulares Tais sinais desencadeiam vias complexas de sinalizaccedilatildeo celular que resultam
na ativaccedilatildeo ou repressatildeo seletiva de genes (Marques 2012 Snyder et al 2013)
Em cromossomos bacterianos os genes estatildeo frequentemente organizados em
operons sendo portanto transcritos como mRNAs policistrocircnicos Dessa forma uma
unidade de transcriccedilatildeo pode ser definida por uma regiatildeo promotora regulatoacuteria um siacutetio
de iniacutecio da transcriccedilatildeo uma ou mais regiotildees codificantes (ORF ou CDS) e um siacutetio de
terminaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Browning e Busby 2004) Com isso bacteacuterias podem
responder de forma raacutepida e eficiente aos sinais que recebem uma vez que o mRNA
policistrocircnico codifica ORFs que atuam geralmente em uma mesma rota metaboacutelica
(Keene 2007) O modelo de operon foi proposto como mecanismo de regulaccedilatildeo
coordenada da expressatildeo de genes relacionados com o transporte e catabolismo de
lactose (Jacob e Monod 1961) Nesse modelo a proteiacutena repressora (repressor lac)
quando ligada ao indutor no caso alolactose sofre mudanccedila conformacional e perde
afinidade pelo operador (elemento regulatoacuterio ao qual o repressor se liga e que controla
13 Introduccedilatildeo
a expressatildeo dos genes do operon) resultando na desrepressatildeo do operon (Lewis 2005)
Em operons unidades transcricionais se sobrepotildeem sempre haacute um promotor que
controla a transcriccedilatildeo do conjunto completo de genes mas podem existir promotores
internos regulando determinados genes do operon ou mesmo regiotildees de terminaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo prematuras fazendo com que apenas alguns genes do operon sejam parte do
mRNA policistrocircnico (Browning e Busby 2004)
A regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em bacteacuterias pode ocorrer em diversos
momentos desde ativaccedilatildeo da transcriccedilatildeo ateacute a estabilidade do produto gecircnico final
(Silva-Rocha e de Lorenzo 2010) A transcriccedilatildeo eacute o principal ponto de regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica (Browning e Busby 2004) poreacutem mecanismos poacutes-transcricionais
tais como a regulaccedilatildeo da traduccedilatildeo ou da estabilidade de transcritos e de proteiacutenas satildeo
tambeacutem importantes em bacteacuterias Os diversos pontos e mecanismos de regulaccedilatildeo
gecircnica em bacteacuterias seratildeo detalhados adiante
Ademais vale destacar que a regulaccedilatildeo gecircnica bacteriana pode ser mediada em
seus diferentes niacuteveis tanto pela accedilatildeo de proteiacutenas como de RNAs regulatoacuterios Como
tambeacutem detalharemos adiante proteiacutenas regulatoacuterias estatildeo representadas por exemplo
pelos fatores σ da RNA polimerase (RNAP) e fatores de transcriccedilatildeo (TF) (Balleza et al
2009) enquanto que os RNAs regulatoacuterios estatildeo representados pelos riboswitches
(Winkler e Breaker 2003) RNAs natildeo codificadores atuantes em trans (non coding
RNAs ncRNAs) (Mandin et al 2013) e RNAs anti-senso atuantes em cis (asRNAs)
(Sesto et al 2013)
111 Regulaccedilatildeo do iniacutecio da transcriccedilatildeo
O iniacutecio da transcriccedilatildeo depende do reconhecimento da sequecircncia de DNA
especiacutefica do gene a ser transcrito pela maquinaria de transcriccedilatildeo aleacutem da formaccedilatildeo de
um complexo aberto (bolha de transcriccedilatildeo) no DNA que iraacute preceder o processo de
elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo Controlar o iniacutecio da transcriccedilatildeo eacute uma das principais formas
de regulaccedilatildeo gecircnica e ocorre por meio de diversos mecanismos que em sua maioria
envolvem a ligaccedilatildeo de moleacuteculas a sequecircncias especiacuteficas no DNA localizadas
principalmente na regiatildeo promotora do gene a ser regulado
14 Introduccedilatildeo
1111 Fatores de transcriccedilatildeo
Fatores de transcriccedilatildeo satildeo proteiacutenas regulatoacuterias que reconhecem sequecircncias
especiacuteficas no DNA e promovem a ativaccedilatildeo ou inibiccedilatildeo da transcriccedilatildeo de seus genes
alvos Aqueles que estimulam a transcriccedilatildeo satildeo chamados de ativadores e agem
estabilizando a ligaccedilatildeo da RNAP ao promotor Seus siacutetios de ligaccedilatildeo normalmente estatildeo
localizados a montante da posiccedilatildeo -35 do promotor mas tambeacutem podem ser
encontrados entre os siacutetios -35 e -10 Enquanto isso aqueles que impedem o acesso da
RNAP ao promotor satildeo chamados de repressores e seus siacutetios de ligaccedilatildeo satildeo chamados
de operadores sendo normalmente encontrados agrave jusante da posiccedilatildeo -35 do promotor
Geralmente o nuacutemero de genes codificando fatores de transcriccedilatildeo aumenta com o
nuacutemero total de genes do organismo Tais fatores satildeo difusiacuteveis pela ceacutelula e portanto
satildeo considerados elementos trans-atuantes que se ligam aos elementos cis-regulatoacuterios
no DNA localizados nas regiotildees promotoras dos genes regulados (Browning e Busby
2004 Balleza et al 2009)
Em alguns casos os fatores de transcriccedilatildeo natildeo satildeo capazes de isoladamente se
ligar aos seus siacutetios de ligaccedilatildeo Moleacuteculas como iacuteons accediluacutecares aminoaacutecidos e outros
metaboacutelitos podem atuar como indutores caso participem na ligaccedilatildeo de um fator
ativador ou na remoccedilatildeo de um repressor ou como co-repressores caso participem da
ligaccedilatildeo de um fator repressor ou remoccedilatildeo de um ativador A grande maioria dessas
moleacuteculas atua na regulaccedilatildeo de genes que codificam vias metaboacutelicas relacionadas agrave sua
siacutentese em um processo de regulaccedilatildeo por feedback (Browning e Busby 2004 Marques
2012)
Fatores de transcriccedilatildeo e proteiacutenas regulatoacuterias satildeo classificados em diversas
famiacutelias nas quais compartilham domiacutenios funcionais conservados (Snyder et al
2013) Pelo menos dois domiacutenios satildeo necessaacuterios um domiacutenio sensor de sinal que pode
diretamente se associar a um ligante ou interagir com outras proteiacutenas e outro domiacutenio
que interage diretamente com o seu respectivo siacutetio de ligaccedilatildeo na sequecircncia do DNA
sendo o motivo estrutural heacutelice-volta-heacutelice o mais encontrado nos reguladores
bacterianos Apesar de membros de uma mesma famiacutelia ter em comum determinado
domiacutenio natildeo necessariamente eles respondem ao mesmo estiacutemulo ou se ligam agraves
mesmas sequecircncias no DNA (Balleza et al 2009)
15 Introduccedilatildeo
Geralmente reguladores negativos se ligam aos promotores e interferem
diretamente na RNAP enquanto que reguladores positivos se ligam a sequecircncias
especiacuteficas a montante do promotor e auxiliam no iniacutecio da transcriccedilatildeo embora existam
fatores de transcriccedilatildeo que apresentam papel regulatoacuterio duplo (Madan Babu e
Teichmann 2003 Balleza et al 2009) Aleacutem disso mais de um fator de transcriccedilatildeo
podem atuar juntos em uma mesma regiatildeo regulatoacuteria Haacute que se considerar tambeacutem a
ocorrecircncia de uma degeneraccedilatildeo da interaccedilatildeo entre os fatores e seus siacutetios de ligaccedilatildeo ou
seja existem diferentes siacutetios capazes de recrutar o mesmo fator e diferentes fatores
podem reconhecer siacutetios similares (Balleza et al 2009)
O acesso dos fatores de transcriccedilatildeo para interagir com o DNA tambeacutem eacute
regulado pelo niacutevel de empacotamento do material geneacutetico (Willenbrock e Ussery
2004) Diversas proteiacutenas (DNA isomerases DNA chaperonas proteiacutenas acessoacuterias)
atuam nos processos de dobramento e enovelamento do cromossomo bacteriano o que
faz com que algumas regiotildees fiquem inacessiacuteveis agrave ligaccedilatildeo de proteiacutenas ou da
maquinaria transcricional (Balleza et al 2009) Aleacutem do niacutevel de empacotamento a
composiccedilatildeo de bases nas regiotildees regulatoacuterias tambeacutem constitui um fator relevante para
o iniacutecio da transcriccedilatildeo uma vez que regiotildees com um maior conteuacutedo de A+T do que
outras tendem a ser mais facilmente acessadas pela maquinaria transcricional (Dekhtyar
et al 2008)
Um conceito importante na regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica por fatores de
transcriccedilatildeo eacute o de regulon (Balleza et al 2009) o qual compreende um grupo de genes-
alvo que sofrem influecircncia de um mesmo conjunto de fatores de transcriccedilatildeo que
respondem a determinado estiacutemulo ou condiccedilatildeo celular Por sua vez um gene tambeacutem
pode ser alvo de mais de um fator de transcriccedilatildeo pertencendo a mais de um regulon
Normalmente genes presentes no mesmo regulon codificam proteiacutenas que participam
de processos celulares relacionados o que justifica o fato deles serem co-regulados Por
outro lado vaacuterios genes podem ser controlados por um determinado estiacutemulo que
acionaria diferentes fatores de transcriccedilatildeo os quais regulariam seus respectivos alvos
constituindo o chamado stimulon (Marques 2012)
Em Escherichia coli a maioria dos genes de fatores de transcriccedilatildeo estaacute
localizada proacutexima de seus genes alvos (Janga et al 2007) Esta proximidade constitui
uma vantagem para a accedilatildeo direta destes fatores que rapidamente podem encontrar seus
siacutetios regulatoacuterios uma vez que muitas vezes a sua concentraccedilatildeo na ceacutelula eacute baixa
16 Introduccedilatildeo
(Kolesov et al 2007) Ademais os regulons satildeo evolutivamente flexiacuteveis pois genes
codificadores de fatores de transcriccedilatildeo e seus respectivos siacutetios de ligaccedilatildeo podem ser
adquiridos ou perdidos a partir da transferecircncia horizontal gecircnica e outros eventos que
possam alterar a estrutura do genoma bacteriano (Balleza et al 2009)
Fatores de transcriccedilatildeo com maior afinidade a determinados siacutetios tendem a se
manter mais tempo ligados ao DNA sugerindo que tal gene alvo precise ter uma
regulaccedilatildeo positiva ou negativa por um tempo prolongado No caso de ativadores
transcricionais quando os promotores satildeo fortes e os fatores de transcriccedilatildeo satildeo
abundantes de modo geral a transcriccedilatildeo ocorreraacute em uma taxa bem definida Poreacutem
quando o promotor eacute fraco e a concentraccedilatildeo do fator oscila a transcriccedilatildeo do gene
dependeraacute de flutuaccedilotildees do acaso para ocorrer (Balleza et al 2009 Silva-Rocha e de
Lorenzo 2010)
1112 Fatores Sigma (σ)
A RNAP bacteriana apresenta cinco subunidades proteicas principais formando
seu cerne ou core duas subunidades α (alfa) uma β (beta) uma βrsquo (beta linha) e uma ω
(ocircmega) O cerne da enzima eacute capaz de se ligar ao DNA de forma natildeo-especiacutefica e
iniciar a siacutentese de RNA a partir de extremidades ou quebras no DNA (Saecker et al
2011) Entretanto para iniciar uma transcriccedilatildeo produtiva a partir de sequecircncias
especiacuteficas precedidas por um promotor eacute exigida a presenccedila de uma subunidade
proteica dissociaacutevel chamada fator σ (sigma) que se liga ao cerne da RNAP formando
a holoenzima (Paget 2015)
Os fatores σ desempenham diversos papeacuteis-chave na iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
incluindo o reconhecimento inicial de sequecircncias promotoras a abertura e estabilizaccedilatildeo
do complexo aberto do DNA no promotor a interaccedilatildeo com outras moleacuteculas ativadoras
aleacutem de influenciar na dissociaccedilatildeo da RNAP do promotor (o fator σ se desliga da RNAP
assim que a fase de elongaccedilatildeo eacute iniciada) (Saecker et al 2011 Feklistov et al 2014
Paget 2015) Enquanto que as funccedilotildees na iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo nos eucariotos estatildeo
divididas entre muitas proteiacutenas o fator σ procarioacutetico realiza todas essas funccedilotildees na
iniciaccedilatildeo (Feklistov et al 2014)
Existem diferentes fatores σ nas ceacutelulas sendo que cada um eacute responsaacutevel por
regular a transcriccedilatildeo de um determinado conjunto de genes para lidar com as condiccedilotildees
17 Introduccedilatildeo
desencadeadas por estiacutemulos intra e extracelulares dirigindo a RNAP agrave posiccedilatildeo correta
para iniciar a transcriccedilatildeo (Feklistov et al 2014) Os estiacutemulos podem ser carecircncia
nutricional iniacutecio da fase estacionaacuteria mudanccedilas de temperatura diferentes tipos de
estresses (oxidativo osmoacutetico) entre outros Os fatores σ satildeo divididos em duas
famiacutelias e diversas subfamiacutelias (ou grupos) baseado nas suas origens filogeneacuteticas a
famiacutelia do σ70 (sigma 70) e a famiacutelia do σ54 (sigma 54) (Paget 2015) Dessa forma
haveraacute uma competiccedilatildeo pelo cerne da RNAP entre os diferentes fatores σ sendo que a
condiccedilatildeo atual da ceacutelula iraacute guiar a predominacircncia de uns pelos outros Uma vez que um
gene pode possuir mais de um promotor e consequentemente ser regulado por mais de
um fator sigma ele pode ser expresso em mais de uma condiccedilatildeo que a ceacutelula eacute exposta
A famiacutelia do σ70 compreende um maior nuacutemero de fatores relacionados com as
mais variadas funccedilotildees durante o crescimento Os membros dessa famiacutelia foram
filogeneticamente e estruturalmente classificados em quatro grupos distintos os quais
satildeo diferenciados pela presenccedila ou ausecircncia de quatro regiotildees conservadas que
correspondem a quatro domiacutenios estruturais (11 2 3 e 4) Tais domiacutenios estatildeo
associados com a ligaccedilatildeo ao DNA nas regiotildees promotoras -10 -10 estendida e -35
caracteriacutesticas de membros dessa famiacutelia (Feklistov et al 2014 Paget 2015)
O grupo 1 consiste de fatores σ primaacuterios e conteacutem todos os domiacutenios estruturais
e consequentemente podem atingir massas moleculares de ~70 kDa O fator σ70 eacute o
mais abundante e basal na ceacutelula sendo responsaacutevel pela transcriccedilatildeo de genes
relacionados agrave manutenccedilatildeo do metabolismo e atividade celulares Um dos pontos de
controle de sua atividade eacute a ligaccedilatildeo com uma proteiacutena regulatoacuteria chamada Rsd a qual
o sequestra e impede a accedilatildeo do fator σ70 atuando como fator anti-sigma Foi observado
que a concentraccedilatildeo de Rsd aumenta duas vezes com a entrada de E coli na fase
estacionaacuteria e que sua ligaccedilatildeo ao fator σ70 eacute mais efetiva nesta fase (Paget 2015)
Os grupos 2 a 4 compreendem os fatores σ alternativos com funccedilotildees
especializadas e se diferenciam do grupo 1 pela completa ausecircncia do domiacutenio 11 a
presenccedila variaacutevel do domiacutenio 3 e a especificidade de sequecircncias no promotor Fatores σ
do grupo 2 estatildeo envolvidos na adaptaccedilatildeo a estresses incluindo limitaccedilatildeo nutricional e
outros associados a entrada em fase estacionaacuteria O σS ou σ38 eacute o mais estudado dos
fatores σ do grupo 2 em E coli Este fator eacute responsaacutevel pela resposta geral a estresse e
pela sobrevivecircncia durante a fase estacionaacuteria sendo induzido em resposta a uma
variedade de estresses ambientais (Battesti et al 2011) Membros do grupo 3 satildeo
18 Introduccedilatildeo
estruturalmente e funcionalmente diversos mas normalmente conteacutem os domiacutenios 2 3 e
4 (Feklistov et al 2014) Eles foram categorizados em quatro subgrupos
filogeneticamente distintos e que parcialmente correlacionam-se com suas funccedilotildees
biossiacutentese de flagelo (σ28 de E coli) resposta a choque de calor (σ32 de E coli)
estresse geral (σB de B subtilis) e esporulaccedilatildeo (quatro fatores σ em B subtilis) (Paget
2015) Finalmente membros do grupo 4 satildeo tambeacutem conhecidos como grupo com
funccedilatildeo extracitoplasmaacutetica (ECF) dado a sua capacidade de perceber e responder a
sinais gerados fora da ceacutelula ou na membrana celular (Lonetto et al 1994) Trata-se do
maior e mais diverso grupo de fatores σ em niacutevel de sequecircncia primaacuteria consistindo de
pelo menos 43 subgrupos filogeneticamente distintos (Staron et al 2009) Dentre os
seus papeacuteis bioloacutegicos estatildeo a resposta ao estresse no envelope celular transporte de
ferro resposta ao estresse oxidativo e estresses em geral aleacutem da regulaccedilatildeo de genes de
virulecircncia (Kazmierczak et al 2005 Paget 2015) Uma vez que fatores σ ECF natildeo
possuem os domiacutenios 11 e 3 eles satildeo menores apresentando ~20 kDa (Feklistov et al
2014 Paget 2015)
O fator σ54 pertence a uma famiacutelia diferente dos outros fatores σ Aleacutem da
separaccedilatildeo filogeneacutetica este fator tem a particularidade de depender de uma sequecircncia
ativadora no DNA (enhancer) distante ~100 pb agrave montante do siacutetio de iniacutecio da
transcriccedilatildeo e que promove a ligaccedilatildeo efetiva a suas sequecircncias especiacuteficas no promotor
Eacute nesta sequecircncia enhancer que ativadores transcricionais iratildeo se ligar hidrolisar ATP e
catalisar a formaccedilatildeo de complexos abertos no promotor (Kazmierczak et al 2005
Zhang e Buck 2015) O fator σ54 reconhece sequecircncias especiacuteficas e conservadas nas
regiotildees -12 e -24 dos promotores que regula sendo mais uma distinccedilatildeo dos membros da
famiacutelia do σ70 (Kazmierczak et al 2005) σ54 contecircm dois domiacutenios conservados
(regiotildees I e III) separados por uma alccedila de ligaccedilatildeo (regiatildeo II) A regiatildeo I interage com
ATPases o cerne da RNAP e com a sequecircncia -12 do promotor Jaacute a regiatildeo III estaacute
principalmente envolvida em se ligar agrave sequecircncia -24 do promotor A regiatildeo II eacute
dispensaacutevel estando ausente no fator σ54 de algumas espeacutecies bacterianas O σ
54 regula
a transcriccedilatildeo de genes relacionados a vaacuterios processos como metabolismo de nitrogecircnio
utilizaccedilatildeo de fontes alternativas de carbono quimiotaxia estresses na membrana e
estresses em geral (Zhang e Buck 2015) Devido agrave necessidade da ligaccedilatildeo de uma
proteiacutena ativadora o processo de transcriccedilatildeo por este fator eacute melhor regulado aleacutem de
poder haver modificaccedilotildees poacutes-traducionais nas proteiacutenas ativadoras (fosforilaccedilatildeo por
19 Introduccedilatildeo
exemplo) Outra vantagem deste mecanismo de regulaccedilatildeo eacute que mesmo que dois genes
possam ter promotores que se ligam ao fator σ54 eles podem ter proteiacutenas ativadoras
diferentes e consequentemente serem regulados em condiccedilotildees distintas (Marques
2012)
A concentraccedilatildeo dos fatores σ pode ser controlada no niacutevel de transcriccedilatildeo
traduccedilatildeo e niacutevel de proteiacutena Alguns fatores ldquoproacute-sigmardquo satildeo ativados por proteoacutelise
envolvendo a remoccedilatildeo de uma determinada sequecircncia inibitoacuteria geralmente localizada
na extremidade N-terminal Poreacutem na maioria dos casos a expressatildeo e atividade dos
fatores sigma alternativos satildeo controladas pela accedilatildeo de fatores anti-sigma os quais satildeo
proteiacutenas que se ligam aos fatores σ e impedem que eles se liguem agrave RNAP O fator
anti-sigma oclui sequecircncias-chave para a ligaccedilatildeo atraveacutes de interaccedilotildees com os domiacutenios
2 e 4 do fator sigma (Paget 2015)
Em resposta a algum sinal ou estiacutemulo especiacutefico os fatores anti-sigma
desligam-se e liberam os fatores σ envolvendo diversos mecanismos distintos Pode
ocorrer a percepccedilatildeo direta do sinal pelo anti-sigma seguida de uma mudanccedila
conformacional que liberaria o fator σ Um sistema de transduccedilatildeo de sinal pode tambeacutem
estar envolvido no qual uma vez recebido o estiacutemulo extracitoplasmaacutetico clivagens do
anti-sigma na membrana liberariam o fator σ no citoplasma Portanto fatores anti-sigma
satildeo compostos de um domiacutenio de ligaccedilatildeo ao fator σ e um domiacutenio sensorsinalizaccedilatildeo
que responde a um sinal tanto dentro como fora da ceacutelula (Paget 2015)
A atividade dos fatores σ na ceacutelula tambeacutem pode ser regulada por ncRNAs Um
dos exemplos mais conhecidos eacute do pequeno RNA 6S que em E coli possui 184
nucleotiacutedeos e que se liga agrave RNAP quando ela estaacute associada ao σ70 impedindo a
ligaccedilatildeo da holoenzima aos promotores dependentes de σ70 As concentraccedilotildees do RNA
6S aumentam quando as ceacutelulas entram na fase estacionaacuteria o que resulta no sequestro
de RNAPs ligadas ao σ70 (Wassarman 2007) Outras moleacuteculas de RNAP ficam entatildeo
livres para interagir com fatores σ alternativos Quando a ceacutelula sai da fase estacionaacuteria
e o crescimento eacute retomado o aumento na concentraccedilatildeo citoplasmaacutetica de nucleotiacutedeos
trifosfatados eacute o sinal que habilita a RNAP-σ70 a ter atividade de RNA polimerase
dependente de RNA e utilizar o proacuteprio 6S como molde para siacutentese de um RNA de 14ndash
20 nucleotiacutedeos (pRNA) O duplex do 6S com pRNA dissocia-se da RNAP-σ70 eacute
degradado e a holoenzima fica portanto livre para associar-se ao promotores
dependente de σ70 (Wassarman 2007 Mandin et al 2013)
20 Introduccedilatildeo
1113 Regulaccedilatildeo epigeneacutetica
A participaccedilatildeo de mecanismos epigeneacuteticos na regulaccedilatildeo gecircnica tem sido muito
estudada na uacuteltima deacutecada Trata-se de modificaccedilotildees estaacuteveis no DNA com implicaccedilotildees
na sua estrutura e acessibilidade da maquinaria de transcriccedilatildeo mas que natildeo envolvem
mutaccedilotildees rearranjos ou modificaccedilotildees na sequecircncia de bases do DNA Tais
modificaccedilotildees (ex metilaccedilatildeo de bases do DNA metilaccedilatildeo de histonas) satildeo herdaacuteveis
pela progecircnie e correspondem a qualquer informaccedilatildeo adicional imposta na sequecircncia de
DNA que possa afetar a expressatildeo gecircnica (Casadesus e Low 2006 Bird 2007)
A metilaccedilatildeo de adeninas do DNA eacute o mecanismo epigeneacutetico mais conhecido e
ocorre pela transferecircncia do grupo metil da S-adenosilmetionina (SAM) para a sexta
posiccedilatildeo de resiacuteduos de adenina (N6-metil-adenina ou m6A) por metilases de DNA
(Balleza et al 2009 Su et al 2016b) O estado metilado frequentemente estaacute
associado com repressatildeo da transcriccedilatildeo A ligaccedilatildeo de grupos metil ao DNA ocorre em
siacutetios-alvo especiacuteficos sendo que o padratildeo de metilaccedilatildeo pode variar entre ceacutelulas
(Casadesus e Low 2006) Em bacteacuterias a remoccedilatildeo da metilaccedilatildeo no DNA eacute
normalmente atingida por dois eventos de replicaccedilatildeo (Su et al 2016b)
A metilaccedilatildeo do DNA desempenha importantes papeacuteis na biologia bacteriana
Processos como o tempo de replicaccedilatildeo do DNA a divisatildeo dos cromossomos para as
ceacutelulas filhas o reparo do DNA e o tempo de transposiccedilatildeo e conjugaccedilatildeo de plasmiacutedeos
estatildeo sensiacuteveis aos estados de metilaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas no DNA Todos estes
eventos utilizam como sinal o estado de hemimetilaccedilatildeo da nova moleacutecula de DNA
sintetizada na qual uma das fitas natildeo estaacute metilada devido ao processo de replicaccedilatildeo
semiconservativa (Casadesus e Low 2006) Esta modificaccedilatildeo no DNA pode alterar
interaccedilotildees de proteiacutenas regulatoacuterias atraveacutes de um efeito esteacuterico direto ou por
modificaccedilatildeo da estrutura do DNA (Casadesus e Low 2006 Balleza et al 2009)
O fenocircmeno chamado de bi-estabilidade (bistability) ou variaccedilatildeo de fase (phase
variation) pode acontecer em populaccedilotildees bacterianas nas quais existem dois ou mais
estados fenotiacutepicos distintos controlados por mecanismos epigeneacuteticos com diferentes
niacuteveis de complexidade (Casadesus e Low 2013)
As metilases regulatoacuterias epigeneacuteticas parecem ser derivadas dos conhecidos
sistemas de restriccedilatildeomodificaccedilatildeo bacterianos Trata-se de um sistema de defesa da
ceacutelula contra sequecircncias de DNA externo ou mesmo viral os quais satildeo degradados
21 Introduccedilatildeo
pelas enzimas de restriccedilatildeo antes que possam ser metilados De fato a maioria das
metilases presentes em genomas bacterianos satildeo componentes desses sistemas poreacutem
as metilases epigeneacuteticas natildeo possuem uma enzima de restriccedilatildeo cognata sendo
chamadas de ldquooacuterfatildesrdquo (Casadesus e Low 2006)
Haacute ainda uma heranccedila epigeneacutetica natildeo relacionada ao material geneacutetico
realizada atraveacutes da transmissatildeo para as ceacutelulas-filhas de componentes celulares do
citoplasma da ceacutelula-matildee em cada ciclo de divisatildeo celular (Balleza et al 2009) Aleacutem
disso algumas espeacutecies bacterianas apresentam complexos eventos de diferenciaccedilatildeo
celular os quais alteram propriedades morfoloacutegicas e fisioloacutegicas da ceacutelula sem que a
sequecircncia do DNA seja alterada (Casadesus e Low 2013)
Em resumo populaccedilotildees bacterianas podem usar esses padrotildees de metilaccedilatildeo do
DNA herdados como uma memoacuteria de curto-prazo das condiccedilotildees metaboacutelicas
encontradas pela geraccedilatildeo anterior conferindo uma vantagem evolutiva para elas Dessa
forma se as ceacutelulas bacterianas podem guardar essa informaccedilatildeo acerca de experiecircncias
passadas podem usar essa memoacuteria para modular seu comportamento na atual condiccedilatildeo
em que se encontram (Casadesus e Low 2006 Wolf et al 2008)
112 Regulaccedilatildeo do teacutermino da transcriccedilatildeo e poacutes-transcricional
Aleacutem dos mecanismos regulatoacuterios no iniacutecio da transcriccedilatildeo existem tambeacutem
mecanismos que regulam o teacutermino da transcriccedilatildeo A maquinaria transcricional durante
seu processo de elongaccedilatildeo pode encontrar estruturas ou moleacuteculas regulatoacuterias que
possam desestabilizaacute-la podendo ocasionar uma terminaccedilatildeo prematura Uma vez que
em bacteacuterias os processos de transcriccedilatildeo e traduccedilatildeo estatildeo frequentemente acoplados
mecanismos de regulaccedilatildeo poacutes-transcricional podem rapidamente atuar no transcrito
nascente e exercerem seus efeitos A regulaccedilatildeo poacutes-transcricional vai depender
principalmente de dois fatores a estabilidade do mRNA ou seja sua meia-vida antes
que seja degradado e a capacidade do ribossomo em acessar e se ligar a sequecircncias
especiacuteficas no mRNA e consequentemente iniciar a traduccedilatildeo
22 Introduccedilatildeo
1121 Antiterminaccedilatildeo e atenuaccedilatildeo
Os mecanismos de terminaccedilatildeo da transcriccedilatildeo em procariotos podem ser
divididos em duas classes terminaccedilatildeo intriacutenseca que depende de estruturas em
sequecircncias especiacuteficas no DNA terminaccedilatildeo dependente da proteiacutena Rho que independe
de segmentos estruturados nas sequecircncias as quais se liga podendo terminar a
transcriccedilatildeo em diferentes siacutetios no genoma (Nudler e Gottesman 2002) Neste uacuteltimo
mecanismo a proteiacutena Rho se liga agraves suas sequecircncias especiacuteficas em forma de um
hexacircmetro e progride na direccedilatildeo 3rsquo do transcrito e assim que encontrar a RNAP em um
siacutetio de pausa aborta a transcriccedilatildeo e libera o transcrito (Henkin e Yanofsky 2002)
Como mencionado anteriormente os genes de um operon satildeo na maioria das
vezes transcritos com um mRNA policistrocircnico Poreacutem em algumas situaccedilotildees ocorre a
transcriccedilatildeo seletiva de genes do operon dirigida por promotores internos ou alternativos
ou pela formaccedilatildeo de uma regiatildeo de terminaccedilatildeo da transcriccedilatildeo interna Neste uacuteltimo
caso dois mecanismos podem ser utilizados pela ceacutelula antiterminaccedilatildeo quando a
transcriccedilatildeo acontece sem interrupccedilatildeo e atenuaccedilatildeo quando a transcriccedilatildeo eacute interrompida
(Marques 2012) A antiterminaccedilatildeo acontece quando a moleacutecula regulatoacuteria induz a
continuaccedilatildeo da transcriccedilatildeo sendo que na ausecircncia do ligante a terminaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo ocorreria Jaacute na atenuaccedilatildeo da transcriccedilatildeo ocorre o inverso ou seja sem a
moleacutecula regulatoacuteria a transcriccedilatildeo ocorreria normalmente poreacutem na sua presenccedila a
terminaccedilatildeo da transcriccedilatildeo eacute induzida (Gollnick e Babitzke 2002) Tais moleacuteculas
regulatoacuterias atuam em trans ligando-se ao mRNA alterando sua estrutura secundaacuteria e
favorecendo ou natildeo a formaccedilatildeo da estrutura de terminaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Gollnick e
Babitzke 2002)
Na terminaccedilatildeo intriacutenseca bacteriana um segmento do transcrito sendo
sintetizado pela RNAP forma uma estrutura secundaacuteria estaacutevel a qual iraacute afetar o
andamento da maquinaria de elongaccedilatildeo podendo gerar pausas Este mecanismo de
terminaccedilatildeo tambeacutem depende de uma sequecircncia rica em nucleotiacutedeos de uridina apoacutes a
estrutura secundaacuteria (Henkin e Yanofsky 2002 Nudler e Gottesman 2002) Aleacutem
dessas caracteriacutesticas a reaccedilatildeo eacute estimulada pela presenccedila de proteiacutenas adicionais
ligadas ao complexo de elongaccedilatildeo que regulam o andamento da RNAP sendo
especiacuteficas e se associando somente aos seus respectivos terminadores No mecanismo
de antiterminaccedilatildeo a accedilatildeo dessas proteiacutenas regulatoacuterias faz com que a transcriccedilatildeo natildeo
23 Introduccedilatildeo
acabe no terminador Um exemplo deste mecanismo ocorre nos operons que codificam
os RNAs ribossomais em E coli em que a antiterminaccedilatildeo eacute mediada pelo complexo de
proteiacutenas da famiacutelia Nus (Nudler e Gottesman 2002)
Alguns terminadores intriacutensecos chamados de atenuadores estatildeo localizados na
sequecircncia liacuteder do primeiro gene de um operon e controlam diretamente a eficiecircncia da
transcriccedilatildeo de genes a jusante (Yanofsky 2000) A formaccedilatildeo ou natildeo da estrutura
secundaacuteria pode determinar se aquela unidade transcricional seraacute transcrita No processo
de atenuaccedilatildeo da transcriccedilatildeo eacute regulada a capacidade da maquinaria transcricional de
passar por este terminador intriacutenseco localizado no iniacutecio (Marques 2012) O primeiro
relato de atenuaccedilatildeo da transcriccedilatildeo foi com o operon de genes relacionados com a
biossiacutentese do aminoaacutecido triptofano em E coli (Yanofsky 1981) Aleacutem disso outros
operons de biossiacutentese de aminoaacutecidos tambeacutem foram descritos como regulados por este
mecanismo sendo que a accedilatildeo deste siacutetio atenuador iraacute depender da concentraccedilatildeo do
aminoaacutecido especiacutefico na ceacutelula (Gollnick e Babitzke 2002)
O mecanismo de atenuaccedilatildeo da transcriccedilatildeo eacute uma estrateacutegia regulatoacuteria comum e
conservada entre genes ortoacutelogos de espeacutecies procarioacuteticas filogeneticamente distantes
(Henkin e Yanofsky 2002 Merino e Yanofsky 2005) Aleacutem disso a conservaccedilatildeo se
manteacutem independente da organizaccedilatildeo dos respectivos operons Tal fato sugere que
possa ter acontecido uma seleccedilatildeo positiva para este mecanismo de atenuaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo promovendo vantagens evolutivas Embora o mecanismo sensor de um
sinal metaboacutelico possa variar entre organismos a estrateacutegia de resposta foi conservada
(Merino e Yanofsky 2005) Uma das principais vantagens de regular a expressatildeo gecircnica
por estes mecanismos eacute que pequenas sequecircncias e estruturas no RNA podem mediar
decisotildees regulatoacuterias importantes (Henkin e Yanofsky 2002)
1122 Riboswitches
Uma das estrateacutegias de regulaccedilatildeo transcricional e poacutes-transcricional eacute a
utilizaccedilatildeo de elementos regulatoacuterios chamados riboswitches Estas estruturas satildeo
exclusivamente encontradas na regiatildeo agrave montante do coacutedon de iniacutecio de traduccedilatildeo na
chamada regiatildeo 5rsquo natildeo-traduzida (5rsquoUTR) a qual natildeo eacute codificante A regulaccedilatildeo eacute
baseada na percepccedilatildeo de diversos sinais intra e extracelulares tais como variaccedilotildees em
paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos ou na concentraccedilatildeo de determinada moleacutecula Ao contraacuterio
24 Introduccedilatildeo
dos fatores de transcriccedilatildeo proteicos e dos ncRNAs regulatoacuterios que atuam na regulaccedilatildeo
em trans os riboswitches estatildeo localizados no proacuteprio transcrito onde iratildeo atuar e
portanto atuam em cis (Winkler e Breaker 2005)
Estes elementos podem modular a expressatildeo da sequecircncia codificadora uma vez
que podem interferir na elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo na estabilidade do RNA e na eficaacutecia
da traduccedilatildeo do mRNA (Breaker 2011) O controle mediado pelo riboswitch pode
operar negativamente na formaccedilatildeo de um terminador transcricional inibindo a siacutentese
completa do transcrito ou inibir a traduccedilatildeo a partir da geraccedilatildeo de estruturas secundaacuterias
em sequecircncias importantes como no ribosome binding site (RBS) (sequecircncia Shine-
Dalgarno) e no coacutedon de iniacutecio da traduccedilatildeo Em outros casos sua accedilatildeo pode ser
positiva liberando as sequecircncias-chave para que a traduccedilatildeo possa ocorrer (Mandin et
al 2013)
Os riboswitches sensiacuteveis a paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos podem ser classificados
em responsivos a mudanccedilas na temperatura no pH e na forccedila iocircnica Os primeiros satildeo
chamados de elementos termossensores ou RNA termocircmetros e a estrutura de sua
regiatildeo 5rsquoUTR eacute afetada por mudanccedilas de temperatura devido a enovelamentos
alternativos que a moleacutecula pode assumir Dentre os RNAs termocircmetros estatildeo os
mRNAs dos genes rpoH e cspA os quais respondem ao choque por calor e por frio
respectivamente sendo encontrados em vaacuterias espeacutecies bacterianas Exemplos de outros
mRNAs que apresentam tais estruturas codificam proteiacutenas com atividade de
chaperonas ou de proteases que atuam sobre proteiacutenas desnaturadas pelo estresse
teacutermico (Mandin et al 2013 Sherwood e Henkin 2016)
O primeiro exemplo de riboswitch sensiacutevel a variaccedilotildees no pH foi o do mRNA do
gene alx de E coli (Nechooshtan et al 2009) que codifica para uma proteiacutena com
provaacutevel funccedilatildeo de transportador Em condiccedilotildees alcalinas aleacutem do aumento na
expressatildeo do gene alx o riboswitch sofre alteraccedilatildeo conformacional e a traduccedilatildeo da
proteiacutena Alx eacute aumentada Jaacute um exemplo de riboswitch que eacute modulado por variaccedilotildees
na concentraccedilatildeo de iacuteons eacute a M-box a qual responde a Mg+2 e eacute encontrada em genes
codificadores de proteiacutenas transportadoras deste iacuteon Em baixa concentraccedilatildeo de
magneacutesio a M-box forma uma alccedila antiterminadora permitindo a transcriccedilatildeo do gene agrave
jusante Com a ligaccedilatildeo do iacuteon ao riboswitch a M-box sofre uma mudanccedila de
conformaccedilatildeo e sequestra a porccedilatildeo da alccedila antiterminadora aleacutem de formar um
terminador resultando na inibiccedilatildeo da expressatildeo destes genes (Ramesh e Winkler 2010)
25 Introduccedilatildeo
Os riboswitches que interagem com ligantes podem ser classificados em trecircs
categorias de acordo com o tipo do ligante proteiacutena RNA ou metaboacutelitos (Winkler e
Breaker 2005 Mandin et al 2013) Os elementos mais simples em sequecircncia e
estrutura satildeo aqueles que se ligam a fatores proteicos enquanto que os riboswitches que
ligam metaboacutelitos apresentam caracteriacutesticas mais complexas de sequecircncia e estrutura
sendo tambeacutem mais diversos (Winkler e Breaker 2005) Geralmente os metaboacutelitos se
ligam a riboswitches de mRNAs que codificam proteiacutenas de vias de sua proacutepria
biossiacutentese eou transporte ou vias nas quais eles satildeo utilizados Dentre os riboswitches
mais comuns desta classe estatildeo os que ligam purinas aminoaacutecidos c-di-GMP
vitaminas eou cofatores (adenosilcobalamina tiamina pirofosfato flavina
mononucleotideo ou FMN e S-adenosilmetionina) Aleacutem disso jaacute foi descrita a
presenccedila de mais de um riboswitch no mesmo mRNA organizados in tandem e
responsivos a diferentes metaboacutelitos (Breaker 2011 Mandin et al 2013 Sherwood e
Henkin 2016)
Outra importante classe de riboswitch eacute daquelas que ligam tRNAs as chamadas
T-boxes (Gutierrez-Preciado et al 2009) Estes elementos interagem com tRNAs e
apresentam conformaccedilotildees alternativas dependendo se o tRNA estaacute ligado ou natildeo ao
seu respectivo resiacuteduo aminoacil A interaccedilatildeo entre a T-box e seu tRNA envolve uma
sequecircncia especiacutefica dentro da T-box e o anticoacutedon do tRNA Quando haacute uma interaccedilatildeo
com um tRNA carregado ocorre a formaccedilatildeo de uma heacutelice terminadora e consequente
parada da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo ou oclusatildeo do RBS caso o tRNA natildeo esteja
carregado ocorre a interaccedilatildeo desta heacutelice com a extremidade 3rsquo livre do tRNA
desestabilizando-a e fazendo com que a transcriccedilatildeo ou traduccedilatildeo possam continuar
(Gutierrez-Preciado et al 2009 Mandin et al 2013) Mais de 90 destes elementos
precedem sequecircncias codificando para aminoacil-tRNA-sintetases e proteiacutenas
relacionadas ao metabolismo de aminoaacutecidos (Gutierrez-Preciado et al 2009) As T-
boxes atuam principalmente na regulaccedilatildeo da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo mas tambeacutem
podem em alguns casos atuar na regulaccedilatildeo da traduccedilatildeo do gene-alvo T-boxes que
regulam a terminaccedilatildeo da transcriccedilatildeo satildeo mais comuns em bacteacuterias Gram-positivas com
baixo conteuacutedo G+C enquanto que T-boxes que controlam o iniacutecio da traduccedilatildeo
predominam em Gram-positivas com alto conteuacutedo G+C e em bacteacuterias Gram-negativas
(nas quais a regulaccedilatildeo por T-box eacute menos comum) (Vitreschak et al 2008)
26 Introduccedilatildeo
Um riboswitch eacute composto de dois domiacutenios distintos O primeiro corresponde a
um aptacircmero evolutivamente conservado quanto a sua sequecircncia e estrutura o qual
corresponde ao siacutetio de ligaccedilatildeo especiacutefico para determinado metaboacutelito Seu
comprimento pode variar de cerca de 70 a 200 nucleotiacutedeos O segundo eacute um domiacutenio
funcional conhecido por plataforma de expressatildeo localizado logo apoacutes o aptacircmero
Suas sequecircncias estrutura e tamanho satildeo mais diversas entre as diferentes classes de
riboswitches Em resumo quando o ligante se liga ao aptacircmero mudanccedilas
conformacionais ocorrem na plataforma de expressatildeo exercendo assim a regulaccedilatildeo da
expressatildeo dos genes presentes no mRNA (Winkler e Breaker 2003 Breaker 2011
Sherwood e Henkin 2016)
Outra correlaccedilatildeo evolutiva entre tipos de riboswitches estaacute na observaccedilatildeo que
bacteacuterias Gram-positivas tendem a apresentar riboswitches atuantes na atenuaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo enquanto que bacteacuterias Gram-negativas teriam maior ocorrecircncia de
riboswitches que controlam o iniacutecio da traduccedilatildeo Entretanto tal afirmaccedilatildeo pode ser
complicada pela ocorrecircncia de eventos de transferecircncia horizontal de genes e operons
ou de duplicaccedilatildeo no mesmo genoma Uma vez que a regulaccedilatildeo baseada em riboswitch
natildeo exige outros fatores para atuar sua funcionalidade apoacutes transferecircncia horizontal eacute
completamente possiacutevel (Vitreschak et al 2004)
1123 RNAs natildeo codificadores
Genomas bacterianos satildeo bastante compactos quanto ao seu tamanho e seu
nuacutemero de genes apresentando alta densidade gecircnica e regiotildees intergecircnicas mais curtas
e menos frequentes do que genomas eucarioacuteticos Mesmo assim eacute crescente a descriccedilatildeo
de novos RNAs natildeo-codificadores (ncRNAs) bacterianos que satildeo normalmente
transcritos a partir de regiotildees intergecircnicas Em E coli os ncRNAs satildeo geralmente
monocistrocircnicos possuindo seu proacuteprio promotor e terminador de transcriccedilatildeo
intriacutenseco Os ncRNAs atuam como reguladores da transcriccedilatildeo da traduccedilatildeo ou da
estabilidade de RNAs-alvo aleacutem de ligarem-se a proteiacutenas regulatoacuterias (Storz et al
2011 Mandin et al 2013)
Os primeiros RNAs regulatoacuterios descobertos em E coli foram o 45S 6S
tmRNA RNase P e Spot42 sendo todos relativamente muito abundantes (Mandin et al
2013) O primeiro relato de determinaccedilatildeo da funccedilatildeo de um ncRNA foi a descoberta de
27 Introduccedilatildeo
um RNA em E coli complementar agrave regiatildeo 5rsquoUTR do mRNA de ompF resultando na
inibiccedilatildeo de sua traduccedilatildeo (Mizuno et al 1984)
Os ncRNAs bacterianos satildeo relativamente pequenos variando entre 50-500
nucleotiacutedeos (Mandin et al 2013 Ternan 2013) Satildeo divididos em duas classes
aqueles que atuam em mRNAs e aqueles que se ligam a proteiacutenas Os ncRNAs formam
duplex com seus mRNAs-alvo a partir de um pareamento de bases imperfeito sendo
tambeacutem importante a sua estrutura secundaacuteria Aleacutem disso atuam em mRNAs
codificados em loci distantes no genoma caracterizando uma atuaccedilatildeo em trans (Mandin
et al 2013) O nuacutemero de ncRNAs varia com o tamanho do genoma sendo que
genomas maiores exigem maior complexidade na regulaccedilatildeo gecircnica O genoma de E
coli possui cerca de 4000 genes e 50 a 100 ncRNAs preditos (Gottesman 2004)
Alguns ncRNAs necessitam de uma proteiacutena chaperona acessoacuteria para serem
capazes de desempenhar suas funccedilotildees A mais estudada e amplamente conhecida eacute a
proteiacutena Hfq que parece ser exigida para a accedilatildeo da maioria dos ncRNAs em seus
mRNAs-alvo principalmente para estabilizar o pareamento de bases imperfeito entre
eles (Vogel e Luisi 2011) Hfq tem alta afinidade por RNA fita simples rico em
adeninas e uracilas e geralmente se liga em regiotildees no ncRNA que natildeo possuem
estrutura secundaacuteria Aleacutem disso foi demonstrado que a maioria dos ncRNAs perdem
estabilidade em ceacutelulas mutantes para o gene codificando Hfq sugerindo que ela os
protege da degradaccedilatildeo por RNases (De Lay et al 2013) Entretanto nem todos os
genomas bacterianos conteacutem um gene homoacutelogo para Hfq Mesmo quando ele estaacute
presente jaacute foi visto sendo dispensaacutevel para a atuaccedilatildeo de alguns ncRNAs Uma hipoacutetese
possiacutevel eacute que Hfq natildeo seria exigida quando a interaccedilatildeo ncRNA e seus mRNAs-alvo
fosse muito forte (Jousselin et al 2009)
Assim como os outros elementos regulatoacuterios os ncRNAs podem exercer um
efeito negativo ou positivo sobre o seu alvo A maioria deles pareia com o mRNA em
uma regiatildeo sobrepondo ou proacuteximo ao RBS sendo que o duplex impede o acesso do
ribossomo e portanto inibindo a traduccedilatildeo (Wagner e Romby 2015) O mRNA fica
entatildeo desprotegido da accedilatildeo de RNases as quais devem ser recrutadas ativamente
Acredita-se que a proteiacutena Hfq possa ter um papel nesse recrutamento (De Lay et al
2013 Mandin et al 2013)
Por outro lado poucos exemplos de regulaccedilatildeo positiva mediada por ncRNA tecircm
sido descritos (Wagner e Romby 2015) Estes RNAs tambeacutem podem atuar na ativaccedilatildeo
28 Introduccedilatildeo
da traduccedilatildeo eou aumentando a estabilidade de seus mRNA alvos A accedilatildeo na ativaccedilatildeo se
daacute pelo deslocamento de um elemento inibitoacuterio interno contido na regiatildeo 5rsquoUTR do
mRNA-alvo Muitas vezes esta inibiccedilatildeo eacute resultado da formaccedilatildeo de uma estrutura
secundaacuteria no mRNA devido agrave complementaridade de bases entre duas regiotildees Na
ausecircncia do ncRNA a estrutura previne o acesso do ribossomo ao RBS inibindo a
traduccedilatildeo Quando ocorre a ligaccedilatildeo do ncRNA agrave esta estrutura o ribossomo eacute entatildeo
capaz de acessar as sequecircncias de ligaccedilatildeo ao DNA e dar iniacutecio agrave traduccedilatildeo Com a
traduccedilatildeo em andamento a presenccedila de ribossomos protege o mRNA da accedilatildeo de RNases
aumentando indiretamente a sua estabilidade (Mandin et al 2013) Em resumo
ncRNAs podem exercer efeitos globais na expressatildeo gecircnica muitas vezes equiparando-
se agrave capacidade regulatoacuteria de fatores de transcriccedilatildeo proteicos sedimentando sua
importacircncia na fisiologia bacteriana (Ternan 2013 Wagner e Romby 2015)
Aleacutem de validaccedilotildees experimentais e prediccedilotildees in silico da presenccedila de ncRNAs
diversos bancos de dados e ferramentas computacionais tecircm sido criados contendo
informaccedilotildees que podem ser rapidamente acessadas e analisadas Um dos mais antigos eacute
o Rfam o qual conteacutem famiacutelias de ncRNAs representadas por alinhamentos muacuteltiplos e
prediccedilotildees de estrutura secundaacuteria (Griffiths-Jones et al 2003 Burge et al 2013)
Diversos outros bancos de dados de ncRNAs foram criados tais como fRNAdb (Kin et
al 2007) sRNAMap (Huang et al 2009) sRNAdb (Pischimarov et al 2012) entre
outros Li e colaboradores desenvolveram um banco de dado chamado BSRD o qual
afirma conter nove vezes mais sRNAs (small RNAs) validados experimentalmente do
que os outros Aleacutem disso foi integrada ao banco uma plataforma de anaacutelise de dados
de RNA-Seq chamada sRNADeep o que permite caracterizar sRNAs a partir de dados
de transcritomas obtidos por sequenciamento em larga escala (Li et al 2013)
1124 RNAs anti-senso
Aleacutem dos ncRNAs transcritos a partir de regiotildees intergecircnicas diversos estudos
tecircm observado a presenccedila de eventos de transcriccedilatildeo de ncRNAs em regiotildees anti-senso a
regiotildees codificadoras jaacute descritas Estes RNAs anti-senso (asRNA) exercem sua accedilatildeo
regulatoacuteria nos seus respectivos genes da fita oposta agrave regiatildeo de onde foram transcritos
apresentando perfeita complementaridade aos seus alvos gerando interaccedilotildees mais
estaacuteveis (Georg e Hess 2011 Mandin et al 2013 Sesto et al 2013) Tal regulaccedilatildeo eacute
29 Introduccedilatildeo
considerada em cis uma vez que o asRNA atua proacuteximo de onde eacute sintetizado e
consequentemente fornece uma resposta de regulaccedilatildeo muito mais raacutepida Alguns
asRNAs respondem a mudanccedilas ambientais podendo sofrer alteraccedilotildees na sua expressatildeo
sob certas condiccedilotildees Tambeacutem haacute relatos sobre efeitos regulatoacuterios mediados por
asRNAs relevantes para a virulecircncia e patogenicidade bacteriana (Georg e Hess 2011
Mandin et al 2013)
Com o avanccedilo das tecnologias de sequenciamento de RNA um grande nuacutemero
de asRNAs tem sido descrito em uma ampla variedade de espeacutecies microbianas Os
asRNAs podem ser classificados de acordo com a sua localizaccedilatildeo sobrepondo agrave regiatildeo
5rsquo sobrepondo agrave regiatildeo 3rsquo ou localizados internamente na unidade transcricional senso
Seus tamanhos podem variar de pequenos 100 a 300 nucleotiacutedeos a muito mais longos
de 700 a 3500 nucleotiacutedeos (Georg e Hess 2011 Sesto et al 2013)
Os asRNAs podem exercer sua accedilatildeo na estabilidade traduccedilatildeo e transcriccedilatildeo de
suas moleacuteculas-alvo A interaccedilatildeo de um asRNA com seu mRNA alvo pode alterar a
estrutura secundaacuteria de ambas as moleacuteculas ao formar um RNA dupla-fita Estas
mudanccedilas alteram a estabilidade e meia-vida dos RNAs e podem resultar na degradaccedilatildeo
completa de ambos por RNases especiacuteficas (Georg e Hess 2011 Sesto et al 2013)
Entretanto em outros casos asRNAs tambeacutem satildeo capazes de proteger seus mRNAs-
alvos da degradaccedilatildeo a partir da sua interaccedilatildeo (Sesto et al 2013) O pareamento do
asRNA com seu mRNA alvo tambeacutem pode ocluir os siacutetios de ligaccedilatildeo ao ribossomo
inibindo a traduccedilatildeo (Georg e Hess 2011)
Os asRNAs podem ainda interferir com a transcriccedilatildeo do RNA senso em razatildeo
de um evento de colisatildeo entre dois complexos de elongaccedilatildeo da RNA polimerase que
sejam convergentes e em fitas opostas resultando na terminaccedilatildeo prematura de um ou
ambos os eventos de transcriccedilatildeo (Sesto et al 2013) Outros mecanismos possiacuteveis para
esta interferecircncia seriam por oclusatildeo do promotor quando ocorre uma repressatildeo
exercida por um complexo de iniacutecio de transcriccedilatildeo na formaccedilatildeo de outro complexo a
montante e em direccedilatildeo oposta ou pela dissociaccedilatildeo de um complexo aberto pela colisatildeo
com outro complexo de elongaccedilatildeo vindo na direccedilatildeo oposta antes que a primeira
polimerase possa proceder na elongaccedilatildeo (Georg e Hess 2011 Mandin et al 2013)
Aleacutem da interferecircncia na transcriccedilatildeo asRNAs podem atuar na terminaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo sendo que os mecanismos de interferecircncia e atenuaccedilatildeo podem ocorrer
simultaneamente (Sesto et al 2013) Aleacutem de regular genes codificadores de proteiacutenas
30 Introduccedilatildeo
asRNAs tambeacutem podem sobrepor-se e afetar a expressatildeo de pequenos ncRNAs (Sesto
et al 2013)
Apesar de todos os trabalhos descreverem a accedilatildeo em cis de asRNAs baseado na
sua perfeita complementaridade com seus alvos um estudo realizado com
Staphylococcus aureus descreveu um asRNA atuando em trans na inibiccedilatildeo da traduccedilatildeo
de seu mRNA-alvo (Sayed et al 2011)
1125 Regulaccedilatildeo da estabilidade do transcrito
A instabilidade metaboacutelica eacute uma das principais caracteriacutesticas de moleacuteculas de
mRNA (Mackie 2013) A degradaccedilatildeo eacute um grande componente do metabolismo geral
de RNAs e desempenha um importante papel em regular os seus niacuteveis intracelulares
(Deutscher 2006) De modo geral a meia-vida de um mRNA bacteriano eacute de poucos
minutos desde a sua transcriccedilatildeo ateacute a degradaccedilatildeo
A estabilidade de cada mRNA eacute uacutenica dependendo principalmente da funccedilatildeo
da proteiacutena que codifica sendo determinada pela combinaccedilatildeo de caracteriacutesticas de sua
sequecircncia de possiacuteveis estruturas secundaacuterias da eficiecircncia na traduccedilatildeo e de sua
possiacutevel ligaccedilatildeo a moleacuteculas regulatoacuterias (Mackie 2013) Como jaacute mencionado a
ligaccedilatildeo de proteiacutenas ou pequenos RNAs regulatoacuterios em seus respectivos siacutetios pode
estimular ou inibir a degradaccedilatildeo do mRNA-alvo A presenccedila de ribossomos tambeacutem
interfere na estabilidade de mRNAs uma vez que podem ocluir siacutetios de
reconhecimento de RNases Entretanto sabe-se que o acuacutemulo de mRNAs pode natildeo
significar uma super-produccedilatildeo das proteiacutenas codificadas uma vez que mesmo
quimicamente estabilizados os mRNAs podem estar funcionalmente inativados por
algum repressor traducional por um asRNA ou por motivos estruturais que obstruem
os siacutetios de iniacutecio da traduccedilatildeo (Regnier e Arraiano 2000)
A degradaccedilatildeo de RNAs eacute catalisada por RNases sendo que existem diversas
RNases bacterianas com funccedilotildees especiacuteficas e eficiecircncia variaacutevel permitindo uma
degradaccedilatildeo seletiva de RNAs (Mackie 2013) Geralmente os mRNAs satildeo degradados
inicialmente por clivagem endonucleoliacutetica seguida de clivagens adicionais do mRNA
em fragmentos menores culminando com a remoccedilatildeo de nucleotiacutedeos terminais por
exonucleases 3rsquo5rsquo (Regnier e Arraiano 2000 Deutscher 2006 Condon 2007)
Dentre as diversas RNases presentes em E coli a endonuclease RNase E eacute a principal
31 Introduccedilatildeo
responsaacutevel pela clivagem da maioria dos RNAs da ceacutelula atuando atraveacutes de um
complexo multienzimaacutetico chamado degradossomo (De Lay et al 2013 Mackie
2013) A RNase E tem como preferecircncia moleacuteculas de RNA-alvo que apresentem uma
extremidade 5rsquo monofosforilada acessiacutevel aleacutem de exigir no miacutenimo quatro
nucleotiacutedeos em fita-simples na extremidade 5rsquo para se ligar eficientemente (Condon
2007 Mackie 2013) Esta preferecircncia impede que esta enzima degrade RNAs intactos
os quais apresentam um trifosfato na extremidade 5rsquo Sua accedilatildeo tambeacutem cliva ligaccedilotildees
fosfodieacutester em regiotildees ricas em adeninas e uracilas gerando extremidades 3ʹ-OH e 5ʹ-
monofosfato nas moleacuteculas-alvo (Misra e Apirion 1979 Deutscher 2006) Entretanto
outra via menos comum independente da extremidade 5rsquo monofosforilada tambeacutem
pode ser usada na degradaccedilatildeo de mRNAs e no processamento de tRNAs e neste caso
outra ribonuclease realiza o corte no interior do mRNA permitindo em seguida a accedilatildeo
da RNase E (Mackie 2013)
A concentraccedilatildeo e atividade de RNase E estaacute sujeita a uma complexa regulaccedilatildeo
A autorregularatildeo combina a disponibilidade de seu proacuteprio mRNA agrave concentraccedilatildeo de
seus substratos na ceacutelula (Sousa et al 2001) Quando a atividade de RNase E excede a
demanda para processamento e degradaccedilatildeo de RNA a siacutentese de seu mRNA eacute
interrompida e ele se torna o proacuteprio alvo preferencial para a degradaccedilatildeo regulando a
concentraccedilatildeo de RNase E Aleacutem da autorregulaccedilatildeo a modulaccedilatildeo da atividade de RNase
E pode ser realizada por proteiacutenas regulatoacuterias as quais respondem a mudanccedilas nas
condiccedilotildees de crescimento de forma a modificar sua atividade tanto globalmente como
contra determinado grupo de mRNAs Assim que a condiccedilatildeo normal eacute reestabelecida a
autorregulaccedilatildeo pode voltar a operar (Mackie 2013) Aleacutem de reguladores proteicos a
atividade de RNase E tambeacutem pode ser regulada atraveacutes da accedilatildeo de ncRNAs (Morita et
al 2005 Storz et al 2011 Vogel e Luisi 2011) A funccedilatildeo inicial dos ncRNAs eacute a
inibiccedilatildeo do iniacutecio da traduccedilatildeo poreacutem a degradaccedilatildeo do alvo eacute consequecircncia da
inatividade do transcrito (Condon 2007) A chaperona de RNA Hfq atua no processo de
regulaccedilatildeo de duas maneiras distintas ela pode se ligar agrave RNase E em seguida a um
ncRNA e direcionar o complexo para o mRNA-alvo ou ela primeiramente facilita a
interaccedilatildeo e formaccedilatildeo do duplex entre o ncRNA e mRNA-alvo sendo entatildeo
posteriormente reconhecido pela RNase E (De Lay et al 2013 Mackie 2013)
Outras RNases tambeacutem desempenham funccedilotildees especiacuteficas com diferentes
mecanismos de accedilatildeo embora com atuaccedilotildees menores como as endonucleases RNase G
32 Introduccedilatildeo
RNase III RNase P RNase I e oligoribonucleases (Condon e Putzer 2002 Condon
