UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ - Inícionbcgib.uesc.br/genetica/admin/images/files/TESE Elizabeth Duarte... · ELIZABETH AMÉLIA ALVES DUARTE ILHÉUS - BAHIA - BRASIL Fevereiro

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

Metagenômica de solo de Mata Atlântica e bioprospecção

de micro-organismos degradadores de glicerol bruto, co-

produto da produção de biodiesel

ELIZABETH AMÉLIA ALVES DUARTE

ILHÉUS - BAHIA - BRASIL

Fevereiro de 2013

ii





Tese apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte das

exigências para obtenção do título de

Doutor em Genética e Biologia

Molecular.

Área de concentração: Biotecnologia e

Genômica.

ILHÉUS - BAHIA - BRASIL

Fevereiro de 2013

iii





Tese apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte

das exigências para obtenção do título

de Doutor em Genética e Biologia

Molecular.

Área de concentração: Biotecnologia e

Genômica.

APROVADO em 28 de fevereiro de 2013.

Dr. Gervásio Paulo da Silva (UNEB)

Dr. Maurício Egídio Cantão (EMBRAPA-CNPSA)

Dr. Ronaldo Costa Argôlo Filho (UESC)

Dr. Carlos Priminho Pirovani (UESC)

______________________________

Dr. Martin Brendel (UESC - Orientador)

iv

A Deus, senhor da minha vida.

AGRADEÇO

A todos os Professores da

UESC, UFRPE e da UEPB, que

em muito contribuíram para esse

momento, em especial o Prof.

Dr. Júlio César de Mattos

Cascardo (in memorian).

DEDICO

Aos meus pais Dorgival e

Sônia, ao meu irmão Lamark

e meu marido Thiago.

OFEREÇO

v

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Programa de Pós-Graduação

em Genética e Biologia Molecular (PPGBM), pelo apoio institucional e

capacitação profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela

concessão da bolsa de estudos, em especial ao Dr. Cláudio Cunha.

Aos meus orientadores: Júlio César de Mattos Cascardo (in memoriam), Martin

Brendel e Leandro Lopes Loguercio, pelos ensinamentos, dedicação e confiança

que certamente alicerçaram minha formação e conduta profissional e pessoal.

Aos professores do PPGGBM-UESC em especial ao Prof. Dr. Leandro Loguercio,

Carlos Priminho Pirovani, Márcio Costa e Cristina Pungartnik, pelos ensinamentos

e trocas de experiências nas disciplinas e em conversas informais.

À Dra. Lucymara Lima (UFRN) e a Dra. Ana Tereza Vasconcelos (LNCC), sou

eternamente grata pela ajuda emocional e profissional quando mais precisei

devido à ausência do querido Júlio Cascardo.

Ao Maurício Cantão, pela paciência e perspicácia nos ensinamentos ”virtuais” em

Bioinformática, pois assim pude verificar amplamente meus dados do ponto de

vista biológico.

As secretárias do PPGGBM-UESC: Luciana Calazans, Fabrícia Silva e Katia

Bezerra, pela presteza e apoio nestes anos de doutoramento.

Aos técnicos de laboratório que se tornaram amigos durante esta jornada: Antônio

Carlos (Pelé), Robson Dias e Cristiane Souza (Tracy).

Aos colegas do CBG agradeço, pelo suporte na execução dos experimentos e os

vários momentos de descontração inesquecíveis e fundamentais.

Aos amigos que fiz na Bahia: Dahyana Britto, Juliane e Josiane Amorim, Cristiano

Dias, Gileno Lacerda, Sanderson Silva, Flamélia, Lorena Kruschewsky, Allan

vi

Pereira, Jamilly Azevedo e alguns outros que foram parceiros profissionais,

amparo fraterno fundamental para quem estava longe dos laços familiares.

À Andréa Barros, cujo convívio revelou uma amizade sincera e minimizou a

insuportável saudade de casa, da família e dos amigos distantes.

Agradeço aos pesquisadores e doutores Márcia Nóbrega, Roseane Cavalcanti,

Péricles Albuquerque e Alessandra Ramos, pelo fundamental alicerce acadêmico

concedido desde o período de iniciação científica.

Aos meus pais (Dorgival e Sônia) e ao meu irmão (Lamark) e tantos outros

familiares que acreditaram no meu sonho e compreenderam minha ausência ao

longo dessa jornada acadêmica, meu agradecimento é eterno, pois juntos

construímos nossa família sólida e fraterna.

Ao meu querido marido Thiago Oliveira, pelo carinho e cumplicidade na execução

deste trabalho. Foi na trajetória acadêmica que nos conhecemos e solidificamos

nossa vida pessoal e profissional através do amor construtivo. Agradeço-lhe

também por me presentear com nosso cãozinho de estimação ”Johnnie”, cuja

relação de amizade é incondicional e agradabilíssima.

A Deus, os meus agradecimentos são diários e constantes, pois me permitiu não

somente a vida, mas promoveu as faculdades físicas e mentais para conduzir

minha trajetória profissional e pessoal com caráter, humildade e enorme senso

crítico frente as adversidades do dia a dia.

vii

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 2

Figure 1. Production of CO2 in tropical Atlantic Rainforest soil evaluated by the method of Bartha. Values in the graph are mean of three replicates. ‘C’: control microcosm, only with soil + minimal medium (grey bars); ‘8%’: control microcosm plus the addition of this percentage of crude glycerol (black bars)........................56 Figure 2. Characterization by PCR of 19 microbial isolates cultivated in vitro on medium containing 10% (v/v) crude glycerol. Electrophoresis in 1% agarose gel. Amplification results for bacterial 16S rDNA (A) and yeast 26S rDNA (B) universal primers. Expected molecular weights for the respective fragments are indicated by arrows.....................................................................................................................56

Capítulo 3

Figura 1. Perfil de emissão de CO2 de micro-organismos presentes nos solos de plantação de cacau abandonada (PC-A) e em produção (PC-P), pelo método de Bartha. Perfis de emissão diária (a, b) e acumulado no período (c, d) são apresentados. Os tratamentos testados são microcosmos sem adição de glicerol bruto (ctrl) e com adição de dois níveis de glicerol bruto (4 e 8%, m/m).......................................................................................................................65 Figura 2. Distribuição dos grupos taxonômicos (famílias) de bactérias e fungos encontrados no solo de PC-A enriquecido com 10% de glicerol bruto. Os valores foram obtidos, em porcentagem, considerando o número de hits identificados para cada família de bactérias (a) e de fungos (b), obtidos pelo programa MG-RAST. Porção da diversidade bacteriana e fúngica examinada cujas famílias possuem abundâncias relativas < 2% são indicadas por uma elipse. Famílias que contém os taxa referentes aos isolados cultiváveis identificados são indicadas por molduras em retângulo..........................................................................................69 Figura 3. Perfis de crescimento de leveduras e bactérias em meio mínimo com 10% de glicerol puro (círculo cheio) e glicerol bruto (círculo aberto), utilizados como única fonte de carbono. Foram realizadas três repetições do experimento para cada ponto de tempo.....................................................................................71

Capítulo 4

Figura 1. Diversidade filogenética de sequências metagenômicas, gerada pelo programa MEGAN baseado no BLASTX utilizando e-value de 1e-5. Os tamanhos dos círculos em escala logarítmica representam o número de leituras atribuídas a cada táxon. Sequências em vermelho (eDNAC - solo controle, sem glicerol bruto), em azul (eDNA10 - solo enriquecido com glicerol bruto a 10% v/v)..........................................................................................................................87

viii

Figura 2. Distribuição significativa entre os domínios de Bacteria, Archaea e Eukaryota gerado a partir da análise comparativa das sequências das amostras eDNAC (círculo branco) e eDNA10 (círculo preto). O gráfico da esquerda mostra a proporção de sequências atribuídas, enquanto que o gráfico da direita mostra a diferença entre as proporções com intervalo de confiança de 95% gerado pelo programa STAMP...................................................................................................88 Figura 3. Gráfico de dispersão indicando a proporção relativa de espécies de micro-organismos, obtidas a partir do total de sequências válidas para os metagenomas eDNAC (círculo branco) e eDNA10 (círculo preto), obtidas pelo programa STAMP...................................................................................................90 Figura 4. Abundância de sequências relacionadas a vias metabólicas, comparativa entre os metagenomas eDNAC (círculo branco) e eDNA10 (círculo preto), analisados pelo programa STAMP.............................................................91 Figura 5. Gráfico de dispersão indicando a proporção relativa de vias metabólicas, obtidas a partir do total de sequências válidas para os metagenomas eDNAC (circulo branco) e eDNA10 (circulo preto), analisados pelo programa STAMP...................................................................................................................93

ix

LISTA DE TABELAS

Capítulo 2 Table 1. Growth curve of five isolates cultivated in vitro on medium containing

10% crude glycerol as sole carbon source............................................................57

Table 2. Identification of the five microorganisms isolated in vitro on medium

supplemented with 10% crude glycerol..................................................................57

Capítulo 3

Tabela 1. Análise química dos solos de plantações de cacau em dois sistemas de manejo, coletados em Ilhéus-BA..........................................................66

Tabela 2. Identificação de três micro-organismos isolados in vitro em meio

enriquecido com 10% de glicerol bruto (v/v).........................................69

x

ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. vii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................. ix

EXTRATO ............................................................................................................. xii

ABSTRACT .......................................................................................................... xiv

INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................... 1

Capítulo 1 - REVISÃO DE LITERATURA .............................................................. 4

1.1. Biodiesel ...................................................................................................... 4

1.2. Glicerol bruto (GB): co-produto da produção de biodiesel ........................... 6

1.3. Diversidade microbiana do solo ................................................................... 8

1.4. Potencial biotecnológico de micro-organismos ............................................ 9

1.5. Bioconversão de glicerol por micro-organismos ........................................ 12

1.6. Respirometria de Bartha e avaliação de atividade biológica ...................... 15

1.7. Abordagens metagenômicas ..................................................................... 17

1.8. Pirosequenciamento .................................................................................. 19

1.9. Referências ................................................................................................ 24

Capítulo 2 - BIOPROSPECTION OF BACTERIAS AND YEASTS FROM ATLANTIC RAINFOREST SOIL CAPABLE OF GROWING CRUDE GLYCEROL RESIDUES ....................................................................................... 39

2.1. Abstract ...................................................................................................... 39

2.2. Introduction ................................................................................................ 40

2.3. Material and Methods ................................................................................ 42

2.3.1. Soil samples .................................................................................... 42

2.3.2. Soil microcosms enriched with crude glycerol and respirometric studies .............................................................................................. 43

2.3.3. Isolation of microorganisms in media containing crude glycerol ...... 44 2.3.4. Isolates identification by PCR of rRNA genes .................................. 44 2.3.5. Isolates growth curves in liquid medium containing crude glycerol .. 45

2.4. Results ....................................................................................................... 46

2.5. Discussion ................................................................................................. 47

2.6. Acknowledgements .................................................................................... 52

2.7. References ................................................................................................ 52

2. 8. Figures and tables: .................................................................................... 56

Capítulo 3 – BIOPROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS E LEVEDURAS POTENCIALMENTE CONVERSORAS DE GLICEROL BRUTO .. 58

xi

3.1. Resumo ..................................................................................................... 58

3.2. Introdução .................................................................................................. 59

3.3. Material e Métodos .................................................................................... 60

3.3.1. Amostras dos solos .......................................................................... 60 3.3.2. Microcosmo de solo enriquecido com glicerol bruto e estudo

respirométrico .................................................................................. 60

3.3.3. Obtenção de DNA metagenômico ................................................... 61 3.3.4. Pirosequenciamento e processamento das sequências obtidas ..... 62 3.3.5. Classificação Taxonômica ............................................................... 62

3.3.6. Isolamento o de micro-organismos em meio com glicerol bruto ...... 62 3.3.7. Identificação molecular dos isolados ............................................... 63 3.3.8. Curva de crescimento dos isolados em glicerol puro e bruto ........... 63

3.4. Resultados ................................................................................................. 64

3.5. Discussão .................................................................................................. 71

3.6. Referências ................................................................................................ 75

Capítulo 4 – METAGENÔMICA COMPARADA DE SOLOS DE CABRUCA ABANDONADA ENRIQUECIDA COM GLICEROL BRUTO ................................ 80

4.1. Resumo ..................................................................................................... 80

4.2. Introdução .................................................................................................. 81

4.3. Material e Métodos .................................................................................... 82

4.3.1. Amostras de solos ........................................................................... 82

4.3.2. Enriquecomento da amostra de solo com glicerol bruto .................. 82 4.3.3. Obtenção de DNA metagenômico ................................................... 83 4.3.4. Pirosequenciamento e processamento das sequências obtidas ..... 83

4.3.5. Classificação Taxonômica e Funcional ............................................ 84

4.4. Resultados e Discussão ............................................................................ 84

4.4. Referências ................................................................................................ 92

5. CONCLUSÕES GERAIS .................................................................................. 96

xii

EXTRATO

DUARTE, Elizabeth Amélia Alves, D.Sc. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA, fevereiro de 2013. Metagenômica de solo de Mata Atlântica e bioprospecção de micro-organismos degradadores de glicerol bruto, co-produto da produção de biodiesel. Orientadores: Júlio Cezar de Mattos Cascardo†, Martin Brendel. Co-orientador: Leandro Lopes Loguercio.

A escassez energética e a utilização de combustíveis fósseis é uma

preocupação mundial. Portanto, alguns combustíveis limpos, como o biodiesel,

estão sendo pesquisados e utilizados em todo o mundo. Porém, a crescente

produção de biodiesel promove o acúmulo do seu principal co-produto (o glicerol

bruto), acarretando em prejuízos econômicos e ambientais. Assim, aplicações

alternativas para o glicerol bruto estão sendo estudadas. Neste trabalho foi

possível isolar, selecionar e identificar potenciais micro-organismos de solo de

Mata Atlântica Tropical, típico da região Sul da Bahia, como potenciais

bioconversores de glicerol bruto obtido do biodiesel produzido do óleo de pinhão

manso (Jatropha curcas L). Foram utilizadas metodologias de baixo custo e com

boa reprodutibilidade, tais como o método respirométrico de Bartha, a PCR com

primers universais para bactérias e leveduras, e avaliações temporais de

densidade ótica. As análises descritivas in silico dos dados obtidos por

pirosequencimanto direto de amostras de DNA de solo (eDNA) viabilizaram os

estudos de diversidade e dos aspectos funcionais e metabólicos com implicações

biotecnológicas. As taxas de biodegradação da matéria orgânica foram

monitoradas pelo método respirométrico de Bartha, através dos perfis de

liberação de CO2 de duas amostras de solo do sistema agroflorestal ‘cabruca’

enriquecidos com 4% e 8% (v/m) de glicerol bruto. Isto permitiu selecionar o solo

de cabruca não cultivado (NC) e a maior concentração de glicerol bruto testada,

que foram utilizados nos demais experimentos deste trabalho. Foram isolados 18

micro-organismos crescidos em meio com 10% de glicerol bruto (GB) como fonte

de carbono. Os respectivos perfis de crescimento desses micro-organismos foram

analisados também em glicerol puro (GP), ambos por espectrofotometria. De

modo geral, as leveduras Meyerozyma guilliermondii, Rhodotorula mucilaginosa e

Trichosporon moniliiforme apresentaram melhor crescimento em meio com GB.

xiii

Entre as bactérias Staphylococcus arlettae e Bacillus megaterium cresceram em

meio com GB. As implicações desses resultados no contexto do uso alternativo

do glicerol bruto são discutidas nos capítulos 2 e 3, deste trabalho. Diante da

possibilidade de estudar as comunidades microbianas de solo, assim como a

identificação de prováveis rotas metabólicas codificadas em seus genomas: i) solo

controle, sem glicerol bruto e, ii) solo enriquecido com 10% (v/v) glicerol bruto,

realizamos a análise comparativa desses dois metagenomas por

pirosequenciamento e in silico, através de softwares apropriados para este tipo de

análise. Para os três principais domínios (Bacteria, Archaea e Eukaryota) a

maioria das sequências classificadas foi agrupada no domínio Bacteria (eDNAC:

386635; eDNA10: 167296), enquanto que uma menor quantidade de sequências

foi dividida entre os domínios Archaea (eDNAC: 2274; eDNA10: 311) e Eukaryota

(eDNAC: 2498; eDNA10: 624). Para as amostras eDNAC (855) e eDNA10 (101)

foram obtidas sequências que não apresentaram classificação com nenhum dos

domínios e foi agrupada em no hits, ou seja, sem similaridade com as sequências

depositadas no banco de dados do NCBI. Famílias e espécies de micro-

organismos foram mais representativas em amostra com glicerol bruto e, portanto

estão envolvidas no consócio microbiano de bioconversão dessa fonte de carbono

e precisam ser melhor estudadas. Outras famílias e espécies foram

representativas no metagenoma eDNAC (sem glicerol bruto, como fonte de

carbono), provável fator que restringiu e/ou limitou o crescimento de muitos micro-

organismos. Espécies do gênero Pseudomonas, como: P. resinovorans, P.

alcaligenes, P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida, foram significativamente

abundantes no metagenoma eDNA10 e precisam ser melhor estudadas quanto ao

uso de glicerol bruto, pois são habilidosas em processos de degradação de

hidrocarbonetos aromáticos, tolueno, entre outros poluentes, e em processos de

biorremediação de solos e no controle biológico em plantas.

Palavras chave: Biocombustível, bioconversão de glicerol, diversidade

microbiana, energia limpa, indústria de glicerol.

xiv

ABSTRACT

DUARTE, Elizabeth Amélia Alves, D.Sc., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA, February 2013. Metagenomics of Atlantic Rainforest soil and bioprospection for microorganisms able to degrade crude glycerol, a coproduct of biodiesel production. Advisors: Júlio Cezar de Mattos Cascardo†, Martin Brendel. Co-Advisor: Leandro Lopes Loguercio.

The shortage of energy and the use of fossil fuels is a global concern.

Therefore, clean fuels, such as biodiesel, are being researched and used

throughout the world wild. However, the increasing production of biodiesel

promotes the accumulation of its main by-product (crude glycerol), resulting in

economic and environmental losses. For this reason, alternative applications for

the use of crude glycerol are being studied in biotechnology. In this work, it was

possible to isolate, select and identify potential microorganisms in Atlantic

Rainforest soil typical from south of Bahia, which are potential bioconverters of

crude glycerol obtained from biodiesel production from Jatropha oil (Jatropha

curcas L). The methodologies used were of low costs and reproducible, such as

Bartha's respirometric method, PCR with universal primers for bacteria and yeast,

and temporal assessments of optical densities. We also conducted a robust

analysis from descriptive pyrosequencing through direct DNA samples from soil to

analyze the microbial diversity, as well as their metabolic and functional aspects.

We discuss the implications of this study both for the academic and

biotechnological industry interests. The biodegradation rates of organic matter

were monitored by the respirometric method of Bartha, through assessment of

release of CO2 profiles from cabruca soils, both with 4% and 8% (w/v) crude

glycerol added. This has allowed to select the uncultivated cabruca soil (UC) and

the highest tested concentration of crude glycerol for use in the further

experiments of this work. Eighteen microorganisms were isolated from medium

with 10% crude glycerol (CG) as the carbon source. Their growth profiles were

also analyzed in pure glycerol (PG) by optical density. Generally, yeasts

Meyerozyma guilliermondii, Rhodotorula mucilaginosa e Trichosporon moniliiforme

showed better growth in medium with CG. Among the bacteria, Staphylococcus

arlettae e Bacillus megaterium grew better in medium with CG. The implications of

xv

these results in the context of alternative use of crude glycerol are discussed in

Chapters 2 and 3. Considering the possibility of studying the microbial

communities in diverse ecosystems, as well as the identification of most likely

metabolic pathways encoded in their genomes, metagenomic pyrosequencing

experiments were performed. A comparative analysis between control soil without

crude glycerol and soil enriched with 10% (v/v) crude glycerol were conducted,

using an in silico treatment (bioinformatics) of the data generated. Most identified

sequences were grouped in the domain Bacteria (eDNAC: 386.635; eDNA10:

167.296), while others were divided between the domains Archaea (eDNAC:

2.274; eDNA10: 311) and Eukaryota (eDNAC: 2.498; eDNA10: 624). For samples

eDNAC (855) and eDNA10 (101), the obtained sequences showed no

classification within any of the domains and were grouped into the 'no hits'

category, i.e. sequences with no similarity to accessions deposited in the NCBI

database. More numerous families and species of microorganisms were found in

the sample with crude glycerol, suggesting they are involved in a microbial

consortium for bioconversion of this carbon source. Further studies are required to

test this hypothesis. Fewer other families and species were represented in the

metagenome of soil without crude glycerol; since this represents a treatment with

no carbon source, it is likely that such a condition has limited the growth of many

microorganisms. Species of the genus Pseudomonas, such as P. resinovorans, P.

alcaligenes, P. aeruginosa, P. fluorescens and P. putida were significantly

abundant in the eDNA10 metagenome. Since these species are able to degrade

aromatic hydrocarbons and toluene, among other pollutants, further studies are

warranted to verify their potential application in soil bioremediation processes and

biological control of plants, using crude glycerol as carbon source for their large-

scale production.

