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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
MICHELLI LOYOLA TWARDOWSKY BOVA
REAPROVEITAMENTO DE RESÍDUO INDUSTRIAL DA PESCA:
EXTRAÇÃO DE COLÁGENO DE ESCAMAS DE CORVINA (MICROPOGONIAS
FURNIERI) E PRODUÇÃO DE SEU HIDROLISADO
Itajaí
2016
MICHELLI LOYOLA TWARDOWSKY BOVA
REAPROVEITAMENTO DE RESÍDUO INDUSTRIAL DA PESCA:
EXTRAÇÃO DE COLÁGENO DE ESCAMAS DE CORVINA (MICROPOGONIAS
FURNIERI) E PRODUÇÃO DE SEU HIDROLISADO
Itajaí
2016
Dissertação apresentada à Universidade do Vale do
Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do
grau de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental
Orientador: Prof. Dr. Marcos Luiz Pessatti
AGRADECIMENTO
Agradeço ao meu esposo pela parceria e companheirismo, sempre ao meu lado,
me apoiando, ensinando e motivando por mais difíceis que sejam as minhas
escolhas. Obrigado meu amor, sem a sua ajuda não chegaria até aqui, essa
conquista é nossa.
Ao meu orientador Dr. Marcos Luiz Pessatti, por me escolher como sua primeira
orientada de mestrado. Muitos desafios nesses longos dois anos, para quem não
tinha perfil, até que não foi tão ruim. Obrigada por todos os ensinamentos no
laboratório, na bioquímica e principalmente pela amizade e ensinamentos de vida.
Ao Dr. Paulo Ricardo Pezzuto, pela concessão da bolsa através do projeto
IGEPESCA – CAPES.
A CAPES (Edital Ciências do Mar 09/2009) e ao CNPQ (Edital 42/2012) pela
concessão dos 24 meses da bolsa de estudo.
Ao coordenador do Curso Dr. Marcus Polette, por me receber várias vezes na
coordenação, obrigada pelo apoio e motivação.
A secretaria do curso em especial a Isabela pela paciência e dedicação para
resolver os problemas com grande profissionalismo.
A todos os professores que fizeram parte da minha formação em especial ao Dr.
Francisco Carlos Deschamps e Dr. André Oliveira de Souza Lima por fazerem parte
da minha banca e a Dr. Maria Luiza de Souza por fazer parte da banca externa.
Aos estagiários do laboratório que fizeram parte da minha história em especial a
Nadine que me orientou nos meus primeiros passos. A Ana pela paciência me
ajudando com todas as dúvidas de bancada foi praticamente minha coorientadora.
E toda família Lab. Mariana, Philipe, Chrystian, Veronica, Igor, Angélica, Fabiana,
Jéssica, Astrid, Carla, Lucas, Claudia, Elvis, Tiele, Estácio, Marcos, Solange.
Aos colegas de sala pelo companheirismo nos trabalhos, pelos momentos que
passamos juntos e pela confiança por me elegerem representante do colegiado,
em especial a Fernanda, Letícia, Mariana, Carolina, Marieta, Angélica, Angelina,
Adriana, Renata, Gabi, Camilla, Ismael.
Aos colegas de trabalho da Industria da pesca Anapaula e Ivonete que sempre me
apoiaram e motivaram em seguir.
Aos meus amigos Luis, Ângela e Marcel por fazerem parte da minha conquista,
sempre dando um apoio moral. Obrigada Marcel por analisar minhas amostras na
Universidade da Costa Rica, e Luis pelos dados de exportação.
“ Lute com determinação, abrace a vida com paixão, perca com classe e vença com
ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve e a vida é muito bela para ser
insignificante”
Charles Chaplin
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ............................................................................................ IV
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. IX
LISTA DE TABELAS ............................................................................................ XI
RESUMO ............................................................................................................. XII
INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
1.1 Produção de pescado....................................................................................1
1.2 Produção de pescado em Santa Catarina.....................................................2
1.3 Produção de corvina......................................................................................3
1.4 Resíduo do beneficiamento da industrial da pesca.......................................4
1.5 Escama de corvina........................................................................................7
1.6 Colágeno........................................................................................................9
1.7 Hidrolisado de colágeno e aplicações.........................................................14
2. PROBLEMAS DE PESQUISA...........................................................................17
2.1 OBJETIVOS.....................................................................................................17
2.1.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................17
2.1.2 OBJETIVO ESPECÍFICO.............................................................................17
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................18
3.1 Obtenção da matéria prima.........................................................................18
3.2 Análise de rendimento de carcaça...............................................................18
3.3 Análises químicas........................................................................................18
3.4 Protocolos de extração do colágeno............................................................20
3.4.1 Protocolo 1................................................................................................20
3.4.2 Protocolo 2................................................................................................21
3.4.3 Protocolo 3................................................................................................23
3.4.4 Extração em batelada do protocolo 1.......................................................23
3.5 Produção do hidrolisado de colágeno..........................................................27
3.6 Determinação do grau de hidrólise..............................................................27
3.7 Determinação do teor de proteinas solúveis................................................27
3.8 Efeito do solvente na solubilização do colágeno.........................................28
3.9 Eletroforese SDS-PAGE (Gel de Poliacrilamida na presença de Dodecil
Sulfato de Sódio)...............................................................................................28
3.10 Eletroforese Tricina-SDS-PAGE.................................................................29
3.11 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR).................................................................................................................30
3.12 Espectroscopia de massas por infusão direta.............................................30
4. RESULTADOS..................................................................................................31
4.1 Rendimento das escamas...........................................................................31
4.2 Composição química das escamas ............................................................31
4.3 Extração e rendimento da extração de colágeno .......................................32
4.4.1 Determinação do teor de proteinas soluveis.............................................32
4.4.2 Composição química do colágeno parcialmente purificado .....................34
4.4.3 Proteínas totais do colágeno e soluções de descarte..............................35
4.5 Análise do colágeno por eletroforese em gel de policrilamida - SDS-
PAGE.................................................................................................................36
4.6 Efeito de hidrolise enzimática sobre a estrutura da escama inteira.............38
4.7 Análise do hidrolisado por eletroforese em gel de policrilamida – SDS –
PAGE.................................................................................................................38
4.8 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)........39
4.9 Espectroscopia de massas por infusão direta...............................................41
5. DISCUSSÃO..................................................................................................................45
6. CONCLUSÃO................................................................................................................48
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Produção Mundial de Proteínas Animais...................................................1
Figura 2. Evolução da produção pesqueira industrial de Santa Catarina de 2004 a
2012 em toneladas...................................................................................................2
Figura 3. Produção pesqueira industrial de Santa Catarina em 2012, por cidades e
modalidade de pesca................................................................................................3
Figura 4. Espécie Corvina (Micropogonias furnieri).................................................4
Figura 5. Fluxograma de beneficiamento do pescado ............................................5
Figura 6. Destinos dos resíduos das Indústrias de Beneficiamento de Pescados, de
acordo com os relatos dos entrevistados..................................................................6
Figura 7. Desenho esquemático da escama de peixe.............................................8
Figura 8. Processo de formação, organização e estrutura de colágeno................10
Figura 9. Estrutura da tripla hélice do colágeno.....................................................12
Figura 10. Fluxograma de extração do colágeno das escamas de corvina pelo
protocolo ...............................................................................................................21
Figura 11. Fluxograma de extração do colágeno das escamas de corvina pelo
protocolo 2.............................................................................................................22
Figura 12. Fluxograma de extração do colágeno das escamas de corvina pelo
protocolo 3.............................................................................................................24
Figura 13. Fluxograma de extração do colágeno em batelada do protocolo 1......26
Figura 14. Separação da escama da pele feira manualmente..............................30
Figura 15. Amostra do colágeno em gelatina (A) e após liofilização (B)...............32
Figura 16. Curva padrão do BSA e colágeno .......................................................34
Figura 17. Separação eletroforética de proteínas constituintes do colágeno por meio
de SDS-PAGE (7,5 %) das escamas de corvina (Micropogonias
furnieri)...................................................................................................................35
Figura 18. SDS-PAGE (10%) do colágeno obtido a partir do extrato de
Colágeno................................................................................................................37
Figura 19. SDS-PAGE (10%) das soluções de descarte. ......................................37
Figura 20. Escamas de corvina hidrolisadas...........................................................38
Figura 21. Eletroforese dos hidrolisados em gel policrilamida (Tricina-SDS-PAGE
16% resolving gel, spacer gel 10%, stacking gel 4%)..............................................39
Figura 22. Espectros de FTIR dos processos extrativos utilizados.........................40
Figura 23. Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido glicina................41
Figura 24. Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido prolina................42
Figura 25. Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido lisina..................43
Figura 26. Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido
hidroxiprolina..........................................................................................................44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tipos diferentes de colágeno encontrados no organismo.....................13
Tabela 2. Composição química das escamas de corvina (Micropogonias
furnieri)...................................................................................................................30
Tabela 3. Dosagem de proteínas nos extratos de colágeno pelos métodos de
Bradford e Lowry....................................................................................................32
Tabela 4. Composição química das amostras de colágeno parcialmente purificada
e seu rendimento...................................................................................................33
Tabela 5. Proteínas Totais nas soluções de descarte e soluções de extração do
colágeno.................................................................................................................34
RESUMO
O beneficiamento industrial de pescado gera quantidade elevada de resíduos,
entre os quais as escamas. Elas constituem fonte de colágeno que podem ser
utilizados nas indústrias de alimentos, farmacêutica e cosmética. Embora sejam
obtidos principalmente de peles e ossos de origem bovina e suína, os resíduos de
pescado, como as escamas, despontam como alternativa. O colágeno das
escamas de corvina (Micropogonias furnieri) foi extraído por três protocolos
diferentes (P1, P2 e P3) e, a partir daquele com maior rendimento, procedeu-se
extração em escala maior. As escamas de corvina foram compostas por 45,8% de
proteína bruta e 44,7% de resíduo mineral. A extração em batelada resultou em
rendimento 27% menor comparado à extração em menor escala. O ácido acético
0,5M, utilizado na solubilização do colágeno, interferiu nas determinações de
proteínas, principalmente no método de Bradford. As frações SC1, SC2 e SC3,
produzidas do colágeno extraído em batelada, apresentaram teores de 44,2%,
43,9% e 49,5% de proteína, semelhantes ao constatado na matéria-prima,
sugerindo que o processo de extração não foi eficiente em concentrar esta classe
de biomolécula. Além disso, nas soluções de descarte o teor somado de proteína
representou 20% da biomassa proteica original, indicando perda de proteína ao
longo da extração. O perfil eletroforético do colágeno extraído pelos protocolos P1,
P2 e P3 confirmou a presença das cadeias peptídicas que o compõem. Da mesma
forma, nas amostras de colágeno produzidas em batelada (SC1, SC2 e SC3) o
mesmo perfil foi observado, com cadeias α1 e α2, indicando se tratar de colágeno
Tipo I. As interações intermoleculares das ligações amida nas fibras do colágeno
e a presença das interações características da hidroxiapatita foram confirmadas
por espectroscopia de infravermelho. Por espectroscopia de massas por infusão
direta foi confirmada a presença dos íons moleculares correspondentes aos
aminoácidos glicina, prolina e lisina, bem como de hidroxiprolina, característicos
do colágeno.
