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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
BRUNA FARIAS BRITO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO
EM PÓ (ACP-102c) ADICIONADA DE ÓLEO DE COCO EXTRA VIRGEM
FORTALEZA – CEARÁ
2017
BRUNA FARIAS BRITO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO
EM PÓ (ACP-102c) ADICIONADA DE ÓLEO DE COCO EXTRA VIRGEM
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
FORTALEZA – CEARÁ
2017
BRUNA FARIAS BRITO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO
EM PÓ (ACP-102c) ADICIONADA DE ÓLEO DE COCO EXTRA VIRGEM
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado Acadêmico em Ciências
Veterinárias do Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do
Ceará, como requisito parcial para à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Veterinárias. Área de concentração:
Reprodução e Sanidade Animal.
Às pessoas mais importantes da minha
vida, sem as quais não teria chegado
aonde cheguei: meus pais (Carlos e
Edilvane), minhas irmãs (Tuíra e Micaela),
meus cunhados (Pedro e Júnior) e minhas
amigas (Bárbara Mara, Brandinice,
Pamella e Ana Júlia).
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as oportunidades que tem me concedido nesta vida.
Aos meus Pais, por sempre valorizarem a minha educação e sempre terem me
encorajado e dado força para realizar meus sonhos.
Às minhas irmãs, por estarem sempre ao meu lado me apoiando, me escutando e me
aconselhando.
Ao Prof. Dr. José Ferreira Nunes, pela orientação e confiança.
À Prof.ª Dr.ª Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, pela coorientação e confiança.
Ao Prof. Dr. Leonardo Tondello Martins, por aceitar o convite e participar da banca.
À Prof.ª Dr.ª Gyselle Viana Aguiar, por aceitar o convite e participar da banca.
A todos os professores da FAVET, do PPGCV e visitantes, pelo conhecimento
adquirido ao decorrer dos dois anos de mestrado.
Aos colegas do PPGCV, que estiveram juntos comigo no decorrer do mestrado.
Aos colegas do Núcleo Integrado de Biotecnologia da Universidade Estadual do
Ceará, aos integrantes do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC) e do
Laboratório de Biotecnologia de Reprodução de Peixes (LBRP), em especial a Annice
Cortez, David Baruc e a Júlia Trúgilo, pelo apoio e colaboração no meu crescimento
na área da pesquisa.
Aos colegas do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen (LRSTS),
em especial Thalles Gothardo, pela amizade, apoio e colaboração no meu
crescimento na área da pesquisa.
Ao Laboratório de Embriologia da UNIFOR, pela apoio e aprendizado na parte da
fertilização in vitro.
Aos colegas do Laboratório de Fisiologia Animal da Universidade Federal do Ceará,
pelo aprendizado e auxílio nos desenvolvimentos das análises de dispersão da
cromatina.
Ao Departamento de Física da Universidade Federal do Ceará, pelo apoio e por tornar
possível a execução do projeto.
A todos os integrantes que passaram pelo Laboratório de Tecnologia do Sêmen de
Caprinos e Ovinos, em especial: Gyselle Aguiar, Bárbara Mara, Maurício Cavalcante,
Brandinice de Almada, Nayra Carvalho, Lívia Antunes, Leonardo Cabral, Priscila
Farias, Juliana Ribeiro, Fábio Ranyeri, Maressa Holanda, Lucas Fonseca, Dona Iraci.
À Kelliani Mucida, pela disponibilização da fazenda para realização do experimento.
Aos funcionários e auxiliares técnicos do PPGCV (Adriana, João, Vicente, César e
Selmar) que tornaram possíveis uma melhor qualidade de ensino.
A todos os meus familiares pela confiança e amor.
Aos meus amigos, pela amizade, por todo amor, carinho, paciência e conselhos.
“Confie sempre no SENHOR, pois ele é
nosso eterno abrigo” (Autoria
desconhecida).
RESUMO
Os aditivos de origem animal como a gema de ovo e o leite, amplamente empregados
na preservação do sêmen, representam um risco potencial na contaminação do
sêmen. Com o intuito de reduzir esses impactos quanto ao uso de substâncias de
origem animal, o trabalho teve como objetivo, avaliar o efeito do diluente à base de
água de coco em pó (ACP -102c) adicionado de óleo de coco extra virgem na
criopreservação de sêmen ovino. O experimento foi realizado no Laboratório de
Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO) e na Fazenda Ouro Branco, Ceará.
Foram coletados ejaculados de cinco ovinos da raça Dorper, com auxílio de vagina
artificial. Em cada coleta, os ejaculados com motilidade massal (≥ 3), motilidade
progressiva (≥ 80%) e vigor (≥ 3) foram selecionados. Em seguida, os ejaculados
foram reunidos em um pool e dividido em quatro alíquotas iguais e diluídas em um
step nos seguintes tratamentos: T1 (TRIS + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T2 (ACP-
102c + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T3 (ACP-102c + 10% óleo coco + 7% glicerol)
e T4 (ACP-102c + 20% óleo de coco + 7% glicerol). As amostras foram envasadas e
submetidas a uma curva de refrigeração (0,35 °C/min.), estabilizadas a 4 °C por 2h,
congeladas em vapor de nitrogênio (-60 °C) e armazenadas em nitrogênio líquido (-
196 °C). Após a descongelação, as amostras foram avaliadas quanto aos seguintes
parâmetros de qualidade espermática: motilidade total (MT), velocidade curvilinear
(VCL), velocidade linear (VSL), velocidade média do percurso (VAP), viabilidade
espermática, fragmentação do DNA, e atividade mitocondrial. Os resultados foram
expressos em média ± desvio padrão. Os dados foram submetidos ao teste de Box-
Cox, Cramer-von Mises e as médias comparadas pelo Teste de Student-Newman-
Keuls (p < 0,05) utilizando o software R-project 3.3.2 para Windows. Os resultados
demonstraram que o T2 foi inferior ao T1 apenas quanto à variável motilidade total (p
< 0,05), e o T3 foi inferior ao T1 e ao T2, apenas quanto a motilidade, no entanto, os
dados de motilidade para o T3 encontram-se acima do proposto pelo CBRA. Já o T4,
foi inferior ao T1 quanto a motilidade, a viabilidade e a VCL (p < 0,05). Conclui-se que
a adição de 10% de óleo de coco extra virgem ao ACP-102c é eficaz na manutenção
da qualidade de sêmen ovino criopreservado.
Palavras-chave: Ruminantes. Espermatozoides. Congelação. Crioprotetor.
ABSTRACT
Animal additives such as egg yolk and milk, widely used in the preservation of semen,
represent a potential risk in sperm contamination. The aim of this study was to evaluate
the effect of the extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with
extra virgin coconut oil in the cryopreservation of ram sperm. The experiment was
carried out at the Laboratory of Goats and Sheep Sperm Technology (LTSCO) and
Farm Ouro Branco, Ceará. Five ejaculates were collected from Dorper ram, using
artificial vagina. In each collection, the ejaculates with mass motility (≥ 3), progressive
motility (≥ 80%) and vigor (≥ 3) were selected. Then the ejaculates were gathered in a
pool and divided into four equal aliquots and diluted in one step in the following
treatments: T1 (TRIS + 20% egg yolk + 7% Glycerol), T2 (ACP-102c + 20% egg yolk
+ 7% Glycerol), T3 (ACP-102c + 10% coconut oil + 7% glycerol) and T4 (ACP-102c +
20% coconut oil + 7% glycerol). The samples were packaged and submitted to a
refrigeration curve (0.35 °C / min.), stabilized at 4 °C for 2 h, frozen in nitrogen vapor
(-60 °C) and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing, the samples were
evaluated for the following sperm quality parameters: total motility (MT), curvilinear
velocity (VCL), linear velocity (VSL), mean velocity (VAP), sperm viability, DNA
fragmentation, and mitochondrial activity. The results were expressed as mean ±
standard deviation. The data were submitted to the Box-Cox test, Cramer-von Mises
and the means compared by the Student-Newman-Keuls test (p < 0.05) using the
software R-project 3.3.2 for Windows. The results showed that T2 was less than T1
only for total variable motility (p <0.05), and T3 was less than T1 and T2, only for
motility, however, motility data for T3 above that proposed by CBRA. T4 was less than
T1 for motility, viability and VCL (p <0.05). It can be concluded that the addition of 10%
extra virgin coconut oil to ACP-102c is effective in maintaining cryopreserved ovine
spermatozoa.
