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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
ANGÉLICA MARÍA CALDERA DÍAZ
Produção de óleo microbiano por leveduras em reatores do tipo coluna
de bolhas
Lorena
2015
ANGÉLICA MARÍA CALDERA DÍAZ
Produção de óleo microbiano por leveduras em reatores do tipo coluna
de bolhas
Projeto de Monografia apresentado como
estudante de intercâmbio à Escola de Engenharia de
Lorena da Universidade de São Paulo como requisito
parcial para a conclusão do curso de graduação em
Engenharia Química na Universidade Simón Bolívar.
Área de Concentração: Fenômenos de
transporte e Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. João Paulo Alves Silva
Lorena
2015
AGRADECIMENTOS
À Deus todo-poderoso por ter me dado saúde para que pudesse realizar este
intercambio no Brasil apesar de todas as adversidades que se me presentaram. Por não
desamparar-me nos momentos de crises mostrando-me as soluções a meus problemas.
À minha mãe por ser meu apoio incondicional sem importar a distância e fazer de
mim uma pessoa perseverante com a capacidade de resolver qualquer desafio. Ela é minha
razão de ser e a que me dá às forças de seguir lutando e alcançar minhas metas.
A meu pai e a minha tia Ruth por emprestar-me seu apoio econômico para poder vir
ao Brasil para acrescentar meus conhecimentos profissionais.
Às minhas irmãs, Katherine e Keila, pelo o grande apoio e amor incondicional e por
ser meus dois grandes exemplos a seguir. Katherine obrigada por acrescentar meus
conhecimentos professionais. Keila obrigada por me ajudar com tua criatividade, tempo e
paciência para melhorar meus trabalhos e apresentações ao longo de meu curso.
A meu tio Alexander e a meus avos, Ovidio e Yolanda pelo ser meus segundos pais e
por ter me dado um espaço em sua casa durante meus estudos. Ovidio graças por ensinar-me
a ser uma pessoa integra que deve conhecer de sua história para poder julgar seu pressente
de melhorar seu futuro. Yolanda tem sido minha segunda mãe em todo momento, obrigada
por tudo seu apoio e por sempre acreditar em mim. Alexander obrigada por ser meu pai, tio
e amigo, é um três em um.
A Bleyth Ugueto, meu namorado e dentre de uns anos meu futuro esposo, por todos
estes anos de amor incondicional, apoio e compreensão desde começos de meu curso até
hoje na distância. Obrigada por acreditar em mim até em momentos que eu nem acredito. Te
amo!
Ao professor João Paulo Alves Silva, pelos ensinamentos, dedicação e orientação ao
longo de todo este ano. Obrigada por me permitir desenvolver este projeto numa área antes
desconhecida para mim.
Aos amigos, Gustavo Amundaray, Angélica Golcalvez e Mariana Peña, pela grande
ajuda econômica ao começo deste intercambio.
À minhas amigas da republica FDK (Mariana, Marianne, Fernanda, Giovanna,
Tainah e Gabi), por todo este ano de convivência e compressão para mim. Foram minha
família no Brasil e eu lhes agradeço.
Aos colegas do departamento (Bruna, Camila, Vitor, Natalia, Tatiane e Letícia) pela
grande colaboração no laboratório durante meus experimentos.
RESUMO
DIAZ, A. M. C. Produção de óleo microbiano por leveduras em reatores tipo coluna de
bolhas. 2015, 54 p. Projeto de Monografia (Trabalho de conclusão de curso I) – Escola de
Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2015.
Grande parte da energia que se utiliza atualmente é proveniente do petróleo, carvão e gás
natural, sendo estes recursos não renováveis. O uso destes combustíveis não renováveis têm
consequências ambientais, como a emissão de gases do efeito estufa. Desta forma há uma busca
frequente por fontes de energias renováveis que possam substituir os combustíveis de origem fóssil.
Diversos setores da atividade humana têm procurado alternativas para combustíveis derivados do
petróleo, no setor automotivo vem se destacando biocombustíveis como o etanol e o biodiesel. O
biodiesel é um combustível obtido pelo processo de transesterificação de óleos e gorduras, no qual os
ácidos graxos são convertidos a ésteres de etila ou metila. A maior parte do biodiesel produzido tem
como matéria prima óleos de origem vegetal, entretanto o uso de tais matérias primas apresenta
desvantagens como a sazonalidade no cultivo, e a competição com a produção de alimentos no uso de
terras agrícolas. Uma alternativa aos óleos vegetais são os óleos microbianos, como os produzidos por
microalgas, fungos e leveduras. A produção de lipídeos por de leveduras constitui uma fonte
interessante de matéria-prima renovável para a produção de biocombustíveis, já que a velocidade de
crescimento dos microrganismos é superior a reportada para microalgas. Além disso, é independente
das mudanças climáticas e a sazonalidade, diferentemente das culturas vegetais. Para uma produção de
óleos microbianos por leveduras são necessárias condições adequadas de cultivo. Este trabalho teve
como objetivo avaliar a produção de óleo microbiano por leveduras em reatores do tipo coluna de
bolhas. A fim de produzir óleo microbiano, primeiramente foram realizados estudos para selecionar a
levedura com maior capacidade de produção de lipídeos utilizando-se glicerol como substrato. Nesta
etapa foram comparadas cinco leveduras (Cryptococcus curvatus Y -1511, Lipomyces starkeyi
Y-27493, Rhodotorula glutinis Y- 12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 e Rhodotorula
mucilaginosa Y-27053). Os estudos permitiram verificar que as cinco cepas avaliadas foram capazes
de consumir substrato, crescer e produzir lipídeos, embora este último parâmetro variou
significativamente de uma levedura a outra. As leveduras Rhodotorula glutinis Y- 12905 e
Cryptococcus curvatus Y -1511 apresentaram as maiores produtividades volumétricas em lipídeos
assim como os maiores acúmulos de biomassa, sendo os valores 0,20 e 0,23 g/L.h para as
produtividades em lipídeos e 23,9 e 18,6 g/L para a concentração celular, respectivamente. No entanto,
a R. glutinis se destacou em relação às demais por sua capacidade de consumo de glicerol (até 59% de
substrato em 120 horas de cultivo), esta levedura foi selecionada como a mais promissora para a
produção de lipídeos utilizando como fonte de carbono o glicerol. Posteriormente foram feitos estudos
para avaliar a influência da condição aeração sobre a produção de lipídeos, biomassa e o crescimento
celular, utilizando 4 reatores tipo coluna de bolhas variando as condições de aeração (0,5, 1,0, 1,5 e
2,5 vvm). Nestes estudos verificou-se que em todas as condições avaliadas houve uma baixa produção
de lipídeos. Verificou se ainda que o maior acúmulo de lipídeo foi obtido para a condição de 1,0 vvm
de aeração (kLa = 2,8 h-1
). O coeficiente de transferência de oxigênio (kLa) foi utilizado como
parâmetro para realizar ampliação de escala do reator de 400 mL para 2 L. Em uma maior escala
também foi verificado um baixo acúmulo de lipídeos e baixo consumo de substrato. O acúmulo de
lipídeos e o baixo consumo de substrato podem indicar que a faixa de variação empregada para o
estudo de condição de aeração está distante da condição ideal para promover o acúmulo de óleos
microbianos nesta levedura, sendo necessária a realização de mais estudos visando estabelecer as
condições ideais.
Palavras-Chave: Coluna de bolhas; Glicerol; Lipídeo microbiano.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Padrões de acumulação de lipídeos em leveduras com o esgotamento de fontes de
nitrogênio (a) e padrão de acúmulo apresentado Cryptococcus terricolus, sendo uma
exceção entre as leveduras por acumular lipídeos sem esta limitação (b). ............................ 16
Figura 2 - Esquema do reator tipo coluna de bolhas com fluxo concorrente. ....................... 19
Figura 3 - Modelo de circulação de líquido no reator tipo coluna de bolhas. Fluxo de
circulação axial (a) e fluxo de circulação radial (b) ............................................................... 20
Figura 4 - Regime dos fluxos. (a) homogêneo (b) transição (c) heterogêneo e (d) Slug. ...... 21
Figura 5 - Perfil de retenção de líquido para diferentes regimes do fluxo. ............................ 22
Figura 6 - Regime de fluxo de acordo com o diâmetro da coluna. ........................................ 23
Figura 7 - Esquema de transferência de oxigênio desde a bolha de ar até a célula. .............. 24
Figura 9 - Curvas de calibração de absorbância a 600 nm em função da concentração celular
para as leveduras (a) Rhodotorula mucilaginosa Y – 27053; (b) Rhodosporidium toruloides
Y – 1091; (c) Rhodotorula glutinis Y – 12905; (d) Cryptococcus curvatus Y – 1511 e
Lipomyces starkeyi Y-27493 (e). ........................................................................................... 35
Figura 10 - Curva de calibração para determinação do teor de lipídio .................................. 36
Figura 11 - Curva de crescimento celular (A), produção de lipídeos (B) e consumo de
glicerol (C), obtidas nas fermentações utilizando glicerol como substrato. .......................... 39
Figura 12 - Curvas de crescimento celular (A), produção de lipídeos (B) e consumo glicerol
(C), obtidas nas fermentações utilizando diferentes vazões de ar. ........................................ 43
Figura 13 - Curva de crescimento celular (A), produção de lipídeos (B) e consumo de
glicerol (C), obtidas nas fermentações utilizando glicerol como substrato e o coeficiente
volumétrico de transferência de oxigênio de 1,9 h-1
. ............................................................. 46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição de ácidos graxos dos lipídeos de diferentes leveduras.................... 14
Tabela 2 - Fontes de carbono para a acumulação de lipídeos em leveduras......................... 15
Tabela 3 - Composição do meio de cultura .......................................................................... 29
Tabela 4 - Dados das curvas de calibração para as cinco espécies de leveduras. ................. 34
Tabela 5 - Concentrações de glicerol e as áreas correspondentes observadas nos
cromatogramas, assim como a curva de calibração para determinação e glicerol por
cromatografia líquida de alta eficiência. ................................................................................ 38
Tabela 6 - Parâmetros fermentativos para a seleção da levedura. ........................................ 40
Tabela 7 - Parâmetros fermentativos para os cultivos da levedura Rhodotorula glutinis em
biorreator do tipo coluna de bolhas. ....................................................................................... 44
Tabela 8 - Parâmetros fermentativos durante os cultivos realizados no reator de 2,0 L com
um kLa = 1,9 h-1
. .................................................................................................................... 47
LISTA DE SIGLAS
AMP Adenosina monofosfato desaminase
ARA Ácido araquidônico
C/N Razão carbono nitrogênio
CoA Coenzima A
EPA Ácido eicosapentaenoico
GHA Ácido docosaexaenoico
GLA Ômega-6
MUFAs Monounsaturated fatty acids (ácidos graxos monoinsaturados)
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
PUFAs Polyunsaturated fatty acids (ácidos graxos polinsaturados)
SCO Single cell oil (Óleo microbiano)
TGC Triglicerídeos
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS .................................................................................................................. 8
SUMARIO ................................................................................................................................. 9
UMARIO ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.