Palavras chave: Escama, colágeno, hidrolisado de pescado, Micropogonias
furnieri sp.
ABSTRACT
The industrial processing of fish generates high amount of waste, including fish
scales, but these are a source of collagen that can be used in the food,
pharmaceutical and cosmetics industries. Although it is mainly obtained from the
skin and bones of bovine and swine origin, fish residues, such as scales, are an
alternative. Collagen from the scales of white croaker (Micropogonias furnieri) was
extracted by three different protocols (P1, P2 e P3) and using the one that produced
the highest yield, the extraction was carried out on a larger scale. White croaker
scales are composed of 45.8% crude protein and 44.7% mineral residue. Batch
extraction resulted in a 27% lower yield than extraction on a smaller scale. 0.5M
acetic acid, used in collagen solubilization, interfered with the protein
measurements, particularly using the Bradford method. The SC1, SC2 and SC3
fractions produced from the batch extracted collagen presented protein contents of
44.2%, 43.9% and 49.5%, similar to that found in the raw material, suggesting that
the extraction process was not effective in concentrating this class of biomolecule
class. Furthermore, in the disposal solutions, the added protein content represented
20% of the original protein biomass, indicating loss of protein during the extraction
process. The eletrophoretic profile of the collagen extracted by the P1, P2 and P3
protocols confirmed the presence of the peptide chains that compose it. Likewise,
in the collagen samples produced by batch extraction (SC1, SC2 and SC3), the
same profile was observed, with α1 and α2 chains, indicating that it is a Type I
collagen. The intermolecular interactions of the amide bonds in the collagen fibers,
and the presence of characteristic interactions of hydroxyapatite, were confirmed by
infrared spectroscopy. For mass spectroscopy by direct infusion, the presence was
confirmed of the molecular ion corresponding to the amino acids glycine, lysine and
proline and hydroxyproline, which are characteristic of collagen.
Keywords: Scales, collagen, fish hydrolysate, Micropogonias furnieri sp.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Produção de Pescado
Os negócios envolvendo o pescado movimentam cerca de US$ 600
bilhões todos os anos. Um volume que torna os negócios com pescado sete vezes
maior que os de carne bovina e nove vezes maior que os de carne de frango em
nível mundial (MAPA, 2015). No ano de 2011 a produção mundial de pescado
chegou a 93,7 milhões de toneladas (FAO, 2014). Em se tratando das proteínas de
origem animal, o pescado tem despontado, nos últimos anos, com a maior
produção na comparação com bovinos, suínos e aves, demonstrando a importância
do consumo dessa proteína pela população mundial (Figura 1).
O Brasil poderá se tornar um dos maiores produtores do mundo até 2030,
ano em que a produção pesqueira nacional teria condições de atingir 20 milhões
de toneladas (FAO, 2014).
Figura 1 - Produção Mundial de Proteínas Animais. Elaboração: MPA, 2015. Fonte:
The State of Wold Fisheries and Aquaculture. FAO, 2014.
O comércio bilateral de produtos e subprodutos de pescado é especialmente
importante para os países emergentes que, em alguns casos, responde por grande
parte do valor total de exportação de commodities. Segundo a FAO, as economias
em desenvolvimento responderam por grande parte do fornecimento mundial de
2
pescado em 2012, com aproximadamente 54% do valor monetário total exportado
naquele ano e 61% do volume comercializado em toneladas (MAPA, 2015/2016).
A China tem sido responsável pela maior parte do crescimento da
disponibilidade de peixe, devido à expansão em sua produção, particularmente da
aquicultura. Sua renda per capita e o consumo de peixe aumentou a uma taxa
média anual de 6% no período de 1990 a 2010. O aumento do consumo de
alimentos soma-se ainda as necessidades de alimentação saudável. Como
consequência disso, tem-se o recorde de consumo mundial de pescado per capita
em 2012, que foi de 19,2 kg de pescado por habitante, ou seja, existe um enorme
mercado a atender, com ampla demanda de pescado. (FAO, 2014).
1.2 Produção de Pescado em Santa Catarina
Santa Catarina continua a manter o posto de maior desembarcador de
pescado de origem marinha e de sediar o maior parque pesqueiro industrial do
Brasil. O volume total de pescado desembarcado em Santa Catarina no ano de
2012 foi de 157.223 toneladas, das quais 13.277 toneladas de corvina
(Micropogonias furnieri) (UNIVALI/CTTMar, 2013), espécie alvo deste trabalho.
Figura 2 - Evolução da produção pesqueira industrial de Santa Catarina de 2004 a 2012 em toneladas. Elaboração: MPA, 2015. Fonte: Univali - Boletim Estatístico da
Pesca Industrial de Santa Catarina - ano 2012.
3
O Estado de Santa Catarina é o maior produtor nacional de pescado de
origem marinha. Essa posição é decorrente da importante atividade de pesca
industrial sediada nos municípios de Itajaí e Navegantes. Somente a região de
Itajaí, englobando os municípios de Itajaí, Navegantes e Porto Belo, é responsável
por cerca de 20% da produção nacional de pescado, concentrando as operações
de descarga de mais de 600 embarcações de porte industrial, sendo assim
considerada o principal polo pesqueiro do Brasil (Figura 3).
Figura 3 - Produção pesqueira industrial de Santa Catarina em 2012, por cidades e modalidade de pesca. Elaboração: MPA, 2015. Fonte: Univali - Boletim Estatístico da
Pesca Industrial de Santa Catarina - ano 2012
No contexto estadual, essa região contribui com 90,95% dos empregos no
setor pesqueiro, representando 3.016 trabalhadores, sediando um significativo
número de empresas que estão, de forma direta ou indireta, ligadas a atividade da
pesca. O arranjo produtivo do setor pesqueiro do litoral centro-norte catarinense
constitui-se basicamente por três segmentos de atividades: a captura, o
beneficiamento do pescado e a construção naval e reparos de embarcações
(SINDIPI, 2013).
1.3 Pesca de Corvina
A corvina (Micropogonias furnieri) apresenta nome comum e sinonímias:
Corvina, Curuca, Cascote, Cururuca. Ordem: Perciformes. Família: Sciaenidae
Gênero: Micropogonias e espécie: Micropogonias furnieri. É um peixe de ampla
distribuição geográfica, habitando principalmente o oceano atlântico, oceano
pacífico e o Mar Mediterrâneo. É uma espécie demersal, que ocorre desde águas
rasas até cerca de 100 m de profundidade. É uma das espécies mais empregadas
na dieta alimentar do brasileiro, capturada com facilidade na costa brasileira
4
durante o ano todo e, portanto, uma espécie de grande importância econômica
(BORGES, 2005). É uma espécie carnívora e sua alimentação varia em função do
seu desenvolvimento. Em geral, os juvenis (encontrados principalmente em
estuários e manguezais) comem pequenos crustáceos, enquanto adultos
alimentam-se de pequenos peixes, crustáceos e moluscos. Segundo Corrêa
(2013), dentre as modalidades pesqueiras industriais, a corvina é a principal
espécie alvo da pesca de emalhe de fundo. Ainda segundo o autor, a pressão da
captura sobre a corvina tanto pela pesca artesanal quanto pela industrial, ameaça
os estoques pela sobrepesca da espécie.
Figura 4 – Espécie Corvina (Micropogonias furnieri). Fonte: MAPA (2016). Manual de
Inspeção para Identificação de Espécies de Peixes e Valores Indicativos de Substituições em Produtos da Pesca e Aquicultura.
1.4 Resíduo do beneficiamento da indústria da pesca
De acordo com a Resolução CONAMA n° 313/2002, Resíduo Sólido Industrial
é todo resíduo que resulte de atividades industriais e que se encontre nos estados
sólido, semi-sólido, gasoso e líquido cujas particularidades tornem inviável o seu
lançamento na rede pública de esgoto ou em corpos d’água.
De acordo com a Organização de Agricultura e Alimentos sobre estatísticas de
descarte e captura, estima-se que anualmente uma média de 7,3 milhões de
toneladas de pescado é descartada (FAO, 2014). Aproximadamente 50% da
biomassa de pescado no Brasil são descartadas durante o processo de
enlatamento ou em outras linhas de produção, como a filetagem (PESSATTI, 2001;
FELTS, 2010). Boa parte deste resíduo é destinado geralmente à produção de
5
farinha de peixe de baixa qualidade, devido principalmente à falta de
reconhecimento deste recurso como matéria prima e fonte para outros produtos.
Para a indústria, a qualidade da carcaça do pescado é fator imprescindível
para definição dos processos de preparação dos produtos e dos tipos de cortes. O
beneficiamento do pescado geralmente consiste nas seguintes etapas: recepção,
classificação, lavagem, retirada das escamas, retirada de cabeça e barbatanas,
evisceração e filetagem, cortes em posta gerando o ventreche que é o primeiro
corte depois da cabeça, possui grande quantidade de carne que não é aproveitado
devido sua aparência não sendo atrativa comercialmente, como apresentadas na
Figura 5.
Figura 5 - Fluxograma de beneficiamento do pescado.
A viabilidade do aproveitamento dos resíduos do processamento do pescado
depende, fundamentalmente, da qualidade da matéria-prima, tendo em vista a
perecibilidade dos tecidos dos peixes, maior que a de outras espécies animais.
Além disso, a qualidade está diretamente relacionada aos cuidados na manipulação
e conservação do pescado, as baixas temperaturas e com a aplicação de
procedimentos adequados de limpeza e sanitização da planta processadora
(PESSATTI, 2001).
Estudo realizado por Stori (2000) mostra o destino dos resíduos produzidos
pela indústria da pesca na região de Itajaí e Navegantes, de acordo com
6
declarações de empresas cerca de 68% dos resíduos eram encaminhados às
indústrias de farinha de pescado, 23% encaminhados ao aterro sanitário municipal
e 9% despejados diretamente nos rios (Figura 6).
Figura 6 - Destinos dos resíduos das Indústrias de Beneficiamento de Pescados, de acordo com os relatos dos entrevistados. Fonte: STORI, 2000
Existe um grande problema ambiental que é a destinação dos resíduos
pesqueiros, já que estes possuem alta carga de matéria orgânica, que se mal
gerenciados podem afetar as características do solo e dos recursos hídricos.