Keywords: Ruminants. Spermatozoa. Freezing. Cryoprotectant.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Velocidades e amplitude de deslocamento lateral da
cabeça do Sperm Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L.,
Espanha)................................................................................ 25
Figura 2 - Teste de dispersão da cromatina. Célula com DNA
íntegro (halo) e célula com DNA fragmentado (sem
halo)........................................................................................ 28
Figura 3 - Avaliação da atividade mitocondrial. Espermatozoide
com alta (I), média (II) e baixa (III) atividade
mitocondrial........................................................................... 29
Figura 4 - Água de coco em pó (ACP).................................................. 33
Quadro 1 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do
sêmen ovino fresco.............................................................. 23
Quadro 2 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do
sêmen ovino descongelado................................................. 23
Quadro 3 - Parâmetros de motilidade espermática obtidos através
do Sperm Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L.,
Espanha)................................................................................ 24
Quadro 4 - Composição do óleo de coco extra virgem orgânico......... 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Médias ± desvios padrões dos parâmetros cinéticos (MT,
VCL, VSL, VAP) de sêmen ovino criopreservado nos
meio tris- 20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de
ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20%
óleo de coco (T4) avaliados pelo
SCA......................................................................................... 52
Tabela 2 - Médias ± desvios padrões da atividade mitocondrial (3,3’-
diaminobenzidine) de sêmen ovino criopreservado nos
meio tris-20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de
ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20%
óleo de coco (T4)................................................................... 52
Tabela 3 - Médias ± desvios padrões da viabilidade (eosina
nigrosina) e do DNA íntegro (SCD test) de sêmen ovino
criopreservado nos meio tris-20% gema de ovo (T1),
ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de
coco (T3) e ACP102c-20% óleo de coco
(T4).......................................................................................... 52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP Água de coco em pó
ATP Adenosina Trifosfato
CASA Computer-assisted sperm analysis (Análise de Sêmen Auxiliada
por Computador)
CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
CCO Citocromo C-Oxidase
DAB Diaminobenzidine
DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)
DNAi DNA íntegro
EN Eosina-nigrosina
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FAVET Faculdade de Veterinária
G.O. Gema de Ovo
GPx Glutationa peroxidase
GR Glutationa Redutase
HCL Ácido Clorídrico
IFCE Instituto Federal do Ceará
LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LRC Laboratório de Reprodução de Carnívoros
LRSTS Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen
LTDA Limitada
LTSCO Laboratório de Tecnologia do Sêmen de Caprinos e Ovinos
MT Motilidade Total
MP Motilidade Progressiva
NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia
O.C. Óleo de coco
PBS Phosphate Buffer Saline (Solução tampão fosfato)
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
RENORBIO Rede Nordeste de Biotecnologia
SCA Sperm Class Analyzer
SCD Sperm Chromatin Dispersion (Dispersão da cromatina
espermática)
SCGE Single-cell gel electrophoresis
SCSA Sperm Chromatin Structure Assay (Teste de avaliação da
estrutura da cromatina espermática)
SPTZ Espermatozoide
SOD Superóxido dismutase
UECE Universidade Estadual do Ceará
UNIFOR Universidade Fortaleza
USA United States of America (Estados Unidos da América)
VAP Velocidade Média do Percurso
VCL Velocidade Curvilinear
VSL Velocidade Linear
TM TradeMarker (Marca registrada)
LISTA DE SÍMBOLOS
% Percentagem
≥ Maior ou igual
< Menor
± Mais ou menos
106 Milhões
109 Bilhões
X Vezes
°C Graus Celsius
© Copyright
µl Microlitro
µm Micrometro
cm³ Centímetro cúbico
G Grama
ml Mililitro
mm³ Milímetro cúbico
Mm Milimolar
min. Minutos
P Nível de significância
pH Potencial Hidrogeniônico
® Marca Registrada
S Segundos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................. 18
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 20
2.1 OVINOCULTURA E BIOTECNOLOGIAS REPRODUTIVAS............. 20
2.2 SÊMEN.............................................................................................. 22
2.3 ANÁLISE ESPERMÁTICA................................................................. 22
2.3.1 Volume.............................................................................................. 24
2.3.2 Turbilhonamento............................................................................. 24
2.3.3 Cinética............................................................................................. 24
2.3.4 Concentração................................................................................... 26
2.3.5 Viabilidade........................................................................................ 27
2.3.6 Dispersão da cromatina.................................................................. 27
2.3.7 Atividade mitocondrial.................................................................... 28
2.4 CONSERVAÇÃO SEMINAL............................................................. 29
2.4.1 Refrigeração..................................................................................... 29
2.4.2 Congelação...................................................................................... 30
2.5 DILUENTES SEMINAIS.................................................................... 31
2.5.1 Água de coco em pó........................................................................ 32
2.6 CRIOPROTETORES......................................................................... 33
2.6.1 Glicerol............................................................................................. 34
2.6.2 Gema de ovo.................................................................................... 34
2.6.3 Óleos vegetais................................................................................. 37
3 JUSTIFICATIVA................................................................................ 41
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA................................................................... 42
5 OBJETIVOS...................................................................................... 43
5.1 GERAL............................................................................................... 43
5.2 ESPECÍFICOS................................................................................... 43
6 CAPÍTULO I - Criopreservação de sêmen ovino em meio à base
de água de coco em pó (acp-102c) adicionada de óleo de coco
extra virgem...................................................................................... 44
7 CONCLUSÃO.................................................................................... 53
REFERÊNCIAS................................................................................. 54
APÊNDICES...................................................................................... 62
APÊNDICE A..................................................................................... 63
APÊNDICE B..................................................................................... 64
18
1 INTRODUÇÃO
O papel da criopreservação seminal é fundamental para os programas
de reprodução, as inseminações artificiais, produção in vivo e in vitro de
embriões. Porém, as mudanças repentinas de temperatura, como choques a frio
e calor, bem como a formação de gelo durante o processo de congelação e
descongelação, afetam a integridade funcional e física das células espermáticas.
Portanto, diferentes diluentes têm sido utilizados para minimizar esses danos.
Os diluentes usados para a preservação espermática, de uma forma
geral, devem ter pH adequado, capacidade de proteção e manutenção da
viabilidade celular, osmolaridade adequada e, ainda, capacidade de proteger o
espermatozoide de crioinjúrias. Nesse contexto, destacamos o uso do diluente à
base de água de coco, que contém proteínas, sais, açúcares, fatores de
crescimento e fosfolipídios (NUNES; SALGUEIRO, 1999).
Além disso, os meios de criopreservação necessitam da adição de
substâncias crioprotetoras, dentre elas, a gema de ovo tem sido comumente
utilizada nos diluentes de sêmen de mamíferos (LEBOEUF; RESTALL;
SALAMON, 2000).
No entanto, nos últimos anos, a exigência em relação à substituição
da gema de ovo como crioprotetor no diluente seminal se intensificou devido à
preocupação da mesma aumentar o risco de contaminação microbiana, o que
pode conduzir à produção de endotoxinas que podem reduzir o potencial
fecundante dos espermatozoides e aumentar o risco de transmissão de doenças,
dificultando a comercialização dessas doses criopreservadas (BOUSSEAU et
al., 1998).
Diante disso, a busca por diluentes livre de produtos de origem animal
têm se intensificado. Diversos estudos com a utilização de óleo e produtos
vegetais como óleo de argan, óleo de coco tem sido realizado (ALLAI et al, 2015;
DEL VALLE et al., 2013; SANTOS, 2013).
O óleo de coco, obtido a partir da polpa do coco fresco maduro (Cocos
nucifera L.), é composto por ácidos graxos saturados e ácidos graxos
insaturados, sendo uma composição lipídica similar ao do plasma seminal dos
ovinos, e tem apresentado potencial antioxidante (SILVA NETO et al., 2013).
Desta forma, com todas essas propriedades benéficas, o óleo de coco parece
19
ser um suplemento potencialmente desejável que possa ter ações benéficas
semelhantes as da gema de ovo como crioprotetor.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OVINOCULTURA E BIOTECNIOLOGIAS REPRODUTIVAS
Os ovinos e caprinos estão espalhados em todos os continentes. No
entanto, existe uma notável concentração dos ovinos localizados principalmente
na Ásia, Oceania e Europa. China, União Europeia e Austrália concentram mais
de 30% do rebanho ovino mundial e quase metade da produção de carne
(BANCO DO BRASIL, 2010).
No Brasil, a ovinocultura tem sua importância econômico-social
apresentando-se como alternativa na oferta de carne, leite e derivados,
favorecendo o aspecto alimentar das populações rural e urbana. A expansão
desse agronegócio em diversas regiões do Brasil vem transformando o cenário
dos sistemas produtivos, tornando-se um atrativo de forma significativa para a
fixação das populações no meio rural. Os mercados interno e externo dessa
atividade vêm crescendo rapidamente e transformando-se, exigindo organização
dos produtores, maior produção com qualidade e segurança alimentar (ALVES;
HOLANDA JÚNIOR; LOPES, 2008).
Por muitos anos a ovinocultura na região Sul foi a mais dinâmica do País,
porém devido a crise da Lã, em meados dos anos 90, a população de animais
nesta região diminuiu drásticamente. De lá para cá, com o advento das raças
deslanadas, o Nordeste expandiu o seu rebanho e tornou-se a região com o
maior número de ovinos no Brasil. Entre 1975 a 2013, enquanto a região Sul
diminuiu 55,9% do seu rebanho, passando de 11,7 milhões de cabeças para 5,2
milhões, a região Nordeste cresceu 75%, chegando a 9.774.436 cabeças de
ovinos em 2013 (INSTITUTO AGROPÓLOS DO CEARÁ, 2015). Em 2015, o
efetivo de ovinos foi de 18,41 milhões, com uma variação de 4,5% em relação a
2014 (IBGE, 2015).
A Região Nordeste se destaca na criação de ovinos e concentrou 60,6%
do rebanho nacional no último ano. A Região Sul figura em seguida,
representando 26,5% do efetivo da espécie, acompanhada pelas Regiões
Centro-Oeste (5,6%), Sudeste (3,8%) e Norte (3,6%) (IBGE, 2015).
21
No ano de 2015, Bahia (17,2%), Pernambuco (13,1%) e Ceará (12,5%)
destacaram-se na criação de ovinos no Nordeste do Brasil, porém o Rio Grande
do Sul ainda era o estado com o maior número de animais, representando 21,5%
do total nacional (IBGE, 2015).
Vale ressaltar que na Região Nordeste a criação desses animais destina-
se basicamente à produção de carne, enquanto na Região Sul tem-se também
a produção e a comercialização de lã (IBGE, 2015).
E mesmo não tendo grande relevância na economia regional nordestina
em relação ao PIB agropecuário, a ovinocaprinoculturta apresenta importância
socioeconômica ao nível de propriedade, distritos e municípios. No geral, essas
atividades são exploradas de forma secundárias nas propriedades rurais,
servindo como renda complementar aos produtores, além de serem importantes
fontes de proteína animal, proporcionando maior segurança alimentar das
famílias, sendo este um alimento de alto valor biológico (INSTITUTO
AGROPÓLOS DO CEARÁ, 2015).
A criação de ovinos e caprinos no Ceará tem a seu favor a boa
adaptabilidade dos animais ao clima semárido e um mercado de carne e pele
com demanda não atendida e ainda em plena expansão. A existência de um
centro de pesquisa como a Embrapa Caprinos em território cearense e a
disponibilidade de material genético de qualidade das diversas raças no Estado
são pontos positivos a serem mencionados (INSTITUTO AGROPÓLOS DO
CEARÁ, 2015).
A utilização de tecnologias reprodutivas apresenta importante ferramenta
na melhoria do potencial produtivo dos rebanhos ovinos e dentre as biotécnicas
da reprodução, a inseminação artificial (I.A.) é aquela que propicia maior
amplitude de resultados nos programas de melhoramento genético do rebanho,
uma vez que, acelera o melhoramento genético, viabiliza a obtenção de produtos
de reprodutores alojados em outros países ou até mesmo que já morreram, evita
a transmissão de doenças venéreas e facilita a realização de testes de progênie
além de possibilitar que machos subférteis produzam filhos (GOMES et al.,
2010). Todavia, Hafez (2004) salienta que diferentemente de bovinos, a I.A. de
ovelhas e cabras tem sido limitada, devido ao alto custo do trabalho, à dificuldade
de identificar acuradamente reprodutores superiores e aos baixos índices de
concepção, especialmente com sêmen congelado.
22
Desta forma, os avanços da fronteira do conhecimento na área da
biotecnologia associadas à reprodução de caprinos e ovinos apresentou
aumento significativo nas últimas décadas graças ao uso de técnicas
consagradas como a laparoscopia e ultrassonografia em tempo real e ao
aumento de interesse pela reprodução destes animais (FONSECA et al., 2014).
A laparoscopia tem sido a técnica mais eficiente para a utilização de
sêmen ovino congelado. Cada vez mais otimizada em rebanhos de animais
puros de origem ou de elite, pela possibilidade de aquisição de sêmen congelado
de reprodutores nacionais localizados em regiões distantes a do rebanho, e
também por viabilizar a importação de material genético de importantes criatórios
internacionais localizados em outros países ou continentes. As taxas de
concepção normalmente são mais elevadas em relação a outras técnicas de
inseminação em razão do local onde é depositado o sêmen, podendo variar de:
75% a 85% para sêmen puro; 60% a 65% para sêmen diluído refrigerado; 50%
a 75% para sêmen congelado (FERNÁNDEZ et al., 1998).
A múltipla ovulação e transferência de embriões em pequenos ruminantes
também já é uma realidade, devido à grande demanda por intensificação dos
programas de melhoramento genético e sistemas produtivos nessas espécies.