Key words: Biofuels, glycerol conversion, microbial diversity, bioremediation,

clean energy, glycerol industry

1

INTRODUÇÃO GERAL

A maior parte da energia consumida no mundo é oriunda de fontes

limitadas e esgotáveis, a exemplo do petróleo, do carvão, do gás natural e, em

menor proporção, das hidrelétricas e da energia nuclear. A escassez desses

recursos tornou-se nas últimas décadas um problema mundial, onde a

concentração de esforços dos diversos segmentos sejam políticos, sociais ou

acadêmicos, tende a ser no sentido de disponibilizar alternativas que visem a

contribuir com a diminuição de impactos ambientais. O Brasil surge neste cenário

mundial como um dos grandes produtores de biodiesel, que se constitui numa

promissora fonte alternativa de energia renovável.

Os óleos vegetais são triésteres de glicerol (ou glicerina), ou seja, produtos

naturais da condensação deste composto com ácidos graxos, cujo peso molecular

é cerca de três vezes maior que o do diesel de petróleo. Visando reduzir a alta

viscosidade dos óleos vegetais, diferentes alternativas estão sendo aplicadas,

com destaque para a transesterificação com etanol ou metanol, que promove a

quebra da molécula destes triglicerídios, gerando mistura de ésteres metílicos ou

etílicos dos ácidos graxos correspondentes. Este processo libera glicerol como

co-produto. O peso molecular desses monoésteres é próximo ao do diesel e

apresentam características físicas semelhantes às deste óleo combustível. Esses

compõem o chamado ‘biodiesel’, que não produz óxido de enxofre, diminui em 1/3

as partículas emitidas, em comparação com o óleo diesel obtido do petróleo, e

pode substituir a este diretamente. Outra característica positiva do biodiesel é a

presença dos ésteres metilados, que são biodegradáveis quando comparados aos

compostos oxigenados recalcitrantes da gasolina e outros derivados do petróleo.

Contudo, um dos entraves da cadeia de produção do biodiesel é, portanto,

o glicerol bruto (GB), principal co-produto do processo de obtenção deste

bicombustível. Estima-se que, para cada 1000 kg de biodiesel produzido, são

gerados 100 kg de GB (10%) que em larga escala torna-se um significativo

excedente, uma vez que a oferta torna-se muito maior que a demanda.

Adicionalmente, este GB contém impurezas (em quantidades variáveis) do

catalisador, álcool, ácidos graxos, sais e água advindos do processo de

transesterificação para obtenção do biodiesel. Portanto, o uso desse GB em

2

indústrias de alimentos, fármacos e cosméticos é inviável, devido o alto custo do

processo de purificação (~95% do custo total para produção de glicerol puro) que

é requerido para estes fins. Além das implicações econômicas, existe o problema

ambiental, uma vez que este excedente de GB vem sendo acumulado ou

descartado de forma inadequada pelos produtores. Neste aspecto, encontram-se

aplicações alternativas para sua utilização, seja de forma direta ou como

derivados de alto valor agregado, são fundamentais para equilibrar a cadeia de

produção do biodiesel.

Uma alternativa para utilização do GB é a sua conversão em bioprodutos

como 1,3-propanodiol (monômero básico na indústria de polímeros), ácido cítrico,

bioplásticos e produção de enzimas, como lipases e outras enzimas de interesse

industrial. A biocatálise (ou biotransformação) é a utilização de enzimas como

catalisadores biológicos nos processos de conversão de um substrato em um

produto, e sua utilização em processos industriais tem crescido nos últimos anos.

Isto justifica a necessidade de busca por novas enzimas, a qual é geralmente

realizada através de triagem na biodiversidade natural ou em ambientes

enriquecidos com o substrato de interesse.

A tecnologia metagenômica tem sido aplicada para o estudo do conjunto de

genomas encontrado na microbiota total do solo, principalmente por favorecer a

identificação de micro-organismos ainda não isolados, ou não cultivados, que

precisam ser considerados em trabalhos de diversidades e prospecção. Este tipo

de estudo a partir da diversidade microbiana do solo surgiu na década de 80 e

permite, com quantidades pequenas de solo, realizar análise de múltiplas

amostras com eficiências próximas de 80%. Finalmente, permite analisar

segmentos de DNA microbiano do solo, após clonagem do material obtido, de

forma a avaliar com mais detalhes a fisiologia e a função dos micro-organismos

na natureza, bem como isolar antibióticos a partir da prospecção em bibliotecas

metagenômicas.

Sendo assim, o foco deste trabalho foi direcionado para a exploração da

diversidade microbiana de solos de Mata Atlântica Tropical do Sul da Bahia, no

sistema agroflorestal ‘cabruca’, buscando-se isolar, identificar e caracterizar neste

ambiente, micro-organismos capazes de utilizar o GB como fonte de carbono.

Procurou-se utilizar técnicas clássicas e básicas, como o método de Bartha,

3

coloração de Gram, PCR e espectrofotometria de luz visível, assim como

metodologias mais robustas, como o pirosequenciamento. Os resultados obtidos

e suas implicações sócio-econômicas, ambientais e de geração de novos

conhecimentos são discutidas nos próximos capítulos.

4

Capítulo 1 - REVISÃO DE LITERATURA

1.1. Biodiesel

O uso de combustíveis derivados do petróleo tornou-se preocupação

mundial, devido à diminuição dos recursos de combustíveis fósseis, aos impactos

ambientais gerados e às dificuldades em reciclar e/ou reaproveitar os resíduos de

petróleo (SUBRAMANIAM et al., 2010; AGEITOS et al., 2011). Neste aspecto, o

mercado mundial de combustíveis ‘limpos’ tem utilizado os biocombustíveis como

o etanol e o biodiesel como fonte alternativa aos combustíveis fósseis, os quais

são obtidos por processos sustentáveis, visando à redução dos impactos

ambientais (MU et al., 2008; MIN et al., 2010; DOBSON et al., 2011).

O biodiesel é um combustível de queima limpa, produzido a partir de

recursos renováveis, que pode ser empregado na substituição total ou parcial do

diesel de petróleo em motores de ignição por compressão interna, ou seja,

motores de ciclo do diesel (RAMOS et al., 2003). Ou ainda, pode ser designado

para todo e qualquer uso que promova a substituição parcial ou total do diesel na

matriz energética mundial, quer sejam óleos vegetais in natura (puros ou

misturas), bio-óleos e micro-emulsões (MA; HANNA, 1999). Estas características

são relevantes no aspecto econômico, uma vez que a produção de biodiesel

diminui a dependência econômica dos países produtores de biodiesel com os

países produtores de petróleo, no contexto mundial de geração de energias

renováveis (SHAY, 1993; RYMOWICZ et al., 2010; LIN et al., 2011). Esta é uma

realidade observada no panorama mundial de produção do biodiesel, confirmada

pelo progressivo aumento de 15.200 para 403.739 mil barris produzidos por dia

entre os anos de 2000 e 2011 segundo a U.S. Energy Information Adminsitration

(EIA, 2012). No ano base de 2011 os principais produtores de biodiesel foram os

países da Europa (177.6), seguida da América Central (103.2), América do Norte

(65.9) e da Ásia/Oceania com 53.3 mil barris/dia (EIA, 2012). Neste cenário a

Alemanha sempre liderou os índices de produção mundial de biodiesel, seguida

dos EUA e do Brasil com 52, 63 e 47 mil barris/dia, respectivamente (EIA, 2012;

ANP 2012). Segundo a Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e

5

Biocombustíveis (ANP), em 2011 a produção de biodiesel no Brasil aumentou em

11,5%, com produção efetiva de aproximadamente 2,7 milhões m³, ou seja,

39,5% da capacidade total (uso interno).

Outro fator preponderante na cadeia de produção do biodiesel é a

diversidade de matéria-prima que pode ser utilizada na produção desse

biocombustível, tais como óleos vegetais, gordura animal, óleos e gorduras

residuais (PIYAPORN et al., 1996; RAMOS; ZAGONEL, 2001; DOBSON et al.,

2011). Nestes óleos encontramos o triacilglicerídeo que, juntamente com um

álcool (geralmente metanol ou etanol) na presença de um catalisador (usualmente

alcalino), forma ésteres monoalquílicos, gerando o biodiesel e o glicerol através

do processo de transesterificação (VARGAS et. al., 1998; ZHANG et al., 2003). A

escolha da matéria prima tem implicações no custo da produção do biodiesel e na

qualidade requerida para que este possa ser utilizado como biocombustível.

Algumas características técnicas são consideradas imprescindíveis: i) a reação de

transesterificação deve ser completa, ii) o biocombustível deve ser de alta pureza,

e iii) a produção de glicerol bruto, catalisador residual ou álcool excedente da

reação (que afetam na qualidade do biocombustível por gerar menor combustão

e, ou redução da vida útil do motor) deve ser mínima (FELIZARDO et al., 2006;

GERIS et al., 2007). Neste aspecto, os principais países produtores de biodiesel

regulamentaram normas e especificações para garantir a qualidade do biodiesel,

como a Alemanha (DIN 14214-Deutsches Institut fur Normung, 2003), os Estados

Unidos (ASTM D6751-American Standard Testing Methods, 2003) e o Brasil

(Portaria n° 42-Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis,

2003).

De maneira geral, o biodiesel é caracterizado como um biocombustível

limpo, de uso simples; suas características químicas e físicas permitem que seja

utilizado nos veículos a diesel, sem necessidade de adaptações e alterações que

modifiquem o desempenho dos motores, como ocorre para outros combustíveis

limpos como o biogás, o gás natural e o óleo in natura (LAURINDO, 2003;

PARENTE, 2003). Todavia, existem importantes fatores que influenciam no

processo de obtenção de biodiesel e seu co-produto (glicerol), durante a reação

de transesterificação, que são: a pureza dos reagentes, tipo do álcool, tipo e

quantidade de catalisador, razão molar óleo:álcool, agitação da mistura,

6

temperatura e tempo da reação (LIN et al., 2011; SHI et al., 2011). A

saponificação é umas das consequências mais comuns e menos desejadas do

processo de transesterificação, pois interfere no rendimento final da reação e

dificulta a recuperação do glicerol (MA; HANNA, 1999; GERIS et al., 2007).

1.2. Glicerol bruto (GB): co-produto da produção de biodiesel

Glicerol é o nome comum do composto orgânico 1,2,3-propanotriol (IUPAC)

que foi relatado pela primeira vez em 1779 pelo químico sueco Carl W. Scheele,

quando aqueceu o óleo de oliva com o litargírio (PbO), usado no esmalte para

cerâmicas (CHRISTOPH et al., 2006; LIN et al., 2011). Em meados de 1846, o

glicerol foi utilizado para produzir a nitroglicerina, e posteriormente para a

produção da dinamite a partir da diatomita (KATHA, 1999). Quimicamente, o

glicerol é um tri-álcool com três carbonos, classificado como um líquido incolor,

com gosto adocicado, sem cheiro e muito viscoso, solúvel em água e

higroscópico (MORRISON, 2000; CHRISTOPH et al., 2006). A maior parte do

glicerol puro, de uso em aplicações industriais é produzido a partir da epicloridrina

oriunda do propileno, que é derivado de combustíveis fósseis (PAGLIARO et al.,

2007); uma quantidade significativa de glicerol também pode ser produzida a

partir do álcool alílico por via fermentativa (WANG et al., 2001; ARRUDA et al.,

2006) e através de hidrogenação de carboidratos (ANDREWS et al., 1991). Na

natureza, o glicerol faz-se presente em vegetais como a soja, mamona, girassol,

palma, algodão, coco, dendê e pinhão manso e, em animais, apresenta-se

combinado a ácidos graxos (PAGLIARO et al., 2008).

O glicerol é uma das mais versáteis e valiosas substâncias químicas

conhecidas pelo homem. Comercialmente chamado de ‘glicerina’, este composto

apresenta diversas aplicações nas indústrias de alimentos, produtos

farmacêuticos e cosméticos (CHRISTOPH et al., 2006; JOHNSON; TACONI,

2007). Para os micro-organismos eucariotos, o glicerol é o principal composto que

regula as variações de atividade de água em ambientes osmofílicos (PAGLIARO

et al., 2008). O glicerol também pode servir como uma plataforma para a química

de conversões catalíticas para outros compostos de valor agregado (JOHNSON;

TACONI, 2007).

7

A maior parte do glicerol disponível no mercado encontra-se em duas

formas: a glicerina sintética (10% do mercado), produzida pela conversão química

de propileno, e a glicerina natural (90% do mercado), que é purificada a partir de

co-produtos gerados pela indústria oleoquímica (CHRISTOPH et al., 2006). Esta

última é demasiadamente representada pela produção de biodiesel, o que tem

tornado a produção de glicerol sintético quase que obsoleta (NILES, 2006).

Contudo, o aumento na produção de biodiesel tem gerado maior oferta de glicerol

e queda do preço no mercado mundial (YAZDANI et al., 2007; MIN et al., 2010),

pois, como visto anteriormente, aproximadamente 10% de glicerol bruto é gerado

a partir da produção de biodiesel (MU et al., 2008). Outro fator relevante que afeta

o preço do glicerol bruto é o grau de pureza, pois existem em média de 20% a

60% de impurezas que variam de acordo com a matéria prima e com a catálise

utilizada na produção do biodiesel. Dentre essas impurezas, as mais comuns são

catalisador, álcool, ácidos graxos, sais e água (MOTA, 2006). Por exemplo, em

2008, quando avançaram os incentivos na produção mundial de biodiesel, a

cotação do glicerol bruto estava em torno de R$ 105,00 / t, a do glicerol

bidestilado (96%) era de R$ 2.100,00/t, e a do glicerol farmacêutico (>99,5%) era

R$ 2.500,00/t (ARAÚJO et al., 2009). A purificação do GB pode ser feita por

destilação sob pressão reduzida e, alternativamente, a quantidade de sais pode

ser diminuída utilizando uma combinação de membranas (eletrodiálise) e

nanofiltros, que requerem a utilização de resinas de troca iônica para obter

glicerol com mais de 99,5% de pureza (PAGLIARO et al., 2008). Neste aspecto,

necessário é interessante utilizar este glicerol na fabricação de bioprodutos

viáveis do ponto de vista econômico (e ambiental), uma vez que a purificação do

GB para utilização como matéria-prima nas indústrias de fármacos, cosméticos e

alimentos é bastante onerosa (DASARI, 2007; DOBSON et al., 2011).

No Brasil, o governo Federal lançou em 2004 o Programa Nacional de

Produção e uso de Biodiesel (PNPB) para incentivar sua produção, utilização e

introdução na matriz energética brasileira (ANP, 2012). A Lei 11.097, publicada

em 13 de janeiro de 2005, dispõe sobre a introdução progressiva e obrigatória do

biodiesel ao óleo diesel nas proporções de 2% (B2), 5% (B5) e 10% (B10). Isto

gerou projeções de produção de 250 mil t/ano de glicerol até este ano de 2013,

quando atingiríamos o B10 (MOTA et al., 2009). Contudo, em 2011 foram gerados

8

273,4 mil m3 (>355 mil toneladas) de glicerol como co-produto na produção de

biodiesel (B10), o que corresponde ao aumento de 6,4% sobre o que foi

produzido em 2010; ou seja, já superamos as estimativas e tendemos a marcas

ainda maiores (ANP, 2012).

Portanto, é consenso que o destino final do GB pode afetar a produção de

biodiesel em larga escala, sendo fundamental buscar alternativas para este

excedente na forma bruta e, ou como derivados de valor agregado.

1.3. Diversidade microbiana do solo

Os micro-organismos apresentam imensa diversidade genética e

desempenham funções cruciais na manutenção dos ecossistemas, sendo

componentes fundamentais de cadeias alimentares e dos ciclos biogeoquímicos

(SCHIMEL, 1995; MYERS, 1996; MYERS et al., 2000), essenciais para a

sobrevivência das formas de vida na Terra (HAMMOND, 1998). Dentre todos os

tipos de ecossistemas do planeta, o solo representa a maior fonte de diversidade

microbiana a ser explorada para fins biotecnológicos (SLEATOR et al., 2008). Os

solos são caracterizados por apresentarem uma população microbiana muito

diversificada, vivendo em micro-habitats discretos, além de serem um sistema

estruturado, heterogêneo e descontínuo, geralmente pobre em nutrientes e em

fontes de energias (STOTZKY, 1997). Outra peculiaridade do solo é a presença

de ‘hot-spots’, zonas de maior atividade biológica, tais como as regiões de

acúmulo de matéria orgânica particulada e a rizosfera (PARKIN, 1987; LYNCH,

1990; PINTON et al., 2001). Nestes micro-habitats ocorrem a decomposição da

matéria orgânica, a ciclagem e imobilização de nutrientes, a agregação do solo, a

filtragem e a biorremediação de poluentes (SLEATOR et al., 2008). Vários fatores

ambientais, tais como fontes de carbono e energia, nutrientes, temperatura,

pressão, pH, potencial redox e interações entre os micro-organismos, podem

afetar a dinâmica e a ecologia do solo (NANNIPIERI et al., 2003).

Um dos maiores desafios para os estudos em ecologia microbiana tem sido

desenvolver métodos eficazes para descrever a diversidade, as funções e a

abundância das populações dos micro-organismos presentes no solo e

associadas às plantas (THIES, 2008). O tipo de solo parece ser o fator primário

9

na determinação da composição da microbiota (GELSOMINO et al., 1999;

GIRVAN et al., 2003; RASCHE et al., 2006). Vários outros fatores, como chuvas,

temperaturas extremas, presença de plantas e animais e atividade humana,

interagem de modo a causar constantes mudanças no solo. Esses fatores,

associados a condições ambientais específicas e comunidades de plantas

características, possibilitaram a formação dos atuais biomas terrestres e seus

solos associados (VORONEY, 2007). Além disso, a localização geográfica do solo

também pode afetar a sua composição filogenética e o crescimento de micro-

organismos. Dessa forma, selecionar o local e o método de amostragem

adequado é um fator muito importante a considerar quando se inicia uma análise

sobre os micro-organismos do solo (KAKIRDE et al., 2010).

Nos últimos anos, o interesse pelo solo como reservatório de biodiversidade

tem aumentado de forma relevante. Estima-se que 1,0 g de solo contenha

milhões de bactérias, arquéias, vírus e micro-organismos eucariotos (TORSVIK;

OVREAS, 2002; FIERER et al., 2007; WOMMACK et al., 2008), dos quais apenas

um pequeno percentual tem sido cultivado em laboratório (HUGENHOLTZ et al.,

1998; CURTIS; SLOAN, 2005). O conhecimento sobre a diversidade microbiana

do solo é limitado pela incapacidade humana de reproduzir adequadamente in

vitro as características intrínsecas desses ambientes. Por esta razão, acessar e

preservar os micro-organismos do solo é fundamental, pois além de todas as

funções indispensáveis à vida por eles exercidas, os micro-organismos possuem

um grande conjunto de genes desconhecidos que podem codificar novas enzimas

e compostos bioativos úteis para a sociedade (KAKIRDE et al., 2010; MOCALI;

BENEDETTI, 2010).

1.4. Potencial biotecnológico de micro-organismos

A prospecção de micro-organismos é um dos principais focos da

biotecnologia contemporânea, visto que as possibilidades de utilização dos

mesmos e, ou de seus produtos em diversas áreas, como indústria, saúde e meio

ambiente, vem crescendo de forma acelerada (OLIVEIRA et al., 2007). A

atividade dos micro-organismos está baseada em sua diversidade metabólica e

adaptabilidade, o que os torna uma importante fonte de recursos genéticos.

10

Consequentemente, o aumento da diversidade de produtos naturais para os

diferentes setores passa pela exploração da diversidade microbiana (COLWELL,

1997; HUNTER-CEVERA, 1998).