1. INTRODUÇÃO e justificativa ........................................................................................... 10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 12
2.1 ÓLEOS MICROBIANOS ................................................................................................... 12
APLICAÇÕES DO ÓLEO MICROBIANO ............................................................................. 12
ÓLEOS MICROBIANOS DE LEVEDURAS ......................................................................... 13
2.2. PRODUÇÃO DE LIPÍDEO .............................................................................................. 14
FONTE DE CARBONO ........................................................................................................... 14
FONTE DE NITROGÊNIO ...................................................................................................... 15
2.3 BIORREATORES NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS ........................................... 17
REATORES TIPO COLUNA DE BOLHAS ........................................................................... 18
2.4 CONDIÇÕES HIDRODINÂMICAS ................................................................................. 19
REGIME DE FLUXO .............................................................................................................. 19
DIÂMETRO DA COLUNA ..................................................................................................... 22
2.5 TRANSPORTE DE OXIGÊNIO ........................................................................................ 23
RESISTENCIA À TRANSFERÊNCIA DE OXIGÊNIO ........................................................ 24
2.6 TEORIA DE PELÍCULA ................................................................................................... 25
3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 27
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 27
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 27
4. materiais e métodos ............................................................................................................ 28
4.1 PROCESSO FERMENTATIVO ........................................................................................ 28
MICRORGANISMOS UTILIZADOS ..................................................................................... 28
PREPARO DE INÓCULO E MEIO DE CULTURA PARA A SELEÇÃO DA LEVEDURA28
SELEÇÃO DA LEVEDURA PRODUTO DE LIPÍDEO ........................................................ 29
4. 2 CULTIVOS REALIZADOS EM REATORES TIPO COLUNA DE BOLHAS .............. 29
AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AERAÇÃO ............................................................... 29
AVALIAÇÃO DO AUMENTO DE ESCALA ....................................................................... 30
DETERMINAÇÃO DO kLa .................................................................................................... 30
4.3 MÉTODOS ANALÍTICOS ................................................................................................ 31
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA .............................................. 31
QUANTIFICAÇÃO DE LIPÍDEOS TOTAIS NA BIOMASSA ............................................. 31
MÉTODO GRAVIMÉTRICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE LIPÍDEOS TOTAIS NA
BIOMASSA .............................................................................................................................. 32
DETERMINAÇÃO DE GLICEROL POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA ............................................................................................................................ 32
4.4 ANÁLISE DE RESULTADOS .......................................................................................... 33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 34
5.1. ADEQUAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS .............................................. 34
DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO CELULAR POR ESPECTROFOTOMETRIA34
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE LÍPÍDIOS .................................................. 36
OBTENÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA ANÁLISE DE GLICEROL POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ..................................................... 37
5.2 SELEÇÃO DE LEVEDURA .............................................................................................. 38
5.3 EFEITO DA AERAÇÃO NO CRESCIMENTO CELULAR, ACÚMULO DE
LIPÍDEOS E CONSUMO DE SUBSTRATO. ......................................................................... 41
5.4 AMPLIAÇÃO DE ESCALA DO REATOR MANTENDO O KLa ................................... 44
6. CONCLUsõES .................................................................................................................... 48
8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 50
APÊNDICES ........................................................................................................................... 53
10
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A procura de fontes alternativas para a produção de energias que possam substituir
os combustíveis fósseis, e assim minimizar as consequências negativas que a utilização
destes acarretam ao ambiente, tem estimulado pesquisas visando a obtenção de
combustíveis renováveis como o etanol e o biodiesel.
O biodiesel é um combustível biodegradável, não tóxico e de baixa contaminação,
que é produzido pelo processo de transesterificação de óleos vegetais e gorduras animais,
onde estes compostos graxos são convertidos a ésteres de etila ou metila. Entretanto,
aspectos como o custo do óleo vegetal, a necessidade de grandes extensões de áreas
agrícolas, grandes períodos de tempo de cultivo, mudanças climáticas e sazonalidade no
cultivo, tem tornado desfavorável o uso destes óleos vegetais como matéria prima para
produção de biodiesel. Uma matéria prima alternativa são os óleos microbianos, como os
produzidos por microalgas, fungos e leveduras.
A produção de lipídios por leveduras constitui uma fonte interessante de matéria-
prima renovável para a produção de biocombustíveis, pois a velocidade de crescimento das
leveduras é muito maior quando comparada com microalgas, e também é independente das
mudanças climáticas e sazonalidade, ao contrário das culturas vegetais. Os óleos extraídos
dos microrganismos são conhecidos como SCO (Single cell oil) e sua utilização como
matéria prima para biodiesel se remonta à primeira metade do século XX.
O óleo microbiano produzido por leveduras pode ser empregado em diferentes
aplicações. Além do uso como matéria-prima para produção de biodisel, também pode ser
utilizado como surfactante natural, nutracêutico, e na indústria de alimentos e de
cosméticos de modo geral.
Para a produção de lipídeos são necessárias condições adequadas de cultivo tais
como a disponibilidade de nutrientes no meio de cultivo, associada com a limitação de
determinado nutriente, geralmente quantidades limitadas de nitrogênio. O perfil lipídico
para as leveduras varia de espécie para espécie e estas podem chegar a armazenar até 70%
de sua biomassa em lipídeos. As fontes de carbono mais utilizadas são a glicose e o
glicerol. Este último é o principal subproduto da produção de biodiesel e corresponde a
uma alternativa promissora como fonte de carbono nos processos fermentativos, por sua
grande disponibilidade e seu baixo valor econômico.
11
Outro aspecto importante, quando se trabalha com processos fermentativos, refere-
se à capacidade para cultivar uma considerável quantidade de microrganismos e isto é
possível com o uso de grandes recipientes conhecidos como biorreatores ou fermentadores.
Um tipo destes biorreatores é o reator tipo coluna de bolhas, o qual apresenta baixos custos
operacionais comparados com os outros reatores, pouca manutenção por não possuir partes
removíveis, tem grande durabilidade de seus componentes, além de proporcionar excelente
transferência de massa e calor.
Dentro deste contesto o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a
produção de óleos microbianos por leveduras em reatores do tipo coluna de bolhas
empregando o glicerol como substrato. Para isso foram realizados estudos para seleção de
leveduras capazes de produzir e acumular lipídeos a partir de glicerol assim como estudos
em biorreatores avaliando a taxa de aeração sobre a produção de lipídeos.
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 ÓLEOS MICROBIANOS
O óleo microbiano, também conhecido como SCO (single cell oil ), é aquele obtido
por microrganismos, visto que em geral sua estrutura é similar aos óleos vegetais e animais
(COHEN; RATLEDGE, 2005). Os microrganismos podem ser microrganismos
procariotos, que não apresentam membrana ao redor do núcleo como as bactérias, ou
eucariotos, que possuem um núcleo definido separado do citoplasma. As algas, fungos e
leveduras constituem este grupo.
Nem todos os microrganismos podem ser considerados como fontes de lipídeos.
Dentro dos microrganismos mais estudados para a produção de lipídeos se encontram as
microalgas, fungos oleaginosos e as leveduras oleaginosas, pois são capazes de acumular
20% ou mais de sua biomassa em lipídeos, geralmente em forma de triglicerídeos TGC
(FAIFE; OTERO; ALVAREZ, 2012). Em relação aos óleos animais e vegetais, os
microrganismos apresentam vantagens potenciais como fontes de lipídeos por sua grande
velocidade de geração, grandes variedades de matérias-primas e de baixo custo, requerem
menores áreas de produção, para uma mesma quantidade de lipídeos e controles mais
simples para a produção, não tem influência de mudanças climáticas e são adequados para
a fermentação em grande escala (FAIFE; OTERO; ALVAREZ., 2012).
APLICAÇÕES DO ÓLEO MICROBIANO
As aplicações de óleos microbianos podem depender do perfil de ácido graxo do
óleo, o qual está relacionado às condições de cultivo e ao tipo de microrganismo. Embora
muitos microrganismos sejam capazes de produzir SCO, há um grande interesse pelos
microrganismos que tem a capacidade de acumular lipídeos especiais, tais como ácido
araquidônico (ARA), eicosapentanóico (EPA), ômega-6 (GLA) e docosaexanóico (DHA)
(LIANG; JIANG.,2013). Estes ácidos graxos têm aplicações importantes como fonte
13
nutricional para produção de suplementos alimentares para gestantes, recém-nascidos e
prematuros (COHEN; RATLEDGE.,2005).