Segundo Matos (2004) as águas residuais geradas nas indústrias de pescado,
assim como os resíduos sólidos, são consideradas como agentes poluidores por
conter gordura, sólidos orgânicos e inorgânicos, além de substâncias químicas que
são adicionadas durante as etapas do processamento. O lançamento desses
resíduos em corpos hídricos pode provocar a redução na concentração de oxigênio
dissolvido, acarretando em morte de peixes e de outros animais aeróbios, a
exalação de mau cheiro e dificuldade no tratamento de água para o abastecimento
público (MATOS, 2005).
A poluição industrial da pesca pode ser convertida em um insumo de valor
agregado quando utilizado adequadamente. Este cenário vem estimulando
pesquisas e desenvolvimentos de produtos e novas tecnologias, tendo em vista que
estes resíduos são ricos em proteínas e ácidos graxos poliinsaturados e diversos
minerais e vitaminas. Denominado pela sigla FPH (Fish Protein Hydolysate),
conforme designado pela Food and Agriculture Organization (FAO), o hidrolisado
proteico possui características passíveis para a transformação de poluente em
7
produtos de excelente qualidade nutricional (FRIES et al., 2011). Hoje os
consumidores querem alimentos com o potencial para melhorar a saúde, aumentar
a longevidade, reduzir os riscos ou retardar o aparecimento de doenças precoces.
Desta forma o valor nutricional dos resíduos de pescado é rico em proteínas e em
ácidos graxos da série ômega-3, incentivando o desenvolvimento de produtos de
maior valor agregado para a alimentação humana, produtos para a Industria
farmacêutica, cosmética e biomédica (FELTES et al., 2010).
1.5 Escama de corvina
Entre os resíduos de beneficiamento do peixe descarte da indústria da pesca
destaca-se as escamas, representando 2% do peso do peixe inteiro. Quando não
são descartadas, são coletadas para o artesanato em algumas pequenas
comunidades, revelando-se um material de baixo custo e abundante, ainda pouco
explorado pela comunidade científica. De acordo com Santos et al. (2009), as
escamas possuem diversas camadas e superfície rugosas, observando ainda que
esta possui uma estrutura formada por lamelas (Figura 7), apresentando um
conjunto de fibras de colágeno que crescem de forma co-alinhadas e compactadas
dando origem aos anéis de crescimento. Essa estrutura fibrosa de colágeno serve
como matriz para a deposição e o crescimento dos minerais durante toda a vida do
peixe.
8
Figura 7 – Desenho esquemático da escama de peixe. (a) a escama pode ser dividida em seguintes subdivisões: um campo rostral, um campo lateral, um foco escalar, e um campo de caudal. Os raios estão localizados no campo rostral. (b) micrografias ópticas
representativos da região centro do campo rostral de escama de peixe. Anéis anuais são vistos nas posições de seta. Fonte: Youn et al. (2009)
Segundo Ribeiro (2014) as escamas de peixes são formadas por uma matriz
com composição média de 49,7% de fração inorgânica (hidroxiapatita) e 50,3% de
fração orgânica (colágeno). Em geral os músculos e escamas apresentam de 0,2%
a 10% de colágeno e estas são principalmente colágenos do tipo I (SUJITHRA, et
al., 2013). Escamas de peixe são uma fonte potencial para extrair colágeno (Kumar
et al., 2011). Contreras-Guzmán (1994) considera que inúmeros fatores podem
influenciar a composição química dos peixes, sendo alguns de natureza intrínseca,
tais como fatores genéticos, morfológicos (tamanho e forma) e fisiológicos
(migração e desenvolvimento gonadal). Fatores exógenos, tais como clima,
estação do ano, abundância e tipo de alimentação também podem afetar a
composição corporal.
9
1.6 Colágeno
O colágeno tem diversas funções no corpo humano, como, manter as células
dos tecidos unidas e fortalecê-las, responsável também pela cicatrização ou
regeneração em caso de corte ou cirurgia, auxilia na hidratação do corpo e no
processo do envelhecimento humano (GONÇALVES et al., 2015). No Brasil, a
maior parte do colágeno é proveniente dos subprodutos da indústria de carne, em
função da elevada produção brasileira de carne para exportação (SILVA et al.,
2012). O Brasil não atende à demanda de matéria prima do colágeno para as
indústrias farmacêutica e cosmética. O uso de colágeno e seus derivados,
principalmente na indústria de alimentos, vem apresentando tendência ascendente
nos últimos anos em virtude, sobretudo, da sua importância benéfica ao organismo.
Segundo a Empresa SBS Trade & Consulting, os complementos alimentares com
código NCM 2106.90.29 contendo colágeno foram importados pelo Brasil no
período de janeiro de 2015 até abril de 2016 cerca de US$ 110,3 milhões que
equivalem a 6.600 toneladas de produtos, ou seja, um valor de US$ 16,76/Kg de
colágeno. O Brasil tem um grande potencial e um mercado a ser explorado.
O termo “colágeno” deriva das palavras gregas Kolla (cola) e Genno
(produção) (OLIVO e SHIMOKOMAKI, 2001). O colágeno é uma proteína fibrosa
encontrada em todo o reino animal, contém cadeias peptídicas constituídas pelos
aminoácidos glicina, prolina, lisina, hidroxilisina, hidroxiprolina e alanina. A família
do colágeno consiste em 28 proteínas diferentes (SILVA e PENNA, 2012). O
processo de formação do colágeno ocorre principalmente durante o preparo da
regeneração e do desenvolvimento do tecido embrionário. As moléculas de
colágeno são secretadas pelos fibroblastos na forma de pró-colágeno solúvel, que
é ladeado por duas estruturas globulares de peptídeos contendo nitrogênio (N-) e
carbono (C-) terminais (CANTY e KADLER, 2012). O pró-colágeno é secretado
dentro das vesículas, formado no aparelho de Golgi e, em sequência, é secretado
para a matriz extracelular (Figura 8). Na matriz extracelular, ocorre a ação das C- e
N-peptidases, para clivar as duas estruturas globulares ligadas às extremidades do
pró-colágeno. Segundo Silva e Penna (2012) a ação dessas enzimas é necessária
para iniciar o processo de fibrogênese (produção de colágeno), pois essas
estruturas globulares ligadas ao pró-colágeno ocupam um grande espaço em volta
10
da molécula. Assim, é necessário que ocorra o processo de clivagem para a
formação do tropocolágeno (Figura 8), que começa a se unir com outras moléculas
de tropocolágeno, formando as fibrilas (NEKLYUDOV, 2003). As moléculas de
tropocolágeno tem um arranjo escalonado por meio de associações lado a lado,
estabilizadas primeiramente pelas interações hidrofóbicas e eletrostáticas
(DAMODARAN et al., 2010).
Figura 8 - Processo de formação, organização e estrutura de colágeno. Adaptado de Damodaran et al. (2010).
11
O colágeno pode ser obtido de diversas espécies animais (bovinos, suínos,
peixes, etc.) (WOLF et al., 2009). A gelatina é uma proteína derivada da hidrólise
parcial do colágeno animal, a conversão do colágeno em gelatina pode ser obtida
através do aquecimento do colágeno, em meio ácido ou alcalino (YANG et al.,
2007). A gelatina é uma proteína completamente desnaturada, consequentemente,
pode ser usada na indústria de alimentos apenas como agente emulsificante e não
como fonte de fibras nutritivas sendo rica em arginina e pouco valor em relação a
quantidade dos outros aminoácidos essenciais (SILVA e PENNA, 2012).
O colágeno (todos, inclusive os de origem marinha) é uma proteína estrutural
complexa que ajuda a manter a força e a flexibilidade da pele, ligamentos, ossos,
articulações, músculos, tendões, gengivas, olhos, vasos sanguíneos, unhas e
cabelos. Em geral o colágeno contém cerca de 30% de glicina, 12% de prolina, 11%
de alanina, 10% de hidroxiprolina, 1% de hidroxilisina e pequenas quantidades de
aminoácidos polares e carregados. A glicina, a prolina e a alanina são aminoácidos
alifáticos e a lisina é um aminoácido com características básicas (PRESTES, 2013).
Schrieber e Garreis (2007) mencionam que além da composição de aminoácidos a
presença de cadeias α e β e os respectivos fragmentos de maior e menor massa
molecular são responsáveis pelas características do colágeno, essas cadeias são
organizadas de forma paralela a um eixo, formando as fibras de colágeno (Figura
9), que proporcionam resistência e elasticidade à estrutura (DAMODARAN et al.,
2010; LINDEN et al., 2000). Na estrutura secundária do colágeno a hidroxiprolina é
um dos aminoácidos responsáveis pela manutenção da estabilidade da tripla hélice.
12
Figura 9 - Estrutura da tripla hélice do colágeno. Fonte: Sibilla et al., 2015
Dentre os diversos tipos de colágenos já identificados, pode se observar a
presença dos tipos I, III, IV, V, VI, XII e XIV na musculatura esquelética dos animais,
sendo que os Tipos I e III se encontram em maiores proporções (PRESTES, 2013).
Na (Tabela 1) estão especificados onde são encontrados os diferentes tipos de
colágeno.
13
Tabela 1 - Tipos diferentes de colágeno encontrados no organismo.
Fonte: Sibilla et al., (2015)
Tipo de colágeno Onde são encntrados
Tipo I
É o tipo mais comum, geralmente são encontrados em locais que resistem a grandes
tensões como, por exemplo, nos tendões, derme da pele, nos ossos e até mesmo na
córnea. Este tipo forma fibras e feixes de colágeno.
Tipo II
Esse tipo de colágeno é encontrado em locais que resiste a grandes pressões,
cartilagem elástica e hialina, discos intervertebrais e nos olhos. Sua síntese ocorre nos
condroblastos. Morfologicamente não é possível distinguir do colágeno Tipo I.
Tipo IIIAbundando no tecido conjuntivo frouxo, é encontrado na artéria aorta do coração, nos
pulmões, nos músculos dos intestinos, fígado, no útero. Constitui as fibras reticulares.
Tipo VIEsse tipo não se associa em fibrilas, tem a função de sustentação e filtração. Presente
nos rins, na lâmina basal e na cápsula do cristalino.
Tipo V
Se associa ao colágeno Tipo I, presente nos locais de grandes resistências as tensões.
Encontramos este colágeno nos ossos, sangue, placenta, tendões e está presente
também na pele.
Tipo VIPresente na maioria do tecido conjuntivo. É encontrado no sangue, na placenta, discos
intervertebrais, na pele e também se associa ao colágeno Tipo I.
Tipo VII Está localizado na junção dermo-epitelial e nas células corioaminióticas.
Tipo VIII Presente em algumas células endoteliais, ou seja, este tipo de colágeno é endotélio.
Tipo IXEste colágeno se interage com o Tipo II, é encontrado nas cartilagens, na retina e na
córnea. Sua função é manter as células unidas dando resistência à pressão.