Todas essas ferramentas de controle, manipulação e potencialização da
reprodução, se adequadamente orientadas, prestar-se-ão a inúmeras
finalidades, desde a simples multiplicação em massa, passando pela
preservação das espécies e raças e, chegando a obtenção, em escala, de
fármacos com potencial de uso humano (FONSECA et al., 2014).
2.2 SÊMEN
O sêmen é uma suspensão celular líquida contendo espermatozoides
e secreções do trato genital masculino. Os espermatozoides são produzidos nos
testículos e a porção fluida (plasma seminal) desta suspensão é produzida pelas
glândulas acessórias no momento da ejaculação. O plasma seminal é um
componente essencial na cobertura natural, que serve como carreador e protetor
dos espermatozoides (HAFEZ; HAFEZ, 2004).
23
2.3 ANÁLISE ESPERMÁTICA
As avaliações espermáticas são realizadas conforme as normas do
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 2013), presentes no Quadro 1
e 2. Os ejaculados são avaliados quanto ao volume (ml), cor (branca ou amarelo-
marfim para espécie ovina), odor (sui generis), aspecto (cremoso, leitoso ou
aquoso), turbilhonamento (0-5), vigor (0-5), motilidade total (0-100%),
viabilidade, morfologia e a concentração espermática, sendo esta, mensurada
em câmara de Neubauer (espermatozoides/mm3) (CBRA, 2013).
Quadro 1 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do sêmen ovino
fresco
Parâmetros Valores
Volume (ml) 0,5 – 3,0
Cor Branca ou amarelo-marfim
Turbilhonamento (0-5) ≥ 3
Concentração (109 sptz/ml) 1 – 3
Motilidade (%) ≥ 80
Vigor (0-5) ≥ 3
Anormalidades (%) < 20
Fonte: CBRA (2013).
Quadro 2 - Valores preconizados pelo CBRA (2013) para análise do sêmen ovino
descongelado
Parâmetros Valores
Concentração (106 sptz/ml) 400
Motilidade (%) ≥ 30
Vigor (0-5) ≥ 3
Fonte: CBRA (2013).
24
2.3.1 Volume
O volume do ejaculado pode ser afetado pela idade do animal,
estação, frequência de coletas (coletas com curtos intervalos reduzem o volume)
ou tipos de equipamento utilizados nas coletas, como o eletroejaculador que
tende a aumentar o volume do ejaculado pelo estímulo das glândulas sexuais
acessórias. A mensuração do volume é determinada pela observação direta no
recipiente coletor graduado (HAFEZ; HAFEZ, 2004). O volume do ejaculado
pode variar de 0,5-3,0 ml em carneiros adultos (CBRA, 2013).
2.3.2. Turbilhonamento
O turbilhonamento é o movimento da massa em forma de ondas
observado em uma alíquota de sêmen recém colhido em decorrência da
interação da motilidade, do vigor e da concentração espermática. Para avaliação
deste parâmetro coloca-se uma gota de sêmen sobre uma lâmina pré-aquecida
a 37 °C e avalia-se em microscopia com um aumento de 100x. A análise é
expressa em uma escala de 0 a 5, onde o zero significa a ausência de
turbilhonamento, e o cinco significa o valor máximo dado a um acentuado
movimento de massa (CBRA, 2013).
2.3.3 Cinética
A motilidade espermática é fundamental para que os
espermatozoides alcancem o ambiente uterino e o local de fertilização, sendo
uma das mais importantes características para a avaliação do potencial de
fertilidade da célula espermática. Entretanto, os resultados das avaliações
microscópicas dependem de diversos fatores, tais como: meio utilizado na
diluição seminal, taxas de diluição, temperatura e tempo de realização durante a
avaliação. Na avaliação convencional, a motilidade espermática é estimada
visualmente em microscopia óptica e com análise de uma gota de sêmen diluído
entre lâmina e lamínula (CAVALCANTE et al., 2005).
25
Os sistemas de análises computadorizadas têm substituído a
avaliação de sêmen por microscopia de luz convencional, uma vez que
proporcionam informações mais detalhadas e objetivas sobre várias
características da motilidade e da morfometria, além de imprimir maior
repetibilidade às observações do que a habilidade do técnico em identificar
padrões de motilidade espermática (CAVALCANTE et al., 2005).
Atualmente, vários sistemas de análises computadorizadas das
células espermáticas (CASA) estão disponíveis comercialmente, como Hamilton
Thorn (Hamilton Thorn Research, Bervely, USA); IMAGESP® (Vimas
IMAGESP®, Barcelona, Espanha); Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking
Systems Ltda., Sheffield, Inglaterra) e Sperm Class Analyzer® (Microptic SL,
Barcelona, Espanha), SM-CMATM (MTM Medical Technologies, Montreaux,
Suíça), QualiSpermTM, 1.3 (Biophos, Pfäffikon, Suíça), entre outros. No entanto,
apesar de serem mais recomendados, ainda possuem uma grande desvantagem
quanto ao uso prático na rotina veterinária, principalmente devido ao alto custo
dos equipamentos (ARRUDA et al., 2011).
Os principais parâmetros da cinética espermática avaliados pelo
sistema CASA estão demonstrados no quadro 3. Os três parâmetros de
velocidade (VCL, VAP, VSL) (Fig. 1), são comumente utilizados para descrição
geral do movimento do espermatozoide (MORTIMER, 2000).
Figura 1 – Velocidades e amplitude de deslocamento lateral da cabeça do Sperm
Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L., Barcelona, Espanha)
Fonte: MORTIMER (2000).
26
Quadro 3 - Parâmetros de motilidade espermática obtidos através do Sperm
Class Analyzer (SCA®, Microptics, S.L., Barcelona, Espanha)
Parâmetro Sigla Unid. Descrição
Motilidade total MT % Percentual de células móveis na concentração espermática total
Motilidade progressiva
MP % Percentual de células móveis com movimento progressivo na concentração espermática total
Velocidade curvilinear
VCL µm/s Velocidade da trajetória real do espermatozoide
Velocidade média da trajetória
VAP µm /s Velocidade da trajetória média do espermatozoide
Velocidade linear
VSL µm /s
Velocidade em função da linha reta estabelecida entre o primeiro e último ponto da trajetória do espermatozoide
Fonte: MORTIMER (2000).
2.3.4 Concentração
A concentração espermática representa o número de espermatozoide
por milímetro cúbico (mm³) ou centímetro cúbico (cm³). Ela é determinada por
hemocitômetro ou Câmara de Neubauer, uma lâmina microscópica com câmaras
traçadas com precisão, onde conta-se o número de espermatozoide
manualmente. Uma determinação acurada do número de espermatozoides e do
volume do ejaculado pode determinar quantas fêmeas podem ser inseminadas
(HAFEZ; HAFEZ, 2004).
De acordo com o CBRA (2013), o número de espermatozoides
desejáveis por palhetas para o sêmen ovino criopreservado é de 100x106 para
via cervical, já a dose inseminante para via transcervical é de 150 a 200x106 e
para via laparoscópica de 40x106.
2.3.5 Viabilidade
A viabilidade espermática está relacionada com a integridade da
membrana plasmática. Esta pode ser avaliada através de colorações vitais, onde
27
os espermatozoides que possuem integridade de membrana, não são corados
(viáveis) e os que não possuem, permitem a entrada do corante no citoplasma
(não viáveis). Dentre os corantes utilizados podem ser citados, além da eosina
nigrosina, o azul de tripan, o Giemsa e o azul de bromofenol (CHEMINEAU et
al., 1991; DERIVAUX, 1980).
Para análise da viabilidade são confeccionados esfregaços em lâmina
pré-aquecida a 37 ºC utilizando 5 μl do corante eosina nigrosina (eosina 1 g,
nigrosina 2 g, citrato de sódio 3,57 g e água destilada q.s.p. 100 ml - BARIL et
al., 1993), adicionado a 5 μl do sêmen rediluído.
2.3.6 Dispersão da cromatina (SCD Teste)
A integridade do DNA espermático é essencial para a correta
transmissão da informação genética. Sua estrutura é altamente compacta e
complexa. Sendo assim, qualquer forma de anormalidades na cromatina ou
danos ao DNA pode resultar em infertilidade masculina (SOUSA; SANTOS;
SANTOS, 2010).
A biologia molecular voltada à área da reprodução tem resultado em
inúmeras técnicas para a avaliação da qualidade da cromatina espermática e
para a determinação da fragmentação do DNA espermático. Atualmente, as
tecnologias utilizadas são as que medem a capacidade da cromatina e do DNA
em sofrer desnaturação diante de vários tratamentos [técnicas: SCSA (Sperm
Chromatin Structure Assay); COMETA (Single-cell gel electrophoresis-SCGE); e
o SCD test (teste de Dispersão da Cromatina Espermática)] (SERGERIE et al.,
2005).
O teste de Dispersão da Cromatina Espermática (SCD) verifica a
fragmentação de DNA, de maneira direta, é um teste simples, prático, rápido,
preciso e que apresenta alta reprodutibilidade. A metodologia do SCD consiste
na utilização de uma solução ácida, geralmente ácido clorídrico e,
posteriormente, as amostras são colocadas em solução de lise contendo
detergentes, além de conter um agente redutor capaz de clivar pontes de enxofre
e de desnaturar as ribonucleases (FERNÁNDEZ et al., 2005).
No teste de Dispersão da Cromatina Espermática (SCD test),
visualizam-se dois morfonucleotipos diferentes: 1- compacto ou com pequeno
28
halo (DNA fragmentado); 2-com largo ou moderado halo (DNA intacto), sendo
considerado aceitável as amostras que apresentam mais de 70% das células
espermáticas com o DNA íntegro (Fig. 2) (FERNÁNDEZ et al., 2005).
Figura 2 - Teste de dispersão da cromatina. Célula com DNA íntegro (halo) e
célula com DNA fragmentado (sem halo)
Fonte: Elaborada pela própria autora.
2.3.7 Atividade mitocondrial (3,3’- diaminobenzidine - DAB)
A mitocôndria está localizada na peça intermediária do
espermatozoide, e possui um importante papel no metabolismo celular,
produzindo energia necessária para a movimentação do flagelo, sendo
fundamental para a motilidade espermática e de suma importância para o
transporte do material genético atingir o sítio de fertilização (CELEGHINI, 2005).
Além disso, atividade mitocondrial está relacionada com a produção
das espécies reativas de oxigênio (EROs), e com o estresse oxidativo, podendo
este ser letal às células espermáticas. Estudos vêm demonstrando correlações
negativas tanto entre o estresse oxidativo e a integridade de DNA quanto com a
atividade mitocondrial, indicando a ocorrência de uma interação, formando
possivelmente um único mecanismo patogênico (BLUMER et al., 2012).
Com base nessa correlação da atividade mitocondrial e a motilidade
espermática, Hrudka (1987) propôs uma técnica citoquímica que detecta a
atividade mitocondrial. Esta técnica é baseada na oxidação da 3,3'-
diaminobenzidine (DAB) pelo Complexo Citocromo C, o que inclui a enzima
Citocromo C-Oxidase (CCO), através de uma reação em cadeia na qual o
29
reagente é polimerizado e se deposita nos locais onde ocorre a reação, ou seja,
se restringe à mitocôndria (Fig. 3). Esta deposição pode ser identificada através
de microscopia convencional ou contraste de fase pela sua coloração marrom.