2007) A RNase G apresenta a porccedilatildeo cataliacutetica homoacuteloga a da RNase E apresentando
substratos e propriedades enzimaacuteticas muito similares a dela (Condon e Putzer 2002)
A RNase III cliva RNAs que contenham estruturas secundaacuterias e tambeacutem autorregula
sua expressatildeo pela induccedilatildeo da degradaccedilatildeo de seus proacuteprios mRNAs estando ausente em
arqueias (Regnier e Arraiano 2000 Condon e Putzer 2002) A RNase P eacute uma
ribozima responsaacutevel por gerar uma extremidade 5rsquo madura em todos os tRNAs e de
catalisar clivagens de alguns poucos mRNAs (Condon e Putzer 2002 Esakova e
Krasilnikov 2010) A RNase I eacute uma nuclease que degrada RNAs livres no ambiente
sendo encontrada exclusivamente no espaccedilo periplasmaacutetico de alfa- e gama-
proteobacteacuterias (Condon e Putzer 2002) E as oligorribonucleases satildeo responsaacuteveis por
converterem produtos de oligoribonucleotiacutedeos da uacuteltima fase da degradaccedilatildeo de
mRNAs em monoribonucleotiacutedeos (Mackie 2013)
A extremidade 3rsquo de mRNAs bacterianos eacute protegida do ataque de exonucleases
devido a estruturas secundaacuterias sendo na maioria dos casos um terminador de
transcriccedilatildeo independente de Rho Apoacutes a clivagem pelas endonucleases novas
extremidades 3rsquo desprotegidas satildeo geradas e podem entatildeo ser degradadas por
exorribonucleases As principais exorribonucleases atuando em mRNAs de E coli satildeo
RNase II PNPase e RNase R (Condon 2007) A RNase II degrada apenas RNAs fita-
simples sendo completamente inibida por estruturas secundaacuterias As outras duas
degradam RNAs com estruturas secundaacuterias embora seja dependente da presenccedila de
uma cauda poli(A) na extremidade 3rsquo a qual foi sintetizada pela poli(A) polimerase
(PAP1) com a ajuda da Hfq (Condon 2007) Juntas as atividades hidroliacutetica da RNase
II e fosforoliacutetica da PNPase geram oligorribonucleotiacutedeos di e monofosfatados
respectivamente (Regnier e Arraiano 2000) PNPases satildeo mais um exemplo de
autorregulaccedilatildeo da expressatildeo de seus proacuteprios mRNAs induzindo sua proacutepria
degradaccedilatildeo em casos de excesso (Regnier e Arraiano 2000) Os oligoribonucleotiacutedeos
gerados durante a degradaccedilatildeo de RNAs satildeo degradados por oligoribonucleases (Ghosh e
Deutscher 1999) Nenhuma exonuclease com habilidade de degradar extremidades 5rsquo
de mRNAs foi identificada em bacteacuterias Na ausecircncia de tal enzima sugere-se que a
degradaccedilatildeo no sentido 5rsquo3rsquo seria devido a vaacuterias clivagens endonucleoliacuteticas 5rsquo3rsquo
as quais geram extremidades 3rsquo livres que satildeo entatildeo degradadas por exonucleases
3rsquo5rsquo (Regnier e Arraiano 2000)
33 Introduccedilatildeo
As RNases tambeacutem satildeo capazes de realizar a maturaccedilatildeo ou processamento de
precursores de rRNAs e tRNAs (Mackie 2013) Em ceacutelulas em crescimento a
estabilidade dos rRNAs parece ser uma consequecircncia de sua incorporaccedilatildeo em
ribossomos e proteccedilatildeo por proteiacutenas ribossomais (Deutscher 2003) No caso de tRNAs
a presenccedila de estruturas secundaacuterias e terciaacuterias lhes confere resistecircncia agrave accedilatildeo de
RNases aleacutem da associaccedilatildeo com aminoacil-tRNA sintetases fatores de elongaccedilatildeo e
ribossomos (Deutscher 2003) Tais RNAs estaacuteveis natildeo satildeo geralmente degradados
durante o crescimento exponencial embora em certas condiccedilotildees (estresses tratamento
com agentes toacutexicos) a degradaccedilatildeo dessas moleacuteculas ocorreraacute Em condiccedilotildees de
escassez de nutrientes ou em fase estacionaacuteria estes RNAs podem ser degradados para
serem utilizados como nutrientes para a ceacutelula (Deutscher 2003) A degradaccedilatildeo de
RNAs estaacuteveis tambeacutem envolve clivagens endonucleoliacuteticas iniciais seguida por
digestatildeo exonucleoliacutetica dos fragmentos resultantes similar ao que acontece com os
mRNAs sendo que as mesmas RNases participam em ambos os processos (Regnier e
Arraiano 2000 Deutscher 2006)
113 Mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular em bacteacuterias
A capacidade de bacteacuterias em sobreviver e se adaptar a um ambiente em
constante mudanccedila e sob os mais variados tipos de estresses lhes confere grande
vantagem evolutiva sendo que desenvolveram complexos sistemas de sinalizaccedilatildeo
celular para gerar respostas adaptativas ao seu ambiente (Parkinson 1993) Para tal as
bacteacuterias satildeo capazes de perceber a condiccedilatildeo atual do ambiente transmitir a informaccedilatildeo
para o interior da ceacutelula e desencadear uma resposta geralmente refletida em mudanccedilas
na expressatildeo gecircnica
O mecanismo inicia-se com a percepccedilatildeo do estiacutemulo ambiental seguida do
processamento do sinal O estiacutemulo pode ser um fenocircmeno fiacutesico-quiacutemico como
temperatura e osmolaridade ou a disponibilidade de diferentes moleacuteculas no ambiente
como nutrientes ou agentes toacutexicos aleacutem da percepccedilatildeo da densidade populacional
(Waters e Bassler 2005 Beier e Gross 2006) A percepccedilatildeo do estiacutemulo pode ser
sentida diretamente no citoplasma ou por ser um sinal fiacutesico-quiacutemico ou por conseguir
atravessar membranas celulares Outros satildeo percebidos indiretamente por meio de
proteiacutenas localizadas na membrana que recebem o sinal e transferem a mensagem para o
34 Introduccedilatildeo
interior da ceacutelula Muitas vezes nem sempre eacute o estiacutemulo em si que desencadeia a
maquinaria de sinalizaccedilatildeo mas o efeito que ele causa (Parkinson 1993 Stock et al
2000)
Um dos sistemas de transduccedilatildeo de sinal mais encontrado e utilizado em bacteacuterias
eacute o sistema de dois componentes (Parkinson 1993 Hoch 2000 Beier e Gross 2006)
Nesse sistema a proteiacutena sensora apresenta um domiacutenio funcional com atividade de
proteiacutena-quinase que ao perceber o estiacutemulosinal se autofosforila em um resiacuteduo de
histidina pela transferecircncia do fosfato de uma moleacutecula de ATP (Hoch 2000 Stock et
al 2000) A transmissatildeo da informaccedilatildeo continua com a transferecircncia do grupo fosfato
da proteiacutena sensora para um resiacuteduo de aspartato no regulador de resposta A
fosforilaccedilatildeo do regulador de resposta altera sua atividade um estado que eacute mantido ateacute
sua desfosforilaccedilatildeo que pode ser autocatalisada ou por outras proteiacutenas com atividade
de fosfatase (Parkinson 1993 Hoch 2000 Stock et al 2000 Beier e Gross 2006) Em
alguns sistemas de dois componentes a transferecircncia do grupo fosfato da proteiacutena
sensora para o regulador de resposta pode envolver proteiacutenas intermediaacuterias Aleacutem
disso a maioria dos reguladores de resposta satildeo fatores de transcriccedilatildeo com domiacutenios de
ligaccedilatildeo ao DNA desencadeando mudanccedilas na expressatildeo gecircnica de seus genes-alvo
(Parkinson 1993 Stock et al 2000) ou satildeo proteiacutenas com atividade enzimaacutetica
regulada pela fosforilaccedilatildeo (Galperin 2004 Beier e Gross 2006)
Sistemas de dois componentes podem sofrer sobreposiccedilatildeo uma vez que mais de
uma histidina-quinase pode interagir com o mesmo regulador de resposta e vice-versa
gerando competiccedilatildeo eou diaacutelogo (cross-talk) entre eles Poreacutem a afinidade da quinase
pelo seu regulador cognato eacute sempre maior sendo geralmente codificados em um
mesmo operon Haacute correlaccedilatildeo positiva entre o nuacutemero de sistemas de dois componentes
e o tamanho do genoma Da mesma forma bacteacuterias de vida livre tambeacutem codificam
mais sistemas de dois componentes do que bacteacuterias que habitam ambientes mais
controlados (por exemplo patoacutegenos que habitam o interior de seus hospedeiros) uma
vez que necessitam de uma maior versatilidade metaboacutelica (Beier e Gross 2006)
O sistema de transduccedilatildeo tambeacutem pode variar na forma como transmite a
mensagem Alguns sistemas transmitem a informaccedilatildeo utilizando pequenas moleacuteculas
intermediaacuterias chamadas segundo-mensageiros que somente geraratildeo a resposta quando
atingirem determinada concentraccedilatildeo Este tipo de transmissatildeo de informaccedilatildeo pode
atingir vaacuterios sistemas simultaneamente uma vez que a moleacutecula sinalizadora pode ser
35 Introduccedilatildeo
identificada por vaacuterias proteiacutenas Dentre os principais segundo-mensageiros bacterianos
estatildeo trecircs derivados de nucleotiacutedeos cAMP ou cGMP ppGpp e c-diGMP (Gorke e
Stulke 2008 Hauryliuk et al 2015 Hengge et al 2016)
O mecanismo de regulaccedilatildeo por repressatildeo cataboacutelica no qual haacute a participaccedilatildeo de
cAMP merece ser detalhado O termo foi pela primeira vez cunhado no iniacutecio da
deacutecada de 1960 (Magasanik 1961) Trata-se de um sistema no qual a ceacutelula opta por
utilizar primeiramente uma fonte de carbono mais facilmente metabolizada do que
outra sendo a glicose o monossacariacutedeo preferencial na maioria dos casos Um exemplo
de genes sujeitos a tal regulaccedilatildeo eacute o operon lac (Jacob e Monod 1961) Enquanto
houver glicose no meio ela seraacute primariamente utilizada e os genes para a utilizaccedilatildeo de
lactose natildeo seratildeo plenamente transcritos mesmo na presenccedila de lactose Quando toda a
glicose for consumida o operon passa a ser plenamente transcrito e as enzimas para
utilizaccedilatildeo da lactose seratildeo produzidas A papel do cAMP eacute o de se ligar ao ativador da
transcriccedilatildeo do operon lac A repressatildeo cataboacutelica tambeacutem age da mesma forma sobre
outros operons que utilizam outras fontes de carbono como aqueles relacionados ao uso
de galactose arabinose e maltose todos tambeacutem regulados por cAMP (Gorke e Stulke
2008) Aleacutem disso a repressatildeo cataboacutelica tem papel importante na expressatildeo de genes
de virulecircncia uma vez que tais genes podem proporcionar agrave bacteacuteria o acesso a novas
fontes de nutrientes Entretanto algumas bacteacuterias patogecircnicas natildeo possuem tal
mecanismo enquanto outras realizam a chamada repressatildeo cataboacutelica reversa na qual a
glicose natildeo eacute a fonte de carbono preferencial (Gorke e Stulke 2008) Um exemplo eacute a
utilizaccedilatildeo preferencial de acetato e outros intermediaacuterios do ciclo do aacutecido tricarboxiacutelico
como fonte de carbono e energia em Pseudomonas aeruginosa (Collier et al 1996)
Mecanismos de sinalizaccedilatildeo e sistemas de dois componentes tambeacutem satildeo usados
no controle da densidade da populaccedilatildeo bacteriana O processo chamado de sinalizaccedilatildeo
por percepccedilatildeo de quoacuterum (quorum sensing) eacute baseado na percepccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
pequenas moleacuteculas secretadas para o meio extracelular por ceacutelulas da populaccedilatildeo
(Waters e Bassler 2005) sendo a concentraccedilatildeo destas moleacuteculas diretamente
proporcional ao aumento do nuacutemero de ceacutelulas Os genes que satildeo alvos de mecanismos
de percepccedilatildeo de quoacuterum satildeo distintos nas diferentes espeacutecies bacterianas podendo
envolver genes relacionados agrave virulecircncia (toxinas mobilidade produccedilatildeo de antibioacuteticos
biofilme exopolissacariacutedeos etc) e a outros aspectos da fisiologia da ceacutelula
36 Introduccedilatildeo
(morfologia de colocircnias produccedilatildeo de pigmentos competecircncia esporulaccedilatildeo etc) (Hoch
2000)
12 Meacutetodos de anaacutelise de transcritomas
Diversos meacutetodos foram desenvolvidos para anaacutelise parcial ou completa de
transcritomas os quais apresentam caracteriacutesticas proacuteprias quanto ao grau de
dificuldade para realizaccedilatildeo acuraacutecia e rendimento (throughput) quanto a quantidade de
genes que podem ser analisados simultaneamente Enquanto alguns meacutetodos
possibilitam a anaacutelise de um nuacutemero reduzido de genes por vez outros podem descrever
o perfil transcricional global de um organismo isto eacute descrever o repertoacuterio completo
de moleacuteculas de RNA presentes na ceacutelula em determinada fase de crescimento ou em
uma condiccedilatildeo ambiental particular As anaacutelises de transcritomas completos tambeacutem satildeo
utilizadas para definir os genes que fazem parte de regulons e stimulons
Ateacute o advento da teacutecnica de PCR o estudo de um nuacutemero limitado de genes de
sequecircncias previamente conhecidas era realizado com meacutetodos baseados em
hibridizaccedilatildeo de aacutecidos nucleicos como Northern Blot e ensaios de proteccedilatildeo contra
RNases (VanGuilder et al 2008) que requerem quantidades significativas de RNA
total (gt10microg) O surgimento da PCR tornou possiacutevel a quantificaccedilatildeo da abundacircncia de
transcritos de interesse previamente convertidos em cDNA com o meacutetodo denominado
RT-PCR (PCR precedido por transcriccedilatildeo reversa) que embora tenha boa sensibilidade
permitindo a detecccedilatildeo de mRNAs pouco abundantes e utilize menores quantidades de
RNA total (~1microg) eacute um meacutetodo semi-quantitativo (Sellner e Turbett 1998) O
aprimoramento desta metodologia veio com o surgimento do qPCR (PCR quantitativo
em tempo real) que uma vez precedido de transcriccedilatildeo reversa (RT-qPCR) possibilita a
quantificaccedilatildeo relativa ou absoluta de transcritos com alta sensibilidade e especificidade
(Schmittgen et al 2000 VanGuilder et al 2008) Frequentemente o meacutetodo de RT-
qPCR eacute utilizado na validaccedilatildeo de anaacutelises de expressatildeo gecircnica globais para confirmar
variaccedilotildees na expressatildeo de genes mais importantes ou mais interessantes (Canales et al
2006)
A primeira abordagem de maior rendimento para anaacutelise de transcritomas foi o
sequenciamento das extremidades 3rsquo e 5rsquo de cDNAs gerando-se sequecircncias de 100 a
37 Introduccedilatildeo
800 pb denominadas de ESTs (Expressed Sequence Tags) Este recurso foi amplamente
utilizado na anaacutelise de transcritomas eucarioacuteticos pelo sequenciamento de clones de
bibliotecas de cDNA geradas pela transcriccedilatildeo reversa de mRNAs poliadenilados ainda
que limitado pela ausecircncia de sequecircncias de porccedilotildees internas dos transcritos (Adams et
al 1991 Nagaraj et al 2006) Esta limitaccedilatildeo foi contornada por um protocolo
alternativo chamado ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags) o
qual acopla uma etapa de PCR agraves preparaccedilotildees de cDNA com o objetivo de enriquecer
em sequecircncias de regiotildees codificadoras dos cDNAs (Dias Neto et al 2000) Estrateacutegias
de normalizaccedilatildeo envolvendo hibridizaccedilatildeo subtrativa de bibliotecas de cDNA satildeo
empregadas para facilitar a detecccedilatildeo de transcritos raros (Bonaldo et al 1996) O perfil
de expressatildeo gecircnica de ceacutelulas ou tecidos pode ser comparado a partir da anaacutelise de
abundacircncia relativa de ESTs se as bibliotecas de cDNA natildeo forem normalizadas
(Gruber 2007) ainda que tais anaacutelises sejam limitadas quanto a sua precisatildeo quando
comparadas a outras metodologias para anaacutelise de transcritomas como os microarranjos
de DNA e o RNA-Seq que seratildeo apresentados a seguir
121 Microarranjos de DNA
Os microarranjos de DNA permitem a quantificaccedilatildeo da abundacircncia relativa de
dezenas de milhares de RNAs transcritos em diferentes ceacutelulas ou tecidos submetidos
ou natildeo a condiccedilotildees ou tratamentos de interesse Como o nome sugere os microarranjos
contecircm fragmentos de DNA de sequecircncias conhecidas (sondas) imobilizados em uma
superfiacutecie soacutelida (lacircminas de vidro ou quartzo) em um arranjo de milhares de pontos
ordenados espacialmente (Schena et al 1995 Dharmadi e Gonzalez 2004 Slonim e
Yanai 2009) Assim como a teacutecnica de Northern blot a teacutecnica dos microarranjos
baseia-se na hibridizaccedilatildeo de moleacuteculas de aacutecidos nucleicos complementares (Dharmadi
e Gonzalez 2004) Assim os RNAs satildeo purificados de ceacutelulas e utilizados como
moldes para siacutentese de cDNAs fluorescentes (marcados com fluoroacuteforos acoplados aos
dNTPs) que satildeo entatildeo utilizados para hibridizaccedilatildeo no microarranjo Por fim um
escaneamento eacute realizado e o sinal de intensidade da luz emitida pelo fluoroacuteforo em
cada ponto do microarranjo eacute registrado e valor obtido eacute utilizado na determinaccedilatildeo da
abundacircncia de cada alvo (transcrito) na amostra de RNA (Dharmadi e Gonzalez 2004
Clarke e Zhu 2006 Malone e Oliver 2011)
38 Introduccedilatildeo
O conjunto de sondas eacute desenvolvido com base na sequecircncia genocircmica ou de
transcritos (cDNAs) do organismo em estudo Inicialmente as sondas eram geradas por
PCR gerando fragmentos de 200 a 500 pares de bases que eram depositados em lacircminas
de vidro (Schena et al 1995) Atualmente as sondas satildeo oligonucleotiacutedeos sinteacuteticos
de 50-80 bases (Dharmadi e Gonzalez 2004) constituindo os chamados oligoarrays
que podem representar sequecircncias genocircmicas completas como nos tilling arrays
possibilitando a verificaccedilatildeo do niacutevel de expressatildeo de qualquer regiatildeo do genoma
independentemente de conter ou natildeo um gene predito (Filiatrault 2011)
As amostras que teratildeo seus niacuteveis de expressatildeo comparados podem ser
hibridizadas separadamente cada uma em um microarranjo (single-color ou single-
channel) ou juntas em um mesmo (two-color ou two-channel) em funccedilatildeo da marcaccedilatildeo
do cDNA com um ou dois fluoroacuteforos distintos (Moreau et al 2003 Slonim e Yanai
2009) No primeiro caso a intensidade do sinal de hibridizaccedilatildeo eacute usada para determinar
a concentraccedilatildeo das moleacuteculas-alvo (quantificaccedilatildeo absoluta) (Moreau et al 2003) No
segundo caso iraacute ocorrer uma hibridizaccedilatildeo competitiva das duas amostras marcadas
eliminando a variabilidade teacutecnica que aconteceria em duas hibridizaccedilotildees distintas e
permitindo uma comparaccedilatildeo direta entre as amostras em uma uacutenica hibridizaccedilatildeo
(Moreau et al 2003 Altman e Hua 2006)
Diversos fatores podem influenciar na reprodutibilidade de experimentos de
microarranjos entre eles o desenho experimental inadequado diferenccedilas no tipo de
microarranjo utilizado e variaccedilotildees na sensibilidade dos scanners a laser (Irizarry et al
2005) Aleacutem disso a teacutecnica de microarranjos apresenta outras limitaccedilotildees incluindo
baixa acuraacutecia das mediccedilotildees de expressatildeo especialmente para transcritos pouco
abundantes em virtude da fluorescecircncia de fundo (background) que pode ocorrer
dependendo das condiccedilotildees de hibridizaccedilatildeo empregadas Recomenda-se que sejam
observadas as especificaccedilotildees do MIAME (Minimum Information about a Microarray
Experiment) que fornece um guia para anotaccedilatildeo de microarranjos incluindo o desenho
experimental desenho do microarranjo detalhes das amostras e tratamentos condiccedilotildees
de hibridizaccedilatildeo medidas e controles de normalizaccedilatildeo de modo a garantir que os dados
obtidos possam ser reproduzidos eou comparados (Brazma et al 2001 Moreau et al
2003)
A comparaccedilatildeo de intensidades de fluorescecircncia de um dado ponto do
microarranjo resultante da hibridizaccedilatildeo com duas amostras distintas resulta na obtenccedilatildeo
39 Introduccedilatildeo
da ldquorazatildeo de expressatildeordquo (fold change) o que reflete diretamente a abundacircncia relativa
do respectivo transcrito nessas amostras A determinaccedilatildeo final das intensidades do sinal
de fluorescecircncia leva em conta o sinal especiacutefico produzido pelo transcrito-alvo
marcado o sinal de hibridizaccedilatildeo-cruzada e o sinal de fundo natildeo-especiacutefico (Zhao et al
2014) Os dois uacuteltimos sinais interferentes dificultam a detecccedilatildeo de genes pouco
expressos Por outro lado transcritos muito abundantes tendem a saturar o sinal
complicando a detecccedilatildeo de variaccedilotildees nos niacuteveis destes mRNAs entre amostras distintas
(Dharmadi e Gonzalez 2004)
A padronizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas eacute de extrema importacircncia para comparar
dados de microarranjos O uso de testes t e ANOVAs cortes de p-valor correccedilotildees
Bonferroni normalizaccedilotildees e cortes de fold change devem ser escolhidos
cuidadosamente Mudanccedilas nos paracircmetros de niacuteveis de significacircncia dos genes
diferencialmente expressos e do corte de fold change podem levar a diferentes
interpretaccedilotildees de dados de microarranjos (Dalman et al 2012) Normalizaccedilotildees dos
dados brutos satildeo utilizadas para controlar ou eliminar a variaccedilatildeo teacutecnica dentro de um
estudo (Slonim e Yanai 2009) Aleacutem disso um experimento de microarranjo deve
incluir pelo menos trecircs reacuteplicas bioloacutegicas e teacutecnicas de modo a estimar com adequado
poder estatiacutestico a significacircncia das mudanccedilas observadas (Lee et al 2000 Clarke e
Zhu 2006) bem como avaliar a probabilidade de variaccedilotildees ao acaso ou devido a
artefatos da teacutecnica (Dharmadi e Gonzalez 2004)
Embora se recomende que resultados de experimentos de microarranjos devam
ser validados por outros meacutetodos distintos como Northern blot ou RT-qPCR (Dharmadi
e Gonzalez 2004 Clarke e Zhu 2006) deve-se atentar que microarranjos podem
subestimar em ateacute uma ordem de grandeza os valores de razatildeo de expressatildeo
determinados por RT-qPCR (Conway e Schoolnik 2003 Moreau et al 2003) Aleacutem
disso em comparaccedilotildees entre experimentos de microarranjos e de proteocircmica a
abundacircncia de transcritos nem sempre reflete os niacuteveis da proteiacutena correspondente
especialmente no caso de eventos poacutes-transcricionais Resultados de anaacutelises
proteocircmicas com geacuteis bi-dimensionais podem subestimar o nuacutemero total de
proteiacutenasgenes induzidos em 2 a 4 vezes comparativamente aos microarranjos
Entretanto na maioria dos casos os niacuteveis de transcriccedilatildeo e de proteiacutenas correlacionam-
se (Conway e Schoolnik 2003)
40 Introduccedilatildeo
A teacutecnica de microarranjos de DNA foi muito utilizada em estudos de
transcritocircmica em bacteacuterias Como exemplos citamos os estudos de Oshima e
colaboradores (Oshima et al 2002) e de Han e colaboradores (Han et al 2004) que
empregaram microarranjos construiacutedos com amplicons de todas as ORFs anotadas nos
genomas No primeiro caso os microarranjos de DNA foram empregados para avaliar o
perfil transcricional de 36 mutantes de sistemas de dois-componentes em E coli sob
uma uacutenica condiccedilatildeo de cultivo possibilitando a identificaccedilatildeo de redes de interaccedilatildeo e
regulaccedilatildeo cruzada entre diferentes sistemas de dois componentes O segundo estudo
analisou as mudanccedilas de expressatildeo do patoacutegeno Yersinia pestis em resposta a variaccedilatildeo
de 26degC para 37degC que satildeo valores de temperatura que a bacteacuteria enfrenta no seu ciclo
de vida em seus hospedeiros naturais evidenciando um aumento da expressatildeo de genes
relacionados a fatores de virulecircncia reguladores transcricionais proacutefagos entre outros
Mais recentemente estudos de transcritomas utilizando tiling arrays e principalmente
RNA-Seq tecircm contribuiacutedo substancialmente para compreensatildeo da complexidade
plasticidade e da regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em procariotos (Sorek e Cossart 2010)
122 RNA-Seq
A tecnologia denominada RNA-Seq (Sequenciamento de RNA) consiste no
sequenciamento de todos os transcritos de uma ceacutelula utilizando abordagens de
sequenciamento de DNA de alto-desempenho (Nagalakshmi et al 2010 Malone e
Oliver 2011 Wolf 2013 Zhao et al 2014) coletivamente denominadas plataformas
de sequenciamento de uacuteltima geraccedilatildeo (NGS Next-Generation Sequencing) (Mardis
2008)
O RNA-Seq substitui plenamente a teacutecnica de microarranjos na descriccedilatildeo de
transcritomas completos apresentando vantagens como menor custo e menor
complexidade experimental (Mardis 2008 Mortazavi et al 2008 Morozova et al
2009) Aleacutem disso RNA-Seq natildeo depende do conhecimento preacutevio da sequecircncia do
genoma o que eacute relevante na confecccedilatildeo dos microarranjos (Malone e Oliver 2011
Mutz et al 2013 Zhao et al 2014) Aleacutem disso alguns problemas e vieses
encontrados na teacutecnica de microarranjos satildeo evitados como diferenccedilas na eficiecircncia das
sondas e hibridizaccedilatildeo-cruzada eou natildeo-especiacutefica (Balleza et al 2009 Nagalakshmi et
al 2010 Wolf 2013 Zhao et al 2014) Entretanto assim como qualquer outra
41 Introduccedilatildeo
teacutecnica a anaacutelise de transcritomas por RNA-Seq tambeacutem eacute vulneraacutevel a erros e vieses
derivados de uma eventual baixa cobertura do sequenciamento ou da ambiguidade no
processo de mapeamento das sequecircncias ao genoma de referecircncia
A cobertura do sequenciamento ou seja quantas sequecircncias devem ser obtidas
por amostra para efetivamente contemplar todo o transcritoma incluindo genes com
baixa expressatildeo eacute uma das questotildees importantes (Wang et al 2009 Malone e Oliver
2011 Wolf 2013) Em geral quanto maior o genoma mais complexo eacute seu
transcritoma e uma maior profundidade de sequenciamento eacute necessaacuteria para uma
cobertura adequada (Wang et al 2009) Aleacutem disso eacute possiacutevel observar uma
heterogeneidade das sequecircncias atraveacutes de uma regiatildeo expressa ou seja a profundidade
de sequenciamento ao longo do comprimento do transcrito pode variar Cobertura e
heterogeneidade natildeo satildeo problemas em microarranjos uma vez que as sondas usadas
satildeo conhecidas (Malone e Oliver 2011) Outro problema que pode ser encontrado na
anaacutelise de dados de RNA-Seq eacute a ambiguidade de mapeamento das sequecircncias em
muacuteltiplos locais do genoma sendo principalmente devido agrave presenccedila de genes paraacutelogos
e regiotildees repetitivas (Wang et al 2009 Wolf 2013) Sequenciamento com a estrateacutegia
de paired-end ajuda a mapear cada sequecircncia no seu correto local no genoma (Wang et
al 2009)
Alguns estudos realizaram a comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos com o
microarranjos de DNA e RNA-Seq Zhao e colaboradores (Zhao et al 2014)
encontraram alta sobreposiccedilatildeo entre os resultados de ambas as tecnologias em
experimentos com ceacutelulas T humanas embora tambeacutem tenham observado genes uacutenicos
em cada uma delas Um nuacutemero maior de genes foi encontrado utilizando a estrateacutegia
de RNA-Seq sendo mais sensiacutevel em detectar genes com expressatildeo muito baixa Aleacutem
disso foi observada uma maior acuraacutecia na medida da expressatildeo de genes muito
abundantes enquanto que em microarranjos pode ocorrer saturaccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo
nestes casos impossibilitando uma quantificaccedilatildeo confiaacutevel (Marioni et al 2008 Zhao
et al 2014) O mesmo foi encontrado em um estudo com Drosophila pseudoobscura
no qual foi encontrada alta congruecircncia nos resultados de expressatildeo de microarranjos e
de RNA-Seq com o mesmo vieacutes em transcritos com baixa expressatildeo (Malone e Oliver
2011) Nookaew e colaboradores realizaram tal comparaccedilatildeo entre tecnologias com a
levedura Saccharomyces cerevisiae e tambeacutem encontraram boa concordacircncia em
relaccedilatildeo agrave quantificaccedilatildeo relativa da expressatildeo gecircnica (Nookaew et al 2012)
42 Introduccedilatildeo
Aleacutem da aplicaccedilatildeo principal que eacute a quantificaccedilatildeo da abundacircncia relativa de
transcritos novos genes podem ser descobertos com a tecnologia de RNA-Seq
incluindo pequenos ncRNAs (Morozova et al 2009 Sorek e Cossart 2010 Malone e
Oliver 2011 Nookaew et al 2012 Mutz et al 2013 Wolf 2013) Melhorar e corrigir
a anotaccedilatildeo de genomas e identificar as sequecircncias das regiotildees natildeo-traduzidas (UTRs)
nas extremidades 5rsquo e 3rsquo dos transcritos tambeacutem satildeo aplicaccedilotildees importantes desta
tecnologia (Wang et al 2009 Nagalakshmi et al 2010 Sorek e Cossart 2010
Nookaew et al 2012 Mutz et al 2013) Em organismos eucarioacuteticos dados gerados
por RNA-Seq podem ser utilizados para definir a expressatildeo alelo-especiacutefica mapear
fronteiras eacutexoniacutentron e determinar variantes de splicing (Wang et al 2009 Nookaew
et al 2012 Mutz et al 2013 Zhao et al 2014)Outra aplicaccedilatildeo do RNA-Seq eacute a
capacidade de definir os siacutetios de iniacutecio de transcriccedilatildeo (Transcription Start Sites TSS)
(Wang et al 2009 Filiatrault 2011 Ozsolak e Milos 2011) O mapeamento das TSSs
aprimora a definiccedilatildeo dos transcritos e permite a caracterizaccedilatildeo de regiotildees promotoras
que regulam a expressatildeo de cada um deles (Sorek e Cossart 2010 Ozsolak e Milos
2011) Um dos primeiros meacutetodos de mapeamento de TSSs em larga escala foi o Cap
Analysis of Gene Expression (CAGe) (Shiraki et al 2003) Poreacutem esta tecnologia
exige elevada quantidade de RNA e gera apenas sequecircncias curtas para cada TSS
(Ozsolak e Milos 2011)
Dados de RNA-Seq tambeacutem contribuem para compreender a estrutura de
operons bacterianos e a regulaccedilatildeo da expressatildeo dos genes constituintes (Sorek e
Cossart 2010 Filiatrault 2011) A prediccedilatildeo derivada da anotaccedilatildeo de genomas eacute
geralmente baseada na ocorrecircncia de uma curta distacircncia entre genes consecutivos
conservaccedilatildeo da ordem dos genes em organismos relacionados e na identificaccedilatildeo de
associaccedilatildeo funcional entre os genes da vizinhanccedila A detecccedilatildeo da expressatildeo de
transcritos policistrocircnicos que incluem ou natildeo sequecircncias de determinados genes do
operon satildeo informaccedilotildees valiosas para o entendimento da regulaccedilatildeo e da plasticidade de
transcritomas procarioacuteticos (Sorek e Cossart 2010)
Qualquer plataforma de sequenciamento de alto-desempenho pode ser utilizada
em experimentos de RNA-Seq ainda que o meacutetodo de preparo de bibliotecas e o
processo de sequenciamento variem entre elas (Mardis 2008) A preparaccedilatildeo de
bibliotecas para sequenciamento inicia-se com a extraccedilatildeo da amostra de RNA total sem
qualquer contaminante e mantendo-se a integridade dessas moleacuteculas (Nagalakshmi et
43 Introduccedilatildeo
al 2010 Malone e Oliver 2011 Wolf 2013) Uma vez que a fraccedilatildeo de mRNAs pode
corresponder a apenas 1ndash5 do RNA total em ceacutelulas procarioacuteticas eacute fundamental que
seja realizada o enriquecimento desta fraccedilatildeo minoritaacuteria de RNAs atraveacutes da depleccedilatildeo
dos abundantes rRNAs (Sorek e Cossart 2010 Malone e Oliver 2011 Wolf 2013) O
enriquecimento pode ser feito por captura dos rRNAs ou hibridizaccedilatildeo subtrativa com
utilizaccedilatildeo de sondas que correspondem a posiccedilotildees conservadas nos rRNAs 16S e 23S
degradaccedilatildeo seletiva de RNAs monofofosrilados na extremidade 5rsquo por exonucleases
poliadenilaccedilatildeo seletiva de mRNAs e captura de RNAs que estatildeo associados com
determinada proteiacutena (ex chaperona de RNA Hfq) com emprego de anticorpo
especiacutefico (Sorek e Cossart 2010 Filiatrault 2011)
Apoacutes a etapa de enriquecimento o RNA eacute fragmentado convertido em cDNA
dupla-fita por transcriccedilatildeo reversa e adaptadores satildeo incorporados por PCR agraves
extremidades dos cDNAs (Malone e Oliver 2011 Wolf 2013) Apoacutes quantificaccedilatildeo e
normalizaccedilatildeo das bibliotecas de fragmentos procede-se o sequenciamento que na
maioria dos estudos atuais eacute realizado na plataforma Illumina a partir de uma uacutenica
extremidade (estrateacutegia single-end) ou a partir de ambas (estrateacutegia paired-end)
(Fullwood et al 2009 Malone e Oliver 2011 Ozsolak e Milos 2011 Wolf 2013)
O sequenciamento por paired-end tag (PET) eacute uma das estrateacutegias para melhorar
a eficiecircncia do sequenciamento de DNA e auxiliar na montagem Neste tipo de
protocolo sequecircncias curtas e pareadas das duas extremidades de fragmentos de DNA
satildeo extraiacutedas e covalentemente ligadas formando construccedilotildees ditag para efeito do
sequenciamento de alto-desempenho e mapeamento no genoma de referecircncia A
distacircncia entre as duas extremidades pode ser usada para relacionar contigs em
montagens de genomas incluindo regiotildees contendo repeticcedilotildees (Fullwood et al 2009)
Apoacutes o sequenciamento os dados brutos de sinais de fluorescecircncia registrados
em diversas imagens devem ser convertidos em sequecircncias de bases em um processo
realizado pelas proacuteprias plataformas de sequenciamento utilizando algoritmos de
identificaccedilatildeo de base (base calling) do fabricante Um escore de qualidade para cada
base eacute calculado indicando a confiabilidade de cada base identificada Todos os dados
de saiacuteda das plataformas satildeo no formato padratildeo FASTQ embora o caacutelculo do escore de
qualidade difira entre elas (Mutz et al 2013) Tal processamento dos dados eacute
importante para reduzir os erros nas anaacutelises de imagem e identificaccedilatildeo de base
podendo remover sequecircncias de baixa-qualidade (Wang et al 2009)
44 Introduccedilatildeo
Apoacutes a obtenccedilatildeo das sequecircncias (reads) seguem-se anaacutelises bioinformaacuteticas e
estatiacutesticas que incluem verificaccedilatildeo da qualidade das sequecircncias com o software
FastQC (Wolf 2013) e eventual remoccedilatildeo de bases com escores de qualidade abaixo do
esperado (quality trimming) Tambeacutem eacute fundamental avaliar a reprodutibilidade das
reacuteplicas bioloacutegicas e teacutecnicas dos transcritomas obtidos atraveacutes de anaacutelises de
correlaccedilatildeo Experimentos de RNA-Seq tecircm se mostrado altamente reprodutiacuteveis
evidenciando ser uma teacutecnica robusta e confiaacutevel (Wang et al 2009 Nagalakshmi et
al 2010)
As sequecircncias obtidas com os dados de RNA-Seq podem ser tanto mapeadas
contra um genoma ou transcritos de referecircncia ou ser utilizadas em uma montagem de
novo para reconstruccedilatildeo dos transcritos (Wang et al 2009 Sorek e Cossart 2010
Grabherr et al 2011 Malone e Oliver 2011 Nookaew et al 2012 Mutz et al 2013
Wolf 2013) Entretanto problemas na montagem podem existir dificultando a
reconstruccedilatildeo de todos os transcritos a partir de sequecircncias curtas devido a erros de
sequenciamento e diferenccedilas na cobertura de cada transcrito ao longo de todo o seu
comprimento (Grabherr et al 2011) Em ambas as estrateacutegias de anaacutelise a contagem de
sequecircncias mapeadas em um dado transcrito fornece uma medida da sua abundacircncia ou
niacutevel de expressatildeo gecircnica (Mortazavi et al 2008 Wolf 2013) Nookaew e
colaboradores compararam ambas as estrateacutegias entre si e com a tecnologia de
microarranjos Os resultados das anaacutelises estatiacutesticas para obtenccedilatildeo de genes
diferencialmente expressos mostraram boa concordacircncia em todas as abordagens
utilizadas nas comparaccedilotildees A mesma concordacircncia foi observada quando os genes
diferencialmente expressos foram funcionalmente categorizados levando a conclusotildees
bioloacutegicas similares (Nookaew et al 2012)
Devido agraves diferenccedilas nos comprimentos dos transcritos em uma amostra de
biblioteca os transcritos mais longos teratildeo mais fragmentos representando-os nos
transcritomas Dessa forma foi proposta a medida de densidade da sequecircncia por
RPKM (Reads per kilobase per million mapped reads) ou FPKM (Fragments per
kilobase of transcript per million fragments mapped) as quais refletem a concentraccedilatildeo
molar de um transcrito na amostra inicial a partir da normalizaccedilatildeo pelo seu
comprimento e pelo nuacutemero total de sequecircncias no transcritoma (Mortazavi et al
2008) Esta normalizaccedilatildeo eacute utilizada para comparar a expressatildeo de genes dentro do
mesmo transcritoma natildeo sendo necessaacuteria em comparaccedilotildees do mesmo transcrito entre
45 Introduccedilatildeo
diferentes transcritomas Nas comparaccedilotildees entre duas amostras outro importante
aspecto de normalizaccedilatildeo eacute controlar as diferenccedilas na profundidade e qualidade do
sequenciamento (Wolf 2013)
Muitos meacutetodos de anaacutelise foram desenvolvidos para identificar genes
diferencialmente expressos atraveacutes de diferentes modelos estatiacutesticos (Nookaew et al
2012) Para dados de RNA-Seq o mais adequado eacute tratar pela distribuiccedilatildeo binomial
negativa (Wolf 2013) Vaacuterios pacotes de software satildeo utilizados para realizar a anaacutelise
de expressatildeo diferencial com diferentes abordagens modelos e eficiecircncias edgeR
(Robinson et al 2010) Cuffdiff (Trapnell et al 2010) DESeq (Anders e Huber 2010)
e DESeq2 (Love et al 2014) baySeq (Hardcastle e Kelly 2010) NOISeq (Tarazona et
al 2011) entre outros Nookaew e colaboradores realizaram uma comparaccedilatildeo de todos
estes meacutetodos de anaacutelise estatiacutestica de dados de RNA-Seq encontrando resultados
consistentes entre eles Foi observado que o edgeR identificou mais genes
diferencialmente expressos do que os outros meacutetodos na mesma condiccedilatildeo e mesmo cut-
off o que pode significar menos controle de erros do tipo 1 ou seja maior presenccedila de
falsos negativos em relaccedilatildeo agrave hipoacutetese nula (de que as mudanccedilas observadas satildeo ao
acaso) (Nookaew et al 2012) Esse mesmo estudo comparou os genes diferencialmente
expressos nos dados de RNA-Seq com os identificados em anaacutelises de microarranjos
evidenciando boa concordacircncia entre as duas tecnologias Com as listas de genes
diferencialmente expressos categorias funcionais devem ser definidas para cada um
sendo a categorizaccedilatildeo por Gene Ontology (GO) uma das mais utilizadas (Ashburner et
al 2000 Gene Ontology Consortium 2004)
A tecnologia de RNA-Seq tambeacutem possibilita obter informaccedilatildeo da fita de DNA
que foi transcrita por meio de meacutetodos alternativos de preparaccedilatildeo de bibliotecas de
fragmentos de cDNA (Wang et al 2009 Sorek e Cossart 2010 Filiatrault 2011
Ozsolak e Milos 2011) Tais meacutetodos envolvem a ligaccedilatildeo de diferentes adaptadores em
orientaccedilatildeo conhecida relativa agraves extremidades 5rsquo e 3rsquo dos transcritos ou agraves moleacuteculas da
primeira-fita dos cDNAs (Levin et al 2010 Ozsolak e Milos 2011) Outra abordagem
depende em marcar uma fita com uma modificaccedilatildeo quiacutemica tanto no proacuteprio RNA ou
durante a siacutentese da segunda fita de cDNA seguida de degradaccedilatildeo da fita natildeo marcada
(Parkhomchuk et al 2009 Levin et al 2010 Ozsolak e Milos 2011) Esta estrateacutegia
de sequenciamento com informaccedilatildeo de fita permite detectar eventos de transcriccedilatildeo anti-
senso a algum gene anotado determinar a fita em que ncRNAs foram transcritos
46 Introduccedilatildeo
demarcar corretamente as fronteiras de genes adjacentes transcritos em fitas opostas e
corrigir os niacuteveis de expressatildeo de transcritos que se sobrepotildeem (Wang et al 2009
Levin et al 2010 Sorek e Cossart 2010 Ozsolak e Milos 2011)
Outras duas importantes aplicaccedilotildees do RNA-Seq satildeo a metatranscritocircmica e o
transcritoma de uma uacutenica ceacutelula A metatranscritocircmica visa a descriccedilatildeo do perfil de
expressatildeo de comunidades microbianas complexas (Sorek e Cossart 2010 Filiatrault
2011) Jaacute a anaacutelise do transcritoma de uma uacutenica ceacutelula permite um melhor
entendimento da heterogeneidade transcricional de ceacutelulas presentes em uma populaccedilatildeo
bacteriana (Sorek e Cossart 2010 Tang et al 2011) Tal estrateacutegia pode ajudar a
entender como ceacutelulas respondem individualmente a sinais ambientais A
heterogeneidade da expressatildeo gecircnica pode ser devido a diferenccedilas no status epigeneacutetico
de seu genoma ciclo celular microambiente ou nicho entre outros fatores Ceacutelulas
individuais podem ser selecionadas manualmente por microdissecccedilatildeo por laser ou
separaccedilatildeo por fluorescecircncia (Tang et al 2011)
Uma estrateacutegia alternativa interessante ao RNA-Seq eacute o chamado
sequenciamento direto de RNA (Direct RNA Sequencing DRS) o qual realiza o
sequenciamento de moleacuteculas de RNA diretamente sem a preacutevia siacutentese de cDNA ou a
necessidade de passos de ligaccedilatildeo e amplificaccedilatildeo A reaccedilatildeo de sequenciamento por
siacutentese eacute realizada usando uma polimerase modificada e anaacutelogos de nucleotiacutedeos
(chamados de Virtual Terminator ou VT) os quais contecircm um marcador fluorescente e
grupos quiacutemicos que podem ser clivados e que permitem o sequenciamento (Ozsolak et
al 2009) As vantagens deste meacutetodo satildeo as quantidades muito pequenas de RNA
exigidas e a eliminaccedilatildeo de vieses introduzidos no processo de preparaccedilatildeo das
bibliotecas de fragmentos em experimentos de RNA-Seq convencional (Ozsolak et al
2009)
A maioria das anaacutelises de transcritomas completos visa obter o perfil
transcricional momentacircneo em condiccedilotildees variadas eou avaliar a expressatildeo diferencial
em resposta a distintos estiacutemulos Estudos de transcritoma tambeacutem estatildeo sendo
utilizados para comparar como linhagens ou espeacutecies proximamente relacionadas
respondem a determinadas condiccedilotildees ou estiacutemulos evidenciando respostas
transcricionais relevantes para sua adaptaccedilatildeo a ambientes distintos e que eventualmente
incluem a expressatildeo de potenciais fatores de virulecircncia (Filiatrault 2011)
47 Introduccedilatildeo
13 Aspectos da biologia de Xylella fastidiosa
Xylella fastidiosa eacute um importante fitopatoacutegeno pertencente ao grupo de
bacteacuterias Gram-negativas da classe Gammaproteobacteria famiacutelia Xanthomonadaceae
(Wells et al 1987 Hopkins 1989) As ceacutelulas de X fastidiosa tecircm formato de
bastonete (Almeida e Nunney 2015) com diacircmetro entre 025 e 050 microm e comprimento
que pode variar entre 10 a 40 microm Suas colocircnias satildeo geralmente circulares com bordas
lisas ou rugosas Apresenta crescimento lento no cultivo in vitro com tempo de
duplicaccedilatildeo que varia entre 9 e 55 horas dependendo do meio de cultivo A sua
temperatura oacutetima de crescimento in vitro eacute entre 26degC e 28degC (Davis et al 1978
Davis et al 1981 Wells et al 1987 Hopkins 1989) Embora classificada como
aeroacutebia obrigatoacuteria foi verificado que dependendo do meio de cultivo essa bacteacuteria se
comporta com anaeroacutebia facultativa (Shriner e Andersen 2014) X fastidiosa coloniza
dois ambientes muito distintos o luacutemen dos vasos do xilema de seus hospedeiros
vegetais natildeo sendo capaz de colonizar outros tecidos da planta e o aparelho bucal de
insetos sugadores de seiva do xilema (Chatterjee et al 2008)
X fastidiosa eacute considerada um fitopatoacutegeno generalista em razatildeo da ampla gama
de hospedeiros em que jaacute foi encontrada A lista atualizada da EFSA (European Food
Safety Authority)1 inclui 359 espeacutecies de plantas de 240 gecircneros e 75 famiacutelias botacircnicas
como hospedeiros naturais eou experimentais de X fastidiosa (EFSA 2016) Contudo
a hipoacutetese eacute que a gama de hospedeiros dessa bacteacuteria poderia aumentar com o
surgimento de novas cepas de X fastidiosa em decorrecircncia de eventos de recombinaccedilatildeo
geneacutetica transferecircncia horizontal de genes e infecccedilatildeo por bacterioacutefagos (Nunney et al
2012 Jacques et al 2016)
Muitos destes hospedeiros vegetais natildeo exibem sintomas quando colonizados
por X fastidiosa e satildeo ditos resistentes agrave infecccedilatildeo nesses casos X fastidiosa pode ser
considerada um endofiacutetico (Chatterjee et al 2008) Por outro lado vaacuterias espeacutecies satildeo
altamente suscetiacuteveis agrave infecccedilatildeo por X fastidiosa nas quais causa doenccedilas de extrema
gravidade como a Clorose Variegada dos Citros (CVC) (Rossetti et al 1990 Chang et
al 1993) Doenccedila de Pierce das videiras (PD) (Hopkins e Purcell 2002) e a Siacutendrome
do Raacutepido Decliacutenio das Oliveiras (OQDS) (Cariddi et al 2014) Exemplos de outras
1 httpswwwefsaeuropaeuenpressnews160209
48 Introduccedilatildeo
doenccedilas associadas agrave infecccedilatildeo por X fastidiosa satildeo as escaldaduras de folha de
ameixeira (plum PLS-plum) amendoeira (ALS) cafeeiro (CLS) pessegueiro (PLS-
peach) oleandro ou espirradeira (OLS) amoreira cerejeira carvalho sabugueiro e
hibisco (Hopkins e Purcell 2002 Chatterjee et al 2008 Janse e Obradovic 2010)
A literatura reporta a existecircncia de especificidade entre cepas de X fastidiosa e
espeacutecies do hospedeiro vegetal que colonizam (Almeida et al 2008 Prado et al 2008
Killiny e Almeida 2011) Aleacutem disso mesmo espeacutecies relacionadas tecircm
comportamentos distintos em relaccedilatildeo agrave Xylella Por exemplo entre as espeacutecies de citros
Citrus sinensis (laranjeira doce) eacute mais suscetiacutevel a CVC enquanto que outras espeacutecies
(C reticulata C limonia C limon C medica e C grandis) apresentam sintomas
moderados ou satildeo resistentes agrave infecccedilatildeo (Rossetti e De Negri 1990) Por outro lado haacute
relatos de uma mesma cepa ter colonizado com sucesso plantas de espeacutecies distintas em
infecccedilotildees artificiais (Li et al 2001 Lopes et al 2003 Prado et al 2008 Lopes et al
2010 Oliver et al 2015) As bases moleculares da especificidade de X fastidiosa ao
hospedeiro vegetal ainda natildeo satildeo conhecidas mas certamente natildeo envolvem efetores
secretados pelo sistema de secreccedilatildeo tipo 3 (McCann e Guttman 2007) visto que este
sistema estaacute ausente nessa fitobacteacuteria (Killiny e Almeida 2011)
131 Doenccedilas causadas por X fastidiosa formas de transmissatildeo e controle
Entre as doenccedilas causadas por X fastidiosa as mais estudadas satildeo a CVC e a
PD Os principais sintomas da CVC satildeo lesotildees cloroacuteticas intervenais na parte superior
de folhas maduras e regiotildees de necrose na parte inferior correspondentes agraves aacutereas de
clorose da parte superior Os frutos apresentam tamanho reduzido endurecidos e sem
sumo e com maturaccedilatildeo precoce inviabilizando o consumo in natura e sua utilizaccedilatildeo na
induacutestria de sucos e derivados (Hopkins 1989 Janse e Obradovic 2010) Entretanto a
CVC geralmente natildeo causa morte de indiviacuteduos susceptiacuteveis infectados (Li et al 2003)
Essa doenccedila ocorre em intensidades diferentes em quase todas as aacutereas citriacutecolas do
Brasil e tambeacutem jaacute foi detectada na Costa Rica Argentina e Paraguai (Coletta-Filho e
Machado 2003)
A PD tem como principal sintoma a necrose do limbo foliar que se inicia nas
bordas e evolui para as regiotildees centrais O desenvolvimento dos frutos eacute severamente
afetado sendo menores e murchos e portanto inadequados para consumo e produccedilatildeo
49 Introduccedilatildeo
de sucos e vinhos A PD pode ser considerada mais agressiva do que a CVC uma vez
que em estaacutegios avanccedilados haacute abscisatildeo das folhas pela parte distal do peciacuteolo e eventual
morte do hospedeiro (Hopkins 1989 Janse e Obradovic 2010) Apesar desses sintomas
geralmente serem associados ao deacuteficit hiacutedrico gerado pela oclusatildeo do xilema pelo
biofilme de X fastidiosa tem sido sugerido que outros fatores teriam papel importante
na geraccedilatildeo dos sintomas (Thorne et al 2006) uma vez que folhas altamente
sintomaacuteticas apresentaram baixas concentraccedilotildees de ceacutelulas do patoacutegeno (Gambetta et
al 2007) A PD eacute encontrada predominantemente nos EUA principalmente no estado
da Califoacuternia mas tambeacutem haacute registros dessa doenccedila na Ameacuterica Central e Taiwan (Su
et al 2013 Almeida e Nunney 2015)
As outras doenccedilas associadas agrave X fastidiosa genericamente denominadas de
escaldaduras apresentam sintomas foliares semelhantes agraves necroses caracteriacutesticas da
PD e tambeacutem comprometem o desenvolvimento dos frutos (Janse e Obradovic 2010)
Os hospedeiros vegetais ornamentais e florestais satildeo de grande importacircncia na
epidemiologia das principais doenccedilas causadas pela X fastidiosa pois no caso de
estarem nas vizinhanccedilas de pomares citriacutecolas vinhedos ou olivais poderiam servir
como reservatoacuterio da bacteacuteria em razatildeo da relativa inespecificidade para algumas cepas
dessa bacteacuteria (Baumgartner e Warren 2005 Hernandez-Martinez et al 2007
Chatterjee et al 2008 Saponari et al 2013 Almeida e Nunney 2015)
Sendo uma bacteacuteria restrita ao xilema X fastidiosa natildeo eacute encontrada em vida
livre ao contraacuterio de outras espeacutecies da famiacutelia Xanthomonadaceae A transmissatildeo de
Xylella entre os hospedeiros vegetais requer a accedilatildeo de pequenos insetos da famiacutelia
Cicadellidae (sharpshooters) e Cercopidae (spitlebugs) popularmente conhecidos
como cigarrinhas Estes insetos tecircm como haacutebito sugar o fluido xilemaacutetico diretamente
dos peciacuteolos das folhas e podem eventualmente adquirir ceacutelulas de X fastidiosa durante
a sua alimentaccedilatildeo As bacteacuterias entatildeo aderem ao forro cuticular das partes bucais do
tubo digestoacuterio anterior do inseto o preacute-cibaacuterio e cibaacuterio que satildeo revestidos com
quitina Em uma proacutexima alimentaccedilatildeo do inseto as bacteacuterias poderatildeo ser inoculadas
diretamente no xilema e dependendo da titulaccedilatildeo de ceacutelulas colonizar o hospedeiro
(Redak et al 2004 Almeida et al 2005 Chatterjee et al 2008 Backus e Morgan
2011) X fastidiosa eacute capaz de se multiplicar no aparelho bucal do inseto sendo o uacutenico
fitopatoacutegeno transmitido por artroacutepode que eacute propagativo mas que natildeo circula na
hemolinfa (Purcell e Finlay 1979) Ademais X fastidiosa produz quitinases indicando
50 Introduccedilatildeo
a possiacutevel utilizaccedilatildeo de quitina como nutriente (Killiny et al 2010 Labroussaa et al
2017) Diante destas observaccedilotildees ainda haacute debate se o inseto eacute meramente um vetor da
bacteacuteria ou pode ser considerado um hospedeiro intermediaacuterio uma vez que a Xylella
natildeo provoca qualquer dano aparente ao inseto ou prejudica seu desenvolvimento e
reproduccedilatildeo
As cigarrinhas satildeo consideradas generalistas uma vez que podem se alimentar
do fluido xilemaacutetico de diversas espeacutecies de plantas e as diversas espeacutecies de
cigarrinhas satildeo capazes de transmitir X fastidiosa embora com diferentes eficiecircncias
(Redak et al 2004) Somando todas essas informaccedilotildees com a relativa inespecificidade
de hospedeiro observada em algumas linhagens de X fastidiosa as probabilidades de
transmissatildeo aumentam e dificultam as estrateacutegias de controle da doenccedila Entretanto o
controle das populaccedilotildees de insetos vetores ainda constitui uma das principais formas de
controle das doenccedilas causadas pela Xylella (Almeida et al 2005)
Aleacutem da principal forma de transmissatildeo por meio do inseto vetor a transmissatildeo
antroacutepica tambeacutem pode disseminar a doenccedila O comeacutercio de mudas de plantas de
interesse econocircmico e agriacutecola pode espalhar a bacteacuteria para diversos locais do planeta
caso elas estejam contaminadas com X fastidiosa Essa bacteacuteria eacute considerada um
patoacutegeno de grave risco bioloacutegico e seu controle eacute requerido na inspeccedilatildeo e certificaccedilatildeo
de mudas que satildeo transportadas de paiacuteses em que Xylella eacute endecircmica (Madden e
Wheelis 2003) Aleacutem da disseminaccedilatildeo por mudas infectadas porta-enxertos
contaminados tambeacutem consistiam em fonte de transmissatildeo Atualmente satildeo
empregadas espeacutecies resistentes como porta-enxertos como o limatildeo-cravo que eacute usado
em mudas de laranjeira doce O manejo adequado dos pomares incluindo a poda de
galhos contaminados e a erradicaccedilatildeo de plantas severamente contaminadas eacute tambeacutem
muito importante para o controle das doenccedilas juntamente com o controle dos insetos
transmissores de X fastidiosa e a utilizaccedilatildeo de mudas certificadas (Janse e Obradovic
2010)
Ainda em caraacuteter experimental outras potenciais formas de controle de doenccedilas
como a PD e a CVC envolvem o controle bioloacutegico por meio da inoculaccedilatildeo de cepas
natildeo-virulentas de X fastidiosa como a EB92-1 em videiras (Hopkins 2005) ou de
endofiacuteticos que interferem na crescimento de X fastidiosa (Araujo et al 2002 Lacava
et al 2004) Outra possibilidade promissora eacute a fertirrigaccedilatildeo com N-acetil-cisteiacutena a
qual se mostrou eficiente no tratamento de plantas com sintomas de CVC (Muranaka et
51 Introduccedilatildeo
al 2013) O desenvolvimento de plantas transgecircnicas resistentes agrave X fastidiosa
tambeacutem estaacute em consideraccedilatildeo (Aguero et al 2005 Dandekar et al 2012 Lindow et
al 2014)
132 As epidemias de X fastidiosa
X fastidiosa foi descrita somente no final da deacutecada de 1980 (Wells et al
1987) poreacutem haacute registros em 1884 de uma grande epidemia em videiras no estado da
Califoacuternia nos EUA a qual se acredita ser o primeiro relato da Doenccedila de Pierce (PD)
(Auger et al 1974) Seis anos mais tarde outra epidemia em videiras foi relatada no
estado da Floacuterida (EUA) sendo comparada com a PD (Stoner 1952 Nunney et al
2010) Somente em 1892 que a doenccedila recebe oficialmente o nome de PD uma vez que
foi descrita pelo fitopatologista Newton B Pierce (Hopkins e Purcell 2002 Janse e
Obradovic 2010 Nunney et al 2010) Inicialmente acreditava-se que a PD e doenccedilas
relacionadas eram causadas por viacuterus Somente em 1978 bacteacuterias foram isoladas de
plantas doentes cultivadas e reinseridas na planta completando o postulado de Koch
comprovando ser o agente causal da doenccedila Inicialmente acreditava-se que essas
bacteacuterias eram do gecircnero Rickettsia A partir de comparaccedilotildees de sequecircncias de rRNA
16S estas bacteacuterias forma classificadas como sendo da familia Xanthomonadaceae e
entatildeo nomeadas de X fastidiosa (Wells et al 1987 Hopkins 1989)
Os primeiros registros de CVC na Ameacuterica do Sul foram relatados no estado de
Minas Gerais em 1987 (Rossetti et al 1990) seguido por sua ocorrecircncia em Satildeo Paulo
(Chang et al 1993) Como jaacute mencionado a CVC ocorre em quase todas as aacutereas
citriacutecolas do Brasil e tambeacutem jaacute foi detectada na Costa Rica Argentina e Paraguai
(Coletta-Filho e Machado 2003) Jaacute a escaldadura da folha do cafeeiro foi observada
pela primeira vez em Satildeo Paulo em 1995 (Beretta et al 1996) em seguida sendo
relatada na Costa Rica (Rodriacuteguez et al 2001)
Ateacute meados dos anos 90 havia registros deste fitopatoacutegeno exclusivamente no
continente americano Entretanto a ocorrecircncia de Xylella foi relatada nos continentes
europeu e asiaacutetico pereiras e videiras em Taiwan (Leu e Su 1993 Su et al 2013)
videiras em Kosovo (Berisha et al 1998) amendoeiras na Turquia (Guumlldumlaut~r et
al 2005) videiras e amendoeiras no Iratilde (Amanifar et al 2014) oleandro
amendoeiras oliveiras cerejeiras aleacutem de duas plantas arbustivas (Polygala myrtifolia
52 Introduccedilatildeo