Tipo X É encontrado nas cartilagens hipertróficas em mineralização.
Tipo XIEste colágeno interage com os Tipos II e XI. É encontrado nas cartilagens e nos discos
intervertebrais.
Tipo XIIÉ encontrado em locais onde são submetidos a altas tensões como nos tendões e nos
ligamentos e se interage com os Tipos I e III.
Tipo XIIITambém se associa aos Tipos I e III e é encontrado abundantemente como proteínas
associada a membrana celular e nas células endoteliais.
Tipo XIV Este tipo de colágeno é encontrado na pele e nos tendões.
Tipo XV Encontrado nas células do músculo liso e nas células chamadas fibroblastos.
Tipo XVI Encontrado nas invaginações da derme para epiderme e nos fibroblastos.
Tipo XVII Abundante na junção dermo-epidermal.
Tipo XVIII Este tipo é encontrado facilmente em tecidos com alto índice de vascularização.
Tipo XIX Encontrado apenas em células tumorais.
14
1.7 Hidrolisado de colágeno e aplicações
O hidrolisado de proteínas se tornou um método comum e extensamente
usado para a formação de peptídeos com atividade biológica (NAJAFIAN; BABJI
2012), podendo chegar a concentrações de até 90% de proteína (OETTERER,
2001), apresentando propriedades que a qualificam e despertam interesse. A
hidrólise das proteínas tem sido usada como alternativa para converter biomassa
subutilizada em produtos proteicos de consumo humano com elevado valor nutritivo
e propriedades funcionais interessantes para elaboração de produtos alimentícios
(DINIZ et al., 1997). As técnicas atualmente utilizadas para recuperar os peptídeos
são a hidrólise enzimática, que resulta na produção de hidrolisados de proteínas
biologicamente ativas (CHALAMAIAH et al., 2012).
Em relação ao colágeno hidrolisado, a característica mais importante é a sua
composição de aminoácidos, podendo fornecer um alto nível de glicina e prolina
(WALRAND et al., 2009), além de apresentar atividades antioxidantes inibindo os
radicais livres e propriedades bioativas que possuem ação metabólica. A qualidade
do colágeno hidrolisado vai depender do seu tamanho molecular médio, que pode
variar de acordo com a metodologia utilizada para extraí-lo (SIBILLA et al., 2015).
Os peptídeos do colágeno extraído a partir das escamas de peixe consistem em
pequenas moléculas peptídicas o que facilita sua absorção no intestino delgado
essa absorção é eficaz em diferentes partes do corpo, tais como tecido conjuntivo,
osso, vasos sanguíneos e derme da pele (KUMAR et al., 2011). Ainda segundo
autor os peptídeos de colágeno são utilizados para suplementos alimentares e
amplamente utilizados na indústria cosmética (KUMAR et al., 2011). Na medicina e
na área odontológica os biomateriais criados a partir do colágeno representam uma
alternativa terapêutica com aplicação variada já que apresentam grande
biocompatibilidade e capacidade de promover a cura de feridas. Na área biomédica,
tem sido utilizado para a reparação da parede abdominal, tendões, ligamentos
substitutos de pele humana e vasos sanguíneos.
Outras aplicações e características importantes devido às suas propriedades
naturais (MODAK et al., 1987) são: aplicações como reconstruções de tecidos
moles (CHEN et al.,2000); revestimento de queimaduras e outras lesões (TABATA
et al., 2000). Nos estudos de Oliveira et al. (2010) o uso de colágeno na superfície
15
da pele mostrou resultados positivos ao ser utilizado junto com Aloe vera no
tratamento de ferida isquêmica sem causar nenhum tipo de complicação ou
desconforto no paciente estudado. Utilizado como suporte para crescimento de
nervos periféricos (PROKOP,1997); orientador de tecidos em desenvolvimento
(GOISSIS et al., 2012). Características importantes do colágeno como biomateriais:
a) baixo índice de alergenicidade que pode ser reduzido mais ainda pela remoção
dos telopeptídeos N e C-terminais, tornando-o altamente biocompatível; b) as
preparações solúveis ou fibrilares de colágeno são capazes de reconstituir-se, isto
é, organizar-se estruturalmente da mesma forma que o tecido nativo com
propriedades similares (PAULA, 2003). Em contraste com colágenos de mamíferos,
colágenos de peixes parecem ser mais seguros (ZHANG et al., 2009). Habilidade
em promover crescimento celular; propriedades hemostáticas (ativação do
processo de coagulação) e susceptível a modificações químicas (GOISSIS et
al.,1996). Guillerminet et al. (2012) observaram a influência do uso de colágeno
hidrolisado na melhoria do estado dos ossos e na prevenção da perda óssea em
ratas ovariectomizadas de diferentes idades. Para Basso et al. (2013) a qualidade
e aplicação específica do colágeno extraído estão diretamente relacionadas com
suas propriedades funcionais e pureza. O colágeno marinho em particular tem
chamado muito atenção para a Industria cosmética, já que estão sendo
apresentados como um excelente ingrediente por ser um produto funcional. As suas
propriedades têm levado ao desenvolvimento de cremes e géis com ação de alta
hidratação, apresentando propriedades como antienvelhecimento e protetores de
radiação ultravioleta. Além do que pode ser utilizado de diversas formas como:
membranas, esponjas, géis, pós, filmes e outros (MA e ZHANG, 1999).
Pesquisas sobre a relação entre o envelhecimento da pele e a produção de
colágeno têm aumentado nos últimos anos, já que uma das principais causas do
envelhecimento é a perda do colágeno pelo organismo. Os músculos ficam flácidos,
a densidade dos ossos diminui, as articulações e os ligamentos perdem
elasticidade e força motora. O conhecimento sobre como estimular a síntese e
como repor o colágeno que se torna insuficiente com a idade, apresenta um grande
potencial já que a população mundial está envelhecendo, esse processo é
inevitável, mas seus efeitos podem possivelmente serem retardados e atenuados.
16
Estudos realizados por Zaque et al. (2011) indicaram que a ingestão de
colágeno hidrolisado pode aumentar a produção de colágeno pelos fibroblastos e
retardar o envelhecimento da pele. A suplementação com colágeno é importante a
partir dos 30 anos e essencial a partir dos 50 anos, pois, com o passar do tempo,
ele vai deixando de ser fabricado pelo organismo e, por isso, a pele vai se tornando
cada vez mais flácida, quando o corpo passa a perder 1% da proteína ao ano
(OLIVEIRA et al., 2010).
Estudos de Silva e Penna (2012) mostraram que o colágeno hidrolisado
apresentou resultados satisfatórios no tratamento da osteoartrite e da osteoporose,
onde a ingestão diária de 10 g de colágeno hidrolisado de grau farmacêutico (PCH)
reduziu a dor em pacientes com osteoartrite no joelho ou quadril e aumentou a
concentração de hidroxiprolina no sangue quando comparados com o uso do
placebo. A hidroxilação da prolina requer vitamina C. Os efeitos mais óbvios, no
cabelo e gengivas, da ausência de ácido ascórbico nos humanos são resultado da
deficiente hidroxilação de resíduos de prolina no colagénio, com a resultante
instabilidade química desta molécula, causando escorbuto, que é uma doença
aguda ou crônica devido a uma carência de vitamina C. Algo importante a ser
mencionado é que o ácido ascórbico exerce papel fundamental no crescimento e
reparação do tecido conjuntivo. A vitamina C está diretamente ligada na síntese de
colágeno e glicosaminoglicanas, fundamentais para manter os tônus e a firmeza da
derme. Portanto, para que haja uma síntese adequada de colágeno, é necessário
o sinergismo entre a vitamina C e a ingestão adequada de proteínas que fornecerão
os aminoácidos que constituem o colágeno (SANTOS e FERNANDES, 2011).
O interesse acerca das propriedades funcionais do colágeno não se resume
apenas ao envelhecimento, mas se reflete nos numerosos e recentes estudos que
abrangem todas as áreas do conhecimento, onde a análise destas moléculas
permite uma maior compreensão da origem de várias doenças decorrentes da
síntese defeituosa, excesso ou insuficiência da produção destas proteínas
(DUARTE, 2011). Até o momento, as pesquisas mostrarão os potenciais efeitos
benefícios para a saúde e que a suplementação de colágeno em alimentos tem
demonstrado resultados promissores (SILVA e PENNA, 2012).
17
2. PROBLEMA DE PESQUISA
As escamas de corvina (Micropogonias furnieri) podem se constituir em fonte de
colágeno?
2.1 OBJETIVOS
2.1.1 Objetivo geral
Extrair o colágeno das escamas de corvina por diferentes metodologias, e a partir
dele, produzir um hidrolisado de colágeno.
2.1.2 Objetivos específicos
1. Avaliar a eficiência de três protocolos distintos, utilizando solução salina,
ácida, alcalina com diferentes temperaturas, tempo, pH, centrifugação e
filtração;
2. Extrair colágeno em batelada com o protocolo que apresentar maior
rendimento e facilidade de operação;
3. Produzir um hidrolisado enzimático de colágeno e determinar a
distribuição de seu peso molecular e seu grau de hidrólise.
18
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção da matéria prima
As peles com escamas de corvina (Micropogonias furnieri), e somente as
escamas, foram gentilmente doadas pelo Mercado Municipal de Itajaí, Natubrás
Pescados e Pescados Quatro Mares. As escamas foram acondicionadas em sacos
plásticos estéreis de 30x20cm, mantidas em caixas de isopor com gelo e
transportadas para o Laboratório de Bioquímica e Bromatologia da Universidade do
Vale do Itajaí. As escamas foram lavadas em água de torneira, enxaguadas em
água destilada e secas em estufa a 110º C. Em seguida foram trituradas em um
moinho de micro de facas até formar um pó, modelo MA048, e mantidas em
dessecador até seu uso.
3.2 Análise de rendimento de carcaça
O rendimento de carcaça foi realizado no laboratório de Controle de
Qualidade da Empresa Natubrás Pescados, no Município de Piçarras. Foram
separadas dez corvinas inteiras e pesadas individualmente. Para as medidas foi
utilizado ictiômetro de 60cm. Também foi realizada pesagem das cabeças,
vísceras, carcaças e peles com as escamas, separadamente. Apenas as peles com
escamas foram acondicionadas em sacos plásticos estéreis de 30x20cm, mantidos
em caixas de isopor com gelo e transportadas para o Laboratório de Bioquímica e
Bromatologia da Universidade do Vale do Itajaí.
3.3 Análises químicas
As análises químicas foram efetuadas de acordo com Horwitz (1997). O teor
de umidade foi determinado por radiação infravermelha, em equipamento da marca
Shimadzu, modelo MOC63u e os resultados expressos em percentual de umidade.