Outra aplicação muito importante da produção de SCOs é a fabricação de
combustíveis, como o biodiesel, o qual pode ser utilizado nos motores diesel sem qualquer
alteração. Os óleos microbianos podem ser uma fonte lipídica para este fim por ser
compostos de Triglicerídeos (TGC). Contudo, há pouca informação sobre a produção de
biodiesel utilizando óleos fúngicos. As bactérias são capazes de produzir outros materiais
como reserva energética como o poli-hidroxi-butirato (alcanoato) (DA ROSA, 2014),
portanto o acúmulo de TGC fica restrito para as leveduras, fungos filamentosos e algumas
algas. Entretanto, como se conhece muitos genes de bactérias que participam na síntese de
ácidos graxos, pode-se aumentar sua acumulação modificando sua composição
caraterística com técnicas de engenharia biológica, genética e metabólica (ALVAREZ,
STEINBUCHEL, 2002; KALSCHEUER et al., 2006; ELLINGSEN et al., 2007).
ÓLEOS MICROBIANOS DE LEVEDURAS
Dentre as leveduras mais promissoras para a produção de lipídeos se encontram os
seguintes gêneros: Candida, Lipomyces, Rhodospiridium, Rodotorula, Saccharomyces,
Torulopsis e Trichosporon (AQUARONE et al; 2001; AGEITOS et al,2011). Embora estas
espécies sejam consideradas oleaginosas podem ainda ser subdivididas em altas produtoras
de lipídeos e baixas produtoras de lipídeos (RATTRAY,1989). As leveduras
Saccharomyces cerevisiae e Candida utilis só acumulan lipídeos até 10% de sua massa
celular, enquanto gêneros como Rodotorula e Lipomyces são capazes de acumular até um
70% de sua biomassa como lipídeos (RATTRAY, 1989).
Os lipídeos produzidos por leveduras estão constituídos principalmente por ácidos
graxos monoinsaturados (MUFAs) e polinsaturados (PUFAs), tais como ácido palmítico
(C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1), linoleico (C18:2), linolênico (C18:3) e mirístico
(C14:0), que são as principais matérias primas para produção do biodiesel (EL-FADALY
et al., 2009; PAPANIKOLAOU, AGGELIS, 2011). Na Tabela 1 se mostra a composição
de ácidos graxos dos lipídeos produzidos por algumas leveduras oleaginosas.
14
Tabela 1 - Composição de ácidos graxos dos lipídeos de diferentes leveduras.
Principais ácidos graxos (% w/w)
Levedura
Teor
Lipídico
(% w/w)
16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 Outros
Cryptococcus curvatus 58 32 ---- 15 44 8
Lipomyces starkeyi 63 34 6 5 51 3
Rhodosporidium
toruloides 66 18 3 3 66 -----
23:0 (3%)
24:0 (6%)
Rhodotorula graminis 72 37 1 3 47 8
Rhodotorula graminis 36 30 2 12 36 15
Yarrowia lipolytica 36 11 6 1 28 51
Fonte. RATLEDGE C (2001)
2.2. PRODUÇÃO DE LIPÍDEO
O rendimento da síntese lipídica depende da presença de nutrientes no meio de
cultivo para atender a demanda nutricional do microrganismo. A composição nutricional é
um parâmetro importante para a produção de lipídeos uma vez que existe um desequilíbrio
entre os componentes nutricionais, ou seja, quando a célula esgota um nutriente-chave,
usualmente o nitrogênio, a assimilação da fonte de carbono em excesso é destinada para a
produção de gordura em forma de TGC. Desta forma a relação carbono/nitrogênio (C/N) é
sumamente importante para a acumulação de lipídeos nos microrganismos.
FONTE DE CARBONO
Embora a relação C/N seja importante para a produção de lipídeos o tipo da fonte
de carbono pode influenciar na produção. Muitos compostos, especialmente os açúcares,
podem causar repressão catabólica de várias enzimas e diminuir a velocidade de
15
crescimento de alguns microrganismos (LILLY, 1979). Por outro lado, para fins
econômicos é necessário encontrar fontes de carbono mais baratas e diferentes da glicose
para obter um óleo com maior competitividade econômica. Segundo a literatura, algumas
fontes de carbono possíveis de serem utilizadas para a produção de lipídeos por leveduras
são glicose, xilose, glicerol, amido, hidrolisados de celulose e de resíduos orgânicos
industriais como glicerol (tabela 2).
Tabela 2 - Fontes de carbono para a acumulação de lipídeos em leveduras.
Espécie Fonte de Carbono Conteúdo de
lipídeos (%)
L starkeyi Xilose 52,6
C potothecoides Amido hidrolisado 46,1
T cutaneun Hidrolisado de Spartina anglica 46,3
C curvatus Glicerol 25,0
C echinula Residuos de fécula de batata 37,6
Fonte. FAIFE, OTERO e ALVAREZ, (2012).
FONTE DE NITROGÊNIO
O acúmulo de lipídeos em microrganismos está associado à limitação de algum
nutriente, sendo utilizada nas maiorias dos casos a limitação de nitrogênio no meio de
cultivo. A limitação de nitrogênio induz uma série de eventos bioquímicos que permitem
esta produção lipídica. Inicialmente há uma forte diminuição na concentração de AMP
devido a um incremento na atividade da enzima AMP desaminase na célula. Tudo isto
afeta a atividade da enzima isocitrato desidrogenase na mitocôndria, a qual é dependente
da AMP nos microrganismos oleaginosos. Então, o isocitrato já não é metabolizado via
ciclo de ácido tricarboxílico, e é equilibrado por citrato via ação da enzima aconitase,
havendo acúmulo de citrato na mitocôndria. Logo, o citrato é expulso da mitocôndria,
onde foi formado, por meio de um sistema de efluxo, entrando no citossol para ser usado
pela ATP citratro liase na formação de oxalacetato e acetil- CoA, que são utilizado para a
síntese de ácidos graxos. O oxalacetato é convertido em malato no citossol e utilizado no
sistema de efluxo para a saída do citrato da mitocôndria (RATLEDGE; WYNN, 2002).
16
Na Figura 1.A é mostrado o padrão de acumulação de lipídeos em leveduras
quando se tem concentrações limitadas de nitrogênio no médio de cultivo. É importante
ressaltar que a levedura Cryptococcus terricolus não precisa ter quantidades limitadas de
nitrogênio para começar seu armazenamento de lipídeos (figura 1.b), sendo esta uma
exceção entre as leveduras.
Figura 1- Padrões de acumulação de lipídeos em leveduras com o esgotamento de fontes
de nitrogênio (a) e padrão de acúmulo apresentado Cryptococcus terricolus, sendo uma
exceção entre as leveduras por acumular lipídeos sem esta limitação (b).
Fonte. RATLEDGE E WYNN, (2002).
17
Severo Poli (2014) e Aquarone et. al (2001) relataram que existe uma relação entre
síntese de lipídeos e a presença da enzima ATP citrato liase, a qual não é encontrada em
leveduras não oleaginosas. Desta forma o acúmulo de lipídeos somente ocorre em
leveduras que possuem esta enzima. Para que exista esta síntese é necessário um
suprimento de acetil-CoA e de outro componente essencial que é o NADPH, produzido nos
microrganismos via enzima málica.
Na literatura a relação entre a conversão na síntese lipídica e a presença de
nutrientes no meio de cultivo é confusa, já que a concentração de nutrientes que é ótima
para uma levedura não é ótima para outra. Algumas espécies aumentam a velocidade de
sínteses de lipídeos com a adição de fosfato no meio, entretanto a levedura Saccharomyces
erhoberg não tem o mesmo comportamento. Existem algumas leveduras como
Rhodotorula gracilis que, além da limitação de nitrogênio no meio, a redução do
fornecimento de fósforo, diminui o crescimento durante a fase da síntese lipídica, e um
aumento da quantidade de nitrogênio e fósforo aumenta o crescimento e baixa
decomposição de matéria graxa. (AQUARONE et al., 2001)
Por outro lado, estudos com a levedura Rhodosporidium toruloides demostram que
a limitação de fósforo tem influência sobre o acúmulo de lipídeos e a quantidade de
nitrogênio não tem nenhuma influência (WU et al, 2011).
Além disso, as fases de crescimento também podem influenciar na produção de
lipídeos, já que o acúmulo de TGC ocorre na fase estacionária. A adição de sais minerais e
as condições de cultura como temperatura, pH e fornecimento de oxigênio exercem
influência marcante no acúmulo de matéria graxa (AQUARONE et al; 2001). Tem sido
relatado que o aumento da concentração do oxigênio dissolvido tem uma correlação
positiva com a acumulação de lipídeos (EL-FAD ALY et al., 2009; DAVIES, READER,
HOLDSWORTH, 1990).
2.3 BIORREATORES NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS
Quando se trabalha com processos fermentativos, precisa-se de uma grande
capacidade para cultivar uma considerável quantidade de microrganismos, e isto é possível
com o uso de grandes recipientes conhecidos como biorreatores ou fermentadores. Neles
18
ocorre uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores, que podem ser
enzimas ou células microbianas, animais ou vegetais, que tenham sua capacidade
metabólica mantida. Os biorreatores com microrganismos são os mais utilizados, desde
1940, são empregados na produção industrial de diversos produtos como enzimas,
antibióticos, vitaminas, ácidos orgânicos, além do tratamento de resíduos industriais ou
domésticos. Vale ressaltar que os reatores que empregam microrganismos podem ter
características diferentes, quanto à transferência de massa, calor e quantidade de
movimento, dependendo do tipo de microrganismo utilizado (AQUARONE, et al., 2001)
REATORES TIPO COLUNA DE BOLHAS
Os reatores tipo coluna de bolhas pertencem à família de reatores agitados
pneumaticamente, caracterizando-se pela ausência do agitador mecânico e por apresentar
borbulhamento de um gás, geralmente ar, em seu interior. São formados por um recipiente
cilíndrico, dotado de um mecanismo de distribuição de ar no fundo (figura 3) para
propósitos de mistura com menos gastos de energia que a agitação mecânica. Apresentam
uma relação altura / diâmetro de 2 a 5 para processos bioquímicos, sendo a altura uma
variável de desenho importante, já que tem influência no processo devido ao tempo de
residência do gás, especialmente para condições operacionais descontínuas ou
semicontínuas. Nos reatores muito altos se tem uma elevada pressão hidrostática próxima à
sua base e uma alta produção de gás. Algumas vezes se instalam placas perfuradas para
evitar a coalescência das bolhas e obter uma melhor redistribuição do ar.