e Westringia fruticosa) na Itaacutelia (Saponari et al 2013 Cariddi et al 2014 Saponari et
al 2014) Acredita-se que a Xylella tenha sido introduzida nesses locais por meio de
mudas infectadas oriundas de paiacuteses em que essa bacteacuteria eacute endecircmica principalmente
das Ameacutericas Vale relatar que em dois episoacutedios recentes as severas poliacuteticas de
controle e manejo atualmente vigentes evitaram introduccedilotildees de mudas infectadas No
primeiro mudas de cafeeiros com sintomas de escaldadura da folha do cafeeiro (CLS)
oriundas da Costa Rica e Honduras foram encontradas nos Paiacuteses Baixos sendo
diagnosticadas e destruiacutedas (Bergsma-Vlami et al 2015) No segundo episoacutedio quatro
mudas de cafeeiro infectadas oriundas do Equador e Meacutexico foram encontradas na
Franccedila e tambeacutem foram destruiacutedas (Jacques et al 2016)
Com as recentes ocorrecircncias de X fastidiosa na regiatildeo mediterracircnea diversos
paiacuteses como Portugal (Pereira 2015) Espanha Greacutecia Marrocos Tuniacutesia Egito Liacutebia
entre outros estatildeo em alerta e tomando as providecircncias necessaacuterias para evitar sua
disseminaccedilatildeo Apesar desses cuidados a bacteacuteria foi recentemente encontrada no
arquipeacutelago das Ilhas Baleares territoacuterio pertencente agrave Espanha e localizado no Mar
Mediterracircneo Oliveiras amendoeiras cerejeiras entre outras espeacutecies foram
diagnosticadas com X fastidiosa em outubro de 2016 nas duas das maiores ilhas do
arquipeacutelago Mallorca e Ibiza2 Um recente estudo em que foi realizada uma anaacutelise da
topologia da rede de olivais indica que o Sul da Itaacutelia estaacute se tornando um reservatoacuterio
para X fastidiosa com poucas chances de erradicaccedilatildeo sugerindo que o foco deve ser
direcionado para estrateacutegias de manejo e controle do vetor de modo a evitar
espalhamento do patoacutegeno a outros paiacuteses e pomares (Strona et al 2017)
Interessantemente em seu livro escrito em 1789 o cientista e professor de Medicina e
Filosofia Cosimo Moschettini descreve os sintomas de uma doenccedila em oliveiras
similares aos observados na Siacutendrome do Raacutepido Decliacutenio das Oliveiras (OQDS)
causada por X fastidiosa e que tem aterrorizado os agricultores italianos nos uacuteltimos
anos (Saponari et al 2013 Cariddi et al 2014 Saponari et al 2014) A Brusca como
ele denominou a doenccedila foi observada proacutexima da regiatildeo onde ocorreu o surto de
OQDS de 20133
2 httpsphysorgnews2017-02-spain-balearic-islands-deadly-olivehtmljCp 3 httpwwwolivenewsgrenarticle7668
53 Introduccedilatildeo
133 Variabilidade entre cepas e genomas de Xylella
Todos os isolados de X fastidiosa tecircm sido classificados ateacute o momento como
uma uacutenica espeacutecie sendo que apresentam suficiente variabilidade geneacutetica para serem
divididos em linhagens ou cepas (Hopkins 1989 Mehta e Rosato 2001) Haacute
entretanto uma exceccedilatildeo a cepa PLS229 isolada de uma aacutervore de pera-asiaacutetica (Pyrus
pyrifoliae) no distrito de Houli Taiwan que foi proposta como uma nova espeacutecie
Xylella taiwanensis (Su et al 2014 Su et al 2016a)
Dezenas de linhagens de X fastidiosa isoladas de variados hospedeiros jaacute foram
descritas e comparadas com base em sequecircncias de genes marcadores filogeneacuteticos o
que permitiu a proposiccedilatildeo de seis subespeacutecies fastidiosa multiplex sandyi pauca
tashke e morus (Schaad et al 2004 Schuenzel et al 2005 Randall et al 2009
Nunney et al 2014b Almeida e Nunney 2015 Jacques et al 2016) Entre as cepas de
X fastidiosa subsp fastidiosa (anteriormente chamada de subsp piercei) estatildeo as que
causam PD e doenccedilas em amendoeira alfafa e carvalho Acredita-se que a subespeacutecie
fastidiosa tenha sido introduzida nos EUA oriunda da Ameacuterica Central (Costa Rica) e
que tenha recombinado com um ancestral nativo da subespeacutecie multiplex o deve ter lhe
conferido a capacidade de infectar videiras gerando o surto de PD ocorrido em 1884
(Nunney et al 2010 Nunney et al 2013) Cepas da subespeacutecie multiplex estatildeo
associadas com uma grande variedade de hospedeiros incluindo doenccedilas de escaldadura
em amendoeiras ameixeira pessegueiro carvalho entre outros Acreditava-se que esta
subespeacutecie era nativa de climas temperados na Ameacuterica do Norte poreacutem uma cepa
causadora da escaldadura da folha de ameixeira (PLS) foi encontrada em 1935 na
Argentina Brasil e Paraguai (French e Kitajima 1978) possivelmente apoacutes introduccedilatildeo
proveniente dos EUA (Nunes et al 2003)
X fastidiosa subsp pauca compreende as cepas causadoras de CVC CLS e
outras doenccedilas causadas por esta bacteacuteria na Ameacuterica do Sul (Almeida et al 2008
Nunney et al 2014a) Dados filogeneacuteticos indicam que a Xylella seria nativa da
Ameacuterica do Sul estando presente de forma endofiacutetica em algum hospedeiro ainda
desconhecido Mesmo com a introduccedilatildeo de espeacutecies de citros originaacuterias do continente
asiaacutetico (principalmente Iacutendia e China) e de espeacutecies de cafeeiros originaacuterias do
continente africano (Etioacutepia) sendo estabelecidas como grandes monoculturas por
vaacuterios anos natildeo havia registros de doenccedilas causadas por X fastidiosa nestes
54 Introduccedilatildeo
hospedeiros Nunney e colaboradores sugerem que a X fastidiosa subsp pauca como a
conhecemos hoje tenha se originado via recombinaccedilatildeo intersubespeciacutefica entre a cepa
de X fastidiosa subsp pauca nativa da Ameacuterica do Sul e a cepa de X fastidiosa subsp
multiplex que infecta ameixeira tornando-se patogecircnica para citros e cafeacute (Nunney et
al 2012)
Os isolados de oliveiras infectadas por X fastidiosa na Argentina e na Itaacutelia
foram tambeacutem classificados como sendo da subespeacutecie pauca (Elbeaino et al 2014
Haelterman et al 2015) Em um estudo filogeneacutetico com sequecircncias de sete genes
housekeeping a cepa italiana CoDiRO (isolada de oliveira com OQDS) agrupou-se no
clado contendo cepas da subespeacutecie pauca distantes das cepas brasileiras de citros e
cafeeiro mas proacuteximas de cepas de cafeeiros do Equador (Jacques et al 2016) Tal fato
corrobora a alta similaridade geneacutetica desta cepa com um isolado de Xylella fastidiosa
subsp pauca da Ameacuterica Central geograficamente mais proacuteximo do Equador do que do
Brasil (Giampetruzzi et al 2015a) Entretanto outras seis cepas de X fastidiosa
isoladas de oliveiras assintomaacuteticas na Califoacuternia foram classificadas como X fastidiosa
subsp multiplex Inoculaccedilotildees em videiras e amendoeiras resultaram em sintomas
caracteriacutesticos de cepas desta subespeacutecie Portanto as oliveiras na Califoacuternia estavam
apenas servindo como reservatoacuterio de cepas de Xylella patogecircnicas a outras espeacutecies de
hospedeiros (Krugner et al 2014) Tal fato eacute mais uma evidecircncia de especificidade
entre cepas e seus respectivos hospedeiros vegetais
Schuenzel e colaboradores estimaram que o clado contendo as subespeacutecies
fastidiosa e sandyi se dividiram da subespeacutecie multiplex haacute cerca de 30000 anos
(Schuenzel et al 2005) Anaacutelises com a subespeacutecie pauca um grupo externo em
relaccedilatildeo agraves subespeacutecies fastidiosa e sandyi indicaram que ela divergiu haacute 60000 anos
(Nunney et al 2012)
As outras trecircs subespeacutecies envolvem cepas que infectam apenas uma espeacutecie de
hospedeiro cada Cepas de X fastidiosa subsp sandyi satildeo responsaacuteveis por causar
doenccedilas em oleandro ou espirradeira (Nerium oleander) Eacute provaacutevel que esse genoacutetipo
tenha sido introduzido nos EUA 100 anos apoacutes a epidemia em videiras na Califoacuternia
(Purcell et al 1999 Yuan et al 2010) A subespeacutecie X fastidiosa subsp tashke eacute
representada por cepas isoladas de plantas sintomaacuteticas da espeacutecie ornamental Chitalpa
tashkentensis (Randall et al 2009) Por fim X fastidiosa subsp morus foi proposta
para cepas que causam doenccedila em amoreira as quais tambeacutem podem ter surgido de
55 Introduccedilatildeo
eventos de recombinaccedilatildeo intersubespeciacutefica entre linhagens das subespeacutecies fastidiosa e
multiplex (Nunney et al 2014b)
Ateacute o momento 38 cepas de Xylella com diversas origens e hospedeiros
tiveram seus genomas sequenciados (Tabela 1) permitindo estudos mais aprofundados
de suas diferenccedilas fenotiacutepicas e genocircmicas A cepa 9a5c isolada de uma planta de citros
com sintomas de CVC no estado de Satildeo Paulo (Li et al 1999) foi o primeiro genoma
de um fitopatoacutegeno sequenciado no mundo (Simpson et al 2000) e se tornou referecircncia
para os outros genomas que vieram a seguir Como pode ser observado na Tabela 1
genomas de cepas de citros satildeo predominantes tendo sido isoladas de diferentes cidades
do estado de Satildeo Paulo diferentes estados do Brasil aleacutem de uma cepa da Argentina
Enquanto isso genomas de cepas norte-americanas mostram uma maior diversidade e
um equiliacutebrio entre os hospedeiros embora a maioria ainda tenha sido isolada de
videiras As primeiras sequecircncias genocircmicas de cepas norte-americanas obtidas foram
de Ann-1 (oleandro) e Dixon (amendoeira) embora incompletas A cepa Temecula1 foi
o primeiro genoma completo de cepas norte-americanas a ser publicado (Van Sluys et
al 2003) servindo como referecircncia para os genomas de cepas norte-americanas
Os primeiros genomas de Xylella sequenciados fora do continente americano
foram o da cepa PLS229 isolada de pereira em Taiwan (Su et al 2014) e o da cepa
CoDiRO isolada de oliveira na Itaacutelia (Giampetruzzi et al 2015a) Recentemente foi
proposto que a cepa PLS229 apresenta um genoma diferente o suficiente para ser
classificada como uma nova espeacutecie do gecircnero Xylella a Xylella taiwanensis Os
valores meacutedios de identidade de nucleotiacutedeo entre esta cepa e outras de X fastidiosa
foram de 834 a 839 significativamente menores do que os 95 encontrados entre
bacteacuterias da mesma espeacutecie Entretanto a similaridade de sequecircncia entre os genes dos
rRNAs 16S comumente empregados para caracterizar espeacutecies foi maior do que 98
acima dos 97 exigidos para justificar que duas cepas sejam da mesma espeacutecie Poreacutem
outras diferenccedilas foram encontradas apenas 87 de similaridade entre as sequecircncias do
espaccedilador 16S-23S SNPs em genes housekeeping perfis de aacutecidos graxos distintos e
diferentes fenoacutetipos Aleacutem disso uma aacutervore filogeneacutetica com sequecircncias de genes de
rRNA 16S posicionaram PLS229 entre os membros dos gecircneros Xylella e
Xanthomonas Tais dados justificaram a proposiccedilatildeo de nova espeacutecie (Su et al 2016a)
Uma vez que os genomas sequenciados satildeo originaacuterios de diferentes cepas de
uma mesma espeacutecie a maior parte da estrutura e organizaccedilatildeo do genoma bem como o
56 Introduccedilatildeo
conteuacutedo gecircnico eacute concordante entre eles Mesmo assim diferenccedilas significativas em
suas sequecircncias ainda foram encontradas refletindo nos fenoacutetipos de suas cepas e nos
diferentes niacuteveis de virulecircncia Estudos de genocircmica comparativa revelaram a
ocorrecircncia de grandes rearranjos de blocos de sequecircncias nos cromossomos
(translocaccedilotildees e inversotildees) indels (inserccedilotildees e deleccedilotildees) de nucleotiacutedeos em genes
importantes e polimorfismos de um uacutenico nucleotiacutedeo (SNPs) Diferenccedilas tambeacutem
foram encontradas no conteuacutedo flexiacutevel do genoma que incluem sequecircncias de
elementos transponiacuteveis como proacutefagos e plasmiacutedeos e outros genes que podem estar
relacionados com a especificidade entre cepa e hospedeiro (Nunes et al 2003 Van
Sluys et al 2003 Koide et al 2004 da Silva et al 2007 Doddapaneni et al 2007 de
Mello Varani et al 2008 Pierry 2012 Santana 2012 Barbosa et al 2015)
Em algumas cepas natildeo foram encontrados plasmiacutedeos enquanto em outras um
ou mais deles estatildeo presentes (Simpson et al 2000 Marques et al 2001 Lee et al
2010 Stenger et al 2010 Rogers e Stenger 2012) os quais eventualmente contecircm
genes que podem conferir alguma vantagem agrave cepa como por exemplo a toxina PemK
que atua como endoribonuclease (Lee et al 2012) X fastidiosa tem a maior razatildeo entre
o nuacutemero de genes de bacterioacutefagos e o tamanho do genoma sendo que o conteuacutedo de
sequecircncias relacionadas a proacutefagos nos genomas eacute muito diverso com cada cepa
apresentando um perfil uacutenico de tipos e quantidades (Varani et al 2013) Postula-se
que uma vez ativos os proacutefagos podem ser responsaacuteveis por rearranjos cromossocircmicos
em larga escala no genoma aleacutem de carregarem genes potencialmente importantes para
a sobrevivecircncia virulecircncia e para a capacidade em colonizar diversas espeacutecies de
hospedeiros (Nunes et al 2003 Chen et al 2005 de Mello Varani et al 2008) O alto
nuacutemero de sequecircncias oriundas de fagos nos genomas de X fastidiosa pode ser devido agrave
ausecircncia do sistema CRISPR-Cas completo (Santana 2012) o qual tem importante
papel de imunidade e proteccedilatildeo contra moleacuteculas de aacutecidos nucleicos invasoras (Sorek et
al 2008 Deveau et al 2010)
57 Introduccedilatildeo
Tabela 1 Lista de cepas de Xylella fastidiosa que tiveram seus genomas sequenciados e suas principais caracteriacutesticas
Cepa Hospedeiro Origem∆ Tamanho (Mb) GC Scaffolds CDS+ Referecircncias
9a5c Citros Brasil (SP) 273 5264 3 2310 (Simpson et al 2000) J1A12 Citros Brasil (SP) 287 5281 3 2378 (Pierry 2012) U24D Citros Brasil (SP) 273 5262 2 2246 (Santana 2012) XRB Citros Brasil (BA) 271 5224 74 2288 Natildeo publicado B111 Citros Brasil (SP) 268 5236 77 2274 Natildeo publicado 11399 Citros Brasil (SE) 274 5264 36 2281 (Niza et al 2016) CVC0251 Citros Brasil (SP) 274 5251 130 2305 Natildeo publicado CVC0256 Citros Brasil (SP) 270 5251 128 2280 Natildeo publicado 3124 Cafeeiro Brasil (SP) 275 5263 1 2261 (Santana 2012) COF0324 Cafeeiro Brasil (MG) 277 5243 143 2352 Natildeo publicado 6c Cafeeiro Brasil (SP) 261 5236 46 2192 (Alencar et al 2014) 32 Cafeeiro Brasil (SP) 261 5250 56 2155 (Alencar et al 2014) HIB4 Hibisco Brasil (SP) 288 5269 2 2388 (Pierry 2012) PR8X Ameixeira Brasil (SP) 271 5259 2 2229 (Pierry 2012)
FB7 Citros Argentina (Corrientes)
270 5251 2 2150 (Santana 2012)
Temecula1 Videira EUA (CA) 252 5180 2 2157 (Van Sluys et al 2003) GB514 Videira EUA (TX) 252 5177 2 1992 (Schreiber IV et al 2010) ATCC 35879 Videira EUA (FL) 252 5180 16 2116 Natildeo publicado Stags Leap Videira EUA (CA) 251 5170 15 2087 (Chen et al 2016) Ann-1 Oleandro EUA (CA) 278 5207 2 2375 (Bhattacharyya et al 2002) Dixon Amendoeira EUA (CA) 262 5200 32 2255 (Bhattacharyya et al 2002) M12 Amendoeira EUA (CA) 248 5190 1 2054 (Chen et al 2010) M23 Amendoeira EUA (CA) 257 5176 2 2193 (Chen et al 2010) EB921 Sabugueiro EUA (FL) 248 5150 168 2070 (Zhang et al 2011) MUL0034 Amoreira EUA (CA) 267 5197 2 2234 Natildeo publicado Mul-MD Amoreira EUA (MD) 252 5160 101 2077 (Guan et al 2014b) Sy-VA Sicocircmoro EUA (VA) 248 5160 128 2042 (Guan et al 2014a)
Griffin-1 Carvalho vermelho
EUA (GA) 239 5170 84 1855 (Chen et al 2013)
58 Introduccedilatildeo
ATCC 35871 Ameixeira EUA (GA) 242 5170 58 1966 Natildeo publicado BB01 Mirtilo EUA (GA) 252 5180 84 2943 (Van Horn et al 2017)
CO33 Cafeeiro Itaacutelia (Costa
Rica) 268 5170 96 2224
(Giampetruzzi et al 2015b)
COF0407 Cafeeiro Costa Rica (San Joseacute)
254 5184 172 2081 Natildeo publicado
OLS0478 Oleandro Costa Rica (San Joseacute)
256 5192 48 2115 Natildeo publicado
OLS0479 Oleandro Costa Rica (San Joseacute)
254 5193 183 2070 Natildeo publicado
CoDiRO Oliveira
Itaacutelia (Apulia) 254 5197 12 2076 (Giampetruzzi et al 2015a)
CFBP8072 Cafeeiro Franccedila (Equador) 250 5190 278 1987 (Jacques et al 2016) CFBP8073 Cafeeiro Franccedila (Meacutexico) 258 5160 328 2141 (Jacques et al 2016) PLS229 (X taiwanensis)
Pereira Taiwan (Houli) 273 5310 1 2152 (Su et al 2014) ∆entre parecircntesis o estado proviacutencia ou distrito do paiacutes de origem da cepa +genes codificadores de proteiacutenas paiacutes de origem das mudas infectadas com X fastidiosa
59 Introduccedilatildeo
134 Fatores de virulecircncia de X fastidiosa
O sequenciamento do primeiro genoma de X fastidiosa (cepa 9a5c agente causal da
CVC e isolada de citros no Brasil) forneceu informaccedilotildees importantes e essenciais para o
entendimento dos principais fatores de virulecircncia e patogenicidade dessa bacteacuteria Este
conhecimento tem sido constantemente enriquecido com o sequenciamento de genomas de
cepas de outras localidades e de diversos hospedeiros aliado a estudos bioquiacutemicos geneacuteticos
e fitopatoloacutegicos realizados principalmente com as cepas de referecircncia 9a5c e Temecula1
que eacute o agente causal da PD
A bacteacuteria X fastidiosa tem como principal caracteriacutestica ser muito adesiva possuindo
vaacuterios genes codificadores de adesinas fimbriais e afimbriais (Simpson et al 2000 Chatterjee
et al 2008 Zaini et al 2015) Os pili de Xylella estatildeo sempre localizados em apenas um dos
polos da ceacutelula e podem ser de dois tipos dependendo de seus tamanhos e funccedilotildees O pilus
curto (as ceacutelulas de X fastidiosa possuem vaacuterios pili curtos) tambeacutem chamado de chaperone-
usher possui funccedilotildees relacionadas agrave adesatildeo a substratos e superfiacutecies aleacutem da formaccedilatildeo de
biofilme e agregaccedilatildeo (Simpson et al 2000 Li et al 2007 Caserta et al 2010) Uma vez que
a Xylella natildeo possui flagelo ela possui um pilus longo tambeacutem chamado de pilus do tipo IV
o qual eacute utilizado pela ceacutelula para realizar a motilidade do tipo twitching aleacutem de participar
na formaccedilatildeo de biofilme (Meng et al 2005 Li et al 2007) Esse mecanismo funciona com a
polimerizaccedilatildeo do pilus para o exterior da ceacutelula adesatildeo ao substrato por uma proteiacutena adesina
localizada na sua extremidade seguido da despolimerizaccedilatildeo do pilus puxando a ceacutelula para
onde a adesina estaacute aderida Como a bacteacuteria habita um ambiente com fluxo constante ambas
as adesinas satildeo importantes para que ela possa se manter presa no substrato (De La Fuente et
al 2007) Foi demonstrado que a motilidade por twitching por pilus longo ocorre
predominantemente contra uma corrente de fluxo em cacircmara de microfluiacutedica sugerindo que
X fastidiosa eacute capaz de se mover na direccedilatildeo oposta do fluxo do fluido xilemaacutetico (Meng et
al 2005) Tal motilidade bacteriana permite que a bacteacuteria possa atingir outros vasos do
xilema e colonizar a planta de forma sistecircmica Esta movimentaccedilatildeo parece envolver
quimiotaxia pois foram identificados genes ortoacutelogos a sistemas quimiossensoriais no
genoma deste fitopatoacutegeno (Cursino et al 2011)
Aleacutem das adesinas fimbriais as adesinas afimbriais tambeacutem satildeo de extrema
importacircncia para a sobrevivecircncia da populaccedilatildeo bacteriana Entre elas estatildeo genes que
codificam para hemaglutininas e adesinas autotransportadoras trimeacutericas (Xad) Todas
60 Introduccedilatildeo
contribuem em diferentes intensidades para a adesatildeo ao substrato mas sua funccedilatildeo principal
parece ser adesatildeo ceacutelula-ceacutelula uma vez que elas estatildeo distribuiacutedas na membrana externa e
natildeo limitadas a um dos polos da ceacutelula como eacute o caso das adesinas fimbriais Este tipo de
adesatildeo tem papel fundamental para a formaccedilatildeo de um biofilme denso (Guilhabert e
Kirkpatrick 2005 Caserta et al 2010 Voegel et al 2010) Por outro lado jaacute foi mostrado
que uma das adesinas natildeo fimbriais (Xad1) eacute componente de vesiacuteculas de membrana externa
(OMV) as quais desempenham um papel modulador da adesatildeo de ceacutelulas de X fastidiosa ao
substrato tanto in vitro como in planta (Ionescu et al 2014) Aleacutem disso a aquisiccedilatildeo de X
fastidiosa pelo inseto-vetor durante sua alimentaccedilatildeo em plantas infectadas eacute mais eficiente se
as ceacutelulas estatildeo mais aderentes (Almeida et al 2005)
Aleacutem das proteiacutenas de adesatildeo para a formaccedilatildeo do biofilme de Xylella os genomas
desta bacteacuteria tambeacutem possuem o operon gum que contecircm todos os genes necessaacuterios para a
produccedilatildeo e secreccedilatildeo de exopolissacariacutedeos que forma a goma fastidiana (Simpson et al
2000 Chatterjee et al 2008) A secreccedilatildeo deste material auxilia na estruturaccedilatildeo da matriz
extracelular do biofilme que juntamente com o aglomerado de ceacutelulas e outras moleacuteculas
como proteiacutenas e aacutecidos nucleicos formam estruturas com densos agregados O biofilme
passa por cinco fases no seu ciclo incluindo o iniacutecio com suas ceacutelulas fundadoras passando
pela maturaccedilatildeo ateacute a sua liberaccedilatildeo e dispersatildeo para colonizar novos vasos e locais (de Souza
et al 2004 Caserta et al 2010) Aleacutem de proteger contra adversidades no ambiente como a
accedilatildeo de outras bacteacuterias e ataques de mecanismos de defesa do hospedeiro esta estrutura
auxilia na captaccedilatildeo de nutrientes do meio aleacutem de manter presas ceacutelulas mortas que tambeacutem
servem para a sua nutriccedilatildeo (Parsek e Singh 2003 Hall-Stoodley et al 2004 Danhorn e
Fuqua 2007) A formaccedilatildeo destes aglomerados de biofilmes densos resulta na oclusatildeo parcial
ou total de vasos do xilema dificultando ou impedindo que o fluido xilemaacutetico possa atingir
as partes superiores do hospedeiro A carecircncia hiacutedrica e nutricional parece ser uma das
principais causas dos sintomas das diversas doenccedilas causadas por Xylella (Chatterjee et al
2008) Entretanto os sintomas tambeacutem podem estar associados com a resposta sistecircmica do
hospedeiro frente agrave presenccedila do patoacutegeno (Gambetta et al 2007)
Vale ressaltar que a estrutura de biofilme formada na parte anterior do tubo digestivo
do inseto eacute diferente do que eacute observado nos vasos do xilema As ceacutelulas se posicionam lado a
lado e se manteacutem em posiccedilatildeo vertical aderida ao substrato pelo polo que conteacutem seus pili
curtos (Newman et al 2004 Almeida e Purcell 2006) Dessa forma o tubo digestoacuterio do
inseto natildeo eacute ocluiacutedo e consequentemente natildeo impede o fluxo de nutrientes Durante a
61 Introduccedilatildeo
alimentaccedilatildeo algumas ceacutelulas de X fastidiosa podem se desprender e atingir as porccedilotildees
posteriores do tubo digestoacuterio e servirem como alimento ao inseto No momento de uma nova
alimentaccedilatildeo de um vetor carregando Xylella em outro hospedeiro foi proposto um mecanismo
de inoculaccedilatildeo por egestatildeosalivaccedilatildeo de ceacutelulas do patoacutegeno no interior de vasos do novo
hospedeiro (Backus e Morgan 2011 Backus et al 2015)
A produccedilatildeo de lipopolissacariacutedeos (LPS) tambeacutem eacute conhecida como um importante
fator de virulecircncia em Xylella atuando como uma barreira seletiva para a entrada de certas
substacircncias na ceacutelula (Clifford et al 2013) LPS eacute uma macromoleacutecula predominante na
membrana externa de bacteacuterias Gram-negativas e por estar localizada na superfiacutecie celular
media as interaccedilotildees entre a ceacutelula bacteriana e o ambiente ao redor Por este motivo tambeacutem
eacute descrito no papel de desencadear respostas de defesa basais dos hospedeiros Sua moleacutecula eacute
composta de um componente conservado de oligossacariacutedeo com lipiacutedeo A e uma porccedilatildeo
variaacutevel de antiacutegeno O Tal antiacutegeno mostrou-se importante para a adesatildeo em superfiacutecies
agregaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e maturaccedilatildeo do biofilme etapas essenciais para a virulecircncia e para
uma infecccedilatildeo bem-sucedida Ensaios de infecccedilatildeo com mutantes para este antiacutegeno mostraram
uma diminuiccedilatildeo da capacidade de colonizaccedilatildeo no hospedeiro vegetal (Clifford et al 2013)
Uma vez que o LPS atua na capacidade de adesatildeo aos vasos do xilema hipotetizou-se que
tambeacutem teria importacircncia na adesatildeo de Xylella ao tubo digestoacuterio do inseto vetor Um
mutante para o antiacutegeno O foi utilizado sendo confirmada a diminuiccedilatildeo da adesatildeo da bacteacuteria
agrave parede do tubo digestoacuterio (Rapicavoli et al 2015) Dessa forma foi confirmado o
importante papel do LPS na virulecircncia de X fastidiosa em todas as etapas do seu ciclo de
vida Aleacutem disso um estudo recente mostrou diferenccedilas na sequecircncia de um gene que
codifica para uma das proteiacutenas que compotildee as moleacuteculas de LPS em cepas de cafeeiro
sugerindo que os diferentes perfis de LPS de cepas distintas podem influenciar na interaccedilatildeo
com seu respectivo hospedeiro e vetor (Alencar et al 2017)
Quando o biofilme atinge a sua fase final de desenvolvimento ele passa a liberar
ceacutelulas que iratildeo se dispersar para eventualmente colonizar outros locais do hospedeiro Para
tal as ceacutelulas precisam atravessar a parede do vaso do xilema em que se encontra para entatildeo
acessar e colonizar o vaso adjacente Na anatomia do xilema existem algumas regiotildees de
comunicaccedilatildeo entre os vasos locais onde a composiccedilatildeo de carboidratos eacute diferente do restante
da parede do vaso apresentando poros por onde passam o fluido xilemaacutetico e seus nutrientes
(Perez-Donoso et al 2010) Entretanto o diacircmetro desses poros eacute inferior ao diacircmetro da
ceacutelula bacteriana impedindo que ela atravesse livremente por eles Como forma de contornar
62 Introduccedilatildeo
esta restriccedilatildeo uma possibilidade eacute a degradaccedilatildeo da parede do vaso Interessantemente o
genoma de X fastidiosa possui diversos genes codificadores de enzimas degradadoras de
parede celular (Cell wall degrading enzymes CWDE) Existe uma variedade delas com
especificidades e eficiecircncias distintas desde celulases hemicelulases endoglucanases
glicohidrolases poligalacturonases entre outras (Simpson et al 2000) Todas as CWDEs satildeo
hipoteticamente secretadas para o meio extracelular pelo sistema de secreccedilatildeo de tipo II
(Chatterjee et al 2008) Aleacutem de serem capazes de degradar os carboidratos das regiotildees de
comunicaccedilatildeo entre vasos algumas dessas proteiacutenas satildeo responsaacuteveis por degradar os
subprodutos das primeiras reaccedilotildees Dessa forma a bacteacuteria poderia utilizar tais compostos
como nutrientes (Killiny e Almeida 2009) Acredita-se que este ponto tambeacutem seja
determinante para a especificidade de hospedeiro uma vez que a composiccedilatildeo de carboidratos
dos pontos de comunicaccedilatildeo de diferentes hospedeiros vegetais pode variar aleacutem da variaccedilatildeo
do repertoacuterio de enzimas ativas das diferentes cepas Isto poderia influenciar na capacidade e
eficiecircncia na colonizaccedilatildeo de uma cepa em um determinado hospedeiro Diferentemente de
todos os demais fitopatoacutegenos jaacute estudados os genomas de X fastidiosa natildeo possuem genes
para o sistema de secreccedilatildeo do tipo III o qual eacute usado para injetar proteiacutenas efetoras
diretamente no interior das ceacutelulas dos hospedeiros (Simpson et al 2000 Van Sluys et al
2003 Chatterjee et al 2008)
O hospedeiro vegetal ao perceber ataque agraves suas estruturas internas pode passar a
expressar mecanismos de defesa contra o patoacutegeno Dentre eles estatildeo a secreccedilatildeo de tiloacuteis e
geacuteis que embora ocluam aquele vaso jaacute danificado e colonizado impede que a bacteacuteria se
espalhe (Chatterjee et al 2008) Outra importante estrateacutegia eacute a produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de
espeacutecies reativas de oxigecircnio como superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio os quais satildeo
toacutexicos para membranas celulares Entretanto a bacteacuteria tambeacutem eacute capaz de se defender
contra estes ataques uma vez que possui genes codificadores para catalases superoacutexido
dismutases glutationa peroxidase glutationa S-transferase que atuam nas espeacutecies reativas de
oxigecircnio degradando-as e impedindo seu efeito Os reguladores de transcriccedilatildeo Ohr (Cussiol
et al 2003) e oxyR (Toledo et al 2011) satildeo ativados na presenccedila destes compostos e
modulam a expressatildeo destes genes de resposta
Aleacutem de ser capaz de se defender de ataques do hospedeiro a Xylella apresenta vaacuterios
genes codificando para um arsenal de toxinas Dentre elas estatildeo hemolisinas pertencentes agrave
famiacutelia RTX e diversas microcinas como as colicinas V (Simpson et al 2000) As primeiras
satildeo teoricamente capazes de formar poros na membrana plasmaacutetica de ceacutelulas do hospedeiro
63 Introduccedilatildeo
(Simpson et al 2000) As microcinas por sua vez poderiam ter funccedilatildeo de combater possiacuteveis
bacteacuterias que estejam competindo por espaccedilo e nutrientes no xilema Jaacute foram relatadas
espeacutecies dos gecircneros Bacillus Curtobacterium Methylobacterium Enterobacter e
Pseudomonas habitando os vasos do xilema de hospedeiros de Xylella (Araujo et al 2002
Lacava et al 2006) Aleacutem disso foi realizado um estudo de metagenocircmica da parte anterior
do tubo digestoacuterio de cigarrinhas que revelou a presenccedila dos gecircneros Wolbachia
Methylobacterium Sphingomonas Agrobacterium Ralstonia Caulobacter entre outros
(Rogers e Backus 2014) Tal microbiota poderia potencialmente interagir com Xylella no
inseto vetor A Xylella possui genes para o transporte das toxinas para o meio extracelular
aleacutem de proteiacutenas de imunidade ou anti-toxinas (Merfa et al 2016 Santiago et al 2016) A
hipoacutetese eacute de que tais toxinas desempenham papel na virulecircncia e patogenicidade da bacteacuteria
e que o repertoacuterio de toxinas pode variar entre cepas
Outros dois conjuntos de enzimas consideradas fatores de virulecircncia e importantes
para a colonizaccedilatildeo de Xylella satildeo as proteases e lipases Diversas proteases foram preditas
pela anotaccedilatildeo dos genomas desta bacteacuteria incluindo serina-proteases metalo-proteases
(algumas dependentes de zinco) e uma cisteiacutena-protease (Simpson et al 2000 Fedatto et al
2006 Nogaroto et al 2006) Esta uacuteltima denominada xilellaiacutena foi encontrada expressa em
uma cepa patogecircnica de citros mas natildeo foi detectada em uma cepa natildeo patogecircnica sugerindo
sua importacircncia na patogecircnese (Nogaroto et al 2006) Outras duas proteases de uma cepa
isolada de videira foram caracterizadas (PD0218 e PD0956) (Chen et al 2008 Gouran et al
2016) Dois estudos definiram o proteoma extracelular de isolados de citros de X fastidiosa e
ambos encontraram proteases sendo secretadas (Smolka et al 2003 Mendes et al 2016)
Tais proteases teriam papel em auxiliar as CWDEs na degradaccedilatildeo das membranas de
comunicaccedilatildeo entre vasos promovendo a movimentaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo da bacteacuteria na planta
aleacutem de fornecer subprodutos de degradaccedilatildeo que podem ser usados para a nutriccedilatildeo do
patoacutegeno e influecircncia na virulecircncia in planta (Smolka et al 2003 Fedatto et al 2006
Gouran et al 2016) As lipases tambeacutem foram implicadas na virulecircncia de Xylella em dois
trabalhos recentes com o gene PD1703 o qual codifica para a lipase LesA Primeiramente o
sequenciamento do genoma de uma cepa natildeo-virulenta de Xylella a EB92-1 evidenciou a
ausecircncia de LesA juntamente com outros genes de virulecircncia (Zhang et al 2011) Com a
inserccedilatildeo do gene PD1703 em EB92-1 a cepa mostrou um aumento significativo dos sintomas
caracteriacutesticos de PD em um ensaio de infecccedilatildeo em videiras (Zhang et al 2015) Em uma
anaacutelise do secretoma de uma cepa de videira LesA foi abundantemente encontrada no
64 Introduccedilatildeo
sobrenadante de cultura Esta lipase foi associada agrave formaccedilatildeo de biofilme sendo encontrada
em vesiacuteculas de membrana externa Aleacutem disso sugeriu-se que sua presenccedila provocaria uma
resposta de hipersensibilidade em videiras e que mutantes deste gene seriam deficientes em
virulecircncia Seu papel na virulecircncia e sua presenccedila em vesiacuteculas levou a hipoacutetese de que esta
lipase seria levada ateacute as margens de folhas natildeo colonizadas e desencadearia os sintomas
iniciais de PD (Nascimento et al 2016)
O papel das vesiacuteculas de membrana externa no transporte de fatores de virulecircncia a
longas distacircncias vem sendo descrito em trabalhos recentes Aleacutem de carregar toxinas e outras
moleacuteculas em seu interior elas tambeacutem levam consigo proteiacutenas localizadas na membrana
externa de onde se originaram como adesinas afimbriais (Voegel et al 2010 Ionescu et al
2014) A presenccedila destas proteiacutenas na membrana das vesiacuteculas lhes confere uma capacidade
de adesatildeo sendo proposto que elas revestiriam as superfiacutecies de contato da bacteacuteria como as
paredes dos vasos do xilema e modulando a adesatildeo das ceacutelulas agraves paredes do xilema e
facilitando seu espalhamento sistecircmico (Ionescu et al 2014)
Todos os fatores de virulecircncia e eventos relacionados agrave sobrevivecircncia e
patogenicidade de Xylella estatildeo relacionados direta ou indiretamente com um sistema de
sinalizaccedilatildeo relacionado com a densidade celular da populaccedilatildeo bacteriana A bacteacuteria possui
um conjunto de genes denominados rpf os quais tecircm papel na siacutentese e secreccedilatildeo de uma
pequena moleacutecula lipiacutedica chamada de DSF (Diffusible signaling factor) com funccedilatildeo na
percepccedilatildeo de quoacuterum (quorum sensing) (Chatterjee et al 2008 Ryan e Dow 2011) O gene
rpfF codifica uma enoil CoA-hidratase que juntamente com o gene rpfB que codifica uma
ligase de acil-CoA de cadeia longa estatildeo envolvidos na siacutentese e processamento de diferentes
moleacuteculas de DSF As ceacutelulas sintetizam DSF e o secretam para o meio extracelular sendo
que a sua concentraccedilatildeo eacute percebida por um sistema de dois componentes compostos pelas
proteiacutenas codificadas pelos genes rpfC e rpfG o sensor e o regulador de resposta
respectivamente O uacuteltimo possui um domiacutenio HD-GYP com atividade de fosfodiesterase de
c-di-GMP ou seja de degradaccedilatildeo deste segundo mensageiro o qual participa ativamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo de diversos genes-alvo deste sistema (Chatterjee et al 2008) Ao
contraacuterio do observado em outras espeacutecies como Xanthomonas DSF modula negativamente
os niacuteveis de c-di-GMP em Xylella (Chatterjee et al 2008 Seshasayee et al 2010 Ryan e
Dow 2011) Acompanhando o crescimento populacional a concentraccedilatildeo de DSF no meio iraacute
variar e consequentemente geraraacute diferentes respostas nas ceacutelulas A proteiacutena sensora na
membrana interna percebe as diferenccedilas na concentraccedilatildeo de DSF e desencadeia uma cascata
65 Introduccedilatildeo
de resposta com diferentes membros do sistema culminando com a mudanccedila da expressatildeo de
diversos genes nas ceacutelulas incluindo aqueles relacionados com virulecircncia Baseando-se na
concentraccedilatildeo de DSF a populaccedilatildeo bacteriana de Xylella apresentaraacute duas fases distintas no
interior dos vasos do xilema A chamada fase de colonizaccedilatildeo do hospedeiro vegetal
compreende o periacuteodo de contato inicial no qual as ceacutelulas foram inoculadas haacute pouco tempo
e consequentemente estatildeo em menor nuacutemero Ainda natildeo haacute infecccedilatildeo sistecircmica ou mesmo
sintomas da doenccedila Devido agraves poucas ceacutelulas presentes a concentraccedilatildeo de DSF eacute baixa o
que implica na regulaccedilatildeo positiva de genes relacionados agrave produccedilatildeo de pilus longo usados na
locomoccedilatildeo dentro dos vasos e na alta expressatildeo de genes codificando para as CWDE as
quais seratildeo utilizadas para degradar as barreiras fiacutesicas existentes entre os vasos e promover a
disseminaccedilatildeo da bacteacuteria dentro do hospedeiro A partir do aumento do crescimento
populacional bacteriano o acuacutemulo de ceacutelulas promove o aumento da concentraccedilatildeo de DSF o
qual sinaliza para uma mudanccedila fenotiacutepica entrando na chamada fase de aquisiccedilatildeo pelo
inseto Neste momento as ceacutelulas passam a expressar genes relacionados com um fenoacutetipo
mais seacutessil formando grandes aglomerados de ceacutelulas que acabam por ocluir vasos o que
aumenta as chances de bacteacuterias serem adquiridas pelo inseto vetor e serem disseminadas para
outros hospedeiros Devido agrave oclusatildeo de vasos sintomas estatildeo presentes nesta fase Os genes
regulados positivamente nesta fase incluem aqueles codificadores de adesinas fimbriais e
afimbriais aleacutem da maior produccedilatildeo e secreccedilatildeo de exopolissacariacutedeo ou goma fastidiana os
quais contribuem para a formaccedilatildeo de um biofilme denso (Chatterjee et al 2008)
Como evidenciado na resposta do sistema de percepccedilatildeo de quoacuterum por DSF a
regulaccedilatildeo precisa da expressatildeo gecircnica eacute extremamente importante para que a ceacutelula possa
sobreviver e lidar com os diferentes nichos nos quais se encontra Ela tem que lidar com as
diferenccedilas na resposta agrave sua infecccedilatildeo nos mais variados hospedeiros e espeacutecies de insetos
vetores os quais podem possuir diferentes e complexas microbiotas em seu interior Com
isso compreender sistemas de regulaccedilatildeo gecircnica e analisar diferentes respostas a determinadas
condiccedilotildees ambientais que a ceacutelula encontra eacute fundamental para buscar o completo
entendimento da biologia desse patoacutegeno Estudos de genocircmica comparativa entre cepas de X
fastidiosa satildeo uacuteteis para a descriccedilatildeo do repertoacuterio gecircnico de cada uma delas e relatar as
diferenccedilas encontradas realizando inferecircncias acerca de seus respectivos fenoacutetipos e niacuteveis de
virulecircncia Entretanto para que possamos analisar de fato quais genes estatildeo sendo ativamente
expressos em determinada condiccedilatildeo estudos de transcritocircmica satildeo necessaacuterios e fornecem
informaccedilotildees mais concretas da real participaccedilatildeo de cada gene
66 Introduccedilatildeo
135 Anaacutelises transcritocircmicas em X fastidiosa
Anaacutelises transcritocircmicas envolvem a descriccedilatildeo de todos os transcritos presentes em
determinada condiccedilatildeo em que o organismo se encontra Diversos estudos com Xylella foram
realizados em resposta a uma variedade de estiacutemulos condiccedilotildees de cultivo e fases do
crescimento e desenvolvimento da populaccedilatildeo bacteriana
A grande maioria dos estudos de transcritocircmica com esta bacteacuteria foi realizado
utilizando a tecnologia de microarranjos de DNA O primeiro estudo analisou diferenccedilas na
expressatildeo dos genes em diferentes estados de crescimento da cepa 9a5c isolada de citros
Foram analisadas populaccedilotildees bacterianas com diferentes nuacutemeros de passagens no cultivo in
vitro uma recentemente extraiacuteda do hospedeiro dita como 1a passagem e outra apoacutes 46
passagens O objetivo seria analisar se o constante crescimento in vitro causaria alteraccedilotildees na
expressatildeo de genes de virulecircncia Ensaios de infecccedilatildeo de plantas confirmaram que as
bacteacuterias receacutem-extraiacutedas tiveram uma colonizaccedilatildeo mais eficiente A anaacutelise de expressatildeo
gecircnica mostrou genes associados com adesatildeo adaptaccedilatildeo ao hospedeiro e virulecircncia como
lipases e colicina V induzidos na populaccedilatildeo de 1a passagem (de Souza et al 2003) Em outro
estudo foram analisados os genes diferencialmente expressos de ceacutelulas crescendo em
biofilme comparado com ceacutelulas planctocircnicas Ceacutelulas no biofilme apresentaram um aumento
da expressatildeo de genes relacionados com funccedilotildees metaboacutelicas de manutenccedilatildeo da ceacutelula aleacutem
de proteiacutenas relacionadas agrave adesatildeo a superfiacutecies (de Souza et al 2004)
Nos seus haacutebitats naturais como os vasos do xilema de diferentes hospedeiros
vegetais e o tubo digestoacuterio de diversas espeacutecies de insetos-vetor a Xylella estaacute sujeita uma
variedade de fatores de estresse Dentre eles se enquadram mudanccedilas nas condiccedilotildees
ambientais nas concentraccedilotildees de nutrientes aleacutem da presenccedila de compostos anti-microbianos
e organismos competidores Koide e colaboradores analisaram a resposta da bacteacuteria ao
aumento da temperatura Aleacutem dos genes relacionados a chaperonas e outros genes
relacionados a mecanismos de controle de qualidade de proteiacutenas foi observado um aumento
da expressatildeo de genes associados agrave virulecircncia como hemaglutininas hemolisinas enzimas
degradadoras de xilana entre outros Genes relacionados agrave siacutentese de pilus respiraccedilatildeo aeroacutebia
e siacutentese proteica foram reprimidos nesta condiccedilatildeo de estresse O estudo ainda sugere um
regulon de choque teacutermico (heat shock) apoacutes analisarem regiotildees promotoras de genes com
expressatildeo diferencial (Koide et al 2006) Uma condiccedilatildeo de carecircncia nutricional foi avaliada
em um estudo com limitadas concentraccedilotildees de nitrogecircnio revelando genes diferencialmente
expressos com funccedilotildees relacionadas ao transporte assimilaccedilatildeo de nitrogecircnio biossiacutentese de
67 Introduccedilatildeo
aminoaacutecidos e regulaccedilatildeo transcricional (da Silva Neto et al 2010) Outros dois trabalhos
avaliaram a resposta da bacteacuteria frente a moleacuteculas com accedilatildeo antimicrobiana Fogaccedila e
colaboradores avaliaram o efeito da gomesina um peptiacutedeo antimicrobiano extraiacutedo de
aracniacutedeo observando um aumento da expressatildeo de genes relacionados com a produccedilatildeo de
biofilme importante mecanismo de defesa bacteriano (Fogaca et al 2010) As accedilotildees do cobre
e do antibioacutetico tetraciclina em Xylella tambeacutem foram avaliadas em outro estudo com
microarranjos Novamente genes envolvidos com a proteccedilatildeo das ceacutelulas em biofilme tiveram
sua expressatildeo aumentada Os autores ainda relataram pela primeira vez em Xylella a
formaccedilatildeo de ceacutelulas persistentes no biofilme em resposta a ambos os estresses sugerindo uma
resposta de toleracircncia a moleacuteculas antimicrobianas (Muranaka et al 2012) Tais moleacuteculas
tambeacutem podem ser sintetizadas por organismos competidores que possam co-habitar nichos
em comum com a Xylella Dourado e colaboradores analisaram a resposta da Xylella agrave
interaccedilatildeo com uma bacteacuteria endofiacutetica de citros Methylobacterium mesophilicum em um co-
cultivo in vitro Aleacutem disso esta bacteacuteria jaacute foi encontrada sendo transportada pelo mesmo
inseto vetor que pode transmitir a Xylella Os resultados mostraram um aumento da expressatildeo
de genes relacionados com produccedilatildeo de energia estresse transporte e motilidade aleacutem da
repressatildeo de genes associados ao crescimento (Dourado et al 2015)
A Xylella possui uma variedade de genes codificadores de fatores de transcriccedilatildeo e
fatores σ Os fatores σE e σ54 foram analisados quanto agrave regulaccedilatildeo de seus respectivos genes
alvo No primeiro caso a condiccedilatildeo de choque por calor foi utilizada para definir o regulon
deste fator sigma identificando genes codificadores de enzimas envolvidas no enovelamento
e degradaccedilatildeo de proteiacutenas transduccedilatildeo de sinal e sistemas de restriccedilatildeomodificaccedilatildeo de DNA
(da Silva Neto et al 2007) O papel do fator σ54 foi investigado a partir da comparaccedilatildeo com o
transcritoma de uma cepa mutante deste gene evidenciando a regulaccedilatildeo de genes envolvidos
com a biogecircnese dos pili curto e longo e na formaccedilatildeo de biofilme (da Silva Neto et al 2008)
A mesma estrateacutegia de gerar mutantes para analisar a expressatildeo gecircnica global regulada por
determinado gene em comparaccedilatildeo com a cepa selvagem foi usada para identificar o regulon
dos fatores de transcriccedilatildeo AlgU e GacA de Xylella Enquanto AlgU regula genes relacionados
agrave agregaccedilatildeo celular adesatildeo formaccedilatildeo de biofilme e virulecircncia (Shi et al 2007) GacA regula
genes que tambeacutem contribuem para a adesatildeo e formaccedilatildeo de biolfime aleacutem de outros com
papel na adaptaccedilatildeo e toleracircncia da bacteacuteria a estresses ambientais (Shi et al 2009)
Sistemas de sinalizaccedilatildeo de dois componentes e de percepccedilatildeo de quoacuterum tambeacutem
foram investigados por microarranjos A anaacutelise do transcritoma da cepa mutante do gene
68 Introduccedilatildeo
xhpT (codifica um regulador de reposta) apontou para alteraccedilatildeo na adesatildeo a superfiacutecies
agregaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula produccedilatildeo de exopolissacariacutedeos e virulecircncia em videiras (Voegel et
al 2013) O sistema de percepccedilatildeo de quoacuterum jaacute descrito baseado nos genes rpf e na
produccedilatildeo de DSF foi analisado a partir da construccedilatildeo de uma cepa mutante para o gene rpfF
principal atuante na siacutentese da moleacutecula sinalizadora DSF O regulon dependente de rpfF
envolve genes relacionados a adesatildeo e formaccedilatildeo de biofilme regulando positivamente a
expressatildeo de hemaglutininas e hemolisinas e negativamente a maioria dos genes de siacutentese
dos pili longo e curto de goma fastidiana e de colicinas V (Wang et al 2012)
Interessantemente aleacutem da resposta da bacteacuteria a diversas condiccedilotildees estudos tecircm
focado na resposta do hospedeiro vegetal a infecccedilatildeo por Xylella A anaacutelise do transcritoma
por meio de microarranjos de Arabidopsis thaliana inoculada com X fastidiosa revelou
aumento da expressatildeo de genes relacionados a limitar o dano por estresse oxidativo enquanto
que outros genes normalmente responsivos a infecccedilotildees por patoacutegenos ou estresse bioacutetico natildeo
tiveram expressatildeo alterada Os autores sugerem que tal resposta da planta estaria mais
relacionada ao deacuteficit hiacutedrico induzido pelo bloqueio dos vasos do xilema do que agrave proacutepria
infecccedilatildeo bacteriana (Rogers 2012)
Em um estudo de RNA-Seq foi analisada a resposta de indiviacuteduos de C reticulata
(resistente agrave colonizaccedilatildeo por X fastidiosa) um dia apoacutes a infecccedilatildeo por Xylella Dentre os
transcritos induzidos foram identificados genes codificadores de proteiacutenas do sistema imune
inato do hospedeiro genes envolvidos com o metabolismo secundaacuterio biossiacutentese e
modificaccedilatildeo da parede celular siacutentese de aacutecido absciacutesico aacutecido jasmocircnico e auxina
(Rodrigues et al 2013)
A resposta de oliveiras agrave infecccedilatildeo por X fastidiosa tambeacutem foi investigada utilizando
RNA-Seq (Giampetruzzi et al 2016) O transcritoma de cultivares que exibem sintomas mais
brandos como o cv Leccino foi comparado ao transcritoma de cultivares suscetiacuteveis a
OQDS como o cv Ogliarola salentina apoacutes infecccedilatildeo por Xylella As anaacutelises de genes
diferencialmente expressos mostraram que a presenccedila do patoacutegeno aciona uma resposta
envolvendo o remodelamento de proteiacutenas da parede celular em ambos os cultivares A
regulaccedilatildeo positiva de genes codificando quinases do tipo receptor (RLK) e proteiacutenas do tipo
receptor (RLP) foi vista no cv Leccino mas natildeo no cv Ogliarola salentina Os autores
concluiacuteram que as diferentes respostas transcricionais observadas podem determinar a menor
concentraccedilatildeo do patoacutegeno no cv Leccino e sua relativa toleracircncia agrave Xylella Em uma anaacutelise
do proteoma de seivas xilemaacuteticas de videiras infectadas ou natildeo com Xylella foi observada
69 Introduccedilatildeo
uma abundacircncia de enzimas modificadoras da parede celular no primeiro caso Os autores
ainda confirmaram por ressonacircncia magneacutetica nuclear um aumento de deposiccedilatildeo de parede
secundaacuteria corroborando o aumento do diacircmetro do caule em videiras infectadas
(Chakraborty et al 2016) Este aumento de deposiccedilatildeo de parede celular secundaacuteria tambeacutem
foi observado em citros infectado por Xylella (Niza et al 2015)
Mudanccedilas nas concentraccedilotildees e disponibilidades de nutrientes no meio satildeo fatores
importantes que influenciam a regulaccedilatildeo gecircnica Alguns estudos analisaram o panorama
global da transcriccedilatildeo na presenccedila de diferentes micro e macronutrientes e em diferentes
concentraccedilotildees Zaini e colaboradores analisaram a resposta de Xylella no crescimento em
diferentes niacuteveis de concentraccedilatildeo e disponibilidade de ferro Genes envolvidos com funccedilotildees
regulatoacuterias patogenicidade e estrutura celular foram regulados nas condiccedilotildees analisadas
incluindo genes para colicinas V e biossiacutentese de pilus (Zaini et al 2008) Outro
micronutriente analisado foi o caacutelcio no primeiro estudo no qual transcritomas de X
fastidiosa foram analisados utilizando a tecnologia de RNA-Seq As ceacutelulas foram cultivadas
em meio suplementado com caacutelcio e ceacutelulas do biofilme foram coletadas para a anaacutelise do
transcritoma Os resultados mostraram regulaccedilatildeo positiva em resposta ao caacutelcio de genes
relacionados com adesatildeo motilidade siacutentese de exopolissacariacutedeo formaccedilatildeo de biofilme
siacutentese de peptidoglicano funccedilotildees regulatoacuterias homeostase de ferro e fagos (Parker et al
2016)
Diferenccedilas no conteuacutedo de macronutrientes do ambiente tambeacutem afetam a expressatildeo
gecircnica global de Xylella sendo que alguns estudos de transcritocircmica foram realizados com
diferentes fontes de carbono e energia Pashalidis e colaboradores analisaram o perfil
transcricional de Xylella cultivada em meio de cultivo com diferentes concentraccedilotildees de
glicose Os resultados indicaram uma induccedilatildeo da transcriccedilatildeo de genes de colicinas V e
precursores de pilus no meio com alta concentraccedilatildeo de glicose (Pashalidis et al 2005)
Outros trabalhos buscaram analisar fontes nutricionais que a bacteacuteria poderia diretamente
encontrar no ambiente Para se locomover no interior dos vasos do xilema de hospedeiros
vegetais e entre eles as jaacute mencionadas CWDE satildeo secretadas e atuam na degradaccedilatildeo da
parede das membranas de comunicaccedilatildeo entre vasos Dessa forma subprodutos de degradaccedilatildeo
satildeo gerados e podem modificar a expressatildeo de genes para a sua utilizaccedilatildeo Em um estudo com
microarranjos foram analisados os efeitos da adiccedilatildeo de pectina e glucano ao meio de cultivo
os quais provocaram mudanccedilas no fenoacutetipo e no perfil de expressatildeo gecircnica da populaccedilatildeo
bacteriana A presenccedila de pectina tornou as ceacutelulas mais adesivas corroborando o aumento da
70 Introduccedilatildeo
expressatildeo de genes relacionados a hemaglutininas e produccedilatildeo de goma em ceacutelulas cultivadas
nos meios com pectina e glucano aleacutem de outras mudanccedilas de expressatildeo em genes
importantes para a patogenicidade Devido a este fenoacutetipo mais agregativo a disponibilidade
para a aquisiccedilatildeo de bacteacuterias pelo inseto vetor foi aumentada elevando a taxa de transmissatildeo
(Killiny e Almeida 2009) Assim que a Xylella eacute adquirida pelo inseto ela encontra um
ambiente completamente distinto e necessita novamente adequar a expressatildeo de seus genes O
carboidrato predominante neste ambiente eacute a quitina que compotildee o exoesqueleto que reveste
o tubo digestoacuterio do vetor tendo sido evidenciado o seu uso como fonte de nutrientes para X
fastidiosa aleacutem de induzir aumento na formaccedilatildeo de biofilme bacteriano no inseto vetor
(Killiny et al 2010)
Os estudos in vitro para analisar o efeito pontual de determinado carboidrato satildeo
importantes para fornecer dados especiacuteficos da regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica do patoacutegeno
Entretanto sabe-se que a composiccedilatildeo do fluido xilemaacutetico eacute muito mais complexa e que
outras moleacuteculas podem influenciar na resposta da bacteacuteria Zaini e colaboradores mostraram
ser possiacutevel sustentar uma cultura estaacutevel de Xylella em seiva do xilema de videiras
resultando em um aumento da taxa de crescimento e induccedilatildeo da adesatildeo e formaccedilatildeo de
biofilme (Zaini et al 2009) Dessa forma estudos que analisam as mudanccedilas no perfil de
expressatildeo gecircnica em diferentes meios com composiccedilotildees nutricionais distintas podem
fornecer respostas mais proacuteximas do que a bacteacuteria possa encontrar no seu ambiente natural
Um estudo realizou a comparaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de Xylella em cultivo em um meio
complexo (BCYE) e um meio definido (XDM2) Este uacuteltimo foi desenvolvido para melhorar o
crescimento de Xylella tendo sido baseado nas necessidades metaboacutelicas do patoacutegeno
reveladas pela anaacutelise de seu genoma (Lemos et al 2003) Foram observados genes
diferencialmente expressos com diferentes funccedilotildees como energia metabolismo de proteiacutena
aminoaacutecido e nucleotiacutedeo transporte toxinas entre outros (Travensolo et al 2009) Um
segundo estudo com diferentes meios de cultura analisou o perfil de expressatildeo gecircnica global
de Xylella cultivada em um meio com caracteriacutesticas nutricionais semelhantes agraves do fluido
xilemaacutetico de videira (3G10-R) (Leite et al 2004) comparando com um meio complexo
usado para cultivo rotineiro desta bacteacuteria (PW) (Davis et al 1981) Os resultados mostraram
que os genes regulados positivamente para o meio 3G10R podem estar envolvidos com a
colonizaccedilatildeo do hospedeiro virulecircncia e competiccedilatildeo ambiental enquanto que nas ceacutelulas
cultivadas no meio PW foi observado um aumento da respiraccedilatildeo aeroacutebica e das taxas de
crescimento bacteriano (Ciraulo et al 2010)
71 Introduccedilatildeo
Em resumo muitos trabalhos de anaacutelise de transcritomas de Xylella fastidiosa jaacute foram
realizados abordando os mais variados objetivos Entretanto quase todos utilizaram a
tecnologia de microarranjos com exceccedilatildeo de apenas um uacutenico estudo (Parker et al 2016) no
qual a estrateacutegia de RNA-Seq foi utilizada Como jaacute descrito anteriormente esta teacutecnica tem
diversas vantagens em relaccedilatildeo aos microarranjos possibilitando uma avaliaccedilatildeo muito mais
aprofundada da expressatildeo de todos os transcritos de uma ceacutelula aleacutem de diversas outras
anaacutelises que podem ser geradas com os dados de sequenciamento Alguns estudos foram
realizados utilizando RNA-Seq como estrateacutegia para anaacutelise da expressatildeo gecircnica global em
fitopatoacutegenos como nas espeacutecies Xanthomonas campestris pv vesicatoria (Schmidtke et al
2011) e Pseudomonas syringae pv tomato (Filiatrault et al 2010) Aleacutem disso trabalhos
subsequentes utilizaram os mesmos organismos para outros fins que a teacutecnica de RNA-Seq
permite como a definiccedilatildeo dos siacutetios de iniacutecio de transcriccedilatildeo (TSS) (Filiatrault et al 2011) e a
