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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RENORBIO
KICIA KARINNE PEREIRA GOMES COPELAND
CALOGÊNESE E USO DE FATORES ABIÓTICOS E BIÓTICOS NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA CATINGUEIRA
(Poincianella pyramidalis Tul.)
Salvador - BA
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RENORBIO
KICIA KARINNE PEREIRA GOMES COPELAND
CALOGÊNESE E USO DE FATORES ABIÓTICOS E BIÓTICOS NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA CATINGUEIRA
(Poincianella pyramidalis Tul.)
Salvador - BA
2015
KICIA KARINNE PEREIRA GOMES COPELAND
CALOGÊNESE E USO DE FATORES ABIÓTICOS E BIÓTICOS NA
PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA CATINGUEIRA
(Poincianella pyramidalis Tul.)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Biotecnologia da Rede Nordeste de
Biotecnologia - RENORBIO, Universidade Federal
da Bahia, como requisito para obtenção do título de
Doutora em Biotecnologia.
Orientadora: Dra. Juceni Pereira de Lima David
Coorientadora: Dra. Ana da Silva Lédo
Salvador - BA
2015
iv
v
Dedico este trabalho à minha família, em
especial meu filho e marido, Davi e Klésio
Copeland.
vi
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer ao Deus todo poderoso, por sempre se manter
presente de diversas formas em minha vida, me dando força, coragem e paciência para seguir
toda essa carreira acadêmica. Obrigada Senhor.
Aos meus pais, que sempre se fizeram presentes nos momentos em que eu precisava me
ausentar, devido aos deveres acadêmicos, e que nunca se opuseram em não me ajudar, me
davam segurança e tranquilidade, pois cuidavam, nessas minhas ausências, sempre com muito
amor, do meu bem mais precioso, meu filho Davi. Sei que sem vocês, essa caminhada seria
mais difícil.
Ao meu marido Klésio Copeland, pelo amor, companheirismo, parceria e cumplicidade,
sempre tão presente em minhas caminhadas, torcendo muito por essa conquista, hoje, mais uma
etapa dessa minha vida acadêmica concluída, e eu tenho a certeza, do quão feliz você está,
porque sabe da minha felicidade com a conclusão desse sonho, te amo muito.
E sem falar no grande amor da minha vida, meu Davi, meu filho, minha luz, minha
realização, fez esse meu doutorado ser mais suave e divertido. Amo você meu filho
incondicionalmente.
À minha orientadora, Juceni David, por desde o primeiro contato acreditar em mim, e,
pela confiança no trabalho desenvolvido. Obrigada Ju!
A todos do laboratório de cultura de tecidos de plantas (LabCult) pela alegria diária.
Aos meus amigos mais que especiais, Caroline Machado, Inácio Roque, Leila
Albuquerque, Aparecida Araújo e Bruno Cardoso pelo convívio diário, pelo companheirismo,
união, risadas e risadas, palavras de conforto e força. Muito grata a Deus pela amizade de
vocês. Obrigada e obrigada por tudo.
À Dra. Ana Lédo, pela confiança e carinho desde a minha iniciação científica, obrigada
pelos conhecimentos adquiridos através da sua competência e dedicação no que faz.
À Dra. Ana Veruska, pelo apoio na estrutura física e elaboração do experimento de
variabilidade genética. Bem como, ao técnico de laboratório Sílvio Gomes e a mestranda
Marina da Vitória.
Às amizades que construí durante o doutorado, Luzia Tabosa, Karen Letícia, Daniela
Castro.
Ao Prof. Jorge David pela disponibilidade do laboratório de Química, e aos doutores
Darlan Santos e Rauldenis Almeida, pela ajuda na realização das análises químicas na UFBA.
vii
Ao pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Dr. José Sá, ao técnico agrícola Paulo
Sérgio e ao analista José Figueroa pela ajuda na concessão do material vegetal.
À Embrapa Tabuleiros Costeiros por dispor de uma excelente estrutura física.
À Universidade Federal da Bahia e a Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO),
pela oportunidade da realização deste doutorado.
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
E por fim, gostaria de agradecer a aqueles que não participaram desse caminho
acadêmico, mas que mesmo de fora, sem entender esse processo, torceram muito por mim.
Obrigada pelo carinho.
Muito Obrigada!
viii
GOMES-COPELAND, Kicia Karinne Pereira. Calogênese e uso de fatores abióticos e bióticos
na produção e metabólitos secundários da Catingueira (Poincianella pyramidalis Tul.). 80 f.:
il. 2015. Tese (Doutorado). Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia,
Salvador, 2015.