Parte dos avanços da biotecnologia moderna deriva das descobertas

recentes em genética, fisiologia e metabolismo dos micro-organismos. Os

benefícios científicos e econômicos esperados, em geral, estão relacionados com

a descoberta de novos agentes terapêuticos, produtos químicos, enzimas e

polímeros para aplicações industriais, biorremediação de poluentes, recuperação

de minérios, entre outros (OLIVEIRA et al., 2007). Dentre os componentes

essenciais para o atual estádio de avanço na biotecnologia, pode-se citar os

novos conhecimentos em sistemática e ecologia microbiana, bioinformática,

genômica, e metagenômica, bem como a atuação dos centros de recursos

biológicos e o perfil das novas empresas de base tecnológica (CANHOS;

MANFIO, 2003). A tendência é que a maioria das enzimas utilizadas

industrialmente seja de origem microbiana, pois é crescente a aplicação de

tecnologias que permitem modificar geneticamente os micro-organismos com o

intuito de obter essas enzimas (MUSSATTO et al., 2007). Enzimas isoladas de

micro-organismos do solo tem sido utilizadas comercialmente por muitas décadas;

no entanto, apesar do desempenho promissor em laboratório, a aplicação dessas

enzimas em escala industrial ainda é limitada (BELOQUI et al., 2008). Uma das

razões para esta limitação é a baixa proporção de micro-organismos que são

cultiváveis, dentro da diversidade acessada (VIEITES et al., 2009).

Ferramentas metagenômicas têm acelerado o processo de descoberta de

novos biocatalisadores e metabólitos secundários (STEELE et al., 2009). Triagens

em larga escala de clones de bibliotecas metagenômicas ambientais tem

permitido descobrir novas enzimas que apresentam um grande potencial para

aplicações industriais (KAKIRDE et al., 2010). O uso de enzimas em processos

industriais pode frequentemente eliminar a aplicação de altas temperaturas,

solventes orgânicos ou pH extremos, e ainda pode garantir o aumento da

especificidade sobre os substratos e a pureza dos produtos gerados; deste

modo,a redução dos impactos ambientais tende a aparecer como conseqüência

(CHERRY; FIDANTSEF, 2003). As hidrolases constituem 75% do mercado das

enzimas industriais comercializadas; as glucosidases (celulases e amilases), por

11

exemplo, constituem o segundo maior grupo comercializado, após as proteases

(BHAT, 2000). O grande interesse por estas enzimas hidrolíticas se deve a

algumas características importantes, tais como, uma ampla gama de substratos,

especifidade e seletividade, independência de co-fatores, estabilidade e atividade

em solventes orgânicos. Essas enzimas são aplicadas em várias indústrias, tais

como, as têxteis, de detergentes, de alimentos, de papel e farmacêutico, além de

serem também utilizadas no tratamento de resíduos industriais (LAMMLE et al.,

2007).

As amilases pertencem a outra categoria de hidrolases amplamente

distribuídas na natureza, apresentando grande importância biotecnológica, pelas

aplicações nas indústrias têxteis, de papel, de celulose, de couro, de detergentes,

de cervejas, de bebidas destiladas, na panificação, liquefação e sacarificação do

amido, e de ração animal, além das indústrias químicas e farmacêuticas

(OLIVEIRA, 2006). As proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de

ligações peptídicas, e estão entre as hidrolases mais bem estudadas, pois tem

grande importância na regulação de diversos processos do metabolismo celular e

fisiologia (CHATTOPADHAYA; YAO, 2006). Apresentam também um grande valor

econômico, devido à sua ampla aplicação industrial, como nas indústrias de

detergentes, alimentos, fármacos, diagnósticos e tratamento de resíduos.

Somente as proteases representam 40% das enzimas vendidas no mercado

(GUPTA et al., 2002).

As lipases e esterases também vêm sendo muito estudadas no campo da

biotecnologia, e são muito utilizadas na síntese orgânica devido a vários fatores,

como versatilidade catalítica, baixo custo, alta estabilidade, entre outros (HENNE

et al., 2000). As enzimas lipolíticas são utilizadas nas indústrias de detergentes,

alimentos, papel, oleoquímica, síntese de fármacos, produtos de química fina e na

resolução de misturas racêmicas (JAEGER; EGGERT, 2002). Na área ambiental,

as lipases podem ser utilizadas para remoção de óleos presentes nas águas

residuais de fábricas, restaurantes ou residências, ou provenientes de indústrias

de refinação de óleos. Além disso, a aplicação de micro-organismos produtores

de lipases na degradação de hidrocarbonetos derivados do petróleo é sugerida

como uma importante alternativa de biorremediação (HASAN et al., 2006).

12

1.5. Bioconversão de glicerol por micro-organismos

Conforme mencionado anteriormente, os incentivos governamentais nos

últimos anos impulsionaram a produção de biodiesel no mundo, cuja produção em

larga escala tem gerado um grande excedente de GB (PAPANIKOLAOU et al.,

2002; ITO et al., 2005; LEVINSON et al., 2007). Este excedente vem acarretando

problemas econômicos e ambientais na cadeia de produção do biodiesel, pois sua

rentabilidade está diretamente relacionada à venda de co-produtos, que confiram

redução dos custos de produção. Assim, com o intuito de evitar futuros problemas

derivados da acumulação de GB residual, e para tornar a produção de biodiesel

mais competitiva, torna-se necessária à busca de alternativas para o uso deste

glicerol (PAPANIKOLAOU et al., 2002; OOI et al., 2004; DOBSON et al., 2011).

Neste contexto, justifica-se o crescente número de estudos envolvendo os

processos de conversão microbiológica do glicerol residual em bioprodutos, ou a

sua utilização como fonte de carbono para crescimento de micro-organismos

(DOBSON et al., 2011). Uma relevante quantidade de trabalhos na literatura

envolve a utilização do glicerol puro para produção de 1,3-propanodiol, que é um

monômero básico usado na produção de polímeros (CHENG et al., 2007;

VILLEGAS, 2007; ZHENG et al., 2008) e para produção de ácido cítrico, utilizando

leveduras (LEVINSON et al., 2007). Estes são, portanto, exemplos claros da

possibilidade de se utilizar o GB para produção desses e de outros bioprodutos

(ZHENG et al., 2008; PAPANIKOLAOU et al., 2002). O trabalho pioneiro de

Papanikolaou et al. (2002) com glicerol residual com baixa pureza (60%)

apresentou resultados satisfatórios na obtenção de ácido cítrico utilizando este

substrato por Yarrowia lipolytica. A produção de hidrogênio e etanol utilizando o

glicerol residual como substrato por Enterobacter aerogenes HU-101 foi

satisfatório e apresentou altos rendimentos desses bioprodutos, mesmo para um

baixo grau de pureza (40%) do glicerol residual (ITO et al., 2005).

Outros estudos estão sendo direcionados para a produção de enzimas

utilizando glicerol como fonte de carbono por micro-organismos, como por

exemplo, utilizar o GB para formação de biomassa e produção de

transglutaminase por Bacillus circulans BL32 (SOUZA et al., 2006).

Adicionalmente, a eficiência produtiva dos micro-organismos pode ser comparada

13

com glicerol puro ou GB, conforme estudado por Lin et al. (2006), cuja produção

de lipases foi semelhante para ambos os substratos utilizando-se Antrodia

cinnamomea. Bacillus sp. também foi capaz de produzir quantidades significantes

de lipase a partir de GB, em meio contendo 10 mL de glicerol (GUPTA et al.,

2004a). Estes resultados positivos com lipases sinalizam para um ciclo otimizado

na produção do biodiesel, pois as lipases poderiam ser utilizadas como

biocatalisadores em substituição aos catalisadores sintéticos, conferindo assim

maior pureza ao GB (CHANG et al., 2005), que terá valores de impurezas

menores e próximos aos parâmetros aceitos e adotados mundialmente

(PAPANIKOLAOU et al., 2002; GUPTA et al., 2004b). Por outro lado, a adoção

desse processo de produção do biodiesel ainda não foi implementada

industrialmente, devido a patente existente para a síntese enzimática do biodiesel

(HAAS, 1997) e, principalmente, por restrições no método, como a inibição da

enzima pelos álcoois presentes na reação de síntese, a exaustão da atividade

enzimática e o alto custo da enzima (RANGANATHAN et al., 2008).

Existe um considerável interesse na investigação de bioconversão

anaeróbica de glicerol por bactérias para a produção de 1,3-propanodiol (PDO),

um importante intermediário na produção de polímeros plásticos. Estes estudos

são voltados para muitas espécies da família Enterobacteriaceae, com particular

interesse em Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter, assim como alguns

representantes dos gêneros Clostridium, Bacillus e Lactobacillus

(DELLOMONACO et al., 2010; AMARAL et al., 2007; YAZDANI et al., 2010).

Outros bioprodutos importantes como a dihidroxiacetona, o butanol, o ácido

propiônico e o ácido succínico também estão sendo estudados (JOHNSON;

TACONI, 2007; AMARAL et al., 2007; YAZDANI; GONZALEZ, 2007).

Apesar dos resultados promissores obtidos por bactérias em laboratório,

existe grande dificuldade em se atingir níveis industrialmente relevantes, uma vez

que a maioria das espécies promissoras é potencialmente patogênica, e, ou

precisam de meios de cultura altamente nutritivos e, ou requerem crescimento em

anaerobiose e, ou toleram níveis baixos de GB, com exceção das espécies de

Klebsiella que crescem em meio pouco nutritivo (DELLOMONACO et al., 2010).

Além disso, as baixas concentrações do bioproduto dissolvido no meio de cultura

é um importante desafio durante as etapas de recuperação e purificação do

14

bioproduto. Neste aspecto, procedimentos de tratamento para o GB estão sendo

estudados na expectativa de melhorar o rendimento de culturas bacterianas

(ASAD-UR-REHMAN et al., 2008). Por exemplo, num esforço para aumentar a

produção de PDO a partir de Clostridium butyricum, o glicerol foi tratado com

ácido fosfórico, filtrado para remover os sais de fosfato, destilado sob vácuo

durante a recuperação de metanol, e lavado com n-hexanol para remoção de

outras impurezas; isto gerou custos adicionais que tendem a comprometer a

produção em larga escala (ASAD-UR-REHMAN et al., 2008). Uma alternativa

viável é identificar micro-organismos capazes de tolerar as impurezas do co-

produto utilizado como substrato e, posteriormente, realizar os testes de

capacidade de produção de bioprodutos de interesse (RUMBOLD et al., 2009).

Com esta abordagem, estes autores observaram que os fungos foram mais

resistentes que as bactérias frente aos inibidores presentes em algumas matérias-

primas industriais testadas, como o GB, o furfural, o 5-hidroximetil furfural, o

acetato, o cloreto de sódio, o sulfato de magnésio, entre outros. Em comparação

com as bactérias, portanto, os fungos foram mais eficazes na utilização deste

substrato utilizado como fonte de carbono, em testes de inibição de crescimento

(WERPY et al., 2004).

A bioconversão de glicerol bruto por fungos filamentosos e leveduras foi

relatada para um seleto número de substâncias químicas de interesse industrial,

testados pelo Departamento de Energia dos EUA (DOE). Entre as substâncias

testadas, houve produção bem sucedida de arabitol pela levedura Debaryomyces

hansenii (KOGANTI et al., 2011), ácido fumárico por Rhyzopus sp. (MOON et al.,

2004), ácido succínico por uma estirpe recombinante de Yarrowia lipolytica

(YUZBASHEV et al., 2010) e xilitol por várias espécies de Candida spp. (KO et al.,

2006; ARRUDA FELIPE, 2009). Outros produtos não incluídos no relatório do

DOE-EUA, como lipases e proteína de célula única (Single Cell Protein - SCP)

(MAFAKHEE et al., 2010), pigmentos (MARTELLI et al., 1992; KUSDIYANTINI,

1998; MANTZOURIDOU et al., 2008), ácido pirúvico, manitol, eritritol e ácido

acético (FINOGENOVA et al., 2005; ANDRÉ et al., 2009; CHATZIFRAKOU et al.,

2011; RYWINSKA et al., 2011) também foram obtidos por bioconversão

utilizando-se fungos e leveduras. Infelizmente, a investigação extensiva sobre a

produção desses compostos a partir de GB ainda não está disponível.

15

1.6. Respirometria de Bartha e avaliação de atividade biológica

A respirometria é uma técnica que pode ser utilizada para o

acompanhamento das atividades metabólicas realizadas pelos micro-organismos,

e se baseia na análise do consumo de oxigênio ou produção de dióxido de

carbono por unidade de volume e de tempo (BERNARDES; SOARES, 2005). Ela

se fundamenta no fato de que a respiração é realizada em todas as células, por

meio de uma série de etapas que envolvem diversas enzimas específicas e

substâncias intermediárias. A respiração, em termos bioquímicos, é o processo

metabólico que envolve a geração de Adenosina Trifosfato (ATP), no qual,

compostos como o O2, o NO3ˉ e o SO4²- são aceptores finais de elétrons. O ATP é

gerado pela remoção de elétrons do substrato e transferência ao longo de uma

cadeia de transporte de elétrons, passando de um transportador metabólico para

o próximo e, por último, para o oxigênio (no caso de sistemas aeróbios), ou outros

aceptores finais. Nesse caminho, há a converção da energia intra-molecular

ligada aos substratos para o fosfato altamente energético ligado ao ATP

(SPANJERS et al., 1998). Quando o aceptor final é o O2, há a produção de CO2;

como não é possível medir as taxas de respiração no interior das células, são

então utilizadas às medidas do volume de oxigênio consumido ou de dióxido de

carbono produzido (BERNARDES; SOARES, 2005).

Quando essa técnica é realizada com misturas de contaminantes é

impossível prever qual contaminante está sendo metabolizado em determinado

momento (BAKER; HERSON, 1994). Além desse inconveniente, o consumo de

oxigênio não se dá unicamente pela remoção de carbono do substrato, mas

também por outros processos, tais como a oxidação de compostos inorgânicos.

As bactérias nitrificantes utilizam o dióxido de carbono dissolvido como fonte de

carbono para a formação de biomassa e as bactérias autotróficas utilizam o

enxofre ou o ferro para a obtenção de energia e o dióxido de carbono ou o

carbonato como fonte de carbono. Assim, todas essas interferências contribuem

para a alteração da taxa total de respiração observada (SPANJERS et al., 1998).

Para medição da variação de oxigênio e, ou CO2 no sistema sob condições

controladas, são utilizados equipamentos denominados ‘respirômetros’, que

16

consistem em um reator ou câmara de respiração com aparato capaz de medir o

consumo de O2 ou produção de CO2 (FERREIRA, 2002). Por exemplo, os

respirômetros de Bartha e Pramer, que são os mais utilizados na avaliação do

processo de degradação de poluentes por micro-organismos em solo, medem a

liberação de CO2 por meio da sua captura por uma substância alcalina (KOH ou

NaOH) e posterior precipitação na forma de carbonato de bário (BaCO3) pela

adição de solução saturada de BaCl2. A soda excedente é, então, titulada com

HCl, permitindo o cálculo da produção de gás carbônico (MARIANI, 2005).

A técnica de respirometria apresenta algumas peculiaridades e pode ser

dividida em: i) respirometria eletrolítica, que monitora o decréscimo da pressão

parcial em frascos fechados e hidrolisa eletricamente a água em hidrogênio e

oxigênio para suprir os frascos com oxigênio, possibilitando a medida da

quantidade de oxigênio produzida (BAKER; HERSON, 1994); e ii) respirometria

manométrica, que se baseia na medida da mudança da pressão parcial dos gases

em frascos fechados com material sofrendo biodegradação. Enquanto o oxigênio

é consumido, o dióxido de carbono produzido e precipitado em uma solução

alcalina faz com que a pressão parcial no frasco diminua (ROZICH; COLVIN,

1990; MAHENDRAKER; VIRARAGHAVAN, 1995). O respirômetro Warburg é um

exemplo de equipamento para medida do decréscimo da pressão parcial no

frasco e é mais adequado para soluções que contém baixa concentração de

substâncias orgânicas (BAKER; HERSON, 1994). Técnicas analíticas indiretas

similares podem ser utilizadas para monitoramento da respiração anaeróbia. Sob

condições anaeróbias, os principais produtos metabólicos são o dióxido de

carbono e o metano. Assim, as amostras de gases podem ser removidas dos

frascos para quantificação por meio da cromatografia gasosa, com detectores

apropriados, ou o aumento de pressão nos recipientes pode ser utilizado para

medir a produção de metano e dióxido de carbono (BAKER; HERSON, 1994).

O uso da respirometria tem sido útil no monitoramento da degradabilidade

de vários compostos sob condições aeróbicas, como óleos, compostos orgânicos

voláteis de alta e baixa solubilidade, compostos fenólicos e outros compostos

tóxicos em geral (HAINES et al., 1996). A respirometria é amplamente utilizada

para acompanhar o processo de biodegradação, pois a maior a quantidade de

CO2 produzido e de O2 consumido em um sistema aeróbio refletem uma maior

17

facilidade dos micro-organismos em degradar a matéria orgânica presente no

resíduo. Assim, é maior o potencial de sucesso na utilização do processo de

biorremediação para recuperação de áreas contaminadas pelo resíduo analisado

(BAKER; HERSON, 1994). Neste sentido, muitos trabalhos remetem ao uso de

respirometria na avaliação da biodegradação de lodos de estações de tratamento

de águas residuais (NUVOLARI, 1996; ANDRADE, 2004), lodos de estações de

tratamento de água potável (GUERRA; ANGELIS, 2005), lodos industriais

(COURACCI FILHO et al., 1997), compostos fenólicos (ALBUQUERQUE, 2000),

derivados do petróleo e do biodiesel (LEI et al., 2005; MELLO, 2005; MARIANO,

2006; WALWORTH et al., 2007; MONTAGNOLLI et al., 2009), e composto

químico Creosoto (CARRIERE et al., 1995).

1.7. Abordagens metagenômicas

A diversidade microbiana do solo e o potencial biotecnológico a ela

associada são bastante conhecidos. Dados estatísticos indicam que 1 g de solo

pode conter cerca de 10 bilhões de micro-organismos, compreendendo milhares

de espécies diferentes, a maioria pertencendo aos domínios Bacteria e Archaea

(AMANN et al., 1995; TRINGE et al., 2005; ROESCH et al., 2007). No entanto,

uma pequena parcela desses micro-organismos pode ser cultivada pelos métodos

tradicionais usados em laboratório (TORSVISK et al. 2002). A metagenômica

utiliza basicamente a purificação e clonagem de DNA de amostras ambientais em

vetores de expressão heteróloga, seguido de sequenciamento e prospecção por

genes e funções de interesse biotecnológico (OGRAM, 2000; HURT et al., 2001).

Durante muitos anos, foram descritos vários protocolos para extração e

purificação de DNA do solo, pois seus constituintes dificultavam e, ou

impossibilitavam a obtenção de DNA em quantidade e com qualidade para os

estudos posteriores (ZHOU et al., 1996; OGRAM, 2000; HURT et al., 2001; LILES

et al., 2008).

Entre as várias metodologias de extração de DNA de amostras ambientais,

existe o método direto e indireto que compreendem etapas químicas e físicas

para desagregar o material celular da matriz do solo (DANIEL, 2005). A

purificação de DNA pelo método direto é realizada com toda a matriz do solo,

18

através da lise mecânica (geralmente esferas de sílica) e agitação intensa. A

intenção é permitir que o máximo de células fosse desagregada do solo, além de

também favorecer a fragmentação da parede celular resistentes à lise química

(HURT et al., 2001; LILES et al., 2008). No método indireto de purificação de

DNA, as amostras de solo são submetidas a vários ciclos de lavagem e

centrifugação com o objetivo de separar as células da matriz do solo (DANIEL,

2004; 2005). Ambos os métodos apresentam vantagens e desvantagens e a

escolha esta associada à pergunta biológica do trabalho. Por exemplo, o método

direto é mais indicado para estudos de diversidade, por permitir o acesso a um

número maior de células e a uma maior diversidade de espécies, devido à

ausência das etapas de lavagens do solo. Por outro lado, este método envolve a

lise mecânica que pode fragmentar em excesso o DNA, além de que é maior

quantidade de contaminantes que podem inviabilizar a construção de bibliotecas

com insertos grandes de DNA (HURT et al., 2001; DANIEL, 2005; LILES et al.,

2008). O método indireto, por realizar várias etapas de lavagem das amostras de

solo e por utilizar uma lise branda, garante um DNA mais puro e de alto peso

molecular, mas acredita-se que uma parte da diversidade bacteriana é perdida

por não conseguir se separar da matriz do solo durante a lavagem (KOZDRÓJ;

VAN ELSAS, 2001; LAKAY et al., 2007).