Entre as vantagens destes reatores estão os baixos custos operacionais comparados
com os outros reatores, pouca manutenção devido à ausência de partes móveis, apresentam
grande durabilidade de seus componentes, além de proporcionar excelente transferência de
massa e calor. Além disso, possuem menos tensões de cisalhamento por conta da ausência
do agitador mecânico, sendo atrativo para cultivo de células animais e vegetais. As bolhas
de ar ou de oxigênio, à medida que ascendem no reator, satisfazem a demanda de oxigênio
das células (AQUARONE et al; 2001)
19
Figura 2 - Esquema do reator tipo coluna de bolhas com fluxo concorrente.
Fonte. KADIC e HEINDEL (2014)
2.4 CONDIÇÕES HIDRODINÂMICAS
Nos biorreatores areados a transferência de massa e a reação química são dadas
entre um gás, um líquido e um sólido, desta forma o gás deve ser transferido para a fase
líquida e através desta fase se deve transferir até os compostos sólidos suspensos nesta.
REGIME DE FLUXO
Sendo a fase líquida mais densa que a fase gasosa, sua velocidade é menor em torno
da bolha. A velocidade superficial do gás (Us) é o parâmetro mais importante, e junto à
coalescência da fase líquida, determina a área interfacial para a transferência de massa.
Kadic e Heindel (2014) assinalam que a velocidade do gás está limitada no intervalo de
0,03- 1,0 m/s na maioria das aplicações de operação na extremidade inferior da coluna, seu
20
valor depende do nível de aplicação operacional, na pratica a nível industrial é usado 1,0
m/s.
Na Figura 4 nota-se que o modelo de fluxo no reator é axial, pois o gás ascendendo
pelo reator em forma de bolha, arrasta algo do líquido, o qual logo recupera seu estado. O
líquido e as bolhas ascendem pelo centro da coluna enquanto nas proximidades com as
paredes existe uma corrente de líquido descendente. A circulação do líquido arrasta as
bolhas do gás produzindo uma entremistura, consequentemente forma-se um perfil de
velocidade e uma retenção radial do gás, apesar da distribuição uniforme inicial do mesmo.
No fluxo de circulação radial não se originam gradientes de concentração na fase líquida
nessa direção.
Figura 3 - Modelo de circulação de líquido no reator tipo coluna de bolhas. Fluxo de
circulação axial (a) e fluxo de circulação radial (b).
Fonte. Doran (1998)
Na coluna de bolhas dependendo da vazão do gás, do disenho do difusor, do
diâmetro da coluna e das propiedades do meio como pode ser a viscocidade, se apresentam
diferentes diferentes estados de operação (figura 5). Quando se têm baixas vazões de gás o
regime homogêneo se desenvolve, é caracterizado por pequenas bolhas estáveis e com
tamanhos bem definidos distribuindo-se uniformemente na direção radial. O diâmetro das
bolhas depende do tipo de difusor. A interação entre as bolhas é muito pequena e por tanto
não se apresentam coalescência e quebras entre elas, do mesmo modo que a mistura do
líquido é bastante limitada, como se mostra na figura 5.a.
21
Figura 4 - Regime dos fluxos. (a) homogêneo (b) transição (c) heterogêneo e (d) Slug.
Fonte. KADIC e HEINDE (2014).
A medida que a velocidade superficial do gás vai aumentando, mais bolhas são
criadas com diferentes diâmetros, afetando assim sua distribuição. Consequentemente, essa
mistura mínima permite um aumento na velocidade da bolha do gás diminuindo o tempo
de residência, ainda nos reatores de grande tamanho.
Com o aumento da velocidade, ocorre a perda do ambiente estável e o regime de
fluxo muda para um fluxo transitório (Figura 5.b). Neste regime a relação entre a retenção
do gás na coluna e a velocidade do mesmo se apresenta em duas partes. A primeira parte
está descrita pela linha “a” da Figura 6, com um incremento tanto na velocidade do gás e
na retenção do gás, devido a sua maior presença assim como ao fenômeno de coalescência,
o qual conduz à retenção máxima do gás. Depois desta etapa, a área superficial e a retenção
do gás vão diminuindo, pois o grande tamanho das bolhas começa a controlar este
comportamento. A segunda parte deste processo se descreve com a linha “b” da figura 6,
ocorre rapidamente e se identifica por incrementos na retenção do gás até chegar a um
regime heterogêneo (Figura 6.c). Este regime acontece em fluidos muito viscosos e em
reatores de diâmetro pequeno.
No regime de fluxo turbulento, também chamado heterogêneo, são mantidas altas
velocidades superficiais do gás. Este regime é o resultado da instabilidade nos padrões de
fluxo e grandes bolhas com curto tempo de residência devido à vazão de gás (Figura 5.c)
(KANTARNCI, BORAK, ULGEN, 2004).
Uma situação especial se apresenta em reatores com coluna de bolhas estreitas,
geralmente em condições de laboratório, as bolhas com grande tamanho são estabilizadas
nas paredes da coluna e ascendem como um fluxo pistonado (Figura 5.d). Estas bolhas
chamam-se slug e ocupam praticamente toda a seção transversal, ademais continuam
crescendo pela adição de outras bolhas menores.
22
Os estados de operação de um reator dependem da velocidade superficial do gás, o
desenho do difusor, do diâmetro da coluna, das propriedades do líquido, como a
viscosidade, da temperatura e da pressão de operação.
Figura 5 - Perfil de retenção de líquido para diferentes regimes do fluxo.
Fonte. SU & HEINDE (2005).
DIÂMETRO DA COLUNA
No regime do fluxo homogêneo e de transição, o coeficiente de transferência de
massa e a retenção de gás na coluna descressem com o incremento do diâmetro da coluna,
até o valor critico de diâmetro que é geralmente citado como 0,15 m o valor de diâmetro
crítico reportado pela literatura (KADIC, HEINDEL, 2014). O diâmetro depende dos
efeitos das paredes, do fluxo e das condições de mistura. Além disso, o diâmetro tem uma
grande influência na estabilidade do fluxo, caracterizada pelo valor crítico de retenção e a
taxa do fluxo de gás, que acontece no fluxo de transição. Grandes diâmetros causam
instabilidade e antecipam a transição, entretanto um diâmetro pequeno poderia induzir um
comportamento oposto. Além disso, os reatores pequenos limitam a distribuição do
23
tamanho das bolhas, podendo originar bolhas pequenas de grande estabilidade e, por
conseguinte, grandes retenções de gás (KADIC, HENDEL, 2014).
O diâmetro ideal da coluna depende do regime de fluxo e o tamanho das bolhas,
conforme mostrado na Figura 7. Porém, vale ressaltar que este mapa não mostra um
comportamento universal, já que omite as variações devido às condições de operação e ao
desenho do difusor.
Figura 6 - Regime de fluxo de acordo com o diâmetro da coluna.
Fonte. Kantarci et al.,2004
2.5 TRANSPORTE DE OXIGÊNIO
Nos processos fermentativos que empregam o cultivo de células aeróbias ou
aeróbias facultativas, se deve fazer um dimensionamento para a transferência de oxigênio,
uma vez que este é um fator determinante para suprir as necessidades dos microrganismos
na respiração celular.
Desde o ponto de vista bioquímico, o oxigênio é o último elemento a receber
elétrons, ao final da cadeia respiratória, para ser reduzido a água e permitir a reoxidacão de
coenzimas que participam das reações de desidrogenação que se inicia na glicose, a qual é
24
seguida pelo no ciclo de Krebs, permitindo que as células guardem energia na forma de
ATP. Dessa forma o cultivo eficiente se caracteriza por ter altas velocidades de consumo
da fonte de carbono para garantir um abundante transporte de elétrons na cadeia
respiratória para geração de ATP e, por sua vez, oxigênio dissolvido é necessário para
receber os elétrons no final da cadeia respiratória. Desta forma a agitação e a areação do
meio de cultivo são necessárias para compensar a demanda de oxigênio (LIMA et al.,
2001).
É importante lembrar que ao contrário das fontes de carbono, o oxigênio é pouco
solúvel na água. De fato, a concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas
7 mg/L (7 ppm), em condições de pressão de 1 atm a 35 ºC. Portanto não só se precisa de
grandes quantidades de nutrientes para efetuar o processo fermentativo descontínuo, mas
também se deve introduzir oxigênio ao longo do processo para proporcionar a condição de
aerobiose (LIMA et al; 2001).
RESISTENCIA À TRANSFERÊNCIA DE OXIGÊNIO
O oxigênio, para ser metabolizado pela célula, deve atravessar uma série de
resistências ao transporte, dependendo da hidrodinâmica da bolha, temperatura, atividade
celular e densidade, composição da solução e fenômeno interfacial, dentre outros fatores.
Na Figura 7 é mostrado um diagrama que ilustra estas diferentes resistências.
Figura 7 - Esquema de transferência de oxigênio desde a bolha de ar até a célula.
Fonte. Kadic e Heindel (2014).
25
Na transferência de oxigênio, a primeira resistência se deve a película gasosa
(resistência 1), através da qual o oxigênio deve difundir até chegar à interface gás-liquido
(resistência 2), e seguidamente a terceira resistência está associada à difusão do soluto por
meio da região estagnada adjacente à bolha. No que se refere na resistência 4, transporte
do soluto através do interior do fluxo, espera-se que o liquido seja o suficientemente
agitado para produzir um transporte convectivo e dessa forma a mesma possa ser
desprezada. Portanto a resistência dominante refere-se aquela associada à película liquida
em torno a célula, a qual é função da difusão do oxigênio no liquido, além da espessura
desta película (resistência 5). Outra resistência do lado do consumo de oxigênio é a
imposta pela membrana celular (resistência 6), a difusão do oxigênio ao citoplasma
corresponde à resistência 7, e por último o transporte através do citoplasma até o lugar da
reação, é a resistência 8 (KADIC; HEINDEL, 2014).