RESUMO
A Caatinga a alguns anos atrás era dita como um ecossistema pobre no que tange a espécies
endêmicas, fato esse que, após diversos estudos, são contestados, mostrando que possui uma
rica biodiversidade e altos índices de endemismos. Dentre essas muitas espécies endêmicas,
temos a Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz, sinônimo botânico Caesalpinia
pyramidalis Tul., conhecida por diversos nomes populares como pau-de-rato, catinga de porco,
catingueira, dentre outros. Apresenta diversos usos, dentre um dos mais importantes, o seu uso
medicinal que, destaca-se pela produção de compostos bioativos como flavonoides, triterpenos,
fenilpropanoides e biflavonóides; sendo este último grupo de bioativos, relativamente raro na
família Leguminosae e, na subfamília Caesalpinaceae, onde foi isolado pela primeira vez. No
perfil químico dessa espécie já foram identificadas a amentoflavona e agatisflavona
pertencentes à classe dos biflavonóides. Fatores tais como, condições geográficas,
sazonalidade, ambiente, entre outros, provocam oscilação na concentração de metabólitos
secundários e, em árvores da Caatinga, em períodos de seca, a coleta do material vegetal é
prejudicada, uma vez que não há frutos, folhas, flores, para extração de metabólitos secundários
em qualquer época do ano. Assim, esses aspectos demonstram a necessidade urgente de
implementação de programas voltados para a multiplicação, conservação, produção e
potencialização dos bioativos de interesse de espécies vivendo nesses ambientes. Diante do
exposto, esse trabalho teve como objetivos estabelecer a calogênese in vitro de P. pyramidalis
visando construir um protocolo de produção da amentoflavona e agatisflavona, bem como,
testar diferentes tipos de fontes de carbono, ausência/presença de luz, acessos e, diferentes
concentrações de 2,4-D combinados ao meio de cultivo, no intuito de aumentar a produção de
amentoflavona e agatisflavona a partir de cultura de calos de P. pyramidalis. Os estudos
mostraram que o 2,4-diclorofenoxiacético induz calos em explantes nodal, foliar e internodal
de P. pyramidalis e, que concentrações de 6,28 mg.L-1, 6,49 mg.L-1 e 4,91 mg.L-1 de 2,4-D nos
segmentos nodal, internodal e foliar, respectivamente, favorecem a maior formação de calos
aos 30 dias. Além disso, pode-se verificar que concentração de 10 mg.L-1 de 2,4-D proporciona
ix
maior oxidação nos calos aos 30 dias de cultivo, sendo que a maior formação de calos ocorre
na concentração de 4,91 mg.L-1 de 2,4-D para o explante foliar aos 30 dias de cultivo in vitro.
O acesso de Pernambuco, produz uma maior biomassa (0,1882 g) dos calos de Catingueira. No
entanto, em ambos os acessos (BA e PE), a produção de amentoflavona é maior do que da
agatisflavona em todos os tratamentos. Pode-se ainda verificar que a maior biomassa em calos
de P. pyramidalis ocorre no tratamento com sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D e, que o período de
tempo de 60 dias é ideal para a produção da biomassa em calos de P. Pyramidalis; sendo que
Sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D favorece uma maior produção de amentoflavona (16,44 mg.L-1)
e agatisflavona (0,58 mg.L-1). Enquanto que, o tratamento GT3 (Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1
mg.L-1 de 2,4-D) é ótimo para a biossíntese de agatisflavona (5,87 mg.L-1) e amentoflavona
(6,27 mg.L-1) aos 70 dias após inoculação. A biossíntese da amentoflavona é superior a
agatisflavona em todos os tratamentos estudados.
Palavras-Chave: Poincianella pyramidalis, cultura de tecidos, metabólitos secundários,
amentoflavona, agatisflavona, variabilidade genética.
x
GOMES-COPELAND, Kicia Karinne Pereira. Callus formation and use of abiotic and biotic
factors in production of Catingueira secondary metabolites (Poincianella pyramidalis Tul.). 80
f.: il. 2015. Thesis (Ph.D.). Institute of Health Sciences, Universidade Federal da Bahia,
Salvador, 2015.
ABSTRACT
A few years ago, the caatinga was said to be a poor ecosystem with respect to endemic species,
a fact that, after several studies, are contested showing that boasts a rich biodiversity and high
levels of endemism. Among these many endemic species, Poincianella pyramidalis (Tul.) L.