Sendo considerado satisfatório quando amostras apresentam o percentual de
alta e média atividade mitocondrial superior a 50%. Desta maneira, é possível
descrever o declínio espontâneo da CCO ocasionado por tratamentos físicos
e/ou químicos aos que os espermatozoides são submetidos (HRUDKA, 1987).
Figura 3 – Avaliação da atividade mitocondrial. Espermatozoide com alta (I),
média (II) e baixa (III) atividade mitocondrial
Fonte: Elaborada pela própria autora.
2.4 CONSERVAÇÃO SEMINAL
2.4.1 Refrigeração
Diversos fatores podem influenciar no metabolismo aeróbio da célula
espermática, podendo ser citados principalmente a temperatura e o pH. Diante
disso, tem sido estudado procedimentos tecnológicos visando prolongar a vida
dos espermatozoides, uma vez que temperaturas mais baixas e a acidez podem
modificar as ligações entre as enzimas que atuam sobre o ATP e as proteínas
responsáveis pela contração. Desta forma, reduzida a motilidade, a célula
espermática diminui seu gasto de energia, prolongando a viabilidade
espermática (MIES FILHO, 1987).
I- Alta
II- Média
III- Baixa
30
Entre as principais vantagens da refrigeração seminal, está a
manutenção da viabilidade espermática por um período prolongado, com a
minimização da redução da capacidade fertilizante dos espermatozoides. Outra
característica importante é a possibilidade de diminuir o estresse imposto aos
reprodutores pelo número excessivo de cópulas diárias durante a estação
reprodutiva, podendo prejudicar os índices reprodutivos do rebanho (BISPO,
2005).
A refrigeração é caracterizada pela redução da temperatura que
inicialmente encontra-se em torno de 37 °C e decresce a temperaturas próximas
a 0 °C. Para promover essa queda na temperatura, recomenda-se o uso de
equipamentos convencionais como refrigerador, garrafas térmicas ou caixas
isotérmicas com gelo, ou ainda, equipamentos automatizados (CÂMARA;
GUERRA, 2011).
O processo de refrigeração do sêmen, de 30 °C a 0 °C deve ser
realizado de maneira constante e homogênea, evitando variações bruscas que
ocasionem o choque térmico e a redução da viabilidade espermática. Quando
realizado de forma abrupta pode ocasionar um estresse letal às células
espermáticas, e quando realizado lentamente ocasionará uma tensão na
membrana celular dos espermatozoides (WATSON, 2000).
2.4.2 Congelação
Uma vez que se tem conhecimento da necessidade de se maximizar
o potencial biológico da espécie ovina a fim de aumentar os índices de
produtividade, a inseminação artificial associada à congelação seminal tem sido
instrumentos importantes para o melhoramento genético dos rebanhos e para
um incremento de produtividade dos mesmos (LEBOEUF et al., 1998).
A possibilidade de armazenar doses de sêmen por um período
indefinido para posterior utilização é uma das maiores vantagens da congelação
seminal nos programas de inseminação artificial na maioria das espécies
domésticas. Outras vantagens são a redução de custos com a aquisição e
transporte de reprodutores e favorecimento da rápida difusão de material
genético entre regiões, países e continentes.
31
Entretanto, o sucesso da criopreservação de sêmen é apenas parcial,
uma vez que a viabilidade espermática do sêmen congelado/descongelado em
geral é menor quando comparada ao sêmen refrigerado, devido ao grande
número de espermatozoides que são destruídos e danificados durante o
processo (WATSON, 2000).
Esses danos têm sido atribuídos às mudanças de temperaturas, à
formação de cristais de gelo, aos estresses oxidativos e o gradiente osmótico,
ocasionando uma série de alterações estruturais, resultando em danos à
membrana plasmática e acrossomal, bem como a outras estruturas
espermáticas (WATSON, 2000).
As crioinjúrias podem ser minimizadas quando se adiciona
crioprotetores penetrantes e não penetrantes ao diluente, a fim de evitar a
formação dos cristais de gelo. Na espécie ovina o crioprotetor penetrante mais
utilizado é o glicerol e o não penetrante é a gema de ovo (PURDY, 2006).
Após o processo de diluição, o sêmen ovino pode ser armazenado em
palhetas francesas de 0,25 ml ou 0,5 ml. Bezerra (2009) avaliou a influência do
volume das palhetas de 0,25 e 0,5 ml sobre a qualidade do sêmen caprino
descongelado e concluiu que o envase nesta última promove maiores resultados
de motilidade progressiva após a descongelação, sendo esta, portanto, a mais
recomendada para nesta espécie.
2.5 DILUENTES SEMINAIS
Os diluentes permitem o aumento do volume total do ejaculado,
facilitando sua divisão em doses inseminantes e proporcionando um meio
favorável para a sobrevivência dos espermatozoides in vitro, uma vez que, os
espermatozoides não sobrevivem por muito tempo no sêmen in natura
(DERIVAUX, 1980).
Na conservação seminal, em geral, um bom diluente deve apresentar
as seguintes características: pressão osmótica compatível com a espécie,
balanço mineral apropriado, combinação ajustada de nutrientes, capacidade de
neutralizar produtos tóxicos originados do metabolismo espermático, proteção
contra os danos causados por ação das mudanças de temperatura, bem como
32
proporcionar a estabilidade dos sistemas enzimáticos e a integridade da
membrana plasmática (AMANN; PICKETT, 1987).
2.5.1 Água de coco em pó
A água de coco (Cocos nucifera L.) é uma solução natural, ácida e
estéril, composta de sais, proteínas, carboidratos, vitaminas, gorduras neutras e
uma pequena quantidade de fosfolipídios além de indutores da divisão celular e
eletrólitos diversos, que apresenta ausência de toxicidade, osmolaridade
semelhante ao do sêmen, pH favorável a sobrevivência e viabilidade das células
espermáticas (SALGUEIRO et al., 2002).
Desta forma, estudos tem apresentado resultados positivos da água
de coco na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozoides
em experimentos in vitro e in vivo, sendo possível sua utilização em processos
biotecnológicos, como a inseminação artificial, sem os custos elevados com
diluentes importados (NUNES, 1998).
A água de coco tem sido utilizada na biotecnologia da reprodução
animal obtendo-se bons resultados na preservação do sêmen de animais
domésticos como caprinos (MELO, 2010), ovinos (CAVALCANTE et al., 2008),
suínos (TONIOLLI; MESQUITA, 1990) e canídeos (UCHOA, 2004).
A água de coco recomendada para o uso em diluentes seminais é a
proveniente de frutos com quatro a seis meses de maturação, composta
principalmente por carboidratos, aminoácidos, vitaminas e minerais. Além desta
composição, estudos cromatográficos realizados visando isolar a fração da água
de coco que atua sobre o espermatozoide, identificaram a presença do ácido 3-
indol-acético, substância com ação hormonal estimuladora do crescimento de
vegetais, a qual demonstrou atividade sobre o metabolismo dos
espermatozoides (NUNES; COMBARNOUS, 1995).
Com o intuito de simplificar a utilização da água de coco como diluente
padronizaram na forma de pó (Fig. 4), recebendo a denominação de ACP,
permitindo a conservação de suas características benéficas e facilitando o seu
uso em regiões onde não se dispõe do fruto (NUNES; SALGUEIRO, 2011).
33
Figura 4. Água de coco em pó (ACP)
Fonte: ACP Biotecnologia
2.6 CRIOPROTETORES
Para o sucesso na criopreservação dos espermatozoides é
necessário observar uma série de fatores, visando à redução dos danos
causados às células espermáticas, assegurando a longevidade in vitro e in vivo.
Dentre esses fatores podemos citar: a taxa de diluição, os diluentes, os
crioprotetores, a taxa de refrigeração e a manutenção da temperatura
(FARSTAD, 1996).
Em relação ao crioprotetor não-penetrante, este não consegue
atravessar a membrana plasmática e age extracelularmente. Assim, ele pode
atuar como um soluto e reduzir a temperatura de congelação do meio. Já os
crioprotetores penetrantes, são permeáveis à membrana plasmática e agem
intra e extracelularmente. Como são solúveis, causam a desidratação do
espermatozoide devido ao fluxo de água osmoticamente direcionado. Após
curtos períodos de tempo, o crioprotetor e a água se equilibram, resultando em
iguais concentrações extra e intracelulares (BEZERRA, 2010). Muitos
crioprotetores penetrantes (glicerol, dimetilsulfóxido, dimetilformarmida,
etilenoglicol, propilenoglicol) e suas combinações têm sido testadas, todavia, o
crioprotetor penetrante mais frequentemente utilizado continua sendo o glicerol,
apresentando-se com os melhores resultados (BEZERRA, 2009).
34
Quando o sêmen é submetido a temperaturas de 4 a 5 °C, as células
espermáticas necessitam de uma proteção contra as lesões na membrana
plasmática. Desta maneira, substâncias ricas em lipoproteínas, como o leite, e
principalmente, a gema de ovo tem sido amplamente utilizada como
crioprotetores externos para criopreservação de sêmen ovino.
2.6.1 Glicerol
Um dos crioprotetores internos mais utilizados é o glicerol, um
composto orgânico, pertencente à função álcool, liquido na temperatura
ambiente, inodoro, incolor, viscoso (FERNANDES et al., 2002). Este tem a
capacidade de penetrar na célula espermática através de difusão passiva,
permanecendo na membrana e no citoplasma, isso faz com que o meio fique
hipertônico, e promove a desidratação da célula, prevenindo a formação de
cristais de gelo dentro da célula (PURDY, 2006).
A adição de glicerol pode ser feita em dois momentos: na diluição
inicial (One step), quando o sêmen ainda está em temperatura ambiente ou após
a refrigeração do sêmen a 4 °C (Two steps), com o intuito de reduzir o efeito
tóxico do glicerol (SILVA; GUERRA, 2011).
Apesar de o glicerol ser o crioprotetor mais utilizado nos diluidores de
congelação do sêmen ovino, alguns autores observaram efeitos deletérios aos
espermatozoides como: estresse osmótico, mudanças na organização, fluidez e
permeabilidade da membrana plasmática, assim como desorganização da sua
composição lipídica (WATSON, 1995).
Devido a esses efeitos negativos, alguns estudos têm dado
preferência à adição do glicerol somente após a refrigeração do sêmen à
temperatura de 5 ºC (FISER; FAIRFULL, 1989), realizando a diluição em duas
etapas. Porém, nos dias atuais, a diluição em uma etapa é preferencialmente
utilizada, com bons resultados, e não há nenhuma evidência convincente que
suporte a necessidade da utilização do procedimento mais trabalhoso
(SALAMON; MAXWELL, 2000).
2.6.2 Gema de ovo
35
O esclarecimento do papel de lipídeos e proteínas presentes na gema
de ovo sobre a proteção da membrana espermática pode, indiretamente,
evidenciar a natureza das mudanças de membrana que ocorrem durante a
refrigeração e a congelação (FARSTAD, 1996). Com base nisso, fosfolipídios,
fosfatidilcolina, frações lipoproteicas e lipoproteínas específicas passaram a ser
estudados, a fim de se entender os mecanismos de crioproteção da gema de
ovo.