identificaccedilatildeo de pequenos RNAs natildeo codificadores (Schmidtke et al 2013)
Objetivos
72
2 Objetivos
O objetivo central desta tese foi sequenciar analisar e comparar os transcritomas de
diferentes cepas de Xylella fastidiosa no iniacutecio e fim da fase exponencial de crescimento em
meio rico PWG e em PIM6 um meio miacutenimo que mimetiza a composiccedilatildeo da seiva do xilema
A premissa para realizaccedilatildeo deste trabalho eacute que a descriccedilatildeo do repertoacuterio completo de genes
diferencialmente expressos nestas condiccedilotildees experimentais aleacutem de aprofundar o
conhecimento das respostas transcricionais de X fastidiosa a variaccedilotildees nas condiccedilotildees de
cultivo in vitro poderaacute evidenciar fatores de virulecircncia e de patogenicidade expressos nestas
condiccedilotildees
Aleacutem da descriccedilatildeo do perfil transcricional das diferentes cepas e da anaacutelise de
expressatildeo gecircnica diferencial entre transcritomas objetivos adicionais incluem a anaacutelise de
vias metaboacutelicas ativas e enriquecidas em determinada condiccedilatildeo definiccedilatildeo de regiotildees natildeo-
traduzidas dos transcritos e estrutura de operons (cepas 9a5c e Temecula1) e a obtenccedilatildeo de
um transcritoma enriquecido em sRNAs (cepa 9a5c)
Procecimentos experimetais
73
3 Procedimentos experimentais
31 Manutenccedilatildeo e cultivo de Xylella fastidiosa
As cepas utilizadas neste trabalho estatildeo listadas na Tabela 2 bem como seus
respectivos locais de origem e plantas hospedeiras de que foram isoladas
Tabela 2 Cepas de X fastidiosa utilizadas e seus respectivos hospedeiros de origem Cepa Hospedeiro Origem Fonte Referecircncia
9a5c Citrus sinensis cv
Natal MacaubalSPBRA Fundecitrus
(Li et al 1999)
J1a12+ Citrus sinensis cv Pecircra
JalesSPBRA Fundecitrus (Monteiro et
al 2001)
U24d Citrus sinensis cv
Baianinha Piracicaba
UbaranaSPBRA APTA Citros (Santana
2012)
Fb7 Citrus sinensis cv
Valencia Bella
VistaCorrientesARG APTA Citros
(da Silva et al 2007)
3124 Coffea arabica MatatildeoSPBRA APTA Citros (Almeida et al 2008)
Hib4 Hibiscus rosa-
sinensis CampinasSPBRA APTA Citros (Pierry 2012)
Pr8x Prunus salicina JarinuSPBRA APTA Citros (Pierry 2012)
Temecula1 Vitis viniacutefera TemeculaCAEUA University of
California Berkeley (Van Sluys et
al 2003) As siglas correspondem aos estados e paiacuteses nos quais as cepas foram isoladas SP Estado de Satildeo Paulo BRA Brasil ARG Argentina CA Estado da Califoacuternia EUA Estados Unidos da Ameacuterica + cepa natildeo-virulenta as demais satildeo virulentas
Estoques de ceacutelulas (diversas passagens) foram mantidos em meio PWG contendo
50 de glicerol em freezer a -80degC A manutenccedilatildeo das culturas foi feita em placas de meio
PWG-aacutegar com repiques semanais e incubaccedilatildeo a 28degC sendo o nuacutemero de passagens
controlado Apoacutes 20 passagens novo cultivo foi iniciado a partir de estoques congelados a -
80ordmC
O meio PW (Davis et al 1981) contendo glicose (meio PWG) eacute constituiacutedo de fitona
peptona 4 gL peptona de caseiacutena com digestatildeo triacuteptica 1 gL cloreto de hemina 0001
K2HPO4 12 gL KH2PO4 1 gL MgSO47H2O 04 gL glutamina 04 e glicose 05 Em
alguns experimentos foi utilizado o meio PIM6 que eacute composto de HEPES 10 mM pH 65
MgSO4 1 mM CaCl2 3 mM D-glicose 01 mM tartarato de soacutedio 01 mM malato de soacutedio
02 mM citrato de soacutedio 1 mM 005 gL K2HPO4 003 gL KH2PO4 L-glutamina 5 mM
0025 soluccedilatildeo de micronutrientes ATCC13061 002 soytone e 004 triptona (Michelle
Igo University of California Davis comunicaccedilatildeo pessoal)
Procecimentos experimetais
74
Para o cultivo em meio liacutequido as bacteacuterias apoacutes 7 a 10 dias de cultivo em meio
soacutelido PWG-aacutegar (PWG contendo aacutegar 15) foram transferidas para frascos contendo de 50
a 100 mL de meio PWG os quais foram incubados a 28ordmC com 170 rpm de agitaccedilatildeo por ateacute
15 dias
Para realizaccedilatildeo de curvas de crescimento o cultivo foi realizado em tubos cocircnicos de
50 mL contendo 10 mL do meio de cultivo PWG ou PIM6 a 28degC com agitaccedilatildeo de 170 rpm
O cultivo foi iniciado a partir de um inoacuteculo de bacteacuterias cultivadas por 10 dias em meio
PWG (50 mL) ou meio PIM6 (50 mL) previamente submetidas a centrifugaccedilatildeo (4000 xg 10
minutos) e ressuspensas em um volume menor (~10 mL) de meio fresco O cultivo foi
iniciado com DO600nm 005 em triplicata para cada dia de mediccedilatildeo a qual for realizada apoacutes 1
3 7 10 15 e 21 dias Em alguns ensaios em meio PIM6 o cultivo foi iniciado com DO600nm
025 035 e 045 e as mediccedilotildees foram realizadas apoacutes 2 5 e 7 dias Imediatamente antes das
mediccedilotildees da DO600nm a cultura foi agitada vigorosamente para adequada suspensatildeo de ceacutelulas
eventualmente aderidas a parede do tubo (Pashalidis et al 2005 Fogaca et al 2010)
32 Extraccedilatildeo de RNA total
As curvas de crescimento de cada uma das cepas nos meios de cultivo PWG ou PIM6
guiaram os tempos de coleta de ceacutelulas no iniacutecio e no final da fase exponencial do
crescimento bacteriano para extraccedilatildeo de RNA total Os cultivos foram iniciados a partir de
inoacuteculos provenientes do cultivo por 10 dias em PWG-aacutegar na DO600nm 005 quando
realizados em meio PWG e na DO600nm 025 quando em PIM6 sendo que nesse caso as
ceacutelulas foram incubadas previamente em PIM6 por 1 dia na DO600nm 03 para ldquoaclimataccedilatildeordquo
ao meio miacutenimo antes do iniacutecio do cultivo destinado agraves extraccedilotildees de RNA total Foram
obtidas trecircs reacuteplicas bioloacutegicas do cultivo das cepas 9a5c e Temecula1 em meio PWG e
PIM6 Para as demais cepas foram obtidas duas reacuteplicas bioloacutegicas do cultivo em meio PWG
Nos tempos de cultivo determinados as ceacutelulas (50 ou 100 mL de cultura dependendo
da cepa e do meio de cultivo) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 xg 10 minutos) e
utilizadas imediatamente para extraccedilatildeo do RNA total No caso de ceacutelulas provenientes de
cultivo em meio PIM6 o precipitado celular foi incubado por 60 minutos a temperatura
ambiente com 2 mL do reagente LifeGuard (Mobio) seguindo-se nova centrifugaccedilatildeo para
completa remoccedilatildeo do reagente antes do iniacutecio do protocolo de extraccedilatildeo de RNA Esta etapa se
Procecimentos experimetais
75
mostrou essencial para preservar a integridade das moleacuteculas de RNA de ceacutelulas provenientes
de meio PIM6 mas sendo dispensaacutevel para ceacutelulas de meio PWG
Para purificaccedilatildeo de RNA total de X fastidiosa foi padronizado um protocolo que
combina os protocolos do reagente Trizol (Invitrogen) e o PureLink RNA Mini Kit (Ambion)
O reagente Trizol (1 a 3 mL dependendo da massa celular) eacute utilizado para a ressuspensatildeo do
precipitado celular e o protocolo do fabricante eacute realizado ateacute a obtenccedilatildeo da suspensatildeo de
RNA apoacutes adiccedilatildeo de isopropanol e etanol Nesta etapa do protocolo RNA em suspensatildeo eacute
entatildeo aplicado agrave coluna de purificaccedilatildeo de RNA do kit PureLink O protocolo segue conforme
especificado pelo fabricante com diversas lavagens com tampotildees sendo a eluiccedilatildeo final
realizada com aacutegua-DEPC (aacutegua preacute-tratada com DEPC dicarbonato de dietila) adicionada
ao centro do filtro A amostra de RNA purificada foi armazenada em freezer a -80degC
Aliacutequotas de 15 microL foram separadas para quantificaccedilatildeo e anaacutelise da qualidade em
espectrofotocircmetro NanoDrop e avaliaccedilatildeo da integridade por eletroforese capilar no
equipamento 2100 BioAnalyzer utilizando-se o RNA 6000 Nano kit (Agilent Technologies) A
integridade do RNA eacute avaliada pelo software do proacuteprio equipamento o qual calcula os
valores do RIN (RNA Integrity Number) (Schroeder et al 2006) baseado nos tamanhos dos
picos observados por todo o perfil eletroforeacutetico incluindo os correspondentes aos rRNAs
16S e 23S Definimos que amostras com RIN ~ 80 eram adequadas para o prosseguimento
das etapas seguintes
33 Purificaccedilatildeo de RNA total com DNase
Para a purificaccedilatildeo adicional do RNA total foi utilizada a etapa de tratamento com a
DNase do ldquoIllustra RNASpin Mini RNA isolation Kitrdquo (GE Healthcare) com modificaccedilotildees no
protocolo do fabricante Foram utilizados ateacute 15 microg de amostra de RNA total preparado como
descrito no item anterior e diluiacutedos em aacutegua-DEPC para um volume final de 100 microL e o
dobro do volume da soluccedilatildeo de DNase (20 microL) para o tratamento da amostra A reaccedilatildeo foi
incubada a temperatura ambiente por 50 minutos e apoacutes diversas lavagens com tampotildees a
eluiccedilatildeo foi realizada com 50 microL de aacutegua-DEPC preacute-aquecida a 50degC Para melhorar a
eficiecircncia do tratamento o eluato foi passado novamente pela coluna e o procedimento de
eluiccedilatildeo foi repetido Aliacutequotas de 15 microL foram separadas para anaacutelise da integridade por
eletroforese capilar no equipamento 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) como descrito
Procecimentos experimetais
76
no item 32 A eficiecircncia do tratamento com DNase foi verificada por PCR como descrito no
item 34
34 Verificaccedilatildeo da eficiecircncia do tratamento com DNase
A ausecircncia de contaminaccedilatildeo com DNA nas preparaccedilotildees de RNA apoacutes o tratamento
com DNase foi verificada por meio de PCR utilizando-se o par de oligonucleotiacutedeos
especiacutefico para X fastidiosa (Pooler e Hartung 1995) indicados abaixo e que geram um
amplicon de 500 pb
CVC-1 5rsquo-AGATGAAAACAATCATGCAAA-3rsquo
272-2-int 5rsquo-GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT-3rsquo
Amostras de DNA genocircmico de X fastidiosa foram usadas como controle positivo do
ensaio de PCR O controle negativo da reaccedilatildeo de PCR foi realizado substituindo-se a
quantidade de RNA ou de DNA por aacutegua-DEPC As reaccedilotildees de PCR (dNTPs 02 mM MgCl2
15 mM primer CVC-1 e primer 272-2 02 microM tampatildeo da enzima diluiacutedo 1x e Taq DNA
Polimerase 25U 100 ng de amostra de RNA ou DNA) foram incubadas em um
termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) a 95degC por 5 minutos
seguindo-se 40 ciclos de 95degC por 45 segundos 60degC por 30 segundos e 72degC por 2 minutos
Ao final as reaccedilotildees foram incubadas a 72degC por 10 minutos e armazenadas a 4degC ateacute anaacutelise
por eletroforese em gel de agarose
A eletroforese dos amplicons foi realizada em gel de agarose 1 em tampatildeo TBE
(Tris-base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM EDTA 2 mM pH 80) contendo 05 mgmL de
brometo de etiacutedio a 100V ateacute a saiacuteda do corante indicador Aproximadamente 8 microL da PCR
foram aplicados misturados com pelo menos 20 do volume total de tampatildeo de amostra
(corante azul de bromofenol 025 (pv) sacarose 40 (pv) Tris-base 10 mM pH 75
EDTA 1 mM) Ao final da corrida o gel foi documentado em um fotodocumentador com luz
UV e o tamanho dos amplicons foi estimado com base na comparaccedilatildeo agrave mobilidade de
fragmentos de DNA com tamanhos jaacute conhecidos (GeneRuler 1kb DNA Ladder Fermentas)
Procecimentos experimetais
77
35 Preparaccedilatildeo de bibliotecas de cDNA para sequenciamento (RNA-Seq)
351 Quantificaccedilatildeo de RNA por meacutetodo fluorimeacutetrico
Antes de iniciar a preparaccedilatildeo das bibliotecas de cDNA para sequenciamento foram
realizadas quantificaccedilotildees mais precisas das amostras de RNA total purificado utilizando o
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit (ThermoFisher Scientific) segundo o protocolo do
fabricante As amostras de RNA total purificado foram diluiacutedas para concentraccedilotildees dentro dos
limites de detecccedilatildeo da curva padratildeo que eacute gerada a partir de uma amostra de RNA de
concentraccedilatildeo conhecida fornecida pelo kit A leitura da fluorescecircncia foi realizada em um
espectrofluoriacutemetro (excitaccedilatildeo em 480 nm e a intensidade de emissatildeo medida a 520 nm)
Apoacutes a mediccedilatildeo os valores de concentraccedilatildeo (ng) das amostras de RNA total purificadas
foram extrapolados a partir da curva padratildeo
352 Depleccedilatildeo de rRNAs
As amostras de RNA total quantificadas como descrito acima foram submetidas ao
protocolo de depleccedilatildeo de rRNAs visando enriquecer a preparaccedilatildeo em mRNAs O
procedimento estaacute baseado na remoccedilatildeo seletiva de moleacuteculas de rRNAs pela hibridizaccedilatildeo
com uma mistura de oligonucleotiacutedeos de sequecircncias conservadas em rRNAs bacterianos
Para tal foi utilizado o Ribo-Zero Magnetic Kit (Gram-negative bacteria) (Illumina)
conforme as instruccedilotildees do fabricante mas com algumas modificaccedilotildees na etapa final O
protocolo recomenda a utilizaccedilatildeo de 1-5 microg de RNA total purificado e sempre que possiacutevel
foi utilizada a quantidade maacutexima de amostra Ao final da depleccedilatildeo 90 microL do sobrenadante
foram transferidos para um tubo de 15 mL e submetido a precipitaccedilatildeo com etanol overnight a
-20degC Esta alteraccedilatildeo no protocolo do fabricante visou aumentar a eficiecircncia da precipitaccedilatildeo
do RNA depletado O precipitado de RNA foi seco e em seguida ressuspendido diretamente
na soluccedilatildeo do kit de preparaccedilatildeo da biblioteca de cDNA permitindo o acoplamento imediato
dos dois protocolos
Um pequeno volume da amostra antes da etapa de precipitaccedilatildeo com etanol foi
separado para posterior anaacutelise da eficiecircncia da depleccedilatildeo de rRNAs por eletroforese capilar no
equipamento 2100 BioAnalyzer utilizando-se o RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies)
Procecimentos experimetais
78
353 Preparaccedilatildeo de bibliotecas de cDNA
Apoacutes a etapa de depleccedilatildeo de rRNAs foi iniciado imediatamente o protocolo de
preparaccedilatildeo da biblioteca de cDNA utilizando o TruSeq RNA sample preparation kit v2
(Illumina) com uma modificaccedilatildeo para acoplar o protocolo de depleccedilatildeo de rRNA Para tal o
precipitado de RNA depletado seco foi ressuspendido em 18 microL da soluccedilatildeo ldquoElute Prime
Fragment Mixrdquo do kit TruSeq RNA A partir dessa etapa o protocolo do kit TruSeq RNA foi
seguido conforme estabelecido pelo fabricante Para a siacutentese da primeira fita de cDNA foi
utilizada a transcriptase reversa ImProm II (Promega) Todos os procedimentos foram
realizados em placas de 96 poccedilos no termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems) Em diversas etapas o protocolo requer a purificaccedilatildeo da amostra para eliminaccedilatildeo
de adaptadores oligonucleotiacutedeos ou de fragmentos de cDNA muito pequenos Tais
purificaccedilotildees foram realizadas com o uso de Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter
Life Sciences) Ao final do protocolo foram coletados 30 microL da biblioteca final transferidos
para um tubo de 15 mL e este armazenado a -20degC Seguiu-se a anaacutelise de distribuiccedilatildeo dos
fragmentos da biblioteca por eletroforese capilar no equipamento 2100 BioAnalyzer
utilizando-se o High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies) e quantificaccedilatildeo por qPCR
absoluto como descrito no item 355 Em uma das etapas do protocolo cada biblioteca de
cDNA eacute identificada pela ligaccedilatildeo de adaptadores de sequecircncias conhecidas e distintas
(indexes ou barcodes) agraves duas extremidades dos fragmentos de cDNA o que possibilita o
sequenciamento simultacircneo de mais de uma biblioteca de cDNA em uma mesma corrida
354 Preparaccedilatildeo de bibliotecas de pequenos RNAs (sRNAs)
Para a preparaccedilatildeo de bibliotecas de pequenos RNAs (sRNAs) de X fastidiosa foi
adaptado um protocolo empregando o NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina
(New England Biolabs) que eacute utilizado na preparaccedilatildeo de bibliotecas de microRNAs
eucarioacuteticos Este kit exige que as moleacuteculas de RNA estejam monofosforiladas na
extremidade 5rsquo e hidroxiladas na extremidade 3rsquo Os sRNAs bacterianos natildeo processados
apresentam extremidade 5rsquo trifosforilada Dessa forma foram realizadas duas etapas
anteriores ao primeiro passo do kit nas quais foram utilizadas as enzimas RNA 5rsquo
Pyrophosphohydrolase (RppH) (New England Biolabs) e T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK)
(New England Biolabs) A T4 PNK adicionaria um monofosfato na extremidade 5rsquo de
Procecimentos experimetais
79
moleacuteculas natildeo-fosforiladas enquanto a RppH removeria um pirofosfato da extremidade 5acute de
moleacuteculas trifosforiladas deixando um monofosfato em 5rsquo Assim amostras de RNA total
foram tratadas com a RppH (25 U) em uma reaccedilatildeo com volume final de 50 microL e 500 ng de
RNA Foi realizada uma incubaccedilatildeo por 30 min a 37degC Apoacutes o teacutermino dessa reaccedilatildeo foi
adicionada a T4 PNK (10 U) e ATP 1 mM seguindo-se incubaccedilatildeo por 30 min a 37degC O
tampatildeo utilizado em ambas as reaccedilotildees foi o T4 PNK buffer Ao final as enzimas foram
inativadas pela adiccedilatildeo de EDTA 500 mM pH80 e incubaccedilatildeo por 20 min a 65degC seguindo-se
purificaccedilatildeo do RNA total com MinElute PCR Purification kit (Qiagen) O protocolo de
purificaccedilatildeo foi seguido conforme sugerido pelo fabricante sendo que foi utilizado acetato de
soacutedio 3 M pH 50 para corrigir o pH apoacutes adiccedilatildeo do tampatildeo inicial do kit Ao final a amostra
de RNA foi eluiacuteda em 10 microL de tampatildeo Tris-HCl 10 mM pH 85
Em seguida foi iniciado o protocolo de preparaccedilatildeo de bibliotecas de sRNAs seguindo
conforme sugerido pelo fabricante O RNA total tratado com RppH e T4 PNK foi utilizado
para ligaccedilatildeo de adaptadores agrave extremidade 3rsquo que pode ser realizada de duas formas incubar
a reaccedilatildeo a 25degC por 1 hora (biblioteca A) ou incubar a reaccedilatildeo a 16degC por 18 horas (biblioteca
B) sendo que esta uacuteltima condiccedilatildeo pode aumentar a eficiecircncia na ligaccedilatildeo dos adaptadores a
RNAs metilados Dessa forma a amostra foi submetida agraves duas condiccedilotildees paralelamente e as
demais etapas do protocolo foram realizadas como recomendado pelo fabricante exceto pela
utilizaccedilatildeo de 15 ciclos na etapa de amplificaccedilatildeo dos fragmentos por PCR Apoacutes o teacutermino do
protocolo as bibliotecas foram novamente purificadas utilizando o MinElute PCR
Purification kit (Qiagen) e a seleccedilatildeo por tamanho dos fragmentos foi realizada com as
Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter Life Sciences) Ao final a amostra purificada
e selecionada foi eluiacuteda em 15 microL de aacutegua-DEPC Seguiu-se a anaacutelise de distribuiccedilatildeo dos
fragmentos da biblioteca por eletroforese capilar no equipamento 2100 BioAnalyzer
utilizando-se o High Sensitivity DNA kit (Agilent Technologies) e quantificaccedilatildeo por qPCR
absoluto como descrito no item 355
355 Quantificaccedilatildeo de bibliotecas de cDNA por qPCR absoluto
A quantificaccedilatildeo das bibliotecas de cDNA foi realizada por meio de qPCR (PCR
quantitativo) absoluto utilizando o Kapa Library Quantification kit (Kapa Biosystems) para
plataformas de sequenciamento Illumina O kit dispotildee de amostras de DNA com
concentraccedilotildees conhecidas para gerar uma curva padratildeo que varia entre 20 pM a 00002 pM
Procecimentos experimetais
80
Antes do ensaio de qPCR a concentraccedilatildeo das bibliotecas de cDNA foi estimada baseando-se
na quantificaccedilatildeo por espectrofotocircmetro NanoDrop tamanho meacutedio dos fragmentos da
biblioteca obtido por eletroforese capilar e uma tabela de conversatildeo ngmicroL em nM (protocolo
Nextera DNA Sample Preparation Guide da Illumina) e devidamente diluiacutedas para
concentraccedilotildees nos limites da curva padratildeo Os ensaios de qPCR foram realizados no
equipamento 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) a 95degC por 5 minutos
seguindo-se 35 ciclos de 95degC por 30 segundos e 60degC por 45 segundos A anaacutelise foi
realizada com o software do proacuteprio equipamento que gera curvas de amplificaccedilatildeo para cada
amostra e fornece o caacutelculo do CT (Cycle Threshold) Os valores meacutedios de CT foram
utilizados para calcular a concentraccedilatildeo das bibliotecas com base na curva padratildeo do kit sendo
ainda realizado um ajuste da concentraccedilatildeo baseado no tamanho meacutedio dos fragmentos de cada
biblioteca
36 Sequenciamento de DNA no equipamento MiSeq (Illumina)
O sequenciamento das bibliotecas de cDNA foi realizado no equipamento MiSeq
(Illumina) com o MiSeq Reagent Kit v2 de 500 ciclos com a estrateacutegia de sequenciamento
Paired-End que resulta em sequecircncias (reads) de ateacute 250 nucleotiacutedeos para cada extremidade
de um fragmento sequenciado No maacuteximo 8 bibliotecas de cDNA com iacutendices distintos e
compatiacuteveis foram sequenciadas em uma mesma corrida Antes de iniciar o sequenciamento
a concentraccedilatildeo das bibliotecas a serem sequenciadas foi ajustada para 4 nM e o mesmo
volume de cada uma delas foi misturado em um uacutenico tubo seguindo-se adiccedilatildeo de volume
igual de NaOH 02N e incubaccedilotildees a temperatura ambiente por 5 minutos e a 95degC por 1
minuto Apoacutes essa etapa de desnaturaccedilatildeo foi realizada a diluiccedilatildeo com tampatildeo fornecido pelo
kit para concentraccedilatildeo final de 6 a 10 pM seguindo-se aplicaccedilatildeo de todo volume (600 microL) do
pool desnaturado de bibliotecas no cartucho de sequenciamento
O workflow escolhido para a anaacutelise apoacutes a corrida foi o Generate FastQ Tal formato
de arquivo de saiacuteda permite obter as sequecircncias geradas na corrida (read1 e read2) acoplado
com a informaccedilatildeo da qualidade para cada nucleotiacutedeo sequenciado
O sequenciamento das bibliotecas de sRNAs foi realizado com menor nuacutemero de
ciclos (50 ciclos) e com a estrateacutegia single-end
Os sequenciamentos foram realizados sempre que possiacutevel no equipamento MiSeq
(Illumina) instalado no Centro Avanccedilado de Tecnologias em Genocircmica (CATG) do Instituto
Procecimentos experimetais
81
de Quiacutemica da Universidade de Satildeo Paulo Poreacutem algumas poucas corridas foram realizadas
no MiSeq instalado no Centro de Facilidades de Apoio agrave Pesquisa (CEFAP) do Instituto de
Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade de Satildeo Paulo
37 Anaacutelises bioinformaacuteticas e estatiacutesticas
Apoacutes o teacutermino do sequenciamento satildeo gerados arquivos em formato FastQ contendo
as sequecircncias (read1 e read2) com informaccedilatildeo do escore de qualidade (Q score) para cada
nucleotiacutedeo atribuiacutedo pelo software do proacuteprio MiSeq Os arquivos FastQ gerados para cada
biblioteca foram submetidos a anaacutelise com o software FASTQC (Andrews et al 2014) que
gera plotagens baseadas no Q score por base sequenciada distribuiccedilatildeo de Q score meacutedio de
cada sequecircncia obtida conteuacutedo de adaptadores remanescentes entre outras informaccedilotildees
O mapeamento das sequecircncias obtidas por RNA-Seq nas respectivas sequecircncias
genocircmicas de referecircncia foi realizado utilizando o software CLC Genomics Workbench
versatildeo 654 com o moacutedulo RNA-Seq analysis Foram utilizados arquivos em formato gbk o
qual conteacutem as informaccedilotildees das sequecircncias de todos os genes anotados dos genomas de
referecircncia Duas opccedilotildees de mapeamento foram realizadas gerando listas de genes com
valores de expressatildeo normalizados por FPKM (Fragments per kilobase transcript per million
reads) (Mortazavi et al 2008) ou com valores brutos de contagem de quantas sequecircncias
mapearam em cada gene
Anaacutelises de correlaccedilatildeo de Pearson entre as reacuteplicas bioloacutegicas foram realizadas com os
valores de expressatildeo por FPKM utilizando a funccedilatildeo cortest do pacote stats do software R (R
Core Team 2013) Para as anaacutelises estatiacutesticas de expressatildeo diferencial entre genes de
transcritomas diferentes foi usado o pacote DESeq2 (Love et al 2014) do software R (R
Core Team 2013) usando como dados de entrada os valores brutos de contagem de
sequecircncias para cada gene Como paracircmetros para definir um gene como diferencialmente
expresso entre duas condiccedilotildees distintas foi estabelecido ter um valor de padj lt 005 e um
valor de log2FoldChange gt |1| A funccedilatildeo plotMA do mesmo pacote foi usada para gerar os
graacuteficos de dispersatildeo dos genes baseados em seus respectivos valores de expressatildeo meacutedia e
razatildeo de expressatildeo A funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots foi utilizada para gerar heatmaps
enquanto que a funccedilatildeo radarchart do pacote fmsb foi usada para gerar os Radar Charts
ambas no software R (R Core Team 2013) 4 httpwwwclcbiocom
Procecimentos experimetais
82
O software Rockhopper2 (Tjaden 2015) foi utilizado para anaacutelises de regiotildees natildeo
traduzidas (Untranslated regions ou UTR) e definiccedilatildeo de operons
Anaacutelises comparativas de genes dos genomas de X fastidiosa foram realizadas
utilizando-se a plataforma IMGER (Integrated Microbial Genomes-Expert Review)
(Markowitz et al 2012) Para pesquisa de identidadesimilaridade de sequecircncias de DNA ou
de proteiacutenas tambeacutem foram utilizados os programas BLASTn BLASTp e BLASTx (Altschul et
al 1990) em bases puacuteblicas de dados tais como GenBank do NCBI (National Center for
Biotechnology Information5) Xylella fastidiosa Genome Project6 e Xylella fastidiosa -
Pierces Disease Strain Genome Project7
Anaacutelises funcionais dos transcritomas foram realizadas com o software MinPath (Ye e
Doak 2009) que analisa quais as vias metaboacutelicas estatildeo representadas nos transcritomas
sendo considerado os genes com valores de FPKM acima de 10 Os dados tambeacutem foram
submetidos agrave classificaccedilatildeo funcional com base nas categorias do Gene Ontology (Ashburner
et al 2000 Gene Ontology Consortium 2004) e vias KEGG (Kanehisa e Goto 2000
Kanehisa et al 2016) para avaliaccedilatildeo de vias enriquecidas (Plt005) em determinada condiccedilatildeo
quando comparada a outra Para isso foram utilizados os genes diferencialmente expressos e o
web-software BayGO (Vencio et al 2006)
As sequecircncias obtidas com o sequenciamento de bibliotecas de sRNAs foram
submetidas a montagem com o software MIRA (Chevreux et al 1999) para que fossem
gerados contigs representativos das sequecircncias completas dos candidatos a sRNAs aleacutem de
fornecer informaccedilotildees do nuacutemero de reads usados para gerar cada possiacutevel sequecircncia completa
de sRNA As sequecircncias dos sRNAs de ambas as bibliotecas foram comparadas entre si por
meio da ferramenta BLAST (Altschul et al 1990) de modo a identificar quais candidatos
foram encontrados nas duas bibliotecas O mesmo procedimento foi aplicado na comparaccedilatildeo
das sequecircncias das bibliotecas com a sequecircncia genocircmica da cepa 9a5c para a obtenccedilatildeo das
coordenadas genocircmicas dos sRNAs
5 httpwwwncbinlmnihgov 6 httpaeglbiicunicampbrxf
7 httpaeglbiicunicampbrworldxfpd
Resultados e Discussatildeo
83
4 Resultados e Discussatildeo
Como jaacute mencionado este trabalho teve como objetivo sequenciar analisar e
comparar os transcritomas de diferentes cepas de Xylella fastidiosa no iniacutecio e fim da
fase exponencial de crescimento em meio rico PWG e em meio miacutenimo PIM6 Para a
descriccedilatildeo do repertoacuterio completo de genes que satildeo expressos ou diferencialmente
expressos nestas condiccedilotildees foi utilizada a teacutecnica de RNA-Seq
O meio PWG eacute um meio complexo e completo utilizado corriqueiramente no
cultivo de X fastidiosa O meio PIM6 foi desenvolvido como uma alternativa para
reproduzir a composiccedilatildeo da seiva do xilema que sabidamente eacute pobre em nutrientes De
modo geral essa bacteacuteria tem crescimento lento no cultivo in vitro com tempo de
duplicaccedilatildeo gt9 horas dependendo do meio de cultivo Nas plantas X fastidiosa coloniza
exclusivamente o luacutemen dos vasos do xilema e eacute considerada um fitopatoacutegeno
generalista em razatildeo da ampla gama de hospedeiros em que jaacute foi encontrada
(Chatterjee et al 2008 Janse e Obradovic 2010 Almeida e Nunney 2015)
As principais etapas envolvidas na obtenccedilatildeo dos transcritomas de diferentes
cepas de X fastidiosa estatildeo esquematizadas na Figura 1 Os resultados obtidos seratildeo
apresentados e discutidos em duas partes
A) Descriccedilatildeo e comparaccedilatildeo dos transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 no
iniacutecio e fim da fase exponencial de crescimento nos meios PWG e PIM6 Estas duas
cepas satildeo consideradas cepas de referecircncia e apresentam diferenccedilas genocircmicas e
fenotiacutepicas no cultivo in vitro Aleacutem de anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial e
descriccedilatildeo de rotas e vias metaboacutelicas enriquecidas em cada condiccedilatildeo experimental o
sequenciamento do transcritoma destas duas cepas foi utilizado na definiccedilatildeo das regiotildees
natildeo-traduzidas dos genes (5rsquoUTR e 3rsquoUTR) e identificaccedilatildeo de operons preditos nestes
genomas Tambeacutem foram identificados transcritos que potencialmente satildeo sRNAs na
cepa 9a5c
B) Descriccedilatildeo e comparaccedilatildeo dos transcritomas de oito cepas isoladas de citros
(cepas 9a5c J1a12 U24d e Fb7) de cafeeiro (cepa 3124) de hibisco (cepa Hib4)
ameixeira (cepa Pr8x) e de videira (cepa Temecula1) no iniacutecio e fim da fase
exponencial de crescimento no meio PWG Ao contraacuterio das cepas Temecula1 e 9a5c
as outras seis cepas satildeo ainda pouco estudadas mas tambeacutem apresentam diferenccedilas
genocircmicas e fenotiacutepicas in vitro A anaacutelise comparativa de transcritomas de cepas de X
fastidiosa que foram isoladas de diferentes espeacutecies de plantas busca associar eventuais
Resultados e Discussatildeo
84
diferenccedilas na expressatildeo gecircnica aos seus respectivos fenoacutetipos e especificidade de
hospedeiro
Figura 1 Etapas para obtenccedilatildeo dos transcritomas de X fastidiosa por RNA-Seq
Resultados e Discussatildeo
85
Parte A) Descriccedilatildeo e comparaccedilatildeo dos transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1
41 Curva de crescimento das cepas 9a5c e Temecula1 em meio PWG e PIM6
O crescimento das cepas 9a5c e Temecula1 foi avaliado em meio PWG e PIM6
por 21 dias com o objetivo de melhor definir os tempos de coleta representativos da
fase inicial e final do crescimento exponencial Como esperado em ambas as cepas foi
observado um maior crescimento no meio rico PWG em comparaccedilatildeo ao meio miacutenimo
PIM6 sendo que a fase estacionaacuteria foi atingida muito mais cedo nesse meio (Figura 2)
A cepa 9a5c aparentemente sustentou um melhor crescimento no meio PWG do
que a cepa Temecula1 uma vez que alcanccedilou uma densidade celular mais alta
(DO600nm= 14) ao atingir a fase estacionaacuteria (~10 dias) A cepa Temecula1 cresceu
rapidamente no iniacutecio do cultivo (DO600nm 005 para 03 em 3 dias) poreacutem atingiu mais
cedo a fase estacionaacuteria (7 dias) com a metade do valor de densidade celular da cepa
9a5c (DO600nm= 07) (Figura 2)
As curvas de crescimento (Figura 2) mostram um modesto aumento da
populaccedilatildeo de ceacutelulas no iniacutecio do cultivo no meio PIM6 para ambas as cepas embora
com uma baixa densidade celular (DO600nm= 01) ao alcanccedilar a fase estacionaacuteria (3
dias) muito antes do observado no meio PWG Portanto ainda que o PIM6
supostamente mimetize a composiccedilatildeo do fluido xilemaacutetico este meio natildeo eacute adequado
para cultivos de longo prazo
Comparaccedilotildees entre o crescimento em diferentes meios de cultivo com
composiccedilotildees distintas foram analisadas em outros estudos Curvas de crescimento
foram obtidas para o meio definido 3G10-R e o meio complexo PW No meio 3G10-R
foi observado um atraso para atingir a fase estacionaacuteria com uma fase exponencial
pouco evidente enquanto que no meio PW a fase estacionaacuteria foi alcanccedilada com poucos
dias (Ciraulo et al 2010) Ao contraacuterio no presente estudo o crescimento no meio
definido PIM6 atingiu mais cedo a fase estacionaacuteria do que no meio complexo PWG o
qual levou mais tempo ateacute atingi-la com mais de 10 dias ambos com fases exponenciais
definidas Tal resultado corrobora o observado em um estudo com o crescimento in
vitro de Xylella em seiva do xilema de videiras no qual foi observada uma antecipaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
86
da chegada agrave fase estacionaacuteria em comparaccedilatildeo com um meio complexo artificial (Zaini
et al 2009)
Para obter quantidade de ceacutelulas para extraccedilatildeo de RNA total suficiente para o
RNA-Seq foram realizados novos ensaios em meio PIM6 iniciando-se o cultivo com
densidades celulares mais altas (dados natildeo mostrados) Desta forma foi definido que os
experimentos para obtenccedilatildeo das amostras de RNA total de ceacutelulas cultivadas neste meio
iniciariam com a DO600nm 025
Estas anaacutelises de crescimento guiaram a definiccedilatildeo do tempo e as condiccedilotildees de
cultivo das cepas 9a5c e Temecula1 para a extraccedilatildeo de RNA total para a anaacutelise
comparativa do transcritoma nestes dois meios Baseando-se nas curvas de crescimento
foi decidido pela coleta no 1deg e 3deg dias (iniacutecio da fase exponencial) nos meios PIM6 e
PWG respectivamente para ambas as cepas Para as amostras do final da fase
exponencial foram definidos o 3deg dia para o meio PIM6 em ambas as cepas e o 7deg e 10deg
dias para o meio PWG em Temecula1 e 9a5c respectivamente (Figura 2)
Como mostrado na Figura 3 pode-se observar uma grande variaccedilatildeo nos
fenoacutetipos do cultivo in vitro em PIM6 ou PWG de ambas as cepas quanto a formaccedilatildeo
de agregados em soluccedilatildeo (ceacutelulas planctocircnicas) e de agregados aderidos agrave parede do
frasco (ceacutelulas em biofilme) Os diferentes fenoacutetipos apresentados pelas duas cepas em
situaccedilotildees de cultivo semelhantes satildeo indicativos de provaacuteveis diferenccedilas em seus
respectivos perfis de expressatildeo gecircnica
Resultados e Discussatildeo
87
Figura 2 Curva de crescimento das cepas 9a5c e Temecula1 As ceacutelulas das cepas 9a5c (painel superior) e Temecula1 (painel inferior) foram crescidas em tubos cocircnicos de 50 mL com DO600nm inicial de 005 nos meios PWG e PIM6 a 28oC e 170 rpm Mediccedilotildees da DO600nm foram realizadas nos 1deg 3deg 7deg 10deg 15deg e 21deg dias de crescimento Barras verticais representam o desvio padratildeo da meacutedia de trecircs reacuteplicas teacutecnicas
Figura 3 Fenoacutetipo do cultivo das cepas 9a5c e Temecula1 nos dias escolhidos para a extraccedilatildeo de RNA total (A) cepa 9a5c com 1 dia em PIM6 (B) cepa 9a5c com 3 dias em PIM6 (C) cepa 9a5c com 3 dias em PWG (D) cepa 9a5c com 10 dias em PWG (E) cepa Temecula1 com 1 dia em PIM6 (F) cepa Temecula1 com 3 dias em PIM6 (G) cepa Temecula1 com 3 dias em PWG (H) cepa Temecula1 com 7 dias em PWG DO600nm inicial de 025 para o cultivo em meio PIM6 e 005 para o cultivo em PWG As imagens mostram uma de trecircs reacuteplicas bioloacutegicas para cada condiccedilatildeo Frascos incubados a 28degC e 170 rpm
Resultados e Discussatildeo
88
42 Obtenccedilatildeo dos transcritomas por RNA-Seq
O primeiro requerimento criacutetico para o sucesso da teacutecnica de RNA-Seq eacute a
obtenccedilatildeo das amostras de RNA total com elevado grau de pureza e integridade A
pureza das preparaccedilotildees de RNA eacute avaliada pela medida da absorbacircncia a 230 260 e 280
nm sendo desejaacutevel a obtenccedilatildeo de razotildees A260nmA280nm e A260nmA230nm gt 18 A
integridade eacute analisada por eletroforese capilar no equipamento 2100 Bioanalyzer
(Agilent Technologies) o qual calcula o RNA Integrity Number (RIN) que deve ser gt8
A Tabela 3 lista estes paracircmetros de qualidade para todas as amostras de RNA extraiacutedas
das cepas 9a5c e Temecula1 que de modo geral foram bastante adequados
especialmente para as preparaccedilotildees originadas de PWG No caso das preparaccedilotildees de
meio PIM6 foi necessaacuterio o uso do LifeGuard (MoBio Laboratories) para obtenccedilatildeo de
RIN gt 70 Aleacutem disso a completa remoccedilatildeo do DNA das preparaccedilotildees de RNA total foi
confirmada por PCR com um par de primers especiacutefico para detecccedilatildeo de DNA de X
fastidiosa (dados natildeo mostrados)
A Tabela 3 tambeacutem inclui as quantificaccedilotildees das amostras de RNA total tanto
pela medida da A260nm no NanoDrop quanto por meacutetodo fluorimeacutetrico (reagente
RiboGreen) que eacute mais preciso Note que a mediccedilatildeo da A260nm medida no NanoDrop
superestimou a concentraccedilatildeo do RNA em relaccedilatildeo agraves determinadas com o reagente
RiboGreen
Apoacutes as anaacutelises de qualidade e pureza das preparaccedilotildees de RNA foi realizada a
depleccedilatildeo de moleacuteculas de rRNAs para obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo enriquecida em mRNAs
seguindo-se anaacutelise por eletroforese capilar Esta etapa tambeacutem eacute criacutetica uma vez que
os rRNAs constituem mais de 90 do RNA total bacteriano Para todas as amostras
indicadas na Tabela 3 a eficiecircncia na remoccedilatildeo de rRNAs foi alta quando foi utilizado 3-
5 microg de RNA total (dados natildeo mostrados)
Finalmente as amostras de RNA purificadas e depletadas de rRNAs foram
utilizadas para a preparaccedilatildeo das bibliotecas de cDNA Para todas elas foi obtido um
excelente rendimento quanto a concentraccedilatildeo como na qualidade e pureza (Tabela 3) A
concentraccedilatildeo das bibliotecas foi determinada por qPCR absoluto em que satildeo utilizados
iniciadores complementares aos adaptadores utilizados na confecccedilatildeo das bibliotecas
Aleacutem da quantificaccedilatildeo precisa (Tabela 3) este ensaio tambeacutem avalia a eficiecircncia do
protocolo de preparaccedilatildeo das bibliotecas uma vez que somente seratildeo amplificados os
Resultados e Discussatildeo
89
fragmentos que tiveram os adaptadores corretamente ligados em suas extremidades
Outro paracircmetro relevante eacute o tamanho meacutedio dos fragmentos de cDNA da biblioteca o
qual eacute definido em eletroforese capilar
As 24 bibliotecas de cDNA foram sequenciadas em cinco corridas no
equipamento MiSeq (Illumina) utilizando a estrateacutegia de Paired-End com um kit para
500 ciclos Dessa forma esperava-se sequecircncias de ateacute 250 bases correspondentes a
cada extremidade do fragmento sequenciado O rendimento destas corridas foi
excelente com quantidades de sequecircncias muito proacuteximas ou ateacute maiores do que o
previsto pelo fabricante que eacute de 25 milhotildees de sequecircncias (Tabela 4) Aleacutem disso uma
alta porcentagem das sequecircncias apresentou alta qualidade de sequenciamento
aumentando a confiabilidade nos dados o que seraacute discutido na proacutexima seccedilatildeo A
densidade de clusters de fragmentos formados na flow cell na etapa inicial do
sequenciamento excedeu os valores tidos como seguros (Tabela 4) os quais segundo o
fabricante devem estar entre 1000 e 1200 Poreacutem felizmente este fato natildeo interferiu no
rendimento do sequenciamento
Resultados e Discussatildeo
90
Tabela 3 Dados das amostras de RNA das duas cepas nas condiccedilotildees de cultivo indicadas (painel esquerdo) e de suas respectivas bibliotecas de cDNA (painel direito)
Cepa Meio de cultivo
Tempo (dias)
NanoDrop (ngmicroL)
A260 280
A260 230
RIN RiboGreen
(ngmicroL) NanoDrop
(ngmicroL) A260 280
A260 230
Tamanho meacutedio (pb)
qPCR (nM)
Reacuteplica 9a
5c
PIM6
1 3298 207 248 81 3486 795 180 197 390 1136 1
1992 209 242 71 1889 683 183 229 366 1916 2
2390 211 241 74 1188 768 181 225 457 2248 3
3 2459 208 240 79 1651 820 180 226 375 3647 1
2588 212 246 86 2011 740 180 226 376 2965 2
2461 210 239 80 1403 845 181 220 469 1695 3
PWG
3 2948 212 132 84 2968 581 180 232 361 2181 1
2653 209 219 73 2753 616 183 226 407 1466 2
2619 211 245 85 1474 931 182 225 461 2510 3
10 3282 210 247 84 2927 353 178 196 355 589 1
2586 213 242 82 2527 633 182 220 365 831 2
2733 211 242 86 1680 807 184 232 471 1980 3
Tem
ecul
a1
PIM6
1 2397 211 247 81 2654 411 178 228 356 1460 1
2321 209 224 78 1639 521 185 225 385 1711 2
2510 210 244 81 1707 888 183 219 450 2136 3
3 2411 210 244 80 1979 582 179 209 353 2484 1
2405 210 235 84 1843 594 179 213 345 2888 2
2279 210 239 87 1096 692 183 207 429 1990 3
PWG
3 2645 212 242 83 1776 857 184 225 410 2508 1
2676 211 217 82 2098 702 179 208 384 2710 2
2662 213 246 86 1675 914 184 219 443 2309 3
7 4476 209 245 83 4715 644 179 172 388 1164 1
2536 208 237 80 2359 539 180 226 365 1903 2
2611 212 245 89 1476 765 183 217 443 2060 3
Resultados e Discussatildeo
91
Tabela 4 Resumo do rendimento das cinco corridas contendo as bibliotecas das cepas 9a5c e Temecula1
Corrida Total de
sequecircncias Sequecircncias filtradas
Nuacutemero de bibliotecas
Densidade de clusters
gtQ30
1 25687600 16908052 4 1439 777
2 29269792 23373882 5 1607 753
3 27988934 23358634 4 1547 777
4 26881580 22864072 5 1451 777
5 24908752 22505602 8 1303 819
Paired-End reads Filtragem que remove sequecircncias com baixa qualidade gtQ30 indica sequecircncias de alta qualidade
43 Anaacutelise da qualidade das sequecircncias dos transcritomas
Antes de realizar o mapeamento das sequecircncias nos genomas de referecircncia e
outras anaacutelises mais aprofundadas foram realizadas anaacutelises para verificar a qualidade
das sequecircncias obtidas a partir de todas as bibliotecas de cDNA
Como exemplo seraacute discutido o resultado das anaacutelises das sequecircncias da
primeira reacuteplica da amostra de RNA da cepa 9a5c crescida por 1 dia em meio PIM6
(Figura 4) A anaacutelise de qualidade com software FASTQC (Andrews et al 2014) foi
feita separadamente com sequecircncias de cada uma das extremidades no sequenciamento
Paired-End (Figura 4A e 4B) com as sequecircncias de ambas as extremidades jaacute pareadas
(Figura 4C) e com as sequecircncias apoacutes o quality trimming (gtQ30) (Figura 4D) realizado
com o software CLC Genomics Workbench Este processo consiste em encurtar
sequecircncias deletando parte de suas bases com escores de qualidade inferiores ao
threshold desejado ou mesmo remover sequecircncias inteiras com valores meacutedios de
qualidade abaixo deste threshold
As anaacutelises de qualidade de base indicam que agrave medida que o tamanho da
sequecircncia aumenta o seu escore meacutedio de qualidade diminui ou seja sequecircncias mais
longas tendem a apresentar um maior nuacutemero de bases com escores de qualidade
inferiores (Figura 4) Este efeito eacute menor para as sequecircncias da primeira extremidade
(read1) (Figura 4A) do que para a segunda extremidade (read2) (Figura 4B) Esta
variaccedilatildeo eacute intriacutenseca da tecnologia utilizada (MiSeqIllumina) na qual o rendimento dos
reagentes sofre uma queda durante a segunda metade da corrida de 500 ciclos afetando
muito mais a qualidade das sequecircncias da segunda extremidade Mesmo assim a anaacutelise
das sequecircncias pareadas (Figura 4C) mostrou que a menor qualidade do read2 natildeo
Resultados e Discussatildeo
92
prejudica a qualidade do read1 A anaacutelise das sequecircncias submetidas ao quality
trimming mostrou como esperado somente sequecircncias acima do escore Q30 (Figura
4D) Poreacutem trata-se de um criteacuterio muito elevado de qualidade uma vez praticamente
todas as sequecircncias foram encurtadas o que poderia prejudicar o mapeamento correto
no genoma Assim foi definido que para as anaacutelises de expressatildeo diferencial
subsequentes seriam utilizadas as sequecircncias sem realizar o processo de trimming
A estrateacutegia de realizar ou natildeo trimming de sequecircncias de RNA-Seq eacute
controversa Williams e colaboradores (Williams et al 2016) avaliaram o impacto do
trimming na anaacutelise de expressatildeo diferencial Para tal eles geraram conjuntos de dados
de RNA-Seq de quatro amostras de neurocircnios sensoriais de larvas de Drosophila
melanogaster e usaram trecircs algoritmos para o trimming baseado na qualidade de base
com diferentes paracircmetros de Q escore Com os paracircmetros de trimming mais
agressivos mais de 10 dos genes tiveram mudanccedilas significativas nos seus niacuteveis de
expressatildeo Observaram este mesmo padratildeo com outros dois conjuntos de dados de
RNA-Seq e com pipelines alternativos de anaacutelise de expressatildeo genica Uma fonte
consideraacutevel das diferenccedilas observadas pode ser atribuiacuteda ao alinhamento de reads
curtos resultantes do trimming mais agressivo Eles ainda realizaram uma comparaccedilatildeo
entre dados de RNA-Seq e microarranjos e sugerem que realizar nenhum trimming ou
trimming moderado resulta em estimativas de expressatildeo gecircnica bem mais acuradas Em
resumo estes autores concluem que o trimming agressivo pode influenciar fortemente a
acuraacutecia da estimativa de niacuteveis de expressatildeo gecircnica o que subsequentemente impacta
na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos De todo modo eles sugerem que
deve ser avaliado em cada caso se o trimming seraacute ou natildeo beneacutefico para o tipo de
anaacutelise a ser realizada (Williams et al 2016)
De modo geral todos os transcritomas sequenciados neste trabalho apresentaram
padrotildees de qualidade semelhantes ao exemplo mostrado na Figura 4 evidenciando a
robustez da teacutecnica de RNA-Seq e a confiabilidade dos dados obtidos
Resultados e Discussatildeo
93
Figura 4 Anaacutelise da qualidade por base das sequecircncias da primeira reacuteplica da cepa 9a5c cultivada por 1 dia em PIM6 (A) anaacutelise das sequecircncias da primeira extremidade (read1) (B) anaacutelise das sequecircncias da segunda extremidade (read2) (C) anaacutelise com as sequecircncias pareadas (read1+read2) (D) anaacutelise apoacutes o quality trimming (Qgt30) As anaacutelises foram realizadas usando o software FASTQC O eixo das abcissas conteacutem os tamanhos das sequecircncias (1 ateacute 250) enquanto que o eixo das ordenadas conteacutem os valores de Q escore (de 0 a 40)
44 Mapeamento das sequecircncias dos transcritomas nos genomas de referecircncia
Apoacutes anaacutelise de qualidade das sequecircncias foi realizado o mapeamento nos
respectivos genomas de referecircncia Para tal os arquivos em formato FastQ contendo as
sequecircncias e seus respectivos escores de qualidade por base para o sequenciamento de
ambas extremidades foram importados para o software CLC Genomics Workbench O
mapeamento foi realizado pelo pareamento do read1 e do read2 de cada fragmento ao
genoma de referecircncia (no caso genomas das cepas 9a5c e Temecula1 incluindo seus
respectivos plasmiacutedeos) o que possibilita a obtenccedilatildeo do tamanho da sequecircncia que
separa as extremidades pareadas de cada fragmento mapeado A Tabela 5 mostra que
em todos os transcritomas foi obtida uma alta porcentagem de mapeamento variando
entre 70-903 Vale lembrar que o genoma X fastidiosa tem tamanho de ~28 Mpb e
que a cepa 9a5c tem 2 plasmiacutedeos (pXF51 de ~51 kbp e pXF13 de ~13 kpb) enquanto
Resultados e Discussatildeo
94
que a cepa Temecula1 possui apenas o pXFPD13 de ~13 kpb (Simpson et al 2000
Van Sluys et al 2003)
O nuacutemero de sequecircncias por biblioteca variou de 5 a 18 milhotildees (Tabela 5) Esta
variaccedilatildeo reflete tanto o nuacutemero de bibliotecas que foram combinadas em uma corrida de
sequenciamento bem como o seu rendimento mas todas apresentaram cobertura
plenamente satisfatoacuteria sendo que a quantidade de fragmentos sequenciados estaacute dentro
do recomendado para anaacutelises de RNA-Seq para genomas bacterianos Por exemplo em
um estudo que explorou dados de transcritomas para duas reacuteplicas bioloacutegicas de
Escherichia coli obtidas no iniacutecio e no final do crescimento foi concluiacutedo que 2 a 3
milhotildees de sequecircncias por amostra satildeo suficientes para se obter e identificar genes
diferencialmente expressos (fold change gt2) com alta significacircncia estatiacutestica no caso
de dados de duas reacuteplicas bioloacutegicas altamente correlatas Tais anaacutelises foram realizadas
com diferentes profundidades de nuacutemero de sequecircncias sugerindo inclusive que um
aumento excessivo da profundidade de sequenciamento pode ser prejudicial para um
mapeamento acurado dos transcritos com relevacircncia bioloacutegica (Haas et al 2012)
Tabela 5 Resumo do rendimento de cada biblioteca sequenciada
Cepa Meio
de cultivo
Tempo (dias)
Total de sequecircncias
Tamanho meacutedio (bases)
Distacircncia entre paired reads
(bases)
Sequecircncias mapeadas
Reacuteplica
9a5c
PIM6
1
9687644 173 70 a 248 7897614 (815) 1
7649084 157 63 a 245 5276706 (700) 2
5899510 160 73 a 249 5170546 (876) 3
3
8386060 158 73 a 251 7219356 (861) 1
9421628 157 68 a 250 8116162 (861) 2
5705434 160 72 a 249 5003758 (877) 3
PWG
3
6308458 163 78 a 241 4484794 (711) 1
13830460 161 74 a 241 9995040 (723) 2
5231176 163 74 a 249 4523362 (865) 3
10
8608030 168 70 a 241 7170120 (833) 1
18589024 161 71 a 246 14220660 (765) 2
6029866 161 71 a 250 5178372 (859) 3
Tem
ecul
a1
PIM6
1
5593228 158 73 a 244 4615180 (825) 1
10209216 152 69 a 241 8472134 (830) 2
5302846 167 75 a 300 4754520 (897) 3
3
9916280 156 69 a 240 8500780 (857) 1
7976518 153 68 a 249 6955478 (872) 2
5186310 161 74 a 248 4560958 (879) 3
PWG 3 12094328 166 71 a 241 9511234 (786) 1
9624394 162 71 a 250 8373524 (870) 2
Resultados e Discussatildeo
95
5742484 171 75 a 300 5152250 (897) 3
7
7397116 163 62 a 244 6145576 (831) 1
7922810 152 67 a 248 6698052 (845) 2
5336466 164 75 a 297 4815956 (903) 3
45 Anaacutelise de correlaccedilatildeo entre reacuteplicas bioloacutegicas e entre diferentes transcritomas
Com o mapeamento das sequecircncias de cada transcritoma nos genomas de
referecircncia das cepas 9a5c e Temecula1 foram obtidos os valores de expressatildeo baseados
na normalizaccedilatildeo por FPKM (Fragments per kilobase per million) (Mortazavi et al
2008) a qual considera o nuacutemero de sequecircncias mapeadas em cada gene o tamanho do
transcrito e o tamanho total do transcritoma
Estes valores de expressatildeo por FPKM foram utilizados para anaacutelises de
correlaccedilatildeo de Pearson entre as trecircs reacuteplicas bioloacutegicas de cada condiccedilatildeo comparadas
duas a duas Tal anaacutelise fornece a informaccedilatildeo se elas satildeo reprodutiacuteveis e poderiam ser
de fato tratadas como reacuteplicas e portanto serem utilizadas nas anaacutelises de expressatildeo
diferencial e seus respectivos testes estatiacutesticos O teste de correlaccedilatildeo de Pearson eacute um
teste parameacutetrico robusto que mede o grau de relaccedilatildeo linear entre duas variaacuteveis
quantitativas (Pearson 1931a Pearson 1931b Norman 2010) Todos os valores de
correlaccedilatildeo de Pearson para todas as comparaccedilotildees entre reacuteplicas foram maiores que 09
(Tabela 6) indicando que todas as reacuteplicas podem ser tratadas como tal As plotagens
entre valores de FPKM entre duas reacuteplicas de uma mesma condiccedilatildeo demonstram a alta
correlaccedilatildeo entre as reacuteplicas bioloacutegicas (Figura 5) As plotagens combinando os outros
dois pares de reacuteplicas de mesma condiccedilatildeo confirmam esta alta correlaccedilatildeo (dados natildeo
apresentados)
Resultados e Discussatildeo
96
Tabela 6 Valores de correlaccedilatildeo de Pearson entre as reacuteplicas de uma mesma condiccedilatildeo Anaacutelise foi realizada com os valores de FPKM de cada transcritoma
Cepa Meio Tempo (dias)
Reacuteplicas Valor de correlaccedilatildeo de Pearson 9a
5c
PIM6
1
1 e 2 0998
1 e 3 0998
2 e 3 0994
3
1 e 2 0999
1 e 3 0999
2 e 3 0999
PWG
3
1 e 2 0993
1 e 3 0970
2 e 3 0958
10
1 e 2 0999
1 e 3 0995
2 e 3 0994
Tem
ecul
a1
PIM6
1
1 e 2 0987
1 e 3 0996
2 e 3 0986
3
1 e 2 0996
1 e 3 0998
2 e 3 0998
PWG
3
1 e 2 0992
1 e 3 0894
2 e 3 0932
7
1 e 2 0999
1 e 3 0998
2 e 3 0997
Resultados e Discussatildeo
97
Figura 5 Graacuteficos de correlaccedilatildeo entre pares de reacuteplicas da mesma condiccedilatildeo baseado nos valores de FPKM transformados em logaritmo na base 10 (A) 9a5c no iniacutecio da fase exponencial em PIM6 (B) 9a5c no final da fase exponencial em PIM6 (C) 9a5c no iniacutecio da fase exponencial em PWG (D) 9a5c no final da fase exponencial em PWG (E) Temecula1 no iniacutecio da fase exponencial em PIM6 (F) Temecula1 no final da fase exponencial em PIM6 (G) Temecula1 no iniacutecio da fase exponencial em PWG (H) Temecula1 no final da fase exponencial em PWG
Resultados e Discussatildeo
98
Os valores de FPKM tambeacutem foram usados para uma anaacutelise de heatmap com
todas as reacuteplicas de ambas as cepas (Figura 6) Os valores foram transformados em
logaritmo na base 10 (log10) de modo a minimizar os efeitos de genes com valores
muito altos de expressatildeo gecircnica o que levaria a uma dificuldade de visualizaccedilatildeo dos
genes com baixa expressatildeo Trata-se de outra forma de avaliar a similaridade entre as
reacuteplicas e amostras uma vez que elas satildeo agrupadas em um dendrograma O resultado
mostra a separaccedilatildeo dos transcritomas em quatro grupos distintos os quais
correspondem exatamente agraves diferentes cepas e meios de cultura (Figura 6) Entretanto
satildeo observadas duas discrepacircncias a terceira reacuteplica bioloacutegica do transcritoma de 9a5c
no iniacutecio do crescimento em PWG agrupou com seus transcritomas de fase tardia e a
terceira reacuteplica bioloacutegica do transcritoma da Temecula1 no final do crescimento em
PWG agrupou com seus transcritomas de fase inicial (Figura 6)
Com estes mesmos valores de FPKM em log10 de todos os transcritomas foi
realizada uma anaacutelise para verificar quais condiccedilotildees seriam mais similares entre si Para
isso foram obtidas meacutedias dos valores de FPKM das reacuteplicas de uma mesma condiccedilatildeo e
plotadas em um heatmap com dendrograma (Figura 7) Os transcritomas agruparam de
acordo com a mesma cepa e mesmo meio com exceccedilatildeo apenas do transcritoma da cepa
Temecula1 na fase inicial em PWG que agrupou com transcritomas em PIM6 (Figura
7)
Tais discrepacircncias observadas podem ser um reflexo da dificuldade em se obter
inoacuteculos da mesma condiccedilatildeo nos quais as populaccedilotildees bacterianas sejam sincrocircnicas e
portanto gerando pequenas dissimilaridades entre as reacuteplicas Apesar disso
consideramos que os dados obtidos satildeo suficientemente robustos para anaacutelises
subsequentes
Resultados e Discussatildeo
99
Figura 6 Heatmap com valores de FPKM em log10 de todas as reacuteplicas das condiccedilotildees analisadas em ambas as cepas As colunas representam os transcritomas indicados As linhas representam cada gene analisado (1584 genes) O dendrograma no topo da figura mostra o agrupamento dos transcritomas O graacutefico na parte superior direita da figura representa uma gradaccedilatildeo de cores baseando-se nos valores de FPKM sendo que na escala quanto mais proacuteximo do vermelho menor a expressatildeo e quanto mais proacuteximo do branco maior a expressatildeo Para a geraccedilatildeo da imagem foi usada a funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots utilizando a plataforma R
Resultados e Discussatildeo
100