Para se determinar o teor de lipídios foram adicionados 100ml de solvente (éter
etílico: éter de petróleo) nos tubos de extração e colocados nas colmeias do bloco
de aquecimento. Em cartuchos de celulose, foram pesados 2g de amostra seca e
acondicionados nos berços e mergulhados em solvente em temperatura de 60° C.
19
Após 30 minutos os berços foram retirados dos tubos de ebulição e deixados
expostos ao gotejamento do solvente por 90 minutos. A recuperação do solvente
por condensação foi realizada em temperatura de 90º C. Os tubos foram retirados
do bloco aquecedor e colocados em estufa a 60° C para evaporação final do
solvente, logo em seguida foram resfriados em dessecador e pesados. O teor de
lipídeos foi expresso em percentual em relação ao peso inicial da amostra seca,
conforme fórmula abaixo:
Onde: Pi = Peso inicial, Pf = Peso final
Para o teor de matéria mineral foi utilizado 1g de amostra seca em cadinhos
de porcelana, levados a mufla com aquecimento progressivo até 550º C, onde
permaneceu por 2 horas até a amostra ficar calcinada. A mufla foi desligada
abaixando sua temperatura até 100º C, os cadinhos foram retirados, levados ao
dessecador, resfriados e pesados. A diferença entre o peso inicial e o peso final é
a quantidade (%) de resíduo mineral (cinzas) na amostra, como mostra a fórmula
abaixo:
Onde: Pi = Peso inicial, Pf = Peso final
O teor de proteína bruta foi determinado pelo método de Kjeldhal. Para o
processo de digestão foi utilizado 0,2g de amostra seca colocadas em tubo
digestor, com cerca de 1,7 gramas de uma mistura catalítica contendo sulfato de
cobre e sulfato de sódio, 7 ml de ácido sulfúrico concentrado. O tubo foi colocado
no bloco digestor e a digestão foi realizada por 4 a 5 horas a 350º C. Para a etapa
de destilação, à amostra digerida fria foi adicionado 10 ml de água destilada,
adicionado NaOH (16M) no copo superior do destilador de nitrogênio e dispensado
RM% = (Pf – Pi) x 100
amostra (g)
L% = (Pf – Pi) x 100
amostra (g)
20
em torno de 25 ml para o tubo contendo a amostra. A amônia liberada foi destilada
por arraste de vapor e condensada para a solução receptora (25ml de ácido bórico
4%), formando borato de amônio. O borato de amônio foi titulado com uma solução
ácida (HCl 0,1N) padronizada. Para converter o nitrogênio medido em proteína,
multiplicou-se o conteúdo de nitrogênio por um fator geral que é obtido com base
no fato de que, na maioria das proteínas, o teor de N é em torno de 6,25 como fator
de correção, através da fórmula abaixo:
Onde: Va = volume de HCl utilizado para amostra, Vb = volume de HCl
utilizado com o branco, F = fator do HCl, N = normalidade do HCl.
3.4 Protocolos de extração do colágeno
3.4.1 Protocolo 1
O protocolo 1 foi baseado no processo de extração de colágeno de Silva
(2010), com algumas modificações. Inicialmente foi utilizado 0,8g de escama de
corvina em pó, permanecendo em 10 ml de solução NaOH 0,1M à 52º C com pH
em 12,0, os tubos tipo Falcon de 15 ml permaneceram em constante agitação no
homogeneizador de sangue por 45 minutos, seguida por centrifugação a 10.000 x
g. O precipitado foi suspenso em 10 ml de HCl 0,1M ajustando-se o pH a 2,0 com
solução NaOH 8M onde permaneceu em agitação por 15 minutos, seguida por
centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos. Em seguida o precipitado foi suspenso
em ácido acético 0,5M, permanecendo nessa solução por 2h à 52º C em constante
agitação. Após este período foi centrifugado a 10.000 x g por 20 min. O
sobrenadante foi recolhido e seco em estufa a 65º C. O material foi mantido sob
congelamento a -18º C até sua utilização.
PB% = (Va-Vb) x F x N x 6,25 x 0,014 x 100
amostra (g)
21
Figura 10 - Fluxograma de extração do colágeno das escamas de corvina pelo protocolo 1 3.4.2 Protocolo 2
Os protocolos 2 e 3 foram baseados no processo de extração de colágeno
de Zhang et al. (2011) seguida por modificações. Inicialmente foi utilizado 0,8g de
escamas de corvina onde permaneceu em 10% de NaCl 0,1M em agitação por 24h,
após este período foi feita centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos. O precipitado
foi suspenso em 10ml de HCl 0,1M em agitação por 90 minutos a 52º C em
agitação. O precipitado foi lavado em funil de Büchner com 3 volumes iguais de
água destilada. Em seguida o precipitado foi suspenso em 10ml de ácido acético
0,5M em agitação por 2h a 52º C seguida por centrifugação por 30 minutos a 10.000
x g, o sobrenadante foi reservado. O precipitado foi suspenso novamente em ácido
acético 0,5M em agitação por 2h a 52º C seguida por centrifugação por 30 minutos
a 10.000 x g, o sobrenadante foi reservado. Foram combinados os sobrenadantes
com NaCl 2,6M ajustando o pH a 7,0 com TRIZMA. Feita centrifugação por 30 min.
22
a 10.000 x g. O precipitado foi suspenso novamente em ácido acético 0,5M em
seguida foi centrifugado por 60 minutos a 10.000 x g. O precipitado foi lavado com
3 volumes iguais de água destilada e centrifugado por mais 15 min a 10.000 x g o
precipitado foi seco em estufa a 60º C. O material foi mantido congelado a -18º C
até sua utilização.
Figura 11 - Fluxograma de extração do colágeno das escamas de corvina pelo protocolo 2.
23
3.4.3 Protocolo 3
Foi utilizado 0,8g de escamas, lavadas em 10% de NaCl (0,1M)
permanecendo nessa solução por 24h em agitação. Após este período feita
centrifugação a 10.000 x g por 20 minutos. O precipitado foi suspenso em 10ml de
HCl 0,1M em agitação por 90 minutos. O precipitado foi lavado em funil de Büchner
com 3 volumes iguais de água destilada. O precipitado foi suspenso em 10ml de
ácido acético 0,5M em agitação por 2 dias, seguida por centrifugação por 30
minutos a 10.000 x g, o sobrenadante foi reservado. O precipitado foi suspenso
novamente em ácido acético 0,5M em agitação por 24 h. seguida por centrifugação
por 30 minutos a 10.000 x g, o sobrenadante foi reservado. Ambos sobrenadantes
foram combinados com NaCl 2,6M ajustando-se o pH a 7,0 com TRIZMA, seguida
por centrifugação por 30minutos a 10.000 x g. O precipitado foi dissolvido em ácido
acético 0,5M, novamente centrifugado por 60 minutos a 10.000 x g. O precipitado
foi seco em estufa a 60º C. O material foi mantido sob congelamento a -18º C até
sua utilização.
24
Figura 12 - Fluxograma de extração do colágeno das escamas de corvina pelo protocolo 3.
3.4.4 Extração em batelada do protocolo 1
Foi utilizado 327g de escama em pó, permanecendo em 4 litros de solução
NaOH 0,1M com agitação manual por 45 minutos à 52º C ajustando-se o pH em
6,0 com solução HCl 0,1M, seguida por filtragem em funil de Bϋchner. No
sobrenadante de HCl 0,1M (AL 2) foi adicionado dois volumes de etanol
permanecendo nessa solução a 4° C por 12 horas, em seguida foi dividido em três
erlenmeyers: (AL 005A) solução foi filtrada apresentando um sobrenadante bem
límpido; (AL 005B1) solução foi filtrada apresentando um sobrenadante não tão
límpido; (AL 005B2) solução com menor volume apresentando um sobrenadante
não tão límpido. A solução (AL 005A) foi seca em estufa a 65 °C por 3 horas,
25
apresentou fases diferentes que foram separadas em três tubos: (CC1) coloração
amarelada, límpida com precipitado; (CC2) coloração amarelada mais liquida
apresentando pequeno precipitado formando um filme; (CC3) coloração branca
com precipitado. O precipitado da solução de HCl 0,1M foi suspenso novamente
em solução NaOH 0,1M agora em pH12 por 12 horas (AL 3). O precipitado foi
suspenso em 4 litros de HCl 0,1M ajustando-se o pH a 3,0 com solução NaOH 8M
onde permaneceu por 15 minutos (AL 4), seguida por filtragem em funil de Bϋchner.
Em seguida o precipitado foi suspenso em ácido acético 0,5M (1:2v),
permanecendo nessa solução por 2h a 52º C seguida por homogeneização manual.
Após este período foi filtrado. Do sobrenadante foi recolhido uma alíquota em
microtubos de 1,5 ml e congelado (SC 002 - 1°Gel e 2°Gel) o restante (SC001) foi
seco em estufa a 65º C à 10% do seu volume, posteriormente foi adicionado etanol
e NaOH pH 11 deixando reagir de um dia para o outro, no dia seguinte essa solução
apresentou três fases diferentes: colágeno limpo (SC1), colágeno pouco precipitado
(SC2) e colágeno apresentando cristais (SC3), as amostras foram liofilizadas em
tubo tipo Falcon de 50ml e em erlenmeyers por aproximadamente 30 horas. O
material foi mantido sob congelamento a -18º C até sua utilização.
26
Figura 13 - Fluxograma de extração do colágeno em batelada do protocolo 1. Os códigos representam a simbologia utilizada para expressar os resultados de cada etapa de extração. Soluções de descarte = (AL1) solução de NaOH pH 6, (AL3) solução de NaOH
pH 12 com etanol, (AL4) solução de HCl, (AL5B1) sobrenadante de NaOH com etanol filtrado limpo, (AL5B2) sobrenadante NaOH com etanol filtrado não tão limpo, (CC1) precipitado do AL3 amarelado e límpido, (CC2) precipitado do AL3 formando uma pele, (CC3) precipitado do AL3 branco. Soluções de extração = (SC001) solução de colágeno
com etanol (SC002 1ºG) solução de colágeno precipitado com NaOH formando a 1º camada da formação do gel, (SC 002 2ºG) solução de colágeno precipitado com NaOH formando a 2º camada da formação do gel, (SC1) solução do SC001 com NaOH colágeno limpo e liofilizado, (SC2) solução do SC001 com NaOH colágeno pouco precipitado e liofilizado, (CS3) solução do SC001 com NaOH precipitado com cristais e liofilizado. Frações conforme figuras dos protocolos 1, 2 e 3 de extração
Feita a extração do colágeno dos diferentes protocolos 1, 2 e 3 e batelada
do protocolo 1, após liofilização foi realizado o cálculo de rendimento pela fórmula
abaixo:
Rendimento (%) = Peso da escama (g) x 100/ Peso do colágeno (g)
27
3.5 Produção do Hidrolisado de colágeno
Através da hidrólise enzimática foi feita a produção do hidrolisado. As
amostras foram preparadas em duplicatas e em tubo tipo Falcon de 15ml. Foram
pesadas separadamente 0,8g de escama inteira, 0,8g de escama em pó e 0,8g do
colágeno que foi liofilizado e que apresentou mais limpo (SC1). Em 50ml de água
destilada foi diluída 0,01g da enzima Protamex Novozymes e desta solução
transferido 12ml para cada tubo. A hidrólise foi realizada em banho maria a 45° C
por 90 minutos.