A principal função protetora da gema de ovo é estabilizar as
membranas biológicas, minimizando os efeitos negativos do choque térmico.
Entretanto, existem diversas teorias quanto ao mecanismo de ação da gema de
ovo na célula espermática durante a criopreservação seminal (HOLT, 2000).
Em 1974, Pace e Graham tentaram purificar e estabelecer a fração da
gema responsável pela proteção dos espermatozoides bovinos congelados
separando a gema nas seguintes frações: a granular, a fração solúvel crua e a
de baixa densidade crua. Nenhum componente protetor foi encontrado nas
frações solúvel crua e granular, diferentemente do observado na fração de baixa
densidade crua, que protegeu tão bem quanto a gema de ovo total (PACE;
GRAHAM, 1974).
Sugere-se que sua ação seja devido à presença de lipoproteínas de
baixa densidade, que atuariam na membrana plasmática do espermatozoide,
restaurando a perda de fosfolipídios e aparentemente induzindo uma alteração
transitória de sua composição, consequentemente, prevenindo a ruptura da
membrana plasmática (FARSTAD, 1996).
Foulkes (1977) propôs que os componentes da gema se ligariam
firmemente às membranas espermáticas bovinas, exercendo papel protetor ao
estabilizarem a membrana durante a refrigeração, ou ao conseguirem manter a
pressão coloidal do meio externo.
Outros estudos sugerem que os fosfolipídios presentes nas
lipoproteínas de baixa densidade protegem os espermatozoides pela formação
de um filme protetor na superfície celular durante a congelação (QUINN; CHOW;
WHITE, 1980).
Apesar dos efeitos benéficos da gema de ovo, as desvantagens dos
diluentes que a utilizam são atribuídas aos seguintes fatores: opacidade óptica,
causada pelos grânulos formados, que dificultam o exame imediato através da
36
avaliação microscópica; prejuízo causado à respiração espermática; diminuição
da motilidade. Além disso, podem transportar micro-organismos patogênicos
(BOUSSEAU et al., 1998).
A contaminação do ovo é decorrente de sua estrutura, uma vez que
a casca do ovo é porosa, sua a cutícula não sela completamente os poros da
casca do ovo, cerca de 1% permanecem abertos. Através destes poros com
medidas de 5 a 35 µm de diâmetro que ocorrem as trocas gasosas por difusão
com os vasos sanguíneos da membrana e o meio externo, e permitindo também
a entrada de bacilos Gram-negativos e leveduras, como o Saccharomyces. O
período de eficiência da cutícula é de aproximadamente quatro a 5 dias, quando
ocorre o desprendimento da superfície dos ovos e um numero maior de
microorganismos conseguem penetrar no interior do ovo (DE REU et al., 2006).
No entanto, a estrutura glicoproteíca denominada cutícula, que
recobre a totalidade da superfície externa da casca, possui um aspecto similar
ao de uma esponja, o que facilita a entrada de ar, mas impede a entrada de
microrganismos. A casca e cutícula intactas previnem a entrada dos
microrganismos no interior do ovo, pelo que é necessário tomar certas medidas
de modo a garantir a manutenção da integridade e segurança dos ovos. A
lavagem, a abrasão, os golpes, o envelhecimento, entre outros fatores, podem
ocasionar a perda da integridade protetora física natural do ovo. E mesmo que a
cutícula do ovo se mantenha intacta, a casca pode estar contaminada,
proporcionando um risco adicional, uma vez que ao tocar na casca com as mãos,
nas superfícies e ao partir os ovos, os microrganismos podem ser inoculados
(CERVI, 2012).
Os microorganismos mais comuns que podem ser encontrados em
ovos são: vírus (Reoviridae, Retrovirídae, Picornaviridae, Ortomyxoviridae,
Adenovírus, Oncovirinae e Circoviridae); Bactérias (Streptococci, Salmonella
spp., Escherichia colli, Staphylococci, Campylobacter, Mycobacterium
Clamydophila psittaci e Chlamydia); Mycoplasmas (M. synoviae, M.
gallisepticum) e Fungos (Aspergillus) (JORDAN; PATTISON, 1998).
Devido essas características do ovo, foram realizados trabalhos
avaliando a contaminação, tanto das gemas de ovos puras como dos diluentes
à base de gema de ovo, observando sistematicamente a contaminação por
bactérias, independentemente da sua fonte inicial. Além disso, os preparativos,
37
incluindo as gemas de ovos de uma fonte industrial (em pó ou líquido),
apresentaram os maiores níveis de contaminação, enquanto que nenhuma
diferença óbvia pode ser detectada entre reparações, incluindo ovos de fazenda
e de mercado. E mesmo quando adicionado antibióticos aos diluentes, as duas
preparações finais de diluentes à base de gema de ovo (Triladyl) e leite
(Laiciphos) foram contaminadas com bactérias, sendo uma possível fonte de
endotoxinas capaz de danificar a capacidade fertilizante dos espermatozoides.
Em contraste, nenhum dos 6 lotes de Biociphos plus (lecitina de soja) mostrou
qualquer vestígio de contaminação (BOUSSEAU et al., 1998).
Como consequência direta, a maioria dos países temem o risco de
introduzir doenças através do transporte de produtos à base de leite ou de ovos
Um inventário internacional das numerosas causas de contaminação do sêmen
processado resultou na identificação de etapas críticas e uma abordagem
semelhante à que está em uso para outros produtos, como alimentos,
conhecidos como Análise de Perigos e Controle de Pontos críticos, a qual tem
sido utilizada na França e na Holanda (THIBIER; GUERIN, 2000).
Desta forma, a indústria de IA não é totalmente livre de
microorganismos patogênicos e consequentemente pode causar riscos
biológicos, como por exemplo, a doença da vaca louca detectada no Canadá.
Além disso, a detecção do vírus da gripe aviária (H2N1) nas aves domésticas
que também afetou consideravelmente a indústria. Então, a inclusão de
suplementos de origem animal ao diluente de sêmen oferece risco mínimo, mas
potencial, a transmissão de patógenos. É por isso que alguns centro de pesquisa
desenvolvem atualmente diluentes sintéticos que não contêm suplementos de
proteína animal, mas sim várias fracções lipídicas de plantas (BLONDIN, 2006).
2.5.3 Óleos vegetais
O óleo de palma é um óleo vegetal extraído da fruta encontrada nas
palmeiras (Elaesis guineensis). É constituído por ácidos graxos, sendo 50% de
ácidos graxos saturados, 40% de ácidos graxos monoinsaturados e 10% de
ácidos graxos poli-insaturados, tendo em sua composição: ácido palmítico, ácido
esteárico, ácido mirístico e ácido láurico de cadeia média. Além disso, o óleo de
38
palma é rico em antioxidantes conhecidos como carotenóides, incluindo beta-
caroteno (HIPERTROFIA, 2017).
Atualmente, o óleo de palma tem sido estudo em diversas áreas,
principalmente em relação aos benefícios à saúde humana, como por exemplo:
protetor contra as doenças coronarianas, antioxidante biológico contra
arteriosclerose, anticancerígeno no câncer mamário. Além disso, também é
utilizado na indústria cosmética, produção de sabões, velas etc (MANOEL
NETO, 2008).
Outro óleo que tem sido estudado é o óleo de coco, obtido a partir da
polpa do coco fresco maduro (Cocos nucifera L.), o qual é composto por duas
frações, a "fração lipídica" que contém ácidos graxos saturados (mais de 80%)
e ácidos graxos monoinsaturados com 5%, e ácidos graxos poli-insaturados de
2%. A "fração não lipídica" ainda não é elucidada; no entanto, sugere-se que a
fração não lipídica contém compostos fenólicos tais como os antioxidantes
(HETTIARACHCHI; JEEWANDARA, 2011).
Os ácidos graxos saturados presentes no óleo de coco são: capróico,
caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico e os insaturados são:
oleico e linoleico. O óleo de coco é rico em ácido láurico, com concentração
acima de 40%. As gorduras láuricas, caso do óleo de coco, são resistentes à
oxidação não enzimática e ao contrário de outros óleos e gorduras apresentam
temperatura de fusão baixa e bem definida (24,4 - 25,6 ºC) (SILVA NETO et al.,
2013).
Atualmente, o óleo de coco tem sido estudado em diversas áreas,
principalmente em relação aos benefícios à saúde humana, como por exemplo:
redução da diabetes, melhoria no quadro de pacientes com Alzheimer, perda de
peso, controle do colesterol e prevenção de diversas doenças cardiovasculares
através de seu efeito hipolipidêmico. Esses benefícios estão relacionados à sua
atividade antioxidante e sua composição lipídica (HETTIARACHCHI;
JEEWANDARA, 2011).
Estudos tem demonstrado também que dieta enriquecida com óleo de
coco virgem em ratos melhora a capacidade antioxidante, aumenta às atividades
de catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase
no fígado, coração e rins. O óleo de coco virgem também preveniu o estresse
39
oxidativo, indicado pela diminuição da formação de peroxidação lipídica e
oxidação de proteínas (ARUNIMA; RAJAMOHAN, 2013).
Del Valle et al. (2013) estudando a função dos espermatozoides
ovinos congelados, utilizaram diluentes complementados com caseína e óleos
vegetais (palma e coco), e observaram que nenhum dos meios quimicamente
definidos utilizados no estudo pós-descongelação obtiveram resultados
melhores quando comparados ao diluente contendo gema de ovo. No entanto,
eles concluíram que apesar de não ter sido demonstrado efeito superior desses
óleos na qualidade seminal pós-descongelação, são ainda necessárias mais
pesquisas sobre assunto.
Andreev et al. (2008), ao avaliarem o efeito de lipídios na formação de
cristais de gelos durante a congelação de células espermáticas de Truta,
observaram que eles são capazes de impedir o crescimento dessas estruturas
de cristais de gelo, e recomendam a sua utilização como aditivos para melhorar
as propriedades crioprotetoras do meio diluente utilizado.
Santos (2013) avaliando o efeito da adição de óleo de coco em meio
de conservação à base de água de coco em pó (ACP-101c) em sêmen caprino
criopreservado nas concentrações de 2,5%, 4%, 10% e 20%, não obteve
resultados superiores ao meio de conservação contendo a gema de ovo como
crioprotetor. Entretanto, observou que o óleo apresentou um possível potencial
crioprotetor quando adicionadas concentrações 2,5 e 4%, sugerindo mais
estudos.
O óleo de coco extra virgem orgânico de origem comercial do grupo
empresarial FidBō, possui o certificado de produtos orgânico do Brasil,
garantindo ausência de contaminantes, padronização e confiabilidade das
amostras (DR.ORGÂNICO, 2017) (quadro 4).