P. Queiroz, botanical synonymous Caesalpinia pyramidalis Tul., known by several common
names as pau-de-rato, catinga de porco, catingueira, among others. This specie has several uses,
among the most important, its medicinal use that stands out for the production of bioactive
compounds such as flavonoids, triterpenes, phenylpropanoids and bioflavonoids. The latter
bioactive group is relatively rare in the Leguminosae family and the subfamily Caesalpinaceae,
which was first isolated. In the chemical profile of this specie have been identified
amentoflavone and agatisflavone, compounds belonging to the biflavonoid groups. Among
other factors, geographical conditions, seasonality, environment cause during dry periods,
fluctuation in the concentration of secondary metabolites in the Caatinga trees, and, the
collection of plant material is impaired, since there is no fruit, leaves and flowers for extraction
of secondary metabolites in any season. These aspects demonstrate the urgent need for
implementation of programs for multiplication, conservation, production and enhancement of
bioactive interest species living in these environments. Thus, this study aimed to establish the
in vitro callus formation of P. pyramidalis in order to build a protocol of amentoflavone and
agatisflavone, productions as well as to test different types of carbon sources, absence/presence
of light, access and different 2,4-D concentrations to the culture medium combinations to
increase the production of amentoflavone and agatisflavone from culture of callus of P.
pyramidalis. The studies showed that 2,4-dichlorophenoxyacetic induces callus of P.
pyramidalis nodal, leaf and internodal explants, and that 2,4-D concentrations of 6.28 mg.L-1,
6.49 mg.L-1 and 4.91 mg.L-1, in the nodal, internodal and leaf segments, respectively, favor
higher callus formation at 30 days. Moreover, it can be seen that 2,4-D concentration of 10
mg.L-1 provides increased oxidation in callus after 30 days of cultivation, and the higher callus
formation occurs at a 2,4-D concentration of 4.91 mg.L-1 to the leaf explant at 30 days of in
xi
vitro culture. The Pernambuco access produces a greater biomass (0.1882 g) of Catingueira
calluses. However, in both access (BA and PE), the production of amentoflavone is greater than
the agatisflavona in all treatments. It´s also observed that the higher biomass in P. pyramidalis
callus occurs upon treatment with sucrose + 2,4-D 5 mg.L-1, and the 60 day time period is
optimal for biomass production in P. Pyramidalis calluses; wherein Sucrose + 2,4-D 5 mg.L-1
favors an increased production of amentoflavone (16.44 mg.L-1) and agatisflavone (0.58 mg.L-
1). While the GT3 treatment (Light - Glucose 30 mg.L-1 + 2,4-D 1 mg.L-1) is great for
agatisflavona biosynthesis (5.87 mg.L-1) and amentoflavone (6,27 mg.L-1) at 70 days after
inoculation. The biosynthesis of amentoflavone is greater than agatisflavone in all treatments.
Keywords: Poincianella pyramidalis, tissue culture, secondary metabolites, amentoflavone,
agatisflavone, genetic variability.
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição geográfica do bioma Caatinga. IBGE,
2004.....................................................................................................................6
Figura 2: Fotos da árvore da Poincianella pyramidalis, nos períodos chuvosos e de
estiagem. Foto: belezadacaatinga.blogspot.com, 2015.......................................8
Figura 3: Fotos das folhas, frutos e flores da P. pyramidalis. Foto:
belezadacaatinga.blogspot.com, 2015................................................................9
Figura 4: Forma explorada comercialmente da P. pyramidalis para fins medicinais, no
Mercado Municipal Albano Franco, Aracaju, SE. Foto: Kicia Gomes-
Copeland...........................................................................................................10
Figura 5: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários..............................................14
Figura 6: Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários. Fonte:
Gobbo Meto Lopes (2007)...............................................................................21
Figura 7: Oxidação de calos em explantes nodal, internodal e foliar de P. pyramidalis aos
30 (A) e 60 (B) dias após inoculação...............................................................34
Figura 8: (A) Aspecto de formação de calo compacto com poucas áreas friáveis de P.
pyramidalis aos 60 dias de cultivo in vitro. (Barra=0,5cm); (B) Micrografia
eletrônica de varredura mostrando calo de P. pyramidalis. Barras (Barra= 100
µm). Fotos: Kicia Gomes-Copeland (A), Caroline Machado (B)....................36
Figura 9: Porcentagem de explantes nodal, internodal e foliar de Poincianella
pyramidalis, responsivos à indução de calos em função da concentração de 2,4-
D aos 30 (A) e 60 (B) dias após inoculação.....................................................37
Figura 10: Notas de intensidade de formação de calos nos explantes nodal, internodal e
foliar de P. pyramidalis aos 30 (A) e 60 (B) dias.............................................38
Figura 11: Produção de massa fresca dos calos em explantes foliares de P. pyramidalis em
função de diferentes concentrações de 2,4-D....................................................41
Figura 12: Massa fresca dos calos em explantes foliares de P. pyramidalis oriundos de dois
acessos, Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco........................................42
Figura 13: Produção de amentoflavona e agatisflavona em cultura de calos de P.