Outro fator importante a ser avaliado na construção de uma biblioteca

metagenômica é o tamanho de inserto a ser clonado. Bibliotecas com insertos de

DNA acima de 10 kb são utilizadas para identificação de enzimas e vias

metabólicas complexas, compostas por vários genes (MACNEIL et al., 2001;

GILLESPIE et al., 2002; GINOLHAC et al., 2004). Porém, o processo de

clonagem é mais difícil devido a dificuldade de inserção no vetor e ao baixo

número de cópias obtidas que pode dificultar a identificação do fenótipo. Por outro

lado, nas bibliotecas com insertos de DNA inferiores a 10 kb o processo de

clonagem e o número de cópias obtidas é maior. No entanto, o tamanho do

inserto pequeno torna praticamente impossível a recuperação de vias metabólicas

e implica em uma análise de muito mais clones para se identificar uma atividade

de interesse (HENNE et al., 1999; BRADY; CLARDY, 2000; KNIETSCH et al.,

2003).

19

A análise ou prospecção de bibliotecas metagenômicas pode ser feita

através de dois métodos: o método baseado na função e o método baseado na

sequência (SCHLOSS; HANDELSMAN, 2003). O método baseado na função

identifica clones que expressam uma enzima ou uma via metabólica de interesse

(RONDON et al., 2000; VOGET et al., 2003; JEONG et al., 2009). Pode ser

realizado através da identificação do fenótipo em meio de cultivo semi-sólido

contendo um substrato seletivo para a função de interesse, ou através da adição

de indicadores de pH no meio seletivo; para ambos, ocorrerá formação de um

halo de hidrólise em volta da colônia positiva (GUPTA et al., 2002; 2003). Já o

método baseado nas sequências requer a construção de sondas ou primers a

partir de regiões conservadas do DNA para as reações de PCR que permitem

identificar, nos clones obtidos, os genes de interesse (LEE et al., 2007). Outra

abordagem utilizada é o sequenciamento das extremidades dos insertos de DNA

clonados ou mesmo o sequenciamento de todo o DNA metagenômico de uma

determinada amostra (VENTER et al., 2004; SCHLÜTER et al., 2008;

MORIMOTO; FUJII, 2009). Por essa metodologia, a identificação é realizada por

comparação das sequências obtidas com sequências depositadas em bancos de

dados públicos ou privados.

Baseadas nessas técnicas descritas, várias bibliotecas metagenômicas

foram construídas a partir dos mais distintos tipos de amostras, como solo

(RONDON et al., 2000), água (ELEND et al., 2006), biofilmes (SCHMEISSER et

al., 2003), rumem bovino (FERRER et al., 2005), boca humana (DIAZ-TORRES et

al., 2003), intestino de cupim (WARNECKE et al., 2007), entre outros. Em todos

esses casos, o objetivo principal foi o isolamento de novas enzimas.

1.8. Pirosequenciamento

Nos últimos 35 anos, o sequenciamento de DNA pelo método dos

dideoxinucleotídeos (SANGER et al., 1977) mudou completamente a visão da

biologia. Com ele, foi possível obter as sequências de bases dos genes,

proporcionando conhecer as sequências de aminoácidos das proteínas

correspondentes e, dessa forma, estudar suas funções. Informações sobre

polimorfismos de genes facilitaram o mapeamento genético, a clonagem, a

20

compreensão das relações evolutivas e permitiram o início dos estudos de

biodiversidade (DELSENYA et al., 2010). O método de sequenciamento de

Sanger, combinado com o progresso nas estratégias de clonagens e automação

dos processos permitiu o sequenciamento de fragmentos cada vez maiores de

DNA e, finalmente, de genomas completos. Com a decodificação de genomas,

iniciou-se a era das ciências genômicas, as quais modificaram totalmente a

investigação biológica, possibilitando o conhecimento da estrutura, função e

interação das partes dos genomas de várias espécies e, com isso, uma infinidade

de novos conhecimentos em metabolismo, fisiologia e interações adaptativas e

evolutivas das espécies entre si e com o ambiente.

Com os contínuos avanços em automatização de procedimentos e robótica,

novas tecnologias de sequenciamento tem sido desenvolvidas, constituindo o que

se tem denominado como ‘next generation sequencing’ (NGS). Em conjunto,

essas metodologias permitem uma capacidade instalada de sequenciamento e

processamento de DNA aproximadamente 1000 x maior, incluindo a análise de

várias amostras ao mesmo tempo, com ou sem necessidades de clonagem

prévia, a um custo comparativamente menor (DELSENYA et al., 2010). O

desenvolvimento dessas novas tecnologias de sequenciamento vem promovendo

a perspectiva de se aplicar novas abordagens para resolver questões biológicas

de cunho global e integrativa, que não poderiam ser respondidas com o

sequenciamento clássico de Sanger.

Várias formas de reduzir os custos no sequenciamento incluem evitar a

clonagem, a miniaturização das reações, o uso novos processos químicos e o

sequenciamento massivamente paralelo (IMELFORT; EDWARDS, 2009; MAC

LELLAN et al., 2009). As três principais plataformas de NGS comercializadas

atualmente incluem o pirosequenciamento (‘454’ da Roche), a Solexa (da

Illumina), que se baseia no sequenciamento por síntese marcada com

fluorescência, gerando fragmentos de 35-76 pb e, por fim, a versão mais recente

do sequenciador da Applied Biosystems, chamado SOLiD4 que gera 100 Gb por

corrida com o comprimento em torno de 50 pb (DELSENYA et al., 2010). Essas

tecnologias vêm se tornando muito apropriadas para o sequenciamento de

metagenomas e metatranscriptomas (WALL et al., 2009). Para o escopo desta

revisão, será detalhada a seguir a plataforma 454 da Roche

21

(pirosequenciamento).

O primeiro instrumento baseado no pirosequenciamento (GS20) conseguiu

sequenciar 25 milhões de bases de um genoma bacteriano em uma corrida de 4

horas, com comprimento médio de 110 pb e 96% de precisão (MARGULIES et al.,

2005). O atual modelo 454 GS-FLX Titanium obtém sequências de até 500 pb,

com previsão de melhorias futuras no comprimento dos fragmentos e na precisão

das leituras. Adicionalmente, esta técnica tem outras vantagens, como rapidez e

preço relativamente baixo, alta flexibilidade e maior tamanho dos fragmentos

sequenciados. No geral, o pirosequenciamento consiste na fragmentação

aleatória do DNA e na ligação dos fragmentos obtidos (300-800 pb) a sequências

adaptadoras comuns, separados em fitas simples e imobilizados em pequenas

esferas, de modo que um único tipo de fragmento liga-se a somente uma esfera.

Esses fragmentos, por sua vez, são imersos em gotículas oleosas, onde se dá a

amplificação pela técnica de "PCR em emulsão", onde cada esfera está isolada

dentro de uma micela na mistura da reação de PCR (CARVALHO; SILVA, 2010).

Os produtos gerados formam agrupados clonais na superfície dessas esferas e,

após a quebra da emulsão, desnaturantes removem as fitas não associadas,

obtendo apenas esferas enriquecidas com os produtos amplificados. Em seguida,

um primer de sequenciamento é hibridizado ao adaptador na posição apropriada,

no começo da sequência desconhecida, e o processo de sequenciamento se

inicia. As esferas são espalhadas em uma placa contendo milhões de poços, que

são reatores individuais para as reações de sequenciamento, catalisadas pela

DNA polimerase.

O diâmetro dos poços permite que apenas uma esfera fique dentro de cada

poço. Esferas ainda menores transportando enzimas imobilizadas necessárias ao

sequenciamento (ATP sulfurilase e luciferase) também são adicionadas. Em cada

ciclo, quando um nucleotideo é adicionado ao iniciador pela DNA polimerase, uma

molécula de pirofosfato (PPi) é liberada e convertida em ATP pela Sulfurilase e a

Luciferase utiliza essa molécula de ATP para oxidar Luciferina e produzir um fóton

de luz. Os fótons produzidos são detectados por aparelhos e a quantidade de luz

transmitida é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados. Se nenhum

fóton for produzido, significa que a base adicionada não corresponde à base

complementar da fita de DNA molde a ser sequenciada. Mas, quando o fóton é

22

produzido, sabe-se qual base foi adicionada na reação e a quantidade de luz

emitida, corresponde ao número de vezes que a base se repete (RONAGHI,

2001; MARGULIES et al., 2005; MAC LELLAN et al., 2009; MARDIS, 2008).

Apesar das vantagens, esta tecnologia apresenta algumas limitações,

como a menor precisão e o menor comprimento das sequências em comparação

ao método de Sanger, o que dificulta os processos de montagens e predição

gênica, além dos homopolímeros, que não são distinguidos nessa técnica,

podendo proporcionar uma maior taxa de erro (HUSE et al., 2007). No entanto,

essas limitações podem não ser tão importantes nos estudos de metagenomas,

os quais se baseiam na busca por similaridade dos fragmentos em bancos de

dados de referência, sem a necessidade de montar ou realizar predições

(EDWARDS; BATLEY, 2009; MAC LELLAN et al., 2009).

A aplicação do pirosequenciamento tem revelado a grande diversidade de

comunidades microbianas complexas. Através dessas novas ferramentas, vem

sendo possível caracterizar a ‘rara biosfera’, que compreende diversos taxa de

micro-organismos de baixa abundância de vários ambientes (HAMP et al., 2009;

MAC LELLAN et al., 2009; SANAPAREDDY et al., 2009; PARAMESWARAN et

al., 2010). Conforme essas questões vão sendo elucidadas, dados vão se

acumulando, proporcionando a comparação entre diferentes conjuntos de

informações metagenômicas para uma melhor compreensão sobre as funções

dos micro-organismos nos diferentes habitats (TRINGE et al., 2005; RAES et al.,

2007; HUSON et al., 2009, DEBROAS et al., 2009; SIMON; DANIEL, 2009). O

enorme conjunto de dados gerados apresenta desafios consideráveis para as

análises, pois o metagenoma pode incluir milhares de espécies, muitas das quais

não tendo sido ainda descritas (HIRSCH et al., 2010). Apesar de novas

ferramentas de bioinformática terem recentemente sido apresentados (HUSON et

al., 2009; MEYER et al., 2008), desenvolvimentos na análise computacional ainda

são necessários para melhorar a interpretação dos dados metagenômicos

(MOCALI; BENEDETTI, 2010).

Os estudos metagenômicos devem primeiro ‘curar’ as sequências para obter

dados de qualidade, eliminando pares de bases ambíguos e sequências de vetor

ou adaptadores. As sequências editadas podem então ser usadas para a predição

de genes e, se desejar, para montagem de contigs. Devido à natureza da maioria

23

dos conjuntos de dados metagenômicos, especialmente para a análise das

comunidades do solo, espera-se que a montagem de contigs tenha um benefício

limitado. Depois de obter sequências de alta qualidade, estas podem ser

depositadas e comparadas com os bancos de dados de referência (KAKIRDE et

al., 2010). Vários grupos estão disponibilizando plataformas para a análise desses

dados, inicialmente criados para a anotação de genomas, que permitem um alto

desempenho para a anotação automática de fragmentos de projetos ambientais

metagenômicos, com sua posterior classificação filogenética e reconstrução de

vias metabólicas. Um exemplo é o servidor Metagenomics RAST ou MG-RAST,

um sistema disponível para processar dados de sequências metagenômicas

(MEYER et al., 2008), comparando-as com banco de dados de proteínas e de

nucleotídeos, para atribuições funcionais de sequências acompanhadas por uma

classificação filogenética (KAKIRDE et al., 2010).

Uma vez que um conjunto de seqüências metagenômicas produz hits

significativos pelas ferramentas de busca do tipo BLAST (ALTSCHUL et al., 1990)

em bancos de dados de DNA (ex. GenBank), as sequências podem ser

categorizadas em subsistemas pelo SEED de forma a organizar as funções dos

genes preditos de acordo com seus processos biológicos (OVERBEEK et al.,

2005). Uma abordagem diferente é tomada pelos programas autônomos

disponíveis livremente, como o MEGAN (MEtaGenome ANalyzer), que prevê

saídas visuais e pode avaliar rapidamente a diversidade biológica das amostras

metagenômicas, permitindo estudos comparativos entre diferentes conjuntos de

dados, incluindo algumas avaliações funcionais. Este programa compara um

conjunto de fragmentos de DNA (ou contigs) contra bancos de dados de

sequências conhecidas, utilizando BLAST. MEGAN é usado para computar e

explorar interativamente o conteúdo de um conjunto de dados taxonômicos,

usando a taxonomia do NCBI para resumir e ordenar os resultados (HUSON et

al., 2007).

Sem as ferramentas e as abordagens de bioinformática, os resultados

obtidos pelas novas tecnologias de sequenciamento seriam inúteis. No entanto, a

metagenômica, as tecnologias de sequenciamento e a bioinformática, atuando em

conjunto como atualmente, prometem um futuro promissor para preencher a

lacuna que se interpõe entre o conhecimento da diversidade genética do planeta

24

e o potencial biotecnológico que pode existir na imensa parcela dos micro-

organismos não cultiváveis (AMANN et al., 1995; TRINGE et al., 2005; ROESCH

et al., 2007).

1.9. Referências

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Capítulo 2 - BIOPROSPECTION OF BACTERIAS AND YEASTS FROM

ATLANTIC RAINFOREST SOIL CAPABLE OF GROWING CRUDE GLYCEROL

RESIDUES

Elizabeth Amélia Alves DUARTE1, Gileno Vieira LACERDA JR1, Thiago Alves Santos de OLIVEIRA2, Martin BRENDEL1, Leandro Lopes LOGUERCIO1 *, Júlio Cézar de Mattos CASCARDO1 †

1 Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, Brasil

2 Laboratório de Expressão Gênica, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil

Running title: Microbial crude-glycerol degraders from Rainforest soil

[ * Corresponding author ]

Manuscrito submetido ao periódico Genetics and Molecular Research (ISSN 1676-5680) em 12/fev/2013

Aceito para publicação em 05/abr/2013

2.1. Abstract

The increasing world production of biodiesel is accumulating crude glycerol

as the major byproduct. This can be used as carbon source for industrial

microbiology, adding economic competitiveness and environmental value for the

biodiesel industry. Here, we assessed the possibility of exploring the

megadiversity of an Atlantic Rainforest soil sample to obtain crude glycerol-

degrading microorganisms. A microcosm of this soil was established containing

minimal medium + 8% crude glycerol (w/w), with its biological activity measured by

respirometry (Bartha method). High CO2 levels were released in crude glycerol

microcosms, suggesting the existence of microorganisms capable of degrading

40

this residue. To test the possibility of isolating and cultivating these

microorganisms in vitro, aliquots of the soil suspension were plated in minimal

medium + 10% crude glycerol (v/v). Out of 19 morphologically distinct isolates, 12

bacteria and six yeasts were identified by PCR from universal primers 16S and

26S rDNAs, respectively. Statistical analysis comparing the values of optical

density at 600 nm per time point was efficient to show growth differences among

cultures. Two yeasts and three bacteria with distinct growth profiles that are viable

for future studies of liquid fermentation were highlighted. While the former showed

rapid adaptation, but lower culture biomass production, the opposite occurred for

the bacteria. Amplicon sequencing placed the bacterial isolates as close to

Staphylococcus arlettae, Pseudomonas citronellolis and Bacillus megaterium, and

the yeasts to Trichosporon moniliiforme and Meyerozyma guilliermondii. The

implications of using these species and overall methodology in crude glycerol

bioreactors or bioremediation processes were discussed.

Key words: Biofuels, glycerol conversion, microbial diversity, clean energy, crude

glycerin, glycerol industry

2.2. Introduction

The world market of “green/clean” energy is increasingly counting on biodiesel as

a viable alternative to fossil fuels for environmentally sustainable development

(Dobson et al., 2011; Yang et al., 2012). However, around 10% of the biodiesel

production results in crude glycerol as the main by-product of this process (Silva et

al., 2009). Therefore, the increased worldwide production of this fuel in recent

years has brought a much larger availability of crude glycerol for this specific

market, with a concomitant drop in its prices (Yazdani and Gonzalez, 2007). This

residue is usually qualitatively and quantitatively contaminated by various other

substances that participate in, or are derived from, the biodiesel production; they

vary according to (i) the biological origin of the oils and fats used as raw material,

(ii) the catalyst type and efficiency of the transesterification process, (iii) the

biodiesel yields, (iv) the initial levels of present impurities, and (v) whether there is

any sort of recovery for the catalyst and methanol employed (Thompson and He,

41

2006; Yang et al., 2012). Such variation and the chemical nature of these

contaminants make the direct use of crude glycerol unviable for food,

pharmaceutical, chemical, and synthetic material industries (Ashby et al., 2011),

which commonly use pure glycerol. Thus, the use of crude glycerol in other

applications and/or in its bioconversion to other products with economic value

appear to be the best alternative for its processing in biodiesel production facilities

(Johnson and Taconi, 2007; Min et al., 2010; Dobson et al., 2011).

To process the crude glycerol residue based upon economic and environmentally

sustainable methods that lead to value-added products, several approaches have

been developed (e.g. Mu et al., 2008; Min et al., 2010; Posada et al., 2011; Ashby

et al., 2011; Jensen, 2011). As noticed from these studies, the use of

microorganisms capable of degrading/converting crude glycerol has been a major

strategy proposed (Pagliaro et al., 2007). The predominant type of work reported

in recent years employs pre-selected and/or already established strains of

microorganisms for glycerol-bioconversion processes (Mu et al., 2008; Rymowicz

et al., 2010; Gungormusler et al., 2011; Ashby et al., 2011), which is relevant

under the urge of developing biotechnologies able to efficiently cope with the

waste of biodiesel production (Yazdani and Gonzalez, 2007; Dobson et al., 2011).

However, the screening for new strains of microorganisms showing greater or

more rapid degradation of crude glycerol, or yet displaying novel metabolic

features in terms of value-added compounds they can generate directly from

growth on this residue, should not be relegated in this context. New crude glycerol-

degrading isolates can be used either alone or making up microbial consortia,

which are showing to be very promising for this purpose (Gallego et al., 2007;

Jensen, 2011). Not unexpectedly, the tendency in screening studies of this nature

is to seek novel isolates exactly in those environments enriched with the same

target substrate (e.g. Maciel et al., 2007; Franciscon et al., 2009), due to the

higher possibility of finding microorganisms already adapted to these human-

generated ecological niches. Nevertheless, other sources of diverse microbes

should not be neglected, since glycerol is an abundant carbon source in nature (it

is a structural component of many lipids), and so, likely prone to be metabolized by

a great variety of microorganisms.

42

From the point of view of biotechnology, bacteria and yeasts are important groups

because their representatives in terrestrial microbiota are recognized by the high

species diversity, adaptive plasticity, and metabolic versatility, which allow their

employment in numerous biodegradation processes (e.g. Maciel et al., 2007; Milić

et al., 2009; Franciscon et al., 2009). The microbial biodiversity of soils from the

Atlantic Rainforest is expectedly very large, due to a higher diversity of plants

(Myers et al., 2000; Arnold et al., 2002) and to a much lower anthropic disturbance

of this environment (Hanada et al., 2010). Hence, an interesting hypothesis to be

tested is whether a supposedly largely diverse ecosystem can harbor microbial

species able to degrade human-generated compounds, even when no previous

contact with such compound has occurred.

The process of biodegradation of organic compounds in soil can be assessed by

microbial respiration, by measuring the emission of CO2 and/or uptake of O2,

which indicate the presence of biological activity (Marin et al., 2004). In this

context, the Bartha respirometer (Bartha and Pramer, 1965) is a simple method

that is frequently used in measurements of microbial activity in soil microcosms

(ABNT, 1999; Mello et al., 2007). In addition, once the existence of active

microbes in a given environment is established, subsequent biotechnological

applications depend on the possibility of isolating and cultivating these

microorganisms in vitro. Hence, the objectives of this study were (i) to determine

the biological activity in microcosms of an Atlantic Rainforest soil sample (from a

biodiversity ‘hot-spot’ area) that was enriched with crude glycerol, (ii) to test the

possibility of isolating microorganisms that are crude glycerol-degraders, with

distinct patterns of growth, and cultivating them in vitro, and (iii) to characterize

these isolates taxonomically by DNA sequencing, in order to identify bacteria and

yeasts with potential applicability in biodegradation/ bioconversion of crude

glycerol.

2.3. Material and Methods

2.3.1. Soil samples

Soil samples from the Atlantic Rainforest located at 14° 47' 6" S and 39° 13' 25" W

were collected in the city of Ilhéus, Bahia, Brazil. In each sample, 500 g of soil

were collected at a depth of 0-20 cm, being five collection spots of 100 g each,

43

spaced 5 m from each other. The samples were sieved in a 2 mm mesh, packed in

plastic bags and stored at 4 °C for further analysis.