3.6 Determinação do Grau de Hidrólise
O grau de hidrólise (GH) foi determinado pelo método do OPA – o-
Phthaldialdehyde (NIELSEN et al., 2001). Basicamente, o método explora a
reatividade do reagente OPA à grupamentos amino-livres. Os ensaios foram
realizados em microplacas com fundo transparente por adição de 40 µl de amostra
e 260 µl do reagente OPA. As leituras de absorbância foram analisadas a 340 nm
no leitor de microplacas (modelo Genius, Tecan®) e o resultado expresso como GH
(%) pela equação:
GH (%) = [(Serina-NH2 - β) / α meqv / g de proteína] / htot * 100
Os valores de α, β foram previamente determinadas por ADLER-NISSEN
(1986), para peixes: 1,00; 0,40 e 8,6, respectivamente.
3.7 Determinação do teor de proteínas solúveis
Para as análises do teor de proteína bruta foram utilizados os métodos de
Bradford (BRADFORD, 1976) e de Lowry (LOWRY et al., 1951), modificado por
Petterson (1977). Para as análises de proteína bruta utilizando o método de
Bradford, em triplicata foi adicionado em cada tubo 3,5ml do reagente de Bradford.
Após a adição da água destilada, do BSA (Albumina Bovina Sérica) e do reagente
de Bradford nos tubos de ensaio, esperou-se 5 minutos para que as proteínas se
28
ligassem ao reagente. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro
(595nm). Colocou-se água destilada na cubeta medindo em seguida sua
absorbância, utilizando do mesmo processo, exceto a calibração do aparelho com
água, foi realizada a leitura da absorbância de todos os tubos. Com os valores das
absorbâncias foi possível determinar a curva padrão do BSA. Para as análises de
proteína bruta utilizando o método de Lowry, em triplicata foi adicionado nos tubos
água destilada seguida pelo BSA (Albumina Bovina Sérica) e do reagente de Lowry,
esperou-se dez minutos e em seguida adicionado reagente follin, após 20 minutos
no espectrofotômetro (750nm) foi feita a medição da absorbância.
3.8 Efeito do solvente na solubilização do colágeno
Para fazer a determinação de proteína bruta do colágeno foi necessário
testar diluições diferentes de ácido acético fazendo a leitura em diferentes métodos
para definir qual deles apresentaria uma quantidade maior de proteína na amostra.
Para a diluição do extrato de colágeno em pó foi pesado 1mg em 500µl de ácido
acético 0,05M e 0,5M ambas em triplicata. Utilizando o método de Bradford, em
triplicata foram adicionados 90µl de água destilada, 10µl de extrato de colágeno e
3,5ml do reagente Bradford, então aguardou-se cinco minutos para que as
proteínas se ligassem ao reagente. Uma a uma as soluções foram colocadas na
cubeta e posteriormente no espectrofotômetro com comprimento de onda de
595nm, foi realizada a leitura da absorbância de todos os tubos. Em triplicata foi
adicionado em cada tubo 10µl do extrato de colágeno seguida pela água destilada
e do reagente de Lowry, esperou-se dez minutos e em seguida adicionado reagente
follin, após vinte minutos no espectrofotômetro (750nm), foi feita a medição
da absorbância.
3.9 Eletroforese SDS-PAGE (Gel de Poliacrilamida na presença de Dodecil
Sulfato de Sódio)
As características de peso molecular das amostras de colágeno foram
determinadas pela técnica de eletroforese em gel de policrilamida em condições
desnaturastes, conforme descrito por Laemmli et al. (1970). As amostras foram
29
preparadas a partir das amostras de colágeno diluídas em ácido acético 0,5M. Para
preparar a amostra foi usado 10µl de amostra adicionadas a igual volume de
tampão de amostra (glicerol 11%, SDS 2,2%, Tris-HCl pH 6,8 0,5 M, água destilada,
DTT 10%), aquecidas a 45º C por cinco minutos e em seguida aplicadas no gel.
Como referência foi usado padrão de proteínas de alto peso molecular (Amersham),
constituída pelas proteínas miosina (212.000 KDa), α₂-Macroglobulina (170.000
KDa), β-Galactosidase (116.000 KDa), Transferrina (76.000 KDa), desidrogenase
glutâmico (53.000 KDa). Géis de 10% de SDS-poliacrilamida (Laemmli, 1970) foram
submetidos a uma corrente inicial de 10 mA, com voltagem 30v passando para
20mA e 120V em sistema de mini-gel, Hoefer miniVE-Vertical electrophoresis
System, da Amersham Pharmacia Biotech. Após a corrida, o gel foi corado com
Coomassie Brilliant Blue e posteriormente se fez necessária a descoloração do gel,
seguida de nova revelação com nitrato de prata, para a revelação das bandas, em
concentração não detectáveis pelo Coomassie (Schägger, 2006). Foi utilizado
também o gel pronto da Bio Rad – mini Protean 7,5%, o gel foi corado com
Coomassie Brilliant Blue e posteriormente se fez necessária a descoloração do gel,
seguida de nova revelação com nitrato de prata.
3.10 Eletroforese Tricina-SDS-PAGE
Para análise da composição de pesos moleculares dos peptídeos gerados
pelo processo de hidrólise, foi realizada eletroforese em gel de poliacrilamida em
condições desnaturastes conforme Schägger (2006). Foram adicionadas 10 µl de
amostras hidrolisada adicionadas a igual volume de tampão de amostra (glicerol
11%, SDS 2,2%, Tris-HCl pH 6,8 0,5 M, água destilada, DTT 10%), aquecidas a
37º C por vinte minutos, e aplicadas no gel. Como referência foi usado a proteína
padrão de baixo peso molecular (Amersham) constituídas pelas proteínas
Fosforilase b (97.000 KDa), Albumina (66.000 KDa), Ovalbumina (45.000 KDa),
Anidrase Carbonica (30.000 KDa), Inibidor de tripsina (20.100 KDa), α-
Lactalbumina (14.400 KDa). A eletroforese foi realizada em gel de policrilamida
(Tricina-SDS-PAGE 16% resolving gel, spacer gel 10%, stacking gel 4%), conforme
Schägger (2006). Utilizando como tampão de corrida tris-tricina (100 mmol/L de
30
Trizma Base (Sigma®) e 100 mmol/L de tricina - Biorad®), pH 8,25, em SDS 0,1%.
Submetidos a uma corrente inicial de 10 mA, com voltagem 40V passando para
30mA e 120V em sistema de mini-gel, Hoefer miniVE-Vertical electrophoresis
System, da Amersham Pharmacia Biotech. As proteínas foram fixadas no gel e
reveladas com azul de Coomassie, conforme Laemmli et al. (1970) e
posteriormente o gel foi fotografado em transiluminador.
3.11 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
Para confirmar a presença dos íons moleculares (M+ + H) correspondentes
aos aminoácidos do colágeno foi utilizada a espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR). A análise de FTIR foi realizada em espectrômetro
Shimadzu IR Affinity-1, utilizando aproximadamente 1,5 mg do colágeno de cada
protocolo (P1, P2 e P3), e acrescentado aproximadamente 100 mg de brometo de
potássio (KBr) sob condições livre de umidade. Todos os espetros foram lidos na
região de 4000 a 400 cm-1.
3.12 Espectroscopia de massas por infusão direta
Foi utilizado 10 mg de cada amostra do colágeno (P1, P2 e P3) e dissolvidas
em 5 ml de solução 6N de HCl e aquecidas a 100 °C por 6 horas em banho de
glicerina. Em seguida o hidrolisado foi filtrado utilizando filtros de fibra de vidro de
2,7 microns. Uma alíquota das amostras de colágeno hidrolisado (500μl) foi diluída
em 1,5 ml de solução 6N de HCl e submetida a análise de espetroscopia de massas
por infusão direta utilizando um espectrômetro de alta resolução Waters Synapt
TOF. A análise dos íons monitorados, assim como os cálculos das massas exatas
dos íons dos aminoácidos avaliados, foram realizados utilizando o software
MassLynx V4.1.
31
4. RESULTADOS
4.1 Rendimento das escamas
O peso médio dos animais inteiros foi de 10,9 Kg. Após a retirada das
escamas da pele Figura 14 (B) e serem secas Figura 14 (C, com peso de 263,14
g), o rendimento das escamas em relação ao peixe inteiro foi de 2,4%.
A B C
Figura 14 - Separação da escama da pele feita manualmente. (A) = pele de
corvina com escamas. (B) = escama de corvina suja. (C) = escama de corvina limpa.
4.2 Composição química das escamas
Os teores de umidade, proteína bruta, lipídeo e matéria mineral das
escamas na matéria seca foram: 28,62; 45,82; 0,1 e 22,49% respectivamente
(Tabela 2).
Tabela 2 - Composição química das escamas de corvina (Micropogonias furnieri).
Parâmetros (%) Média desvio padrão (%)
Umidade 28,62 0,84
Proteína bruta 45,82 0,16
Lipídio 0,13 0,01
Resíduo mineral 22,49 0,68
±
±
± ±
±
32
4.3 Extração e Rendimento da extração de colágeno
O rendimento do extrato de colágeno bruto do protocolo 1 foi de 23 %, do
protocolo 2 foi de 21,48 %, protocolo 3 foi de 21,29 % e protocolo em batelada do
protocolo 1 foi de 16,76 %. O colágeno úmido, formando gelatina, de coloração
transparente e límpida, após liofilizado formou um material rígido e em forma de
filme transparente (Figura 15).
A B
Figura 15 – Amostra do colágeno em gelatina (A) e após liofilização (B).
4.4.1 Determinação do teor de proteínas solúveis
Para a dosagem de proteínas nos extratos de colágeno dos diferentes
protocolos optou-se, inicialmente, pelo método de Lowry (LOWRY et al., 1951),
modificado por Petterson (1977). A curva-padrão corresponde à relação gráfica
entre os valores de absorbância e os de concentração. Com base em análise
gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular o fator de conversão
dos valores de absorbância em concentração. O resultado para a curva padrão do
BSA pelo método de Bradford apresentou coeficiente de correlação (R²) = 0,9966
e para a curva padrão pelo método de Lowry o coeficiente de correlação foi de (R²)
= 0,997. A determinação do teor de proteína pelo método de Bradford no protocolo
1 (P1) foi de 0,4 mg/ml, protocolo 2 (P2) 0,2 mg/ml, protocolo 3 (P3) 0,2 mg/ml.