Figura 7 Heatmap com as meacutedias dos valores de FPKM em log10 de todas as reacuteplicas para cada condiccedilatildeo analisada em ambas as cepas As colunas representam as condiccedilotildees indicadas As linhas representam cada gene analisado (1584 genes) O dendrograma no topo da figura mostra o agrupamento das condiccedilotildees O graacutefico na parte superior direita da figura representa uma gradaccedilatildeo de cores baseando-se nos valores meacutedios de FPKM sendo que na escala quanto mais proacuteximo do vermelho menor a expressatildeo e quanto mais proacuteximo do branco maior a expressatildeo Para a geraccedilatildeo da imagem foi usada a funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots utilizando a plataforma R
Resultados e Discussatildeo
101
46 Identificaccedilatildeo de regiotildees natildeo-traduzidas (UTRs) e operons
Dentre as muitas vantagens da anaacutelise de expressatildeo gecircnica por RNA-Seq em
comparaccedilatildeo com os microarranjos estaacute a possibilidade de definir as coordenadas de
iniacutecio de transcriccedilatildeo dos genes e tambeacutem de descrever a distribuiccedilatildeo de genes em
operons sendo portanto uma forma de validar prediccedilotildees da anotaccedilatildeo de genomas
Considerando que as sequecircncias dos transcritomas apresentaram boa qualidade e alta
correlaccedilatildeo entre reacuteplicas elas foram utilizadas para a definiccedilatildeo de regiotildees 5rsquo e 3rsquo natildeo-
traduzidas (5rsquoUTR e 3rsquoUTR) e para identificaccedilatildeo de operons preditos nestes genomas
Para isso foi realizado um mapeamento utilizando os arquivos FastQ de todos os
transcritomas de uma mesma cepa utilizando o software Rockhopper2 (Tjaden 2015)
Para esta anaacutelise todas as sequecircncias dos transcritomas de uma mesma cepa foram
reunidas e portanto o nuacutemero de sequecircncias utilizadas na anaacutelise aumentou
extraordinariamente Esta junccedilatildeo de transcritomas partiu do pressuposto que as
coordenadas do iniacutecio e final da transcriccedilatildeo natildeo devem variar entre transcritomas de
modo importante em bacteacuterias
A anaacutelise com as sequecircncias dos transcritomas da cepa 9a5c revelou 1142
5rsquoUTRs (413 dos genes analisados) e 1281 3rsquoUTRs (463 dos genes analisados)
Enquanto isso a anaacutelise com as sequecircncias da cepa Temecula1 definiu 800 5rsquoUTRs
(383) e 972 3rsquoUTRs (465) A anaacutelise tambeacutem foi realizada mapeando as
sequecircncias no plasmiacutedeo de 9a5c o pXF51 sendo possiacutevel definir 33 5rsquoUTRs (516
dos genes analisados) e 30 3rsquoUTRs (469 dos genes analisados) As UTRs
encontradas definem portanto as coordenadas de iniacutecio e final da transcriccedilatildeo destes
genes com base em dados de RNA-Seq As tabelas suplementares S1 e S2 descrevem as
coordenadas destas regiotildees UTRs encontradas para as cepas 9a5c (genoma e plasmiacutedeo
pXF51) e Temecula1 respectivamente Este tipo de resultado poderaacute ser melhor
explorado quando for integrada com a anotaccedilatildeo de cada um destes dois genomas
Com esta anaacutelise natildeo foi possiacutevel definir os limites de tamanho de todos os
transcritos dos genes de ambas as cepas Provavelmente genes com baixa expressatildeo e
portanto menor abundacircncia de transcritos tiveram suas definiccedilotildees de UTRs
inviabilizadas ou dificultadas Este problema talvez seja resolvido com novos
sequenciamentos das mesmas bibliotecas aumentando ainda mais a cobertura do
genoma ou mesmo sequenciar novas reacuteplicas das mesmas condiccedilotildees
Resultados e Discussatildeo
102
Aleacutem da anaacutelise de UTRs o mesmo software foi usado para descrever quantos e
quais operons poderiam ser definidos com base na presenccedila de transcritos
policistrocircnicos Novamente foram usadas todas as sequecircncias dos transcritomas de cada
cepa O nuacutemero de operons encontrados foi de 545 e 386 para as cepas 9a5c e
Temecula1 respectivamente (Tabela 7) Dentre os operons encontrados a maioria deles
foi predita com apenas dois genes embora tambeacutem tenham sido encontrados operons
com mais de 10 genes (Tabela 7)
A prediccedilatildeo a partir de dados de RNA-Seq foi comparada com o banco de dados
DOOR2 (Database of prOkaryotic OpeRons version 20) (Dam et al 2007 Mao et al
2009) Este banco conteacutem mais de 13 milhotildees de operons preditos em mais de 2000
genomas procarioacuteticos Trata-se de uma prediccedilatildeo computacional baseada em
caracteriacutesticas genocircmicas que incluem distacircncia intergecircnica conservaccedilatildeo da vizinhanccedila
distacircncia filogeneacutetica informaccedilatildeo de pequenos motivos de DNA similaridade entre
termos GO (Gene Ontology) de pares de genes e razatildeo de comprimento entre pares de
genes Como pode ser observado na Tabela 7 as quantidades de operons satildeo similares
embora apresente algumas discrepacircncias em relaccedilatildeo a estrutura de operons de ambas as
prediccedilotildees Outros genomas de X fastidiosa presentes no DOOR2 mostraram
quantidades proacuteximas do nuacutemero de operons observados em Temecula1 Todos os
genomas satildeo de cepas norte-americanas com 409 429 e 437 operons para as cepas
M12 M23 e GB514 respectivamente (Tabela 7) O maior nuacutemero de operons em 9a5c
pode ser justificado por apresentar um genoma maior do que as outras cepas citadas
A prediccedilatildeo de operons tambeacutem foi realizada mapeando as sequecircncias obtidas por
RNA-Seq na sequecircncia do plasmiacutedeo de 9a5c o pXF51 Foram encontrados 14 operons
sendo que novamente a maioria apresentou apenas dois genes o que foi similar ao
predito pelo banco de dados DOOR2 (Tabela 7)
No uacutenico estudo de RNA-Seq com cepas de Xylella fastidiosa uma anaacutelise de
estruturas de operons tambeacutem foi realizada Foram sequenciados transcritomas da cepa
Temecula1 cultivada em meio PD2 sem ou com suplementaccedilatildeo de caacutelcio (Parker et al
2016) Tambeacutem foi utilizado o software Rockhooper2 o qual identificou 389 operons
quantidade muito proacutexima dos 386 operons encontrados aqui para a cepa Temecula1
com conteuacutedo de 2 a 15 genes em ambos os estudos Entretanto nem todos os operons
foram encontrados exatamente iguais em ambas as anaacutelises sendo vistos 320 operons
em comum Portanto 66 operons foram encontrados somente na anaacutelise do presente
estudo enquanto que 69 somente na anaacutelise de Parker e colaboradores Sabe-se que a
Resultados e Discussatildeo
103
regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de operons pode variar com a condiccedilatildeo de cultivo e com
determinado estiacutemulo ou sinal (no caso diferentes meios e suplementaccedilatildeo nutricional)
A maioria dos operons ldquoexclusivosrdquo das duas anaacutelises corresponde agraves mesmas regiotildees
poreacutem com diferenccedilas no conteuacutedo de genes presentes no policistron ou seja foram
vistos genes a mais ou a menos em determinado transcrito em uma condiccedilatildeo em
comparaccedilatildeo com a outra Trata-se de uma comprovaccedilatildeo em larga escala da regulaccedilatildeo
diferencial da transcriccedilatildeo de mRNAs policistrocircnicos sugerindo a presenccedila de regiotildees
promotoras TSSs e regiotildees de teacutermino da transcriccedilatildeo alternativos
Apesar dos dados de RNA-Seq gerados no presente trabalho terem sido obtidos
a partir do sequenciamento de bibliotecas de cDNA sem informaccedilatildeo de orientaccedilatildeo de
fita todos os operons preditos nas duas cepas conteacutem genes proacuteximos e com a mesma
orientaccedilatildeo conforme checado por verificaccedilatildeo manual As tabelas suplementares S3 e S4
apresentam a descriccedilatildeo de todos os operons encontrados com a prediccedilatildeo por RNA-Seq
das cepas 9a5c e Temecula1 respectivamente
Tabela 7 Prediccedilatildeo de estruturas de operons de cepas de X fastidiosa utilizando o software Rockhopper2 e o banco de dados DOOR2 As colunas indicam o nuacutemero de genes no operon
Nuacutemero de genes por operon
2 3 4 5 6 7 8 9 ge10
Cepa Meacutetodo Total
9a5c RNA-Seq 545 318 111 57 23 11 8 4 5 8
DOOR2 546 323 117 60 22 6 4 5 3 6
9a5c pXF51
RNA-Seq 14 7 1 2 2 0 1 1 0 0
DOOR2 13 7 1 3 0 0 1 1 0 0
Temecula1 RNA-Seq 386 209 89 45 20 9 4 2 2 6
DOOR2 400 233 84 42 22 7 4 2 1 5
M12 DOOR2 409 243 89 33 21 9 5 3 1 5
M23 DOOR2 420 238 88 46 19 13 7 3 1 5
M23 plasmiacutedeo
DOOR2 9 5 2 0 0 0 1 0 0 1
GB514 DOOR2 426 263 80 43 17 13 5 1 1 3
GB514 plasmiacutedeo
DOOR2 11 7 3 0 1 0 0 0 0 0
Resultados e Discussatildeo
104
47 Anaacutelise dos transcritomas baseada nos valores de FPKM
471 Panorama da expressatildeo gecircnica das cepas 9a5c e Temecula1
Inicialmente foram utilizados os valores de FPKM para as comparaccedilotildees de
expressatildeo gecircnica dentro do mesmo transcritoma uma vez que natildeo eacute adequado usaacute-los
para comparar abundacircncia de transcritos entre transcritomas distintos
As listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo em FPKM para cada
transcritoma (dados natildeo apresentados) foram ordenadas e os genes entatildeo divididos em
quatro categorias sendo que a categoria mais representada foi de genes com FPKM
entre 100 e 0 Isso mostra que apesar de terem sido observados valores muito altos de
FPKM a maioria dos genes (417-798) apresentou-se com baixa expressatildeo em todos
os transcritomas analisados (Tabela 8)
Foi possiacutevel observar genes com valores de expressatildeo iguais a zero em todos os
transcritomas (63 ndash 96) Dentre estes estatildeo a grande maioria dos genes de tRNAs
pois estes transcritos satildeo perdidos durante o procedimento de preparaccedilatildeo das
bibliotecas Os tRNAs detectados possuem valores de FPKM baixos Em resumo estas
observaccedilotildees confirmam a completa ausecircncia de contaminaccedilatildeo com DNA nas
preparaccedilotildees de RNA total que foram utilizadas no RNA-Seq
Transcritos de rRNAs foram detectados em poucos transcritomas mas tambeacutem
com baixiacutessima expressatildeo (ex rRNA 23S com FPKM de 010 em duas reacuteplicas de
Temecula1_PWG_7d) Um dos paracircmetros utilizados no mapeamento foi que o
fragmento sequenciado somente seria contado caso mapeasse exclusivamente em um
uacutenico local do genoma Caso o fragmento fosse mapeado em dois ou mais locais no
genoma ele natildeo seria contado e seria considerado natildeo-mapeado Isto evitaria qualquer
mapeamento espuacuterio em locais de genes paraacutelogos ou regiotildees repetidas ambos eventos
possiacuteveis nos genomas de X fastidiosa Uma vez que os genomas dessa bacteacuteria
possuem dois clusters de genes de rRNAs pouquiacutessimos fragmentos foram contados
nessa estrateacutegia de mapeamento Isso natildeo quer dizer que a depleccedilatildeo dos rRNAs
funcionou completamente uma vez que poderiacuteamos encontrar fragmentos para rRNAs
no conjunto dos natildeo-mapeados Poreacutem devido agraves altas porcentagens de genes com
FPKM acima de zero em todas as condiccedilotildees testadas (904 - 937) (Tabela 8) pode-se
evidenciar que a depleccedilatildeo foi satisfatoacuteria levando ao enriquecimento da fraccedilatildeo de
Resultados e Discussatildeo
105
mRNAs Aleacutem disso esta alta porcentagem de genes expressos mostra que no genoma
de X fastidiosa a grande maioria de seus genes estaacute ativa mesmo que em niacuteveis basais
Dentre os genes com expressatildeo igual a zero estatildeo principalmente aqueles com
funccedilatildeo hipoteacutetica ou provenientes de regiotildees de proacutefagos Este dado sugere que estes
genes sejam parte de regiotildees remanescentes de fagos incompletos e inativos ou que a
condiccedilatildeo de cultivo natildeo tenha estimulado sua expressatildeo Apesar da maioria dos genes
relacionados a fagos estarem silenciados alguns deles apresentaram valores positivos de
expressatildeo por FPKM
Dentre os demais genes que natildeo estatildeo aparentemente expressos em todos os
transcritomas de ambas as cepas nas condiccedilotildees investigadas estatildeo genes codificadores
de uma DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase uma permease de um sistema de
transporte do tipo ABC e do fator de traduccedilatildeo EF-Tu Na cepa 9a5c ainda foi
encontrado silenciado um gene para uma DNA primase para uma hidrolase dependente
de metal e para uma proteiacutena componente do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV (VirD4)
Na cepa Temecula1 trecircs dos quatro genes codificadores da toxina Zonula occludens
(Zot) natildeo estatildeo expressos Contudo a ausecircncia de expressatildeo destes genes citados pode
refletir artefatos gerados pela estrateacutegia de anaacutelise que exclui mapeamentos que natildeo satildeo
uacutenicos sendo que estes genes podem estar duplicados no genoma de X fastidiosa
Verificaccedilotildees manuais seratildeo necessaacuterias para investigar estes casos pontuais
As cepas 9a5c e Temecula1 tambeacutem possuem plasmiacutedeos em seus genomas
(Simpson et al 2000 Marques et al 2001 Van Sluys et al 2003) e dessa forma as
sequecircncias obtidas nos transcritomas tambeacutem foram mapeadas em suas respectivas
sequecircncias Para os pequenos plasmiacutedeos de ambas as cepas o pXF13 natildeo foi
detectada expressatildeo de seus genes em nenhuma condiccedilatildeo
Em relaccedilatildeo ao plasmiacutedeo pXF51 da cepa 9a5c (Marques et al 2001) na maioria
dos transcritomas todos os 69 genes preditos estatildeo expressos As uacutenicas exceccedilotildees foram
duas reacuteplicas de transcritomas de ceacutelulas cultivadas em PIM6 no iniacutecio da fase
exponencial nos quais um gene que codifica uma proteiacutena hipoteacutetica teve valor zero de
FPKM (pXF51_00066) Todos os genes expressos mostraram altos valores de expressatildeo
em ambos os meios de cultivo concentrando-se nas categorias ldquoacima de 10000rdquo e
ldquoentre 10000 e 1000rdquo (Tabela 9) Esta alta expressatildeo pode ser reflexo do plasmiacutedeo
estar eventualmente presente em mais de uma coacutepia
Resultados e Discussatildeo
106
Tabela 8 Nuacutemero de genes contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos em cada transcritoma das cepas 9a5c e Temecula1
Cepa Meio de cultivo
Tempo (dias)
Total de genes
gt10000 Entre 10000 e
1000 Entre 1000 e
100 Entre 100 e 0 Zero+ Genes
expressos () Reacuteplica
9a5c
PIM6
1 2581 8 69 842 1460 202 922 1
2581 7 44 688 1634 208 919 2
2581 6 97 1152 1153 173 933 3
3 2581 4 45 1161 1185 186 928 1
2581 4 44 1212 1139 182 929 2
2581 6 47 1201 1164 163 937 3
PWG
3 2581 9 83 807 1465 217 916 1
2581 6 109 868 1416 182 929 2
2581 7 84 1088 1223 179 931 3
10 2581 4 43 800 1547 187 928 1
2581 6 61 775 1569 170 934 2
2581 6 80 1039 1274 182 929 3
Temecula1
PIM6
1 2420 9 112 778 1289 232 904 1
2420 7 81 775 1352 205 915 2
2420 7 119 1085 1009 200 917 3
3 2420 2 64 999 1160 195 919 1
2420 2 88 1083 1053 194 920 2
2420 4 74 1020 1112 210 913 3
PWG
3 2420 8 107 805 1289 211 913 1
2420 7 111 1014 1082 206 915 2
2420 6 125 999 1088 202 917 3
7 2420 2 70 666 1464 218 910 1
2420 2 12 248 1932 226 907 2
2420 6 97 929 1180 208 914 3
total de genes analisado subtraindo-se os genes de rRNAs e tRNAs +genes com valor zero de FPKM subtraindo-se os genes de rRNAs e tRNAs
Resultados e Discussatildeo
107
Tabela 9 Nuacutemero de genes do plasmiacutedeo pXF51 contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos em cada transcritoma da cepa 9a5c
Meio de cultivo
Tempo (dias)
Total de genes
gt10000 Entre 10000 e 1000
Entre 1000 e 100
Entre 100 e 0
Zero Genes
expressos ()
Reacuteplica
PIM6
1
69 23 44 1 0 1 985 1
69 29 38 2 0 0 100 2
69 29 38 1 0 1 985 3
3
69 23 44 2 0 0 100 1
69 22 45 1 1 0 100 2
69 20 47 2 0 0 100 3
PWG
3
69 25 42 2 0 0 100 1
69 25 41 2 1 0 100 2
69 24 43 1 1 0 100 3
10
69 24 41 4 0 0 100 1
69 24 41 4 0 0 100 2
69 28 39 1 1 0 100 3
472 Descriccedilatildeo dos genes mais expressos
A partir das listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo gecircnica
normalizados por FPKM foram destacados os dez genes mais expressos em todas as
condiccedilotildees e reacuteplicas das cepas 9a5c (Tabela 10) e Temecula1 (Tabela 11)
Em todos os transcritomas o gene que apresentou o maior valor de FPKM
codifica o ncRNA que eacute componente da Bacterial RNase P class A RNase P eacute uma
ribonucleoproteiacutena envolvida principalmente no processamento da extremidade 5rsquo de
tRNAs mas que tambeacutem atua em outras moleacuteculas de RNA Ela eacute encontrada em todos
os domiacutenios da vida sendo considerada uma ribonucleoproteiacutena housekeeping o que
justifica os altos valores de expressatildeo do ncRNA observados em todos os transcritomas
e condiccedilotildees analisadas Aleacutem do ncRNA de 350-400 nucleotiacutedeos a RNaseP eacute
composta uma subunidade proteica de aproximadamente 14 kDa (Evans et al 2006
Altman 2011 Mondragon 2013) sendo que o ncRNA atua como a parte cataliacutetica
desta ribozima (Guerrier-Takada et al 1983 Reiter et al 2010 Masquida e Westhof
2011 Mondragon 2013) Altos niacuteveis de expressatildeo deste ncRNA tambeacutem foram
verificados em um estudo com o fitopatoacutegeno Xanthomonas campestris atingindo
valores proacuteximos de um milhatildeo de sequecircncias mapeadas para este transcrito (Liu et al
2013) de modo semelhante ao que verificamos nos transcritomas de X fastidiosa
Resultados e Discussatildeo
108
Outro ncRNA que tambeacutem estaacute entre os transcritos mais abundantes em todos os
transcritomas eacute o RNA 6S Ele foi observado nas primeiras dez primeiras posiccedilotildees dos
rankings em 19 dos 24 transcritomas analisados enquanto que nos demais eacute encontrado
entre os 15 genes mais expressos O RNA 6S desempenha um papel regulador na
transcriccedilatildeo pela interaccedilatildeo com a RNA polimerase ligada ao σ70 em resposta agrave mudanccedila
da fase exponencial de crescimento para a fase estacionaacuteria (Wassarman e Storz 2000)
Aleacutem disso o 6S mostrou-se essencial para a sobrevivecircncia celular durante a fase
estacionaacuteria (Trotochaud e Wassarman 2004) Mesmo durante a fase estacionaacuteria
tardia na qual a maioria das moleacuteculas de RNA polimerase-σ70 estaacute complexada com o
RNA 6S nem todos os promotores por ela reconhecidos estatildeo inibidos
Consequentemente agrave ligaccedilatildeo do RNA 6S a RNA polimerase-σ70 a expressatildeo de genes
regulados pela RNA polimerase-σS importante durante a fase estacionaacuteria e condiccedilotildees
de estresse eacute aumentada (Wassarman 2007) Interessantemente o RNA 6S estaacute entre
os mais expressos nos transcritomas de todas as reacuteplicas de 9a5c e Temecula1 extraiacutedas
proacuteximas da fase estacionaacuteria tanto em meio PIM6 (3 dias para ambas) como em meio
PWG (10 dias para 9a5c e 7 dias para Temecula1) Por outro lado para ambas as cepas
o 6S parece ligeiramente menos abundante nos transcritomas de amostras extraiacutedas de
PWG no iniacutecio da fase exponencial Observamos que para algumas reacuteplicas do
crescimento em PIM6 em sua fase exponencial inicial o 6S eacute encontrado em altos
niacuteveis Isto pode ser devido ao fato de que o meio miacutenimo constituiria uma situaccedilatildeo de
estresse nutricional o que poderia estimular a expressatildeo deste ncRNA para inibir a
expressatildeo de genes regulados pelo σ70 e consequentemente liberar a expressatildeo de
genes de resposta a estresses X fastidiosa possui trecircs fatores sigma alternativos σ32 σE
e σ54 sendo que os dois primeiros estatildeo relacionados a resposta a estresses (Koide et al
2006 da Silva Neto et al 2007 da Silva Neto et al 2008)
Diversos trabalhos de anaacutelise de transcritomas por meio de RNA-Seq jaacute
reportaram a presenccedila destes dois ncRNAs (RNase P e 6S) em algumas condiccedilotildees
sendo altamente expressos em diversas espeacutecies bacterianas tais como Helicobacter
pylori (Sharma et al 2010) Vibrio splendidus (Toffano-Nioche et al 2012) Yersinia
pestis (Yan et al 2013) Neisseria gonorrhoeae (McClure et al 2014) e Pseudomonas
aeruginosa (Dotsch et al 2012 Wurtzel et al 2012) Aleacutem disso essas moleacuteculas
tambeacutem foram encontradas em transcritomas de fitopatoacutegenos como Pseudomonas
syringae (Filiatrault et al 2010) Xanthomonas oryzae patovar oryzae (Liang et al
2011) e Pectobacterium atrosepticum (Kwenda et al 2016)
Resultados e Discussatildeo
109
Outro destaque entre os dez genes mais expressos nos 24 transcritomas
analisados satildeo os genes de diversas bacteriocinas Dentre elas estatildeo as trecircs colicinas V
descritas no genoma de X fastidiosa (XF0262 XF0263 e XF0264) (Simpson et al
2000 Pashalidis et al 2005) e novas microcinas previamente anotadas como proteiacutenas
hipoteacuteticas para quais haacute evidencia de funccedilatildeo e expressatildeo em X fastidiosa (Rodrigo R
Duarte e Aline M da Silva dados natildeo publicados) Em conjunto as observaccedilotildees
indicam que mesmo em um crescimento in vitro estas cepas ainda continuam a
produzir toxinas que supostamente tem papel de controlar populaccedilotildees bacterianas de
outras cepas de Xylella e de outras espeacutecies endofiacuteticas no xilema (Pashalidis et al
2005 Koide et al 2006 Zaini et al 2008 Fogaca et al 2010)
Observamos entre os genes com maiores valores de FPKM o que codifica a
proteiacutena Ax21 primeiramente descrita em Xanthomonas oryzae pv oryzae Nesta
bacteacuteria foi sugerido que Ax21 estaacute relacionada agrave percepccedilatildeo de quoacuterum e com a
regulaccedilatildeo da expressatildeo de genes ligados a motilidade virulecircncia e formaccedilatildeo de
biofilme A proteiacutena estaria diretamente interagindo com o sistema Rax o qual seria
responsaacutevel por sulfatar Ax21 e formar um poro atraveacutes das duas membranas por onde a
proteiacutena seria lanccedilada ao meio extracelular Outras proteiacutenas deste mesmo sistema
teriam a funccedilatildeo de sensor e de regulador de resposta de acordo com as alteraccedilotildees de
concentraccedilatildeo de Ax21 Aleacutem disso esta proteiacutena seria responsaacutevel pela ativaccedilatildeo da
resposta imune inata de seu hospedeiro vegetal uma vez que interagiria com o receptor
XA21 em arroz (Han et al 2011) Entretanto natildeo haacute interaccedilatildeo comprovada de Ax21
com o sistema Rax o que indica que ela natildeo seria sulfatada (Bahar et al 2014) Aleacutem
disso esses autores sugerem que Ax21 natildeo seria difusiacutevel e secretada para o meio
extracelular mas sim transportada para o periplasma pelo sistema Sec e localizada na
membrana externa Ela somente seria secretada atraveacutes de vesiacuteculas de membrana
externa (Bahar et al 2014) Ax21 foi renomeada como Omp1X sendo confirmada
como uma proteiacutena de membrana externa mais especificamente um tipo uacutenico de
porina com domiacutenio estrutural de barril-β possuindo diversos papeacuteis em X oryzae
incluindo motilidade e formaccedilatildeo de biofilme (Park et al 2014) Em um trabalho
posterior foi mostrado que a verdadeira elicitora da resposta imune da planta
dependente do receptor XA21 eacute a forma sulfatada da proteiacutena RaxX (Pruitt et al
2015) Em X fastidiosa o gene PD1063 na cepa Temecula1 ortoacutelogo do gene que
codifica para Omp1XAx21 tambeacutem foi encontrado em vesiacuteculas de membrana externa
Anaacutelises com a cepa mutante para este gene mostraram uma diminuiccedilatildeo da agregaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
110
celular embora natildeo foram observadas diferenccedilas no crescimento celular formaccedilatildeo de
biofilme e virulecircncia em ensaios de infecccedilatildeo em planta em comparaccedilatildeo com a cepa
selvagem (Pierce et al 2014)
A lista de transcritos mais abundantes inclui ainda as chaperonas GroEL e
GroES e tambeacutem Hfq que eacute uma chaperona de RNA Estes transcritos codificam
proteiacutenas reconhecidamente abundantes nas ceacutelulas de um modo geral mas sua
presenccedila pode indicar que estas condiccedilotildees de cultivo in vitro satildeo estressantes para X
fastidiosa Aleacutem disso transcritos de bacterioferritina e peroxiredoxina tambeacutem estatildeo
entre os mais abundantes reforccedilando esta hipoacutetese Genes de proteiacutenas de choque frio e
os fatores σ70 e σ32 (RpoH) tambeacutem apresentaram alta expressatildeo Outros genes
encontrados abundantemente expressos codificam proteiacutenas para pilinas como FimA
proteiacutenas de membrana como OmpW peptidases e proteases como Clp entre outros
(Tabelas 10 e 11) Interessantemente os genes com funccedilatildeo hipoteacutetica XF9a_01460
XF9a_01737 XF9a_01177XFTem_00614 tambeacutem aparecem altamente expressos em
vaacuterios dos transcritomas e portanto satildeo bons candidatos para futuros estudos
posteriores para caracterizaccedilatildeo de suas respectivas funccedilotildees
Quanto aos genes do plasmiacutedeo pXF51 de 9a5c observamos que em todos os
transcritomas analisados e em todas as condiccedilotildees e reacuteplicas o transcrito mais abundante
codifica para uma phage-related protein (pXF51_00036) (Tabela S5) Buscas em
bancos de dados mostraram que essa proteiacutena teria similaridade com a toxina RelE a
qual faz parte de um sistema de toxinaantitoxina de manutenccedilatildeo de plasmiacutedeos na
ceacutelula (Lee et al 2014) Em X fastidiosa o sistema DinJRelE codificado no
cromossomo da cepa Temecula1 controla a proliferaccedilatildeo e a populaccedilatildeo bacteriana na
colonizaccedilatildeo da planta e o nocaute deste sistema resulta em um fenoacutetipo de
hipervirulecircncia (Burbank e Stenger 2017)
Resultados e Discussatildeo
111
Tabela 10 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas da cepa 9a5c baseando-se em valores de FPKM Meio de cultivo
Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PIM6
1
RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
Ax21 (XF1803)
Colicina V (XF0264)
Omp (XF0872)
PilA (XF2542)
Hipoteacutetica (1460)
GroEL (XF0615)
Omp (XF0343)
Hipoteacutetica (XF1840)
RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
Hipoteacutetica (1460)
6S RNA (1899)
Omp (XF0872)
Colicina V (XF0264)
Ax21 (XF1803)
GroEL (XF0615)
Omp (XF0343)
Cold shock proteins
(XF2622)
RNase P (0973)
Omp (XF0872)
Colicina V (XF0263)
Hipoteacutetica (1460)
Ax21 (XF1803)
GroEL (XF0615)
Colicina V (XF0264)
PilA (XF2542)
6S RNA (1899)
Fimbrial precursor (XF0083)
3
RNase P (0973)
6S RNA (1899)
Colicina V (XF0263)
Hipoteacutetica (1737)
Hipoteacutetica (1460)
PilA (XF2542)
Cold shock proteins
(XF2622)
Ax21 (XF1803)
Omp (XF0872)
Bacteriocina (XF1217)
RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
6S RNA (1899)
Hipoteacutetica (1737)
PilA (XF2542)
Hipoteacutetica (1460)
Cold shock proteins
(XF2622)
Bacteriocina (XF1217)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Ax21 (XF1803)
RNase P (0973)
6S RNA (1899)
Hipoteacutetica (1737)
Colicina V (XF0263)
PilA (XF2542)
Hipoteacutetica (1460)
Omp (XF0872)
Ax21 (XF1803)
Cold shock proteins
(XF2622)
Bacteriocina (XF1217)
PWG
3
RNase P (0973)
Colicina V (XF0264)
Colicina V (XF0263)
Ax21 (XF1803)
Hipoteacutetica (1737)
Hipoteacutetica (1460)
Omp (XF0872)
Bacteriocina (XF1217)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Bacteriocina (XF1218)
RNase P (0973)
Colicina V (XF0264)
Ax21 (XF1803)
Colicina V (XF0263)
Cold shock proteins
(XF2622)
Hipoteacutetica (1460)
Peptidase (XF0531)
Bacteriocina (XF1217)
6S RNA (1899)
Bacteriocina (XF1218)
RNase P (0973)
Omp (XF0872)
Colicina V (XF0263)
Ax21 (XF1803)
Hipoteacutetica (1737)
Hipoteacutetica (XF1287)
Hipoteacutetica (1460)
Colicina V (XF0264)
Omp precursor (XF1024)
Bacteriocina (XF1217)
10 RNase P (0973)
Colicina V (XF0263)
6S RNA (1899)
Hipoteacutetica (1737)
Colina V (XF0264)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Hsp20 (XF2234)
Ax21 (XF1803)
Omp (XF0872)
Hipoteacutetica (1460)
RNase P 6S RNA Colicina V Cold shock Bacteriocina Colicina V Hipoteacutetica Bacterio- Hipoteacutetica Bacteriocina
Resultados e Discussatildeo
112
(0973) (1899) (XF0263) proteins (XF2622)
(XF1217) (XF0264) (1737) ferritina (XF0395)
(1460) (XF1307_2)
RNase P (0973)
6S RNA (1899)
Colicina V (XF0263)
Omp (XF0872)
Ax21 (XF1803)
Hipoteacutetica (1737)
Colicina V (XF0264)
Bacterio-ferritina
(XF0395)
Bacteriocina (XF1306)
Hipoteacutetica (XF1287)
Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov) Tabela 11 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas da cepa Temecula1 baseando-se em valores de FPKM Meio de cultivo
Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PIM6
1
RNase P (0379)
Ax21 (PD1063)
Omp (PD1807)
PilA (PD1926)
Cold shock proteins
(PD1993)
6S RNA (0904)
Colicina V (PD0216)
Bacteriocina (0632)
GroEL (PD1538)
Proteiacutena ribossomal (PD0460)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Omp (PD1807)
Ax21 (PD1063)
GroES (PD1537)
Hsp20 (PD1280)
GroEL (PD1538)
PilA (PD1926)
Cold shock proteins
(PD1993)
Colicina V (PD0216)
RNase P (0379)
Ax21 (PD1063)
6S RNA (0904)
Omp (PD1807)
PilA (PD1926)
Colicina V (PD0216)
Fimbrial precursor (PD0062)
Cold shock proteins
(PD1993)
Omp (PD1709)
Hipoteacutetica (PD0540)
3
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Omp (PD1807)
Hipoteacutetica (PD0312)
Omp (PD1709)
Colicina V (PD0215)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Hsp20 (PD1280)
RNA chaperone
Hfq (PD0066)
Peroxire-doxina
(PD1040)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Colicina V (PD0215)
Omp (PD1807)
Membrane protein
(PD1295)
RNA chaperone Hfq
(PD0066)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Omp (PD1709)
Hsp20 (PD1280)
Hipoteacutetica (PD0312)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Competen-ce protein (PD1558)
Colicina V (PD0215)
Omp (PD1807)
Membrane protein
(PD1295)
RNA chaperone Hfq
(PD0066)
Hipoteacutetica (PD0540)
Cold shock proteins
(PD1993)
Hipoteacutetica (PD0312)
PWG 3 RNase P (0379)
Omp (PD1807)
Colicina V (PD0216)
Ax21 (PD1063)
Cold shock Proteins
(PD1993)
Bacteriocina (PD0497)
Bacteriocina (0632)
Colicina V (PD0217)
Bacteriocina (0560)
Bacteriocina (PD0556)
RNase P Omp Ax21 Hipoteacutetica Colicina V Hipoteacutetica Bacteriocina Cold shock Membrane 6S RNA
Resultados e Discussatildeo
113
(0379) (PD1807) (PD1063) (PD0312) (PD0216) (PD0540) (PD0497) proteins (PD1993)
protein (PD1295)
(0904)
RNase P (0379)
Omp (PD1807)
Hipoteacutetica (PD0540)
Ax21 (PD1063)
Fimbrial precursor (PD0062)
Bacteriocina (PD0497)
Colicina V (PD0216)
Hipoteacutetica (PD0312)
Cold shock proteins
(PD1993)
Competence protein
(PD1558)
7
RNase P (0379)
Colicina V (PD0216)
Hsp20 (PD1280)
6S RNA (0904)
Colicina V (PD0217)
Fator sigma RpoH
(PD2048)
Membrane protein
(PD1295)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Bacterio-ferritina
(PD1672)
Proteiacutena ribossomal (PD0460)
RNase P (0379)
6S RNA (0904)
Hsp20 (PD1280)
Fator sigma RpoH
(PD2048)
Bacterio-ferritina
(PD1672)
Clp protease subunit ClpP
(PD0472)
Peroxire-doxina
(PD1040)
GroES (PD1537)
DNA-binding protein H-NS
(PD0708)
Fator Sigma 70
(PD0593)
RNase P (0379)
Colicina V (PD0216)
Omp (PD1807)
Colicina (PD0217)
Ax21 (PD1063)
Hipoteacutetica (PD0540)
6S RNA (0904)
Bacteriocina (0632)
Bacteriocina (PD0497)
Cold shock proteins
(PD1993)
Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov)
Resultados e Discussatildeo
114
473 Anaacutelise de rotas metaboacutelicas expressas
Os rankings de genes gerados a partir de dados de expressatildeo gecircnica
normalizados por FPKM tambeacutem foram usados para uma anaacutelise global de quais rotas
metaboacutelicas estariam ativas nas condiccedilotildees utilizadas no presente trabalho Para esta
anaacutelise foi utilizado o software MinPath (Minimal set of Pathways) (Ye e Doak 2009)
o qual utiliza um meacutetodo de parcimocircnia para reconstruccedilatildeo de rotas bioloacutegicas a partir de
prediccedilotildees de famiacutelias proteicas Desta forma eacute obtida uma estimativa mais conservativa
e confiaacutevel das rotas bioloacutegicas de um grupo de dados especiacutefico
Foram analisados todos os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 sendo
considerados efetivamente expressos os genes que apresentaram valores de expressatildeo de
FPKM maiores que 10 Os resultados foram obtidos com a notaccedilatildeo de que ldquo1rdquo significa
presenccedila da rota naquele transcritoma e ldquo0rdquo significa ausecircncia da mesma (Tabela S6)
Analisando os dados com mais detalhes pode-se observar a presenccedila de rotas
essenciais para crescimento e proliferaccedilatildeo Dentre elas rotas do metabolismo
energeacutetico como glicoacutelisegliconeogecircnese ciclo do aacutecido tricarboxiacutelico (TCA) via das
pentoses-fosfato e glioxilato fosforilaccedilatildeo oxidativa metabolismo de piruvato e
ubiquinona entre outras O metabolismo de outros carboidratos tambeacutem foi observado
como amido sacarose frutose e manose embora natildeo tenha sido encontrada a rota de
metabolismo de galactose
Todas as rotas de manutenccedilatildeo e transmissatildeo da informaccedilatildeo geneacutetica como
replicaccedilatildeo do DNA transcriccedilatildeo traduccedilatildeo siacutentese de aminoacil-tRNAs estatildeo presentes
em todos os transcritomas Aleacutem disso os sistemas de reparo do DNA por excisatildeo de
bases ou nucleotiacutedeos e por mismatch tambeacutem estatildeo presentes assim como a rota de
recombinaccedilatildeo homoacuteloga O metabolismo de purinas e pirimidinas tambeacutem foi
encontrado em ambas as cepas Poreacutem a rota de metabolismo de nucleotiacutedeos de accediluacutecar
para siacutentese de precursores de gliconjugados estaacute ausente
As rotas de exportaccedilatildeo de proteiacutenas e dos sistemas de secreccedilatildeo do tipo II e IV
estatildeo ativas em todos os transcritomas Outras rotas de transporte tambeacutem foram
observadas como transportadores ABC sistema de dois componentes e sistema de
fosfotransferase de accediluacutecar (PTS)
Rotas relacionadas agrave siacutentese de membranas e parede celular como o metabolismo
de glicerofosfolipiacutedeos biossiacutentese de peptidioglicano e lipopolissacariacutedeo (LPS)
Resultados e Discussatildeo
115
tambeacutem estatildeo ativas Por outro lado as rotas de biossiacutentese de aacutecidos graxos saturados
e insaturados e esteroacuteides tambeacutem estatildeo ativas nas duas cepas Jaacute as rotas de
metabolismo de aacutecidos graxos e glicerolipiacutedeos estatildeo presentes em 9a5c mas ausentes
em Temecula1
Diversas vitaminas e coenzimas como tiamina riboflavina vitamina B6 biotina
porfirinas aacutecido lipoacuteico nicotinato e nicotinamida pantotenato e co-enzima A tambeacutem
tiveram suas rotas representadas nos transcritomas Entretanto o metabolismo de
ascorbato (vitamina C) natildeo foi encontrado em Temecula1 somente em 9a5c e a rota de
metabolismo de inositol natildeo foi encontrado em nenhuma delas
Interessantemente rotas para a biossiacutentese de antibioacuteticos e poliquetiacutedeos foram
encontradas ativas como as de vancomicina ansamicina tetraciclina e estreptomicina
Natildeo foram encontradas as rotas para biossiacutentese de penicilina cefalosporinas e de
resistecircncia a beta-lactacircmicos
Finalmente as rotas de metabolismo de nitrogecircnio enxofre glutationa e grupos amino
atraveacutes do ciclo da ureacuteia foram encontradas ativas Entretanto nem todas as rotas de
biossiacutentese e metabolismo de aminoaacutecidos estatildeo presentes nos transcritomas As rotas
para o metabolismo de alanina aspartato glicina serina treonina arginina prolina
histidina fenilalanina e metionina estatildeo ativas Poreacutem as rotas de metabolismo de
glutamato cisteiacutena tirosina glutamina e glutamato seleno e cianoaminoaacutecidos estatildeo
inativas Para os aminoaacutecidos lisina valina leucina e isoleucina somente estatildeo ativas as
rotas de biossiacutentese ao contraacuterio de suas rotas de degradaccedilatildeo O metabolismo de
triptofano foi encontrado ativo somente nas duas primeiras reacuteplicas dos transcritomas do
iniacutecio da fase exponencial em PIM6 e PWG e na segunda reacuteplica do final do
crescimento em PWG todos na cepa 9a5c Nos outros transcritomas esta rota estaacute
inativa Coincidentemente a rota de metabolismo de metano foi encontrada inativa
nestes mesmos transcritomas acima mencionados poreacutem ativa nos demais Ainda natildeo eacute
possiacutevel especular qualquer relaccedilatildeo entre essas duas observaccedilotildees A provaacutevel
inatividade de rotas de siacutentese de alguns aminoaacutecidos talvez seja uma justificativa para
esta bacteacuteria ter crescimento lento e dependente da suplementaccedilatildeo destes aminoaacutecidos
no meio de cultivo
Em resumo os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 mostraram poucas
divergecircncias em relaccedilatildeo agraves suas rotas metaboacutelicas ativas e mostraram que as rotas
essenciais para seu crescimento e sobrevivecircncia estatildeo presentes
Resultados e Discussatildeo
116
48 Anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial
481 Comparaccedilotildees entre os transcritomas
Apoacutes a descriccedilatildeo dos genes mais expressos em um mesmo transcritoma baseada
em valores de FPKM foram realizadas comparaccedilotildees entre valores de expressatildeo de um
mesmo gene entre transcritomas distintos Para tal foi usado o pacote DESeq2 (Love et
al 2014) o qual exige como dados de entrada valores de contagem brutos de quantas
sequecircncias foram mapeadas para determinado gene Natildeo eacute recomendado utilizar valores
de expressatildeo jaacute normalizados por FPKM uma vez que o pipeline do pacote realiza uma
normalizaccedilatildeo interna A obtenccedilatildeo das listas de genes com contagem bruta tambeacutem foi
realizada pelo mapeamento das sequecircncias no software CLC Genomics Workbench
As anaacutelises comparativas foram realizadas em trecircs niacuteveis 1) comparaccedilotildees entre
transcritomas da mesma cepa e mesmo meio em fases de crescimento diferentes como
por exemplo entre os transcritomas da cepa 9a5c crescida em PIM6 no iniacutecio e no final
da fase exponencial 2) comparaccedilotildees entre transcritomas da mesma cepa em meios
diferentes mas em fases de crescimento equivalentes como por exemplo entre o
transcritoma de 9a5c no iniacutecio da fase exponencial em PIM6 com o transcritoma de
9a5c no iniacutecio da fase exponencial em PWG 3) comparaccedilotildees entre transcritomas de
cepas diferentes poreacutem em mesmo meio e fase de crescimento como por exemplo
entre o transcritoma de 9a5c e o transcritoma de Temecula1 ambas no iniacutecio da fase
exponencial em PIM6 Os paracircmetros utilizados para considerar um gene como
significativamente diferencialmente expresso foram um valor de p ajustado pela
correccedilatildeo FDR (False Discovery Rate) (Benjamini e Hochberg 1995) menor do que
005 e um valor de razatildeo de expressatildeo (fold change) maior que 2 A Tabela 12 apresenta
um resumo de quantos genes foram encontrados dentro desses paracircmetros em cada
comparaccedilatildeo
Como uma forma graacutefica de mostrar uma visatildeo geral da dispersatildeo de todos os
genes em cada transcritoma o pacote DESeq2 (Love et al 2014) tambeacutem realiza
plotagens tendo os valores de expressatildeo meacutedia entre todas as condiccedilotildees analisadas no
eixo das abscissas e os seus respectivos valores de razatildeo de expressatildeo no eixo das
ordenadas (Figura 8) Estes graacuteficos apresentam em pontos vermelhos os genes
considerados diferencialmente expressos de acordo com os paracircmetros acima citados e
em cinza os genes cuja expressatildeo natildeo variou
Resultados e Discussatildeo
117
Tabela 12 Resumo do nuacutemero de genes diferencialmente expressos (plt005 fold changegt2) em todas as comparaccedilotildees
Niacuteveis de comparaccedilatildeo
Total de genes
Condiccedilatildeo 1 (c1)
Condiccedilatildeo 2 (c2)
Genes DE (plt005 FCgt20)
Genes up-regulated (c1c2)
1
2639 9a5c_PIM6_1d 9a5c_PIM6_3d 83 (31) 794
2639 9a5c_PWG_3d 9a5c_PWG_10d 0 0
2476 Tem_PIM6_1d Tem_PIM6_3d 61 (25) 5011
2476 Tem_PWG_3d Tem_PWG_7d 1 (004) 01
2
2639 9a5c_PIM6_1d 9a5c_PWG_3d 4 (015) 04
2639 9a5c_PIM6_3d 9a5c_PWG_10d 20 (08) 317
2476 Tem_PIM6_1d Tem_PWG_3d 1 (004) 10
2476 Tem_PIM6_3d Tem_PWG_7d 6 (024) 24
3
1882 9a5c_PIM6_1d Tem_PIM6_1d 102 (54) 5448
1882 9a5c_PIM6_3d Tem_PIM6_3d 238 (126) 115123
1882 9a5c_PWG_3d Tem_PWG_3d 58 (31) 4216
1882 9a5c_PWG_10d Tem_PWG_7d 95 (50) 4649
DE diferencialmente expressos Tem Temecula1
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo foi possiacutevel observar um maior nuacutemero de
genes diferencialmente expressos nas comparaccedilotildees entre transcritomas de ceacutelulas em
meio PIM6 do que entre os transcritomas de ceacutelulas em PWG para ambas as cepas
Dentre estes genes a maioria estaacute mais expressa no iniacutecio da fase exponencial Dos
genes considerados diferencialmente expressos nas comparaccedilotildees das duas cepas 31 satildeo
comuns entre elas correspondendo a 373 e 508 nas cepas 9a5c e Temecula1
respectivamente Todos estes genes estatildeo mais expressos na mesma fase de crescimento
nas duas cepas sendo 28 genes no iniacutecio do crescimento e 3 no final Foram
encontrados genes relacionados a proteiacutenas ribossomais chaperonas biogecircnese dos pili
longo e curto e genes com funccedilatildeo hipoteacutetica sendo positivamente regulados no iniacutecio da
fase exponencial Dentre os genes positivamente regulados no final da fase exponencial
estatildeo um gene de uma colicina V de uma fumarase e um gene com funccedilatildeo hipoteacutetica
Estes resultados podem sugerir que as ceacutelulas cultivadas em meio miacutenimo
enfrentam em menor intervalo de tempo mudanccedilas no ambiente por exemplo um
esgotamento dos nutrientes e que resulta na alteraccedilatildeo do transcritoma As observaccedilotildees
de uma maior atividade de siacutentese proteica associada agrave atividade de chaperonas
corrobora uma resposta de adaptaccedilatildeo a um ambiente estressante Esta anaacutelise pode ser
extrapolada ao ambiente natural da bacteacuteria a qual vive constantemente em um
Resultados e Discussatildeo
118
ambiente de escassez nutricional seja no xilema da planta ou no cibaacuterio do inseto tendo
que rapidamente regular a expressatildeo de seus genes para sobreviver
Nas comparaccedilotildees entre transcritomas em meio PWG somente um gene de uma
colicina V foi encontrado diferencialmente expresso na comparaccedilatildeo de transcritomas
da cepa Temecula1 com maior expressatildeo no final da fase exponencial Este gene eacute o
mesmo encontrado como positivamente regulado no final do crescimento em PIM6 em
ambas as cepas O fato de somente um gene ser encontrado diferencialmente expresso
nas comparaccedilotildees em PWG pode ser justificado devido agraves ceacutelulas em meio rico
encontrarem um ambiente favoraacutevel desde o iniacutecio do crescimento ateacute o final da fase
exponencial natildeo necessitando de alteraccedilotildees significativas na expressatildeo de seus genes
Nas comparaccedilotildees entre meios de cultivo no segundo niacutevel de anaacutelises foi
observado um maior nuacutemero de genes diferencialmente expressos entre os transcritomas
do final da fase exponencial para ambas as cepas Dentre estes genes considerados
diferencialmente expressos a maioria deles foi positivamente regulada nos
transcritomas em meio PWG Entretanto nenhum gene foi encontrado em comum entre
as duas cepas Na cepa 9a5c vaacuterios genes relacionados a proteiacutenas ribossomais um
gene responsaacutevel pela formaccedilatildeo do poro para a externalizaccedilatildeo do pilus longo um gene
para uma proteiacutena de transporte pela membrana um gene para colicina V e trecircs genes
para bacteriocinas aleacutem de genes com funccedilatildeo hipoteacutetica foram positivamente regulados
no final do crescimento em PWG Dentre os genes positivamente regulados no final da
fase exponencial em PIM6 estatildeo um gene para uma proteiacutena translocase e dois genes
com funccedilatildeo hipoteacutetica Para a cepa Temecula1 dois genes foram positivamente
regulados no final do crescimento em PIM6 codificadores de uma proteiacutena ribossomal
e uma proteiacutena de um sistema de estabilizaccedilatildeo de plasmiacutedeo Por sua vez no meio PWG
quatro genes para proteiacutenas hipoteacuteticas foram identificados
Dentre os poucos genes encontrados diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre os transcritomas de fase inicial nos dois meios trecircs bacteriocinas e
uma bacterioferritina foram positivamente reguladas em PWG na cepa 9a5c O uacutenico
gene diferencialmente expresso na cepa Temecula1 foi positivamente regulado no iniacutecio
do crescimento em PIM6 e codifica para uma proteiacutena hipoteacutetica
Em dois estudos utilizando a tecnologia de microarranjos para anaacutelise de
expressatildeo gecircnica foram realizadas comparaccedilotildees dos transcritomas da cepa 9a5c
cultivada em dois meios diferentes (Travensolo et al 2009 Ciraulo et al 2010) Assim
como no presente estudo um dos meios apresentava composiccedilatildeo especificamente
Resultados e Discussatildeo
119
desenvolvida para o melhor crescimento de Xylella em comparaccedilatildeo com outros meios
complexos (Lemos et al 2003 Leite et al 2004) Vaacuterios genes foram encontrados
diferencialmente expressos entre as duas condiccedilotildees nos dois estudos poreacutem somente
quatro genes em comum com as comparaccedilotildees aqui apresentadas Travensolo e
colaboradores compararam os transcritomas de 9a5c nos meios XDM2 (meio definido) e
BCYE (meio complexo) apoacutes cultivo de 4 dias a 30degC e agitaccedilatildeo de 140 rpm Somente
o gene pilQ (XF0373) o qual codifica para a proteiacutena formadora de poro na membrana
para externalizaccedilatildeo do pilus longo foi encontrado em comum com a comparaccedilatildeo entre
os transcritomas de 9a5c de final da fase exponencial em ambos os meios Nos dois
trabalhos este gene apresentou-se mais expressos nos meios complexos BCYE e PWG
embora com diferentes razotildees de expressatildeo (183 e 373 respectivamente) (Travensolo
et al 2009) No segundo estudo novamente a cepa 9a5c teve seus transcritomas
analisados agora nos meios 3G10-R (meio definido) e PW (meio complexo) apoacutes
cultivo a 28degC e 100 rpm por 13 e 3 dias respectivamente Comparando os resultados
deste trabalho com os genes diferencialmente expressos obtidos na comparaccedilatildeo entre os
transcritomas de iniacutecio da fase exponencial do presente estudo um gene codificando
para uma bacterioferritina (XF0395) foi encontrado positivamente regulado nos meios
complexos PW e PWG com razotildees de expressatildeo 233 e 615 respectivamente Ao
comparar com os genes diferencialmente expressos no final da fase exponencial dois
genes foram encontrados em comum Um deles codificando para uma proteiacutena
ribossomal (XF1164) mostrou concordacircncia com o presente estudo sendo mais
expresso nos meios complexos com diferentes razotildees de expressatildeo (188 para o PW e
566 para o PWG) Entretanto outro gene codificando para um colicina V foi visto
mais expresso no meio definido 3G10-R (razatildeo de expressatildeo igual a 1715) e mais
expresso no meio complexo PWG no presente estudo (razatildeo de expressatildeo igual a 492)
(Ciraulo et al 2010) Desta forma sugere-se que embora as composiccedilotildees dos meios
sejam semelhantes quaisquer diferenccedilas de nutrientes podem influenciar nas
comparaccedilotildees entre eles aleacutem de variaccedilotildees nas condiccedilotildees de cultivo densidade celular
passagem da cepa utilizada entre outros fatores dificultando as comparaccedilotildees entre
estudos
A observaccedilatildeo de uma maior quantidade de genes positivamente regulados em
PWG poderia ser explicada pelo fato de que as ceacutelulas estariam metabolicamente mais
ativas neste meio devido agrave abundacircncia de nutrientes Entretanto o objetivo do presente
trabalho era identificar possiacuteveis genes com expressatildeo aumentada no meio miacutenimo
Resultados e Discussatildeo
120
PIM6 o qual simula a condiccedilatildeo nutricional do fluido xilemaacutetico do hospedeiro vegetal
Poreacutem somente foram encontrados trecircs genes positivamente regulados neste meio em
cada cepa quando comparados com o meio PWG o que nos leva a concluir que natildeo haacute
diferenccedilas significativas na expressatildeo dos genes nos dois meios de cultivo quando
comparamos pontualmente fases de crescimento semelhantes Por outro lado haacute
diferenccedilas na expressatildeo gecircnica ao longo do crescimento em cada meio conforme
descrito nos paraacutegrafos acima
No terceiro e uacuteltimo niacutevel de comparaccedilatildeo foram analisados os valores de
expressatildeo somente de genes compartilhados entre as cepas 9a5c e Temecula1 natildeo
levando em consideraccedilatildeo genes exclusivos de cada uma delas Nestas comparaccedilotildees
podemos observar um maior nuacutemero de genes diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre transcritomas de ceacutelulas cultivadas em PIM6 embora tambeacutem tenha
sido encontrado um nuacutemero razoaacutevel de genes diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre transcritomas de PWG Dentre estes genes nas comparaccedilotildees de
iniacutecio do crescimento em ambos os meios foi observado um maior nuacutemero de genes
positivamente regulados na cepa 9a5c Ao contraacuterio a cepa Temecula1 apresentou um
maior nuacutemero de genes positivamente regulados nas duas comparaccedilotildees de final de
crescimento nos dois meios (Tabela 12)
Quando satildeo comparados os genes diferencialmente expressos entre os
transcritomas das duas cepas cultivadas em PIM6 observamos que 84 genes satildeo
comuns agraves comparaccedilotildees de iniacutecio e final do crescimento Tal quantidade de genes
corresponde a 824 de todos os genes considerados diferencialmente expressos no
iniacutecio do crescimento e 353 no final Destes genes em comum 46 foram
positivamente regulados na cepa 9a5c e 38 na cepa Temecula1 Todos os genes foram
positivamente regulados para a mesma cepa nas duas fases de crescimento ou seja tais
genes manteacutem sua expressatildeo desde o iniacutecio ateacute o final do crescimento Dentre os genes
mais expressos em 9a5c vaacuterios codificam proteiacutenas com funccedilatildeo hipoteacutetica um gene
para uma adesina da extremidade do pilus longo genes relacionados a bacterioacutefagos
genes para proteiacutenas de sistema de toxinaantitoxina e estabilizaccedilatildeo de plasmiacutedeos
DNA polimerase I componentes do sistema de transporte ABC entre outros Os genes
regulados positivamente na cepa Temecula1 codificam para proteiacutenas relacionadas
principalmente a bacterioacutefagos e com funccedilatildeo hipoteacutetica embora tambeacutem tenham sido
encontrados genes relacionados agrave siacutentese do pilus curto proteiacutenas de membrana
Resultados e Discussatildeo
121
desidrogenases uma proteiacutena ribossomal proteiacutenas de transporte pela membrana entre
outros
Nas comparaccedilotildees entre os transcritomas das fases de crescimento em PWG
foram observados 41 genes regulados durante todo o crescimento correspondendo a
707 e 432 de todos os genes considerados diferencialmente expressos no iniacutecio e
no final do crescimento respectivamente Trinta genes foram encontrados mais
expressos na cepa 9a5c e 11 na cepa Temecula1 Todos eles foram positivamente
regulados para a mesma cepa nas duas fases de crescimento mantendo sua expressatildeo
desde o iniacutecio ateacute o final Dentre os genes positivamente regulados para a cepa 9a5c haacute
predominacircncia de genes de proteiacutenas relacionadas a bacterioacutefagos ou com funccedilatildeo
hipoteacutetica embora deva ser destacada a maior expressatildeo do gene da DNA polimerase I
de uma adesina da extremidade do pilus longo uma proteiacutena quinase relacionada agrave
sinalizaccedilatildeo entre outros Enquanto isso os genes positivamente regulados para a cepa
Temecula1 foram quase todos de proteiacutenas de fagos e com funccedilatildeo hipoteacutetica com
exceccedilatildeo de uma aminotransferase e uma desidrogenase
Este alto nuacutemero de genes diferencialmente expressos que foi observado
justifica outras comparaccedilotildees entre transcritomas de cepas diferentes uma vez que
mesmo os genes ortoacutelogos desses genomas parecem apresentar regulaccedilatildeo distinta na
mesma condiccedilatildeo de cultivo Aleacutem disso em todas as comparaccedilotildees entre cepas foi
possiacutevel observar altos valores de razatildeo de expressatildeo (fold change) entre genes dos
transcritomas comparados Tal resultado demonstra que aleacutem de apresentar um maior
nuacutemero de genes diferencialmente expressos as comparaccedilotildees entre cepas tambeacutem
apresentam maiores diferenccedilas na expressatildeo sugerindo que cada cepa possui um
panorama uacutenico de expressatildeo gecircnica em resposta a determinada condiccedilatildeo de cultivo
Resultados e Discussatildeo
122
Figura 8 Graacuteficos de dispersatildeo dos genes analisados em cada comparaccedilatildeo No eixo das abscissas estatildeo os valores de expressatildeo meacutedia no eixo das ordenadas estatildeo os valores de razatildeo de expressatildeo em log2 Os pontos em vermelho representam genes com valores de p ajustado menores do que 005 os pontos em cinza representam genes com valores de p ajustado maiores que 005 Cada graacutefico representa uma comparaccedilatildeo (A) 9a5c-PIM6-1d e 9a5c-PIM6-3d (B) 9a5c-PWG-3d e 9a5c-PWG-10d (C) 9a5c-PIM6-1d e 9a5c-PWG-3d (D) 9a5c-PIM6-3d e 9a5c-PWG-10d (E) Tem-PIM6-1d e Tem-PIM6-3d (F) Tem-PWG-3d e Tem-PWG-7d (G) Tem-PIM6-1d e Tem-PWG-3d (H) Tem-PIM6-3d e Tem-PWG-7d (I) 9a5c-PIM6-1d e Tem-PIM6-1d (J) 9a5c-PIM6-3d e Tem-PIM6-3d (K) 9a5c-PWG-3d e Tem-PWG-3d (L) 9a5c-PWG-10d e Tem-PWG-7d Tem Temecula1
Resultados e Discussatildeo
123
482 Categorizaccedilatildeo funcional dos genes diferencialmente expressos
4821 Anaacutelise por ontologia gecircnica
Foram realizadas anaacutelises globais funcionais dos genes considerados
diferencialmente expressos (plt005 e fold changegt2) utilizando o software online
BayGO (Vencio et al 2006) Primeiramente tais genes foram categorizados baseando-
se nas suas ontologias gecircnicas (Gene Ontology ou GO) (Ashburner et al 2000 Gene
Ontology Consortium 2004)
Iniciamos as anaacutelises com os transcritomas do niacutevel 1 de comparaccedilatildeo Nas fases
iniciais do crescimento exponencial de ambas as cepas em meio PIM6 quando
comparado com sua fase final foi possiacutevel observar um enriquecimento de categorias
GO relacionadas agrave transcriccedilatildeo e traduccedilatildeo (Tabela 13) Dentre as categorias em comum
estatildeo biossiacutentese de proteiacutenas biogecircnese e montagem do ribossomo e transcriccedilatildeo pela
atividade de RNA polimerase A cepa 9a5c apresentou como categorias exclusivas
algumas relacionadas ao enovelamento proteico atividade de fatores de elongaccedilatildeo da
traduccedilatildeo ligaccedilatildeo a tRNA atividade de nucleotidiltransferase transporte proteico
intracelular e secreccedilatildeo de proteiacutenas Por sua vez a cepa Temecula1 apresentou duas
categorias exclusivas enriquecidas relacionadas agrave atividade de metalopeptidades e
metaloendopeptidases Entretanto na fase final do crescimento exponencial natildeo foi
encontrada nenhuma categoria enriquecida nas comparaccedilotildees das duas cepas
Na comparaccedilatildeo entre as diferentes fases de crescimento no meio PWG na cepa
9a5c jaacute haviacuteamos mencionado que natildeo foi encontrado nenhum gene diferencialmente
expresso Na cepa Temecula1 foi encontrado apenas um gene
Tabela 13 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes fases de crescimento nas cepas 9a5c e Temecula1 Categorias GO up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa 9a5c Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0006457 protein folding 001 061 [061061] GO0051082 unfolded protein binding 001 074 [074074] GO0003723 RNA binding 0 082 [082082] GO0006412 protein biosynthesis 0 089 [088090] GO0003746 translation elongation factor activity 003 081 [081081] GO0006414 translational elongation 0 086 [086086] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 095 [095096] GO0005622 Intracelular 0 087 [086088] GO0005840 Ribosome 0 095 [095096] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 095 [095095] GO0000049 tRNA binding 0 088 [088088]
Resultados e Discussatildeo
124