2.3.2. Soil microcosms enriched with crude glycerol and respirometric studies

The crude glycerol used in the experiments was the residue obtained by the

transesterification of Jatropha oil (Jatropha curcas L.) used for biodiesel

production and kindly provided by the group of Bioenergy and Environment of the

State University of Santa Cruz (Ilhéus-BA, Brazil). The ‘microcosms’ formed from

Atlantic Rainforest soil consisted of 50 g soil, 15 mL of minimal medium (0.1%

KH2PO4, 0.1% K2HPO4, 0.1% NH4NO3, 0.05% MgSO4, Fe2SO4 0.001%, 0.001%

CaCl2) and 5.0 mL of crude glycerol as carbon source (8% v/w). The control was

established similarly, but without addition of crude glycerol. Higher concentrations

of crude glycerol (50%, 70% and 100%) were also tested, but were discarded due

to the high viscosity, which generated spongy and saponified compounds that

impaired subsequent analyses.

The CO2 emission in these microcosms was monitored by the method of Bartha,

used in respirometric studies, as defined in the technical standards L 6350

CETESB and NBR 14283 (ABNT, 1999). The experiment was done with triplicate

measurements for each time point. Each respirometer contained a single

microcosm treatment as described above. To determine the amount of CO2 being

possibly produced by microorganisms during aerobic metabolism of the carbon

source added, 10 mL of a 0.2 N KOH solution was added every 24 h for 80 days.

The amount of carbon dioxide that was released by the microcosm and absorbed

by this alkaline solution was estimated by titration of residual KOH after addition of

1 mL of barium chloride 1.0 N. For titration of KOH, a standardized solution of 0.1

N HCl was used. From the volume of acid added during titration, the release of

CO2 was quantified using the formula: [CO2] = (A – B) 50 fHCl , (1), where: ‘A’ =

Volume of 0.1 N HCl used to titrate the KOH solution in the blank test (mL); ‘B’ =

volume of 0.1 N HCl used to titrate the KOH solution in each treatment (mL); ‘50’ =

factor to convert the volume of CO2 in their respective equivalent in micromoles

(mol); ‘fHCl’ = factor of the 0.1 N HCl solution (Mello et al., 2007).

44

2.3.3. Isolation of microorganisms in media containing crude glycerol

Different proportions of soil, minimal medium and crude glycerol from those

described above were used to make a suspension that could enable better

manipulation and potential isolation of microorganisms capable of metabolizing the

crude glycerol. In 250 mL of minimal medium (in a 500 mL Erlenmeyer flasks), 25

g of crude glycerol + 200 g of soil were added and maintained under constant

stirring at 120 rpm, at a temperature of 25 ± 2 °C. The bottle was sealed, but

allowed aeration; it was incubated for 90 days, seeking to reproduce roughly the

period of enrichment with crude glycerol of the soil sample in the respirometer (see

above). After this incubation period, aliquots were removed for in vitro culture.

In a Petri dish (100 x 20 mm) containing minimal medium (see composition

above), 1.5% agar and 10% crude glycerol (v/v), 100 µL of the soil suspension

enriched with crude glycerol (after 90 days incubation) were added. For this

experiment, three plates were inoculated and incubated for 7 days in BOD at a

temperature of 35 ± 2 °C. The microorganisms that grew in this medium were

evaluated and characterized by morphology and by the Gram test. By means of

subcultures in Petri dishes containing the same medium, 19 microorganisms

morphologically distinct from each other were isolated, of which 12 were bacteria

and seven yeast. These isolates were stored in liquid minimal medium + pure

glycerol (25%, v/v) at -80 ° C for later use.

2.3.4. Isolates identification by PCR of rRNA genes

The isolates were subjected to amplification by PCR with universal primers

designed for the 16S rRNA gene of the bacterium domain, designated as ‘27F’ (5'-

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') and ‘1525R’ (5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3')

(Lane, 1991), and D1/D2 primers for the 26S subunit of rRNA gene of yeast,

designated as ‘NL-1’ (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') and ‘NL-4’ (5'-

GTCCGTGTTTCAAGACGG-3') (O'Donnell, 1993). For both amplifications, the

following reagents and concentrations were used: a small amount of a colony from

each strain grown on the plate (DNA), 1x buffer Taq DNA polymerase, 3.7 mM

MgCl2, 0.6 pmol/µL of dNTPs, 0.4 pmol/µL of each primer, 0.4 mM Bovine Serum

Albumin (BSA), 5 U of Taq DNA polymerase, in a final volume of 50 µL, adjusted

45

with sterile ultrapure water. In these experiments, 10 ng of DNA from Escherichia

coli or Saccharomyces cerevisiae were included as positive controls for bacteria

and yeast, respectively. Amplified products were separated in 1% agarose gel,

stained with ethidium bromide and visualized over UV light. The amplicons were

sequenced by Molecular Analysis ACTGene Ltda (Porto Alegre-RS) using the

automated sequencer ABI-PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

The taxonomic identity of the isolates was assessed through BlastN search in the

GenBank, using the general database for 26S rRNA-amplified sequences and the

16S rRNA database for the bacterial amplicons.

2.3.5. Isolates growth curves in liquid medium containing crude glycerol

For standardization of inocula, the strains of bacteria were grown in Nutrient Agar

medium at 35 °C for 48 h and monitored every 12 h. For yeasts, Sabouraud agar

medium was used, with the corresponding isolates incubated at 29 °C for 24 h.

The respective inocula for bacteria and yeast were standardized in sterile saline to

0.45%. To determine the growth curve of these isolates, suspensions were made

at a concentration of 5 x 108 CFU mLl-1 as the initial inoculum, which corresponds

to the optical density of 0.3 at the McFarland scale. The growth curve was

determined using 50 mL sterile Falcon tubes containing 20 mL of minimal medium

(see above) + 10% crude glycerol (v/v) as the sole carbon source. The flasks were

incubated at 30 °C, 120 rpm for 7 days in an orbital shaker, with growth monitored

every 24 hours by spectrophotometry (SpectraMax Plus ®) at 600 nm. For each

isolate, three inoculations (replicates) were set in separate flasks and incubated

under the same growth conditions. The growth of microorganisms in culture

medium containing crude glycerol was evaluated from the optical densities (OD) at

600 nm, with a reading every 24h until the maximum time of 168h. The OD data

obtained for each time and for each microorganism were statistically compared in

order to identify the moments of their respective growth curves in which the

increase in cell number was significant. For analysis of variance, these data were

submitted to the Scott-Knott test (P ≤ 0.05) using the SISVAR 5.3 program

(Ferreira, 2011). Only significant differences in the OD values at adjacent time

points were indicated by letters in Table 1.

46

2.4. Results

Aiming to verify the magnitude of detectable biological activity in soil of tropical

Atlantic Rainforest enriched with 8% crude glycerol, the release of CO2 in this

system was monitored by respirometry (Bartha method). Over 80 days of analysis,

the results clearly demonstrate that this method was sufficient to detect biological

activity in the soil microcosm induced by crude glycerol (Figure 1). Compared with

the control microcosm, a greater release of CO2 was observed in glycerol-

containing microcosm as early as the 5th day. For this treatment, CO2 production

varied between 125 and 300 µmol from the 10th day of analysis, with points of

maximum emission between 55 and 65 days of incubation. As it might be

expected, the control treatment that consisted only of original soil + minimal

medium without added carbon source, showed some production of CO2 (90 µmol)

only in the initial phase of the observations, with a sharp decline in the amounts of

this gas released in the final period of the experiment (Figure 1).

To verify the possibility of identifying cultivable microorganisms from the Atlantic

Rainforest soil with potential to consume crude glycerol, we established a soil

suspension in minimal medium containing this residue. After 90 days of incubation,

aliquots of this suspension were plated and incubated in minimal medium

containing 10% crude glycerol. Several morphologically distinct colonies were

observed on the plates after 24 h incubation at 28 °C, 32 °C and 35 °C

respectively (data not shown). In order to proceed with a molecular

characterization, 19 isolates with morphological features distinct from each other

were selected for amplification by PCR with universal primers for the 16S rRNA

gene of bacteria and the 26S rRNA gene of yeast (Figure 1). The results for the 19

isolates under study have confirmed that they are members of these two

taxonomic groups (Figure 2). The amplification was positive for all 12 strains of

bacteria and for six of the seven yeast isolates (Figure 2). Interestingly, results for

yeasts amplification revealed the presence of two bands around the expected size

(~ 650 bp) but slightly different between them. Only the largest fragment was

observed for three isolates, only the lowest for two isolates, and both fragment

sizes at the same time for one of the isolates (Figure 2B).

47

The use of a microorganism in biotechnology relies on the knowledge of their

growth pattern in liquid medium, considering the cost/benefit ratio for large-scale

production, especially in liquid fermentation. Aiming at further studies, a

preliminary analysis of the growth profiles in culture for the 19 isolates under

scrutiny (data not shown) allowed the selection of five (three bacteria and two

yeasts) that showed distinct growth patterns. Statistical analysis comparing the

mean values of optical density (OD) at 600 nm, per time point for each isolate, was

used as an indicator of those moments when there were significant increases in

growth rates for each culture (inflection points on the respective curves – Table 1).

The A1 and E2 strains reached the log phase during the first 24 to 48 h of growth,

showing more rapid adaptation responses in culture medium containing crude

glycerol. However, their optical density values at later times showed stabilization at

lower levels of cell biomass. In contrast, H1 and C isolates took a longer time to

reach the exponential phase of growth (between 72 and 96 h), but the final cell

biomass in each culture was higher. Finally, the H2 strain showed two moments of

inflection in its growth curve (Table 1).

Through the BlastN program, rRNA sequences obtained from these five

microorganisms were compared with other sequences in the NCBI database. To

define the taxon corresponding to our isolates, the highest scores in the output

table of aligned sequences were considered priority for the identification, when the

other parameters showed a same value among accessions. With this criterion, all

five sequences allowed the identification of our isolates to the species level,

showing a percentage of identity > 94% and a sequence coverage > 98% (Table

2). Interestingly, the fragment amplified and sequenced for the H1 strain, which

was identified as Pseudomonas citronellolis, showed 18 extra nucleotides along

the region of coverage (477 bases from a total of 479 – Table 2) compared to the

sequences in the database that aligned with it (data not shown).

2.5. Discussion

Considering the overall characteristics of the anthropic activity of biodiesel

production, large amounts of crude glycerol are generated as waste in this process

(Johnson and Taconi 2007; Silva et al., 2009). The biotechnological use of

microorganisms capable of biodegrading/bioconverting this residue has been the

48

major approach proposed for handling this issue in an economic and environment-

friendly manner (Pagliaro et al., 2007; Dobson et al., 2011). The identification of

new microbe strains with advantageous features in metabolization of crude

glycerol is a requirement, and the tendency in studies of this nature is to seek

novel isolates exactly in those environments enriched with the same target

substrate (e.g. Maciel et al., 2007; Francisco et al., 2009). In the present work we

sought an alternative approach for identification and isolation of microbial activity

for consumption of crude glycerol, which was based upon an expectedly large

functional biodiversity of soils from the Atlantic Rainforest.

Increased biological activity in soil microcosms enriched with 8% crude glycerol

(Figure 1) suggests that there was microbial growth in the Atlantic Rainforest soil.

The crude glycerol, even being exogenous to this habitat and containing various

other compounds from the oil transesterification process for biodiesel production

(Johnson and Taconi, 2007), seems to have been used as carbon source for

microbial metabolism. The oscillations observed in the CO2 emissions over the

experimental period may have represented the temporal variation of metabolic

adjustments likely required for the microbial bioconversion of crude glycerol. Such

behavior may have been due to the fact that, in general, microbial consortia are

related to degradation of exogenous or xenobiotic substances, in which each

microorganism performs distinct but synergistic enzymatic activities in a given

environmental condition (Gallego et al., 2007). The hypothesis that consumption of

crude glycerol is occurring by pre-existing microorganisms in Atlantic Rainforest

soil is further supported by the observation that, in the control treatment (only with

mineral medium added), only a basal production of CO2 was noticed until the 55th

day of analysis, with a sharp decline thereafter. This suggests just a minimal

biological activity, due to the absence of a carbon source. These data indicate,

therefore, that the existing biodiversity of the Atlantic Rainforest soil can be

exploited biotechnologically in the biodiesel production context, if crude glycerol-

converter microbes can be isolated and cultured in vitro.

Based on these results, we attempted to isolate microorganisms in vitro, from

culture medium containing crude glycerol as the carbon source. Such a simple

approach indeed allowed the isolation of microbes from Atlantic Rainforest soil

49

with distinct morphological characteristics. This indicated the existence of in vitro-

cultivable bacteria and yeasts in this ecosystem, which thereby may have the

potential for biotechnological applications in the degradation of residues from

biodiesel production. A simple visual inspection and selection of morphologically

distinct colonies were effective in capturing at least part of the microbial diversity of

interest, confirming to be a practical, relatively fast and less expensive technique

for screening environmental samples for given purposes. Confirmation of the

presence of bacteria and yeast among the isolates was relevant, since these are

two important groups from the biotechnological viewpoint (e.g. Papanikolaou et al.,

2002; Dharmadi et al., 2006). Interestingly, the presence of bands of slightly

different sizes after amplification with the universal primers for yeast (Figure 2)

suggests that possible variants of the species identified in databases, or even new

species, may have been isolated in this work. As discussed below, this possibility

was strengthened by the results of alignment with GenBank sequences (Table 2).

Future research aiming at a detailed identification of these isolates is certainly

warranted.

A statistical analysis of the OD values at time points along a given growth curve

was effective to assess and detect differences between the behavior patterns of

isolates cultivated in crude glycerol-containing medium. A comparison of microbial

growth suggests important differences related to the respective metabolic behavior

of these isolates in terms of bioconversion this residue. For example, while the A1

and E2 yeasts demonstrated earlier adaptation to the medium, but with cellular

biomass stabilizing at lower levels, the opposite occurred with the two bacteria C

and H1, whose adaptation in culture was delayed, but higher levels of biomass

were achieved (Table 1). Such an availability of different patterns of growth

response can be useful in different circumstances, mainly for optimization of

fermentation processes to obtain products of biotechnological interest related to

crude glycerol conversion. For instance, in time-sensitive applications, when a

rapid response to the substrate is a required factor, A1 and E2 yeasts are

indicated. On the other hand, when a given technical application requires higher

biomass accumulation, C and H1 bacteria would be more appropriate.

50

The two inflexions in the growth curve observed for H2 (Table 1) may indicate

different forms of glycerol use, or the metabolization of other compounds existing

in the residue. The characteristics observed for the five growth profiles may also

have been a consequence of isolate-specific responses to the presence of other

compounds in the crude glycerol, such as sodium methoxide (a catalyst of the oil

transesterification process) and some fatty acid and alcohol residues (Johnson

and Taconi, 2007; Thompson and He, 2006). These substances can either serve

as alternative carbon sources or activators/inhibitors of enzymes that are important

to the overall microbial metabolism. The implications of these residual components

of crude glycerol have been studied for some algae and bacterial species of

biotechnological interest (Chiu et al., 2006; Easterling et al., 2009; Liang et al.,

2010). In this work, it is suggested that the presence of these residues may also

be related to the different patterns of growth and biomass accumulation as a

function of time for these microorganisms. The metabolic specificities found for the

isolates of this study can be used individually, or combined into microbial consortia

that can be applied in industry for the degradation of these wastes from the

biodiesel production (Gallego et al., 2007; Jensen, 2013).

The microorganisms isolated and identified in this study provide a first glance at

the potential diversity that make up the soil microbiota of the Atlantic Rainforest.

Considering the domain bacteria, it was no surprise to find isolates of the

Pseudomonas and Bacillus genera, since their various species are widely

recognized for metabolic versatility and ability to withstand the most extreme

environments, which is why they are found in so many different ecosystems;

furthermore, these bacterial genera are widely studied for a variety of

anthropogenic purposes (Raaijmakers et al., 2010). Some species of

Pseudomonas, Bacillus and Staphylococcus have been reported as being glycerol

bioconverters (Silva et al., 2009; Yang et al., 2012), which may help explain their

ability to handle contaminants in the crude glycerol. In this study, it is speculated

that the H1 sequence that lined up with Pseudomonas citronellolis (Table 2) may

represent a variant of this species, or even a new species of this genus, because

the 18 extra nucleotides found within the alignment region was not identified in any

of the 16S rRNA sequences deposited in the GenBank thus far (data not shown).

The H2 isolate aligned strongly with an accession of Bacillus megaterium,

51

described as a mostly aerobic spore-forming bacterium, found in a wide variety of

ecological niches and capable of growing in an array of carbon sources, that has

been used for more than 50 years in protein-producing industry (Vary et al., 2007).

This species has been studied for industrial fermentation based on crude glycerol

from biodiesel production as the substrate (Posada et al., 2011). Finally,

Staphylococcus was another bacterial genus found in this study, which comprise

not only pathogenic species, but also various others described in different

contexts, including those that are glycerol degraders (Yang et al., 2012). The

ability to degrade residues from the textile industry made up by dyes containing

aromatic azo group has been recently reported for a facultative aerobic isolate of

the Staphylococcus arlettae species (Franciscon et al., 2009). The ability of our S.

arlettae C isolate of converting crude glycerol seems to be a new feature of

biotechnological interest for members of this species.

Yeasts are widely known for their diversity and variability, and hence, extensively

studied with regard to various biotechnological applications, including degradation

of glycerol (Silva, 2009). Our yeast isolates aligned with maximal identity to

accessions of Trichosporon moniliiforme and Meyerozyma (ex Pichia)

guilliermondii species (Table 2). T. moniliiforme has been isolated from several soil

and water samples, including mangrove sediments, showing ability for

bioremediation of xenobiotics (Luo et al., 2012). Antifungal activity of industrial

interest for the production of bread has been reported for strains of M.

guilliermondii (Coda et al., 2013), as well as biological control of fungal diseases at

the post-harvest of important agricultural crops (Janisiewicz and Korsten, 2002).

We suggest the yeast isolates from this work may be further studied regarding the

possibility of accumulating other characteristics of biotechnological interest,

beyond the observed consumption of crude glycerol.

In conclusion, this study demonstrated the feasibility of bioprospecting

microorganisms, capable of converting anthropically-generated compounds, within

very biodiverse ecosystems (such as Atlantic Rainforest soil) that has not had

previous contact with the target substrate in its biological history. Furthermore, it

was shown that this procedure can be performed by efficient and low-cost

methods, such as the Bartha respirometry, in vitro culture and analysis of growth

52

profiles through optical densities. Further characterization of these isolates is

currently underway for a more in-depth investigation of their potential for

biotechnological use. We hope the information and methodological scheme of this

study are not only applicable to handling crude glycerol residues from biodiesel

production, but also useful in similar bioprospection or bioremediation systems

dealing with the processing of by-products from industrial activities.

2.6. Acknowledgements

The authors are grateful to Dr. João Carlos Teixeira Dias (DCB/UESC) for

insightful comments and suggestions in the early stages of the research. The work

was supported by CNPq and UESC. E.A.A. Duarte was granted with a doctoral

fellowship from CNPq. This article is dedicated to Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos

Cascardo, in memoriam, for being the intellectual mentor and supporter of this line

of investigation at UESC.

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56

2. 8. Figures and tables:

Figure 1. Production of CO2 in tropical Atlantic Rainforest soil evaluated by the method of Bartha. Values in the graph are mean of three replicates. ‘C’: control microcosm, only with soil + minimal medium (grey bars); ‘8%’: control microcosm plus the addition of this percentage of crude glycerol (black bars).

Figure 2. Characterization by PCR of 19 microbial isolates cultivated in vitro on medium containing 10% (v/v) crude glycerol. Electrophoresis in 1% agarose gel. Amplification results for bacterial 16S rDNA (A) and yeast 26S rDNA (B) universal primers. Expected molecular weights for the respective fragments are indicated by arrows.

57

Table 1. Growth curve of five isolates cultivated in vitro on medium containing

10% crude glycerol as sole carbon source

Isolate 2 O.D. at 600 nm 1

0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h

C 0.0 0.18 0.25 0.23 a 0.82 b 0.95 1.02 0.93

H1 0.0 0.09 0.13 0.12 a 0.80 b 1.01 1.20 0.96

H2 0.0 a 0.42 b 0.34 0.33 b 0.55 c 0.76 0.79 0.74

A1 0.0 a 0.34 b 0.55 0.47 0.43 0.51 0.58 0.52

E2 0.0 0.17 a 0.36 b 0.34 0.37 0.42 0.45 0.37

C.V. (%) 14.95 1 Values in each row followed by different letters are statistically different, according to the Scott-

Knott test (p <0.05), indicating points of the curve where steeper growth was observed. Values before and after those with significance letters were not statistically different from previous and subsequent ones (letters were removed for clarity). 2 Isolates ‘C’, ‘H1’ and ‘H2’ are bacteria, ‘A1’ and ‘E2’ are yeast.