pyramidalis, aos 60 dias após inoculação, em diferentes concentrações de 2,4-
D, nos acessos da Bahia (A) e Pernambuco (B)...............................................43
xiii
Figura 14: Produtos de amplificação de ISSR gerados em indivíduos de P. pyramidalis de
ocorrência nos municípios de Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco......45
Figura 15: Calos de P. pyramidalis aos 60 dias após inoculação, em seis diferentes
tratamentos: T1 – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T2 – Frutose 30 g.L-1 +
5 mg.L-1 de 2,4-D; T3 – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T4 – Glicose 30
g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T5 – Sacarose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T6 –
Sacarose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D. Foto: Kicia Gomes-Copeland.............47
Figura 16: Produção de amentoflavona e agatisflavona em cultura de calos de P.
pyramidalis, aos 60 dias após inoculação, com diferentes fontes de carbono e
concentrações de 2,4-D.....................................................................................49
Figura 17: Cromatograma dos padrões da agatisflavona e amentoflavona (A); UV/VIS dos
padrões da agatisflavona (B) e amentoflavona (C)...........................................51
Figura 18: Cromatogramas da agatisflavona e amentoflavona e seus respectivos UV/VIS
referentes aos tratamentos de glicose + 1 mg.L-1 de 2,4-D (A1 e A2); sacarose +
1 mg.L-1 de 2,4-D (B1 e B2); sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D (C1 e C2)............53
Figura 19: Efeito da glicose e frutose na produção da massa dos calos aos 20, 40 e 60 dias
após inoculação da P. pyramidalis. Médias seguidas de mesma letra não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade...........................................54
Figura 20: Efeito das condições de luminosidade na produção da massa nos calos aos 20,
40 e 60 dias após inoculação de P. pyramidalis. Médias seguidas de mesma letra
não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade......................56
Figura 21: Concentrações da agatisflavona nos calos de Poincianella pyramidalis aos 40,
60 e 70 dias após inoculação, submetidos a diferentes tratamentos.
Tratamentos: Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT1); Claro – Glicose 30
g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT3); Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT2);
Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT4)................................................57
Figura 22: Concentrações da amentoflavona nos calos de Poincianella pyramidalis aos 40,
60 e 70 dias após inoculação, cultivados em diferentes tratamentos.
Tratamentos: Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT1); Claro – Glicose 30
g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT3); Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT2);
Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT4)...............................................58
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Compostos químicos predominantes na espécie Poincianella pyramidalis
encontrados em diferentes partes da planta (Mendes et al., 2000; Bahia et al.,
2005; Bahia et al., 2010).....................................................................................11
Tabela 2: Algumas estratégias para aumentar a produção de metabólitos secundários em
células vegetais e cultura de órgãos otimizando o meio de cultura. Fonte: Murthy
et al. (2014).........................................................................................................18
Tabela 3: Iniciadores ISSR testados, sendo a base Y (C,T) e R (A, G).............................27
Tabela 4: Número de fragmentos gerados pelas reações de ISSR em dois acessos de
Catingueira..........................................................................................................45
Tabela 5: Efeito de diferentes fontes de carbono combinados com duas concentrações de
2,4-D na produção de massa em calos de P. pyramidalis. Média seguida de
mesma letra minúscula na coluna para tratamentos e, maiúsculas na linha para
tempo, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade............48
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2,4-D Ácido 2,4-dicloofenoxiacético
AIA Ácido indolácetico
ANA Ácido naftaleno acético
MS Murashige & Skoog
ISSR Inter Repetições de Sequências Simples
PCR Polymerase Chain Reaction
CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético
HPLC/DAD High Perfomance Liquid Chromatography/Diode-array-detector
UV/VIS Ultravioleta/Visível
ANAVA Análise de Variância
CV Coeficiente de Variação
RNA Ácido Ribonucleico
DNA Ácido Desoxirribonucleico
GT1 Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D
GT3 Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D
FT2 Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D
FT4 Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D
xvi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL................................................................................ 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................... 5
2.1 Biotecnologia.................................................................................................... 5
