UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE FARMÁCIA

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE NANOPARTÍCULAS

Prof. Rilton Alves de FreitasCentro e Ciência da Saúde, Universidade do

Vale do Itajai, Itajai-S.C., Brasil

Aula curso Second Brazilian School on Nanobiotechnology-Itajai-S.C.4-10 de Novembro 2007 (rede de nanobiotecnologia-NANOBIOTEC

ASPECTOS GERAIS DE NANOPARTÍCULAS

• Fatores de toxicidade de nanopartículas (Nighswonger, 1999; Oberdörster et al., 2005; Smart et al. 2005)::

- Como citado anteriormente a razão área superficial pela massa, pois uma grande área superficial gera partículas com uma maior área de contato com membranas células, assim como uma grande capacidade de absorção e transporte de substâncias tóxicas.

- O Tempo de retenção da partícula, pois quanto maior o tempo de contato da mesma com a membrana celular, maior a chance de dano. Este fator incorpora o conceito de mobilidade de partícula, ou pelo clearance ou migração para tecidos adjacentes.

- Reatividade ou toxicidade inerente do composto químico contido com a partícula.

ASPECTOS GERAIS DE NANOFIBRAS

• Tamanho da fibra x respirabilidade (capacidade de penetrar na região centro-acinar do pulmão).

– Fibras com comprimento maior que 15 um apenas são respiráveis se apresentam uma espessura menor que 5 um.

– Fibras longas (>17 um) tornam difícil a fagocitose por macrófagos, promovendo uma resposta crônica que contribui para a fibrose pulmonar.

– Fibras curtas, menores que 7 um, são por outro lado facilmente fagocidadas, e removidas por macrófagos alveolares (DONALDSON e TRAN, 2004; YE et al., 1999; DONALDSON et al., 1992).

• A Biopersistência: partículas longas são dificilmente fagocitadas por macrófagos.

– Fibras biosolúveis são capazes de se difundir reduzindo e serem fagocitadas mas facilmente, gerando uma baixa biopersistência e reduzindo assim a toxicidade de fibras longas longas (maiores que 20 um).

• Reatividade ou toxicidade inerente, dependendo basicamente dos componentes químicos da nanopartículas.

REGULAMENTAÇÃO DA NANOTOXICOLOGIA

• AVALIAÇÃO COMPLETA DO RISCO DE PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS (Friedrichs, Schulte, 2007)– Identificação do risco– Caracterização do risco– Avaliação do risco– Prevenção e controle o risco– Avaliação das medidas de controle do

Obs:. Royal Society and the Royal Academy of Engineering of UK government, Recommend nanoparticulate materials to be treated as new substances.

Tempo para desenvolver um Tempo para desenvolver um medicamentomedicamento

5.0000 a 10.000 5.0000 a 10.000 selecionadosselecionados

250 entram em 250 entram em teste pré-clínicoteste pré-clínico

Apenas 1 chega ao Apenas 1 chega ao mercadomercado

00 22 44 66 88 1010 1212 15151414

AnosAnos

Invenção e desenvolvimento Invenção e desenvolvimento

Testes pré-clínicos Testes pré-clínicos (testes laboratoriais em (testes laboratoriais em animais)animais)

Fase I – 20 a 80 voluntários Fase I – 20 a 80 voluntários saudáveis para determinar saudáveis para determinar segurança e dosagemsegurança e dosagemFase II – 100 a 300 Fase II – 100 a 300

voluntários para determinar voluntários para determinar eficácia e efeitos colateraiseficácia e efeitos colaterais

Fase III – 1.000 a 20.000 pacientes Fase III – 1.000 a 20.000 pacientes voluntários para monitorar reações voluntários para monitorar reações adversas em uso de longa duraçãoadversas em uso de longa duração

Aprovação do GovernoAprovação do Governo

Fase IV – Teste adicional pós-Fase IV – Teste adicional pós-comercializaçãocomercialização