Table 2. Identification of the five microorganisms isolated in vitro on medium

supplemented with 10% crude glycerol

Isolate Query size

(bp) 1

Query coverage

(%)

Nucleotide identity (%) 2

Taxon Access

number 3

Bacteria

C 353 99 96 Staphylococcus arlettae JX188021

H1 479 99 94 Pseudomonas

citronellolis AB021396

H2 618 98 99 Bacillus megaterium JN845569

Yeast

A1 357 99 99 Trichosporon moniliiforme

GQ367302

E2 542 100 100 Meyerozyma guilliermondii

JN391347

1 All amplicons were sequenced at both forward and reverse orientations; the query fragments

presented correspond to the longest sequence of the two (fwd for isolates C and A1; rev for H1, H2 and E2). 2 ‘e-values’ were equal to zero for H1, H2 and E2; to 2e-166 for C, and to 1e-179 for A1.

3 Access numbers correspond to the descriptive sequences of the taxa indicated in the previous

column.

58

Capítulo 3 – BIOPROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS E

LEVEDURAS POTENCIALMENTE CONVERSORAS DE GLICEROL BRUTO

3.1. Resumo

A escassez energética e a utilização de combustíveis fósseis é uma

preocupação mundial. Portanto, combustíveis renováveis, como o biodiesel, estão

sendo pesquisados e implementados em todo o mundo. Contudo, a produção de

biodiesel gera 10% de glicerol bruto (GB) como co-produto, gerando custo

adicional e acúmulo residual inadequado. Neste contexto, estão sendo estudadas

aplicações alternativas para o glicerol bruto. Neste trabalho foi possível isolar,

selecionar e identificar potenciais micro-organismos do solo de cabruca, típico da

região Sul da Bahia, que são potenciais bioconversores de glicerol bruto obtido a

partir da transesterificação do óleo de pinhão manso (Jatropha curcas L) para

produção de biodiesel. A taxa de biodegradação da matéria orgânica foi

monitorada pelo método respirométrico de Bartha, e os perfis de consumo e

liberação de CO2 do solo enriquecido com 4% e 8% de glicerol bruto permitiram

selecionar o solo de cabruca não cultivado (NC) e a concentração de 10% de

glicerol bruto, utilizados nos demais experimentos deste trabalho. Foram isolados

18 micro-organismos crescidos em meio contendo 10% de GB como fonte de

carbono. Os respectivos perfis de crescimento desses micro-organismos foram

analisados também em glicerol puro (GP) por espectrofotometria. De modo geral,

as leveduras apresentaram melhor crescimento em meio BG do que em meio GP,

sendo que Meyerozyma sp. I e II, Rhodotorula sp. e Pichia sp. não diferiram

estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0.05). Entre as bactérias

Staphylococcus e Bacillus sp. II cresceram em meio com BG. As implicações

desses resultados no contexto do uso alternativo do glicerol bruto são discutidas.

Palavras-chave: Glicerol bruto, respirômetro de Bartha, bioconversão,

pirosequenciamento, isolamento microbiano.

59

3.2. Introdução

As principais fontes de energia como o petróleo, o carvão, o gás natural,

hidrelétricas e em menor proporção, a energia nuclear são limitadas ou

esgotáveis (NASCIMENTO et al., 2001). A escassez desses recursos somada aos

impactos ambientais gerados, principalmente o aquecimento global, tornou-se

preocupação mundial (HERMANN; PATEL, 2007). Neste contexto, o mercado

mundial de combustíveis renováveis “limpos” tem utilizado biocombustíveis, como

o biodiesel, como fonte alternativa aos combustíveis fósseis (MU et al., 2008; MIN

et al., 2010; DOBSON et al., 2011). Contudo, a produção de biodiesel gera 10%

de glicerol bruto como principal co-produto (MU et al., 2008). Assim, o aumento da

produção de biodiesel nos últimos anos tem gerado maior oferta de glicerol e

queda nos preços (YAZDANI; GONZALEZ, 2007; MIN et al., 2010). Por

conseguinte, existe a necessidade de utilizar este co-produto para produção de

bioprodutos viáveis do ponto de vista econômico e ambiental, uma vez que a

purificação do glicerol bruto para utilização como matéria prima nas indústrias de

fármacos, cosméticos e alimentos é bastante onerosa (DASARI, 2007; DOBSON

et al., 2011).

Entre as alternativas economica- e ecologicamente viáveis para utilização de

resíduos são estudadas estratégias biotecnológicas para obtenção de produtos de

valor agregado, por exemplo, a conversão microbiana desses subprodutos em

biomassa, biomoléculas e produtos com importância comercial (WANG et al.,

2001; DOBSON et al., 2011). Vários estudos reportam sobre a utilização do

glicerol bruto como fonte de carbono para micro-organismos, assim como os

prováveis mecanismos de assimilação do glicerol para a produção de compostos

intermediários de polímeros, resinas e aditivos para combustíveis

(PAPANIKOLAOU et al., 2000; ITO et al., 2005; CHENG et al., 2007). O glicerol

tem sido estudado para produção de 1,3-propanodiol (1,3-PDO), matéria-prima

para bioplásticos e com novas perspectivas na indústria de biopolímeros,

especialmente o poliéster politrimetileno tereftalato (PPT), de ampla utilização

comercial (JUN et al., 2010).

Outra alternatival viável para utilização do glicerol bruto residual é

biorremediação de contaminantes de solo por micro-organismos capazes de

degradar e estabilizar diversas fontes de carbono exógenas, como os vários

60

poluentes (BAKER, HERSON, 1994; MILIĆ et al., 2009). O processo de

biodegradação de compostos orgânicos no solo pode ser avaliado a partir da

respiração dos micro-organismos, seja pela evolução de CO2 e/ou absorção de O2

que indicam o perfil da atividade biológica evidenciado pela biodegradação

(CONEGLIAN, 2003; MARIN, 2004, MOREIRA; SIRQUEIRA 2006).

O sistema cabruca é caracterizado como sistema agroecológico de cultivo,

que consiste na substituição de estratos florestais por cultura de interesse

econômico, implantada no estrato florestal intermediário de forma descontinua e

circundada por vegetação natural. No sul da Bahia, é predominante o sistema

cabruca com cultivo de cacau, e existem áreas de cultivo abandonadas (não

cultivadas), principalmente, devido à disseminação da vassoura-de-bruxa, que

mudou o panorama de produção de cacau neste estado (LOBÃO et al., 2004).

Assim, neste trabalho dois solos de cabruca (abandonado e em produção),

peculiares à região Sul da Bahia-Brasil, foram utilizados para isolar e identificar

micro-organismos potencialmente envolvidos na degradação do glicerol bruto com

possíveis aplicações biotecnológicas.

3.3. Material e Métodos

3.3.1. Amostras dos solos

Foram coletadas duas amostras de solo do sistema agroflorestal ‘cabruca’

em distintas condições de cultivo: i) plantação de cacau em produção (PC-P) e II)

plantação de cacau abandonada (PC-A), georreferenciadas a 14°47'6"S

39°13'25"W e 14°47'46"S 39°10'22"W, respectivamente. Localizadas no município

de Ilhéus-Bahia-Brasil. Os solos foram coletados a profundidade de 0-20 cm,

peneirados, em condições estéreis, numa malha de 2 mm de abertura e

analisados quimicamente (Tabela 1) no Laboratório de Solos da Comissão

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC).

3.3.2. Microcosmo de solo enriquecido com glicerol bruto e estudo respirométrico

O glicerol bruto utilizado nos experimentos, co-produto obtido pelo processo

de transesterificação do óleo de pinhão manso (Jatropha curcas L.) empregado

61

para produção do biodiesel, foi cedido pelo grupo de Bioenergia e Meio Ambiente

da Universidade Estadual de Santa Cruz (Ilhéus-BA, Brasil). Os ‘microcosmos’

foram constituídos por 50 g de solo, 15 mL de meio mínimo (0,1% KH2PO4, 0,1%

K2HPO4, 0,1% NH4NO3, 0,05% MgSO4, 0,001% Fe2SO4, 0,001% CaCl2, adaptado

de Li et al., 2000) e glicerol bruto nas concentrações de 4% e 8% (v/m) como

fonte de carbono. O tratamento controle foi constituído de forma semelhante, sem

adição do glicerol bruto.

O monitoramento da emissão de CO2 nestes microcosmos foi realizado

através do estudo de respirometria pelo método de Bartha, conforme definido na

norma técnica L 6.350 da CETESB e a NBR 14283 (ABNT, 1999). O experimento

foi feito em triplicata. Para cada respirômetro foi utilizado um microcosmo nas

quantidades e proporções descritas acima. Para se determinar a quantidade de

CO2 a ser potencialmente produzida por micro-organismos aeróbios durante a

metabolização da fonte de carbono, 10 mL de uma solução de KOH (0,2 N) foi

adicionada ao microcosmo nas leituras diárias, totalizando 80 dias de análise. A

quantidade de gás carbônico liberado pelo microcosmo e absorvida por esta

solução alcalina foi estimada por titulação do KOH residual após adição de 1 mL

de cloreto de bário a 1,0 N. Para a titulação de KOH utilizou-se solução

padronizada de HCl a 0,1 N. A partir do volume de ácido adicionado na titulação,

o desprendimento do CO2 foi quantificado utilizando-se a fórmula: [CO2] = (A – B)

50 fHCl ,onde: A = volume de HCl 0,1 N utilizado para titular a solução de KOH da

prova em branco (mL); B = volume de HCl a 0,1 N para titular a solução de KOH

de cada tratamento (mL); ‘50’ = fator para transformar o volume equivalente em

μmol de CO2; fHCl = fator da solução de HCl 0,1 N (MELLO et al., 2007;

CAMARGO et al., 2009).

3.3.3. Obtenção de DNA metagenômico

Para as análises de pirosequenciamento abordadas neste estudo, foi

escolhido o solo da plantação de cacau abandonada (PC-A) e a concentração de

glicerol bruto a 10% (v/v), após observação dos dados apresentados no capítulo

2. Para melhor compreensão textual foi adotada a terminologia eDNA10 por se

tratar de amostra de DNA ambiental de um solo enriquecido com 10% (v/v) de

glicerol bruto.

62

Após 90 dias o DNA metagenômico da amostra foi extraído com o kit

PowerMax Soil DNA Extraction (MoBio®), seguindo a recomendação do

fabricante. A qualidade e a quantidade do DNA foi checadas usando eletroforese

em gel de agarose e espectrofotômetro Genequant (GE®).

3.3.4. Pirosequenciamento e processamento das sequências obtidas

Foi utilizado 5 µg de DNA para sequenciamento na plataforma 454 (GS-FLX

Titanium®) do Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC, Petrópolis,

RJ, Brasil. Os DNAs metagenômicos foram submetidos ao pirosequenciamento

de acordo com o método de Marguilies et al. (2005). As sequências obtidas foram

analisadas pelo programa Replicates para eliminar “artefatos”, ou seja, réplicas

artificiais geradas durante o sequenciamento (GOMEZ-ALVAREZ et al., 2009) e

pelo programa Lucy para remoção de sequências curtas e de baixa qualidade

(CHOU et al., 2001). As sequências do metagenoma foram depositadas no NCBI-

SRA com os seguintes números de acesso: Submission Acession: SRA026698;

Study: SRP004644; Sample: SRS139629.

3.3.5. Classificação Taxonômica

As sequências foram classificadas taxonomicamente pelo programa MG

RAST usando BLASTx contra o banco de dados não-redundante (NR) do NCBI. O

programa usa o algoritmo LCA (Last Common Ancestor) para atribuir as

sequências para cada táxon. Os limiares usados no programa foram min-score:

70; min-support: 15; top-percent: 10. Os dados foram normalizados e comparados

pelo próprio programa.

3.3.6. Isolamento o de micro-organismos em meio com glicerol bruto

Em placas de Petri (100 x 20 mm), contendo meio mínimo (0,1% KH2PO4,

0,1% K2HPO4, 0,1% NH4NO3, 0,05% MgSO4, 0,001% Fe2SO4, 0,001% CaCl2,

1,5% de Agar) e glicerol bruto 10% (v/m) foi adicionado 10 µL de suspensão do

microcosmo com 10% glicerol bruto do solo cabruca não cultivado incubado por

90 dias (os mesmos solos utilizados nos estudos respirométricos). As placas

63

foram incubadas em BOD a 35 ± 2 °C por sete dias. Os experimentos foram

realizados em triplicata.

3.3.7. Identificação molecular dos isolados

Foram realizadas amplificações por PCR com primers universais do gene

rRNA 16S, domínio bacteria, designados com ‘27F’ (5’-

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) e ‘1525R’ (5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3')

(Lane, 1991), e primers do domínio D1/D2 da subunidade do gene rRNA 26S de

leveduras, designados como ‘NL-1’ (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e

‘NL-4’ (5’-GTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (O’Donnell, 1993). Para ambas as

amplificações, foram utilizados os seguintes reagentes e concentrações:

fragmento de colônia isolada em placa (DNA), 1x de tampão da enzima Taq DNA

polimerase, 3,7 mM de MgCl2, 0,6 pmol/μL de dNTPs, 0,4 pmol/μL de cada

primer, 0,4mM de Albumina de Soro Bovino (BSA), 5 U de Taq DNA polimerase,

com volume final ajustado para 50 μL com água ultra pura estéril. Foram incluídos

nos experimentos 10 ng de DNA de Escherichia coli e de Saccharomyces

cerevisiae, como controle positivo para bactéria e levedura respectivamente. Os

produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1%, corados com

brometo de etídio e visualizados sobre luz ultravioleta. Em seguida, os amplicons

foram sequenciados pelo sequenciador automático ABI-PRISM 3100 Genetic

Analyzer (Applied Biosystems), pela empresa ACTGene Análises Moleculares

Ltda (Porto Alegre-RS).

3.3.8. Curva de crescimento dos isolados em glicerol puro e bruto

Para a padronização dos inóculos de bactérias, os isolados de bacterianos

foram cultivados em Ágar Nutriente e incubados a 35 °C por 48h, sendo

monitorados a cada 12h. Para as leveduras, o meio Ágar Sabouraud foi utilizado,

sendo estes isolados incubados a 29 °C por 24h. Os respectivos inóculos de

bactérias e leveduras foram padronizados em solução salina estéril a 0,9%. Para

determinar a curva de crescimento dos isolados microbianos, foram feitas

suspensões na concentração de 5 x 108 UFC mL-1 como inóculo inicial, que

corresponde à densidade óptica de 0,3 na escala de McFarland. A curva de

64

crescimento foi determinada utilizando tubos Falcon de 50 mL estéreis, contendo

20 mL de meio mínimo (com a mesma composição do meio de isolamento) + 10%

(v/v) de glicerol bruto como única fonte de carbono. Os frascos foram incubados

em agitador orbital a 30 °C e 120 rpm por 7 dias, sendo o crescimento monitorado

a cada 24h por espectrofotometria (SpectraMax Plus®) a 600 nm. Foram

estabelecidas três inoculações por isolado (repetições) em frascos distintos, nas

mesmas condições de crescimento. O crescimento dos micro-organismos em

meio contendo 10% glicerol bruto foi avaliado a partir das densidades óticas (OD)

a 600 nm, com uma leitura a cada 24h até o tempo máximo de 168h. Os dados de

OD obtidos para cada tempo e para cada micro-organismo foram comparados

estatisticamente, buscando-se verificar os momentos das respectivas curvas de

crescimento em que o aumento no número de células foi significativo. Para a

análise de variância, estes dados foram submetidos a agrupamento de médias

efetuado pelo teste Scott-Knott (P≤0,05), utilizando o programa SISVAR 5.3

(FERREIRA, 2011).

3.4. Resultados

Com o objetivo de verificar a resposta de atividade biológica de solos de

plantações de cacau sombreada em distintas condições de manejo e duas

concentrações de glicerol bruto (4% e 8%), estabeleceu-se microcosmos de solo

em aparatos específicos para análise respirométrica pelo método de Bartha

(BARTHA; PRAMER, 1965). Os microcosmos de solos de plantações de cacau

abandonada há mais de 25 anos (PC-A) e em produção atual (PC-P)

apresentaram perfis de emissão de CO2 maiores que o controle, para ambos os

níveis de glicerol bruto ao longo dos 80 dias de monitoramento (Figura 1).

Comparando dados dos solos de PC-A e de PC-P (Fig. 1), podemos

observar claramente que no primeiro deles houve atividade biológica durante todo

o período, sem o declínio acentuado (próximo à zero) que ocorreu para o

segundo. No solo de PC-A houve manutenção da respiração para ambos os

tratamentos de glicerol bruto, inclusive após os 80 dias de análise. Para este solo

também foram observadas oscilações na emissão de CO2 para os tratamentos

com 8% (100 a 290 µmol) e 4% (120 a 400 µmol) de glicerol bruto, mas somente

no tratamento com 8% de glicerol bruto ocorreu uma faixa constante de

65

respiração ao longo do tempo de análise. Por outro lado, principalmente após os

50 dias de análise, o tratamento com 4% declinou acentuadamente de um

patamar maior de emissão de CO2 (360 a 400 µmol) para valores próximos a 150

µmol (Figura 1a). Pelos perfis de acúmulo de CO2 apresentados na Figura 1c-d

para ambas as concentrações de glicerol bruto, houve maior acúmulo no solo de

PC-A, com perspectiva de continuidade da respiração do sistema para além do

período estudado (ausência de inflexão/platô nas curvas). Ao final do período

experimental, no solo de PC-P com 40 g/L e 80 g/L de glicerol bruto foram,

respectivamente, 11,3 e 24% menores que aos observados em solo de PC-A.

Importante observar que, ao contrário do que ocorreu para PC-A, as curvas de

acúmulo de CO2 para o microcosmo de solo de PC-P tenderam ao declínio

completo ao final do período estudado.

Figura 1. Perfil de emissão de CO2 de micro-organismos presentes nos solos de plantação de cacau abandonada (PC-A) e em produção (PC-P), pelo método de Bartha. Perfis de emissão diária (a, b) e acumulado no período (c, d) são apresentados. Os tratamentos testados são microcosmos sem adição de glicerol bruto (ctrl) e com adição de dois níveis de glicerol bruto (4% e 8%, m/m).

Na Tabela 1 foi verificado diferenças na composição de elementos químicos

essenciais e de pH entre os dois tipos de solo comparados por respirômetria e as

prováveis implicações desses resultados foram discutidas.

66

A análise granulométrica classificou ambos os solos como sendo areia silto-

argilosa (areia 47%, silte 41% e argila 12%). O pH foi classificado como ácido

para ambos os solos, porém o solo de PC-A apresentou 1 unidade de pH maior

que o de PC-P, aproximando-se mais do nível de pH considerado mais favorável

para atividade microbiana de solo (aproximadamente 5,6 a 6,0). Os níveis

superiores de H + Al no solo de PC-P, por serem deletérios às raízes de plantas,

confirmaram as condições menos favoráveis para uma funcionalidade microbiana

mais diversa neste tipo de solo.

Houve diferenças relevantes para alguns elementos macro e micronutrientes

requeridos por micro-organismos entre os solos de PC-P e PC-A, exceto para os

elementos K, N e C indicando níveis próximos de matéria orgânica entre eles. O

solo de PC-A apresentou maiores quantidades de Ca (5,0 x), Mg (3,8 x), Zn (3,5

x), Cu (1,7 x), Mn (2,5 x) do que o solo de PC-P. O solo de PC-A também se

destacou por apresentar 103,3 x mais do elemento fósforo que o solo de PC-P.

Somente para o elemento Fe é que o solo de PC-P apresentou concentração 2,7

x maior que o solo de PC-A. Os resultados da análise de solo em relação aos

teores dos principais elementos de relevância biológica, associados às curvas de

respirometria (Fig.1) indicaram que o solo de PC-A provavelmente possui maior

riqueza e/ou abundância de espécies microbianas com capacidade de

degradação de glicerol bruto

Tabela 1. Análise química dos solos de plantações de cacau em dois sistemas de

manejo, coletados em Ilhéus-BA

Solo de PC 2

Análise Química 1

pH H+Al Ca Mg K N C P Fe Zn Cu Mn

(cmol/dm3) (g/dm3) (mg/dm3)

Em produção 4,7 6,2 3 1,3 0,17 1 47 0,3 43 2 7 64

Abandonada 5,7 4,7 15 5 0,15 1 40 31 16 7 12 158

1 pH em H2O: 1:2,5; P, K, Fe, Zn, Mn, Cu: Extrator Mehlich 1. Ca

2+, Mg

2+, Al

2+: Extrator KCl mol L

-1.