2.2 Bioma Caatinga................................................................................................. 6
2.3 Aspectos gerais sobre a espécie Poincianella pyramidalis.............................. 7
2.4 Química do gênero Poincianella....................................................................... 9
2.5 Uso da cultura de tecidos de plantas na produção de metabólitos secundários 12
2.6 Estratégias aplicadas ao cultivo in vitro de plantas para aumentar a produção
dos metabólitos secundários
15
2.7 Biflavonóides na espécie Poincianella pyramidalis......................................... 19
2.8 Fatores que interferem no metabolismo secundário de plantas........................ 20
2.9 Variabilidade Genética..................................................................................... 22
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 24
3.1 Material vegetal................................................................................................. 24
3.2 Germinação in vitro das sementes de Poincianella pyramidalis...................... 24
3.3 Estabelecimento in vitro e calogênese em diferentes explantes de Poincianella
pyramidalis
24
3.4 Produção de biflavonóides e de massa dos calos de Poincianella pyramidalis
provenientes de regiões do Nordeste Brasileiro
25
3.5 Análise de diversidade genética entre espécies de Poincianella pyramidalis
oriundas de duas regiões do Nordeste Brasileiro
25
3.5.1 Material vegetal................................................................................................. 25
xvii
3.5.2 Extração de DNA.............................................................................................. 26
3.5.3 Quantificação e diluição do DNA.................................................................... 26
3.5.4 Iniciador e amplificação................................................................................... 27
3.5.4.1 Inter Sequencias Simples Repetidas (ISSR)..................................................... 27
3.5.4.2 Eletroforese, visualização e fotodocumentação dos géis.................................. 27
3.5.4.3 Análise estatística............................................................................................. 28
3.6 Efeito da interação de diferentes carboidratos com 2,4-D para a produção de
amentoflavona e agatisflavona em calos de Poincianella pyramidalis
30
3.6.1
Preparação dos extratos de Poincianella pyramidalis provenientes de calos.... 30
3.7 Efeito dos fatores abióticos na produção de biflavonóides e massa dos calos
da espécie Poincianella pyramidalis
33
3.8 Análise estatística.............................................................................................. 33
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................
34
4.1 Estabelecimento in vitro e calogênese em diferentes explantes de Poincianella
pyramidalis
33
4.2 Produção de biflavonóides e de massa nos calos de Poincianella pyramidalis
em duas regiões provenientes do Nordeste Brasileiro
40
4.3
Efeito da interação de diferentes carboidratos com 2,4-D para a produção de
amentoflavona e agatisflavona em calos de Poincianella pyramidalis
46
4.4 Efeito dos fatores abióticos na produção de biflavonóides e massa dos calos
da espécie Poincianella pyramidalis
55
5 CONCLUSÕES................................................................................................ 60
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 62
xviii
ANEXO............................................................................................................. 79
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A caatinga a alguns anos atrás era dita como um ecossistema pobre no que tange a
espécies endêmicas. No entanto, diversos estudos contestam esses fatos, mostrando que a
Caatinga possui uma rica biodiversidade e altos índices de endemismos, com um mínimo de
318 espécies de plantas endêmicas (Gariglio et al., 2010). Sua biodiversidade ampara várias
áreas econômicas, especialmente nos ramos farmacêutico, cosmético, químico e de alimento
(MMA, 2014). Dentre essas muitas espécies endêmicas, temos a Poincianella pyramidalis
(Tul.) L. P. Queiroz, sinônimo botânico Caesalpinia pyramidalis Tul., conhecida por diversos
nomes populares, tais como, pau-de-rato, catinga de porco, catingueira, dentre outros. Essa
espécie tem ocorrência no Maranhão e, do Ceará até a Bahia, com uma disjunção no Estado do
Amazonas (Queiroz, 2009), que carece de estudos, uma vez que é uma planta de rápido
crescimento, após o período de seca, e com bom potencial de rebrota, tornando-se interessante
para a primeira e segunda fase de recomposição florestal mista de área degradada.
Naturalmente essa espécie se propaga por sementes. No entanto, sua população tem sido
afetada devido a coleta extrativista inadequada de uso, pois as folhas, flores e cascas do caule
são as mais utilizadas no uso medicinal pela população em infecções catarrais, nas diarreias,
hepatite e anemias, além do uso da sua madeira para obtenção de lenha e carvão (Queiroz, 2009;
Maia, 2012). O uso medicinal destaca-se pela produção de compostos bioativos como
flavonóides, triterpenos, fenilpropanóides e biflavonóides, sendo este último grupo de
metabólitos especiais, relativamente raro na família Leguminosae e, na subfamília
Caesalpinaceae. (Bahia et al., 2005).