GO0015935 small ribosomal subunit 0 099 [099099] GO0019843 rRNA binding 0 096 [096096] GO0003899 DNA-directed RNA polymerase activity 0 091 [091091] GO0006350 Transcription 0 083 [083083] GO0006351 transcription DNA-dependent 0 097 [097097] GO0016779 nucleotidyltransferase activity 002 068 [068068] GO0006986 response to unfolded protein 002 082 [082082] GO0045449 regulation of transcription 004 074 [070080] GO0006886 intracellular protein transport 0 090 [090090] GO0009306 protein secretion 004 064 [064064] GO0015450 protein translocase activity 0 090 [090090] GO0015934 large ribosomal subunit 0 093 [093093] GO0042254 ribosome biogenesis and assembly 0 100 [100100] Categorias GO up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa Temecula1 Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003723 RNA binding 0 078 [075081] GO0006412 protein biosynthesis 0 089 [087090] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 094 [093094] GO0005622 Intracelular 0 085 [083087] GO0005840 Ribosome 0 094 [092094] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 092 [092093] GO0015935 small ribosomal subunit 001 082 [082082] GO0019843 rRNA binding 0 090 [090090] GO0003899 DNA-directed RNA polimerase activity 0 082 [082082] GO0006350 Transcription 004 073 [067083] GO0006351 transcription DNA-dependent 0 094 [094094] GO0004222 metalloendopeptidase activity 004 070 [070070] GO0042254 ribosome biogenesis and assembly 001 100 [100100] GO0008237 metallopeptidase activity 003 080 [080080] GO0006364 rRNA processing 003 072 [072072] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
A categorizaccedilatildeo funcional dos genes diferencialmente expressos tambeacutem foi
realizada nas comparaccedilotildees de niacutevel 2 entre os meios de cultivo e em uma mesma fase
do crescimento bacteriano Dentre todas as comparaccedilotildees somente foram observadas
categorias enriquecidas no final do crescimento em PWG na cepa 9a5c quando
comparado com o final do crescimento em PIM6 (Tabela 14) Tais categorias estatildeo
relacionadas exclusivamente a atividade de siacutentese e transporte de proteiacutenas incluindo
categorias de formaccedilatildeo de ribossomos
Tabela 14 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes meios de cultivo na cepa 9a5c Categorias GO up-regulated no meio PWG no final da fase exponencial na cepa 9a5c Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003723 RNA binding 0 090 [090090] GO0006412 protein biosynthesis 0 097 [096097] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 098 [098099] GO0005622 Intracelular 0 097 [096097] GO0005840 Ribosome 0 098 [097099] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 098 [098099] GO0019843 rRNA binding 001 096 [096096] GO0008565 protein transporter activity 0 085 [083090] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
125
Como descrito anteriormente no uacuteltimo niacutevel de comparaccedilatildeo envolvendo as
duas cepas nas mesmas condiccedilotildees foi encontrado um maior nuacutemero de genes
diferencialmente expressos os quais tambeacutem foram categorizados funcionalmente
(Tabela 15) Na comparaccedilatildeo entre transcritomas do iniacutecio do crescimento em PIM6 a
cepa 9a5c apresentou um enriquecimento de categorias relacionadas agrave ligaccedilatildeo
integraccedilatildeo e recombinaccedilatildeo de DNA aleacutem de atividades de helicase e ligase e uma
categoria de fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos Por sua vez a cepa Temecula1 na mesma fase
de crescimento em PIM6 mostrou enriquecimento de categorias relacionadas agrave siacutentese e
transporte de proteiacutenas Ainda no meio PIM6 mas na comparaccedilatildeo de transcritomas no
final da fase exponencial foram encontradas enriquecidas categorias relacionadas agrave
atividade de metiltransferases e metilaccedilatildeo de DNA na cepa 9a5c aleacutem novamente das
categorias de fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos e integraccedilatildeo de DNA tambeacutem enriquecidas
no iniacutecio do seu crescimento Enquanto isso a cepa Temecula1 apresentou o maior
nuacutemero de categorias enriquecidas com 28 no total Elas se dividem em quatro
importantes processos celulares transcriccedilatildeo (atividade de RNA polimerase regulaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo atividade de fator sigma) metabolismo de ATP (transporte de
proacutetonshidrogecircnio atividade de ATP sintase e ATPase) defesa (atividade de lisozima
citoacutelise catabolismo de peptidioglicano e parede celular resposta de defesa contra
bacteacuterias) e siacutentese proteica (biogecircnese de ribossomo enovelamente e transporte) O
maior nuacutemero de categorias enriquecidas na cepa Temecula1 significa uma atividade
metaboacutelica mais intensa no meio PIM6 possivelmente para lidar com o estresse
nutricional encontrado neste meio De fato o meio PIM6 foi desenvolvido baseado na
composiccedilatildeo nutricional do fluido xilemaacutetico de videiras na Ameacuterica do Norte (Michelle
Igo comunicaccedilatildeo pessoal) o que pode justificar uma melhor adaptaccedilatildeo desta cepa neste
meio De qualquer forma o uso do PIM6 para o crescimento de outras cepas que natildeo
tenham videiras como hospedeiros natildeo eacute inviabilizada devido ao fato de ainda
constituir um meio pobre em nutrientes e que se assemelha com composiccedilotildees de fluidos
xilemaacuteticos de outras plantas
Tabela 15 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PIM6 de ambas as cepas Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0005524 ATP binding 001 049 [041060] GO0003677 DNA binding 001 072 [060081] GO0006310 DNA recombination 002 085 [078092]
Resultados e Discussatildeo
126
GO0003676 nucleic acid binding 004 062 [051077] GO0004386 helicase activity 0 079 [074086] GO0006468 protein amino acid phosphorylation 0 086 [086086] GO0016874 ligase activity 004 048 [040052] GO0015074 DNA integration 0 098 [094099] Categorias GO up-regulated na cepa Temecula1 no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0006412 protein biosynthesis 003 045 [039060] GO0003677 DNA binding 0 062 [049077] GO0003735 structural constituent of ribosome 001 066 [060073] GO0005622 Intracelular 001 060 [054070] GO0005840 Ribosome 001 066 [060069] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 067 [060073] GO0008565 Protein transport activity 001 072 [066082] Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0000287 magnesium ion binding 0 052 [052052] GO0006306 DNA-methylation 002 095 [076099] GO0008170 N-methyltransferase activity 004 095 [078099] GO0009007 Site-specific DNA-methyltransferase (adenine-specific)
activity 0 100 [100100]
GO0006468 Protein amino acid phosphorylation 004 053 [053053] GO0015074 DNA integration 003 091 [077097] Categorias GO up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003677 DNA binding 004 041 [029052] GO0003735 structural constituent of ribosome 0 058 [053063] GO0005622 Intracelular 0 047 [039055] GO0005840 Ribosome 0 058 [053064] GO0030529 ribonucleoprotein complex 0 060 [056067] GO0015935 small ribosomal subunit 0 073 [073073] GO0019843 rRNA binding 0 068 [064073] GO0003899 DNA-directed RNA polymerase activity 0 084 [084084] GO0006350 Transcription 004 059 [051072] GO0006355 regulation of transcription DNA-dependent 0 050 [040059] GO0003796 lysozyme activity 0 100 [092100] GO0009253 peptidoglycan catabolism 004 090 [076096] GO0016998 cell wall catabolism 002 090 [076096] GO0019835 Cytolysis 002 086 [076093] GO0042742 defense response to bacteria 002 100 [090100] GO0006986 response to unfolded protein 0 069 [069069] GO0015986 ATP synthesis coupled proton transport 0 073 [073073] GO0016469 proton-transporting two-sector ATPase complex 002 069 [069069] GO0046933 hydrogen-transporting ATP synthase activity rotational
mechanism 002 073 [073073]
GO0046961 hydrogen-transporting ATPase activity rotational mechanism
002 073 [073073]
GO0006352 transcription initiation 0 090 [090090] GO0016987 sigma fator activity 002 090 [090090] GO0015031 protein transport 0 061 [061061] GO0015934 large ribosomal subunit 0 077 [077077] GO0008462 endopeptidase Clp activity 0 100 [095100] GO0015992 proton transport 002 073 [073073] GO0016820 hydrolase activity acting on acid anhydrides catalyzing
transmembrane movement of substances 0 090 [090090]
GO0015078 hydrogen ion transporter activity 001 077 [077077] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
127
Os transcritomas das duas cepas crescidas em meio PWG tambeacutem apresentaram
diferenccedilas No iniacutecio da fase exponencial somente a cepa 9a5c apresentou categorias
enriquecidas mostrando maior atividade de ligaccedilatildeo a DNA e aacutecidos nucleicos ligaccedilatildeo
de ATP atividade de helicase e fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos Ao final do crescimento
exponencial no meio PWG pudemos encontrar quase as mesmas categorias
enriquecidas no iniacutecio em 9a5c apenas substituindo fosforilaccedilatildeo de aminoaacutecidos por
atividade de ligase Enquanto isso a cepa Temecula1 novamente mostrou alta atividade
metaboacutelica no final do crescimento desta vez em PWG Dentre as categorias super-
representadas estatildeo o metabolismo de carbohidratos transcriccedilatildeo e novamente defesa
(atividade de lisozima citoacutelise catabolismo de peptidioglicano e parede celular
resposta de defesa contra bacteacuterias) as mesmas encontradas no final do crescimento em
PIM6 (Tabela 16)
Tabela 16 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em categorias GO dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PWG de ambas as cepas Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0005524 ATP binding 0 074 [067080] GO0003677 DNA binding 003 062 [046080] GO0003676 Nucleic acid binding 0 077 [069084] GO0004386 Helicase activity 0 087 [083092] GO0006468 Protein amino acid phosphorylation 0 092 [092092] Categorias GO up-regulated na cepa 9a5c no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0005524 ATP binding 0 069 [060077] GO0003677 DNA binding 001 070 [061084] GO0003676 Nucleic acid binding 0 074 [066085] GO0004386 Helicase activity 0 086 [082091] GO0016874 Ligase activity 0 063 [055067] Categorias GO up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo GO Descriccedilatildeo P G G90 IC GO0003677 DNA binding 003 064 [050077] GO0003824 Catalytic activity 0 051 [044066] GO0005975 Carbohydrate metabolismo 003 070 [057084] GO0016798 Hydrolase activity acting on glycosyl bonds 0 090 [083095] GO0008152 Metabolismo 003 052 [044064] GO0003899 DNA-directed RNA polymerase activity 0 093 [093093] GO0016779 Nucleotidyltransferase activity 0 078 [072085] GO0003796 Lysozyme activity 0 100 [098100] GO0009253 Peptidoglycan catabolism 0 098 [094099] GO0016998 Cell wall catabolism 0 098 [094099] GO0019835 Cytolysis 0 097 [094098] GO0042742 Defense response to bacteacuteria 0 100 [098100] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
128
4822 Anaacutelise por vias KEGG
Os genes considerados diferencialmente expressos tambeacutem foram categorizados
em relaccedilatildeo as suas vias metaboacutelicas que estariam mais representadas e enriquecidas
(vias KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa e Goto 2000
Kanehisa et al 2016)
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre fases de crescimento no mesmo meio
somente foram encontradas vias enriquecidas no iniacutecio de crescimento em PIM6 Dentre
elas estatildeo vias relacionadas ao processamento da informaccedilatildeo geneacutetica traduccedilatildeo
ribossomo e RNA polimerase em ambas as cepas Uma via relacionada ao exporte e
enovelamento de proteiacutenas foi encontrada enriquecida na cepa 9a5c enquanto uma via
relacionada a fatores de traduccedilatildeo na cepa Temecula1 (Tabela 17)
Tabela 17 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes fases de crescimento nas cepas 9a5c e Temecula1 Vias KEGG up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa 9a5c Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 085 [084086] 1220 Translation 0 082 [081083] 3100 protein folding and associated processing 002 071 [071071] 3010 Ribosome 0 093 [093094] 3020 RNA polymerase 001 085 [085085] Vias KEGG up-regulated no iniacutecio da fase exponencial em meio PIM6 na cepa Temecula1 Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 090 [087091] 1220 Translation 0 090 [088091] 3014 other translation factors 002 074 [074074] 3010 Ribosome 0 093 [092094] 3020 RNA polymerase 002 078 [078078] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
As vias KEGG tambeacutem foram classificadas nas comparaccedilotildees entre meios de
cultivo sendo encontradas vias enriquecidas somente no final do crescimento em PWG
na cepa 9a5c Trecircs vias foram encontradas relacionadas a processamento da informaccedilatildeo
geneacutetica traduccedilatildeo e ribossomo (Tabela 18)
Tabela 18 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas de diferentes meios de cultivo na cepa 9a5c Vias KEGG up-regulated no meio PWG no final da fase exponencial na cepa 9a5c Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 001 100 [100100] 1220 Translation 001 093 [090093] 3010 ribosome 0 097 [097097] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Resultados e Discussatildeo
129
Nas comparaccedilotildees entres cepas algumas vias foram encontradas enriquecidas O
iniacutecio do crescimento em meio PIM6 estimulou na cepa 9a5c o enriquecimento da via
de metabolismo de carboidratos enquanto que na cepa Temecula1 foi observado um
enriquecimento das vias de metabolismo de lipiacutedeos traduccedilatildeo e ribossomo Jaacute no final
do crescimento em PIM6 a cepa 9a5c mostrou uma maior expressatildeo de genes de vias
relacionadas ao metabolismo de aminoaacutecidos (fenilalanina tirosina triptofano e
histidina) transportadores ABC e a via das pentoses-fosfato Por sua vez a cepa
Temecula1 manteve um enriquecimento de vias de traduccedilatildeo e ribossomo aleacutem de vias
relacionadas com transcriccedilatildeo siacutentese de ATP enovelamento proteico metabolismo de
tirosina e transportadores acoplados a iacuteons (Tabela 19)
Tabela 19 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PIM6 em ambas as cepas Vias KEGG up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1110 Carbohydrate metabolism 0 070 [058077] Vias KEGG up-regulated na cepa Temecula1 no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1130 lipid metabolism 002 074 [067082] 1220 Translation 001 060 [055070] 3010 Ribosome 0 079 [077085] Vias KEGG up-regulated na cepa 9a5c no final da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1160 metabolism of other amino acids 001 043 [043043] 400 phenylalanine tyrosine and tryptophan biosynthesis 004 055 [046066] 30 pentose phosphate pathway 0 074 [074074] 2010 ABC transporters prokaryotic 003 056 [056056] 340 histidine metabolismo 0 080 [080080] Vias KEGG up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 053 [046059] 1220 Translation 002 046 [041051] 1210 Transcription 001 061 [056069] 350 tyrosine metabolism 001 093 [086097] 3100 protein folding and associated processing 0 070 [067075] 3010 Ribosome 0 073 [070077] 2052 other ion-coupled transportes 003 057 [057057] 193 ATP synthesis 002 081 [081081] 3020 RNA polymerase 0 089 [089089] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
Nas comparaccedilotildees do crescimento em PWG foram observadas somente duas vias
enriquecidas a de processamento da informaccedilatildeo geneacutetica no iniacutecio do crescimento na
cepa 9a5c e a de metabolismo de lipiacutedeos no final do crescimento na cepa Temecula1
(Tabela 20)
Resultados e Discussatildeo
130
Tabela 20 Caracterizaccedilatildeo funcional baseada em vias KEGG dos genes diferencialmente expressos entre transcritomas em meio PWG em ambas as cepas Vias KEGG up-regulated na cepa 9a5c no iniacutecio da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1200 genetic information processing 0 100 [100100] Vias KEGG up-regulated na cepa Temecula1 no final da fase exponencial Coacutedigo KEGG Descriccedilatildeo P G G90 IC 1130 lipid metabolism 0 078 [074085] G eacute a medida gamma de associaccedilatildeo estatiacutestica e G90 seu intervalo de credibilidade 90 (error-bar)
4823 Anaacutelise de genes relacionados agrave virulecircncia e patogenicidade
Foi realizada uma anaacutelise dos niacuteveis de expressatildeo de genes relacionados agrave
virulecircncia em X fastidiosa (Simpson et al 2000 Van Sluys et al 2003 Chatterjee et
al 2008) eventualmente incluiacutedos entre os genes diferencialmente expressos
identificados nas comparaccedilotildees anteriormente descritas (Tabela 21)
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo somente foi possiacutevel observar genes
diferencialmente expressos no iniacutecio do crescimento em meio PIM6 Dentre eles
destacam-se genes relacionados com a biogecircnese do pilus longo responsaacutevel pela
motilidade twitching da bacteacuteria (Meng et al 2005) como o gene pilV em ambas as
cepas Jaacute os genes pilO e pilQ foram mais expressos somente na cepa 9a5c Tal
resultado sugere que um contato inicial com o xilema promoveria a expressatildeo de genes
relacionados agrave motilidade O gene fimA relacionado com a formaccedilatildeo de pilus curto (tipo
chaperone-usher) (Li et al 2007) responsaacutevel pela adesatildeo ao substrato (parede dos
vasos do xilema ou exoesqueleto do tubo digestoacuterio do inseto vetor) tambeacutem foi
diferencialmente expresso nas duas cepas analisadas Outro gene observado em comum
entre as comparaccedilotildees de 9a5c e Temecula1 codifica para uma protease dependente de
zinco com funccedilatildeo de chaperona Dentre os genes diferencialmente expressos em
somente uma das cepas estatildeo os que codificam para a proteiacutena regulatoacuteria LexA fator
sigma 70 duas proteases e uma proteiacutena de membrana externa na cepa 9a5c na cepa
Temecula1 foi encontrada uma oligopeptidase dependente de zinco e uma flavodoxina
multimeacuterica (WrbA)
Nas comparaccedilotildees entre as fases de crescimento em meio PWG natildeo foi
encontrado nenhum gene diferencialmente expresso relacionado com a virulecircncia da
bacteacuteria Tal observaccedilatildeo pode refletir o menor nuacutemero de genes diferencialmente
expressos no meio PWG em comparaccedilatildeo com o meio PIM6 Obviamente natildeo eacute
possiacutevel afirmar que tais genes de virulecircncia natildeo estatildeo ativos no meio rico em
Resultados e Discussatildeo
131
nutrientes somente eacute possiacutevel inferir que eles natildeo apresentam mudanccedila de expressatildeo
entre as duas fases de crescimento testadas ao contraacuterio do que acontece no meio PIM6
No segundo niacutevel de comparaccedilatildeo entre os transcritomas dos dois meios de
cultivo somente foi possiacutevel observar dois genes diferencialmente expressos
relacionados agrave virulecircncia ambos nas comparaccedilotildees de final do crescimento Na cepa
9a5c o gene pilQ responsaacutevel pela externalizaccedilatildeo do pilus longo foi encontrado mais
expresso no meio PWG Na cepa Temecula1 transcritos de uma proteiacutena regulatoacuteria
relacionada com estabilizaccedilatildeo de ribossomos modulaccedilatildeo do σ54 estariam mais
abundantes no meio PIM6 Esta proteiacutena tem sido relacionada a resposta a estresse
ambientais e a virulecircncia (Oosthuizen et al 2002 Ancona et al 2014) Nas
comparaccedilotildees de iniacutecio da fase exponencial natildeo foram observadas diferenccedilas de
expressatildeo destes genes entre os meios de cultivo nas duas cepas analisadas
No terceiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre os transcritomas das duas cepas nas
mesmas condiccedilotildees somente foram analisados os genes presentes em ambas No iniacutecio
do crescimento em meio PIM6 foram encontrados cinco genes diferencialmente
expressos Dentre eles genes de uma adesina da extremidade do pilus longo (PilY1)
uma histidina quinase e uma proteiacutena com funccedilatildeo regulatoacuteria (AraC-type) foram mais
expressos na cepa 9a5c Enquanto isso a cepa Temecula1 mostrou maior expressatildeo de
um gene de uma proteiacutena com domiacutenio de clivagem do tipo preacute-pilina (relacionada ao
pilus longo) e de uma lipase Todos estes genes mantiveram suas expressotildees
diferenciais no final do crescimento em PIM6 inclusive no que diz respeito em qual
cepa estariam mais expressos Outros genes foram encontrados diferencialmente
expressos nesta comparaccedilatildeo de final do crescimento em PIM6 Na cepa 9a5c foram
observados os genes de uma glicosidade (enzima degradadora de parede vegetal) um
regulador transcricional (famiacutelia LuxRUhpA) uma flavodoxina multimeacuterica (WrbA)
outro regulador transcricional e um gene para hemolisinas Na cepa Temecula1 os
genes rpfG e rpfF foram mais expressos no final do crescimento em PIM6 O primeiro
codifica para uma proteiacutena reguladora de resposta sensiacutevel agraves concentraccedilotildees de DSF e
atuando como uma fosfodiesterase degradando o segundo mensageiro intracelular c-di-
GMP Jaacute RpfF seria responsaacutevel pela proacutepria siacutentese de DSF (Chatterjee et al 2008)
Juntamente com os genes do cluster rpf foi observado um gene para uma diguanilato
ciclase regulado positivamente em Temecula 1 quando comparado com a cepa 9a5c Em
X fastidiosa o acuacutemulo de DSF (moleacutecula sinalizadora produzida por genes deste
cluster) modula negativamente os niacuteveis de c-di-GMP resultando em maior formaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
132
de biofilme (Chatterjee et al 2010) Outros genes encontrados positivamente regulados
em Temecula1 foram dois genes de fatores sigma (σ70 e RpoH) de regulaccedilatildeo de
nitrogecircnio subunidade ClpP da protease Clp uma protease dependente de zinco com
funccedilatildeo de chaperona e uma proteiacutena associada com gracircnulos de poli-hidroxialcanoatos
As diferenccedilas de expressatildeo gecircnica nos transcritomas de ceacutelulas cultivadas em
PWG foram poucas Tanto no iniacutecio da fase exponencial como no seu final foi possiacutevel
observar na cepa 9a5c uma maior expressatildeo de um gene codificando uma adesina da
extremidade do pilus longo (PilY1) e outro para uma histidina quinase relacionada a
transduccedilatildeo de sinal A cepa 9a5c tambeacutem teve um gene para hemolisina mais expresso
no iniacutecio do crescimento Para a cepa Temecula1 apenas foi observada uma maior
expressatildeo de um gene de uma lipase no final do crescimento em PWG
Estas observaccedilotildees sugerem diferenccedilas relevantes na virulecircncia de cada cepa e
possivelmente na resposta da bacteacuteria ao ambiente do xilema e poderatildeo nortear futuros
estudos sobre sistemas ou genes que foram destacados nas anaacutelises comparativa dos
transcritomas que foram detalhadas aqui
Tabela 21 Lista com genes diferencialmente expressos em todas as comparaccedilotildees e que estatildeo relacionados com sistemas de virulecircncia de X fastidiosa
Anotaccedilatildeo
XFPD Anotaccedilatildeo IMG Descriccedilatildeo
Fold change
(log2)
9a5c_PIM6_1d x 9a5c_PIM6_3d
Biogecircnese do pilus longo
XF0029 XF9a_00026 type IV pilus modification protein PilV 213
XF0371 XF9a_00335 type IV pilus assembly protein PilO 179
XF0373 XF9a_00337 type IV pilus secretin (or competence protein)
PilQ 173
Biogecircnese do pilus curto
XF0083 XF9a_00074 P pilus assembly protein pilin FimA 204
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF0122 XF9a_00107 SOS regulatory protein LexA (EC342188) 164
XF1350 XF9a_01234 RNA polymerase sigma factor sigma-70 family 151
Proteases
XF0453 XF9a_00409 Membrane protease subunits stomatinprohibitin
homologs (EC34-) 158
XF1484 XF9a_01357 ATP-dependent protease HslVU peptidase
subunit (EC34252) 214
XF2625 XF9a_02481 Zn-dependent protease with chaperone function 284
Resultados e Discussatildeo
133
(EC3424-)
Outras funccedilotildees
XF0343 XF9a_00315 Outer membrane protein and related
peptidoglycan-associated (lipo)proteins 191
Temecula1_PIM6_1d x Temecula1_PIM6_3d
Biogecircnese do pilus longo
PD0020 XFTem_00023 type IV pilus modification protein PilV 230
Biogecircnese do pilus curto
PD0062 XFTem_00068 P pilus assembly protein pilin FimA 228
Funccedilotildees regulatoacuterias
PD0422 XFTem_00475 Multimeric flavodoxin WrbA 199
Proteases
PD0856 XFTem_00970 Zn-dependent oligopeptidases (EC34155) 208
PD1995 XFTem_02316 Zn-dependent protease with chaperone function
(EC3424-) 257
9a5c_PIM6_3d x 9a5c_PWG_10d
Biogecircnese do pilus longo
XF0373 XF9a_00337 type IV pilus secretin (or competence protein)
PilQ -186
Temecula1_PIM6_3d x Temecula1_PWG_7d
Funccedilotildees regulatoacuterias
PD0636 XFTem_00723 ribosomal subunit interface protein
(sigma fator 54) 224
9a5c_PIM6_1d x Temecula1_PIM6_1d
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 196
XF2539
PD1924
XF9a_02403
XFTem_02236
prepilin-type N-terminal cleavagemethylation
domain (PilA) -235
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF1254
PD0520
XF9a_01154
XFTem_00591
AraC-type DNA-binding domain-containing
proteins 199
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 244
Lipases
XF2151
PD1211
XF9a_02036
XFTem_01402 hypothetical protein (lipase) -262
9a5c_PIM6_3d x Temecula1_PIM6_3d
Enzimas degradadoras de parede vegetal (CWDEs)
XF0845 XF9a_00767 Beta-glucosidase-related glycosidases 163
Resultados e Discussatildeo
134
PD1829 XFTem_02128 (EC32121)
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 250
XF2539
PD1924
XF9a_02403
XFTem_02236
prepilin-type N-terminal cleavagemethylation
domain (PilA) -294
Cluster rpf
XF1113
PD0405
XF9a_01026
XFTem_00457
Response regulator containing a CheY-like
receiver domain and an HD-GYP domain (RpfG) -157
XF1115
PD0407
XF9a_01028
XFTem_00459
Enoyl-CoA hydratasecarnithine racemase
(RpfF) -148
Fosfodiesterase e diguanilato ciclase
XF2624
PD1994
XF9a_02479
XFTem_02315
PAS domain S-boxdiguanylate cyclase (GGDEF)
domain -219
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF0972
PD0268
XF9a_00898
XFTem_00303
Response regulator containing a CheY-like
receiver domain and an HTH DNA-binding
domain
153
XF1133
PD0422
XF9a_01043
XFTem_00475 Multimeric flavodoxin WrbA 144
XF1254
PD0520
XF9a_01154
XFTem_00591
AraC-type DNA-binding domain-containing
proteins 262
XF1275
PD0534
XF9a_01172
XFTem_00606
poly(hydroxyalkanoate) granule-associated
protein -164
XF1350
PD0593
XF9a_01234
XFTem_00672 RNA polymerase sigma factor sigma-70 family -146
XF1463
PD0682
XF9a_01338
XFTem_00771 Transcriptional regulators 168
XF1843
PD1025
XF9a_01728
XFTem_01193 Nitrogen regulatory protein PII -175
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 206
XF2691
PD2048
XF9a_02538
XFTem_02377 alternative sigma factor RpoH -166
Hemolisinas
XF1280
PD0536
XF9a_01174
XFTem_00610
Hemolysins and related proteins containing CBS
domains 244
Lipases
XF2151
PD1211
XF9a_02036
XFTem_01402 hypothetical protein (lipase) -281
Resultados e Discussatildeo
135
Proteases
XF1187
PD0472
XF9a_01095
XFTem_00531
ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit
ClpP (EC342192) -154
XF2625
PD1995
XF9a_02481
XFTem_02316
Zn-dependent protease with chaperone function
(EC3424-) -160
9a5c_PWG_3d x Temecula1_PWG_3d
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 251
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 255
Hemolisinas
XF1280
PD0536
XF9a_01174
XFTem_00610
Hemolysins and related proteins containing CBS
domains 182
9a5c_PWG_10d x Temecula1_PWG_7d
Biogecircnese do pilus longo
XF1224
PD0502
XF9a_01129
XFTem_00565
type IV pilus assembly protein tip-associated
adhesin PilY1 200
Funccedilotildees regulatoacuterias
XF2535
PD1920
XF9a_02399
XFTem_02232 Signal transduction histidine kinase 298
Lipases
XF2151
PD1211
XF9a_02036
XFTem_01402 hypothetical protein (lipase) -274
49 Identificaccedilatildeo de pequenos RNAs (sRNAs) expressos pela cepa 9a5c
Eacute crescente o interesse na identificaccedilatildeo de pequenos RNAs regulatoacuterios em
bacteacuterias (sRNA) e no estudo de sua biogecircnese e dos mecanismos de atuaccedilatildeo (Morris e
Mattick 2014 Nitzan et al 2017) Na tentativa de descrever o conteuacutedo de sRNAs em
X fastidiosa e concomitantemente estimar seus niacuteveis de expressatildeo foi realizado o
sequenciamento de bibliotecas enriquecidas em sRNAs preparadas da cepa 9a5c
cultivada no meio rico PWG (iniacutecio do crescimento exponencial) Segundo o protocolo
de preparaccedilatildeo de bibliotecas de sRNA a etapa de ligaccedilatildeo dos adaptadores eacute passiacutevel de
modificaccedilatildeo Deve-se escolher entre incubar a amostra por um menor periacuteodo de tempo
agrave temperatura ambiente (1 hora a 25degC biblioteca A) ou aumentar o tempo de
Resultados e Discussatildeo
136
incubaccedilatildeo em uma temperatura inferior (18 horas a 16degC biblioteca B) A diferenccedila
estaria no fato de que diferentes tipos de sRNAs poderiam ter diferentes eficiecircncias na
ligaccedilatildeo dos adaptadores Uma vez que se trata da primeira tentativa em analisar sRNAs
de X fastidiosa foi decidido realizar o sequenciamento de bibliotecas preparadas com
os dois protocolos de incubaccedilatildeo
Apoacutes o sequenciamento foi realizada a etapa de filtragem dos diacutemeros de
adaptadores que possam ter sido formados e do corte (trimming) de sequecircncias de
adaptadores das sequecircncias dos cDNA obtidos Em seguida as sequecircncias obtidas
foram usadas para montagem de transcritos gerando sRNAs candidatos (Tabelas S7 e
S8) Foram encontrados 1154 e 1167 sRNAs candidatos para as bibliotecas A e B
respectivamente Conforme sugerido no protocolo a biblioteca B incubada por um
periacuteodo de tempo maior teve um maior nuacutemero de sRNAs obtidos apesar da diferenccedila
ser de somente 13 sRNAs Entretanto podemos observar a presenccedila de transcritos
montados com tamanhos fora dos limites descritos na literatura para sRNAs
bacterianos que teriam comprimentos entre 50 e 500 nucleotiacutedeos Apoacutes a retirada
dessas sequecircncias que estatildeo fora dos limites foram definidos 1126 e 1143 sRNAs para
as bibliotecas A e B respectivamente com tamanhos meacutedios de cerca de 80
nucleotiacutedeos (Tabela 22)
Os valores de cobertura dos transcritos isto eacute a razatildeo entre ldquonuacutemero total de
bases das sequecircncias (reads)rdquo pelo ldquonuacutemero de bases do sRNA montadordquo variou de
pouco mais de 3x ateacute cerca de 6500x contando ambas as bibliotecas O nuacutemero de
reads usados para a montagem de cada sRNA candidato variou entre 10 e 11700
valores que podem indicar uma medida superficial de expressatildeo daquele candidato
Tabela 22 Resultados da montagem dos sRNAs candidatos Os valores de tamanho cobertura e nuacutemero de reads correspondem ao total de sRNAs com tamanho entre 50 e 500 nucleotiacutedeos
Biblioteca Total de sRNAs
Total (50 a 500
nts)
Tamanho (meacutedia) (nts)
Cobertura (meacutedia)
Ndeg de reads (meacutedia)
A (1h 25degC) 1154 1126 50 - 486 (81)
34 - 44419 (284)
10 ndash 11202 (839)
B (16h 18degC) 1167 1143 50 - 476 (825)
33 - 65815 (339)
10 ndash 11773 (1138)
Em seguida foram realizados alinhamentos das sequecircncias das duas bibliotecas
entre si e contra o genoma da cepa 9a5c utilizando a ferramenta BLAST (Altschul et al
1990) No primeiro caso foi possiacutevel observar 321 alinhamentos com alta porcentagem
de identidade (gt96) entre as sequecircncias dos sRNAs candidatos das duas bibliotecas
Resultados e Discussatildeo
137
correlacionando os sRNAs em comum (Tabela S9) Apesar da grande quantidade de
sRNAs candidatos observados nas duas bibliotecas apenas cerca de 28 foram
encontrados em ambas de acordo com este alto valor de identidade considerado Pode-
se sugerir que a diferenccedila no tempo de incubaccedilatildeo das preparaccedilotildees refletiu nos diferentes
perfis de sRNAs candidatos observados
Ao realizar o alinhamento dos sRNAs candidatos com o genoma de 9a5c foram
obtidas as coordenadas genocircmicas exatas que definem a regiatildeo de onde eles foram
transcritos (Tabelas S10 e S11) Em ambas as bibliotecas foram encontrados sRNAs
que mapearam em mais de um local no genoma podendo estar proacuteximos ou mesmo
distantes Trata-se de uma informaccedilatildeo interessante uma vez que o genoma de Xylella
apresenta diversas regiotildees repetidas o que pode ter aumentado o nuacutemero de coacutepias
destes sRNAs Segundo o protocolo de preparaccedilatildeo de bibliotecas utilizado eacute preservada
a informaccedilatildeo da direccedilatildeo da transcriccedilatildeo ou seja de qual fita do DNA o transcrito
originou-se Dessa forma seraacute possiacutevel definir sRNAs candidatos que estejam antisenso
a regiotildees contendo ORFs jaacute conhecidas Tal correlaccedilatildeo entre ORFs e sRNAs deveraacute ser
feita futuramente juntamente com a busca por possiacuteveis moleacuteculas de mRNAs que
possam ser alvo de regulaccedilatildeo por estes sRNAs
Resultados e Discussatildeo
138
Parte B) Descriccedilatildeo e comparaccedilatildeo dos transcritomas de oito cepas de Xylella
fastidiosa
Nesta segunda parte do trabalho seratildeo apresentados os estudos dos transcritomas
de oito cepas de X fastidiosa em duas fases do crescimento em meio PWG Como
detalhado na seccedilatildeo anterior (parte A) foi observado maior quantidade de genes
diferencialmente expressos na comparaccedilatildeo entre transcritomas de duas cepas (9a5c e
Temecula1) cultivadas nas mesmas condiccedilotildees do que na comparaccedilatildeo entre meios ou
fases de crescimento de uma mesma cepa Estas observaccedilotildees sugerem uma regulaccedilatildeo
gecircnica diferente entre genes ortoacutelogos destas duas cepas o que motivou a ampliaccedilatildeo do
trabalho para descrever e comparar transcritomas de seis outras cepas de X fastidiosa
Dessa forma foram realizadas anaacutelises dos transcritomas de outras seis cepas
isoladas de hospedeiros vegetais ou locais distintos (Tabela 2) J1a12 (natildeo virulenta)
U24d e Fb7 isoladas de citros 3124 isolada de cafeeiro Hib4 isolada de hibisco e
Pr8x isolada de ameixeira Ao contraacuterio das cepas Temecula1 e 9a5c estas seis cepas
satildeo ainda pouco estudadas mas tambeacutem apresentam diferenccedilas genocircmicas e fenotiacutepicas
in vitro (Pierry 2012 Santana 2012) Por exemplo algumas mutaccedilotildees em genes de
virulecircncia importantes foram encontradas no gene pilQ relacionado a externalizaccedilatildeo
do pilus longo na cepa U24d (Santana 2012) no gene rpfC proteiacutena sensora de DSF
na sinalizaccedilatildeo por percepccedilatildeo de quorum na cepa Fb7 (Santana 2012) no gene rpfB
responsaacutevel pela diversidade de moleacuteculas de DSF na cepa J1a12 (Pierry 2012) aleacutem
da confirmaccedilatildeo das diferenccedilas encontradas em um trabalho anterior com esta cepa
utilizando microarranjos (Koide et al 2004) a observaccedilatildeo de que o gene para a
poligalacturonase (pglA) se encontra intacto nas cepas Hib4 e Pr8x (Pierry 2012) assim
como nas cepas norte-americanas e diferente do gene truncado encontrado nas cepas
sul-americanas (Simpson et al 2000) Somadas agraves anaacutelises dos seus genomas as
anaacutelises dos transcritomas seratildeo importantes para explicar os fenoacutetipos observados
Aleacutem disso as comparaccedilotildees entre os transcritomas tem o potencial de apontar para
determinantes relevantes para a especificidade de hospedeiro bem como de revelar
novos genes associados agrave colonizaccedilatildeo e virulecircncia
Assim como no caso das cepas 9a5c e Temecula1 foram sequenciados os
transcritomas de ceacutelulas no iniacutecio e no final do crescimento exponencial no meio rico
PWG Este meio foi escolhido porque resulta em melhor rendimento do crescimento
populacional e maior facilidade na obtenccedilatildeo de amostras iacutentegras de RNA total Foram
Resultados e Discussatildeo
139
realizadas as curvas de crescimento para orientar a escolha do tempo de coleta das
ceacutelulas para extraccedilatildeo da amostra de RNA total Os procedimentos de extraccedilatildeo de RNA
total depleccedilatildeo do rRNA preparo das bibliotecas de cDNA sequenciamento do
transcritoma e anaacutelises de dados foram realizados como descrito na parte A deste
trabalho seguindo o fluxograma mostrado na Figura 1
410 Curva de crescimento populacional de seis cepas de X fastidiosa
O crescimento populacional das seis cepas no meio PWG foi analisado por 21
dias (Figura 9) assim como realizado para as cepas 9a5c e Temecula1 (Figura 2) As
cepas isoladas de citros J1a12 e U24d apresentaram certo atraso no crescimento nos
primeiros dias de cultivo quando comparado com as outras cepas analisadas
Consequentemente ambas atingiram o final da fase exponencial tardiamente poreacutem
com valores semelhantes de densidade celular A cepa Pr8x isolada de ameixeira
apresentou valores altos de densidade celular ao final do ensaio assim como observado
para a cepa 9a5c A cepa 3124 apresentou um perfil mais caracteriacutestico de crescimento
bacteriano com suas fases bem definidas e atingindo a fase estacionaacuteria com tempo
semelhante ao observado para a cepa J1a12
A cepa Fb7 isolada de citros na Argentina atingiu a fase estacionaacuteria mais cedo
(~8 dias) aleacutem de apresentar um crescimento populacional menor (DO600nm lt 10) Tal
fato tambeacutem foi observado para a cepa Temecula1 a qual parece ter atingido a fase
estacionaacuteria com 7 dias Jaacute o perfil de crescimento populacional da cepa Hib4 isolada
de hibisco parece apresentar um decreacutescimo moderado com 15 dias poreacutem retoma apoacutes
21 dias e ultrapassa ligeiramente a DO600nm gt10
As curvas de crescimento foram utilizadas para guiar a escolha do dia de coleta
para cada uma das seis cepas As amostras do iniacutecio do crescimento exponencial foram
obtidas no 3deg dia para as cepas Fb7 3124 Hib4 e Pr8x no 5deg dia para a cepa J1a12 e 7deg
dia para a cepa U24d As amostras do final do crescimento exponencial foram obtidas
no 7deg dia para as cepas Fb7 3124 e Hib4 no 10deg dia para J1a12 e Pr8x e no 15deg dia
para U24d (Figura 9) Todos os cultivos foram iniciados com DO600nm = 005
Assim como observado para as cepas 9a5c e Temecula1 os fenoacutetipos in vitro de
cultivo das seis cepas analisadas nesta etapa tambeacutem mostraram grande variaccedilatildeo (Figura
10) As cepas J1a12 Fb7 e Hib4 mostraram fenoacutetipos de menor agregaccedilatildeo de ceacutelulas
Resultados e Discussatildeo
140
planctocircnicas quando comparados com as outras cepas Apesar disso em fases tardias de
crescimento apresentaram formaccedilatildeo de biofilme aderido ao frasco A cepa U24d
apresentou a maior deposiccedilatildeo de ceacutelulas aderidas em biofilme
Figura 9 Curva de crescimento de seis cepas de X fastidiosa (A) cepa J1a12 (B) cepa U24d (C) cepa Fb7 (D) cepa 3124 (E) cepa Hib4 e (F) cepa Pr8x foram cultivadas em tubos cocircnicos de 50 mL com DO600nm inicial de 005 no meio PWG a 28oC e 170 rpm Mediccedilotildees da DO600nm foram realizadas nos 1deg 3deg 7deg 10deg 15deg e 21deg dias de cultivo Barras verticais representam o desvio padratildeo da meacutedia de trecircs reacuteplicas teacutecnicas
Resultados e Discussatildeo
141
Figura 10 Fenoacutetipo de crescimento in vitro no meio PWG dos dias escolhidos para a extraccedilatildeo de RNA total (A) cepa J1a12 com 5 dias (B) cepa J1a12 com 10 dias (C) cepa U24d com 7 dias (D) cepa U24d com 15 dias (E) cepa Fb7 com 3 dias (F) cepa Fb7 com 7 dias (G) cepa 3124 com 3 dias (H) cepa 3124 com 7 dias (I) cepa Hib4 com 3 dias (J) cepa Hib4 com 7 dias (K) cepa Pr8x com 3 dias (L) cepa Pr8x com 10 dias O cultivo foi iniciado com DO600nm de 005 As imagens mostram uma de duas reacuteplicas bioloacutegicas para cada condiccedilatildeo Frascos incubados a 28degC e 170 rpm
411 Obtenccedilatildeo dos transcritomas por RNA-Seq
As extraccedilotildees das amostras de RNA total das seis cepas quantificaccedilotildees e anaacutelises
de qualidade e integridade foram realizadas exatamente como descrito na parte A (item
43) A Tabela 23 lista os paracircmetros de qualidade para todas as amostras de RNA
extraiacutedas das seis cepas os quais de modo geral estatildeo plenamente adequados para
realizaccedilatildeo do RNA-Seq Tambeacutem para estas amostras a completa remoccedilatildeo do DNA
destas preparaccedilotildees de RNA total foi confirmada por PCR com um par de primers
especiacutefico para detecccedilatildeo de DNA de X fastidiosa (dados natildeo mostrados)
As preparaccedilotildees de RNA total foram submetidas agrave depleccedilatildeo de rRNAs para
enriquecimento em moleacuteculas de mRNAs seguindo-se anaacutelise por eletroforese capilar
Para quase todas as amostras indicadas na Tabela 23 a eficiecircncia na remoccedilatildeo de rRNAs
Resultados e Discussatildeo
142
foi muito bem-sucedida (dados natildeo mostrados) Entretanto em algumas reacuteplicas das
cepas Hib4 e U24d a depleccedilatildeo do rRNA foi incompleta o que soacute foi verificado apoacutes o
sequenciamento do transcritoma Assim novas reacuteplicas foram obtidas sendo que
apenas os paracircmetros destas reacuteplicas constam da Tabela 23
As amostras purificadas e depletadas de rRNAs foram entatildeo utilizadas para a
preparaccedilatildeo das bibliotecas de cDNA Assim como observado para as bibliotecas das
cepas 9a5c e Temecula1 para todas elas foi obtido um excelente rendimento tanto
quanto agrave concentraccedilatildeo como na qualidade pureza e tamanho meacutedio do inserto (Tabela
23) As 31 bibliotecas de cDNA foram sequenciadas em nove corridas no equipamento
MiSeq (Illumina) utilizando a estrateacutegia de Paired-End com um kit para 500 ciclos Este
total de bibliotecas inclui 7 bibliotecas das cepas Hib4 e U24d que foram refeitas devido
a falhas na etapa depleccedilatildeo de rRNAs como mencionado acima Assim como nas
corridas anteriores (Tabela 3) o rendimento da maioria dessas corridas foi excelente
com quantidades de sequecircncias muito proacuteximas ou ateacute maiores do que o previsto pelo
fabricante que eacute de 25 milhotildees de sequecircncias (Tabela 24) Dados das corridas 1 e 3
(Tabela 3) foram novamente citados na Tabela 24 uma vez que incluiacuteram bibliotecas da
cepa Fb7
Cabe destacar que a corrida 11 gerou cerca de 20 milhotildees de sequecircncias devido
a uma densidade de clusters mais baixa que as demais Por outro lado densidades muito
altas tambeacutem podem prejudicar como aconteceu na corrida 8 quando a porcentagem de
sequecircncias de alta qualidade apresentou uma queda em relaccedilatildeo as outras corridas Essas
variaccedilotildees na densidade de clusters provavelmente refletem pequenos erros na
quantificaccedilatildeo das bibliotecas sendo que a concentraccedilatildeo que foi utilizada nestes
sequenciamentos variou de 6 a 8 pM
Resultados e Discussatildeo
143
Tabela 23 Dados das amostras de RNA de cada uma das seis cepas cultivadas em PWG (painel esquerdo) e de suas respectivas bibliotecas de cDNA (painel direito)
Cepa Tempo (dias)
NanoDrop (ngmicroL)
A260 280
A260 230
RIN RiboGreen
(ngmicroL) NanoDrop
(ngmicroL) A260 280
A260 230
Tamanho meacutedio (pb)
qPCR (nM)
Reacuteplica
J1a12
5 2298 215 089 82 1423 847 185 219 412 1384 1
2671 214 226 85 1577 896 187 221 417 1101 2
10 2519 215 218 87 1612 872 186 211 388 1418 1
2387 215 159 82 1459 929 184 215 404 1598 2
U24d
7 2557 214 226 88 1494 893 186 217 401 1365 1
2807 213 181 94 1662 856 187 229 422 1444 2
15 1773 210 177 92 1005 451 184 220 368 1064 5
1853 210 144 91 1179 414 180 196 352 907 6
Fb7
3 2554 213 213 93 1411 744 185 222 369 2029 1
2469 214 107 94 1313 780 187 234 370 1484 2
7 3682 216 187 80 3353 607 184 191 381 940 1
2011 210 213 84 2246 506 182 229 342 1915 2
3124
3 2665 215 142 85 1559 932 184 221 383 1289 1
2629 215 204 88 1523 983 184 216 402 1327 2
7 2551 214 220 91 1515 857 185 220 401 1342 1
2606 215 222 95 1548 879 185 220 438 1171 2
Hib4
3 2687 215 193 81 1558 887 186 214 407 1528 2
2818 212 231 86 1753 939 182 193 415 2229 3
7 1931 207 203 89 1267 762 186 214 382 1774 3
1766 208 142 86 1112 731 186 227 352 2111 4
Pr8x
3 2525 214 222 92 1529 851 187 209 416 1388 1
2525 215 218 97 1462 731 190 205 389 1226 2
10 2621 216 115 90 1528 851 190 215 397 1492 1
2675 215 223 91 1572 733 190 208 383 1336 2
Resultados e Discussatildeo
144
Tabela 24 Resumo do rendimento de nove corridas contendo as bibliotecas das cepas J1a12 U24d Fb7 3124 Hib4 e Pr8x
Corrida Total de
sequecircncias Sequecircncias filtradas
Nuacutemero de bibliotecas
Densidade de clusters
gtQ30
1+ 25687600 16908052 4 1439 777
3+ 27988934 23358634 4 1547 777
6 22602532 20644205 6 1196 801
7 29875986 23164145 5 1654 746
8 30020946 24186651 5 1630 623
9 29033867 23293348 5 1591 751
10 27364241 23518326 5 1471 773
11 20793330 19006836 5 1099 797
12 22873995 19779191 2 1245 741
Paired-end reads Filtragem que remove sequecircncias com baixa qualidade gtQ30 indica sequecircncias de alta qualidade + Corridas citadas na Tabela 3 mas que conteacutem bibliotecas da cepa Fb7
412 Anaacutelises da qualidade das sequecircncias dos transcritomas
As sequecircncias obtidas nos sequenciamentos de todos os transcritomas das seis
cepas foram analisadas quanto agrave qualidade de suas bases seguindo a mesma estrateacutegia
descrita no item 43 De modo geral quase todos os transcritomas sequenciados nesta
parte apresentaram padrotildees de qualidade semelhantes ao exemplo mostrado
anteriormente (Figura 4) como exemplificado pela anaacutelise das sequecircncias da biblioteca
da primeira reacuteplica da cepa 3124 crescida por 3 dias em meio PWG (Figura 11A-C)
No entanto foi verificado que as bibliotecas sequenciadas na corrida 8
(3124_7d1 Pr8x_3d1 e Pr8x_10d1) apresentaram uma maior quantidade de sequecircncias
com escores de qualidade acima de Q15 (Figura 11D) o que reflete o fato dessa corrida
ter apresentado uma menor porcentagem de sequecircncias com alta qualidade
Resultados e Discussatildeo
145
Figura 11 Anaacutelise da qualidade por base das sequecircncias do transcritomas 3124_3d1 e Pr8x_3d1 Anaacutelise das sequecircncias da primeira extremidade (read1) (A) da segunda extremidade (read2) (B) e as sequecircncias pareadas (read1+read2) (C) do transcritoma da primeira reacuteplica da cepa 3124 cultivada por 3 dias em PWG (D) anaacutelise das sequecircncias pareadas (read1+read2) da primeira reacuteplica da cepa Pr8x cultivada por 3 dias em PWG As anaacutelises foram realizadas usando o software FASTQC O eixo das abcissas conteacutem os tamanhos das sequecircncias (1 ateacute 250) enquanto que o eixo das ordenadas conteacutem os valores de Q escore (de 0 a 40)
413 Mapeamento das sequecircncias dos transcritomas nos genomas de referecircncia
O software CLC Genomics Workbench foi utilizado para o mapeamento das
sequecircncias nos genomas de referecircncia exatamente como descrito no item 44 Todas as
cepas utilizadas neste estudo jaacute tiveram seus genomas sequenciados e montados em
trabalhos anteriores (Pierry 2012 Santana 2012) Portanto cada transcritoma foi
adequadamente mapeado na sua respectiva sequecircncia genocircmica e anotaccedilatildeo gecircnica para
obtenccedilatildeo de valores de expressatildeo baseados na normalizaccedilatildeo por FPKM
O nuacutemero de sequecircncias por biblioteca variou refletindo o nuacutemero de bibliotecas
sequenciadas por corrida (Tabela 25) e assim como observado para os transcritomas de
9a5c e Temecula1 (item 44) estaacute dentro do recomendado para anaacutelise de expressatildeo
Resultados e Discussatildeo
146
diferencial (Haas et al 2012) As porcentagens de sequecircncias mapeadas (664 a 889)
foram consideradas satisfatoacuterias para as anaacutelises subsequentes
Tabela 25 Resumo do rendimento de cada biblioteca sequenciada
Cepa Tempo (dias)
Total de sequecircncias
Tamanho meacutedio (bases)
Distacircncia entre paired reads
(bases)
Sequecircncias mapeadas
Reacuteplica
J1a12
5 8094534 156 63 a 240 6752880 (834) 1
9982832 157 65 a 249 8064520 (808) 2
10 9683066 150 62 a 240 7195622 (743) 1
7957756 150 63 a 249 5792488 (728) 2
U24d
7 10279226 151 60 a 240 8997494 (875) 1
9332698 150 59 a 240 7635964 (818) 2
15 19078998 152 64 a 250 15067468 (790) 5
19890124 146 63 a 249 17282894 (869) 6
Fb7
3 5783996 159 71 a 240 4809678 (832) 1
9142576 157 70 a 240 6984550 (764) 2
7 7743594 163 66 a 241 6458294 (834) 1
10071298 147 67 a 241 8943750 (888) 2
3124
3 9733762 158 67 a 249 8445092 (868) 1
9546034 153 63 a 240 8236080 (863) 2
7 8542486 160 63 a 235 6554300 (767) 1
11366984 149 63 a 240 10105710 (889) 2
Hib4
3 8676050 155 62 a 249 6783638 (782) 2
7658814 160 68 a 248 6161342 (805) 3
7 8571260 155 64 a 248 7132760 (832) 3
6979646 155 67 a 249 5719766 (820) 4
Pr8x
3 10111206 159 62 a 238 7770606 (769) 1
7377760 154 65 a 249 5832910 (791) 2
10 8900358 163 63 a 232 5913106 (664) 1
8509818 149 64 a 249 6681236 (785) 2
414 Anaacutelise de correlaccedilatildeo das reacuteplicas bioloacutegicas e entre diferentes transcritomas
As anaacutelises de transcritomas relatadas na parte A mostraram altos valores de
correlaccedilatildeo entre as trecircs reacuteplicas bioloacutegicas para cada amostra quando comparadas aos
pares Este resultado justificou a decisatildeo de sequenciar somente duas reacuteplicas de cada
condiccedilatildeo no caso dos transcritomas das seis cepas descritas nesta parte da tese
Sabe-se que um maior nuacutemero de reacuteplicas eleva o poder estatiacutestico nas anaacutelises
de expressatildeo diferencial principalmente na detecccedilatildeo de genes com baixa expressatildeo
Para contornar eventuais imprecisotildees de anaacutelises de expressatildeo baseadas em duas
Resultados e Discussatildeo
147
reacuteplicas Schurch e colaboradores (Schurch et al 2016) recomendam que seja
estabelecido um limite ao fold change diferente da hipoacutetese nula default que seria 0 o
que eacute possiacutevel quando eacute utilizada a ferramenta DESeq2 Estes autores realizaram um
estudo com 48 reacuteplicas bioloacutegicas de duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae e
utilizaram 11 ferramentas de anaacutelise de expressatildeo diferencial Dentre elas DESeq2 foi
considerada uma das 5 melhores ferramentas uma vez que eacute capaz de controlar o iacutendice
de falsos positivos mantendo-o perto ou abaixo de 5 (conforme utilizado neste
trabalho padjlt005) independentemente do nuacutemero de reacuteplicas ou do valor limite de
fold change Outra vantagem desta ferramenta eacute a sua opccedilatildeo exclusiva de especificar o
valor limite de fold change para a hipoacutetese nula sendo testada Neste modo a ferramenta
testa se o valor medido para o fold change de um determinado gene eacute consistente em
estar abaixo do valor limite escolhido do que ser consistente com zero fornecendo um
mecanismo natural de incorporar um limite ao fold change de uma forma
estatisticamente significante
Assim como para os transcritomas de 9a5c e Temecula1 tambeacutem foram
realizadas anaacutelises de correlaccedilatildeo de Pearson entre as duas reacuteplicas de uma mesma
condiccedilatildeo utilizando valores de expressatildeo por FPKM Os valores de correlaccedilatildeo das
reacuteplicas foram sempre acima de 09 (Tabela 26) indicando que podem ser tratadas
como tal As plotagens de valores de FPKM entre duas reacuteplicas em uma mesma
condiccedilatildeo demonstram a alta correlaccedilatildeo entre as reacuteplicas bioloacutegicas (Figura 12)
Tabela 26 Valores de correlaccedilatildeo de Pearson entre as reacuteplicas de uma mesma condiccedilatildeo Anaacutelise foi realizada com os valores de FPKM de cada transcritoma
Cepa Meio Tempo (dias)
Valor de correlaccedilatildeo de Pearson
J1a12 PWG 5 0984
PWG 10 0995
U24d PWG 7 0991
PWG 15 0995
Fb7 PWG 3 0999
PWG 7 0999
3124 PWG 3 0992
PWG 7 0990
Hib4 PWG 3 0926
PWG 7 0955
Pr8x PWG 3 0997
PWG 10 0994
Resultados e Discussatildeo
148
Figura 12 Graacuteficos de correlaccedilatildeo entre reacuteplicas da mesma condiccedilatildeo baseado nos valores de FPKM transformados em logaritmo na base 10 Os graacuteficos correspondem agrave correlaccedilatildeo entre reacuteplicas de transcritomas em PWG das cepas J1a12 iniacutecio (A) e final (B) da fase exponencial U24d iniacutecio (C) e final (D) da fase exponencial Fb7 iniacutecio (E) e final (F) da fase exponencial 3124 iniacutecio (G) e final (H) da fase exponencial Hib4 iniacutecio (I) e final (J) da fase exponencial Pr8x iniacutecio (K) e final (L) da fase exponencial
Com os valores de FPKM transformados em log10 de todos os transcritomas
analisados foram gerados dois heatmaps um separado por reacuteplicas (Figura 13) e outro
com valores meacutedios de cada condiccedilatildeo (Figura 14) Estas anaacutelises incluiacuteram os
transcritomas de 9a5c e Temecula1 obtidos do crescimento em meio PWG para
comparaccedilatildeo com os transcritomas das outras seis cepas
O heatmap baseado nos valores de cada reacuteplica separadamente mostrou que as
cepas Fb7 J1a12 Pr8x e Hib4 tiveram todos os seus transcritomas agrupados lado a
Resultados e Discussatildeo
149
lado inclusive separados de acordo com a mesma fase de crescimento (Figura 13)
Entretanto as cepas 9a5c U24d 3124 e Temecula1 natildeo seguiram o mesmo padratildeo Em
alguns casos as reacuteplicas de mesma fase do crescimento se mantiveram agrupadas como
para as cepas 9a5c e 3124 Jaacute na cepa U24d uma das reacuteplicas de iniacutecio do crescimento
agrupou-se distante do grupo de outras reacuteplicas da mesma cepa Os transcritomas de
Temecula1 a uacutenica cepa norte-americana e da subespeacutecie fastidiosa apresentaram
localizaccedilotildees isoladas dos grupos maiores comportando-se com ldquogrupo externordquo Os
dois transcritomas de iniacutecio de crescimento de Temecula1 localizaram-se externamente
ao grupo de todos os transcritomas de Hib4 e os de fase inicial das cepas 9a5c e 3124 A
primeira reacuteplica do transcritoma de Temecula1 na fase final comportou-se com ldquogrupo
externordquo ao grupo contendo todos os transcritomas de Pr8x trecircs reacuteplicas de U24d e os
transcritomas de fase final de 9a5c Jaacute a segunda reacuteplica do transcritoma de Temecula1
na fase final posicionou-se externamente ao grupo contendo todos os transcritomas de
Fb7 os transcritomas de 3124 na fase final e uma reacuteplica do transcritoma de iniacutecio do
crescimento de U24d Os transcritomas da cepa J1a12 foram os que mostraram maior
diferenccedila em relaccedilatildeo aos outros uma vez que se localizaram isoladamente em um uacutenico
grupo (Figura 13)
O heatmap baseado nos valores meacutedios (log10) de FPKM de cada condiccedilatildeo
mostrou um agrupamento das condiccedilotildees similar ao observado no heatmap anterior As
cepas Fb7 J1a12 Hib4 e Pr8x apresentaram seus transcritomas de iniacutecio e final do
crescimento agrupados lado a lado As cepas 9a5c e 3124 tiveram os transcritomas de
iniacutecio do crescimento posicionados em um mesmo grupo Por outro lado o transcritoma
da cepa 9a5c no final do crescimento agrupou com o da cepa U24d tambeacutem da fase
final do crescimento Jaacute a condiccedilatildeo de fase inicial de U24d agrupou-se com a de fase
final de 3124 tendo a condiccedilatildeo de Temecula1 em fase final localizada proacutexima Ainda
Temecula1 teve sua condiccedilatildeo de iniacutecio do crescimento localizada externamente ao
grupo que inclui Hib4 (Figura 14)
Novamente justificamos que estas discrepacircncias podem ser um reflexo da
dificuldade em se obter inoacuteculos da mesma condiccedilatildeo nos quais as populaccedilotildees
bacterianas estejam em sincronismo entre si assim como dito em relaccedilatildeo aos heatmaps
da parte A (item 45) Entretanto de um modo geral foi possiacutevel observar uma
coerecircncia nos agrupamentos baseados nos valores de FPKM das oito cepas analisadas
Resultados e Discussatildeo
150
Figura 13 Heatmap com valores de FPKM em log10 de todas as reacuteplicas das condiccedilotildees analisadas em todas as cepas As colunas representam os transcritomas devidamente nomeadas As linhas representam cada gene analisado (1341 genes) O dendrograma no topo da figura mostra o agrupamento dos transcritomas em questatildeo O graacutefico na parte superior direita da figura representa uma gradaccedilatildeo de cores baseando-se nos valores de FPKM sendo que na escala quanto mais proacuteximo do vermelho menor a expressatildeo e quanto mais proacuteximo do branco maior a expressatildeo Para a geraccedilatildeo da imagem foi usada a funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots utilizando a plataforma R