2 ‘PC’: plantação de cacau sombreado da região sudeste da Bahia (Ilhéus-BA).

67

Visando caracterizar a diversidade de micro-organismos, com relevância

para biotecnologia, presentes no solo amostrados de PC-A, foi realizada análise

metagenômica por pirosequenciamento (Figura 2), que inclui tanto a microbiota

cultivável quanto a não cultivável. Uma elevada diversidade de micro-organismos

no solo sob estudo foi observada, sendo que representantes de 266 famílias de

bactérias e 33 famílias de fungos foram identificadas. A riqueza total foi de 1425

espécies para bactérias e 123 para fungos (dados não mostrados). Enquanto que

para eubactérias, famílias taxonômicas com abundâncias relativas menores do

que 2% representaram 50% da abundância total dos taxa identificados, este

percentual foi de apenas 13,2% para os fungos. Além das famílias Bacillaceae,

Brucellaceae e Staphylococcacae, um total de 254 outras famílias de Eubactérias

com menos de 2% de abundância relativa foram agrupadas nesta metade. Assim,

apenas 11 famílias bacterianas compõem a outra metade, incluindo-se aí

Pseudomonadaceae, que se revelou como a família mais abundante neste tipo de

solo (12,1 %).

Já para os fungos, a distribuição de abundâncias mostrou um maior número

de famílias (17) com abundâncias relativas > 2%, sendo a Trichocomaceae (que

abrange os conhecidos gêneros Penicillium e Aspergillus) a mais abundante,

compondo praticamente ¼ do total geral. As três famílias fúngicas com maior

abundância de seus taxa na amostra perfazem aproximadamente 41% do total

(Fig. 2). Os isolados de leveduras e bactérias cultiváveis in vitro, pertencem às

famílias indicadas por molduras (Fig. 2). Após o procedimento de cultivo in vitro

de 19 isolados em meio de cultura contendo glicerol bruto (capítulo 2), definiu-se

quatro leveduras e quatro bactérias para verificar os perfis de utilização de glicerol

puro ou bruto como única fonte de carbono (Figura 3). O objetivo foi verificar

semelhanças ou diferenças no padrão de crescimento de cada isolado entre as

duas fontes de carbono buscando detectar possíveis alterações provocadas pelos

contaminantes do glicerol bruto (catalisador, resíduo de álcool, água e ácidos

graxos).

68

Figura 2. Distribuição dos grupos taxonômicos (famílias) de bactérias e fungos encontrados no

solo de PC-A enriquecido com 10% de glicerol bruto. Os valores foram obtidos, em porcentagem,

considerando o número de hits identificados para cada família de bactérias (a) e de fungos (b),

obtidos pelo programa MG-RAST. Porção da diversidade bacteriana e fúngica examinada cujas

famílias possuem abundâncias relativas < 2% são indicadas por uma elipse. Famílias que contém

os taxa referentes aos isolados cultiváveis identificados são indicadas por molduras em retângulo.

Com exceção do isolado II de Meyerozyma guilliermondii, o crescimento das

leveduras em meio contendo glicerol bruto foi melhor que em meio com glicerol

a

b

69

puro. As bactérias, ao contrário, apresentaram melhor crescimento em glicerol

puro, com exceção do isolado II de Bacillus megaterium que apresentou perfil

semelhante entre os dois meios, mas maior biomassa celular em glicerol bruto

(Figura 3).

Tabela 2. Identificação de três micro-organismos isolados in vitro em meio enriquecido com 10% de glicerol bruto (v/v)

Isolado Amplicon

(bp) 1

Cobertura alinhamento

(%)

Identidade nucleotídeos

(%) 2 Taxon

Número acesso 3

Bactéria

E1 314 100 99 Bacillus

megaterium HQ683902

Levedura

D1 561 99 99 Rhodotorula mucilaginosa

KC006650

A3 486 98 100 Meyerozyma gulliermondii

KC119207

1 Todos os fragmentos amplificados foram sequenciados em ambas as direções (forward e

reverse); o fragmento apresentado corresponde à sequência mais longa entre os dois (fwd para os isolados C e A1; rev para H1, H2 e E2).

2 Os ‘e-values’ foram iguais a zero para D1; 1e-159 para

E1 e de 1e-179 para A1. 3

Os números de acesso correspondem às sequências descritivas dos taxa indicados na coluna anterior.

O isolado II de M. guilliermondii também apresentou crescimento em glicerol

puro desde o início do experimento. Entre as leveduras de mesma espécie, os

perfis de crescimento dos isolados I e II de Meyerozima apresentaram-se

semelhantes em glicerol bruto e distintos em glicerol puro: o primeiro isolado

apresentou baixo crescimento (ODs entre 0,2 e 0,3), com tendência à rápida

estabilização, enquanto o segundo isolado apresentou maior biomassa (ODs

entre 0,6 e 1,0).

Para as bactérias, o comportamento geral para os isolados de Pseudomonas

citronellolis e B. megaterium (II) foi inverso às leveduras, isto é, crescimento

tendendo à continuidade após 168h. Para os isolados de Staphylococcus arlettea

e B. megaterium (I), no meio com glicerol bruto, foi semelhante às leveduras,

tendendo as estabilizar/declinar durante o período de observação. Com exceção

do B. megaterium (II), as demais bactérias estudadas apresentaram intenso

crescimento até 168 h em meio com glicerol puro. Porém, este isolado foi o único

dentre elas em que o crescimento em glicerol bruto foi superior ao do puro.

70

Figura 3. Perfis de crescimento de leveduras e bactérias em meio mínimo com 10% de glicerol

puro (círculo cheio) e glicerol bruto (círculo aberto), utilizados como única fonte de carbono. Foram

realizadas três repetições do experimento para cada ponto de tempo.

71

3.5. Discussão

Pouco tem sido explorado da diversidade biológica de solos de Mata

Atlântica tropical para isolamento de micro-organismos capazes de degradar

glicerol bruto, oriundo da produção do biodiesel. A presença de grandes áreas

sob condições de plantação de cacau dispertou o interesse na bioprospecção de

micro-organismos bioconversores de glicerol bruto em duas condições de manejo

comuns da região (PC-P e PC-A) discutindo sua aplicação em processos de

tratamento adequado para o resíduo e/ou de alternativas de exploração

econômica para este. Os perfis de liberação e acúmulo de CO2 observados na

Figura 1 sugerem que houve alterações na atividade biológica de ambos os solos

de plantação de cacau, sob os dois manejos estudados, como resposta à fonte de

carbono disponibilizada, isto é, glicerol bruto a 4% e 8%. Os resultados da

respirometria para o solo de PC-A sugerem um metabolismo microbiano mais

complexo, tanto em termos do tempo de duração desta atividade biológica,

quanto do perfil de variação na emissão de CO2 ao longo deste período (Fig. 1a-

c). Para o solo de PC-P, os resultados sugerem um metabolismo microbiano

distinto. Apesar de que a emissão de CO2 tenha atingido níveis similares aos da

PC-A, não se observou oscilações nessa emissão a partir deste ponto, mas sim

uma queda consistente até níveis próximos de zero (Fig. 1b), que refletem o platô

atingido para o perfil cumulativo de CO2 (Fig. 1d). Essas diferenças, entre os

perfis de atividade biológica observados, podem ser devidas aos impactos

causados à megadiversidade biológica da floresta atlântica tropical pela plantação

do cacau. Por exemplo, o processo de regeneração florestal, que impactará

diretamente as características gerais da diversidade microbiana do solo

(sucessão ecológica microbiana), pela qual passa uma plantação de cacau

abandonada por mais de 25 anos (solo usado neste estudo). Este raciocínio

permite-nos supor que a diversidade microbiana, bem como a possibilidade de

isolamento e identificação de micro-organismos degradadores de glicerol bruto

sejam maiores em solo de PC-A. Outro fator relevante a ser considerado para

este solo é o perfil contrastante entre os tratamentos de maior (8%) e menor (4%)

concentração de glicerol bruto. Embora o perfil de emissão de CO2 tenha sido

maior para o tratamento a 4%, na metade do período experimental ocorreu

decréscimo para níveis de emissão menores até do que foi observado para o

72

tratamento 8%. Isto sugere que o tratamento com maior concentração de glicerol

fornece um perfil de atividade biológica mais constante ao longo do tempo para o

consórcio microbiano.

O manejo e os tratos culturais adotados no solo de PC-P inclui ações físicas

e químicas que podem estar diretamente relacionados ao perfil metabólico

apresentado pelos micro-organismos. A análise química dos solos empregados

para compor os microcosmos dá suporte a este argumento. Os resultados obtidos

sugerem que o manejo adotado para PC-P diminui o potencial de exploração da

diversidade microbiana deste solo em direção a atividades de bioconversão do

glicerol bruto. Os resultados deste trabalho demonstram que o método

respirométrico de Bartha, apesar da simplicidade de execução e baixo custo, foi

capaz de capturar a diversidade e as diferenças entre os tipos de solo testados,

auxiliando-nos a orientar os estudos posteriores a respeito da capacidade de

degradação de glicerol bruto aplicado como fonte de carbono.

A caracterização química do solo em relação aos teores dos principais

elementos de relevância biológica é necessária, visto que os elementos interferem

no metabolismo de biodegradação de matéria orgânica (CONEGLIAN et al.,

2006). Os resultados da análise química, associados às curvas de respirometria

(Tabela 1 e Fig.1), sugerem que o solo de PC-A provavelmente possui maior

riqueza e/ou abundância de espécies microbianas com capacidade de

degradação de glicerol bruto. Esta é uma possível razão pela qual os perfis

respirométricos do mesmo apresentam menor metabolismo e, portanto, mais

duradouro. Uma vez que a biomassa microbiana do solo pode ser determinada

pela taxa de respiração e pela concentração de elementos como carbono,

nitrogênio e fósforo (DE POLLI; GUERRA, 2008), conclui-se que ambos os tipos

de solo não diferiram entre si do ponto de vista de biomassa microbiana. Contudo,

as diferenças encontradas para outros macro- e micronutrientes podem ter

contribuído de modo relevante para as possíveis interações entre os micro-

organismos do solo de PC-A quanto ao uso do glicerol bruto como fonte de

carbono (Figs. 1a, c). Devido a modulações favoráveis na disponibilidade hídrica,

temperatura e níveis de intemperismo (SANTOS 2008; SHANE et al., 2008),

sistemas agroflorestais e florestais tendem a promover maior acúmulo de matéria

orgânica no solo, sendo que a disponibilidade de vários nutrientes está associada

73

à atividade microbiana (GAMA-RODRIGUES, 2004). Pela análise do solo (Tabela

1), porém, este parece não ter sido fator preponderante para as diferenças

encontradas, visto que os níveis de N e C foram similares entre os dois tipos de

solo. Por outro lado, as variações nas quantidades da maioria dos nutrientes que

foram observadas nos dois tipos de solo podem também estar relacionadas ao

manejo e tratos culturais. Por exemplo: os valores de pH e de H + Al observados

para o solo de PC-P indicam que, no momento da coleta, havia a necessidade de

uma nova correção. A grande diferença na quantidade de fósforo observada pode

estar exatamente relacionada às diferenças nos valores de pH e H + Al entre os

solos (Tabela 1).

Em solo sob práticas de cultivo, a fertilização fosfatada é necessária para

tornar o fósforo imediatamente disponível para as plantas (BALOTA et al., 2004;

PULROLNIK, 2009), visto que sua disponibilidade decresce acentuadamente em

condições de pH mais ácido e de maiores teores de Alumínio livre no solo. Outro

fator relevante para as diferenças de atividade biológica entre os solos pode ter

sido a influência do pH na velocidade da decomposição da matéria orgânica, pois

para a maioria dos micro-organismos, a atividade biológica ocorre em condições

de pH entre 5,0 e 7,0 (MELLO et al., 1985; SANTRUCKOVA et al., 1991;

PULROLNIK, 2009). Com base nos resultados obtidos, consideramos que o solo

não cultivado e a concentração de glicerol a 10% correspondem a uma

interessante amostra do ponto de vista experimental e aplicado (uso em reatores

ou processo de Land Farm, por exemplo).

Os resultados da análise metagenômica confirmaram uma esperada

diversidade de fungos e bactérias para o solo de PC-A, corroborando os dados de

respirometria e análise química do solo (Figura 1 e Tabela 1). A variedade de

famílias/espécies de fungos e bactérias encontradas na amostra sugere a

existência de uma microbiota com potencial biodiversidade funcional para utilizar

o glicerol residual da produção de biodiesel. Do ponto de vista de biodegradação

de glicerol bruto, e considerando a ação global e integrada do consórcio

microbiano existente na amostra de solo, supõe-se que seria viável a estruturação

de uma forma de landfarming e, ou biopilhas para este tipo de resíduo (MACIEL et

al., 2007; SILVA, 2009). Isto possibilitaria um tratamento controlado e

ambientalmente adequado para seu descarte, além de, dependendo do contexto

74

sócio-econômico e logístico do local, ser utilizado para produção de outros

compostos de interesse industrial (JOHNSON; TACONI, 2007; MIN et al., 2010;

DOBSON et al., 2011). Do ponto de vista biotecnológico, os resultados sugerem

uma boa probabilidade de se isolar micro-organismos (bactérias e, ou leveduras)

com capacidade de serem cultiváveis em meio de cultura contendo glicerol bruto

como fonte de carbono. Uma análise metagenômica, com densa caracterização

taxonômica da amostra, também pode permitir a seleção de diversos outros

substratos alternativos para utilização pelo consórcio microbiano. Isto se dá

simplesmente a partir do conhecimento dos gêneros existentes e de suas

características bioquímicas e funcionais já descritas na literatura especializada.

Os resultados sugerem que os demais componentes contaminantes

existentes no glicerol bruto podem de alguma forma, ter interferido nos perfis de

crescimento dos isolados, mas provavelmente não impediram o consumo do

glicerol, ao menos nas fases iniciais e intermediárias das culturas.

Alternativamente, alguns desses contaminantes podem também ter sido usados

como fonte de energia, ou ativadores/inibidores de enzimas do metabolismo

microbiano, o que levou a perfis de crescimento diferentes em relação ao

crescimento em glicerina pura. Os resultados sugerem que, para os oito isolados

estudados, o glicerol bruto serviu como fonte de carbono possível de utilização.

As diferenças de perfil de crescimento entre eles provavelmente refletem

diferentes tempos de adaptação ao meio, multiplicação e estabilização da

biomassa celular em cultura, como provável consequência das diferenças

genéticas e metabólicas entre eles.

Os isolados bacterianos de B. megaterium (II) e P. citronelollis

demonstraram potencial de utilização para consumo de glicerol bruto para além

das 168h do experimento, visto que as respectivas curvas não atingiram o platô.

Porém, os mecanismos de metabolização parecem ser distintos entre eles, pois

enquanto o primeiro cresceu melhor em glicerol bruto, o segundo cresceu mais

em glicerol puro, a partir da metade do período de cultura (Fig. 3). Isto sugere que

o isolado de Pseudomonas efetivamente prefere o glicerol como fonte de carbono

e pode estar sendo inibido por outros componentes do glicerol bruto; já o isolado

II de Bacillus pode estar sendo estimulado, ou mesmo utilizando outros

componentes do glicerol bruto para seu crescimento. Devido aos diferentes perfis

75

de crescimento demonstrados pelos isolados, aplicações dos mesmos em

sistemas de processamento de glicerol bruto podem ser estabelecidas de forma

consorciada (GALLEGO et al., 2007; JENSEN, 2013). Testes de

associação/interferência mútua de crescimento in vitro entre os isolados são

necessários para se verificar a possibilidade de se acomodar os diferentes

metabolismos e potenciais degradativos/conversores em um mesmo ambiente de

crescimento sobre glicerol bruto.

Encontrar alternativas para o uso do glicerol bruto por meio de bioconversão,

a partir de micro-organismos de solos megadiversos, representa uma excelente

oportunidade para se agregar valor para a cadeia de produção do biodiesel no

Brasil. Pelas características de produção primária de nosso país, há grande

diversidade de matérias-primas disponíveis (cultivos de espécies oleaginosas,

resíduos pecuários, agrícolas e industriais, entre outros), que possibilitam

alternativas de produção de biodiesel e bioetanol. Para a utilização do co-produto

glicerol bruto, a megadiversidade de nossos solos tropicais oferece alternativas

viáveis para processos de bioconversão e, assim, agregação de valor às

plataformas de produção dos biocombustíveis.

De acordo com os resultados apresentados, sugere-se ser possível

aproveitar diretamente o potencial de biodegradação de glicerol bruto existente

em solos de Mata Atlântica de forma alternativa. Pode-se estabelecer uma

unidade de processamento deste co-produto diretamente no solo do local de

produção do biodiesel, num sistema semelhante aos landfarms utilizados pela

indústria de derivados de petróleo (MACIEL et al., 2007). Esta prática será útil

para casos em que eventualmente não houver viabilidade econômica para

empreendimentos de bioconversão desse co-produto em plantas de produção de

biodiesel, evitando assim descartes inadequados e poluição ambiental.

3.6. Referências

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80

Capítulo 4 – METAGENÔMICA COMPARADA DE SOLOS DE CABRUCA

ABANDONADA ENRIQUECIDA COM GLICEROL BRUTO

4.1. Resumo

A possibilidade de estudar as comunidades microbianas em diversos

ecossistemas, assim como as rotas metabólicas codificadas em seus genomas

tem sido amplamente estudada por metodologia metagenômica associada ao

pirosequenciamento. Nesta perspectiva, buscou-se neste trabalho estudar a

diversidade microbiana e seus aspectos funcionais a partir de solo de cabruca da

Mata Atlântica Tropical, de onde sugere-se haver uma maior abundância de

micro-organismos potencialmente envolvidos no processo de bioconversão de

glicerol bruto. A análise comparativa das sequências obtidas a partir da amostra

eDNAC (metagenoma de solo de Plantação de Cacau-Abandonada sem glicerol

bruto) e eDNA10 (metagenoma de solo de Plantação de Cacau-Abandonada

enriquecido com 10% v/v de glicerol bruto) possibilitou identificar sequências

relacionadas a famílias e gêneros mais abundantes na amostra eDNA10, como as

Pseudomonas, que são conhecidas em processo de degradação de poluentes

diversos e em biorremediação. Assim como maior número de sequências

relacionadas a rotas metabólicas para manutenção dos micro-organimos sob

déficit e/ou restrição de nutrientes (síntese de carboidratos, metabolismo de

proteínas), observadas no metagenoma eDNAC. Outras sequências foram mais

abundantes no metagenoma eDNA10, e estão envolvidas com motilidade e

quimiotaxia, resposta ao estresse, transporte de membranas e a aquisição e

metabolismo de ferro. As rotas metabólicas e algumas função preditas que

prevaleceram no metagenoma eDNA10 estão sendo estudadas na perspectiva

de utiliza-las em processos biotecnológicos para obtenção de produtos

secundários a partir do glicerol bruto, utilizado como substrato para micro-

organismos cultiváveis que foram identificados neste estudo.

Palavras-chave: Diversidade microbiana e pirosequenciamento.

81

4.2. Introdução

Características como o conteúdo de água, pH, variações climáticas,

atividade biótica, estrutura e textura física e química como: areia, silte, argila e

matéria orgânica, assim como a organização dessas partículas em micro e

macroagregados conferem grande complexidade aos solos (ROBE et al., 2003).

Nos solos são encontrados números imensuráveis de micro-organismos que

promovem alterações na estrutura desse ambiente, como por exemplo, nos

processos de decomposição e nos ciclos biogeoquímicos (AMANN et al., 1995;

HUNGRIA, 1999).