Para o método de Lowry os resultados foram: protocolo I (P1) 2,1 mg/ml, protocolo
2 (P2) 1,5 mg/ml, protocolo 3 (P3) 2,1 mg/ml (Tabela 3).
33
Tabela 3 - Dosagem de proteínas nos extratos de colágeno pelos métodos de Bradford e Lowry. Valores de proteína bruta (mg/ml) solubilizada em ácido acético 0,5M.
Proteína Bruta mg/ml
Bradford Lowry
P1 0,4 2,9
P2 0,2 2,6
P3 0,2 2,7
Porém notou-se certa discrepância entre os resultados fazendo que os
resultados de Bradford subestimem os resultados de Lowry, foi então feito
diferentes diluições para comprovar o efeito do solvente na solubilização do
colágeno. Na diluição das amostras utilizando ácido acético 0,05M o teor de
proteína bruta foi de 1,5 mg/ml para o método de Bradford e 1,7 mg/ml no método
de Lowry. Na diluição em ácido acético 0,5M o teor de proteína bruta foi de 2,6
mg/ml para o método de Bradford e 2,8 mg/ml no método de Lowry. Com base
nesses resultados foi definido a diluição do colágeno em ácido acético 0,5M por
apresentar um teor maior de proteína bruta pelo método de Lowry. Os resultados
mostram que o ácido acético presente na amostra de colágeno diminui a
capacidade do azul de Comassie (Bradford) se ligar a proteína. Tendo em vista os
resultados dos teores de proteínas nos diferentes métodos foi determinado uma
curva especifica para o colágeno substituindo a curva de calibração do BSA pela
curva padrão do colágeno (Figura 16). O resultado para a curva padrão do colágeno
presentou coeficiente de correlação (R²) = 0,9865, e a curva padrão do BSA foi de
(R²) = 0,991. A partir do gráfico, optou-se por utilizar a equação y = 0,0077x + 0,11
do colágeno para a obtenção da concentração de proteína nas amostras.
34
Figura 16 - Curva padrão do BSA e colágeno. Comparação da absorbância do BSA em relação a amostra de colágeno utilizando o método de Lowry (LOWRY et al., 1951).
4.4.2 Composição química do colágeno parcialmente purificado
Utilizando o método de Kjeldahl para determinar o teor de proteína bruta o
resultado foi de 44,2% para SC1, 43,9% para o SC2 e 49,5% para o SC3. O teor
de umidade na amostra SC1 foi de 16,19%, 14,22% para o SC2 e 4% para o SC3.
Não foi possível determinar o teor de lipídios por não apresentar volume suficiente
de amostras. O teor de resíduo mineral para SC1 foi de 26,63%, SC2 de 30,14% e
SC3 sem amostra suficiente para análise. O rendimento do balanço de massa do
processo de extração em batelada foi de 20,37% para o SC1, 15,3% para o SC2 e
1,18% para o SC3 (Tabela 4).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
ânci
a
Concentração (µg)
Curva Padrão - Colágeno e BSA
BSA
Colágeno
35
Tabela 4 - Composição química das amostras de colágeno parcialmente purificada e seu rendimento do balanço de massa do processo de extração em batelada –
Produto final do extrato de colágeno parcialmente purificado dividido em três amostras: SC1 (amostra mais limpa); SC2 (amostra precipitada); SC3 (amostra apresentou cristais).
4.4.3 Proteínas totais do colágeno e soluções de descarte
Antes do processo de liofilização do colágeno, ainda em forma de gel, foi
alicotado a amostra SC001 que apresentou um teor de proteína bruta de 8,7 g/ml,
SC002 1º Gel de 3,8 g/ml e a amostra SC002 2º Gel de 3,7 g/ml. Devido a
manutenção no equipamento, somente a amostra SC001 foi liofilizada o restante
foram conservadas em congelador. Devido a amostra SC001 apresentar três fases
diferentes foram então liofilizadas separadas, gerando três amostras a SC1 que
apresentou 11,6 g/ml de proteína bruta a SC2 com 10,6 g/ml e SC3 com 11,1 g/ml.
As diferentes soluções de descartes provenientes da extração do colágeno
renderam um total de proteínas entre 4,5 g e 15,7 g dependendo da etapa de
extração (Tabela 5).
SC1 SC2 SC3
Composição
Proteína bruta ( N x 6,25) 44,2 43,9 49,5
Umidade 16,2 14,2 4,0
Lipídio - - -
Resíduo mineral 26,6 30,1 -
(% matéria seca)
36
Tabela 5 - Proteínas Totais nas soluções de descarte e soluções de extração do
colágeno.
Soluções de descarte
Amostras PB Total (g)
AL 1 8,4
AL 3 4,9
AL 4 4,6
AL 5B1 6,1
AL 5B2 4,5
CC 1 10,6
CC 2 15,7
CC 3 12,7
Soluções de extração
Amostras PB Total (g)
SC 001 8,7
SC 002 1ºGel 3,8
SC 002 2ºGel 3,7
SC 1 11,6
SC 2 10,6
SC 3 11,1
Soluções de descarte = (AL1) solução de NaOH pH 6, (AL3) solução de NaOH pH 12
com etanol, (AL4) solução de HCl, (AL5B1) sobrenadante de NaOH com etanol filtrado limpo, (AL5B2) sobrenadante NaOH com etanol filtrado não tão limpo, (CC1) precipitado do AL3 amarelado e límpido, (CC2) precipitado do AL3 formando uma pele, (CC3) precipitado do AL3 branco. Soluções de extração = (SC001) solução de colágeno com
etanol (SC002 1ºG) solução de colágeno precipitado com NaOH formando a 1º camada da formação do gel, (SC 002 2ºG) solução de colágeno precipitado com NaOH formando a 2º camada da formação do gel, (SC1) solução do SC001 com NaOH colágeno limpo e liofilizado, (SC2) solução do SC001 com NaOH colágeno pouco precipitado e liofilizado, (CS3) solução do SC001 com NaOH precipitado com cristais e liofilizado. Frações conforme figuras dos protocolos 1, 2 e 3 de extração.
4.5 Análise do colágeno por eletroforese em gel de policrilamida – SDS-PAGE
O perfil eletroforético das amostras de colágeno dos protocolos 1, 2 e 3
obtidas da escama de corvina, revelou a presença das cadeias peptídicas
compatíveis com as do colágeno, à saber: Com peso molecular aparente
determinados para essas cadeias foram de 238 KDa para a cadeia γ, 203 KDa para
a cadeia beta, 112 KDa para alfa 1 (α1) e 106 KDa para alfa 2 (α2) (Figura 17).
37
Figura 17 – Separação eletroforética de proteínas constituintes do colágeno por meio de SDS-PAGE (7,5 %) da escama de corvina (Micropogonias furnieri). (P) proteína de
marcador de peso molecular, (P1) colágeno do protocolo 1, (P2) colágeno do protocolo 2 e (P3) colágeno do protocolo 3.
Os resultados do perfil eletroforético das amostras de colágeno em batelada
do Protocolo I estão representadas na Figura 18. As três amostras apresentaram
as cadeias alfa (α1 e α2), porém com menor intensidade, enquanto, que a cadeia
β não foi visualizado
Figura 18 - SDS-PAGE (10%) do colágeno obtido a partir do extrato de colágeno. (P) proteína de marcador de peso molecular, (SC1) colágeno limpo, (SC2) colágeno pouco
precipitado, (SC3) colágeno com cristais.
38
O perfil eletroforético das soluções de descarte obtidos através do processo
de extração do colágeno estão representadas na Figura 19, destacando-se a
presença das quatro bandas de proteína do colágeno (alfa (α1 e α2), Beta (β) e
gama (γ)), além de outros contaminantes que podem ser alergênicos.
A B
Figura 19 - SDS-PAGE (10%) das soluções de descarte. Imagem A = (P) proteína de
marcador de peso molecular, (1ºGel) solução de colágeno precipitado com NaOH 1º camada da formação do gel, (2ºGel) solução de colágeno precipitado com NaOH 2º camada da formação do gel, (CC1) precipitado do AL3 amarelado e límpido, (CC2) precipitado do AL3 formando uma pele, (CC3) precipitado do AL3 branco, (AL1) solução de NaOH pH 6. Imagem B = (P) proteína de marcador de peso molecular, (SC001) solução
do colágeno precipitado com etanol.
4.6 Efeito de hidrolise enzimática sobre a estrutura da escama inteira
Para se observar o efeito da hidrólise sobre a estrutura da matéria-prima,
escamas inteiras, submetidas à hidrólise, suas imagens foram registradas através
de máquina digital Olympus C7070WZ, adaptada ao microscópio Olympus BX41TF
com aumento de 100 vezes (Figura 20 A). Foi observada na Figura 20 B
modificações na estrutura da escama.
39
A B
Figura 20 – Escamas de corvina hidrolisadas. Visualizadas em microscópio Olympus BX41TF, com aumento de 100x. (A) escama inteira não hidrolisada, (B) escama inteira hidrolisada.
4.7 Análise do hidrolisado por eletroforese em gel de policrilamida – SDS –
PAGE
O grau de hidrólise calculado a partir da relação entre a concentração do
padrão de µg de L-serina, após reação com o OPA (340nm), foi de 14,7% da fração
SC1. O perfil eletroforético das amostras hidrolisadas revela que apesar do grau
de hidrolise médio obtido o processo foi eficiente e gerou massa considerável de
proteínas e peptídeos de menor massa molecular do que a matéria prima original
que foram as escamas (Figura 21).
Figura 21 - Eletroforese dos hidrolisados em gel policrilamida (Tricina-SDS-PAGE 16% resolving gel, spacer gel 10%, stacking gel 4%). (EI) hidrolisado de escama inteira,
(EP) hidrolisado de escama em pó, (SC1) hidrolisado do colágeno bruto.
40
4.8 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
O espectro do infravermelho das amostras de cada protocolo de extração do
colágeno está demonstrado na Figura 22, na qual estão indicados os principais
níveis vibracionais de absorção observadas. Em todos os espectros foi possível
observar níveis vibratórios de estiramento de grupos carbonila (C=O) na região
entre 1600-1700 cm-1 (banda 2). Foi observado picos características de
deformação angular de N-H e estiramento C-N na região entre 1550 e 1400 cm-1
(banda 3) e estiramento N-H e C-H na região de 1200 cm-1 (banda 5), assim como
as bandas de estiramentos N-H acoplados com pontes de hidrogênio na região de
3400 cm-1 (banda 1), caracterizando, desta forma, a presença dos aminoácidos
constituintes das fibras de colágeno nas amostras analisadas. Além das bandas
características dos aminoácidos, foi possível observar bandas características de
grupamentos fosfato de hidroxiapatita na região de 600 (banda 7) e 1100 cm-1
(banda 5), assim como as bandas características de íons OH da ligação P-OH em
700 cm-1 (banda 6), ambas se mostrando mais intensas nos protocolos de extração
P2 e P3.