Quadro 4. Composição do óleo de coco extra virgem orgânico
NUTRIENTES UNID. 100g
Energia Kcal 867
Proteína g 0.00
Lipídios totais g 93.33
40
Carboidratos g 0.00
Fibra total g 0.00
Açúcar total g 0.00
MINERAIS
Sódio (Na) mg 0.00
LIPÍDIOS
Ác. Graxos saturados totais g 86.670
Ác. Graxos monoinsaturados totais g 3.330
Ác. Graxos poliinsaturados totais g 3.330
Ác. Graxos trans totais g 0.00
Colesterol mg 0.00
Fonte: USDA, 2017.
Estudos previamente realizados pelo laboratório de Tecnologia do
sêmen de Caprinos e Ovinos da Universidade Estadual do Ceará, avaliando a
adição de 2,5%, 5%, 10% e 20% de óleo de coco extra virgem ao meio de
conservação à base de água de coco em pó (ACP-102c) em sêmen ovino
criopreservado, observou possível ação crioprotetora quando adicionadas as
concentrações de 10 e 20%.
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3 JUSTIFICATIVA
Os meios de conservação existentes para o sêmen ovino, em sua
quase totalidade, possuem em sua composição substâncias de origem animal
como a gema de ovo ou o leite desnatado, o que implica em risco biológico
potencial, comprometendo o comércio internacional de doses de sêmen e,
ocasionando uma redução na difusão de material genético de alto valor.
Desta forma, o presente estudo se justifica pela necessidade mundial
do desenvolvimento de meios de conservação seminal que sejam livres de
produtos de origem animal.
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4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O meio de criopreservação seminal à base água de coco em pó
adicionado de óleo de coco extra virgem mantém a qualidade espermática do
sêmen ovino pós-descongelação.
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5 OBJETIVOS
5.1 GERAL
Avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c)
adicionada de óleo de coco extra virgem na criopreservação de sêmen ovino.
5.2 ESPECÍFICOS
- Determinar a concentração ideal de óleo de coco extra virgem a ser adicionada
ao meio de criopreservação à base de água de coco em pó (ACP-102c) do
sêmen ovino;
- Avaliar os efeitos do diluente à base de água de coco em pó e do crioprotetor
de origem vegetal nas células espermáticas comparado ao diluente TRIS
adicionado de gema de ovo após a descongelação através da avaliação da:
(a) cinética espermática: motilidade total, VCL, VSL e VAP;
(b) atividade mitocondrial;
(c) integridade do DNA;
(d) viabilidade espermática.
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6 CAPÍTULO I
Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó
(ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem
Cryopreservation of ram sperm in extender based on powered coconut water
(ACP-102c) added with extra virgin coconut oil
Periódico: Pesquisa Veterinária Brasileira
(Submetido em 19 de junho de 2017)
Qualis A2
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Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem1
Bruna F. Brito2*, Bárbara M. B. Santos3, Leonardo A. R. Cabral², Thalles G.P. Nunes 2, Francisco J. R.
Silveira Jr.4, Annice A. Cortez 2, Cristiane C. M. Salgueiro3, José F. Nunes²
ABSTRACT.- Bruna F. Brito²*, Bárbara M. B. Santos³, Leonardo A. R. Cabral², Thalles G.P. Nunes 2, Francisco J. R. Silveira Jr. 4, Annice A. Cortez 2, Cristiane C. M. Salgueiro3 & José F. Nunes. 2017. [Cryopreservation of ram sperm in extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil] Criopreservação de sêmen ovino em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionada de óleo de coco extra virgem. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Universidade Estadual do Ceará, Avenida Silas Munguba,1700, Campus Itaperi, Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. *Autor para correspondência: [email protected]
The objective of this study was to evaluate the effect of the extender based on powdered coconut water (ACP-102c) added with extra virgin coconut oil on the cryopreservation of ovine sperm. The experiment was carried out at the Laboratory of the Goat and Sheep Sperm Technology (LTSCO) and Fazenda Ouro Branco, Ceará, Brazil. The sperm of five Dorper rams was collected with the aid of an artificial vagina; then assembled in a pool, divided into four equal aliquots and diluted in one step in the extenders: T1 (TRIS + 20% egg yolk), T2 (ACP-102c + 20% egg yolk + 7% glycerol), T3 (ACP-102c + 10% coconut oil + 7% glycerol), and T4 (ACP-102c + 20% coconut oil + 7% glycerol). The samples were packaged and submitted to a refrigeration curve (0.35 °C / min.), stabilized at 4 °C for 2 h, frozen in nitrogen vapor (-60 °C) and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing, the samples were evaluated for the following sperm quality parameters: total motility (MT), curvilinear velocity (VCL), linear velocity (VSL), mean velocity (VAP), sperm viability, DNA fragmentation, and mitochondrial activity (p < 0.05). According to the results, T3 differed from control treatments only for MT; however, this remained within the values recommended by the Manual of the Brazilian College of Animal Reproduction. Thus, it can be concluded that ACP-102c extender added with 10% coconut oil is efficient in maintaining the quality of cryopreserved ovine spermatozoa. INDEX TERMS: Ovine, sperm, freezing, coconut water, coconut oil.
RESUMO.- Objetivou-se avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c) adicionado de óleo de coco extra virgem na criopreservação de sêmen ovino. O experimento foi realizado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO) e na Fazenda Ouro Branco, Ceará, Brasil. O sêmen de cinco ovinos da raça Dorper foi coletado com o auxílio de vagina artificial; em seguida, reunidos em um pool, dividido em quatro alíquotas iguais e diluídas em um step nos diluentes: T1 (TRIS + 20% gema de ovo), T2 (ACP-102c + 20% gema de ovo + 7% glicerol), T3 (ACP-102c + 10% óleo coco + 7% glicerol) e T4 (ACP-102c + 20% óleo de coco + 7% glicerol). As amostras foram envasadas e submetidas a uma curva de refrigeração (0,35 °C/min.), estabilizadas a 4 °C por 2h, congeladas em vapor de nitrogênio (-60 °C) e armazenadas em nitrogênio líquido (-196 °C). Após a descongelação, as amostras foram avaliadas quanto aos seguintes parâmetros de qualidade espermática: motilidade total (MT), velocidade curvilinear (VCL), velocidade linear (VSL), velocidade média do percurso (VAP), viabilidade espermática, fragmentação do DNA, e atividade mitocondrial (p < 0,05). De acordo com os resultados, o T3 foi inferior aos tratamentos controle apenas quanto à MT (p<0.05); no entanto, este se manteve dentro dos valores preconizados pelo Manual do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Desta forma, pode-se concluir que o meio ACP-
1 Recebido em................................ Aceito para publicação em.......................... 2 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Dr. Silas Munguba,1700, Campus Itaperi, Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. Pesquisa de Mestrado com o apoio FUNCAP/CAPES/CNPq.*Autor para correspondência: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]. 3 Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), UECE, Av. Dr. Silas Munguba,1700, Campus Itaperi, Fortaleza, Ceará, 60.714-903, Brasil. [email protected], [email protected]. 4 Faculdade Tecnológica do Nordeste, Rua Coronel Correia, 1119, Soledade, Caucaia, Ceará, 61603-005, Brasil. [email protected].
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102c adicionado de 10% óleo de coco é eficiente na manutenção da qualidade dos espermatozoides ovinos criopreservados. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Ovino, sêmen, congelação, água de coco, óleo de coco.
INTRODUÇÃO As biotecnologias de conservação de sêmen ovino são de fundamental importância, uma vez
que possibilitam a preservação do material genético, permitem a implantação das mesmas em diversas regiões, devido à facilidade de transporte do material genético e, consequentemente, uma melhoria nos rebanhos.
Dentre as biotecnologias de conservação seminal recomenda-se a criopreservação, uma vez que os espermatozoides não sobrevivem por muito tempo no sêmen in natura, tornando-se necessário a adição de diluentes para otimizar o meio que o envolve e manter a sua sobrevivência. Esses diluentes fornecem proteção contra os produtos do metabolismo espermático e as mudanças de temperatura, principalmente, nos processos de criopreservação.
Um bom diluente deve apresentar ausência de toxicidade, osmolaridade semelhante ao do sêmen, pH favorável e ser de preparação simples e de baixo custo. Características essas que estão presentes no diluente à base de água de coco, promovendo a sobrevivência e viabilidade dos gametas masculinos (Nunes 1998).
A água de coco tem apresentado resultados positivos na manutenção da viabilidade e poder fecundante dos espermatozoides em experimentos in vitro e in vivo, sendo possível sua utilização em processos biotecnológicos, como a inseminação artificial, sem os custos elevados com diluentes importados (Nunes 1998). Devido aos excelentes resultados obtidos nos primeiros estudos com água de coco in natura, foi desenvolvido um meio de conservação seminal à base de água de coco em pó (ACP), caracterizado pela padronização e estabilização, permitindo a conservação de suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões onde não se dispõe do fruto (Nunes & Salgueiro 2011).
O componente responsável pela proteção contra o choque térmico é denominado crioprotetor não-penetrante, sendo a gema de ovo a substância mais utilizada. Porém, por ser um produto cru e de origem animal, apresenta a possibilidade de contaminação biológica do diluente e, subsequente produção de endotoxinas capazes de prejudicar a capacidade de fecundação dos espermatozoides (Aires et al. 2003, Gil et al. 2003). Outras desvantagens referentes à utilização da gema de ovo, são atribuídas à opacidade óptica, causada pelos grânulos formados, que dificultam o exame imediato através da avaliação microscópica, o prejuízo causado à respiração do espermatozoide e a diminuição da motilidade (Bousseau et al. 1998, Martin 2005).
Estudos avaliando a qualidade dos espermatozoides ovinos congelados com diluentes suplementados com caseína e óleos vegetais, observaram que nenhum dos meios utilizados no presente estudo pós-descongelação obtiveram resultados superiores quando comparados ao diluente contendo gema de ovo. No entanto, concluíram que apesar de não ter sido demonstrado efeito superior desses óleos na qualidade seminal pós-descongelação, são ainda necessárias mais pesquisas sobre assunto (Del Valle et al. 2013).
O óleo de coco, obtido a partir da polpa do coco fresco maduro (Cocos nucifera L.), é composto por ácidos graxos saturados (mais de 80%) e ácidos graxos insaturados. Os ácidos graxos saturados presentes no óleo de coco são: capróico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico, e os insaturados são: oléico e linoléico. Esses ácidos graxos são os mesmo observados no plasma seminal de pequenos ruminantes (Cardoso et al. 2011).
Em um recente estudo, avaliando a qualidade de espermatozoide caprinos criopreservados em meio à base de água de coco em pó adicionanda de óleo de coco, foi observado a ação crioprotetora do óleo de coco, entretanto, os dados obtidos foram inferiores ao preconizado pelo CBRA (Santos 2013).
Diante disso, objetivou-se avaliar o efeito do diluente à base de água de coco em pó adicionada de óleo de coco extra virgem na criopreservação de espermatozoides ovinos.