Deve-se notar que nem todas as resistências são resistências físicas, com exceção
da última resistência, sendo esta a mais significativa para a transferência de massa e a que
está associada à velocidade de reação enzimática da respiração (resistência 8). Assim, as
resistências 5, 6 e 7 podem ser desprezadas quando se tem em conta as reduzidas
dimensões das células, a enorme área do meio líquido, e a penetração da membrana por
simples difusão do oxigênio (KADIC; HEINDEL, 2014).
2.6 TEORIA DE PELÍCULA
O grande problema da transferência de oxigênio na interface gás-líquido pode ser
descrita com a teoria da película, a qual descreve que o fluxo de um composto (Ni) é
proporcional a um gradiente de concentração descrito entre o seio de uma fase e a
interface, ou vice-versa, ou seja
( )Ni k Ci C (
(1)
Onde k é o coeficiente de transferência de massa e pode ter o sobescrito L o G
dependendo se a concentração corresponde ao lado gasoso ou líquido.
26
De acordo com esta teoria, embora os seios de ambos fluidos se encontrem
misturados, a turbulência diminui perto da interface, formando-se uma película estagnada
de ambos os lados da interface (Figura 9). A transferência na interface se produz somente
por difusão molecular.
Figura 8 - Perfis de concentração na interface gás-líquido entre duas películas
estagnadas.
Fonte. DECKWER (1992).
A transferência de massa é controlada pela fase líquida, já que a resistência da
transferência de massa na fase gás é consideravelmente menor que na resistência na fase
líquida KG>>KL. Dessa forma o cálculo da transferência de massa está descrito como,
( )L
dCk a Ci C
dt
(
(2)
Tendo em vista a dificuldade de medir KL independente da área interfacial, na
equação se utiliza kLa. Apesar da simplicidade da equação, a mesma dispõe o controle da
concentração de oxigênio em um certo meio.
27
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste estudo consiste em avaliar a produção de óleo microbiano por
leveduras em reatores do tipo coluna de bolhas.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Selecionar a levedura mais promissora para a produção de óleo microbiano
utilizando glicerol como substrato.
Avaliar a influência da taxa de aeração sobre a produção de lipídeo e crescimento
celular.
Determinar o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) nas
condições de maior produtividade, estabelecida durante os estudos, para realizar
aumento de escala do reator.
28
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 PROCESSO FERMENTATIVO
MICRORGANISMOS UTILIZADOS
Foram utilizadas cinco leveduras: Cryptococcus curvatus Y -1511, Lipomyces
starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y- 12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 e
Rhodotorula mucilaginosa Y-27053, fornecidas pela USDA (United States Department of
Agriculture), de Peoria, Illinois. As cepas foram conservadas repicadas a 4 °C em tubos de
ensaio contendo o ágar inclinado.
PREPARO DE INÓCULO E MEIO DE CULTURA PARA A SELEÇÃO DA
LEVEDURA
O meio de cultura utilizado para o crescimento do inóculo foi preparado de acordo
com a composição apresentada na Tabela 3, o qual foi esterilizado em autoclave a 121 °C
por 20 minutos. Os inóculos foram preparados transferindo-se uma alçada de células
cultivadas por 24 horas no meio de manutenção, para frascos Erlnmeyers de 250 mL
contendo 50 mL do meio de cultura, e incubados em agitador rotatório a 30 °C, sob
agitação de 200 rpm, por 24 horas. Após deste tempo as células foram separadas por
centrifugação e ressuspensas em água estéril até se obter uma suspensão celular densa. A
partir desta suspensão foi calculado o volume necessário para inocular o meio de
fermentação com concentração celular inicial de 1 g/L.
29
Tabela 3 - Composição do meio de cultura
Substancia Concentração (g/l)
Glicerol P.A 30
Extrato de levedura 3,0
MgSO4.7H2O 1,0
(NH4)2HPO4 3,0
SELEÇÃO DA LEVEDURA PRODUTO DE LIPÍDEO
Realizaram-se ensaios com cinco cepas diferentes de leveduras utilizando glicerol
como substrato. Os ensaios foram feitos em frascos agitados de 250 mL com 100 mL de
meio de fermentação composto de 70 g/L de Glicerol, 3,0 g/L extrato de levedura, 1,0 g/L
de MgSO4.7H2O e 3,0 g/L de (NH4)2HPO4, previamente esterilizado em autoclave, a
121 °C por 20 minutos. Após o meio de cultivo ser inoculado os frascos foram incubados
em agitador rotatório à temperatura de 30 °C e agitação de 200 rpm por um período de
120 horas, e durante este período foram retiradas amostras a cada 24 horas para o
acompanhamento do crescimento celular, produção de lipídios e consumo de substrato.
4. 2 CULTIVOS REALIZADOS EM REATORES TIPO COLUNA DE BOLHAS
AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AERAÇÃO
Os estudos em biorreator foram realizados visando avaliar os efeitos de diferentes
condições de fornecimento de oxigênio sobre o crescimento celular e a produtividade em
lipídeos. Neste estudo foi utilizada a levedura já selecionada na etapa anterior deste
trabalho. Os ensaios foram conduzidos em reatores do tipo coluna de bolhas com volume
de meio de fermentação de 400 mL, onde foram avaliadas diferentes vazões específicas de
30
ar (0,5; 1,0; 1,5; e 2,5 vvm), por um período de 120 h, com retirada de amostra a cada
24 horas para o acompanhamento das fermentações.
AVALIAÇÃO DO AUMENTO DE ESCALA
Nos estudos de aumento de escala em biorreatores do tipo coluna de bolha foram
realizados cultivos em um reator de 2,0 L de capacidade, tendo como parâmetro utilizado
na ampliação o valor de kLa, sendo mantido neste reator o valor mais próximo determinado
para o reator de 400 mL. Neste estudo foi utilizada a levedura já selecionada na etapa
anterior deste trabalho. Os ensaios foram conduzidos em reatores do tipo coluna de bolhas
com volume de meio de fermentação de 2,0 L, por um período de 120 h, com retirada de
amostra a cada 24 horas para o acompanhamento das fermentações.
DETERMINAÇÃO DO kLa
O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) foi determinado em
condições abióticas nos reatores de 400 mL e de 2,0 L. Para a determinação do kLa foi
utilizada uma sonda polarográfica em orientaçãoo vertical, a qual foi calibrada à pressão
atmosférica, definindo-se como zero o meio isento de oxigênio pela remoção com
nitrogênio, e como 100% o meio saturado com O2 proveniente do ar atmosférico.
Após removido todo o oxigênio do meio de fermentação por introdução de
nitrogênio, foram retomadas as condições de aeração, correspondentes as características
hidrodinâmicas de interesse, sendo monitorada a variação da porcentagem de oxigênio
dissolvido em função do tempo, o que foi utilizado para calcular o valor de kLa através da
forma integrada da equação dois (2), onde o valor de kLa é igual à inclinação resultante da
representação linear de ln(Ci- C) em função do tempo.
31
4.3 MÉTODOS ANALÍTICOS
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE BIOMASSA
A concentração de biomassa foi determinada pela medida das absorbâncias das
amostras em espectrofotômetro, utilizando água destilada como branco. As amostras foram
levadas a uma centrifuga Fanem Excelsa a 1000 xg por 5 min, lavadas e centrifugadas
novamente nas mesmas condições descartando-se o sobrenadante. Os valores de
concentração foram calculados pela equação das curvas de calibração específicas para cada
levedura e absorbância, a 600 nm, obtidas para os microrganismos em questão.
QUANTIFICAÇÃO DE LIPÍDEOS TOTAIS NA BIOMASSA
Para a quantificação de lipídios totais produzidos pelas leveduras foi utilizada uma
mistura de clorofórmio/ metanol (2:1 v/v), de acordo com o método de Bligh e Dyer (1959)
e a quantificação foi realizada por calorimetria empregando o método de coloração por
Sulfo-fosfo-vanilina (KNIGHT et al., 1972). Durante a fermentação foram retiradas
alíquotas de 1 mL do meio de cultivo a cada 24 horas, as quais foram centrifugadas para a
separação do sobrenadante. A extração de óleos foi feita adicionando-se 1 mL de metanol e
2 g de pérolas de vidro (0,50 mm de diâmetro) às células. Esta mistura foi submetida a
agitação em vortex por quatro ciclos de um minuto cada um e com intervalos de um
minuto em banho de gelo. Após a realização dos ciclos foram adicionados 2 mL de
clorofórmio e a mistura foi agitada durante 1 hora a 200 rpm em um shaker. Após deste
período foram acrescentados 1 mL de solução de cloreto de potássio 0,88% e 0,8 mL de
água destilada. A mistura foi centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos havendo a separação
de duas fases. Foi retirada uma alíquota de 0,4 mL da fase de fundo (orgânica) a qual foi
colocada em tubos de ensaios e levada a estufa a 80 ºC por 24 horas para evaporação do
solvente.
32
Para o método colorimétrico, após a evaporação foi adicionado nos tubos de
ensaio 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, e a mistura foi aquecida em banho maria sob
fervura por 10 minutos e em seguida foram resfriadas outros 10 min. Logo foi adicionado
1 mL de uma solução de ácido fosfórico e vanilina (17%) para desenvolver a coloração,
foram homogeneizadas e colocadas em ultrassom por 5 min. Prontamente as amostras se
colocaram no escuro por 45 minutos e depois desse período de tempo foi então
determinada a absorbância das amostras a 525 nm, tendo água como branco. A
concentração de lipídeos foi calculada pela curva de calibração específica para cada
levedura.