41
Figura 22 - Espectros de FTIR dos processos extrativos utilizados.
42
4.9 Espectroscopia de massas por infusão direta
A espectrometria de massa é uma técnica analítica física para detectar e
identificar moléculas de interesse por meio da medição da sua massa e da
caracterização de sua estrutura química. Analisando as amostras do extrato de
colágeno SC1, SC2 e SC3 foi possível observar a presença dos íons moleculares
(M+ + H) correspondentes aos aminoácidos, glicina (Figura 23), prolina (Figura 24),
lisina (Figura 25) e hidroxiprolina (Figura 26). A amostra SC2 confirmou a presença
mais pura em relação ao cálculo da massa de prolina e lisina.
Figura 23 - Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido Glicina. Amostras
SC1, SC2 e SC3.
43
Figura 24 - Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido Prolina. Amostras SC1, SC2 e SC3.
44
Figura 25 - Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido Lisina. Amostras SC1, SC2 e SC3.
45
Figura 26 - Identificação do íon molecular (M++H) do aminoácido Hidroxiprolina. Amostras SC1, SC2 e SC3.
46
5. DISCUSSÃO
O beneficiamento industrial da pesca gera elevada quantidade de resíduos,
entre elas as escamas. Elas podem representar fontes valiosas de colágeno e seu
hidrolisado pode ser utilizado nas indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética
e como biomateriais. Um dos aspectos importantes neste contexto diz respeito à
disponibilidade de matéria-prima. O rendimento da escama encontrado neste
trabalho foi semelhante aos obtidos por Wang et al. (2013). Ainda que
aparentemente baixo (2,4%), há de se considerar que este trabalho focou nas
escamas de uma única espécie, a corvina. O sentido disso foi o de se testar um
conceito e dar início a resposta a uma pergunta/hipótese e ao entendimento das
etapas envolvidas na extração de colágeno se utilizando este recurso como
matéria-prima. Certamente um sistema produtivo consideraria escamas de diversas
espécies, o que aumentaria substancialmente a disponibilidade desta matéria-
prima.
No tocante a composição química da escama, o teor de proteína bruta (N x
6,25) de 45,82 % foi concordante com o encontrado por Sankar et al. (2008).
Segundo os autores essa quantidade pode variar de 41% a 84%, sendo que o
restante é o fosfato e carbonato de cálcio. O elevado teor de resíduo mineral
determinado nas escamas de corvina (44,7%) deve-se a presença de hidroxiapatita
resultados concordam com Wang et al. (2013). A presença deste mineral foi
confirmada pelas análises de infravermelho e espectro de massa de alta resolução.
O baixo teor de lipídio da escama foi semelhante ao encontrado por Silva (2010)
para cabeças e ossos da espécie carpa comum (Cyprinus carpio) que foi de 3,7%.
As extrações dos três protocolos (P1, P2 e P3) resultaram em rendimentos
semelhantes aos obtidos por Wang et al. (2013) que relataram rendimento de
20,3% de colágeno de escamas da corvina amarela (Pseudosciaena crocea). O
teor de proteína bruta e rendimento foi maior no P1 e na produção em batelada
deste protocolo foi observado rendimento 27% menor. Essa queda pode ser
explicada como decorrente das etapas do processo de extração (homogeneização,
filtração e centrifugação), que em escala maior levou a perdas maiores. Atualmente
o laboratório não está preparado com equipamentos para realizar uma extração em
escala maior. Apesar disso, esse processo foi importante como exercício, pois
47
através dele foi possível perceber com mais clareza os pontos do processo a serem
melhorados. Além disso, também gerou material suficiente para a determinação de
algumas características interessantes do colágeno produzido. Após liofilizado ele
resultou numa película (filme) transparente, homogênea e muito resistente, também
encontrado por Quintero e Sobral (2000); Souza e Bezerra (2010) e Zavareze
(2014).
A diluição do colágeno foi realizada com ácido acético 0,5M, também
utilizado por Sujithra et al. (2013) e Zhang et al. (2011). No entanto, foi percebido
que isto interferiu nos resultados de determinação de proteína, principalmente pelo
método de Bradford. Este fato foi confirmado ao se proceder uma curva de
calibração usando água e ácido acético como diluente da soroalbumina (BSA),
quando foi possível observar o efeito do ácido acético na diminuição da capacidade
do azul de Coomassie em se ligar a proteína. Segundo (ZAIA et al., 1998) existem
poucas substâncias interferentes no método de Bradford. Estes interferentes
normalmente reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante ou
reagem com o corante causando aumento na absorbância. Já o método de Lowry
apresentou sensibilidade, mas de forma distinta para corar o BSA e o colágeno.
Como a utilização do BSA como padrão poderia subestimar os teores de proteínas
nas amostras de colágeno, se optou pela realização de uma curva de calibração de
colágeno. Para esta curva foi escolhido o colágeno que se apresentou mais puro
entre as amostras, o CC1 (Figura 19 A), como padrão para os cálculos de teores
de proteínas nas diversas frações e extratos.
O colágeno extraído (frações SC1, SC2 e SC3) apresentaram teores de
proteína semelhantes ao constatado na matéria-prima, sugerindo que os processos
de extração não foram eficientes em concentrar esta classe de biomolécula. Além
disso, nas soluções de descarte os teores somados de proteína representaram uma
perda de 20%, indicando grande perda de proteína ao longo do processo de
extração. Estas perdas também foram retratadas por Silva (2010). Segundo o autor,
o processo alcalino/ácido é responsável pela eliminação das proteínas não
colagênicas; muitas delas são, inclusive, alergênicas (Zhang et al., 2009). Após a
extração em batelada do P1, a biomassa retida na filtração do colágeno solubilizado
em ácido acético 0,5M apresentou um teor de proteína de 36,4%. Este resultado
mostra claramente a grande perda de proteína no processo. No entanto, qual o teor
48
de colágeno presente nesta fração ainda permanece para ser resolvida e sugere a
oportunidade para ainda se buscar melhoria na eficiência do processo de extração.
Um dos aspectos que levou às perdas de proteínas nas soluções de descarte
foi pela solubilização de proteínas pela presença de sal. Como é sabido, com o
aumento da força iônica, os íons carregados provenientes da dissociação dos sais
passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre as
próprias moléculas de proteína e aumentando a sua interação com a água. A esse
fenômeno dá-se o nome de salting-in. Deste modo, tem-se um aumento na
solubilidade da proteína em meio aquoso. Segundo Ogawa e Maia (1999) o
colágeno é solúvel em solução de sal, em meio ácido e em meio alcalino, sendo
portanto, inevitável a perda de colágeno nas soluções de descarte.
As modificações realizadas nos protocolos originais foram introduzidas com
a intenção de tornar o processo mais eficiente. No entanto, estas práticas não
resultaram em melhora perceptível de processo ou de eficiência. Um dos
parâmetros de eficiência diz respeito a ausência de contaminantes no colágeno
purificado. Apesar da constatação de outras proteínas no colágeno purificado (SC1,
SC2 e SC3), o aparecimento de contaminantes também foi constatado por diversos
autores (WANG et al., 2013; TAMILMOZHI et al., 2013; KITTIPHATTANABAWON
et al., 2010).
Não obstante, o perfil eletroforético do colágeno extraído pelos protocolos
P1, P2 e P3 confirmou a presença das cadeias peptídicas que o compõem. Da
mesma forma, o perfil eletroforético das amostras de colágeno produzidas em
batelada (SC1, SC2 e SC3) também confirmam a presença das cadeias α1 e α2.
Segundo Pati et al. (2010) a presença de α1 e α2 indica que o colágeno é do Tipo
I, ainda que a relação 2:1 entre α1 e α2 (SOUZA e BEZERRA, 2010) não pôde ser
estabelecida com clareza. Outro aspecto que ainda merece confirmação se deve a
fato de que não foi possível constatar a presença da cadeia β na eletroforese.
Considerando que mesmo as cadeias α apareceram de forma tímida, é possível
que não tenha sido aplicada quantidade suficiente de proteína no gel para a
coloração com azul de Coomassie, menos sensível que a coloração por nitrato de
prata. Perdas das bandas α, β e y podem estar relacionadas com a concentração
e o ácido utilizada na extração do colágeno (GIMENEZ et al., 2005a). Outro fator
que impacta na extração e manutenção da integridade do colágeno diz respeito a
49
remoção ou não de sal. Caso não seja removido da amostra pode mudar a estrutura
do colágeno, aumentando sua solubilidade e, desta forma, favorecendo a sua saída
para as soluções utilizadas durante a extração (GIMENEZ et al., 2005b). Parece ter
sido este o caso, considerando a grande quantidade de proteína perdida nas “águas
de lavagem”.
Os resultados de espectroscopia de infravermelho dos protocolos P1, P2 e
P3 confirmaram a presença das interações intermoleculares das ligações amidas
nas fibras do colágeno (TAMILMOZHI, VEERURAJ, ARUMUGAM, 2013; ZHAO,
CHI, 2009). Da mesma maneira foi possível identificar a presença das interações
características da hidroxiapatita (GALIA et al., 2011). Os resultados da
espectroscopia de massas por infusão direta demonstraram nas amostras de
colágeno SC1, SC2 e SC3 a presença dos íons moleculares (M+ + H)
correspondentes aos aminoácidos glicina (Figura 23), prolina (Figura 24), lisina
(Figura 25) e hidroxiprolina (Figura 26), constituintes da fibra do colágeno (SIBILLA
et al., 2015).
6. CONCLUSÕES
As análises de composição química das escamas de corvina demonstram
uma ótima fonte de colágeno e minerais.
A extração do protocolo 1 em batelada apresentou perdas importantes de
colágeno e de proteínas não colagenosas nas águas de lavagem.
A extração de colágeno de escamas foi viabilizada por diferentes protocolos
de extração, porém eles não renderam colágeno íntegro purificado.
Não foi possível isolar o colágeno nas frações SC1-3 da extração em
batelada, por eletroforese.
O ácido acético interfere na sensibilidade da leitura de determinação de
proteínas, tendo em vista que ela subestima os valores para o método de Bradford;
por isso a necessidade de se utilizar um padrão de colágeno.
As analises espectroscópicas confirmaram a presença das ligações
características da fibra de colágeno, assim como seus aminoácidos constituintes
confirmando a presença da proteína nos extratos produzidos.
50
As escamas apresentaram composição interessante para o uso de
biomateriais, pela presença simultânea de colágeno e hidroxiapatita.
51
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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