Nessa espécie já foram identificadas a amentoflavona e agatisflavona (Bahia, 2005),
pertencentes à classe dos biflavonóides. Estas substâncias merecem destaque, em razão dos
inúmeros trabalhos científicos que demonstram suas atividades farmacológicas, sendo estas,
fortes candidatas para o controle da epilepsia (Svenningsen et al., 2006); atividades antivirais
(Lin et al., 1999; Lin et al., 1997); e um grande potencial antineoplásico (Chen et al., 2005; Lin
et al., 2000; Silva et al., 1995; Lin et al., 1989).
Sendo uma árvore da Caatinga, a espécie P. pyramidalis perde suas folhas na estação
seca, rebrotando apenas no início das chuvas, com floração acontecendo na época de transição
seca-chuvosa e chuvosa, seguida pela frutificação, dificultando assim, trabalhos envolvendo a
produção de princípios ativos de interesse da indústria farmacêutica (Maia, 2012). Dessa forma,
torna-se inviável obter, a qualquer momento, material vegetal dessa espécie para a extração de
metabólitos secundários que tenham relevância do ponto de vista terapêutico, uma vez que a
2
produção de metabólitos especiais realizada pela espécie in natura apresenta diversas
desvantagens, tais como, rendimentos baixos e, alterações nas concentrações desses metabólitos
devido às variações geográfica, sazonal e ambiental (Murthy et al., 2014).
Diante do exposto, a cultura de tecidos de plantas torna-se uma aliada importante, no
que tange a produção de material vegetal em qualquer época do ano, bem como uma possível
potencialização dos bioativos ou mesmo, produzir compostos que, por algum impedimento, não
são sintetizados. Permitindo ainda, estabelecer protocolos padrão para a multiplicação massal
de várias espécies (Morais et al., 2012). Com isso, a produção de metabólitos secundários
associada a cultura de tecidos de plantas, vem sendo amplamente estudada (Charlet et al., 2000).
Recentemente, essa técnica tem recebido uma maior atenção para a produção de compostos
bioativos em plantas específicas, que têm aplicações em produtos farmacêuticos, cosméticos e
indústrias de nutracêuticos (Rao e Ravishankar, 2002).
Embora a Catingueira apresente um grande potencial, principalmente, químico e
farmacológico, estudos que envolvam morfogênese in vitro de espécies florestais nativas, ainda
são escassos (Oliveira et al., 2013). Raros são os relatos sobre P. pyramidalis, sendo mais
encontrados trabalhos na literatura para espécies do mesmo gênero, tais como, a Caesalpinia
echinata Lam. (Werner et al., 2007, 2009, 2010; Barbosa et al., 2014), Caesalpinia bonduc (L.)
Roxb (Cheruvathur et al., 2010). A relevância desses aspectos demonstra a necessidade urgente
de implementação de programas voltados para a multiplicação, conservação e produção de
bioativos dessa espécie.
Dessa forma, para aumentar a produtividade de metabólitos especiais de interesse nos
vegetais, são utilizadas diversas estratégias, tais como, melhoramento de cepas, otimização de
meios de cultura, nutrientes e precursor de alimentação, permeabilização, imobilização,
métodos de biotransformação e elicitores (Murthy et al., 2014). Esta última estratégia citada,
vem sendo amplamente usada como uma técnica eficiente para este fim (Bourgaud et al., 2001),
pois em paralelo com a cultura de tecidos de plantas, é possível incrementar a produção de
metabólitos secundários de interesse agrícola, farmacêutico e alimentar (Qin e Lan, 2004),
embora, seus mecanismos de reação de alguns elicitores ainda não sejam muito bem
compreendidos (Namdeo, 2007).
Sendo assim, carboidratos e reguladores de crescimento são utilizados como alternativas
para aumentar a produção dos metabólitos secundários em cultura de tecidos de plantas e células
vegetais in vitro. Partindo do princípio que a modificação dos nutrientes básicos do meio de
cultivo, pode elevar a produção desses compostos, então, ao alterar as concentrações e o tipo
da fonte de carbono e, reguladores de crescimento, como o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-
3
D), por exemplo, pode-se ter um forte efeito sob o acúmulo desses bioativos na cultura de calos.