MÉTODO GRAVIMÉTRICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE LIPÍDEOS TOTAIS
NA BIOMASSA
Para o método gravimétrico após o procedimento de extração foi realizado de modo
semelhante ao descrito no item anterior, porém foi utilizada uma quantidade de células
cerca de dez vezes superior. E a evaporação do solvente foi realizada em estufa, para tal
foram utilizados frascos previamente tarados em balança analítica. O teor de lipídeos foi
então calculado com base na massa de óleo microbiano presente no frasco após a
evaporação e na quantidade de células usadas na extração.
DETERMINAÇÃO DE GLICEROL POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA
Glicerol foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em
equipamento Waters com detector de índice de refração e coluna BIO-RAD Aminex HPX-
87H (300 X 7,8 mm), nas seguintes condições: temperatura de 45 °C; eluente: ácido
sulfúrico 0,005 mol/L; fluxo de 0,6 mL/min; volume de amostra de 20 mL. As amostras
foram filtradas em filtro Sep-Pack C18 Cartridge (Waters Associates). As concentrações
foram calculadas sendo usadas curvas de calibração com uma faixa de concentração de 6 a
33
0,5 g/L. As soluções padrão foram filtradas em filtro milipore e em seguida analisadas no
cromatografo. Para a fase móvel foi utilizado água deionizada e ácido sulfúrico. A fase
móvel foi filtrada em membrana de 0,45 µm, 47 mm e desgaseificada em banho ultrassom
por 20 minutos.
4.4 ANÁLISE DE RESULTADOS
Os resultados dos cultivos foram analisados considerando parâmetros como: fator
de conversão de substrato em biomassa (YX/S) e em lipídeo (YP/S) e produtividade
volumétrica de lipídeos (QP) e consumo de substrato (Qs).
34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. ADEQUAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS
DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO CELULAR POR
ESPECTROFOTOMETRIA
Para o acompanhamento da concentração celular durante os cultivos foi utilizada a
técnica espectrofotométrica de densidade óptica (D.O.) na qual a absorbância de suspensão
celular a 600 nm é correlacionada à concentração celular determinada por gravimétrica.
Nesta técnica se faz necessária a obtenção de curvas de calibração específicas para cada
cepa de levedura. Desta forma foram obtidas curvas de calibração para relacionar valores
de densidade óptica à massa seca de células correspondente para cada uma das cinco
espécies estudadas.
Na Tabela 4 são apresentadas as equações que relacionam a absorbância da
suspensão celular a 600 nm (densidade ótica) com a concentração celular de biomassa seca
(em g/L), assim como seus respectivos coeficientes de determinação (R2). As curvas de
calibração também são apresentadas na Figura 10.
Para todas as leveduras avaliadas, as curvas de calibração apresentaram
comportamento linear dentro da região observada, com valores de absorbância na região
entre 0,01 e 1,30. As curvas de calibração obtidas por regressão linear dos dados
apresentaram um bom ajuste, sendo os valores dos coeficientes de determinação (R2)
superiores a 96% para todas as leveduras na região estudada. Baseado no comportamento
linear e no grau de ajuste obtido as curvas foram consideradas satisfatórias para a
determinação da concentração celular a partir da leitura da densidade ótica da suspenção
celular das leveduras.
Tabela 2 - Dados das curvas de calibração para as cinco espécies de leveduras.
Levedura Equação R2
Rhodotorula mucilaginosa Y – 27053 Conc. (g/L) = 0,7411.Abs 600nm - 0,0526 0,9658
Rhodosporidium toruloides Y – 1091 Conc. (g/L) = 1,0817.Abs 600nm - 0,0368 0,9889
Rhodotorula glutinis Y – 12905 Conc. (g/L) = 0,7986.Abs 600nm - 0,0293 0,9639
Cryptococcus curvatus Y – 1511 Conc. (g/L) = 0,8552.Abs 600nm - 0,0593 0,9617
35
Lipomyces starkeyi Y – 27493 Conc. (g/L) = 1,1258.Abs 600nm - 0,01304 0,9956
Fonte: Elaborado pelo autor
Figura 9 - Curvas de calibração de absorbância a 600 nm em função da concentração
celular para as leveduras (a) Rhodotorula mucilaginosa Y – 27053; (b) Rhodosporidium
toruloides Y – 1091; (c) Rhodotorula glutinis Y – 12905; (d) Cryptococcus curvatus Y –
1511 e Lipomyces starkeyi Y-27493 (e).
Fonte: Elaborado pelo autor.
y = 0,7411x - 0,0526 R² = 0,9658
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 0,5 1 1,5
Co
nce
ntr
açã
o c
elu
lar
(g/L
)
Absorbância à 600 nm
(a)
y = 0,7986x - 0,0293 R² = 0,9639
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 0,5 1
Co
nce
ntr
açã
o c
elu
lar
(g/L
)
Absorbância à 600 nm
(c)
R² = 0,9617 y = 0,8552x - 0,0593
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 0,5 1 1,5
Co
nce
ntr
açã
o c
elu
lar
(g/L
)
Absorbância à 600 nm
(d)
y = 1,1258x - 0,013 R² = 0,9956
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0 0,5 1 1,5 2
Co
nce
ntr
açã
o c
elu
lar
(g/L
)
Absorbância à 600 nm
(e)
y = 1,0817x - 0,0368 R² = 0,9889
0
0,5
1
1,5
0 0,5 1 1,5 C
on
cen
traç
ão
ce
lula
r (g
/L)
Absorbância à 600 nm
(b)
36
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE LÍPÍDIOS
A determinação da concentração de óleo microbiano produzido e acumulado pelas
leveduras foi realizada pela extração empregando o método Bligh & Dyer (1959) adaptado
seguida pela quantificação por calorimetria utilizando a técnica de coloração pela reação
Sulfo-fosfo-vanilina (KNIGHT et al., 1972). Para a utilização da técnica colorimétrica foi
necessária a construção de uma curva de calibração que relacionasse a absorbância a 525
nm de uma solução resultante da reação de coloração com a concentração de lipídios no
extrato celular.
A curva de calibração obtida para produção de lipídios está apresentada na Figura
10. Dentro da região avaliada, absorbância entre 0,02 e 1,6, a curva mostrou um
comportamento linear, sendo obtido o coeficiente de determinação (R2) de 0,9855, o que
permitiu sua utilização para a quantificação do teor de lipídios nas amostras de extrato
celular.
Figura 10 - Curva de calibração para determinação do teor de lipídio
O uso de técnica colorimétrica para a determinação de lipídeos no extrato celular
permitiu a quantificação de lipídios em pequenas quantidades de amostra, ou seja com as
células presentes em cerca de 1,0 mL do meio de cultivo. Tal quantificação não poderia ser
analisada com o emprego de técnica gravimétrica devido à pequena massa de lipídio
extraído. O emprego desta metodologia permitiu um acompanhamento mais detalhado da
Abs 525nm = 0,812. Conc.(g/L) - 0,0673 R² = 0,9855
0,0
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Ab
S (5
25n
m)
Concentração de Lipídios (g/L)
37
evolução do acúmulo de óleos microbianos pelas leveduras, sendo um importante
parâmetro para o bom desenvolvimento dos passos seguintes deste estudo.
Visando comparar os resultados obtidos pela técnica colorimétrica com a técnica
gravimétrica, comumente empregada para quantificação de lipídeos, foi realizado um
ensaio comparativo no qual foi determinado o teor de lipídeos em leveduras provenientes
do mesmo cultivo. Nesta comparação foi utilizada a levedura Rhodotorula glutinis Y-
12905 proveniente de um cultivo de 120 horas em meio contendo glicose como substrato.
Para a determinação por técnica gravimétrica foi necessário um volume de amostra dez
vezes maior que a técnica colorimétrica. As determinações foram feitas em duplicata para a
técnica gravimétrica, na qual foi estimado um teor de 10,1±0,2 %, de lipídeos em relação à
massa seca de levedura. Para a técnica colorimétrica foram realizadas vinte repetições, e
como resultado foi estimado um teor de 8±1% de lipídeos em relação à massa seca. Apesar
da diferença observada, a técnica colorimétrica foi considerada satisfatória, pois permitiu
estimar um teor muito próximo ao obtido pelo método gravimétrico. A diferença entre as
análises pode estar relacionada ao observado em alguns pontos da curva de calibração,
mostrada na Figura 11.
OBTENÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA ANÁLISE DE GLICEROL POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Para o acompanhamento do consumo de substrato pelas leveduras foi utilizada a
técnica de determinação das concentrações por Cromatografia Líquida de Eficiência. Para
o emprego desta técnica foi necessária a obtenção de curva de calibração específica para
glicerol. A curva de calibração foi obtida pela regressão linear dos dados de concentração
das soluções padrão de glicerol em função das áreas dos picos das gramas cromato, cujos
dados são apresentados na Tabela 10. Dentro da região observada, concentrações entre
0,04 e 6,00 g/L, a curva de calibração apresentou um comportamento linear e um elevado
valor para o coeficiente de determinação (R2 = 1,0000) para o composto analisado. Desta
forma, a quantificação dos substratos por cromatografia líquida mostrou-se adequada para
o acompanhamento das fermentações.
38
Tabela 3 - Concentrações de glicerol e as áreas correspondentes observadas nos
cromatogramas, assim como a curva de calibração para determinação e glicerol por
cromatografia líquida de alta eficiência.
Glicerol
Área Concentração (g/L) Curva de calibração
9850404,0000 5,8420
y= ax+b
a= 5,92 E-0,07
b =0,00 E+0,00
r2 = 1,0000
485104,5000 2,8640
1594075,0000 0,9390
754244,0000 0,4410
288493,8130 0,1350
145513,8910 0,0820
Fonte: Elaborado pelo autor.