Patente Patente

solicitadasolicitada

Patente Patente

concedidaconcedida

5 entram 5 entram

em testes em testes

clínicosclínicos

Avaliação toxicológica – Estudos Pré- clínicos

Estudos Agudos

• DL50 Oral• DL50 Dérmica • CL50 Inalatória• Irritação / Corrosão Ocular• Irritação / Corrosão Dérmica• Sensibilização Cutânea

Avaliação de perigo

Classificação toxicológica

Avaliação toxicológica

Estudos sobre mutagenicidade• Mutação gênica (procariontes) • Mutação cromossômica (eucariontes)

Estudos sobre carcinogenicidade• Camundongo (18 meses) • Rato (24 meses)

Estudos sobre teratogenicidade• Coelho • Rato

Proibição do Registro

Estudos de reprodução e prole

Estudos de curto prazo• Roedor (90 dias) • Não roedor (1 ano)

Avaliação toxicológica

Estudos de longo prazo e carcino• Camundongo (18 meses) • Rato (24 meses)

Estudos dos efeitos teratogênicos

Estudos de neurotoxicidade

NOAEL

Ingestão Diária Aceitável (IDA) - quantidade máxima que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece não oferecer risco apreciável à saúde, à luz dos conhecimentos atuais

Definições importantes

Avaliação toxicológica

Dose 3X

Controle

Dose 2X

Dose X

NOAEL

Avaliação toxicológica

NOAEL

IDA = NOAEL

Fator de incerteza

Fatores de incerteza

TESTES PRÉ-CLÍNICOS:MÉTODOS TOXICOLOGICOS “IN

VITRO”

Azul de tripan

QUANTIFICAÇÃO DE CRESCIMENTO

MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

http://www.ib.amwaw.edu.pl/home/dslado/video/mtt.html

Apoptosis Necrosis

Alaranjado de Acridina

AO stains DNA

Small intense spots Diffuse spots

Processos necróticos: Lactato desidrogenase

LACTATO PIRUVATO

NAD+ NADH

• Processos terminais– Nucleases: Fragmentação do DNA– Morfologia (nuclear)

• Processos iniciais– Fosfatidilserina– Caspases

QUANTIFICAÇÃO APOPTOSE

DAPI TUNEL/IODETO PROPIDIO

BROMETO DE ETIDIO ALARANJADO DE ACRIDINA

• Células saudáveis– Membrana polarizada DAPI – Sistema de transporte ativo (Azul 460 nm)

• Células vitais– Membrana polarizada BROMETO DE ETIDIO– Sem sistema de transporte ativo (Vermelho 602 nm)

• Células intactas– Membrana despolarizada BROMETO DE ETIDIO– Sem sistema de transporte ativo (Vermelho 602 nm)

• Células mortas– Membrana despolarizada BROMETO DE ETIDIO– Sem sistema de transporte ativo IODETO PROPIDIO

(Vermelho 603 nm)

--

--

-

-

--

-

-

-- Annexine-FITC

normal

early

late

+ PI

Espalhamento (Forma, Granulos)

size

Fluorescence Verde (FITC)

Fluorescence Vermelho (PI)

Citometria de Fluxo

Dados Típicos

Forward scatter Espalhamento frontal

Side scatterEspalhamento lateral

Forward scatter

Side scatter

100 101 102 103 104

FL

3-H

eig

ht

100

101

102

103

104

FL1-Height Annexine-FITC

PI

Early apoptotic

Late apoptoticNecrotic

Viable

?

PI vs. Annexin-FITC)

Propidium iodide = DNA

BRdU = Sintese DNA

Ciclo celular + corantes

G1

S

G2

M

Apoptose

S=DNA synthesisM=cell dividesG = gap

LosingDNA

G2/MG1

SO

Red fluorescenceG

reen

G2/MG1

SO

Red fluorescence

Gre

en

Higher dilution rateLower death

Lower dilution rateHigher death

CASPASE -3 WESTERN BLOT OU IMMUNOBLOT

FRAGMENTAÇÃO DNA

Células Caco-2

culture dish

insert Basolateral medium

apical medium

Caco-2 cell monolayer

MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA BIODISPONIBILIDADE “IN VITRO” DE