Resultados e Discussatildeo
151
Figura 14 Heatmap com as meacutedias dos valores de FPKM em log10 de todas as reacuteplicas para cada condiccedilatildeo analisada em todas as cepas As colunas representam as condiccedilotildees devidamente nomeadas As linhas representam cada gene analisado (1341 genes) O dendrograma no topo da figura mostra o agrupamento das condiccedilotildees em questatildeo O graacutefico na parte superior direita da figura representa uma gradaccedilatildeo de cores baseando-se nos valores meacutedios de FPKM sendo que na escala quanto mais proacuteximo do vermelho menor a expressatildeo e quanto mais proacuteximo do branco maior a expressatildeo Para a geraccedilatildeo da imagem foi usada a funccedilatildeo heatmap2 do pacote gplots utilizando a plataforma R
Resultados e Discussatildeo
152
415 Anaacutelise dos transcritomas baseada nos valores de FPKM
4151 Panorama da expressatildeo gecircnica das seis cepas
As listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo em FPKM (dados natildeo
apresentados) para cada transcritoma foram devidamente ordenadas e os genes divididos
em quatro categorias (Tabela 27) de acordo com intervalos de valores de FPKM Assim
como observado nos transcritomas de 9a5c e Temecula1 a categoria mais representada
foi a de genes com FPKM entre 100 e 0 evidenciando que a maioria dos genes
apresenta baixa expressatildeo (456 ndash 766)
Genes com valores de expressatildeo iguais a zero tambeacutem foram observados nestes
transcritomas (59 ndash 133) Dentre esses genes estatildeo a grande maioria dos genes de
tRNAs pois como mencionado anteriormente tais transcritos satildeo perdidos durante o
procedimento de preparaccedilatildeo das bibliotecas Estas observaccedilotildees confirmam a completa
ausecircncia de contaminaccedilatildeo com DNA nas preparaccedilotildees de RNA total que foram utilizadas
no RNA-Seq
Tambeacutem como observado anteriormente (parte A item 471) sequecircncias de
rRNAs foram detectadas com baixiacutessima expressatildeo em poucos transcritomas Conforme
jaacute mencionado o paracircmetro utilizado no mapeamento permite a contagem do fragmento
apenas caso ele mapeie exclusivamente em um uacutenico local do genoma Uma vez que
tambeacutem observamos altos valores de porcentagens de mapeamento das sequecircncias em
um uacutenico local no genoma em todos os transcritomas (862 - 939) pode-se considerar
a depleccedilatildeo de rRNAs satisfatoacuteria (Tabela 27)
A maioria dos genes encontrada com expressatildeo igual a zero satildeo aqueles com
funccedilatildeo hipoteacutetica ou provenientes de regiotildees de proacutefagos assim como verificado para
os transcritomas analisados na parte A (item 471) Vale lembrar que o conteuacutedo de
fagos nos diferentes genomas varia em nuacutemero e composiccedilatildeo de genes (Santana 2012)
Novamente podemos sugerir que tais genes possivelmente fazem parte de regiotildees
remanescentes de fagos incompletos e inativos embora pudessem eventualmente ser
expressos em outras condiccedilotildees de cultivo Entretanto alguns genes relacionados a fagos
apresentaram valores positivos de expressatildeo por FPKM em todos os transcritomas
Resultados e Discussatildeo
153
Destacamos a observaccedilatildeo de que genes codificadores da toxina Zonula
occludens (Zot) tambeacutem natildeo estatildeo expressos nas cepas 3124 e Hib4 assim como visto
em Temecula1 Nas outras cepas todos os genes para Zot estariam expressos
Nas cepas de citros U24d e J1a12 os genes para uma DNA primase e para a
proteiacutena VirD4 tambeacutem foram encontrados silenciados assim como em 9a5c Um gene
codificador de uma flavodoxina multimeacuterica (WrbA) foi encontrado com expressatildeo zero
em U24d Jaacute na cepa J1a12 dois genes para subunidades da protease Clp e dois genes
para proteiacutenas de montagem do pilus longo (PilA) natildeo estatildeo expressos Entretanto
outras duas coacutepias de pilA mostraram-se fracamente expressas Na outra cepa de citros
Fb7 genes de proteiacutenas de exportaccedilatildeo de grupo heme e uma acetiltransferase foram
encontrados silenciados
Assim como visto para a cepa U24d as cepas 3124 e Pr8x mostraram expressatildeo
zero para o gene da flavodoxina multimeacuterica (WrbA) Na cepa 3124 genes de uma
possiacutevel hemaglutinina e de uma metilase de DNA natildeo estatildeo expressos Jaacute em Pr8x um
gene de uma permease para arabinose e outro de GTPase relacionada a fatores de
elongaccedilatildeo da traduccedilatildeo estariam silenciados
Na cepa Hib4 foi observado que genes codificadores de acetiltransferases
proteiacutenas de biossiacutentese de grupo heme glicosil transferases uma esterase predita uma
metilase envolvida na biossiacutentese de ubiquinona e metaloproteases dependentes de
zinco (elastase) tambeacutem natildeo estatildeo expressos Poreacutem outras duas coacutepias de elastases
estariam expressas Por fim genes da proteiacutena de retraccedilatildeo do pilus longo (PilT) e uma
hemaglutinina tambeacutem apresentaram valores de expressatildeo iguais a zero
As cepas que tiveram seus transcritomas sequenciados exceto a cepa 3124
possuem plasmiacutedeos (Pierry 2012 Santana 2012) As sequecircncias obtidas nos
transcritomas tambeacutem foram mapeadas contra as sequecircncias destes plasmiacutedeos e o niacutevel
de expressatildeo desses genes foi classificado baseado nos valores de FPKM A grande
maioria dos genes mostrou altos valores de expressatildeo em todas as condiccedilotildees e cepas
concentrando-se nas categorias ldquoacima de 10000rdquo e ldquoentre 10000 e 1000rdquo (Tabela 28)
A alta expressatildeo destes genes pode estar relacionada ao nuacutemero de coacutepias destes
plasmiacutedeos
Nos plasmiacutedeos pXF27 (J1a12) pXF39 (Pr8x) e nos transcritomas da fase
inicial em pXF64 (Hib4) a categoria mais representada foi a de genes com FPKM
maiores que 10000 Enquanto isso os outros plasmiacutedeos e os transcritomas de fase
Resultados e Discussatildeo
154
final em pXF64 a categoria com maior nuacutemero de genes foi a de genes com FPKM
entre 10000 e 1000 (Tabela 28)
Quase todos os genes dos plasmiacutedeos foram encontrados com valores de FPKM
diferentes de zero com algumas exceccedilotildees (Tabela 28) No pXF39 da cepa Fb7 foi
anotado o ncRNA traJ-II poreacutem tais transcritos natildeo foram detectados em nenhum dos
transcritomas analisados Trata-se de um motivo cis-regulatoacuterio encontrado in silico em
proteobacteacuterias poreacutem ainda sem funccedilatildeo definida (Weinberg et al 2010) Os outros
poucos genes com expressatildeo igual a zero satildeo classificados com funccedilotildees hipoteacuteticas
Alguns deles se repetem nos transcritomas da mesma cepa como por exemplo o
primeiro gene do pXF51 de U24d os genes 50 e 52 no pXF64 e o genes 1 21 e 57 do
pXF39 de Pr8x
Resultados e Discussatildeo
155
Tabela 27 Nuacutemero de genes contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos em cada transcritoma Cepa Tempo (dias) Total de genes gt10000 Entre 10000 e 1000 Entre 1000 e 100 Entre 100 e 0 Zero+ Genes expressos () Reacuteplica
J1a12
5 2784 9 89 929 1422 335 880 1
2784 11 104 901 1434 334 880 2
10 2784 2 64 767 1621 330 881 1
2784 4 30 709 1697 344 876 2
U24d
7 2623 5 32 691 1711 184 930 1
2623 4 16 388 1996 219 917 2
15 2623 9 63 987 1410 154 941 5
2623 6 45 759 1651 162 938 6
Fb7
3 2659 4 87 611 1706 251 906 1
2659 4 74 552 1819 209 921 2
7 2659 3 35 340 2037 243 909 1
2659 4 38 474 1979 162 939 2
3124
3 2674 6 95 735 1578 260 903 1
2674 8 98 772 1540 256 904 2
7 2674 3 40 510 1836 285 893 1
2674 3 35 530 1840 266 901 2
Hib4
3 2765 8 89 808 1504 356 871 2
2765 10 117 949 1321 368 862 3
7 2765 10 126 929 1356 344 871 3
2765 6 130 1003 1262 364 864 4
Pr8x
3 2603 12 72 811 1506 202 922 1
2603 11 70 738 1563 221 915 2
10 2603 8 70 784 1531 210 919 1
2603 6 36 686 1672 203 922 2
total de genes analisado subtraindo-se os genes de rRNAs e tRNAs +genes com valor zero de FPKM subtraindo-se os genes de rRNAs e tRNAs
Resultados e Discussatildeo
156
Tabela 28 Nuacutemero de genes dos plasmiacutedeos indicados contabilizados por faixa de valores de FPKM e porcentagem de genes expressos
Plasmiacutedeo Tempo (dias)
Total de
genes gt10000
Entre 10000 e 1000
Entre 1000 e 100
Entre 100 e 0
Zero Genes
expressos ()
Reacuteplica
pXF27
(J1a12)
5 38 31 6 1 0 0 100 1
38 26 11 1 0 0 100 2
10 38 30 7 1 0 0 100 1
38 28 9 0 0 1 974 2
pXF51
(J1a12)
5 73 25 42 5 0 1 986 1
73 27 38 7 0 1 986 2
10 73 29 38 6 0 0 100 1
73 26 40 7 0 0 100 2
pXF51
(U24d)
7 70 27 40 1 1 1 986 1
70 32 35 1 0 2 971 2
15 70 29 38 2 0 1 986 5
70 26 41 2 0 1 986 6
pXF39
(Fb7)
3 51 21 26 3 0 1 980 1
51 21 26 3 0 1 980 2
7 51 23 25 2 0 1 980 1
51 23 27 0 0 1 980 2
pXF64
(Hib4)
3 67 33 29 3 0 2 970 2
67 32 30 3 0 2 970 3
7 67 28 34 3 0 2 970 3
67 30 33 2 0 2 970 4
pXF39
(Pr8x)
3 57 32 20 3 0 2 965 1
57 33 20 2 0 2 965 2
10 57 32 22 0 0 3 947 1
57 35 19 1 0 2 965 2
4152 Descriccedilatildeo dos genes mais expressos
A partir das listas de genes e seus respectivos valores de expressatildeo gecircnica
normalizados por FPKM foram destacados os dez genes mais expressos em todas as
condiccedilotildees e reacuteplicas das seis cepas em questatildeo (Tabelas 29 e 30)
Em quase todos os transcritomas o gene que apresentou maior expressatildeo
codifica para o ncRNA da endoribonuclease RNase P (Altman 2011) assim como
observado para os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 (item 472) As exceccedilotildees
foram as duas reacuteplicas dos transcritomas de fase final do crescimento em Hib4 nos
quais o gene mais expresso codifica uma colicina V (XF0263) O ncRNA da RNase P
Resultados e Discussatildeo
157
foi encontrado respectivamente nas 6ordf e 2ordf posiccedilotildees dos ordenamentos das reacuteplicas 1 e
2 de Hib4
O ncRNA 6S tambeacutem foi encontrado nas dez primeiras posiccedilotildees em 18 dos 24
transcritomas analisados As exceccedilotildees foram dois transcritomas de fase inicial (um em
J1a12 e um em 3124) e todos os transcritomas de Hib4 Nestes sua posiccedilatildeo no
ranqueamento variou da 11ordf ateacute a 47ordf Por se tratar de um RNA relacionado agrave mudanccedila
da fase exponencial para a fase estacionaacuteria em geral ele ocupa posiccedilotildees mais altas nos
rankings de FPKM dos transcritomas do final do crescimento assim como visto para as
cepas 9a5c e Temecula1
De modo similar ao observado com os transcritomas de 9a5c e Temecula1 (Parte
472) em todos os 24 transcritomas analisados estatildeo vaacuterios genes codificadores de
bacteriocinas Entre eles estatildeo os ortoacutelogos de trecircs colicinas V descritas no genoma de
X fastidiosa (XF0262 XF0263 e XF0264) (Simpson et al 2000) sendo que a XF0263
figura na primeira posiccedilatildeo dos rankings dos transcritomas do final do crescimento em
Hib4 Tambeacutem procuramos a identidade dos genes anotados como hipoteacuteticos e estes
codificam vaacuterias novas microcinas preditas em genomas de X fastidiosa (Rodrigo R
Duarte e Aline M da Silva dados natildeo publicados) Aleacutem daquelas indicadas nos
transcritomas de Temecula1 e 9a5c foram detectados transcritos de
bacteriocinasmicrocinas exclusivas das cepas J1a12 3124 e Fb7 Desta forma
modificamos a anotaccedilatildeo destes genes para ldquobacteriocinardquo A observaccedilatildeo de que o
arsenal de toxinas expressos nas cepas 9a5c e Temecula1 tambeacutem eacute abundantemente
encontrado em outras seis cepas de X fastidiosa eacute um forte indiacutecio de que esta pode ser
uma caracteriacutestica importante e comum neste fitopatoacutegeno Isto sugere um
comportamento agressivo desta bacteacuteria em seus nichos naturais para disputar recursos
(espaccedilo e nutrientes) com outros microrganismos presentes nos seus hospedeiros eou
vetores
Outra caracteriacutestica comum entre todas as cepas eacute detecccedilatildeo do gene de
Ax21Omp1X nas primeiras posiccedilotildees dos rankings de FPKM dos transcritomas das seis
cepas principalmente com maior expressatildeo no iniacutecio do crescimento
Outros genes tambeacutem encontrados entre os dez mais expressos em todos os
transcritomas codificam proteiacutenas relacionadas a estresses sejam as cold shock proteins
ou a heat shock protein Hsp20 Genes de proteiacutenas de membrana externa como a
OmpW tambeacutem estatildeo entre os mais expressos em todas as cepas e condiccedilotildees
Bacterioferritinas foram encontradas altamente expressas nos transcritomas das cepas
Resultados e Discussatildeo
158
J1a12 U24d Fb7 e 3124 assim como haviam sido vistas em 9a5c e Temecula1 Aleacutem
disso as cepas J1a12 e Fb7 apresentaram em comum a alta expressatildeo de genes de uma
cisteiacutena protease e de duas subunidades da protease Clp (ClpP e ClpX) O gene de uma
peroxiredoxina estaacute entre os dez mais expressos em J1a12 Jaacute em Fb7 trecircs genes de
proteiacutenas ribossomais um de uma lisozima um de uma peptidase e dois genes de
lipases (especificamente no final do crescimento) estatildeo abundantemente expressos
Mais uma vez genes com funccedilatildeo hipoteacutetica tambeacutem aparecem altamente expressos em
vaacuterios dos transcritomas os quais poderatildeo ser analisados em futuros estudos (Tabelas
29 e 30)
Os genes dos plasmiacutedeos de todas as cepas tambeacutem foram ranqueados baseados
em seus valores de FPKM (Tabela S12) O plasmiacutedeo pXF51 de U24d apresentou o
gene 37 o qual codifica uma proteiacutena relacionada a fagos sempre na primeira
colocaccedilatildeo em todos os transcritomas desta cepa Os outros genes observados entre os
dez primeiros do ranking codificam hidrolases putativas proteiacutena VirB5
transglicosilases uma proteiacutena de regulaccedilatildeo transcricional e a proteiacutena TrbJ
(relacionada agrave transferecircncia conjugativa) (Tabela S12)
A cepa J1a12 apresenta dois plasmiacutedeos o pXF27 e o pXF51 O primeiro
mostrou alta expressatildeo dos genes 13 (proteiacutena do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV) e 23
(funccedilatildeo hipoteacutetica) nos transcritomas de iniacutecio do crescimento Jaacute nos transcritomas do
seu final o gene 8 (funccedilatildeo hipoteacutetica) foi o primeiro colocado nos rankings seguido
tambeacutem pelo gene 23 Outros genes altamente expressos codificam uma proteiacutena
inibidora de crescimento (provavelmente uma toxina para manutenccedilatildeo do plasmiacutedeo na
ceacutelula) proteiacutenas do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV e transposases No pXF51 o gene
37 (proteiacutena com funccedilatildeo hipoteacutetica) foi o primeiro colocado em todos os transcritomas
desta cepa Os outros genes observados entre os dez mais expressos no pXF51 da cepa
J1a12 codificam para a proteiacutena VirB5 uma proteiacutena relacionada a fagos e uma proteiacutena
de regulaccedilatildeo transcricional (Tabela S12)
No plasmiacutedeo encontrado cepa Fb7 o gene 37 (proteiacutena relacionada a fagos) foi
encontrado como mais expresso em todos os transcritomas desta cepa O segundo
colocado codifica uma metil-ester carboxilesterase seguido de diversos genes com
funccedilatildeo hipoteacutetica reguladores transcricionais proteiacutena da famiacutelia ParB a interferase
MazF e a proteiacutena TrbJ (Tabela S12) No plasmiacutedeo pXF39 da cepa Pr8x o gene 19
(funccedilatildeo hipoteacutetica) foi encontrado como mais expresso em todos as condiccedilotildees
analisadas nesta cepa Outros genes observados nas dez primeiras posiccedilotildees codificam
Resultados e Discussatildeo
159
para proteiacutenas do sistema de secreccedilatildeo do tipo IV como a VirB2 VirB3 VirB5 e VirD2
aleacutem de reguladores transcricionais proteiacutenas relacionadas a fagos e diversas proteiacutenas
hipoteacuteticas (Tabela S12) Finalmente o pXF64 da cepa Hib4 apresentou o gene 4
(funccedilatildeo hipoteacutetica) como mais expresso nos transcritomas da fase inicial de
crescimento Jaacute nos transcritomas de final do crescimento o gene 35 (aciltransferase) e
o 42 (funccedilatildeo hipoteacutetica) foram encontrados na primeira posiccedilatildeo nas reacuteplicas analisadas
Genes codificando para proteiacutenas hipoteacuteticas proteiacutenas relacionadas a fagos
recombinases e aciltransferases tambeacutem figuram entre os dez genes mais expressos
(Tabela S12)
Resultados e Discussatildeo
160
Tabela 29 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas das cepas J1a12 U24d e Fb7 baseando-se em valores de FPKM Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov)
Cepa Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
J1a12
5
RNase P (13800)
Omp W (24200)
Bacteriocina (12310)
Cold shock proteins (26860)
Bacteriocina (12300)
6S RNA (21550)
Bacteriocina (11430)
Hipoteacutetica (11640)
Ax21 (18890)
Bacterio-ferritina (03640)
RNase P (13800)
Bacteriocina (11430)
Bacteriocina (11470)
Cold shock proteins (26860)
Ax21 (18890)
Bacteriocina (12310)
Omp W (24200)
Colicina V (02430)
Bacteriocina (12300)
Hipoteacutetica (11850)
10
RNase P (13800)
6S RNA (21550)
Cold shock proteins (26860)
Hipoteacutetica (11850)
Hipoteacutetica (11640)
Bacterio-ferritina (03640)
Omp W (24200)
Bacteriocina (12310)
Cysteine protease (01370)
Clp protease subunit ClpP
(12570)
RNase P (13800)
Colicina V (02420)
6S RNA (21550)
Hipoteacutetica (11850)
Heat shock protein Hsp20
(15830)
Cold shock proteins (26860)
Clp regulatory
subunit ClpX (12560)
Bacterio-ferritina (03640)
Peroxiredo-xina
(16820)
Bacteriocina (12310)
U24d
7
RNase P (0983)
Colicina V (0244)
Colicina V (0245)
6S RNA (1924)
Hipoteacutetica (1759)
Bacteriocina (1209)
Hipoteacutetica (1480)
Bacteriocina (1132)
Bacteriocina (1210)
Bacteriocina (1211)
RNase P (0983)
6S RNA (1924)
Colicina V (0244)
Colicina V (0245)
Bacteriocina (1209)
Hipoteacutetica (1759)
Ax21 (1709)
Bacteriocina (1210)
Bacteriocina (1132)
Hipoteacutetica (1480)
15
RNase P (0983)
6S RNA (1924)
Colicina V (0245)
Colicina V (0244)
Hipoteacutetica (1759)
Bacteriocina (1132)
Bacterio-ferritina (0360)
Omp W (0798)
Bacteriocina (1210)
Bacteriocina (1209)
RNase P (0983)
6S RNA (1924)
Colicina V (0244)
Colicina V (0245)
Hipoteacutetica (1759)
Hipoteacutetica (1480)
Bacterio-ferritina (0360)
Bacteriocina (1132)
Heat shock protein Hsp20 (2153)
Bacteriocina (1210)
Fb7 3 RNase P (112021)
Cold shock protein
(112563)
Ax21 (111062)
Bacterio-ferritina (11369)
Omp (112285)
Proteiacutena ribossomal
S13P (111907)
Cysteine protease (11142)
6S RNA (111355)
Hipoteacutetica (111798)
Proteiacutena ribossomal
S3P (111922)
RNase P Cold shock Ax21 6S RNA Omp Cysteine Hipoteacutetica Bacterio- Proteiacutena Proteiacutena
Resultados e Discussatildeo
161
(112021) protein (112563)
(111062) (111355) (112285) protease (11142)
(111798) ferritina (11369)
ribossomal S3P
(111922)
ribossomal S13P
(111907)
7
RNase P (112021)
6S RNA (111355)
Colicina V (11247)
Secretory lipase
(11333)
Lysozyme (11711)
Hipoteacutetica (111798)
Hipoteacutetica (111660)
Cold shock protein
(112563)
Secretory lipase
(11332)
Cysteine protease (11142)
RNase P (112021)
6S RNA (111355)
Cold shock protein
(112563)
Colicina V (11247)
Hipoteacutetica (111798)
Lysozyme (11711)
Clp protease subunit ClpX
(111892)
Clp protease subunit ClpP
(111893)
Proteiacutena ribossomal
L29 (111920)
Cysteine protease (11142)
Tabela 30 Lista dos dez genes mais expressos nos transcritomas das cepas 3124 Hib4 e Pr8x baseando-se em valores de FPKM Genes anotados utilizando a plataforma IMGER (httpsimgjgidoegov)
Cepa Tempo (dias)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3124
3
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
Hipoteacutetica (1481)
Ax21 (1330)
Bacteriocina (1877)
Cold shock proteins (2569)
Hipoteacutetica (1207)
Omp W (2308)
Bacteriocina (1876)
Bacterio-ferritina (0353)
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
Cold shock proteins (2569)
Ax21 (1330)
Bacteriocina (1877)
Hipoteacutetica (1481)
Hipoteacutetica (1207)
Bacteriocina (1876)
6S RNA (1036)
Bacteriocina (1802)
7
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
6S RNA (1036)
Hipoteacutetica (1207)
Bacteriocina (1877)
Bacteriocina (1802)
Hipoteacutetica (0236)
Cold shock proteins (2569)
Bacterio-ferritina (0353)
Bacteriocina (1806)
RNase P (2024)
Colicina V (0235)
Hipoteacutetica (1207)
6S RNA (1036)
Hipoteacutetica (0236)
Bacteriocina (1802)
Bacteriocina (1877)
Omp W (2308)
Colicina V (0234)
Bacteriocina (1806)
Hib4 3
RNase P (2229)
Colicina V (0235)
Ax21 (1380)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
Omp W (2410)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (1999)
Bacteriocina (1998)
Bacteriocina (2081)
RNase P (2229)
Colicina V (0235)
Ax21 (1380)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
Omp W (2410)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (1999)
Colicina V (0236)
Hipoteacutetica (0989)
Resultados e Discussatildeo
162
7
Colicina V (0235)
Colicina V (0236)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
RNase P (2229)
Acyl carrier protein (0600)
Bacteriocina (2081)
Bacteriocina (1998)
Bacteriocina (1999)
Colicina V (0235)
RNase P (2229)
Colicina V (0236)
Bacteriocina (2083)
Bacteriocina (2082)
Cold shock proteins (2676)
Bacteriocina (1997)
Ax21 (1380)
Bacteriocina (2081)
Bacteriocina (1998)
Pr8x
3
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
Hipoteacutetica (1189)
Bacteriocina (1865)
Omp W (2272)
Ax21 (1240)
Colicina V (0244)
Bacteriocina (1773)
Bacteriocina (1864)
6S RNA (1024)
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
Hipoteacutetica (1189)
Colicina V (0244)
Bacteriocina (1865)
6S RNA (1024)
Omp W (2272)
Ax21 (1240)
Bacteriocina (1773)
Cold shock proteins (2479)
10
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
6S RNA (1024)
Hipoteacutetica (1189)
Bacteriocina (1773)
Bacteriocina (1865)
Omp W (2272)
Cold shock proteins (2479)
Bacteriocina (1771)
Colicina V (0244)
RNase P (2017)
Colicina V (0243)
Colicina V (0244)
6S RNA (1024)
Hipoteacutetica (1189)
Bacteriocina (1773)
Bacteriocina (1865)
Bacteriocina (1771)
Bacteriocina (1772)
Cold shock proteins (2479)
Resultados e Discussatildeo
163
4153 Anaacutelise de rotas metaboacutelicas expressas
Assim como realizado para os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 (item
473) os valores de expressatildeo gecircnica normalizados para FPKM de todos os
transcritomas das seis cepas descritos nesta parte da tese tambeacutem foram submetidos a
anaacutelises de rotas metaboacutelicas ativas utilizando o software MinPath Os genes utilizados
nesta anaacutelise apresentaram valores de expressatildeo de FPKM maiores que 10 sendo que a
notaccedilatildeo ldquo1rdquo significa presenccedila da rota naquele transcritoma e ldquo0rdquo significa a sua
ausecircncia (Tabela S13)
A maioria das observaccedilotildees encontradas na anaacutelise das cepas da parte A tambeacutem
foi vista na anaacutelise das outras seis cepas da parte B mostrando que as principais rotas
metaboacutelicas de sobrevivecircncia e manutenccedilatildeo da vida estatildeo presentes em todas elas
(Tabela S13) Isto significa que nenhuma cepa analisada teria alguma deficiecircncia
importante no metabolismo celular que possa prejudicar o seu adequado crescimento
As rotas relacionadas agrave obtenccedilatildeo de energia metabolismo de carboidratos
manutenccedilatildeo e transmissatildeo da informaccedilatildeo geneacutetica metabolismo de purinas e
pirimidinas exportaccedilatildeo de proteiacutenas e outras rotas de transporte de moleacuteculas formaccedilatildeo
de membranas e parede celular metabolismo de vitaminas coenzimas nitrogecircnio e
enxofre biossiacutentese e metabolismo de alguns aminoaacutecidos estatildeo presentes e ativas nas
cepas analisadas
Da mesma forma rotas metaboacutelicas que foram consideradas inativas nas cepas
9a5c e Temecula1 tambeacutem natildeo foram detectadas nos transcritomas das outras seis
cepas Dentre elas o metabolismo de inositol galactose accediluacutecares presentes em
nucleotiacutedeos aleacutem das rotas de metabolismo e degradaccedilatildeo dos aminoaacutecidos glutamato
cisteiacutena tirosina valina leucina isoleucina e lisina
Entretanto algumas particularidades puderam ser observadas A rota para o
metabolismo de triptofano foi vista inativa em quase todos os transcritomas com
exceccedilatildeo de uma reacuteplica de U24d_15d e uma reacuteplica de 3124_7d Nestes mesmos
transcritomas a rota para o metabolismo de metano foi observada inativa enquanto que
foi vista ativa nos outros transcritomas Esta mesma relaccedilatildeo tambeacutem pode ser observada
em alguns transcritomas da cepa 9a5c descrita na parte A No transcritoma de uma das
reacuteplicas de U24d_7d a rota de metabolismo de enxofre mostrou-se inativa
As rotas metaboacutelicas observadas nos transcritomas da cepa Fb7 foram as que
Resultados e Discussatildeo
164
apresentaram um maior nuacutemero de diferenccedilas em relaccedilatildeo aos outros transcritomas A
rota de degradaccedilatildeo de N-glicano mostrou-se inativa em Fb7 e ativa nas outras cepas
Entretanto a rota de degradaccedilatildeo de estruturas de glicanos mostrou-se ativa em Fb7 e
inativa nos outros transcritomas Apesar de serem capazes de degradar estruturas de
glicanos os genes para a rota de sua biossiacutentese aparentemente estatildeo ausentes nesta
cepa Aleacutem disso as rotas para biossiacutentese de zeatina e de alcaloacuteides tambeacutem estariam
ausentes nesta cepa A rota relacionada ao sistema de secreccedilatildeo do tipo IV natildeo foi
encontrada em Fb7 e Pr8x Estas mesmas duas cepas tambeacutem diferiram das outras ao
apresentarem a rota de resistecircncia a beta-lactacircmicos ativa
Em resumo a anaacutelise de rotas metaboacutelicas das oito cepas de X fastidiosa
mostrou um perfil metaboacutelico geral para este fitopatoacutegeno no qual as rotas essenciais
para a sua sobrevivecircncia nos seus nichos bioloacutegicos estatildeo ldquoativasrdquo Foi observada alta
concordacircncia entre as cepas e algumas poucas diferenccedilas observadas que natildeo gerariam
vantagens ou desvantagens significativas agrave determinada cepa Vale lembrar que este tipo
de anaacutelise leva em consideraccedilatildeo somente se a rota estaacute ativa e natildeo diz respeito agrave
intensidade da expressatildeo gecircnica a qual seraacute analisada e comparada a seguir
416 Anaacutelises de expressatildeo gecircnica diferencial
A intensidade da expressatildeo gecircnica foi comparada entre os transcritomas
analisados utilizando o mesmo pacote DESeq2 (Love et al 2014) sendo que os dados
de entrada foram os valores de contagem brutos de quantas sequecircncias mapearam em
cada gene
Uma vez que para as seis cepas foram sequenciados transcritomas em um uacutenico
meio de cultivo (PWG) foram realizados apenas dois niacuteveis de comparaccedilatildeo A
nomenclatura dos niacuteveis definida na parte A (item 481) foi mantida 1) comparaccedilotildees
entre transcritomas da mesma cepa mas em fases de crescimento diferentes como por
exemplo entre os transcritomas da cepa J1a12 no iniacutecio e no final da fase exponencial
3) comparaccedilotildees entre transcritomas de cepas diferentes poreacutem na mesma fase de
crescimento como por exemplo entre o transcritoma de J1a12 e o transcritoma de Fb7
ambos do iniacutecio da fase exponencial No niacutevel 3 foram incluiacutedas as comparaccedilotildees entre
os transcritomas da cepa 9a5c e Temecula1 com os das outras seis cepas
Resultados e Discussatildeo
165
Assim como nas anaacutelises discutidas na parte A os paracircmetros utilizados para
considerar um gene como significativamente diferencialmente expresso foram um valor
de p ajustado pela correccedilatildeo FDR (False Discovery Rate) (Benjamini e Hochberg
1995) menor do que 005 e um valor de razatildeo de expressatildeo (fold change) maior que 2
A Tabela 31 apresenta o nuacutemero de genes diferencialmente expressos dentro desses
paracircmetros em cada comparaccedilatildeo Os graacuteficos de dispersatildeo baseados nos valores de
expressatildeo meacutedia dos genes entre as condiccedilotildees analisadas foram gerados mas devido ao
alto nuacutemero de comparaccedilotildees realizadas seraacute mostrado um exemplo deste graacutefico para
cada niacutevel (Figura 15)
Tabela 31 Resumo do nuacutemero de genes diferencialmente expressos (plt005 fold changegt2) em todas as comparaccedilotildees
Niacuteveis Total de
genes Condiccedilatildeo 1
(c1) Condiccedilatildeo 2
(c2)
Genes DE (plt005 FCgt20)
Genes up-regulated (c1c2)
Genes DE em
comum
1
2841 J1a12_PWG_5d J1a12_PWG_10d 2 (007) 20 -
2679 U24d_PWG_7d U24d_PWG_15d 1 (004) 10 -
2714 Fb7_PWG_3d Fb7_PWG_7d 14 (05) 104 -
2729 3124_PWG_3d 3124_PWG_7d 11 (04) 101 -
2822 Hib4_PWG_3d Hib4_PWG_7d 3 (011) 30 -
2660 Pr8x_PWG_3d Pr8x_PWG_10d 0 0 -
3
2316 9a5c_PWG_3d J1a12_PWG_5d 63 (27) 4419 55
2316 9a5c_PWG_10d J1a12_PWG_10d 85 (37) 5530
2536 9a5c_PWG_3d U24d_PWG_7d 4 (02) 13 0
2536 9a5c_PWG_10d U24d_PWG_15d 5 (02) 05
2192 9a5c_PWG_3d Fb7_PWG_3d 108 (49) 6345 69
2192 9a5c_PWG_10d Fb7_PWG_7d 100 (46) 4654
2284 9a5c_PWG_3d 3124_PWG_3d 42 (18) 3210 37
2284 9a5c_PWG_10d 3124_PWG_7d 53 (23) 3518
2206 9a5c_PWG_3d Hib4_PWG_3d 120 (54) 8337 105
2206 9a5c_PWG_10d Hib4_PWG_7d 145 (66) 9352
2268 9a5c_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 50 (22) 2822 39
2268 9a5c_PWG_10d Pr8x_PWG_10d 63 (28) 2934
2265 U24d_PWG_7d 3124_PWG_3d 76 (34) 4828 44
2265 U24d_PWG_15d 3124_PWG_7d 69 (30) 3732
2198 U24d_PWG_7d Fb7_PWG_3d 183 (83) 79104 117
2198 U24d_PWG_15d Fb7_PWG_7d 167 (76) 66101
2321 U24d_PWG_7d J1a12_PWG_5d 94 (40) 5539 83
2321 U24d_PWG_15d J1a12_PWG_10d 147 (63) 7572
2206 U24d_PWG_7d Hib4_PWG_3d 126 (57) 9234 118
2206 U24d_PWG_15d Hib4_PWG_7d 263 (119) 137126
Resultados e Discussatildeo
166
2262 U24d_PWG_7d Pr8x_PWG_3d 42 (19) 2517 38
2262 U24d_PWG_15d Pr8x_PWG_10d 98 (43) 4058
1874 U24d_PWG_7d Tem_PWG_3d 129 (69) 7950 54
1874 U24d_PWG_15d Tem_PWG_7d 87 (46) 3552
2274 J1a12_PWG_5d 3124_PWG_3d 119 (52) 7544 86
2274 J1a12_PWG_10d 3124_PWG_7d 104 (46) 6539
2186 J1a12_PWG_5d Fb7_PWG_3d 139 (64) 7366 69
2186 J1a12_PWG_10d Fb7_PWG_7d 84 (38) 2757
2199 J1a12_PWG_5d Hib4_PWG_3d 179 (81) 10475 153
2199 J1a12_PWG_10d Hib4_PWG_7d 209 (95) 11891
2249 J1a12_PWG_5d Pr8x_PWG_3d 95 (42) 4847 80
2249 J1a12_PWG_10d Pr8x_PWG_10d 106 (47) 5551
1856 J1a12_PWG_5d Tem_PWG_3d 120 (65) 7050 53
1856 J1a12_PWG_10d Tem_PWG_7d 60 (32) 2535
2163 Fb7_PWG_3d 3124_PWG_3d 163 (75) 9172 95
2163 Fb7_PWG_7d 3124_PWG_7d 114 (53) 7143
2117 Fb7_PWG_3d Hib4_PWG_3d 225 (106) 15372 162
2117 Fb7_PWG_7d Hib4_PWG_7d 216 (102) 15462
2178 Fb7_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 160 (73) 9466 108
2178 Fb7_PWG_7d Pr8x_PWG_10d 142 (65) 7963
2192 3124_PWG_3d Hib4_PWG_3d 148 (68) 8662 129
2192 3124_PWG_7d Hib4_PWG_7d 185 (84) 10778
2244 3124_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 63 (28) 2241 42
2244 3124_PWG_7d Pr8x_PWG_10d 48 (21) 1830
1879 3124_PWG_3d Tem_PWG_3d 118 (63) 5662 50
1879 3124_PWG_7d Tem_PWG_7d 58 (31) 1642
2229 Hib4_PWG_3d Pr8x_PWG_3d 134 (60) 4490 131
2229 Hib4_PWG_7d Pr8x_PWG_10d 221 (99) 68153
1887 Hib4_PWG_3d Tem_PWG_3d 145 (77) 5689 102
1887 Hib4_PWG_7d Tem_PWG_7d 132 (70) 3597
1872 Pr8x_PWG_3d Tem_PWG_3d 95 (51) 6233 47
1872 Pr8x_PWG_10d Tem_PWG_7d 60 (32) 2832
1799 Tem_PWG_3d Fb7_PWG_3d 206 (115) 91115 53
1799 Tem_PWG_7d Fb7_PWG_7d 58 (32) 1840
DE diferencialmente expressos Tem Temecula1
Resultados e Discussatildeo
167
Figura 15 Graacuteficos de dispersatildeo dos genes analisados em uma comparaccedilatildeo de cada niacutevel No eixo das abscissas estatildeo os valores de expressatildeo meacutedia no eixo das ordenadas estatildeo os valores de razatildeo de expressatildeo em log2 Os pontos em vermelho representam genes com valores de p ajustado menores do que 005 os pontos em cinza representam genes com valores de p ajustado maiores que 005 Cada graacutefico representa uma comparaccedilatildeo (A) Fb7-PWG-3d e Fb7-PWG-7d (B) 9a5c-PWG-3d e J1a12-PWG-5d
No primeiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre transcritomas da mesma cepa e em
tempos de crescimento diferentes foi possiacutevel observar poucos genes considerados
diferencialmente expressos com os paracircmetros utilizados A maior quantidade de genes
observada foi na comparaccedilatildeo entre os transcritomas da cepa Fb7 com 14 genes sendo
10 positivamente regulados no iniacutecio do crescimento exponencial O mesmo padratildeo se
manteve nas comparaccedilotildees das outras cepas com a maioria dos genes modulados
positivamente na fase inicial Tais resultados satildeo corroborados com as comparaccedilotildees
entre os transcritomas de 9a5c e Temecula1 em meio PWG evidenciando que neste
meio rico em nutrientes o ambiente de cultivo estaacute favoraacutevel agrave manutenccedilatildeo do
crescimento por um periacuteodo prolongado e que no intervalo de tempo das amostras
analisadas poucas mudanccedilas na expressatildeo gecircnica foram necessaacuterias
Dentre os genes positivamente regulados no iniacutecio do crescimento em Fb7
podemos encontrar genes codificando proteiacutenas ribossomais proteiacutenas relacionadas a
transporte uma proteiacutena para a biossiacutentese do pilus longo (relacionado agrave motilidade da
bacteacuteria) e o gene codificando para Ax21 Interessantemente dois ncRNAs foram
encontrados mais expressos no final do crescimento a RNaseP e o 6S Dos 11 genes
diferencialmente expressos na cepa 3124 10 mostraram-se mais expressos no iniacutecio do
crescimento genes da DNA polimerase III da RNA polimerase proteiacutenas ribossomais
e de um transportador Jaacute na cepa J1a12 genes de uma GTPase putativa e de uma
Resultados e Discussatildeo
168
proteiacutena com funccedilatildeo hipoteacutetica foram mais expressos no iniacutecio do crescimento A cepa
U24d apresentou apenas um gene codificando para uma proteiacutena hipoteacutetica sendo mais
expresso no iniacutecio do crescimento Um gene de uma proteiacutena de membrana OmpW um
gene relacionado agrave biossiacutentese do pilus longo e um com funccedilatildeo hipoteacutetica foram
encontrados positivamente regulados na cepa Hib4 A cepa Pr8x natildeo mostrou nenhum
gene diferencialmente expresso dentro dos paracircmetros utilizados
No terceiro niacutevel de comparaccedilatildeo entre transcritomas de cepas diferentes foi
observado um alto nuacutemero de genes diferencialmente expressos em todas as 54
comparaccedilotildees Assim como nas comparaccedilotildees entre as cepas da parte A foram
considerados somente genes ortoacutelogos entre o par de cepas analisado Examinando um
mesmo par de cepas comparadas observa-se um maior nuacutemero de genes
diferencialmente expressos nas comparaccedilotildees entre transcritomas de iniacutecio do
crescimento mais especificamente em 15 pares (total de 27) No que diz respeito agraves
comparaccedilotildees com a cepa 9a5c quase em todos os casos foi observada uma maior
quantidade de genes diferencialmente expressos no final do crescimento (incluindo a
comparaccedilatildeo com a cepa Temecula1) com exceccedilatildeo da comparaccedilatildeo com a cepa Fb7 No
caso de Fb7 em todas as comparaccedilotildees maior nuacutemero de genes diferencialmente
expressos foi sempre observado nas comparaccedilotildees entre transcritomas no iniacutecio do
crescimento Nas outras cepas natildeo foram observados padrotildees variando entre as
comparaccedilotildees com cada cepa Aleacutem disso um grande nuacutemero de genes foi
diferencialmente expresso desde o iniacutecio ateacute o final da fase exponencial em todas as
comparaccedilotildees entre pares de cepas (Tabela 31) Assim como jaacute mencionado o meio rico
PWG parece ser um ambiente relativamente estaacutevel e que exige poucas mudanccedilas na
expressatildeo gecircnica durante o crescimento populacional bacteriano Devido ao alto nuacutemero
de comparaccedilotildees e de genes diferencialmente expressos somente os genes relacionados agrave
virulecircncia seratildeo discutidos mais detalhadamente na seccedilatildeo seguinte
Em resumo foi observado um alto nuacutemero de genes diferencialmente expressos
nas comparaccedilotildees entre transcritomas de cepas distintas aleacutem de altos valores de razatildeo
de expressatildeo (fold change) assim como observado na parte A Isto sugere que as
maiores diferenccedilas entre as cepas natildeo estatildeo necessariamente no seu genoma mas na
regulaccedilatildeo da expressatildeo do conteuacutedo gecircnico em resposta a determinado ambiente ou
estiacutemulo
Resultados e Discussatildeo
169
4161 Anaacutelise de genes relacionados agrave virulecircncia e patogenicidade
A Tabela S14 conteacutem todos os genes diferencialmente expressos nas
comparaccedilotildees entre os transcritomas de todas as cepas analisadas que jaacute foram
relacionados aos sistemas de virulecircncia descritos em X fastidiosa (Simpson et al 2000
Van Sluys et al 2003 Chatterjee et al 2008)
Dentre as comparaccedilotildees do niacutevel 1 somente as cepas Fb7 e Hib4 apresentaram
genes relacionados agrave virulecircncia dentre os que foram definidos como diferencialmente
expressos Em ambos os casos um gene relacionado agrave biogecircnese do pilus longo
(XF2539 e XF2542 para Fb7 e Hib4 respectivamente) foi mais expresso no iniacutecio do
crescimento (Tabela S14)
Nas anaacutelises de niacutevel 3 diversos genes de virulecircncia foram encontrados entre
todos os pares de cepas com exceccedilatildeo da comparaccedilatildeo entre os transcritomas de iniacutecio do
crescimento das cepas 9a5c e U24d (Tabela S14)
Para melhor visualizaccedilatildeo dos resultados graacuteficos do tipo Radar Chart ou Spider
Chart foram confeccionados de duas formas diferentes A primeira tem como veacutertices
as oito cepas que tiveram seus transcritomas analisados (Figura 16) Cada um dos charts
representa um sistema de virulecircncia sendo que as linhas verdes e vermelhas dizem
respeito agraves comparaccedilotildees de transcritomas no iniacutecio e final do crescimento
respectivamente Como todas as cepas foram comparadas entre si um niacutevel aumentado
no graacutefico significa que determinada cepa apresentou maior expressatildeo daquele sistema
do que outra com a qual foi comparada Por exemplo se encontramos um niacutevel 4 no
chart aquela cepa teve um maior nuacutemero de genes positivamente regulados a seu favor
do que outras 4 cepas com as quais foi comparada (miacutenimo 0 e maacuteximo 7) Este tipo de
anaacutelise fornece um panorama de expressatildeo destes sistemas e que natildeo leva em
consideraccedilatildeo os genes individualmente e nem seus valores de razatildeo de expressatildeo Tais
informaccedilotildees estatildeo detalhadas na Tabela S14
Resultados e Discussatildeo
170
Figura 16 Graacuteficos do tipo radar chart com os resultados das comparaccedilotildees entre as cepas em relaccedilatildeo aos sistemas de virulecircncia analisados As linhas verdes representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no iniacutecio do crescimento exponencial enquanto que as linhas vermelhas representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no final do crescimento exponencial Cada graacutefico representa um sistema de virulecircncia como segue (A) Enzimas degradadoras de parede (CWDE) (B) Biogecircnese do pilus longo (C) Biogecircnese do pilus curto (D) Goma fastidiana (E) Lipopolissacariacutedeos (F) Funccedilotildees regulatoacuterias (G) Adesinas autotransportadoras (H) Hemolisinas (I) Lipases (J) Proteases A cada niacutevel aumentado no graacutefico significa que aquela cepa apresentou maior expressatildeo daquele sistema do que em comparaccedilatildeo com outra cepa
Resultados e Discussatildeo
171
Neste primeiro grupo de Radar charts foi observada uma maior expressatildeo de
enzimas degradadoras de parede (CWDE) nas cepas U24d e Pr8x nas comparaccedilotildees do
iniacutecio do crescimento enquanto isso J1a12 e Fb7 apresentam maior expressatildeo nas
comparaccedilotildees da fase final (Figura 16A) As cepas restantes natildeo apresentaram diferenccedilas
significativas quando comparadas com as outras
No que diz respeito aos genes relacionados com a biogecircnese do pilus longo as
cepas 3124 e Temecula1 apresentaram maior expressatildeo desse sistema do que outras
quatro cepas nas comparaccedilotildees no iniacutecio da fase exponencial (Figura 16B) Foram
seguidas pelas cepas 9a5c e Pr8x com 3 niacuteveis neste chart de genes para o pilus longo
Entretanto nas comparaccedilotildees de final do crescimento a cepa Pr8x apresentou maiores
niacuteveis mostrando maior expressatildeo destes genes do que outras quatro cepas A cepa
U24d se juntou com a 9a5c na segunda colocaccedilatildeo de expressatildeo destes genes atingindo
o niacutevel 3 Tais cepas com maior expressatildeo de genes do pilus longo seriam
hipoteacuteticamente mais moacuteveis do que as outras dentro das condiccedilotildees de crescimento
analisadas Entretanto sabe-se que a cepa U24d apresenta uma mutaccedilatildeo no gene pilQ
(proteiacutena formadora de poro pra externalizar o pilus) a qual impede a correta traduccedilatildeo
desta proteiacutena (Santana 2012) Dessa forma mesmo que haja a produccedilatildeo de transcritos
de genes relacionados com a biogecircnese do pilus longo este natildeo poderia ser
externalizado e portanto natildeo exerceria sua funccedilatildeo
Enquanto isso os genes para a biogecircnese do pilus curto mostraram maior
expressatildeo nas cepas Hib4 e Temecula1 nas comparaccedilotildees entre transcritomas do iniacutecio
do crescimento com 4 niacuteveis cada no chart (Figura 16C) Poreacutem no final da fase
exponencial a cepa U24d apresentou maior expressatildeo destes genes do que outras quatro
cepas sendo que a cepa Hib4 caiu para 3 niacuteveis Nota-se que a cepa Fb7 natildeo apresentou
nenhum niacutevel para este sistema de pilus curto o qual estaacute relacionado agrave adesatildeo ceacutelula-
ceacutelula e ceacutelula-substrato o que corrobora com seu fenoacutetipo sem formaccedilatildeo de agregados
de ceacutelulas planctocircnicas e a ausecircncia de ceacutelulas aderidas no frasco de cultivo
A seguir foram analisados os genes relacionados com a formaccedilatildeo de goma
fastidiana um produto celular essencial para a formaccedilatildeo do biofilme bacteriano A cepa
que apresentou maior atividade destes genes foi a Fb7 com 5 e 6 niacuteveis nas
comparaccedilotildees de iniacutecio e final da fase exponencial respectivamente (Figura 16D) Estes
dados estatildeo de acordo com a alta viscosidade de suas colocircnias em placas de cultivo
contrastando com o aspecto seco e aacutespero de outras cepas de X fastidiosa Aleacutem disso
nota-se claramente a turbidez no meio liacutequido ao cultivar Fb7 A segunda colocaccedilatildeo
Resultados e Discussatildeo
172
ficou com a cepa J1a12 a qual tambeacutem apresenta certa viscosidade em suas colocircnias
embora natildeo seja como a cepa Fb7 (Figura 16D)
Outro fator de virulecircncia analisado foi a produccedilatildeo de lipopolissacariacutedeos (LPS)
LPSs satildeo componentes da membrana externa atuando como proteccedilatildeo da ceacutelula contra
substacircncias toacutexicas e como modulador da resposta de defesa do hospedeiro (Newman et
al 2001) Genes para a produccedilatildeo de LPS foram vistos mais expressos nas cepas 9a5c e
Fb7 com 4 niacuteveis cada nas comparaccedilotildees entre transcritomas da fase inicial do
crescimento exponencial (Figura 16E) Interessantemente as outras duas cepas que
tambeacutem mostraram uma expressatildeo aumentada destes genes foram U24d e J1a12
tambeacutem cepas isoladas de citros Jaacute nas comparaccedilotildees de transcritomas de final do
crescimento exponencial Pr8x e Temecula1 apresentaram niacuteveis no chart embora
U24d se mantenha como a cepa com niacutevel mais alto (Figura 16E)
Uma extensa e diversa categoria de genes importantes para a virulecircncia eacute a
daqueles relacionados a funccedilotildees regulatoacuterias como reguladores transcricionais e fatores
sigma Nesta categoria a cepa J1a12 se destacou nas comparaccedilotildees com as outras cepas
atingindo os niacuteveis 7 e 6 nas comparaccedilotildees de iniacutecio e final da fase exponencial
respectivamente As outras cepas tambeacutem mostraram expressotildees aumentadas em
algumas comparaccedilotildees atingindo ateacute o niacutevel 4 (Fb7 nas comparaccedilotildees de iniacutecio do
crescimento exponencial) (Figura 16F)
Aleacutem das adesinas localizadas nas extremidades dos pili longo e curto X
fastidiosa ainda apresenta outros genes codificando para proteiacutenas adesinas afimbriais
como hemaglutininas e adesinas da famiacutelia dos autotransportadores trimeacutericos (Xad)
(Simpson et al 2000 Caserta et al 2010) Satildeo trecircs genes codificando para Xads
presentes no genoma de Xylella e eles mostraram-se mais expressos na cepa Fb7
atingindo trecircs niacuteveis tanto nas comparaccedilotildees de fase inicial como nas de fase final
(Figura 16G) A uacutenica outra cepa que mostrou expressatildeo aumentada de genes para Xads
foi a cepa U24d nas comparaccedilotildees de iniacutecio do crescimento
Assim como pudemos observar altos valores de expressatildeo de bacteriocinas e
colicinas em todos os transcritomas analisados as hemolisinas tambeacutem constituem um
importante grupo de toxinas atuando como fatores de virulecircncia amplamente
distribuiacutedos entre bacteacuterias patogecircnicas Gram-negativas (Simpson et al 2000
Linhartova et al 2010) Genes de hemolisinas mostraram-se mais expressos na cepa
Fb7 alcanccedilando o niacutevel 4 tanto nas comparaccedilotildees de fase inicial como final (Figura
Resultados e Discussatildeo
173
16H) A cepa 3124 tambeacutem apresentou expressatildeo aumentada nas comparaccedilotildees entre
transcritomas de fase inicial e final
Outros dois grupos de enzimas que satildeo considerados importantes fatores de
virulecircncias em X fastidiosa satildeo as lipases e proteases Uma das lipases de X fastidiosa
jaacute foi descrita como importante fator de virulecircncia para este fitopatoacutegeno (Nascimento
et al 2016) Neste estudo foi gerado um mutante para a lipase LesA (PD1703 e
XF0357) o qual apresentou virulecircncia reduzida ao ser inoculado em videiras quando
comparado com a cepa selvagem Aleacutem disso foi descrito que esta proteiacutena seria
secretada associada a vesiacuteculas de membrana externa e consequentemente poderia
causar seu efeito toacutexico em partes da planta distantes de sua ceacutelula de origem Dessa
forma lipases estariam associadas diretamente com a patogenicidade de X fastidiosa
(Nascimento et al 2016) Nas anaacutelises dos transcritomas foram detectados genes de
lipases abundantemente expressos na cepa Fb7 atingindo os niacuteveis maacuteximos nos charts
das duas comparaccedilotildees (Figura 16I) Aleacutem de vaacuterios genes para lipases estarem
positivamente regulados nesta cepa ainda foram observados altos valores de razatildeo de
expressatildeo (Tabela S14) Outra cepa com alta expressatildeo de lipases foi a J1a12 atingindo
os niacuteveis 5 e 6 nas comparaccedilotildees de fase inicial e final respectivamente Em relaccedilatildeo agraves
cepas restantes Temecula1 tambeacutem se destacou atingindo niacutevel 3 nas duas comparaccedilotildees
(Figura 16I)
As proteases tambeacutem constituem um importante grupo de enzimas relacionadas
agrave virulecircncia bacteriana Elas podem agir diretamente na integridade do tecido do
hospedeiro atuando na inativaccedilatildeo de proteiacutenas de defesa aleacutem de lidar com o turnover
de proteiacutenas bacterianas que tenham sido geradas em resposta agraves condiccedilotildees adversas
encontradas no hospedeiro (Lantz 1997 Ingmer e Brondsted 2009) Em relaccedilatildeo aos
genes codificando proteases em X fastidiosa (Chen et al 2008 Leite et al 2013
Zhang et al 2015 Gouran et al 2016) foi observada sua alta expressatildeo na cepa J1a12
nas comparaccedilotildees de iniacutecio da fase exponencial seguido por Fb7 e U24d (Figura 16J)
Entretanto nas comparaccedilotildees de fase final do crescimento a cepa Fb7 se destaca
atingindo o niacutevel 6 seguido de J1a12 e 9a5c (Figura 16J)
O segundo grupo de Radar Charts apresentou como veacutertices dez categorias de
genes de virulecircncia (Figura 17) Neste caso cada um dos charts representa uma cepa
que teve seus transcritomas analisados Novamente as linhas verdes dizem respeito agraves
comparaccedilotildees de transcritomas no iniacutecio do crescimento e as vermelhas no seu final
Dessa forma seraacute possiacutevel analisar qualquer mudanccedila significativa de expressatildeo de
Resultados e Discussatildeo
174
algum sistema entre as fases do crescimento O esquema de niacuteveis no chart eacute o mesmo
utilizado no primeiro grupo
A cepa 9a5c apresentou um aumento na expressatildeo de genes relacionados a
proteases na fase final do crescimento enquanto que pode ser observada uma
diminuiccedilatildeo nas categorias de LPS e genes regulatoacuterios (Figura 17A) Jaacute na cepa U24d
niacuteveis para biogecircnese dos pili longo e curto e para a produccedilatildeo de LPS foram
aumentados no final do crescimento com diminuiccedilatildeo dos niacuteveis das categorias de
CWDEs Xads hemolisinas lipases e proteases (Figura 17B) A cepa J1a12 apresentou
mudanccedilas de niacuteveis com o aumento de CWDEs goma fastidiana LPS e lipases aleacutem de
diminuiccedilotildees de niacuteveis nas categorias de biogecircnese do pilus longo e proteases (Figura
17C) A cepa Fb7 mostrou um aumento de genes relacionados agraves CWDEs goma
fastidiana e proteases na fase final do crescimento Entretanto foram observadas quedas
em niacuteveis das categorias relacionadas agrave produccedilatildeo de LPS e funccedilotildees regulatoacuterias (Figura
17D) Na cepa 3124 mudanccedilas foram vistas no aumento dos niacuteveis de expressatildeo de
hemolisinas e lipases embora tenham sido observadas diminuiccedilotildees nas categorias de
biogecircnese do pilus longo goma fastidiana funccedilotildees regulatoacuterias e proteases (Figuras
17E) A cepa Hib4 foi a que apresentou menos alteraccedilotildees entre as duas fases do
crescimento exponencial mostrando somente a queda de um niacutevel na categoria de
biogecircnese do pilus curto (Figura 17F) Jaacute a cepa Pr8x mostrou um aumento da
expressatildeo de CWDEs biogecircnese do pilus longo e LPS com queda nos niacuteveis de
hemolisinas (Figura 17G) Temecula1 mostrou um aumento de genes relacionados a
funccedilotildees regulatoacuterias e proteases na fase final do crescimento embora tenha sido vista
uma diminuiccedilatildeo nos niacuteveis de genes para biogecircnese dos pili longo e curto (Figura 17H)
Resultados e Discussatildeo
175
Figura 17 Graacuteficos do tipo radar chart com os resultados das comparaccedilotildees entre as cepas em relaccedilatildeo aos sistemas de virulecircncia analisados As linhas verdes representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no iniacutecio do crescimento enquanto que as linhas vermelhas representam as comparaccedilotildees entre transcritomas no final do crescimento Cada graacutefico representa uma cepa como segue (A) 9a5c (B) U24d (C) J1a12 (D) Fb7 (E) 3124 (F) Hib4 (G) Pr8x (H) Temecula1 A cada niacutevel aumentado no graacutefico significa que aquela cepa apresentou maior expressatildeo daquele sistema do que em comparaccedilatildeo com outra cepa
Consideraccedilotildees finais
176
5 Consideraccedilotildees finais
O sequenciamento de transcritomas de diferentes cepas de Xylella fastidiosa no iniacutecio
e no final da fase exponencial de crescimento no meio rico PWG e no meio miacutenimo PIM6
possibilitou uma descriccedilatildeo abrangente do repertoacuterio de genes que eacute expresso nas diferentes
cepas e condiccedilotildees de cultivo A tecnologia de RNA-Seq mostrou-se altamente reprodutiacutevel e
robusta fornecendo enorme quantidade de dados de oacutetima qualidade e sem precedentes para
X fastidiosa Aleacutem da definiccedilatildeo de perfis transcricionais e anaacutelises de expressatildeo diferencial
entre transcritomas foi possiacutevel utilizar os dados gerados para definir as coordenadas
genocircmicas exatas para os transcritos descrevendo suas regiotildees 5rsquo e 3rsquo natildeo-traduzidas Aleacutem
disso as estruturas de operons expressos nas condiccedilotildees investigadas tambeacutem foram definidas
para as cepas 9a5c e Temecula1 Pela primeira vez foi descrito o perfil de sRNAs expressos
por X fastidiosa (cepa 9a5c)
Os transcritomas mostraram que a maior parte dos genes eacute transcrita em todas as
cepas mesmo que seus transcritos sejam pouco abundantes Em todos os transcritomas foram
observados ncRNAs muito abundantes como os da RNase P e do 6S Outra observaccedilatildeo
interessante foi a elevada expressatildeo de genes de bacteriocinas (colicinas microcinas
hemolisinas) sugerindo que mesmo em um cultivo in vitro sem a presenccedila de espeacutecies
competidoras a X fastidiosa expressa seu arsenal de toxinas As principais vias metaboacutelicas
de manutenccedilatildeo da sobrevivecircncia da ceacutelula foram encontradas ativas em todas as cepas e
transcritomas
Os transcritomas das cepas 9a5c e Temecula1 na condiccedilatildeo de crescimento em PIM6
um meio que mimetiza a composiccedilatildeo da seiva do xilema revelou um conjunto de genes que
tem relaccedilatildeo com a carecircncia de nutrientes que a bacteacuteria enfrenta no xilema O crescimento da
populaccedilatildeo microbiana em PIM6 foi gravemente afetado pela escassez nutricional antecipando
a fase estacionaacuteria e com menor concentraccedilatildeo celular Ainda assim nesta condiccedilatildeo foi
observada a expressatildeo de genes que parecem relevantes para manutenccedilatildeo da sobrevivecircncia no
inoacutespito ambiente do hospedeiro vegetal eou do inseto vetor
As anaacutelises de expressatildeo diferencial entre os transcritomas das duas fases de
crescimento em um mesmo meio evidenciaram que o estresse gerado pela limitaccedilatildeo
nutricional do meio PIM6 exigiu mudanccedilas mais draacutesticas na expressatildeo gecircnica devido ao
maior nuacutemero de genes diferencialmente expressos observados Aleacutem disso o contato inicial
com este meio estimulou uma maior ativaccedilatildeo da transcriccedilatildeo As comparaccedilotildees entre os
transcritomas em meio PWG natildeo mostraram muitas mudanccedilas na expressatildeo de seus genes
Consideraccedilotildees finais
177
sugerindo que o meio rico em nutrientes apresentou condiccedilotildees adequadas para o crescimento
desde o iniacutecio do cultivo as quais natildeo sofreram muitas alteraccedilotildees ateacute o final da fase
exponencial Quando comparamos transcritomas de diferentes meios foram observadas
maiores diferenccedilas na fase final exponencial mostrando que o contato inicial com ambos os
meios ativa basicamente os mesmos genes e na mesma intensidade com divergecircncias sendo
observadas apoacutes o cultivo prolongado
As comparaccedilotildees entre os transcritomas de diferentes cepas mostraram que genes
ortoacutelogos respondem de maneiras distintas a uma mesma condiccedilatildeo evidenciando que
aparentemente satildeo regulados de formas diferentes
A comparaccedilatildeo da expressatildeo de genes de fatores de virulecircncia das cepas de X
fastidiosa revelou diferenccedilas significativas interessantes Natildeo foi observada uma
homogeneidade na resposta para estes sistemas sendo que cada sistema de virulecircncia
analisado se mostrou mais ativo em determinadas cepas Em alguns casos foi possiacutevel
correlacionar estas particularidades aos fenoacutetipos in vitro e virulecircncia in planta
As anaacutelises dos transcritomas evidenciaram vaacuterios genes candidatos que poderatildeo ser
futuramente investigados em maior detalhe quanto ao seu papel na biologia e na virulecircncia de
X fastidiosa Aleacutem disso a transcritocircmica comparativa expocircs diferenccedilas relevantes na
regulaccedilatildeo gecircnica de cepas de hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas agrave
especificidade ao hospedeiro
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Apecircndices
Tabela S1 Lista de regiotildees natildeo-traduzidas (UTRs) obtidas a partir do mapeamento de sequecircncias dos transcritomas da cepa 9a5c e suas respectivas coordenadas O mapeamento foi realizado com o software Rockhopper2