Em outras palavras, o efeito do açúcar no produto de biossíntese secundária, poderia resultar
em uma entrada específica de carbono, ou refletir numa mudança do metabolismo devido a
alterações no equilíbrio geral do balanço carbono/nitrogênio, dependendo, evidentemente, do
tipo de açúcar utilizado (Ong et al., 2011). E, apesar da sacarose ser o açúcar mais utilizado na
cultura de tecidos de plantas, sabe-se que é rapidamente hidrolisado em glicose e frutose, duas
hexoses que podem ser adicionadas ao meio de cultivo de calos para que ajam de maneira
similar à sacarose, podendo ainda melhorar o desenvolvimento e acúmulo de bioativos nos
calos, já que a captação é independente, e não possui qualquer efeito da glicose em relação a
frutose e vice-versa (Botha e O´Kennedy, 1998). A biossíntese de Paclitaxel por cultura de
células foi melhorada quando se adicionou frutose ao meio (Hirasuna et al., 1996).
Entretanto, a concentração utilizada desses dois açúcares, precisa ser bastante testada e
estudada, para saber qual o efeito no tecido da planta, uma vez que pode conduzir a uma
acumulação no meio, gerando um desequilíbrio, que pode ser em virtude da incapacidade das
células em utilizar eficazmente a frutose, por exemplo (Botha e O´Kennedy, 1998). Mas,
embora esses problemas no metabolismo possam ocorrer, ainda assim, o uso desses elicitores
pode ser, uma estratégia importante para a melhoria do rendimento da massa dos calos, como
também na síntese de metabólitos secundários.
A produção de metabólitos secundários em culturas de calos é controlada por fatores
ambientais e de material vegetal. E os reguladores de crescimento, tais como o uso de auxinas,
o ácido 2,4-diclorofenoxiacético, por exemplo, é, geralmente, o mais recomendado na indução
de calos em tecidos de plantas (George et al., 2008), uma vez que demonstra uma notável
influência no crescimento, diferenciação e no metabolismo das células em cultura. Esta por ser
uma auxina mais ativa, pode substituir a auxina natural presente nas plantas, o ácido
indolacético (AIA) que em meios de cultura é rapidamente oxidado. Pois calos com diferentes
taxas de crescimento e níveis de diferenciação (friáveis, compactos) podem diferir na
capacidade de sintetizar compostos bioativos (Navroski et al., 2012). De acordo com
Chinnamadasamy et al. (2010), com aumento do nível de 2,4-D no meio de cultivo para
Catharanthus roseus L. ocorreu acumulação de vincristina. Com isso, está claro que o efeito
sobre o acúmulo de metabólitos secundários em plantas vai depender do tipo de auxina e das
concentrações utilizadas.
É importante salientar que, diante do exposto, essa espécie está sob pressão antrópica e
pode se tornar extinta, assim, a P. pyramidalis precisa de um bom programa de conservação da
floresta a fim de obter sua proteção genética (Santos et al., 2012), bem como, exploração
4
racional da espécie. Portanto, conhecer a variabilidade genética dessa planta, pode ser essencial
para a sobrevivência a longo prazo, além de ser útil na compreensão da estrutura, relações
evolutivas, taxonomia, demografia da espécie além de, identificar características genéticas
interessantes para usos futuros. A forma mais utilizada para verificar a distribuição da
variabilidade genética em populações naturais, é com o uso de marcadores moleculares. O ISSR
(Inter Repetições de Sequências Simples) é um tipo de marcador, que apresenta vantagem em
virtude da sua simplicidade, aplicabilidade em um grande número de espécies sem
conhecimento prévio das suas sequências de DNA, por permitirem a análise de um grande
número de locos e, por fim, produzirem fragmentos com grande reprodutibilidade (Silva et al.,
2011).
Assim, esse trabalho teve como objetivos estabelecer a calogênese in vitro de plantas de
Poincianella pyramidalis e, testar diferentes tipos de fontes de carbono, ausência/presença de
luz, acessos e, diferentes concentrações de 2,4-D combinados ao meio de cultivo, no intuito de
aumentar a biomassa dos calos e o acúmulo de amentoflavona e agatisflavona.
Palavras-Chave: Poincianella pyramidalis, cultura de tecidos, metabólitos secundários,
amentoflavona, agatisflavona, variabilidade genética.
5
2. REVISÃO BIBLIOGRÁGICA
2.1. Biotecnologia
O desenvolvimento sustentável de um país depende essencialmente de uma política
consistente de educação, ciência, tecnologia e inovação, sustentada na preservação da natureza,
na biodiversidade e na exploração racional de fontes naturais necessárias para alimentação,
avanço social e econômico, num cenário que assegura a manutenção da saúde e a cura de
doenças (Braz Filho, 2010). Ou seja, a necessidade exige e a ciência busca a unificação do
progresso com aquilo que a natureza oferece, respeitando a cultura do povo em torno do uso de
produtos ou ervas medicinais para curar os males.