Estudos sobre os micro-organismos de solos e sua atividade biológica são

amplamente reportados, mesmo que pouco representativos, pois estima-se que

apenas 1% da população total dos micro-organismos do solo podem ser

cultivados empregando técnicas de cultivo clássicas (TORVISK et al., 1990). Por

este motivo, durante muitos anos, a maioria dos estudos relacionados a descrição

de espécies ou táxons e o isolamento de enzimas e produtos antimicrobianos

foram realizados com base no isolamento de culturas puras, em meio artificial e

em laboratório (RODRÍGUEZ-VALERA, 2002). Devido a estas limitações, buscou-

se alternativas de explorar a diversidade microbiana no seu próprio habitat,

utilizando técnicas independentes de cultivo. Este tipo de estudo é chamado de

‘Metagenômica’ e consiste no uso de técnicas moleculares independentes de

cultivo para a análise do metagenoma total de uma determinada amostra

ambiental (HANDELSMAN et al., 1998). Por essa técnica o DNA é extraído

diretamente da amostra para construção de bibliotecas metagenômicas ou para

estudo in silico. A análise funcional é baseada no metabolismo de clones, onde

uma substância de interesse é produzida e secretada, como por exemplo, novos

antibióticos e enzimas e a análise de sequências envolve o sequenciamento

completo de clones ou o sequenciamento aleatório guiado pela identificação de

marcadores filogenéticos para identificação de genes ou vias metabólicas.

(HANDELSMAN, 2004; 2005). Dessa forma é possível acessar a diversidade

microbiana de uma amostra quantitativa e qualitativamente, a atividade de

comunidades microbianas in locu, as vias metabólicas e genes específicos de

interesse (STEELE; STREIT, 2005). Essa diversidade representa uma rica fonte

para pesquisa de novas enzimas, fármacos, biossurfactantes, dentre outros

82

compostos bioativos com potencial para aplicações biotecnológicas (DUBEY;

TRIPATHI; UPADHYAY, 2006). A análise metagenômica pode ser empregada em

estudos em ambientes diversos, como por exemplo, o intestino humano ou animal

(GUAN et al., 2007; QIN et al., 2010), água doce e salgada (VENTER et al., 2004;

COTTRELL et al., 2005), biofilmes (SCHMEISSER et al., 2003; TYSON et al.,

2004), solos (BUCKLEY; SCHMIDT, 2003; RIESENFELD et al., 2004; ALLEN et

al., 2009) e sedimentos (COUTO et al., 2010).

Resultados de estudos metagenômicos evidenciaram a alta diversidade

genética de micro-organismos do solo, com uma riqueza estimada variando entre

2000 e 52000 espécies (TRINGE et al., 2005; ROESCH et al., 2007). Portanto,

neste estudo a abordagem metagenômica foi utilizada para explorar a diversidade

microbiana do solo do sistema agroflorestal de plantio do cacau em Mata Atlântica

denominado ‘cabruca’, na perspectiva de identificar micro-organismos e suas

prováveis funções quando na presença de glicerol bruto, principal co-produto da

produção do biodiesel. As implicações descritivas dessa análise in silico poderá

ser utilizada em estudos posteriores voltados ao isolamento e identificação de

micro-organismos e de rotas metabólicas envolvidas no processo de

bioconversão do glicerol bruto utilizado como fonte de carbono.

4.3. Material e Métodos

4.3.1. Amostras de solos

Foi coletada amostra de solo do sistema agroflorestal ‘cabruca’, denominada

de plantação de cacau abandonada (PC-A), georreferenciada a 14°47'46"S

39°10'22"W, localizada no município de Ilhéus, Bahia, Brasil. As amostras desse

solo foram coletadas a profundidade de 0-20 cm, peneirados numa malha de 2

mm de abertura e analisados quimicamente no Laboratório de Solos da Comissão

Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC).

4.3.2. Enriquecomento da amostra de solo com glicerol bruto

Os ‘microcosmos’ foram montados em erlenmeyrs, contendo 50 g de solo,

15 mL de meio mínimo (0,1% KH2PO4, 0,1% K2HPO4, 0,1% NH4NO3, 0,05%

MgSO4, 0,001% Fe2SO4, 0,001% CaCl2, adaptado de Li et al., 2000) e 5.0 mL

83

10% (v/m) de glicerol bruto utilizado como fonte de carbono. O tratamento

controle foi constituído de forma semelhante, sem adição do glicerol bruto.

O glicerol bruto utilizado no experimento foi cedido pelo grupo de Bioenergia

e Meio Ambiente da Universidade Estadual de Santa Cruz (Ilhéus-BA, Brasil).

Obtido pelo processo de transesterificação do óleo de pinhão manso (Jatropha

curcas L.).

4.3.3. Obtenção de DNA metagenômico

Após 90 dias de incubação, o DNA metagenômico total das amostras foram

extraídos com o kit PowerMax Soil DNA Extraction (MoBio®), seguindo a

recomendação do fabricante. A qualidade e a quantidade do DNA foram checadas

usando eletroforese em gel de agarose e espectrofotômetro Genequant (GE®).

Para melhor compreensão textual foi adotada a terminologia eDNA, por se tratar

de amostra de DNA ambiental, sendo eDNAC o tratamento com amostra de solo

controle (sem glicerol bruto) e eDNA10 o tratamento com a amostra de solo

enriquecida com 10% (v/v) de glicerol bruto não estéril.

4.3.4. Pirosequenciamento e processamento das sequências obtidas

Foi utilizado 5 µg de DNA para sequenciamento na plataforma 454 (GS-FLX

Titanium®) do Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC, Petrópolis,

RJ, Brasil. O sequenciamento foi realizado de acordo com o método de Margulies

et al. (2005) e dividido em duas etapas, sendo a primeira corrida em ¼ de placa

para a amostra eDNAC e a segunda em ½ placa para a amostra eDNA10. DO

número inicial de reads gerados para cada amostra, aproximadamente 100 e 200

reads respectivamente, foi realizado o processo de controle de qualidade com os

programas Replicates (GOMES-ALVAREZ et al., 2009) usado na remoção de

artefatos e Lucy (CHOU et al., 2001) usado na remoção de sequências curtas e

de baixa qualidade, 80 sequências de eDNAC e 90 de eDNA10 foram usados

nas análises posteriores. Uma vez finalizado o processo, todas as sequências do

metagenoma foram depositadas no NCBI-SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)

com os seguintes números de acesso: Submission Acession: SRA026698; Study:

SRP004644; Sample: SRS139629.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra

84

4.3.5. Classificação Taxonômica e Funcional

As sequências foram classificadas taxonomicamente pelo programa MEGAN

versão 4.7 (HUSON et al., 2007) usando BLASTx contra o banco de dados não-

redundante (NR) do NCBI. O programa usa o algoritmo LCA (Last Common

Ancestor) para atribuir um táxon a cada sequência. Os parâmetros usados no

programa foram min-score: 70; min-support: 15; top-percent: 10. Os dados foram

normalizados e comparados pelo próprio programa.

Para analisar o potencial funcional dos metagenomas, as sequências foram

submetidas ao servidor MG-RAST (MEYER et al., 2008) para reconstrução

metabólica através do banco de dados de proteínas SEED usando um valor de

corte para E-value de 1e-5. Os genes classificados foram agrupados em vias

metabólicas e em uma estrutura hierárquica em que todos os genes necessários

para uma tarefa específica são organizados em subsistemas (OVERBEEK et al.,

2005). Os metagenomas foram comparados estatisticamente pelo programa

STAMP (PARKS; BEIKO, 2010), usando o teste exato de Fisher com correção

FDR Storey para reduzir os falsos positivos.

4.4. Resultados e Discussão

O DNA metagenômico das amostras foi submetido ao pirosequenciamento

direto, cujos dados de saída processados e analisados possibilitou as análises

descritas neste trabalho. Como o sequenciamento das amostras foi feito em ½ e

¼ de placa, o número de reads finais para cada uma foi diferente. A amostra

eDNAC obteve 3 vezes mais sequências que a amostra eDNA10, totalizando

681.740 e 214.297 reads respctivamente. Para resolver o problema da grande

discrepância no número de reads para cada amostra, todas as análises foram

normalizadas para a comparação.

O estudo da diversidade microbiana observada na análise das sequências

obtidas de cada amostra foi realizado pelo programa MEGAN Versão 4.7 e,

possibilitou a formação de uma árvore, na qual um táxon é atribuído às

sequências a partir da comparação de BLASTx com as sequências do banco de

dados NCBI-NR (Fig.1).

85

Figura 1. Diversidade filogenética de sequências metagenômicas, gerada pelo programa MEGAN baseado no BLASTx utilizando e-value de 1e

-5. Os tamanhos dos círculos em escala logarítmica

representam o número de leituras atribuídas a cada táxon. Sequências em vermelho (eDNAC - solo controle, sem glicerol bruto), em azul (eDNA10 - solo enriquecido com glicerol bruto a 10% v/v).

86

Na Análise comparativa dos dois metagenomas, para os três principais

domínios (Bacteria, Archaea e Eukaryota) a maioria das sequências classificadas

foi agrupada no domínio Bacteria (eDNAC: 386635; eDNA10: 167296), enquanto

que menor quantidade de sequências foi dividida entre os domínios Archaea

(eDNAC: 2274; eDNA10: 311) e Eukaryota (eDNAC: 2498; eDNA10: 624). Para

as amostras eDNAC (855) e eDNA10 (101) foram obtidas sequências que não

apresentaram classificação com nenhum dos domínios e foi agrupada em no hits,

ou seja, sem similaridade com as sequências depositadas no banco de dados do

NCBI (Fig. 1).

Considerando a prevalência de sequências pertencentes ao domínio

Bacteria, estes dados foram comparados em bancos de dados para regiões

conservadas do genoma que codificam para os genes RNA ribossomais 16S. Do

total de sequências associadas ao domino Bacteria (Fig. 1) apenas 240 reads

foram obtidos por análise 16S e associados a 18 filos. Destes, seis (Firmicutes,

Proteobacteria, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Bacteroidetes, Lentisphaerae)

foram comuns a ambas as amostras, oito (Actinobacteria, Chloroflexi,

Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Deferribacteres,TM7, WS3 e Nitrospira)

foram associados apenas a amostra eDNAC e somente três filos (Cyanobacterias,

Synergistetes e OP10) foram associados exclusivamente a amostra eDNA10.

Figura 2. Distribuição significativa entre os domínios de Bacteria, Archaea e Eukaryota gerado a partir da análise comparativa das sequências das amostras eDNAC (círculo branco) e eDNA10 (círculo preto). O gráfico da esquerda mostra a proporção de sequências atribuídas, enquanto que o gráfico da direita mostra a diferença entre as proporções com intervalo de confiança de 95% gerado pelo programa STAMP.

A identificação de comunidades microbianas em diversos ecossistemas,

assim como a identificação de prováveis rotas metabólicas codificadas em seus

genomas tem sido amplamente estudada por metodologia metagenômica

associada ao pirosequenciamento (TRINGE et al., 2005; EDWARDS et al., 2006;

87

DINSDALE et al., 2008; RODRIGUEZ-BRITO et al., 2010). Neste aspecto os

metagenomas eDNAC e eDNA10 foram analisados quanto ao padrão de

diversidade ao nível de espécies (Fig.3), perfil metabólico (Fig. 4) e comparados

após normalização dos dados utilizando o programa MG-RAST.

De maneira geral, do total de sequências obtidas a partir da amostra

eDNAC, 1.781 sequências foram reprovadas pelo QC (controle de qualidade), que

inclui entre outros parâmetros a remoção de artefatos e de sequências

duplicadas. Ou seja, das sequências que passaram pelo QC apenas 496 (0,1%)

foram associadas a genes ribossômicos (RNA); 367,05 (53,8%) foram

relacionadas a proteínas com funções conhecidas e 306,595 (45%) foram

relacionadas com proteínas preditas com função desconhecida. Para esta

amostra, além das sequências reprovadas pelo QC, outras 5.780 (0,8%) são

sequências desconhecidas, pois não foram relacionadas a genes ribossomais

(RNA) ou proteínas preditas. Já na amostra eDNA10, foram obtidas: 4.874

sequências (2,3%), relacionadas a genes ribossômicos (RNA), 155.330 (72,5%)

foram relacionadas a proteínas com funções conhecidas e 54.093 (25,2%) foram

relacionadas com proteínas preditas com função desconhecida.

Ao analisar o gráfico de dispersão, observa-se a distribuição proporcional de

espécies de micro-organismos quando comparados os dois genomas estudados

(Fig. 3). Bactérias do gênero Pseudomonas foram mais expressivas no

metagenoma eDNA10, apesar do metagenoma eDNAC também ser amostra de

solo, habitat natural desse grupo de bactéria. É possível que o fator

preponderante para esta maior expressividade na amostra com glicerol bruto, seja

exatamente a ausência de uma fonte de carbono exógena na amostra controle.

Assim como a reconhecida habilidade de algumas espécies desse gênero em

degradar hidrocarbonetos aromáticos, tolueno, outros poluentes e particaparem

dos processos de biorremediação de solos e do controle biológico em plantas

(MARQUES; RAMOS, 1993). Por exemplo, das espécies: Pseudomonas

resinovorans, P. alcaligenes, P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida. Com

ressalvas para aquelas bactérias patogênicas, confere vantagem, pois são

espécies cultivávies.

88

Figura 3. Gráfico de dispersão indicando a proporção relativa de espécies de micro-organismos, obtidas a partir do total de sequências válidas para os metagenomas eDNAC (círculo branco) e eDNA10 (círculo preto), obtidas pelo programa STAMP.

Para verificar possíveis alterações no perfil metabólico entre os

metagenomas, os dados foram comparados estatisticamente pelo programa

STAMP. O metabolismo de carboidratos foi o mais significante, assim como a

maioria dos genes relacionados com as vias de manutenção dos micro-

organismos (genes constitutivos), como a síntese de aminoácidos e derivados,

proteínas de metabolismo e metabolismo de RNA. Foi predominante, entre os

metagenomas estudados, o grande percentual do subsistema baseado em

clusterização, ou seja, um conjunto de genes funcionais envolvidos numa rota

metabólica ainda não conhecida (Fig. 4). Estes resultados, reportaram a

plasticidade e habilidade dos micro-organismos em ambientes adversos de

temperatura, pH, propriedades do solo, condições de cultivo (uso do solo) e

vegetação predominante (JANSSEN, 2006; YOUSSEF; ELSHAHED, 2009), como

os sistema artificiais aos quais foram condicionados neste estudo, principalmente

com fonte de carbono exógena ao habitat dos mesmos.

Outras vias metabólicas são visivelmente mais abundantes nas amostras do

metagenoma eDNA10, cuja fonte de carbono é o glicerol bruto, e podem estar

89

relacionadas as interações do consócio microbiano em utilizar esta fonte de

carbono. Por exemplo, vias metabólicas que envolvem a motilidade, a

quimiotaxia, o transporte através da membrana e a aquisição e metabolismo de

ferro (Fig. 5).

Figura 4. Abundância de sequências relacionadas a vias metabólicas, comparativa entre os metagenomas eDNAC (círculo branco) e eDNA10 (círculo preto), analisados pelo programa STAMP.

A maior abundância de sequências relacionadas à motilidade e quimiotaxia,

presença de flagelos e sistema de transporte Ton e Tol foram significativamente

maiores no metagenoma eDNA10 (Fig. 5). Estes resultados nos permitiraminferir

sobre o comportamento metabólico dos micro-organismos, inicialmente para

suportar as condições experimentais aos quais foram submetidos: glicerol bruto

(como fonte de carbono) e meio mínimo líquido. Assim como a prevalência de

micro-organismos aquáticos e perda de diversidade de outros exclusivamente

terrestres.

O sistema de transporte Ton e Tol, esta relacionado com o transporte

através da membrana, e com a captação de energia que é transferida da

membrana externa para a membrana interna e vice-versa. Neste aspecto, o

entendimento de ambas as funções desse sistema podem ser aplicados para

90

facilitar a absorção de nutrientes essenciais, assim como a extrusão de

substâncias nocivas por bactérias Gram-negativas na obtenção de fármacos e

outros bioprodutos (KELLER et al., 2007; LARSEN et al., 2007; POSTLE;

LARSEN, 2007; BRINKMAN; LARSEN, 2008).

Maiores investigações sobre estes sistemas podem viabilizar a produção de

enzimas de interesse biotecnológico, como as lipases que podem ser produzidas

por algumas espécies de Pseudomonas e Bacillus, ambos, representativos no

metagenoma eDNA10 e, portanto, parecem estar envolvidos na bioconversão do

glicerol bruto (GERRITSE et al., 1998; COX et al., 2001; VAN POUDEROYEN et

al., 2001; SAEED et al., 2005).

Entre as funções metabólicas encontradas com maior significância para o

metagenoma eDNA10, o processo de aquisição de ferro e a mobilidade (flagelos),

foram as via mais acessada pelos micro-organismos submetidos ao sistema com

glicerol bruto (Figura 5). Possivelmente, esta característica esteja associada à

prevalência de bactérias das classes Deltaproteobacteria e

Gammaproteobacteria, porque compreendem representantes das bactérias

magnetotáticas, que são capazes de responder a campos magnéticos devido à

presença de nano-partículas (magnetossomos) ricas em ferro que são

encontradas em seu citoplasma (BLAKEMORE, 1975; SCHÜLER; FRANKEL,

1999; BAZYLINSKI; WILLIAMS, 2003; 2007). Esta orientação ao longo de campos

magnéticos parece ser vantajosa para essas bactérias porque, em ambientes

adversos elas usam o campo geomagnético para encontrar regiões adequadas

para crescimento e/ou sobrevivência (FRANKEL et al., 1997). Ou seja, essas

características remetem aos ajustes metabólicos dos micro-organismos no

processo de bioconversão do glicerol bruto como fonte de carbono e, não

somente a vias metabólicas de sobrevivência, como observado na amostra

controle.

91

Figura 5: Gráfico de dispersão indicando a proporção relativa de vias metabólicas, obtidas a

partir do total de sequências válidas para os metagenomas eDNAC (circulo branco) e eDNA10

(circulo preto), analisados pelo programa STAMP.

Nesta perspectiva, buscou-se neste trabalho estudar a diversidade

microbiana e aspectos funcionais de solo de Mata Atlântica com maior

abundância de micro-organismos potencialmente envolvidos no processo de

bioconversão de glicerol bruto (DUARTE, et al., 2011), a partir da comparação de

amostras desse solo com e sem glicerol bruto. Os dados descritivos e obtidos por

análise in silico contribuirão para estudos de isolamento e identificação de micro-

organismos bioconversores dessa fonte de carbono para obtenção de bioprodutos

ou para processos de biorremediação.

92

4.4. Referências

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96

5. CONCLUSÕES GERAIS

- O solo de Mata Atlântica tropical, devido a sua diversidade microbiana, mostrou-

se um potencial ambiente para estudos de isolamento e identificação de micro-

organismos bioconversores de glicerol bruto.

- Diante da comparação da atividade respiratória microbiana do solo de Mata

Atlântica Tropical nas condições de manejo: i) plantio de cacau em produção (PC-

P) e, ii) plantio de cacau abandonada (PC-A), verificou-se que PC-A apresentou

maior atividade metabólica quando submetido ao sistema de microcoscomo, cuja

fonte de carbono foi glicerol bruto nas concentrações 4 e 8% (v/m).

- Os perfis de produção e acúmulo de CO2 observados para os microcosmos PC-

P e PC-A sugerem o solo PC-A + 8% (v/m) de glicerol bruto como o melhor

sistema para isolamento e identificação de micro-organismos promissores na

bioconversão de glicerol bruto, além da obtenção de bioprodutos de interesse

comercial.

- Adotando o sistema solo PC-A e 10% (v/v) de glicerol bruto, foi possível isolar,

cultivar e identificar 19 micro-organismos, dentre os quais bactérias e leveduras.

Dentre estes, foi possível isolar e identificar (por sequenciamento de rDNAs

ribossomais) as bactérias Bacillus megaterium, Staphylococcus arlettae,

Pseudomonas citronellolis, e as leveduras Rhodotorula mucilaginosa,

Meyerozyma gulliermondii e Trichosporon moniliiforme.

- Os micro-organismos isolados neste estudo apresentaram diferentes padrões de

crescimento em meio com glicerol bruto em diferentes concentrações. Sendo,

portanto, passiveis de aplicações em processos de fermentação para a obtenção

de produtos de interesse biotecnológico relacionado com a conversão de glicerol

bruto.

- No aspecto taxonômico e funcional, analisados por pirorsequenciamento, foi

possível verificar grupos de micro-organismos capazes de crescer em meio com

glicerol bruto e, as vias metabólicas utilizadas para adaptação dos mesmos às

condições experimentais adotadas. Os resultados descritivos obtidos, in silico,

97

são fundamentais para viabilizar a identificação de micro-organismos não

cultiváveis que participam em consórcio microbiano na bioconversão do glicerol

bruto que podem elucidar rotas e funções metabólicas de interesse

biotecnológico, antes restrito aos micro-organismos cultiváveis.

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