Coacutedigo Fita 5 UTR Iniacutecio de transcriccedilatildeo Iniacutecio de traduccedilatildeo Final de traduccedilatildeo Final de transcriccedilatildeo 3 UTR
XF0001 + 88 55 143 1462 1592 130
XF0002 + - 1759 1759 2859 2888 29
XF0003 + 34 3127 3161 4255 4255 -
XF0004 + 30 4470 4500 4766 - -
XF0006 + 834 7208 8042 8962 8969 7
XF0008 + 39 10260 10299 10394 10394 -
XF0009 + 308 10395 10703 11368 11405 37
XF0010 + - 11464 11464 12228 12256 28
XF0011 + 6 12279 12285 12707 12707 -
XF0012 + 3 12708 12711 13121 13122 1
XF0016 + - 16281 16281 16823 16897 74
XF0021 + 24 19371 19395 19691 19691 -
XF0024 + 100 20554 20654 20815 20981 166
XF0025 + - 20982 20982 21236 21947 711
XF0026 - 20 22846 22826 21732 21295 437
XF0028 + 7 23992 23999 24562 24562 -
XF0029 + 9 24563 24572 25048 - -
XF0032 + 5 26598 26603 30295 30297 2
XF0033 + - 30298 30298 30717 31018 301
XF0034 - 314 32207 31893 31159 30126 1033
XF0035 + 1 32676 32677 32811 32828 17
XF0036 + 6 33012 33018 34220 34220 -
201
XF0037 + 28 34221 34249 34434 34511 77
XF0038 - 38 34948 34910 34755 34753 2
XF0039 - 111 35610 35499 35095 35041 54
XF0040 - 501 36677 36176 35823 35753 70
XF0041 + 68 36131 36199 36459 36470 11
XF0042 + - 36474 36474 37736 37835 99
XF0044 + 506 38892 39398 39937 39996 59
XF0046 + 1 43590 43591 43686 43702 16
XF0047 + 338 43871 44209 44655 44655 -
XF0048 + 24 44694 44718 45203 45203 -
XF0049 + 57 45204 45261 46628 46889 261
XF0050 - 286 49277 48991 46805 46311 494
XF0052 - 112 50523 50411 50226 50186 40
XF0053 + 187 50364 50551 51744 52189 445
XF0054 - 69 52195 52126 51758 51693 65
XF0055 + 12 52200 52212 52319 52429 110
XF0056 + 23 52430 52453 52626 52626 -
XF0057 + 6 52704 52710 52820 52834 14
XF0061 - - - 56257 55178 54869 309
XF0064 + 320 57783 58103 59128 59128 -
XF0065 + 52 59130 59182 59283 59317 34
XF0066 + 54 59333 59387 60574 60710 136
XF0067 + 88 60951 61039 61278 61545 267
XF0068 - - 62396 62396 61395 58524 2871
XF0071 + 14 71794 71808 72623 72960 337
XF0072 - 843 74446 73603 72755 72537 218
XF0073 + 73 73682 73755 75059 75333 274
202
XF0074 + - 75334 75334 75627 75698 71
XF0076 - - - 76905 76738 76702 36
XF0078 - - 79077 79077 78097 77864 233
XF0079 + 441 78788 79229 79465 79480 15
XF0080 - - 80706 80706 79744 79429 315
XF0081 - 26 83512 83486 80781 80707 74
XF0082 - 60 84373 84313 83513 83513 -
XF0083 - 175 85114 84939 84385 84383 2
XF0084 + 126 85227 85353 85448 85476 28
XF0085 + 134 85477 85611 85775 86086 311
XF0086 - 2 86911 86909 86421 86373 48
XF0087 - 48 88344 88296 86989 86912 77
XF0088 - 8 89705 89697 88345 88345 -
XF0089 - 17 90007 89990 89712 89706 6
XF0090 - - - 91047 90094 90008 86
XF0091 - 308 92251 91943 91047 - -
XF0092 + 1031 91013 92044 92250 94476 2226
XF0094 - 8 94886 94878 94237 94190 47
XF0095 + 13 94935 94948 95253 95271 18
XF0097 + 1 95804 95805 95969 96150 181
XF0098 - - - 96234 96040 95838 202
XF0099 - 33 98096 98063 96231 - -
XF0104 - 15 102758 102743 101904 101902 2
XF0105 + - 102867 102867 104213 104465 252
XF0106 + 10 104587 104597 105979 106091 112
XF0107 + - 106195 106195 106455 106498 43
XF0109 + 109 107012 107121 107906 107979 73
203
XF0110 + 63 108008 108071 108481 108481 -
XF0111 + 71 108835 108906 109685 109710 25
XF0112 + - 109735 109735 109929 109979 50
XF0113 + 15 110028 110043 110210 110258 48
XF0115 + - - 111267 111641 111648 7
XF0116 + 9 111704 111713 112846 112931 85
XF0117 + - 112932 112932 113093 113132 39
XF0118 + 113 113133 113246 114937 115212 275
XF0119 - 223 116246 116023 114995 114805 190
XF0120 + 123 116652 116775 116930 116930 -
XF0121 + - 117045 117045 118076 118114 38
XF0124 + 47 120765 120812 123562 123562 -
XF0125 + 6 123695 123701 123916 123995 79
XF0126 + 332 124089 124421 124600 124647 47
XF0127 - 14 127065 127051 125027 124988 39
XF0133 + - - 131034 132008 132326 318
XF0134 - - 135249 135249 132265 131970 295
XF0142 + 3 143184 143187 144386 144582 196
XF0145 - - 148457 148457 147702 147666 36
XF0147 - - 151138 151138 149378 149339 39
XF0148 - - 151893 151893 151195 151175 20
XF0149 + 8 151960 151968 153197 - -
XF0151 + 490 154154 154644 156038 156415 377
XF0152 - 130 156754 156624 156052 154132 1920
XF0156 - 10 160152 160142 159327 159317 10
XF0159 + - - 161369 161719 161773 54
XF0161 + - 162520 162520 164328 164479 151
204
XF0162 - 64 164624 164560 164426 164297 129
XF0163 + 129 164752 164881 164976 165006 30
XF0166 - - 168767 168767 167622 167598 24
XF0167 - 47 170290 170243 168828 168786 42
XF0168 + 84 170094 170178 170294 170443 149
XF0169 + - 170444 170444 171700 172273 573
XF0170 + 11 177513 177524 178339 178830 491
XF0171 - 100 179419 179319 178471 178116 355
XF0172 + - 179767 179767 181674 181725 51
XF0173 - - 182830 182830 182075 181846 229
XF0174 + 176 183153 183329 184975 184975 -
XF0175 + 82 184976 185058 185702 185707 5
XF0176 - - 187063 187063 185927 185821 106
XF0177 - 10 188003 187993 187211 187068 143
XF0178 + 68 188273 188341 189114 189114 -
XF0179 + 9 189115 189124 189216 189535 319
XF0180 + - 189953 189953 190414 190737 323
XF0181 - 57 192231 192174 191779 191349 430
XF0182 - 279 192695 192416 192282 192232 50
XF0183 - 22 193824 193802 192696 192696 -
XF0185 - 274 195667 195393 194380 - -
XF0187 - - - 197338 196538 196534 4
XF0188 - 294 198186 197892 197335 - -
XF0189 + 536 197386 197922 199382 - -
XF0192 + 166 201507 201673 203013 203013 -
XF0193 + 65 203014 203079 203450 203450 -
XF0194 + 160 203451 203611 203769 203803 34
205
XF0195 + 133 203804 203937 204140 204194 54
XF0196 - - 205047 205047 204523 203769 754
XF0197 + 1285 204255 205540 206202 206202 -
XF0198 + 267 206203 206470 206634 207156 522
XF0199 - - 207521 207521 206814 206023 791
XF0200 - 95 207910 207815 207720 207677 43
XF0201 - 14 208570 208556 207957 207947 10
XF0202 + 251 208370 208621 209073 209075 2
XF0203 - - 210198 210198 209239 209108 131
XF0205 - 29 215118 215089 214163 214096 67
XF0207 + - 215580 215580 215957 215976 19
XF0209 - 282 217721 217439 217032 217032 -
XF0210 + 451 217133 217584 219047 219067 20
XF0211 + 8 219194 219202 219786 219824 38
XF0212 + - 219855 219855 220889 220892 3
XF0213 + 2 220966 220968 221762 - -
XF0214 + - - 221759 222481 222896 415
XF0215 - 132 223452 223320 223150 222970 180
XF0216 + - 223451 223451 223957 224083 126
XF0217 - 81 224385 224304 224149 223459 690
XF0218 + 138 225112 225250 225348 225491 143
XF0219 - 60 225783 225723 225511 225279 232
XF0220 + - 225879 225879 227081 227242 161
XF0221 + 11 227243 227254 229095 229100 5
XF0223 + 5 231337 231342 232496 232513 17
XF0224 + 56 232551 232607 232969 233035 66
XF0226 + 19 234881 234900 235865 236138 273
206
XF0229 + 6 238005 238011 238829 - -
XF0230 + - - 238826 239671 239696 25
XF0232 + 3 240135 240138 241646 241801 155
XF0233 + 799 242919 243718 244365 - -
XF0235 + 95 245874 245969 248647 248647 -
XF0236 + 107 248648 248755 249132 249132 -
XF0237 + 90 249133 249223 250131 250191 60
XF0238 + 41 250261 250302 250562 250563 1
XF0239 + 53 250607 250660 252819 252929 110
XF0240 - 157 253554 253397 252969 249634 3335
XF0241 + 518 252994 253512 254393 254831 438
XF0242 - 259 254950 254691 254467 254405 62
XF0243 - - - 258792 255709 255427 282
XF0244 - 52 259950 259898 258789 - -
XF0245 - 12 260121 260109 259951 259951 -
XF0247 - 134 260795 260661 260326 260287 39
XF0248 + 187 260497 260684 261076 261094 18
XF0251 + 83 262578 262661 262831 263200 369
XF0252 - - 264692 264692 262848 262752 96
XF0253 - - - 265942 264992 264766 226
XF0254 - 36 266724 266688 265939 - -
XF0255 + - 266904 266904 267965 268025 60
XF0259 - - 271988 271988 270540 270536 4
XF0260 - 428 273931 273503 272001 272001 -
XF0261 + 31 273516 273547 273747 273869 122
XF0262 - 91 274331 274240 273932 273932 -
XF0263 + 141 274417 274558 274866 274866 -
207
XF0264 + 562 274867 275429 275737 275737 -
XF0265 + 39 275810 275849 276070 276171 101
XF0268 - 198 282567 282369 281182 280953 229
XF0269 + 122 282294 282416 282526 282551 25
XF0270 - 228 283045 282817 282659 282643 16
XF0272 - 46 283896 283850 283275 283275 -
XF0273 - 75 284082 284007 283897 283897 -
XF0274 - - 285543 285543 284260 284203 57
XF0275 + 44 285612 285656 286219 286241 22
XF0276 + 263 286250 286513 287928 287928 -
XF0277 - 482 290807 290325 288196 288196 -
XF0278 + 48 290292 290340 290999 290999 -
XF0279 + 9 291094 291103 291321 291425 104
XF0281 - 19 293991 293972 292803 292801 2
XF0283 - 30 294833 294803 294369 - -
XF0284 - 28 295244 295216 294851 294844 7
XF0285 - 117 297033 296916 295471 295395 76
XF0286 - - 298080 298080 297184 297082 102
XF0287 - 1 300496 300495 298786 298639 147
XF0289 + 30 301149 301179 301478 301609 131
XF0290 - 61 304789 304728 302002 301974 28
XF0291 + 116 305049 305165 305599 - -
XF0292 + - - 305596 308256 308312 56
XF0293 + - 308408 308408 308575 308583 8
XF0296 - 39 313758 313719 312391 312318 73
XF0302 + - - 317243 317530 317578 48
XF0303 + 74 317747 317821 318570 318570 -
208
XF0304 + 41 318571 318612 319010 319057 47
XF0305 + 72 319143 319215 319622 - -
XF0306 + - - 319592 320167 320205 38
XF0309 + - - 322272 322799 322803 4
XF0312 + 29 326370 326399 327457 - -
XF0313 + - - 327458 327949 327953 4
XF0316 + 7 328925 328932 331073 331073 -
XF0317 + 21 331074 331095 332600 332625 25
XF0318 + - 332635 332635 334092 334169 77
XF0319 - 58 335567 335509 334769 334625 144
XF0320 - 132 337031 336899 335568 335568 -
XF0321 - 221 338449 338228 337032 337032 -
XF0322 + 241 338187 338428 339123 - -
XF0325 + 5 341641 341646 341960 342003 43
XF0327 - 119 343379 343260 343099 343074 25
XF0329 - 2 343991 343989 343885 343858 27
XF0330 + 129 344002 344131 344715 344715 -
XF0336 + - - 346223 346399 346448 49
XF0337 - - 346497 346497 346387 346305 82
XF0338 - - 347248 347248 346772 346722 50
XF0339 + - 347467 347467 350250 350266 16
XF0340 - 144 351283 351139 350618 350355 263
XF0341 + 24 351314 351338 351433 351446 13
XF0342 + 48 351524 351572 351760 351949 189
XF0343 - - 353268 353268 352099 352064 35
XF0344 - 76 353540 353464 353360 353315 45
XF0345 + 1419 352124 353543 353776 353776 -
209
XF0346 + 281 354014 354295 354399 354410 11
XF0347 - - 356526 356526 355141 355027 114
XF0348 - - 356994 356994 356842 356756 86
XF0349 + 364 356673 357037 357210 357210 -
XF0350 + 6 357211 357217 357312 357332 20
XF0351 - 443 358027 357584 357360 357236 124
XF0352 + 38 357786 357824 360031 360031 -
XF0355 + 74 362793 362867 363013 363040 27
XF0357 + 53 365111 365164 366327 366577 250
XF0358 + - 367442 367442 368599 368717 118
XF0359 + 78 368942 369020 369202 - -
XF0360 + - - 369172 369285 369296 11
XF0361 + - 369297 369297 370712 370847 135
XF0362 - 29 371266 371237 370914 370904 10
XF0363 + 21 371354 371375 372103 372368 265
XF0364 - - 372383 372383 372111 371351 760
XF0365 - 245 373261 373016 372813 372786 27
XF0366 - 2 374222 374220 373267 373262 5
XF0368 - - 378493 378493 375998 375697 301
XF0369 + 12 378536 378548 379726 - -
XF0373 + - - 381583 383496 383920 424
XF0375 + - - 385628 387286 387528 242
XF0376 - 140 387899 387759 387598 387571 27
XF0379 + 12 390684 390696 390869 391355 486
XF0380 - 131 391301 391170 391003 390841 162
XF0381 + - 391356 391356 393941 394022 81
XF0382 - - 394665 394665 394483 393394 1089
210
XF0383 - 114 395383 395269 394790 394666 124
XF0384 + 1314 394042 395356 397401 397454 53
XF0387 + - 399121 399121 400143 400152 9
XF0388 + 79 400282 400361 400732 400797 65
XF0389 + - 400823 400823 401506 401513 7
XF0392 + 107 404363 404470 405681 405932 251
XF0393 + 52 406028 406080 406652 406652 -
XF0394 + 26 406729 406755 406979 407060 81
XF0395 + - 407061 407061 407525 407538 13
XF0396 + - 407540 407540 407821 407892 71
XF0397 - 44 408614 408570 408157 408105 52
XF0399 - 53 409539 409486 409292 409223 69
XF0400 - 4 409977 409973 409578 409576 2
XF0401 - 257 411935 411678 409978 409978 -
XF0402 + 1064 411456 412520 412759 - -
XF0405 + 34 413779 413813 414199 415272 1073
XF0406 - 22 415272 415250 414291 413859 432
XF0407 + - 415519 415519 416688 417478 790
XF0408 - - 418505 418505 417063 417010 53
XF0409 - 307 419154 418847 418692 418506 186
XF0410 + 60 418762 418822 418986 419151 165
XF0411 + 7 419252 419259 421013 421033 20
XF0412 + 2 421057 421059 422360 422368 8
XF0413 + - 422702 422702 424072 424240 168
XF0414 + 70 424241 424311 424505 424507 2
XF0415 + - 424508 424508 424708 425631 923
XF0416 - 14 425829 425815 424760 424276 484
211
XF0419 - 101 427415 427314 426778 - -
XF0420 - - - 428205 427456 427439 17
XF0421 - 132 429131 428999 428205 - -
XF0432 - 29 443670 443641 442832 442823 9
XF0433 - 142 444542 444400 443954 443954 -
XF0434 - 76 444878 444802 444587 444587 -
XF0435 + 5 444970 444975 446021 446021 -
XF0436 + 33 446071 446104 446466 446466 -
XF0437 + 113 446467 446580 447998 447998 -
XF0438 + 139 447999 448138 448254 448455 201
XF0439 + 15 448456 448471 450693 450772 79
XF0440 + - 450905 450905 451153 451394 241
XF0441 - 267 452158 451891 451421 450961 460
XF0442 - - 453084 453084 452314 452303 11
XF0443 - 190 453480 453290 453138 453097 41
XF0444 + 160 453117 453277 453627 453686 59
XF0445 + 25 453687 453712 455406 455495 89
XF0446 + - 455556 455556 455930 456555 625
XF0447 - 82 456551 456469 456269 454258 2011
XF0448 + 55 456580 456635 456742 456908 166
XF0449 + - 457038 457038 457388 457479 91
XF0450 - 60 458430 458370 457972 457947 25
XF0451 - 4152 463694 459542 458451 458451 -
XF0452 + 516 459086 459602 460741 - -
XF0454 + 78 461602 461680 461946 461949 3
XF0455 + 121 461988 462109 463431 464104 673
XF0456 - 34 463947 463913 463737 463736 1
212
XF0457 - 22 464974 464952 463948 463948 -
XF0458 + 18 466464 466482 466907 466917 10
XF0460 + 55 468139 468194 468934 468940 6
XF0462 + 10 469577 469587 469808 469817 9
XF0463 + 51 469818 469869 470525 470525 -
XF0464 + 12 470526 470538 471761 471786 25
XF0465 + - 471787 471787 473184 473231 47
XF0466 - - - 474556 473417 473063 354
XF0467 - 29 474710 474681 474553 - -
XF0468 - - 475120 475120 474935 474864 71
XF0469 - 166 475622 475456 475196 475196 -
XF0471 + 6 477152 477158 477286 477294 8
XF0472 + 25 477541 477566 478915 479060 145
XF0478 + - - 481950 486368 486382 14
XF0479 + - 486443 486443 486820 486924 104
XF0480 - - - 488229 487057 486935 122
XF0486 - 17 490789 490772 490161 - -
XF0487 - 102 491506 491404 490847 490810 37
XF0488 - - 491782 491782 491516 491509 7
XF0494 + - 494079 494079 494432 494439 7
XF0495 + - 494469 494469 494771 494854 83
XF0496 + 6 495051 495057 496232 - -
XF0497 + - - 496232 496699 496858 159
XF0499 - 36 497605 497569 497039 496941 98
XF0530 + - 525069 525069 525194 525227 33
XF0531 + 16 525323 525339 526343 527329 986
XF0532 - - - 527065 526772 526306 466
213
XF0533 - 71 527407 527336 527049 - -
XF0534 - 145 528108 527963 527619 527613 6
XF0535 + 22 528629 528651 528965 529094 129
XF0539 - 594 532354 531760 531197 - -
XF0543 + - 533197 533197 533865 533910 45
XF0544 - - 534044 534044 533877 533785 92
XF0545 + 43 533977 534020 534202 534312 110
XF0546 + 20 534337 534357 534557 534571 14
XF0550 - 335 541106 540771 537646 537628 18
XF0551 + 420 540413 540833 541027 541105 78
XF0552 - - 542110 542110 541289 541154 135
XF0553 + 6 542186 542192 543922 543922 -
XF0555 + 133 544292 544425 544607 - -
XF0556 + - - 544600 545625 546316 691
XF0557 - - 546302 546302 545847 545604 243
XF0561 + 21 548195 548216 549112 549311 199
XF0562 - - - 549920 549180 548500 680
XF0563 - 11 550350 550339 549917 - -
XF0564 - 74 550646 550572 550357 550351 6
XF0565 - 46 551598 551552 550647 550647 -
XF0566 + 1402 550272 551674 552687 552777 90
XF0567 - - 553787 553787 553023 553015 8
XF0568 - 38 554801 554763 553855 553788 67
XF0570 + 102 555996 556098 556328 556451 123
XF0571 - 24 556563 556539 556369 555996 373
XF0575 + - - 558092 558442 560251 1809
XF0577 + 24 560692 560716 560865 560885 20
214
XF0578 + 14 560886 560900 561037 561037 -
XF0579 + 16 561093 561109 561330 561339 9
XF0580 + - 561340 561340 561993 561999 6
XF0581 + 65 562024 562089 562298 562323 25
XF0582 + 12 562324 562336 562527 562650 123
XF0583 - - 563249 563249 562566 562244 322
XF0584 - 9 564119 564110 563253 563251 2
XF0587 - - 566212 566212 565157 565156 1
XF0593 + 240 571496 571736 572065 572746 681
XF0594 - 4 573749 573745 572810 572724 86
XF0596 - - 575208 575208 574684 574660 24
XF0597 - - 575890 575890 575234 575209 25
XF0598 - 43 576635 576592 575900 575891 9
XF0600 + 4 579285 579289 579699 - -
XF0601 + - - 579699 580592 580706 114
XF0602 + 164 580758 580922 581143 581143 -
XF0603 + 133 581144 581277 582647 582736 89
XF0604 - 1843 584704 582861 582700 581760 940
XF0605 + - 582883 582883 583023 583159 136
XF0608 + - - 584709 587258 587268 10
XF0609 + 46 587304 587350 588390 588419 29
XF0610 + - 588420 588420 589307 589315 8
XF0611 + 22 589316 589338 590327 590329 2
XF0612 + - 590330 590330 591283 591301 18
XF0613 + 35 591648 591683 592276 - -
XF0614 + - - 592267 594354 594541 187
XF0615 - - 596278 596278 594635 594616 19
215
XF0616 - 247 596923 596676 596389 596279 110
XF0617 + 2114 594692 596806 597006 597006 -
XF0618 + 81 597010 597091 597183 597188 5
XF0620 + - - 597627 599903 600334 431
XF0621 - - - 600892 600068 599175 893
XF0623 + 149 601690 601839 602171 602384 213
XF0624 + 64 602495 602559 603407 603508 101
XF0625 - - 603668 603668 603402 603344 58
XF0627 - 202 604918 604716 604465 604465 -
XF0629 - - 606406 606406 605696 605691 5
XF0630 - 50 606947 606897 606421 606407 14
XF0632 + 24 608573 608597 608941 608941 -
XF0641 - 65 615885 615820 614678 - -
XF0642 + 658 615626 616284 616469 616469 -
XF0643 - - 616708 616708 616520 616487 33
XF0644 - 2 617612 617610 616918 616714 204
XF0645 + 630 617183 617813 617935 618016 81
XF0646 + 30 618141 618171 618602 618628 26
XF0648 + 119 619286 619405 619626 619627 1
XF0649 - - 620279 620279 619605 619001 604
XF0650 + 32 620281 620313 620429 620681 252
XF0651 - - 622017 622017 620725 620696 29
XF0653 + - 622544 622544 623182 623227 45
XF0654 + - 623228 623228 624094 624326 232
XF0655 - 50 624738 624688 624428 624401 27
XF0656 - 15 626161 626146 624833 624804 29
XF0667 + 157 633578 633735 634160 - -
216
XF0668 + - - 634160 637783 637810 27
XF0669 - 31 640911 640880 638190 637894 296
XF0671 + 6 642415 642421 643164 643310 146
XF0673 + 157 643569 643726 644961 644975 14
XF0674 + 76 645102 645178 646536 646536 -
XF0675 + 96 646554 646650 647702 647708 6
XF0677 + - - 648688 649044 649103 59
XF0678 - - 650278 650278 649115 647860 1255
XF0683 - 1 655042 655041 652861 - -
XF0687 - 110 658801 658691 658467 - -
XF0695 + 113 661168 661281 661541 661541 -
XF0696 - 66 662447 662381 661716 661692 24
XF0697 + 3 662443 662446 662670 662751 81
XF0698 - - - 663065 662844 662834 10
XF0700 - - 663829 663829 663335 663285 50
XF0701 + 141 663704 663845 663997 - -
XF0702 + - - 663994 664242 664319 77
XF0703 - 65 664739 664674 664312 663830 482
XF0704 + 205 664653 664858 665490 665601 111
XF0705 + 12 665612 665624 668161 668560 399
XF0706 + - 668704 668704 668901 668937 36
XF0707 + 3 669675 669678 670172 670174 2
XF0709 + - - 670466 670945 671065 120
XF0719 + - - 679473 680060 680576 516
XF0720 - - 680340 680340 680065 679934 131
XF0721 - - 680668 680668 680351 680341 10
XF0729 + 2 685973 685975 686262 686284 22
217
XF0735 - 355 691648 691293 690919 690538 381
XF0736 + 167 691300 691467 693374 693374 -
XF0737 + 115 693375 693490 693969 694153 184
XF0739 + - - 694230 694427 694428 1
XF0740 + 9 694429 694438 694797 694882 85
XF0741 + 146 694923 695069 696070 696153 83
XF0742 + - 696154 696154 698532 698551 19
XF0743 + 4 698552 698556 698855 - -
XF0744 + - - 698830 699192 699234 42
XF0745 + 45 699399 699444 699563 699605 42
XF0746 + - 699868 699868 700143 700365 222
XF0749 - 8 703140 703132 702728 702716 12
XF0750 - 53 703410 703357 703259 703243 16
XF0751 - 10 704509 704499 703411 703411 -
XF0753 - 22 706690 706668 706483 706472 11
XF0754 + 98 706452 706550 707407 707618 211
XF0755 - 5 708812 708807 707473 706894 579
XF0757 + 206 709051 709257 710747 - -
XF0758 + - - 710744 711232 711290 58
XF0759 + - 711291 711291 712910 712986 76
XF0760 + 3 713043 713046 714905 714905 -
XF0761 + 39 714911 714950 715867 716710 843
XF0762 - 17 716728 716711 716136 715941 195
XF0763 - 31 717112 717081 716788 716788 -
XF0769 - - 721856 721856 720966 720541 425
XF0770 - - 722283 722283 721873 721857 16
XF0773 - 126 723647 723521 723417 723417 -
218
XF0774 + 241 723295 723536 723823 - -
XF0775 + - - 723820 724800 724917 117
XF0778 - 666 731492 730826 728706 728614 92
XF0779 + 11 730795 730806 731462 731462 -
XF0780 + 150 731463 731613 731855 731855 -
XF0781 - - 734041 734041 732248 732237 11
XF0782 + 11 734145 734156 734383 734383 -
XF0783 + 3 734396 734399 735226 - -
XF0784 + - - 735223 735957 735970 13
XF0789 + - 739092 739092 739604 739610 6
XF0798 + 55 749033 749088 750521 750521 -
XF0799 + 2 750522 750524 751486 751486 -
XF0801 + - - 752426 753661 753830 169
XF0802 + - 753831 753831 755066 755438 372
XF0803 + - 755439 755439 756353 756729 376
XF0804 - 88 756873 756785 756513 754914 1599
XF0805 + 138 756828 756966 757925 757968 43
XF0806 + 12 758061 758073 760817 - -
XF0807 + - - 760796 760963 760977 14
XF0808 + 235 761179 761414 761548 761557 9
XF0809 - 328 762042 761714 761538 758032 3506
XF0810 + 40 761673 761713 763410 763505 95
XF0811 - 181 764731 764550 763690 763690 -
XF0812 + 84 764533 764617 764757 764863 106
XF0814 + 176 765595 765771 765923 765964 41
XF0815 + - 765965 765965 766126 769071 2945
XF0816 - - 769224 769224 766252 766219 33
219
XF0817 + 17 769255 769272 769448 769578 130
XF0818 - - 771418 771418 769640 769225 415
XF0819 - 164 771970 771806 771651 771623 28
XF0820 + - 771718 771718 773376 773385 9
XF0821 - - 774064 774064 773555 773534 21
XF0822 - - 775484 775484 774081 774065 16
XF0823 + 3 776089 776092 777267 777273 6
XF0824 + 8 777677 777685 779151 779151 -
XF0826 + 8 779860 779868 780872 781002 130
XF0827 - 176 782025 781849 781043 781022 21
XF0828 + 446 781602 782048 782629 782629 -
XF0829 + 44 782630 782674 782901 783011 110
XF0830 - 10 783384 783374 782958 782602 356
XF0834 - - - 788361 787165 786875 290
XF0835 - 45 789596 789551 788343 - -
XF0836 - - 790009 790009 789746 789614 132
XF0838 + - - 792417 793811 793814 3
XF0851 + 7 811602 811609 812916 - -
XF0853 + 373 814087 814460 815959 816234 275
XF0854 + - 816235 816235 816444 817337 893
XF0855 - - - 817850 817122 816601 521
XF0857 - - - 819164 818487 818483 4
XF0858 - 101 820050 819949 819161 - -
XF0859 + 78 819890 819968 820216 820244 28
XF0860 - 643 821560 820917 820210 820109 101
XF0861 + 242 820970 821212 821478 821667 189
XF0867 + 15 826338 826353 826691 826858 167
220
XF0868 - 45 828948 828903 827092 826606 486
XF0869 - 31 830635 830604 828949 828949 -
XF0871 + 165 831074 831239 831463 831468 5
XF0872 + 105 831489 831594 832139 832167 28
XF0873 - 37 833067 833030 832245 832220 25
XF0874 - - - 833831 833124 833068 56
XF0876 - - 835558 835558 835250 835246 4
XF0877 + 231 835588 835819 836133 - -
XF0880 + - 838143 838143 838805 838833 28
XF0881 + - 838834 838834 839442 839492 50
XF0882 - - 841802 841802 839676 839324 352
XF0883 - - - 842380 841823 841813 10
XF0884 - 3 844806 844803 842377 - -
XF0885 + - 845057 845057 846181 846202 21
XF0890 + - 859344 859344 860192 860259 67
XF0894 + 3 862798 862801 863649 863649 -
XF0895 + 4 863866 863870 864721 864803 82
XF0898 - 3 867220 867217 866864 866858 6
XF0899 - 126 867535 867409 867221 867221 -
XF0904 - 54 873127 873073 872090 872090 -
XF0905 - 10 873403 873393 873199 873152 47
XF0907 + - 875047 875047 875940 875986 46
XF0910 + - - 877970 878731 878872 141
XF0911 + - 878873 878873 879508 879538 30
XF0913 + 10 879980 879990 880775 880823 48
XF0914 + - 880998 880998 881423 881484 61
XF0915 + 3 881583 881586 881918 881925 7
221
XF0916 + 33 881926 881959 882204 - -
XF0919 - 113 884245 884132 883569 883311 258
XF0921 + 79 886820 886899 887117 887138 21
XF0922 + 151 887328 887479 887652 888278 626
XF0923 - 27 888201 888174 887701 887021 680
XF0924 - 6 889389 889383 888220 888220 -
XF0926 + 19 890730 890749 891261 891261 -
XF0927 + 105 891262 891367 892290 892291 1
XF0928 + 19 892292 892311 893576 893614 38
XF0930 + 219 895331 895550 895846 895859 13
XF0931 - 183 896240 896057 895887 895886 1
XF0933 + - - 896526 898379 898382 3
XF0935 + 15 898684 898699 899634 - -
XF0937 - - - 901121 900732 900485 247
XF0938 - 1117 903132 902015 901122 - -
XF0939 + 8 902095 902103 903098 903099 1
XF0944 - - 908895 908895 907231 907229 2
XF0945 - 176 909449 909273 909058 909052 6
XF0947 + 128 910831 910959 911456 911483 27
XF0949 + 3 912133 912136 912393 912454 61
XF0950 + - 912455 912455 913549 913593 44
XF0951 - 1091 915112 914021 913782 913782 -
XF0952 + 165 913971 914136 914738 - -
XF0953 + - - 914735 915868 915888 20
XF0954 + 9 915889 915898 916362 - -
XF0955 + - - 916359 916832 916917 85
XF0956 + 5 916918 916923 917897 918163 266
222
XF0957 + 251 918356 918607 918831 918836 5
XF0958 + 54 918887 918941 919222 919268 46
XF0959 - 35 919832 919797 919201 918340 861
XF0960 - - 920601 920601 919858 919833 25
XF0961 - 34 921179 921145 920666 920666 -
XF0962 - - 921818 921818 921192 921182 10
XF0963 + 19 921901 921920 922828 - -
XF0964 + - - 922818 923354 923376 22
XF0965 + 80 923420 923500 923631 924122 491
XF0966 - 30 924407 924377 923820 921878 1942
XF0967 + - 924533 924533 926542 926572 30
XF0968 - - 927659 927659 926826 926625 201
XF0972 + - 928656 928656 929288 929420 132
XF0973 - - 930962 930962 929325 928584 741
XF0975 - 79 932982 932903 931734 931669 65
XF0976 + 4 933074 933078 934550 934685 135
XF0977 + - 934718 934718 937012 937015 3
XF0978 - - 939156 939156 937243 937236 7
XF0979 + 43 939288 939331 939957 - -
XF0980 + - - 939954 940442 940448 6
XF0981 + 1 940500 940501 940983 - -
XF0982 + - - 940961 941155 941175 20
XF0984 + - - 941436 943247 943519 272
XF0985 - 325 944219 943894 943733 943718 15
XF0986 + 243 943752 943995 945779 945936 157
XF0987 - - - 946736 945879 944632 1247
XF0989 - 83 948428 948345 948082 - -
223
XF0990 - 611 949605 948994 948809 948463 346
XF0991 + 47 948406 948453 949397 949397 -
XF0992 + 23 949602 949625 950608 950608 -
XF0993 - - - 952048 950792 949856 936
XF0994 - 15 952500 952485 952045 - -
XF0995 - 420 954414 953994 952570 952501 69
XF0996 + 66 954075 954141 954668 954668 -
XF0997 + - 954674 954674 954958 955006 48
XF0998 + 14 955043 955057 956067 956072 5
XF1001 + 10 958523 958533 959849 959849 -
XF1010 + 10 967322 967332 967841 967841 -
XF1014 + 225 973718 973943 974125 974125 -
XF1015 + 1 974126 974127 975545 975558 13
XF1016 + 2 975559 975561 975725 975758 33
XF1017 - - 975876 975876 975703 975536 167
XF1018 - - 976807 976807 976043 975961 82
XF1020 - 3 977723 977720 977229 977229 -
XF1022 - 128 978923 978795 978685 978676 9
XF1024 - 14 979821 979807 979490 979468 22
XF1025 - 2833 983998 981165 980782 980161 621
XF1026 + 5 980862 980867 983875 983881 6
XF1027 - 18 984384 984366 984121 984022 99
XF1028 - 39 984926 984887 984687 984492 195
XF1029 - 26 987136 987110 985119 985119 -
XF1030 + - 987384 987384 987557 987559 2
XF1031 - 21 990380 990359 987747 987714 33
XF1032 - 57 991239 991182 990976 990951 25
224
XF1033 + 108 991256 991364 991549 - -
XF1034 + - - 991519 991734 991853 119
XF1035 + - 991854 991854 992156 992167 11
XF1036 + 11 992240 992251 995277 995656 379
XF1037 - - 996825 996825 995383 992812 2571
XF1038 + 348 997421 997769 999280 999290 10
XF1041 - - 1000783 1000783 1000079 1000029 50
XF1042 - 43 1002040 1001997 1000840 1000840 -
XF1043 - 20 1002885 1002865 1002074 1002074 -
XF1045 - 21 1004451 1004430 1003366 - -
XF1046 - - 1006931 1006931 1004577 1004548 29
XF1047 - 56 1008390 1008334 1007030 1006932 98
XF1049 - - - 1010438 1009584 1009582 2
XF1051 - - 1011762 1011762 1011205 1011203 2
XF1052 - 36 1012202 1012166 1011927 1011763 164
XF1053 - - 1013856 1013856 1012513 1012267 246
XF1054 + 184 1013885 1014069 1014767 1014819 52
XF1055 + 48 1014831 1014879 1015199 1015359 160
XF1056 - 221 1015999 1015778 1015455 1015410 45
XF1057 + 29 1016049 1016078 1016380 1017133 753
XF1058 - 207 1017359 1017152 1016409 1016017 392
XF1059 + - 1017134 1017134 1017292 1017308 16
XF1060 - 31 1017782 1017751 1017524 1017360 164
XF1061 - - 1019186 1019186 1018527 1018339 188
XF1063 - - - 1022035 1021316 1021310 6
XF1067 + 36 1024769 1024805 1025899 1025922 23
XF1068 - 3450 1030411 1026961 1026044 1025411 633
225
XF1069 + 207 1026950 1027157 1027375 1027375 -
XF1070 + 24 1027376 1027400 1027828 - -
XF1072 + 7 1028209 1028216 1030006 1030006 -
XF1073 + 20 1030007 1030027 1030812 1030812 -
XF1074 + 75 1030813 1030888 1031181 1031181 -
XF1075 + 19 1031182 1031201 1031584 1031599 15
XF1076 + - 1031610 1031610 1032851 1032866 15
XF1077 + - 1032883 1032883 1033566 1033642 76
XF1080 + 4 1037040 1037044 1037481 - -
XF1082 + - - 1039244 1040263 1040663 400
XF1083 - 5 1040668 1040663 1040487 1040011 476
XF1084 + 130 1040779 1040909 1041550 1041550 -
XF1085 + 16 1041551 1041567 1042046 1042046 -
XF1086 + 19 1042047 1042066 1042638 - -
XF1087 + - - 1042635 1044593 1044604 11
XF1090 - - 1046010 1046010 1045600 1045588 12
XF1093 - 14 1047804 1047790 1047305 1047125 180
XF1094 - - 1048632 1048632 1048033 1047902 131
XF1098 + 32 1050411 1050443 1050562 1050608 46
XF1099 - - 1051154 1051154 1050579 1050327 252
XF1100 + 256 1051294 1051550 1051771 1051859 88
XF1101 + 3 1052094 1052097 1052255 1052552 297
XF1102 - - 1052826 1052826 1052533 1052079 454
XF1103 + - 1052911 1052911 1055682 1055740 58
XF1106 + 97 1057139 1057236 1058360 1058360 -
XF1107 + 77 1058484 1058561 1061803 1061811 8
XF1109 + 46 1062277 1062323 1063204 1063240 36
226
XF1110 + 29 1063241 1063270 1065015 1065167 152
XF1111 + 101 1065680 1065781 1066797 1066803 6
XF1112 + - 1066981 1066981 1068501 1068546 45
XF1113 + 37 1068596 1068633 1069793 1069798 5
XF1114 + 7 1069935 1069942 1071930 1071954 24
XF1115 - 1072 1073897 1072825 1071953 1071244 709
XF1116 + 111 1072995 1073106 1075712 - -
XF1118 + - - 1077145 1078551 1078797 246
XF1119 - 96 1079611 1079515 1079129 1079124 5
XF1121 - 17 1081426 1081409 1080582 1080582 -
XF1122 + 1 1081690 1081691 1081831 1082640 809
XF1123 - 25 1082653 1082628 1081900 1081763 137
XF1125 + - - 1083317 1084810 1084957 147
XF1128 + 18 1090367 1090385 1090504 1090504 -
XF1129 + 46 1090505 1090551 1090715 1090715 -
XF1130 - 53 1091425 1091372 1090815 1090784 31
XF1131 + 259 1091254 1091513 1092799 1092803 4
XF1132 - 70 1093861 1093791 1092886 1092488 398
XF1133 + 74 1093932 1094006 1094575 1094575 -
XF1134 + 26 1094576 1094602 1094778 - -
XF1136 + 85 1094909 1094994 1096052 1096056 4
XF1137 + - 1096057 1096057 1096746 1096806 60
XF1138 + 16 1097194 1097210 1097428 1097492 64
XF1139 - 26 1097843 1097817 1097518 1093869 3649
XF1140 - - 1099595 1099595 1098222 1098046 176
XF1141 - 19 1100569 1100550 1099975 1099949 26
XF1142 - - 1101228 1101228 1100797 1100570 227
227
XF1143 - 82 1102780 1102698 1101298 1101229 69
XF1145 - 49 1105334 1105285 1103738 1103645 93
XF1147 - 1 1106337 1106336 1105866 1105863 3
XF1148 - 1 1106763 1106762 1106457 1106342 115
XF1149 - - 1107623 1107623 1106826 1106764 62
XF1150 - 462 1108486 1108024 1107653 1107629 24
XF1151 + 854 1108507 1109361 1109672 1109672 -
XF1152 + 27 1109675 1109702 1110334 1110348 14
XF1154 + - - 1110945 1111256 1111257 1
XF1155 + 7 1111261 1111268 1112095 1112095 -
XF1156 + 7 1112096 1112103 1112372 1112384 12
XF1157 + - 1112385 1112385 1112720 1112737 17
XF1158 + 1 1112738 1112739 1113458 1113458 -
XF1159 + 5 1113459 1113464 1113877 - -
XF1162 + 23 1114341 1114364 1114732 1114732 -
XF1163 + 15 1114733 1114748 1115065 1115065 -
XF1164 + 11 1115066 1115077 1115616 1115616 -
XF1165 + 16 1115617 1115633 1115938 1115938 -
XF1166 + 19 1116078 1116097 1116495 1116503 8
XF1167 + 6 1116504 1116510 1117037 1117037 -
XF1168 + 87 1117038 1117125 1117484 1117491 7
XF1169 + 5 1117655 1117660 1118199 1118199 -
XF1170 + 19 1118200 1118219 1118380 - -
XF1171 + - - 1118381 1118830 1118839 9
XF1172 + - 1118840 1118840 1120213 1120275 62
XF1173 + 51 1120292 1120343 1120699 1120701 2
XF1174 + 13 1120702 1120715 1121107 1121110 3
228
XF1175 + 11 1121111 1121122 1121748 1121802 54
XF1177 + 10 1122921 1122931 1123311 1123459 148
XF1178 + - 1124306 1124306 1124626 1124636 10
XF1179 + - 1124637 1124637 1126157 1126252 95
XF1182 + - - 1129813 1130865 1131311 446
XF1183 + - 1131441 1131441 1132742 1133137 395
XF1184 - 113 1133727 1133614 1133510 1133236 274
XF1185 - 122 1134461 1134339 1133878 1133762 116
XF1186 + 127 1136120 1136247 1137542 1137676 134
XF1187 + - 1137677 1137677 1138303 1138398 95
XF1188 + 32 1138399 1138431 1139711 1139711 -
XF1189 + 77 1139712 1139789 1142335 1142335 -
XF1190 + 220 1142336 1142556 1142840 1142841 1
XF1191 + 61 1143374 1143435 1145402 1145438 36
XF1192 + 601 1146051 1146652 1147677 1147677 -
XF1193 - 400 1148262 1147862 1147719 1147462 257
XF1194 + 256 1147725 1147981 1148190 1148266 76
XF1196 + 66 1148810 1148876 1151368 1151368 -
XF1197 + 77 1151369 1151446 1152486 1152497 11
XF1199 + - - 1152952 1153278 1153367 89
XF1201 + - - 1154406 1155086 1155169 83
XF1202 + - 1155269 1155269 1155481 1156828 1347
XF1203 - - 1155857 1155857 1155591 1155075 516
XF1204 - 55 1156549 1156494 1155937 1155895 42
XF1205 - 1131 1158046 1156915 1156550 1156550 -
XF1206 + 153 1156933 1157086 1157322 1157322 -
XF1207 + 13 1157323 1157336 1157500 - -
229
XF1208 + - - 1157501 1157650 1157662 12
XF1210 + 7 1159452 1159459 1160076 1160853 777
XF1211 - - 1161254 1161254 1160247 1159038 1209
XF1212 - 27 1161889 1161862 1161368 1161353 15
XF1213 + 140 1161962 1162102 1163931 1163946 15
XF1214 + 214 1163947 1164161 1164436 1164455 19
XF1215 + 195 1164506 1164701 1164877 1164983 106
XF1216 + - 1165068 1165068 1166330 1166555 225
XF1217 + - 1166556 1166556 1166810 1166850 40
XF1218 + 107 1166859 1166966 1167265 1167265 -
XF1219 + 122 1167378 1167500 1167739 1168133 394
XF1220 + 184 1168218 1168402 1170525 1170558 33
XF1221 + 9 1170662 1170671 1170970 1171171 201
XF1222 - - 1171819 1171819 1171040 1170473 567
XF1223 - 12 1172843 1172831 1171899 1171893 6
XF1224 + 20 1173700 1173720 1177373 1177396 23
XF1226 - - 1178263 1178263 1177772 1177525 247
XF1227 + 109 1178469 1178578 1178739 1178966 227
XF1228 - 259 1179821 1179562 1179173 1178977 196
XF1230 - 75 1183373 1183298 1182810 1182331 479
XF1231 + 5 1183586 1183591 1185444 - -
XF1232 + - - 1185441 1189262 1189369 107
XF1233 - 19 1189503 1189484 1189365 1189113 252
XF1234 + - 1190039 1190039 1190935 1191329 394
XF1236 + 123 1191986 1192109 1192426 1192446 20
XF1240 - - 1194136 1194136 1193891 1193854 37
XF1242 + - 1197439 1197439 1197609 1197639 30
230
XF1250 + 2 1203096 1203098 1203979 1204128 149
XF1251 - 32 1204351 1204319 1204131 1203129 1002
XF1252 + 13 1204461 1204474 1209399 1209457 58
XF1253 - - 1210482 1210482 1209505 1209467 38
XF1254 + - 1210746 1210746 1211600 1211616 16
XF1255 - 434 1212484 1212050 1211775 1211743 32
XF1257 + 57 1212432 1212489 1213070 1213080 10
XF1258 - - - 1214205 1213288 1213196 92
XF1259 - 11 1216592 1216581 1214206 - -
XF1261 + 81 1217568 1217649 1218134 1218148 14
XF1262 + - 1218184 1218184 1218690 1218822 132
XF1264 - - - 1220796 1219168 1219167 1
XF1265 - 19 1221659 1221640 1220711 - -
XF1266 + 8 1222043 1222051 1222161 1222230 69
XF1269 - 36 1226851 1226815 1225694 1225683 11
XF1271 - 32 1227839 1227807 1227529 - -
XF1272 - 10 1228783 1228773 1227973 1227944 29
XF1273 - 11 1229073 1229062 1228784 1228784 -
XF1274 - 508 1229824 1229316 1229074 1229074 -
XF1275 + 19 1229269 1229288 1229809 1229816 7
XF1276 - 584 1230561 1229977 1229825 1229825 -
XF1277 + - 1229990 1229990 1230190 1230299 109
XF1281 + 78 1234372 1234450 1234653 1234818 165
XF1282 - - 1236284 1236284 1234773 1234245 528
XF1284 + - - 1236503 1236661 1237530 869
XF1285 - 101 1237014 1236913 1236743 1236735 8
XF1287 + - 1238943 1238943 1239383 1239393 10
231
XF1289 + 65 1241303 1241368 1242198 1242325 127
XF1290 + 5 1242361 1242366 1242530 1242532 2
XF1291 + - 1242553 1242553 1243938 1243941 3
XF1294 + - 1245011 1245011 1245517 1246577 1060
XF1295 - 32 1246334 1246302 1245760 1245704 56
XF1298 - 99 1249704 1249605 1247959 1247800 159
XF1299 + 30 1249665 1249695 1250297 1250781 484
XF1300 - - - 1251133 1250492 1250375 117
XF1301 - 1 1252057 1252056 1251130 - -
XF1303 - 487 1254573 1254086 1252896 - -
XF1304 + 39 1254085 1254124 1255386 1255565 179
XF1306 + 18 1255822 1255840 1256040 1256729 689
XF1307 - 442 1256737 1256295 1256059 1255626 433
XF1308 + - 1258417 1258417 1258704 1258826 122
XF1309 + - 1258846 1258846 1259955 1260096 141
XF1310 + 56 1260097 1260153 1261103 - -
XF1314 + 89 1264778 1264867 1265910 1265922 12
XF1315 + 447 1265923 1266370 1266546 1266614 68
XF1316 + - 1266639 1266639 1268795 1268806 11
XF1318 + - - 1268973 1270376 1270569 193
XF1319 - 2 1271406 1271404 1270898 1270602 296
XF1321 - - 1272533 1272533 1271724 1271722 2
XF1322 - 15 1273301 1273286 1272570 1272545 25
XF1323 - 1745 1275625 1273880 1273302 1273302 -
XF1324 + 932 1273351 1274283 1275470 1275478 8
XF1325 + 116 1275482 1275598 1275816 1275819 3
XF1326 + 48 1275820 1275868 1276518 1276604 86
232
XF1327 - - 1277430 1277430 1276861 1276630 231
XF1328 - - 1278014 1278014 1277448 1277433 15
XF1329 - - 1278731 1278731 1278027 1278015 12
XF1331 - 45 1283185 1283140 1283039 1282502 537
XF1332 - 18 1284268 1284250 1283186 1283186 -
XF1337 + - 1286542 1286542 1287168 1287411 243
XF1338 - - 1289156 1289156 1287414 1287134 280
XF1344 + 1 1291348 1291349 1292368 1292371 3
XF1347 + 13 1294189 1294202 1295248 1295716 468
XF1348 - 27 1296447 1296420 1295470 1295386 84
XF1349 - 18 1296591 1296573 1296448 1296448 -
XF1350 + 5 1296784 1296789 1298645 1298645 -
XF1351 - 62 1298847 1298785 1298657 1296827 1830
XF1352 + 29 1298959 1298988 1299161 1299650 489
XF1354 + 3 1301817 1301820 1302257 1302377 120
XF1356 - 14 1303826 1303812 1303045 1303045 -
XF1359 + 30 1305695 1305725 1306888 - -
XF1360 + - - 1306885 1307796 1307890 94
XF1361 + 216 1308249 1308465 1309304 1309713 409
XF1362 - 12 1310923 1310911 1309661 1308433 1228
XF1364 - 47 1313328 1313281 1313126 - -
XF1365 - - - 1314563 1313682 1313562 120
XF1367 - 46 1315116 1315070 1314918 - -
XF1368 + 1 1315139 1315140 1316066 1316071 5
XF1370 + 18 1317263 1317281 1317439 1317472 33
XF1371 + - 1317583 1317583 1318617 1318637 20
XF1372 + 17 1318638 1318655 1320571 1320571 -
233
XF1373 + 41 1320572 1320613 1321386 - -
XF1374 + - - 1321356 1322045 1322140 95
XF1376 + 125 1323764 1323889 1324695 1324699 4
XF1377 + - 1324700 1324700 1324933 1325208 275
XF1378 - 6 1326324 1326318 1324927 1322628 2299
XF1379 + 26 1326490 1326516 1327481 1328166 685
XF1380 - - 1328158 1328158 1327682 1327377 305
XF1382 - 70 1330923 1330853 1330263 1330219 44
XF1383 + 661 1330237 1330898 1335298 1335816 518
XF1384 - 1201 1338053 1336852 1335311 1335228 83
XF1385 + 408 1336818 1337226 1340207 1340273 66
XF1386 + - 1340274 1340274 1340420 1340494 74
XF1387 - - - 1340914 1340573 1340571 2
XF1389 - - - 1343546 1341528 1341523 5
XF1390 - 91 1344569 1344478 1343519 - -
XF1391 - 3 1345943 1345940 1344942 1344604 338
XF1392 + 34 1346155 1346189 1346683 1346786 103
XF1397 + - 1348297 1348297 1349208 1349219 11
XF1398 + 31 1349464 1349495 1350715 1350715 -
XF1400 - 91 1351848 1351757 1351542 1351540 2
XF1401 - 139 1352928 1352789 1351956 1351925 31
XF1405 - - - 1356657 1355785 1355713 72
XF1406 - 109 1357713 1357604 1356654 - -
XF1407 - 20 1358240 1358220 1357870 1357715 155
XF1408 - - 1359666 1359666 1358278 1358271 7
XF1409 - - - 1360430 1359708 1359667 41
XF1413 - 20 1363091 1363071 1362070 1362070 -
234
XF1414 + 8 1363125 1363133 1363360 1363429 69
XF1416 + - - 1364704 1365006 1365113 107
XF1417 - 36 1365350 1365314 1365072 1365027 45
XF1418 - - 1365780 1365780 1365385 1365351 34
XF1420 + - - 1366827 1367027 1367033 6
XF1421 + - 1367034 1367034 1367222 1367759 537
XF1422 - - - 1367562 1367323 1367266 57
XF1423 - 5 1371536 1371531 1367563 - -
XF1429 + 327 1377353 1377680 1377838 1378529 691
XF1430 - - - 1378619 1377930 1377801 129
XF1433 + 37 1378963 1379000 1379095 1379206 111
XF1435 + 133 1380704 1380837 1380989 1381049 60
XF1436 + - 1381050 1381050 1381697 1381804 107
XF1437 + - 1381805 1381805 1382587 1382632 45
XF1438 + - 1382633 1382633 1383370 1383437 67
XF1439 - - - 1384093 1383479 1383351 128
XF1442 + 344 1385514 1385858 1386178 1386178 -
XF1443 + 130 1386181 1386311 1388587 1389170 583
XF1444 - 13 1388860 1388847 1388638 1388370 268
XF1445 - 32 1389170 1389138 1388920 1388919 1
XF1447 - 1 1391126 1391125 1389998 1389998 -
XF1448 - 681 1393208 1392527 1391562 1391357 205
XF1449 + 105 1392571 1392676 1392780 1392793 13
XF1450 + - 1392794 1392794 1395148 1395168 20
XF1451 + 2 1395331 1395333 1397243 1397286 43
XF1452 + 28 1397777 1397805 1398431 1398438 7
XF1453 + 28 1398528 1398556 1399923 1399939 16
235
XF1454 + 6 1399944 1399950 1400495 1400858 363
XF1456 + 15 1402645 1402660 1403289 1403300 11
XF1457 - 3 1404040 1404037 1403300 1402356 944
XF1458 + 21 1404103 1404124 1405308 - -
XF1459 + - - 1405296 1405712 1405721 9
XF1460 - - 1406751 1406751 1405732 1404856 876
XF1461 + 57 1407043 1407100 1407363 1407363 -
XF1466 - 816 1413117 1412301 1412152 1412136 16
XF1467 + 359 1412136 1412495 1413391 - -
XF1468 + - - 1413388 1414734 1414787 53
XF1469 - - - 1415672 1414818 1414797 21
XF1470 - 415 1417214 1416799 1415669 - -
XF1471 + 322 1416745 1417067 1417222 1417222 -
XF1478 + 57 1423322 1423379 1423798 1423798 -
XF1480 + - - 1426722 1427030 1427039 9
XF1483 + 23 1428563 1428586 1429470 1429740 270
XF1484 + 204 1429856 1430060 1430611 1430659 48
XF1485 + - 1430680 1430680 1432059 1432727 668
XF1486 - 582 1434212 1433630 1432275 1432242 33
XF1487 + 431 1433507 1433938 1434699 1434858 159
XF1488 + 37 1434869 1434906 1436921 1436921 -
XF1489 + 523 1436922 1437445 1438086 1438147 61
XF1490 - 35 1438876 1438841 1438362 1438316 46
XF1492 - 46 1440010 1439964 1439752 1439752 -
XF1493 + 75 1440371 1440446 1440862 1441385 523
XF1494 - 51 1443090 1443039 1442152 1441650 502
XF1495 - 7 1443544 1443537 1443091 1443091 -
236
XF1496 + 136 1443914 1444050 1446101 1446341 240
XF1500 + 15 1450864 1450879 1451832 - -
XF1501 + - - 1451832 1453814 1454246 432
XF1502 - 35 1454258 1454223 1453924 1453482 442
XF1504 - 25 1456040 1456015 1455152 1455123 29
XF1505 + 12 1456101 1456113 1456838 1456838 -
XF1506 + 54 1456865 1456919 1457533 1457533 -
XF1507 + - 1457756 1457756 1458907 1458969 62
XF1508 + 15 1458970 1458985 1461480 - -
XF1509 + - - 1461477 1461815 1461844 29
XF1510 - - 1462839 1462839 1461898 1461632 266
XF1517 + 192 1469345 1469537 1471288 1471323 35
XF1518 + - 1471324 1471324 1472541 1472669 128
XF1519 + 25 1472670 1472695 1473192 1473192 -
XF1520 + 5 1473193 1473198 1473704 - -
XF1526 + - - 1477297 1478064 1478068 4
XF1530 + 298 1487450 1487748 1488368 1488368 -
XF1531 + 71 1488375 1488446 1490161 1490223 62
XF1532 + - 1490224 1490224 1491201 1491326 125
XF1533 + - 1491327 1491327 1492016 1492332 316
XF1534 + - 1492333 1492333 1492575 1492642 67
XF1535 + 154 1492649 1492803 1494092 1495230 1138
XF1536 - 4 1494707 1494703 1494311 1491788 2523
XF1537 - 94 1495230 1495136 1494708 1494708 -
XF1538 + 1 1495356 1495357 1496010 1497114 1104
XF1539 - 1145 1498117 1496972 1496178 1495373 805
XF1541 + 94 1497805 1497899 1498072 1498079 7
237
XF1542 + 73 1498107 1498180 1498383 1498383 -
XF1544 + - - 1498643 1498813 1498891 78
XF1545 - 3 1499954 1499951 1499121 1498487 634
XF1546 + 26 1500315 1500341 1500508 1500514 6
XF1547 + 89 1500599 1500688 1501149 1501219 70
XF1548 - 400 1504173 1503773 1502301 1502279 22
XF1549 - 42 1505391 1505349 1504174 1504174 -
XF1550 - 15 1508235 1508220 1505392 1505392 -
XF1551 + 166 1508913 1509079 1509342 1509425 83
XF1552 - - 1510682 1510682 1509414 1508236 1178
XF1553 - - 1512220 1512220 1510853 1510824 29
XF1554 + 39 1512794 1512833 1514242 1514362 120
XF1555 - - 1515201 1515201 1514347 1512767 1580
XF1556 - - - 1515386 1515231 1515202 29
XF1562 + 29 1519107 1519136 1519402 - -
XF1563 + - - 1519389 1519727 1519779 52
XF1568 + 5 1521501 1521506 1521904 - -
XF1571 + - - 1523387 1524790 1525442 652
XF1572 - - - 1525120 1524839 1524651 188
XF1579 + 2 1529430 1529432 1529806 - -
XF1583 + - - 1531095 1532591 1532600 9
XF1588 - - 1536306 1536306 1535977 1535644 333
XF1589 - - - 1536873 1536445 1536307 138
XF1590 - 1 1537135 1537134 1536874 - -
XF1595 + - - 1539789 1540142 1540156 14
XF1596 - - - 1540497 1540198 1540157 41
XF1598 + 63 1540830 1540893 1541075 - -
238
XF1599 + - - 1541057 1541287 1543016 1729
XF1600 - 130 1542078 1541948 1541391 1541385 6
XF1602 - 8548 1552452 1543904 1543053 - -
XF1604 + 365 1544309 1544674 1545258 1545260 2
XF1606 + 2 1546886 1546888 1548240 - -
XF1608 + 38 1548477 1548515 1549150 1549234 84
XF1609 + 165 1549839 1550004 1551284 - -
XF1611 + - - 1552294 1553499 1553503 4
XF1612 - 3 1553723 1553720 1553568 1552953 615
XF1613 + 154 1553538 1553692 1553871 1554154 283
XF1616 - 177 1556497 1556320 1556201 - -
XF1619 + 44 1557900 1557944 1558099 1558099 -
XF1620 + 254 1558325 1558579 1559469 1559655 186
XF1621 - 5 1560968 1560963 1559596 1559391 205
XF1622 - 61 1561893 1561832 1561665 1561433 232
XF1623 + 430 1562025 1562455 1564359 1564359 -
XF1624 + 28 1564360 1564388 1565062 1565075 13
XF1625 + - 1565076 1565076 1566116 1566141 25
XF1627 + 16 1566901 1566917 1567834 1567869 35
XF1628 - 115 1568854 1568739 1567888 1567842 46
XF1629 - 1327 1570683 1569356 1568994 1568994 -
XF1630 + 224 1569281 1569505 1570554 1570554 -
XF1631 + 278 1570555 1570833 1570985 1572263 1278
XF1632 - - 1572201 1572201 1571071 1571009 62
XF1633 - 8 1573409 1573401 1572367 1572202 165
XF1634 - - 1573667 1573667 1573470 1573410 60
XF1635 - 70 1573965 1573895 1573767 1573668 99
239
XF1636 - 1888 1576154 1574266 1573991 1573966 25
XF1637 + 516 1574091 1574607 1575491 1575606 115
XF1638 - 6 1576985 1576979 1576155 1576155 -
XF1640 + - 1579527 1579527 1582703 1583800 1097
XF1641 - 148 1585767 1585619 1583028 1582267 761
XF1642 - - - 1586999 1585980 1585808 172
XF1643 - 18 1587264 1587246 1586989 - -
XF1644 - 18 1587738 1587720 1587265 1587265 -
XF1646 - - - 1589534 1588734 1588728 6
XF1650 - 6 1593335 1593329 1592955 1592945 10
XF1656 + 9 1595537 1595546 1595734 - -
XF1657 + - - 1595731 1596342 1596783 441
XF1658 - - 1597088 1597088 1596393 1596271 122
XF1659 - 151 1598250 1598099 1597134 1597134 -
XF1660 + 947 1597168 1598115 1598267 - -
XF1661 + - - 1598264 1598512 1598568 56
XF1662 + - 1598569 1598569 1598892 1598893 1
XF1665 + - - 1600510 1601598 1601807 209
XF1668 + 144 1603529 1603673 1604035 1604137 102
XF1676 + - - 1607753 1609156 1609893 737
XF1677 - - - 1609486 1609205 1608974 231
XF1678 - 61 1609882 1609821 1609483 - -
XF1684 + 2 1613796 1613798 1614172 - -
XF1688 + - - 1615461 1616957 1616966 9
XF1692 + - - 1617971 1619860 1620094 234
XF1693 + 13 1620114 1620127 1620366 1620366 -
XF1694 + 33 1620367 1620400 1620588 1621295 707
240
XF1695 - - 1620763 1620763 1620593 1620082 511
XF1696 - - 1621371 1621371 1621075 1620769 306
XF1701 + - - 1623962 1624315 1624859 544
XF1702 - - - 1624631 1624326 1624325 1
XF1706 + 3 1626732 1626735 1627898 1629986 2088
XF1707 - 32 1628442 1628410 1627931 1627547 384
XF1709 - 9 1629874 1629865 1629575 1629560 15
XF1710 + 93 1630083 1630176 1630508 1630701 193
XF1711 + - 1630703 1630703 1631056 1631332 276
XF1712 - 72 1632833 1632761 1631811 1631418 393
XF1714 - 384 1634079 1633695 1633153 - -
XF1715 + 809 1632875 1633684 1634505 1634638 133
XF1716 + 91 1634758 1634849 1637560 1638152 592
XF1717 - 318 1638715 1638397 1637597 1637491 106
XF1719 - - 1641621 1641621 1640956 1640902 54
XF1725 - 8 1645618 1645610 1645362 1645295 67
XF1755 + 11 1674470 1674481 1675110 1675110 -
XF1756 + 12 1675183 1675195 1675413 1675439 26
XF1757 - 16 1676094 1676078 1675818 1675816 2
XF1774 - 6 1694035 1694029 1690011 1690011 -
XF1777 + 236 1696375 1696611 1696781 1696781 -
XF1788 - - 1705285 1705285 1704782 1704770 12
XF1789 - 29 1705642 1705613 1705455 1705307 148
XF1790 + 383 1705285 1705668 1705781 1705836 55
XF1791 + 37 1705965 1706002 1706265 - -
XF1792 + - - 1706262 1706546 1706633 87
XF1793 - 450 1707511 1707061 1706753 1706710 43
241
XF1794 - - 1708375 1708375 1707749 1707588 161
XF1795 - - - 1709114 1708386 1708376 10
XF1796 - 275 1710339 1710064 1709111 - -
XF1797 - - - 1711638 1710469 1710340 129
XF1799 - 1922 1715502 1713580 1712663 - -
XF1800 + 459 1713511 1713970 1714455 1714456 1
XF1801 + 12 1714561 1714573 1715091 1715111 20
XF1802 + - 1715112 1715112 1716152 1716945 793
XF1803 - 84 1716946 1716862 1716290 1716290 -
XF1804 + - 1717816 1717816 1718697 1718884 187
XF1805 + - 1719045 1719045 1719215 1719552 337
XF1808 + 3 1722294 1722297 1722620 1722664 44
XF1809 + 1 1722674 1722675 1723409 1723470 61
XF1810 + - 1723471 1723471 1723815 1724599 784
XF1811 - 229 1724594 1724365 1723883 1723465 418
XF1813 - 552 1728809 1728257 1727304 1727289 15
XF1814 + 35 1728232 1728267 1730114 1730156 42
XF1816 + 50 1730779 1730829 1731023 1731023 -
XF1817 + 94 1731024 1731118 1732092 1733505 1413
XF1818 - - 1734144 1734144 1732585 1730086 2499
XF1819 - 27 1735368 1735341 1734199 1734186 13
XF1822 - 21 1738433 1738412 1737396 1737396 -
XF1823 - 135 1741373 1741238 1739055 1738794 261
XF1824 - - 1741564 1741564 1741403 1741379 24
XF1825 - 8 1742626 1742618 1741620 1741576 44
XF1826 + 298 1742370 1742668 1742871 1743809 938
XF1827 - - 1743299 1743299 1742868 1742866 2
242
XF1828 - - - 1744704 1743487 1743397 90
XF1830 - - 1746856 1746856 1745528 1745377 151
XF1831 - 35 1748061 1748026 1747175 1747077 98
XF1832 + 674 1747501 1748175 1748822 - -
XF1833 + - - 1748819 1750477 1751254 777
XF1834 - - 1751131 1751131 1750667 1750665 2
XF1835 - 15 1752550 1752535 1751330 1751275 55
XF1836 - - - 1753511 1752957 1752946 11
XF1838 - 10 1755336 1755326 1754397 1754360 37
XF1839 - 33 1755788 1755755 1755510 1755489 21
XF1840 + 435 1755388 1755823 1756536 1757536 1000
XF1841 - 5 1757477 1757472 1756687 1756687 -
XF1843 + 53 1759305 1759358 1759696 - -
XF1844 + - - 1759686 1761164 1761524 360
XF1845 - - 1761667 1761667 1761182 1761042 140
XF1846 - 10 1761883 1761873 1761703 1761668 35
XF1847 + 1 1761949 1761950 1762048 1762114 66
XF1848 - - - 1763617 1762190 1761935 255
XF1849 - 5 1764670 1764665 1763610 - -
XF1850 - 78 1765608 1765530 1765042 1764828 214
XF1851 + 65 1765667 1765732 1768734 1769220 486
XF1852 - 6 1769253 1769247 1768999 1768000 999
XF1853 + 329 1769322 1769651 1769839 - -
XF1854 + - - 1769836 1771446 1771452 6
XF1855 + 121 1771454 1771575 1773230 1773314 84
XF1856 - 13 1775207 1775194 1773425 1773424 1
XF1857 - 359 1775969 1775610 1775434 1775433 1
243
XF1858 + 169 1775460 1775629 1776393 1776434 41
XF1859 + 29 1776974 1777003 1778181 - -
XF1860 + - - 1778168 1778500 1778506 6
XF1861 + - 1778507 1778507 1778668 1778709 41
XF1862 - - - 1779086 1778757 1778742 15
XF1863 - 283 1779581 1779298 1779077 - -
XF1864 - 14 1780030 1780016 1779582 1779582 -
XF1870 + - - 1782890 1783960 1784441 481
XF1871 - 13 1784398 1784385 1784137 1783188 949
XF1872 - 1220 1785856 1784636 1784448 1784448 -
XF1873 + 6 1784953 1784959 1785306 1785323 17
XF1874 + 40 1785329 1785369 1785680 1786598 918
XF1878 - 21 1788741 1788720 1788499 1788499 -
XF1880 - 2 1789256 1789254 1788949 1788943 6
XF1885 - - 1791564 1791564 1791298 1791252 46
XF1886 - - 1792302 1792302 1791658 1791565 93
XF1887 - 158 1794675 1794517 1792367 1792303 64
XF1889 + 45 1796815 1796860 1797639 1797639 -
XF1890 - 68 1798273 1798205 1797633 1797633 -
XF1891 + 726 1797805 1798531 1800063 1800218 155
XF1892 - 62 1801006 1800944 1800225 1800225 -
XF1893 + - 1801044 1801044 1801793 1801795 2
XF1894 - - 1802575 1802575 1801892 1801840 52
XF1895 - - 1803408 1803408 1802593 1802576 17
XF1896 - - 1803972 1803972 1803412 1803409 3
XF1897 - 251 1805557 1805306 1804014 1803973 41
XF1900 - 9 1807875 1807866 1807093 1807060 33
244
XF1901 - - - 1808336 1807890 1807876 14
XF1903 - - 1811330 1811330 1809426 1809365 61
XF1904 - - 1811969 1811969 1811385 1811383 2
XF1905 - 94 1812670 1812576 1812055 1811970 85
XF1906 - 624 1814054 1813430 1812696 1812696 -
XF1907 + 2485 1811257 1813742 1813879 1814054 175
XF1909 - 65 1815595 1815530 1814457 - -
XF1910 - - 1816799 1816799 1815606 1815603 3
XF1911 + 6 1817361 1817367 1817840 1817840 -
XF1912 + 7 1818104 1818111 1818716 1818861 145
XF1913 - - 1819654 1819654 1818848 1816800 2048
XF1918 + 124 1823938 1824062 1824634 1824699 65
XF1919 + - 1824700 1824700 1825290 1825372 82
XF1920 - 7 1825767 1825760 1825482 1825482 -
XF1921 + 35 1825987 1826022 1826750 1826765 15
XF1922 - 78 1826995 1826917 1826795 1825870 925
XF1923 + 1 1827247 1827248 1828219 1828219 -
XF1924 + 4 1828228 1828232 1829770 1829771 1
XF1925 + - 1829772 1829772 1830641 1830701 60
XF1926 - - 1830771 1830771 1830613 1830236 377
XF1933 + 74 1836064 1836138 1836932 1836978 46
XF1935 + 138 1837857 1837995 1838633 1839162 529
XF1936 - - 1840683 1840683 1838683 1838623 60
XF1937 - 161 1842294 1842133 1840790 1840771 19
XF1938 + 12 1842281 1842293 1842412 1842427 15
XF1939 + - 1842428 1842428 1842559 1842819 260
XF1940 - 60 1843497 1843437 1842787 1842787 -
245
XF1941 - - 1844039 1844039 1843545 1843500 45
XF1942 - 27 1844315 1844288 1844193 1844186 7
XF1943 + - 1844716 1844716 1845108 1845296 188
XF1944 + 233 1845552 1845785 1847935 1848001 66
XF1945 - - 1848455 1848455 1848018 1845357 2661
XF1947 + 31 1850488 1850519 1851487 1851487 -
XF1948 + 77 1851488 1851565 1852266 1852337 71
XF1949 + - 1852338 1852338 1853795 1853830 35
XF1950 - - 1854655 1854655 1854185 1854081 104
XF1951 - 16 1855862 1855846 1854677 1854656 21
XF1955 - 378 1864550 1864172 1863756 1863740 16
XF1956 + 59 1864369 1864428 1865372 - -
XF1957 + - - 1865350 1866249 1866322 73
XF1958 + - 1866558 1866558 1867367 1869248 1881
XF1959 - 92 1869814 1869722 1867554 1867527 27
XF1960 - 23 1870761 1870738 1869815 1869815 -
XF1961 - 52 1872738 1872686 1871049 1871049 -
XF1963 - 204 1873571 1873367 1873134 1873088 46
XF1964 + 139 1873419 1873558 1873941 1873941 -
XF1968 - 30 1879582 1879552 1877948 - -
XF1970 - 28 1881133 1881105 1880089 1879917 172
XF1971 - 7 1881575 1881568 1881257 1881219 38
XF1972 + 11 1881791 1881802 1882248 1882262 14
XF1973 + 7 1882638 1882645 1883037 1883060 23
XF1974 - 2 1883296 1883294 1883067 1882665 402
XF1975 + 352 1883131 1883483 1885207 1885287 80
XF1976 + - 1885366 1885366 1886679 1886691 12
246
XF1978 + - - 1887189 1889411 1889637 226
XF1979 - 510 1891037 1890527 1889583 1888903 680
XF1980 + 44 1890585 1890629 1891003 1891015 12
XF1981 - 246 1894833 1894587 1891180 1891178 2
XF1983 + - 1895679 1895679 1896299 1896319 20
XF1985 - - 1898930 1898930 1898181 1898145 36
XF1986 - - 1899336 1899336 1899019 1898931 88
XF1987 - - 1901898 1901898 1899481 1899403 78
XF1988 - - 1902029 1902029 1901910 1901899 11
XF1989 - 74 1903390 1903316 1902087 1902030 57
XF1990 - 62 1904317 1904255 1903620 1903494 126
XF1991 - 380 1905051 1904671 1904318 1904318 -
XF1992 + 2145 1903139 1905284 1906480 1906500 20
XF1993 - - - 1907863 1906829 1906818 11
XF1994 - 15 1908750 1908735 1907860 - -
XF1995 - 18 1910063 1910045 1908774 1908751 23
XF1999 - - 1913242 1913242 1912154 1912114 40
XF2000 - 21 1913888 1913867 1913316 1913292 24
XF2001 + - 1913995 1913995 1914420 1914508 88
XF2002 - - 1914828 1914828 1914667 1914621 46
XF2003 - 14 1915191 1915177 1914944 1914944 -
XF2004 + 18 1915378 1915396 1916049 1916086 37
XF2005 - 172 1917604 1917432 1916095 1915870 225
XF2006 + 10 1917402 1917412 1917573 1917581 8
XF2007 + - 1917643 1917643 1918218 1918228 10
XF2008 + - 1918400 1918400 1919053 1921084 2031
XF2009 - - - 1920517 1919177 1918477 700
247
XF2010 - 135 1921206 1921071 1920514 - -
XF2011 + 5 1921259 1921264 1921485 - -
XF2012 + - - 1921482 1921781 1922201 420
XF2013 + 48 1922235 1922283 1922894 1922894 -
XF2014 + 5 1922910 1922915 1923358 1923387 29
XF2015 + 22 1923399 1923421 1924068 1924068 -
XF2016 + 196 1924090 1924286 1924501 1924850 349
XF2017 - 331 1925424 1925093 1924521 1924453 68
XF2018 + 101 1925221 1925322 1925447 1925576 129
XF2019 - 387 1927468 1927081 1925444 1925444 -
XF2020 + 775 1926666 1927441 1927737 1927876 139
XF2021 - 11 1929357 1929346 1928048 1927996 52
XF2025 + 67 1932813 1932880 1933971 1933971 -
XF2026 + 3 1933972 1933975 1934082 1934105 23
XF2027 - - 1934821 1934821 1934189 1933973 216
XF2028 - 1 1935500 1935499 1934942 1934934 8
XF2033 + - - 1937083 1937304 1938116 812
XF2034 - - 1938778 1938778 1937477 1936853 624
XF2035 - - - 1939139 1938855 1938847 8
XF2038 - 7 1941920 1941913 1941263 - -
XF2040 - - 1943881 1943881 1942781 1942779 2
XF2041 - - 1944647 1944647 1943886 1943882 4
XF2042 - 363 1945749 1945386 1944658 1944648 10
XF2043 - 18 1946312 1946294 1945929 1945929 -
XF2045 - - 1948432 1948432 1947827 1947814 13
XF2046 - - 1949832 1949832 1948438 1948433 5
XF2047 - 31 1950103 1950072 1949836 1949833 3