MATERIAL E MÉTODOS Este trabalho está em conformidade com o projeto aprovado pela Comissão de Ética para o
Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (UECE) com o número de protocolo: 1845940/2016 e foi executado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino (LTSCO), inserido no Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) da UECE, juntamente a Fazenda Ouro Branco. O
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Núcleo está localizado na cidade de Fortaleza, no Estado do Ceará, Brasil, com latitude de 3°43’47” sul e longitude de 38°30’37” oeste e altitude de 16 metros acima do nível do mar. O clima da região, de acordo com a classificação de Koppen, é quente e úmido, com médias térmicas variando entre 26 a 27 °C, máximas de 30 °C e mínimas de 19 °C. A Fazenda Ouro Branco localiza-se em Amanari, distrito do município de Maranguape, Ceará.
Utilizou-se cinco reprodutores ovinos da raça Dorper, com idade entre 1-4 anos, mantidos em manejo semi-intensivo, alimentados com pasto verde e concentrado comercial com 18% de proteína bruta, além de sal mineral e água à vontade. As colheitas de sêmen foram realizadas com auxílio de vagina artificial, duas vezes por semana, perfazendo seis colheitas por animal, totalizando 30 ejaculados. Após a colheita, avaliou-se cada ejaculado quanto ao volume, concentração, motilidade massal, percentual de espermatozoides móveis e vigor. Foram utilizados apenas ejaculados com volume superior a 0,5 ml, percentual de espermatozoides móveis superior a 80%, concentração mínima de espermatozoides de 3,5 x 109 espermatozoides (sptz) /ml e escore mínimo de 3,5 para motilidade massal e vigor (CBRA 2013).
Para a criopreservação seminal utilizaram-se os diluentes ACP-102c e TRIS. O diluente ACP-102c foi preparado segundo recomendação do fabricante (ACP Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil). O diluente TRIS consistiu na adição de 300 mM de Tris-hidroximetil-aminometano, 94,7 mM de ácido cítrico monohidratado e 27,8 mM de glicose. O diluente TRIS foi acrescido de 20% de gema de ovo (G.O.) e 7% de glicerol, e o diluente ACP-102c foi fracionado em três alíquotas as quais foram acrescidas de 20 % de gema de ovo, 10% de óleo de coco (O.C.), 20 % de óleo de coco. As três alíquotas foram acrescidas de 7% de glicerol e, para todos os diluentes, foi acrescido 40 mg de gentamicina para cada 100 ml de diluente.
Em cada coleta, os ejaculados foram reunidos em um pool, divididos em quatro alíquotas e diluídos a 34 °C nos tratamentos T1 (TRIS-20% G.O.-7% glicerol), T2 (ACP102c-20% G.O.-7% glicerol), T3 (ACP102c-10% O.C.-7% glicerol) e T4 (ACP102c-20% O. C.-7% glicerol), obtendo uma concentração final de 400x106 sptz/ml. Em seguida, as amostras foram envasadas em palhetas de 0,5 ml e refrigeradas até 4 °C em 120 min., a um decréscimo de 0,35 °C/min. Ao atingir 4 °C, as amostras foram acondicionadas em geladeira a 4 °C por 2 h, para estabilização. Após este período, as palhetas foram congeladas em vapor de nitrogênio (- 60 °C) por 15 min., a uma altura de 4 cm do nitrogênio líquido, e então imersas em nitrogênio líquido a -196 °C e armazenadas em botijões criogênicos.
Para avaliação do sêmen criopreservado, duas palhetas por diluente foram descongeladas em banho Maria a 37 °C por 30 segundos, acondicionadas em tubos tipo Eppendorfs e incubadas por cinco minutos em banho Maria a 37 °C. As amostras de sêmen descongeladas foram avaliadas quanto aos parâmetros cinéticos, viabilidade espermática, atividade mitocondrial espermática e dispersão da cromatina espermática.
A motilidade espermática foi avaliada em Sistema de Análise de Sêmen Auxiliado por Computador (CASA), com uso do programa Sperm Class Analyser® (SCA®, Microptic S.L., Barcelona, Espanha) que processa imagens obtidas em microscópio de contraste de fase acoplado a uma câmara digital. Foram utilizadas as seguintes variáveis do programa: 25 quadros/s, sendo 25 quadros/campo; velocidade limite para espermatozoides lentos de 30μm/s; limite para velocidade média de 60 μm/s; retilinearidade mínima para espermatozoides progressivos de 80%. Para a avaliação, diluiu-se o sêmen descongelado nos diluentes-base (ACP-102c e TRIS) a 37 °C, até a concentração de 40 x 106 sptz/ml. Dez microlitros desta diluição foram alíquotados em câmara de Makler (Sefi Medical Instruments Ltda., Haifa, Israel), pré-aquecida a 37 °C, para se estudar as variáveis: percentual de espermatozoides móveis, velocidade curvilinear (VCL - μm/s), velocidade linear (VSL - μm/s), e velocidade média do percurso (VAP - μm/s).
A viabilidade espermática foi avaliada pela técnica de coloração de esfregaço utilizando o corante eosina-nigrosina (eosina 1 g, nigrosina 2 g, citrato de sódio 3,57 g, e água destilada qsp. 100 ml - Baril et al. 1993). Foram confeccionados esfregaços em lâmina pré-aquecida a 37 °C utilizando 5 μl do corante eosina nigrosina adicionado de 5 μl do sêmen rediluído. Foram contadas 200 céulas espermáticas por lâmina e classificadas como viáveis (não coradas) e não viáveis (coradas).
A atividade mitocondrial foi verificada pela técnica citoquímica (Hrudka 1987). Foi pesado 0,0045 g de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) e diluído em 300 µl de solução tampão fosfato salina (PBS). A seguir, uma alíquota de 25μl de amostra foi incubada com 50 μl de DAB+PBS, a 37 °C, por 40 min. Após incubação, foram confeccionados esfregaços em lâmina de vidro pré-aquecidas, estas fixadas em formol a 10% por 10 min., lavadas com água destilada e secas a temperatura ambiente (22 °C). Todo o procedimento deste teste foi realizado protegidos da luz.
Para análise da atividade mitocondrial, as lâminas foram observadas em microscópio de contraste de fase em aumento de 400x, sendo contados 200 espermatozoides/lâmina, e classificados
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de acordo com o grau de coloração da peça intermediária em quatro classes: Classe I [células espermáticas com peça intermediária totalmente corada indicando alta atividade mitocondrial -DAB I]; Classe II [células espermáticas com mais da metade dos segmentos corados (ativos) indicando atividade mitocondrial média a alta - DAB II]; Classe III [células espermáticas com menos da metade dos segmentos corados (ativos) indicando baixa atividade mitocondrial - DAB III]; Classe IV [células espermáticas com peça intermediária totalmente descorada indicando ausência de atividade mitocondrial - DAB IV] (Hrudka 1987).
Para avaliação da integridade do DNA, utilizou-se o teste SCD (Sperm Cromatine Dispersion). A agarose de baixo peso molecular foi fervida por 5 min., em seguida, uma alíquota de 50 µl de agarose foi acondicionada em tubo tipo Eppendorf e mantida em banho Maria a 37 °C por 5 min. A seguir, uma alíquota de 25 µl da amostra de sêmen descongelada foi adicionada ao Eppendorf contendo agarose. Em lâmina previamente preparada, foram aliquotados 2 µl do sêmen diluído na agarose em cada ponto devidamente sinalizado e em seguida cobertas com lamínulas, sendo um total de oito alíquotas por lâmina. Posteriormente, as lâminas foram acondicionadas em geladeira por 5 min. Após o tempo de acondicionamento, foram retiradas as lamínulas e as lâminas submetidas a uma série de soluções: solução de HCL (7 min.); solução de lise (25 min.); água destilada (5 min.), e álcool 70%, 90% e 95% respectivamente (2 min. cada). Em seguida, as lâminas foram secas em temperatura ambiente (22 °C) e posteriormente submetidas à coloração com kit Panótico. Por fim, as lâminas foram lavadas com água destilada e secas em temperatura ambiente (22 °C). Duzentas células espermáticas foram avaliadas e o percentual de células com DNA íntegro (DNAi) determinado pela presença de grande halo de dispersão de cromatina ao redor da cabeça do espermatozoide e o percentual com DNA fragmentado (DNAf) determinado pela ausência do halo (Fernández et al. 2005, Cavalcante et al. 2014).
Os dados obtidos foram expressos em média e desvio padrão e analisados através do software estatístico R-project© versão 3.3.2 (The R Foundation, Viena, Áustria). Os dados foram submetidos ao teste de homocedasticidade Box-Cox e ao teste de normalidade Cramer-von Mises, as proporções encontradas para os parâmetros espermáticos foram submetidas ao Teste de Student-Newman-Keuls para comparação entre os diluentes pós-descongelação. Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO No presente estudo, o sêmen ovino foi diluído e criopreservado nos diluentes TRIS- 20%
G.O.-7% glicerol, ACP102c-20% G.O. -7% glicerol, ACP102c-10% O.C. -7% glicerol e ACP102c-20% O.C. -7% glicerol. Os parâmetros cinéticos incluindo o VSL, VCL, VAP, bem como a motilidade foram analisados em sistema de análise de sêmen auxiliada por computador (CASA). Adicionalmente, as análises da viabilidade espermática foram realizadas pelo método de coloração de eosina-negrosina (EN), da fragmentação de DNA pelo teste SCD (Sperm Cromatine Dispersion) e a atividade mitocondrial pelo teste de oxidação do 3,3’- diaminobenzinde.
A motilidade espermática é uma importante característica seminal para avaliar o potencial de fertilidade de espermatozoides. Vários estudos sugerem evidências entre os parâmetros de motilidade e a fertilidade (Stålhammar et al. 1994, Januskauskas et al. 2003).
Nesse estudo, excetuando-se as variáveis motilidade e viabilidade, em todos as demais (VCL, VSL, VAP, DNAi e atividade mitocondrial) não foi observada diferença estatística entre os quatro tratamentos (Tabela 1, 2 e 3). Logo após a descongelação, o sêmen criopreservado nos diluentes TRIS (20% G.O. -7% glicerol) e ACP102c (20% G.O. -7% glicerol, 10% O.C. -7% glicerol e 20% O.C. -7% glicerol) diferiu estatisticamente (p < 0,05) para a variável motilidade, em que o TRIS foi superior aos tratamentos à base de ACP-102c (p < 0,05) (Tabela 1). Os dados corroboram com o trabalho de criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c), onde observou que o TRIS apresentou superioridade para a variável motilidade e manteve similar as velocidades (Cavalcante et al. 2014).
Os resultados demonstraram que a adição de 10% do óleo de coco (32,78% + 16,72) manteve a qualidade do sêmen semelhante ao diluente ACP102c-20% G.O. (22,58% + 6,14) em todos os parâmetros avaliados (p>0.05) e foi inferior estatisticamente do diluente TRIS – 20% G.O. (68,40% + 14,25) somente em relação ao parâmetro motilidade (p<0.05), no entanto os dados de motilidade do T3 foram superior a 30%, valor preconizado pelo CBRA.