5.2 SELEÇÃO DE LEVEDURA
Nesta etapa do trabalho foi realizada uma comparação de cinco diferentes leveduras
quanto a suas capacidades de consumo de substrato, crescimento celular e acúmulo de
lipídeos. O objetivo foi encontrar a espécie mais promissora para a produção de óleo
microbiano utilizando o glicerol como substrato.
Na Figura 12 são apresentados gráficos referentes à variação da concentração
celular, concentração de lipídeos e de glicerol durante o cultivo das leveduras avaliadas.
Em relação ao crescimento celular (Figura 12.A), foi observado um crescimento contínuo
até o tempo máximo de fermentação 120h. As maiores concentrações de biomassa foram
observadas para as leveduras Rhodotorula Glutinis e Lipomyces starkeyi as quais
alcançaram concentrações de 23,9 g/L e 22,9 g/L, respectivamente. As demais leveduras
apresentam um crescimento mais lento. A menor produção de biomassa (correspondente a
cerca da metade da máxima concentração celular observada) foi notada para a levedura
Rhodosporidium toruloides, sendo esta a única levedura que apresentou um período de
latência no início da fermentação, constituindo o início do crescimento celular observado a
partir de 24 horas. Dentre as leveduras avaliadas, Rhodotorula Glutinis e Lipomyces
starkeyi foram as que demostraram crescimento celular mais expressivo desde o início das
fermentações.
39
Figura 11 - Curva de crescimento celular (A), produção de lipídeos (B) e consumo de
glicerol (C), obtidas nas fermentações utilizando glicerol como substrato.
Fonte. Arquivo do autor
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Rhodotorula micilaginosa
Rhodosporidium toruloides
Rhodotorula glutinis
Cryptococcus curvatus
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Tempo (h)
Rhodotorula mucilaginosa
Rhodosporidium toruloides
Rhodotorula glutinis
Cryptococcus curvatus
Lipomyces starkeyi
C
40
No que se refere à produção de óleo microbiano (Figura 12.B), nem todas as
leveduras foram capazes de produzir lipídeos a partir de glicerol. Três das cinco espécies-
Rhodotorula glutinis, Cryptococcus curvatus Y-1511 e Lipomyces starkeyi- apresentaram
valores similares de concentração de lipídeos acumulado (entre 0,9 e 1,2 g/L). A maior
concentração de lipídeo acumulado, 1,2 g/L, foi obtida pela Cryptococcus curvatus. Por
outro lado, a levedura Rhodosporidium toruloides foi a única incapaz de acumular lipídeos
nestas condições, ou seja utilizou o substrato quase em sua totalidade para o crescimento
celular e não para a conversão em óleos microbianos, sendo esta máxima concentração
obtida de cerca de 0,1 g/L. Efetivamente, o acúmulo de lipídeos depende da natureza do
microrganismo e das condições do meio, já que as condições ótimas variam de espécie a
espécie (AQUARONE et al; 2001; AGEITOS et al; 2011).
Todas as leveduras avaliadas foram capazes de consumir glicerol como única
fonte de carbono no meio de fermentação, embora nenhuma delas tenha conseguido
consumir completamente o substrato durante o tempo de fermentação observado de 120
horas. De um modo geral, a Rhodotorula glutinis se destacou em relação às demais
leveduras quanto a sua capacidade de assimilar glicerol, sendo seu consumo total próximo
a duas vezes o valor apresentado pela Cryptococcus curvatus, que apresentou o segundo
maior consumo de substrato.
Na Tabela 6 são apresentados parâmetros fermentativos dos cultivos das leveduras
em glicerol tais como produtividade volumétrica em lipídeos, fator de conversão se
substrato em produto e em células, assim como informações referentes ao cultivo como
porcentagem de consumo de substrato, concentrações de células e óleo microbiano.
Tabela 4 - Parâmetros fermentativos para a seleção da levedura.
Levedura Consumo de
substrato (%) Células
(g/L) Lipídios
(g/L) Lipídios
(%) QP
(g/L.h) Y P/S
(g/g) Y X/S
(g/g) Rhodotorula mucilaginosa
Y-27053 30,3 14,1 0,5 3,7 0,0043 0,022 0,61
Rhodosporidium
toruloides Y-1091 15,8 8,2 0,1 0,7 0,0005 0,003 0,76
Rhodotorula glutinis Y-
12905 58,5 23,9 1,0 4,2 0,0083 0,023 0,54
Cryptococcus curvatus
Y-1511 34,6 18,6 1,2 6,2 0,0096 0,046 0,72
Lipomyces starkeyi Y-27493
30,6 22,9 0,9 4,0 0,0076 0,044 1,05
41
Em relação à produtividade volumétrica em lipídeos (QP), Lipomyvces starkeyi,
Rhodotorula glutinis e Cryptococcus curvatus obtiveram os maiores valores entre as
leveduras avaliadas, cerca de 0,0076; 0,0083 e 0,0096 g/L.h. Por outro lado, quando
comparamos o fator de conversão se substrato em produto (YP/S) destas três leveduras, verifica-se
que Rhodotorula glutinis apresentou cerca metade do valor do fator de conversão
observado para Cryptococcus curvatus e Lipomyvces starkeyi. Entretanto, é válido ressaltar que
o fator de conversão de substrato em produto apresentado pela Cryptococcus curvatus e
Lipomyvces starkeyi estão associados a um menor consumo de substrato quando
comparado com a levedura Rhodotorula glutinis. Entretanto, quando comparadas quanto à
capacidade de consumo de substrato, a levedura Rhodotorula glutinis se destaca em
relação às demais, uma vez que esta levedura foi capaz de consumir 58% do substrato em
120 horas de cultivo, ou seja, quase o dobro do consumo observado para a Cryptococcus
curvatus, que apresentou o segundo maior consumo, cerca de 34% do substrato em 120
horas de cultivo.
A elevada capacidade de consumo de glicerol de Rhodotorula glutinis foi um
critério importante na seleção desta levedura como a mais promissora para a produção de
óleo microbiano a partir de glicerol, visto que um lento consumo de substrato, como o
apresentado pelas demais leveduras, pode ser um fator limitante para se obter elevadas
produtividades. Desta forma, os ensaios seguintes foram realizados utilizando-se
unicamente a levedura Rhodotorula glutinis Y-12905.
5.3 EFEITO DA AERAÇÃO NO CRESCIMENTO CELULAR, ACÚMULO DE
LIPÍDEOS E CONSUMO DE SUBSTRATO.
Até esta parte do estudo, os experimentos foram realizados utilizando frascos de
250 mL com 50 mL de meio de fermentação. A partir deste ponto, após da seleção da
levedura, os ensaios de fermentação foram realizados em reatores do tipo coluna de bolhas,
com diâmetro 5 cm e uma altura útil de 35 cm (55,7% da altura total), com controle de
temperatura e com diferentes vazões de ar para cada reator, sendo o volume de meio de
fermentação de 400 mL.
42
Na Figura 12 são mostrados os perfis de consumo de substrato, crescimento celular
e acúmulo de lipídeos ocorridos ao longo dos cultivos da levedura Rhodotorula glutinis em
biorreatores coluna de bolha tendo glicerol como fonte de carbono.
De um modo geral o aumento na taxa de aeração exerceu efeito positivo no
crescimento celular (Figura 13.A). A concentração celular máxima (24,7 g/L, em 120
horas) foi obtida na fermentação realizada sob a condição de maior nível de aeração
(2,5 vvm), enquanto que a menor concentração celular foi obtida com o cultivo realizado
sob a menor vazão específica de ar (0,5 vvm), alcançando uma concentração de 14,8 g/L,
em 120 horas de cultivo.
Em geral, as produções de lipídeos foram pequenas para todas as condições de
aeração avaliadas, sendo alcançadas concentrações inferiores a 1,0 g/L em todos os
ensaios. A maior concentração de lipídeos observada, cerca de 0,9 g/L, se apresentou na
condição de aeração de 1,0 vvm, seguida pelos ensaios realizados com 2,5 vvm e 1,5 vvm,
que alcançaram concentrações de 0,7 e 0,6 g/L, respectivamente. A menor concentração de
óleo microbiano, cerca de 0,5 g/L, foi obtida na menor condição de aeração (0,5 vvm). De
modo geral, dentro da região de variação de aeração estudada, a vazão específica teve uma
pequena influência sobre a produção e o acúmulo de lipídeos pela levedura. Por
consequência do baixo acúmulo de lipídeos os valores de produtividade volumétrica de
lipídeos (QP) também foram pequenos, variando entre 0,0057 e 0,0039 g/L.h, para as
condições de aeração de 1,0 vvm e 0,5 vvm, respectivamente (Tabela 7). Outro aspecto
importante refere-se ao consumo de glicerol, este substrato não foi completamente
consumido em 120 h de fermentação em nenhuma das condições avaliadas (Figura 13.C).
43
Figura 12 - Curvas de crescimento celular (A), produção de lipídeos (B) e consumo
glicerol (C), obtidas nas fermentações utilizando diferentes vazões de ar.
Fonte. Arquivo pessoal.
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Analisando os outros parâmetros fermentativos, o maior fator de conversão de
substrato em produto (YP/S) (Tabela 5) foi obtido a 2,5 vvm, sendo responsável pelo pouco
consumo de substrato. O teor de lipídeo acumulado nas células variou entre 2,8 e 4,8%. O
máximo teor de lipídeo acumulado, cerca de 4,8%, ocorreu para uma areação de 1,0 vvm
(Tabela 7).
Tabela 5 - Parâmetros fermentativos para os cultivos da levedura Rhodotorula glutinis em
biorreator do tipo coluna de bolhas.
Aeração Consumo
de Substrato
Concentração de células
Concentração de lipídeos
Teor de lipídeos
YP/S YX/S QP QS
vvm % (g/L) (g/L) % (g/g) (g/g) (g/Lh) (g/Lh)
0,5 16,7 14,7 0,5 3,2 0,036 1,11 0,0039 0,110
1,0 30,8 18,6 0,9 4,8 0,035 0,73 0,0074 0,213
1,5 14,4 18,9 0,6 3,4 0,059 1,74 0,0053 0,631
2,5 15,0 24,6 0,7 2,8 0,060 2,13 0,0057 0,096
Dentre as condições avaliadas nesta etapa a vazão específica de ar de 1,0 vvm foi
escolhida como a mais favorável para o cultivo da levedura Rhodotorula Glutinis Y-12905.