NANOPARTÍCULAS

Célula Caco-2Meio E-MEM 10% SFB

200.000 células/mL

Matriz extracelular

Permeação aparente (Papp)

Porção apical

Incubação14 – 28 dias37oC/5%CO2TEER 350 *cm2

BasoLateral

Tempos0 – 24 horasIntervalo 2h

CLASSIFICAÇÃO BIOFARMACÊUTICA

Solubilidade e Permeabilidade são os parâmetros chaves que controlam a absorção de fármacos (AMIDON, 1995)

Classe I: Fármacos de alta solubilidade e alta permeabilidade;

Classe II: Fármacos de baixa solubilidade e alta permeabilidade;

Classe III: Fármacos de alta solubilidade e baixa permeabilidade;

Classe IV: Fármacos de baixa solubilidade e baixa permeabilidade

TEER: Resistência Elétrica Transepitelial

> 300 cm2 < 300 cm2

Manitol

 

Apical 

Basal 

enterocito 

 

APICAL 

*

CYP3A4

BASAL 

enterocito 

 

APICAL 

CYP3A4

BASAL 

enterocito 

*X

 

APICAL 

BASAL 

enterocito 

*

 

APICAL 

BASAL 

enterocito 

Pgp

CYP3A4

OATP

BIODISPONIBILIDADE

Classificação do fármaco segundo o Sistema de Classificação Biofarmacêutico.

ClassePapp Razão

dose/solubilidade

1 Altamente solúveis e altamente permeáveis

> 10-5 < ou = 0,5

2 Baixa solubilidade e alta permeabilidade

> 10-5 > 0,5

3 Alta solubilidade e baixa permeabiliade

< 2 x 10-6 < ou = 0,5

4 baixa solubilidade e baixa permeabilidade

< 2 x 10-6 > 1

TEMPO (h)

Conc.Basal

tg

• Papp > 10-6 cm/s: 100% absorvido• 10-7 < Papp < 10-6 cm/s: 1 – 99% absorção• Papp < 10-7 cm/s: < 1 % absorção

Bioequivalência:

• Alta permeabilidade Papp > 10-5 cm/s

• Baixa permeabilidade Papp < 10-5 cm/s

TESTES PRÉ-CLÍNICOS: TESTES TOXICOLÓGICOS “IN VIVO”

Acridinas = intercalantesLevam a mudança de fase de leitura

Dímero de pirimidinaLesão mais comum do UV curto

(fotoliase)

Nem sempre a droga é mutagênicaAflatoxina do fungo do amendoim

é ativada perto do núcleo

4. MUTAGÊNESE (GENOTOXICIDADE) E CARCINOGÊNESE

Reparo de erros de pareamento“Mismatch repair”

Teste de AMES10 bilhões de Salmonella his-

Uma reversão de mutação torna-as his+

Expansão de repetiçõesHuntintina expande de 6-31 rep.

para 36-82

GENOTOXICIDADE

CamundongoFêmur

Remoção dasepífises 1) Contagem

câmara de Neubauer

2) Viabilidade 85%

3) 1.000.000 cel/mL

Lâminas Jateadas

Agarose1%

Agarose Low melting

0,75%

Incubar 1h 37C/5%CO2

Controles DMSOMMS ou H2O2

Lavar com PBS gelado

Tampão de lise Tampão de corrida25 V

300 mA30 min

Tampão de NeutralizaçãoBrometo de etídeo

DMSO: Núcleo íntegro (controle NEGATIVO de Genotoxicidade)MMS: Fragmentação nuclear (controle POSITIVO de Genotoxicidade)

Método de classificação de Kobayashi et al. (1995); Miyamae et al. (1998) 1)sem cauda2) cometas com pequenas caudas (caudas com comprimento < 25% da cabeça)3) Cometas com caudas de tamanho médio (caudas com comprimento entre 25% e 100% da cabeça)4) Cometas com caudas longas (comprimento da cauda > que a cabeça)5) Cometas mal definidos ou com cabeça pequena.