Recente estudo demonstrou evidências do efeito crioprotetor do óleo de coco adicionado ao diluente ACP-101c (específico para caprinos) na sobrevivência espermática pós-descongelação; no entanto, os resultados obtidos quanto a motilidade progressiva ( T1 -10%, T2 -7%), , VSL (T1 – 21,15, T2 – 24,4 µm/s ) e VAP (T1 – 34,15, T2 – 40,9 µm/s ) (Santos 2013). Além disso, exceto o parâmetro
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de motilidade, VCL e viabilidade, os demais parâmetros cinéticos e qualitativos foram semelhantes entre todos os tratamentos pós-descongelação. Ressalta-se ainda que, ao comparar o diluente ACP-102c acrescido de gema de ovo e acrescido de 10% de óleo de coco, não foi observado diferença estatística em nenhum parâmetro, inclusive na motilidade (Tab. 1).
Vale ressaltar que, durante as análises, observou-se que os tratamentos contendo o óleo de coco, apresentaram uma variação entre as palhetas de uma mesma colheita quanto a motilidade. Isso pode ser justificado pela dificuldade de homogeneização do óleo, o que pode ter ocasionado uma variação na concentração do óleo entre as palhetas, justificando o alto desvio padrão observado nos diluentes acrescidos de óleo.
Assim como a motilidade, as velocidades também são importantes parâmetros para avaliar o potencial de fertilidade. Neste estudo, ocorreu um declínio das velocidades VCL, VSL e VAP no sêmen descongelado (Tab. 1); no entanto, os resultados foram similares para as três velocidades entre os diluentes T1, T2 e T3, apresentando diferença estatística significativa apenas entre o T4 (45,29±8,53) e os tratamentos contendo gema de ovo (T1 - 69,30±14,82 e T2 - 51,11±13,67) quanto a VCL, onde o T4 foi inferior quando avaliados pós-descongelação. Esses resultados demonstram que o sêmen ovino criopreservado nos diluentes empregados neste estudo, não sofreu danos sub letais decorridos em função de efeitos da liberação de radicais livres pela atividade metabólica dos espermatozoides ativos e da liberação de enzimas tóxicas após lise de células mortas (Bag et al. 2004).
Outro fator importante para predizer o potencial de fertilidade espermática é o funcionamento mitocondrial de maneira ordenada e aprimorada, sendo altamente relacionado com altas taxas de funcionalidade e fertilidade da célula espermática (Angrimani et al. 2015). Dessa forma, a avaliação criteriosa da atividade, do potencial e do metabolismo mitocondrial surgiu como ferramenta para o sucesso na seleção de animais de interesse reprodutivo.
Em relação a atividade mitocondrial (Tab. 2), não houve diferença significativa no sêmen descongelado entre os tratamentos e o percentual de células espermáticas com alta (classe I) e média (classe II) atividade mitocondrial correspondem a mais de 50%. Estes índices significam que,na maioria dos espermatozoides mais da metade das mitocôndrias estão ativas nos espermatozoides após a descongelação, o que é compatível para promover a motilidade espermática pós-descongelação.
Além disso, o alto percentual de espermatozoides classe I e II e consequentemente, e um baixo percentual de classe III e IV observados nesse estudo, corroboram com os dados obtidos pela técnica de citoquímica para o sêmen caprino pós-descongelação das raças Boer e Alpina (Cavalcante et al. 2005). Desta forma, os diluentes foram eficazes em manter a função mitocondrial (Tab. 2), mantendo os níveis da síntese de energia (ATP), necessária ao movimento de espermatozoides no trato genital da fêmea.
Quanto à viabilidade e a fragmentação do DNA, acredita-se que o responsável pelas mudanças negativas bioquímicas e fisiológicas durante o armazenamento de espermatozoides seja a produção das espécies reativas de oxigênio (ROS) induzidas pela degradação de membranas espermáticas e pelos ácidos graxos poliinsaturados de alto nível (Vishwanath & Shannon 2000, Hong et al. 2010). As ROS podem interagir com uma variedade de macromoléculas biológicas, tais como proteínas e lipídios, causando danos oxidativos e afetando a integridade promovendo a fragmentação do DNA (Kelly et al. 1998, Gosalvez et al. 2007). No sêmen dos ovinos existem antioxidantes endógenos; no entanto, durante o processo de diluição e criopreservação, há uma diminuição da concentração dessas substâncias, podendo resultar em danos oxidativos.
Nos resultados, apenas o diluente ACP102c-20% O.C. apresentou diferença estatística quando comparado aos diluentes contendo gema de ovo no parâmetro viabilidade espermática (Tab. 3). No percentual de células espermáticas com DNA íntegro, também não foram encontradas diferenças significativas (p > 0,05) entre os diluentes, demonstrando que o ACP102c-10% O.C. é eficaz na manutenção da membrana espermática e na integridade do DNA, evitando a ação das ROS, atuando simultaneamente como crioprotetor e antioxidante.
Os dados desse estudo diferem com os achados do estudo no qual foi realizado a suplementação de 8% de óleo de coco extra virgem a diferentes concentrações de gema de ovo no diluente TRIS em touros. Nesse estudo foi observado que a adição apenas do óleo de coco ao diluente apresentou resultados insatisfatórios e que o melhor resultado foi do tratamento TRIS 20% de gema de ovo adicionado de 8% de óleo de coco, sugerindo assim, que a combinação aumentou a fluidez do meio e a integridade da membrana plasmática (Tarig et al. 2017).
Estas ações crioprotetoras e antioxidantes podem ser justificadas pelo fato do óleo de coco possuir composição rica em ácidos graxos e possuir em sua maioria, os mesmos lipídios do plasma
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seminal dos ovinos (Cardoso et al. 2011). Estudos sugerem que as fortes ligações dos lipídeos exógenos ocorrem na superfície da membrana, o que promoveria uma barreira física aos danos da congelação e descongelação, prevenindo a fase de separação da membrana por influência do empacotamento, diminuindo assim as temperaturas de transição lipídica e mantendo a integridade e organização da membrana (Ricker et al. 2006).
Adicionalmente, estudos têm demonstrado que o óleo de coco extra virgem, em ratos, melhora a capacidade antioxidante, aumenta as atividades da catalase, superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) no fígado, coração e rins e que também previne o estresse oxidativo, indicado pela diminuição da formação de peroxidação lipídica e oxidação de proteínas (Arunima & Rajamohan 2013). Diante disso, sugere-se que o óleo possui uma ação antioxidante relacionada à atividade da superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), presente no espermatozoide (Agarwal & Prabakaran 2005).
Como observado no presente estudo, o diluente ACP102c adicionado de 10% óleo de coco extra virgem manteve a atividade mitocondrial, a integridade do DNA e os parâmetros cinéticos (inclusive motilidade total) e a viabilidade espermática com valores superiores aos recomendados pelo CBRA (2013), além de ser um meio de conservação livre de produtos de origem animal, podendo assim ser utilizado para exportação de doses de sêmen ovino criopreservados.
CONCLUSÕES De acordo com os dados obtidos neste experimento pode-se concluir que o meio de
conservação ACP-102c adicionado de 10% óleo de coco extra virgem é eficiente na manutenção da qualidade dos espermatozoides ovinos criopreservados. Apresentando-se como um diluente alternativo para programas internacionais de inseminação artificial e transferências de embriões.
Agradecimentos À empresa ACP Biotecnologia, aos Laboratório de Reprodução de Carnívoros, de
Biotecnologia da Reprodução de Peixes e de Tecnologia de Sêmen Caprinos e Ovinos da Universidade Estadual do Ceará, ao Departamento de Física e ao Laboratório de Fisiologia Animal da Universidade Federal do Ceará, ao CNPq, à FUNCAP e à CAPES.
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Tabela 1. Médias ± desvios padrões dos parâmetros cinéticos (MT, VCL, VSL, VAP) de sêmen ovino criopreservado nos meio tris- 20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20% óleo de coco (T4) avaliados pelo SCA
a,b,c Letras minúsculas sobrescritas diferentes na mesma linha significa que houve diferença estatística entre os diluentes (p < 0,05). MT = motilidade, VCL = velocidade curvilinear, VSL = velocidade linear, VAP = velocidade média do percurso. Tabela 2. Médias ± desvios padrões da atividade mitocondrial (3,3’- diaminobenzidine) de
sêmen ovino criopreservado nos meio tris-20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20% óleo de coco (T4)
p > 0,05. Tabela 3. Médias ± desvios padrões da viabilidade (eosina nigrosina) e do DNA íntegro (SCD
test) de sêmen ovino criopreservado nos meio tris-20% gema de ovo (T1), ACP102c-20% gema de ovo (T2), ACP102c-10% óleo de coco (T3) e ACP102c-20% óleo de coco (T4)
a,b Letras minúsculas sobrescritas diferentes na mesma linha significa que houve diferença estatística entre os diluentes (p < 0,05). DNAi = DNA íntegro
Parâmetro/Tratamento T1 T2 T3 T4
MT 68,40±14,25a 44,15±13,20b 32,78±16,72bc 22,58±6,14c
VCL 69,30±14,82a 51,11±13,67ab 56,22±14,0ab 45,29±8,53b
VSL 33,08±5,94a 28,76±12,21a 30,13±10,20a 25,09±6,10a
VAP 44,26±6,63a 38,34±13,45a 38,88±10,22a 33,83±5,16a
DAB/Tratamento T1 T2 T3 T4
I – Alta 50,30±9,12 50,30±15,75 38,10±9,15 37,50±7,44
II –Média 35,10±4,26 34,50±6,72 38,30±5,69 41,80±6,36
III – Baixa 12,70±5,71 12,80±8,89 17,75±5,33 19,80±5,57
IV – Ausente 1,80±1,68 2,40±2,04 1,80±1,60 1,10±1,08
Parâmetro/Tratamento T1 T2 T3 T4
Viabilidade 44,90±4,17a 46,20±9,20a 32,60±12,35ab 24,68±7,07b
SCD (DNAi) 87,70±12,3a 82,00±14,63a 84,90±8,91a 74,70±20,09a
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7 CONCLUSÃO
De acordo com os dados obtidos nesse experimento pode-se concluir
que o meio de conservação ACP-102c adicionado de 10% óleo de coco extra
virgem é eficiente na manutenção da qualidade dos espermatozoides ovinos
criopreservados. Apresentando-se como um diluente alternativo para programas
de inseminação artificial e transferências de embriões.
A ACP102c-10% óleo de coco extra virgem mantém a atividade
mitocondrial, a dispersão da cromatina, a viabilidade e as velocidades linear e
média semelhante ao controle, os dados de motilidade apresentaram-se
superiores aos recomendados pelo CBRA, e além de ser um meio de
conservação livre de produtos de origem animal, possui uma maior praticidade,
podendo assim ser utilizado para exportação de doses de sêmen ovino
criopreservadas.
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62
APÊNDICES
63
APÊNDICE A – Delineamento experimental
64
APÊNDICE B – Quadro com os parâmetros do sperm class analyser
ajustados no experimento para análise do sêmen ovino pós-
descongelação
Parameter Setting
Contraste 100
Brightness 637
Image/second 24
Optic Ph+
Chamber Makler
Scale 10x
Particle size ((µm2)) 10 < 70
Slow (µm/s) > 10
Medium (µm/s) > 45
Rapid (µm/s) > 75
Progressivity 80% of STR
Circular 50% of LIN
Connectivy 12
Velocity on the average path points 5
Numbers of image 25