Esta condição foi escolhida por apresentar o maior acúmulo celular de lipídeos (4,8%) e o
maior consumo de substrato (cerda de 31% em 12 horas de cultivo). Entretanto, as altas
concentrações celulares obtidas e a baixa produção de lipídeos pela levedura em diferentes
condições de aeração, não permitem uma discussão precisa referente à influência da
aeração e ao acúmulo de lipídeos. Por outro lado, foi possível observar uma influência da
aeração sobre o crescimento celular, o qual mostrou um comportamento positivo ao
aumentar a areação. Também é válida a possibilidade que a concentração de nitrogênio não
chegou ao limite para favorecer a síntese lipídica da levedura, sendo o parâmetro que não
pôde ser avaliado para o tempo de realização deste trabalho de conclusão de curso.
5.4 AMPLIAÇÃO DE ESCALA DO REATOR MANTENDO O KLa
O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) foi o parâmetro
utilizado para realizar a ampliação de escala de um reator de 400 mL de meio de
45
fermentação para um reator de 2 L de meio. Desta forma foi determinado o valor do kLa
para o reator de menor escala para a condição de aeração de 1,0 vvm (kLa = 2,8 h-1
), e a
aeração no reator de 2,0 L foi ajustada de modo a proporcionar o valor mais próximo
possível deste coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio.
Na Figura 14 são apresentados o crescimento celular, o consumo de substrato e a
produção de lipídeos durante os cultivos realizados no reator de 2,0 L com um
kLa = 1,9 h-1
.
De modo geral a levedura Rhodotorula Glutinis apresentou maior crescimento
celular no reator de 2,0 L quando comparada ao reator de 400 mL, apesar de manter o
coeficiente de transferencia de oxigênio em aproximadamente 2 h-1
nas duas condições.
Independentemente da maior concentração celular, a concentração de lipídeo acumulada
no longo do cultivo diminuiu aproximadamente 60% em comparação com o menor reator,
sendo seu máximo valor igual a 0,33g/L em um tempo de 72h (Figura 14.B). Após este
tempo a produção de lipídeo diminuiu significativamente a 0,051g/L, ou seja, a levedura
pode ter consumido lipídeo para o crescimento celular, mesmo possuindo uma alta
concentração de glicerol.
Quanto ao consumo de glicerol, semelhante ao observado para o reator de 400 mL,
no reator de maior escala (2,0 L) o consumo de substrato foi parcial, consumindo cerca de
25% com 120 horas de cultivo (Tabela 8). Valor este inferior ao observado para o reator de
menor escala. A produtividade volumétrica em lipídeos observada foi de 0,0013 g/L.h,
para o reator de 2,0 L, ou seja este parâmetro também foi menor em comparação com o
reator de 400mL. Devido a diferença dos resultados observados para os reatores de 400 mL
e 2,0 L, mesmo sendo mantido um valor semelhante de kLa, pode-se perceber que apenas o
coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio não foi um parâmetro suficientemente
adequado para o aumento de escala, e que outros fatores, tais como a geometria dos
reatores, pode também ter afetado a fermentação. É importante ressaltar que a faixa de
variação da condição de aeração empregada neste trabalho, por se tratar de um estudo
exploratório, pode estar distante das condições ideais de fornecimento de oxigênio, o que
pode ter limitado a produção de lipídeo pela levedura e, consequentemente, afetado
negativamente os resultados obtidos. Vale destacar ainda que novos estudos devem ser
desenvolvidos de modo a estabelecer condições mais adequadas de aeração, entretanto, em
virtude do tempo restrito para o desenvolvimento deste trabalho de conclusão de curso,
novos ensaios com condições diferentes de aeração não puderam ser realizados.
46
Figura 13 - Curva de crescimento celular (A), produção de lipídeos (B) e consumo de
glicerol (C), obtidas nas fermentações utilizando glicerol como substrato e o coeficiente
volumétrico de transferência de oxigênio de 1,9 h-1
.
Fonte. Arquivo pessoal
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Na Tabela 8 são apresentados parâmetros fermentativos do cultivo da levedura em
glicerol no reator de 2,0L com um kLa = 1,9 h-1
,tais como Produtividade volumétrica em
lipídeos, fator de conversão se substrato em produto e em células, assim como informações
referentes ao cultivo como porcentagem de consumo de substrato, concentração de células
e óleo microbiano.
Tabela 6 - Parâmetros fermentativos durante os cultivos realizados no reator de 2,0 L com
um kLa = 1,9 h-1
.
Consumo de Substrato
Concentração de células
Concentração de lipídeos
Teor de lipídeos
YP/S YX/S Qp Qs
% (g/L) (g/L) % (g/g) (g/g) (g/Lh) (g/Lh)
24,6 7,14 0,156 0,434 0,00895 0,41 0,00130 0,145
48
6. CONCLUSÕES
Todas as cinco leveduras avaliadas foram capazes de consumir substrato, crescer e
acumular lipídios nas condições de cultivo avaliadas Verificou-se ainda que, dentre as
leveduras avaliadas, a Rhodotorula glutinis Y-12905 foi a que apresentou maior consumo
de glicerol durante o tempo de cultivo observado tendo se destacado também quanto ao
acúmulo de biomassa celular e produtividade volumétrica em lipídios. Desta forma esta
levedura demonstrou um importante potencial para a obtenção de lipídios a partir de
glicerol.
O aumento da aeração resultou maior crescimento celular e menor teor de lipídeos,
indicando que um maior nível de oxigênio disponível no meio de fermentação ocasionou
um direcionamento de substrato para a produção de biomassa. Em relação à produção de
óleo microbiano, as concentrações de lipídeos alcançadas foram inferiores a 1,0 g/L em
todos os ensaios. O maior a de lipídeos foi observado na condição de aeração de 1,0 vvm.
Para condições de aeração superiores e inferires a esta houve um menor teor de lipídeos
acumulados nas células.
Na etapa do aumento de escala, na qual o kLa foi utilizado como parâmetro de
referência, houve uma dificuldade em estabelecer o mesmo valor em ambas as escalas
havendo uma discreta diferença (para o reator de 400 mL o kLa foi de 2,8 h-1
e para o
reator de 2,0 L o valor mais próximo conseguido foi 1,9 h-1
). Foram observadas diferenças
entre o crescimento celular, acúmulo de lipídeos e consumo de glicerol no aumento de
escala. Devido aos resultados obtidos, o coeficiente de transferência de oxigênio não foi
um parâmetro suficiente para realizar a ampliação de escala, já que a geometria do reator
ou a ausência de um difusor adequado podem ter afetado a transferência de massa.
É importante ressaltar que a baixa produção de lipídeos observada em todos os
ensaios pode estar relacionada a parâmetros que não foram abordados neste estudo, tais
como condições nutricionais do meio cultivo e controle de pH, ou ainda a faixa de aeração
utilizada, o que pode ter impactado fortemente a capacidade de produção de lipídeo
microbiano.
49
7. RECOMENDAÇÕES
Para estudos posteriores se recomenda
- Avaliar caraterísticas da levedura com uso de um microscópio durante o tempo de
fermentação estudado e com as mesmas condições para aperfeiçoar as condições do meio
(concentração de substrato, Ph, nutrientes, aeração e temperatura) em caso da presença do
estresse celular no processo de fermentação.
- Realizar experimentos variando o desenho do difusor do ar do reator para
conhecer a influência do tamanho das bolhas do ar no meio para a produção de lipídeos.
Também é importante estudar a influência da relação entre o diâmetro e a altura do reator e
sua influência na ampliação de escala.
- Determinar a quantidade de células viáveis durante o processo de fermentação
para obter um resultado mais preciso do crescimento celular, já que utilizando a curva de
calibração com absorbância não permite conhecer a quantidade de células viáveis que se
encontram no meio podendo interferir no resultado, assim como a possível produção de
pigmentos pelas leveduras.
50
8. REFERÊNCIAS
AGEITOS, J. M., VALLEJO, J. A., VEIGA-CRESPO, P., VILLAS, T. G. Oily yeasts as
oleaginous cell factories: Applied Microbiology and ans biotechnology, 2011, p. 1219-
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AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W., e LIMA, U. D. Biotecnologia
Industrial: Biotecnologia na produção de alimentos. São Paulo: Edgard Blucher LTDA, v.
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Tese(Doutorado em ciencias-Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial na
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53
APÊNDICES
APÊNDICE A- Determinação do coeficiente de transferência de oxigênio
Para o reator menor de 400 mL:
Tabela A1. Coeficiente de transferência de oxigênio (kLa) para o reator de 400 mL
Medida KLa (s-1) 1 3,6 2 3,6
3 22 4 1,8
meia 2,8
Para realizar a ampliação de escala se utilizou o kLa como o único parâmetro
como referencia e se realizou o mesmo procedimento para determinar este coeficiente no
reator maior, sendo este valor 1,9 h.
y = -0,001x + 0,0793 R² = 0,9992
-0,1
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0
100 130 160
ln(1
-P02
/100
)
Tempo (s)
y = -0,001x + 0,1005 R² = 0,9727
-0,1
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0
100 130 160
ln(1
-P02
/100
) Tempo (s)
y = -0,0006x + 0,0508 R² = 0,9941 -0,07
-0,06
-0,05
-0,04
-0,03
-0,02
-0,01
0
100 130 160
ln(1
-P02
/100
)
Tempo (s)
y = -0,0005x + 0,0516 R² = 0,9804
-0,07
-0,06
-0,05
-0,04
-0,03
-0,02
-0,01
0
100 130 160
ln(1
-P02
/100
)
Tempo (s)