Portanto, a biotecnologia surge como uma ferramenta moderna, para promover esses
avanços no setor da terapêutica, no aumento da produtividade do setor agrícola, na geração de
novas técnicas de controle biológico, além de melhorar o teor nutritivo dos alimentos, dentre
outros (MCT, 2009). E essa ferramenta atualmente, é considerada, no Brasil e no cenário
mundial, como uma área estratégica para o desenvolvimento econômico de países
desenvolvidos e em desenvolvimento. O Brasil identificou a biotecnologia como uma das áreas
estratégicas que poderá contribuir para o desenvolvimento tecnológico do País e,
consequentemente, o seu bem-estar social e desenvolvimento socioeconômico (Brasil, 2015).
Nesse contexto, as engenharias genética, metabólica e de micropropagação se somam
para otimizar a produção de metabólitos secundários. Assim, atualmente, o uso dessas
ferramentas citadas torna-se cada vez mais importante no aumento de constituintes ativos tanto
na pesquisa como nas indústrias farmacêuticas (Zabala et al., 2009), uma vez que, o mercado
de produtos naturais cresce exponencialmente a cada ano. No entanto, apesar dos avanços
alcançados na área de biotecnologia vegetal para produção de metabólitos secundários de
interesse, infelizmente, as taxas obtidas não atingem a aplicação comercial (Vasconsuelo e
Boland, 2007).
Portanto, a biotecnologia na área de produtos naturais, é importante e necessária, haja
vista que essa tecnologia poderá trazer uma variedade de produtos farmacêuticos de grande
interesse socioeconômico, uma vez que a necessidade por novas e mais potentes drogas são
demandadas a cada ano.
6
2.2. Bioma Caatinga
O Brasil ocupa uma área de cerca de 8,5 milhões de km2, abrangendo várias zonas
climáticas, como por exemplo o trópico úmido do Norte, o semiárido do Nordeste e as áreas
temperadas do Sul. Estas diferenças climáticas levam às grandes variações ecológicas,
formando biomas distintos, como a caatinga (MMA, 2014).
Figura 1: Distribuição geográfica do bioma Caatinga. IBGE, 2004.
A Caatinga ocupa, aproximadamente, 844.453 km2 de área (Figura 1, p. 6), o que
equivale a 9,9% do território nacional ou 55,6% do Nordeste (IBGE, 2004). Exclusivamente
brasileira, engloba todos os estados do Nordeste e o norte de Minas Gerais (MMA, 2014).
Assim, a caatinga caracteriza-se por apresentar clima semiárido, dispondo de abundante área
luminosa durante todo o ano e temperaturas elevadas (médias anuais de 27 ºC a 29 ºC).
Apresenta baixos índices pluviométricos, em torno de 500 mm a 700 mm anuais, e solos rasos
e pedregosos, que tem baixa capacidade de acumular água (Silva et al., 2003; Neto, 2009;
Sampaio, 2010). Relevo com planaltos, depressões e planícies, e sua rede fluvial composta por
muitos rios temporários, que devido ao clima, passam boa parte do ano secos (Ribeiro et al.,
2008). Sampaio (2010) acrescenta ainda que esse bioma apresenta plantas herbáceas anuais
7
com suculência, acúleos e espinhos ou, predominância de arbustos e arvoretas, com cobertura
descontínua de copas.
Apesar da sua aparente fragilidade, a Caatinga possui uma rica biodiversidade e altos
índices de endemismo, sendo cerca de 1512 espécies vegetais e, dentre essas, no mínimo 318
endêmicas (Gariglio et al., 2010).
Sua biodiversidade ampara várias áreas econômicas, especialmente nos ramos
farmacêutico, cosmético, químico e de alimento (MMA, 2014). Mas, apesar de toda essa
importância econômica e de posição única no mundo, já que dispõe de um considerável número
de espécies endêmicas e, que deveriam ser consideradas como um patrimônio biológico de valor
incalculável, esse bioma não vem tendo a devida importância pelo poder público, que a coloca
em segundo plano (Nea, 2011; Kill, 2011). O maior exemplo disso, é que a Constituição Federal
de 1988, em seu artigo 225, não inclui o Cerrado e a Caatinga na lista de biomas brasileiros
designados como Patrimônios Nacionais (Maciel, 2010). A prova disso são o desmatamento de
cerca de 46% dessa área, e a exploração de fauna e flora de forma ilegal e insustentável (MMA,
2014). No entanto, a caatinga diante de toda sua flora “sofrida”, nos traz alternativas a
tratamentos convencionais, tendo como base o conhecimento construído pelas famílias que lá
se encontram. Nesse contexto, estudos etnodirigidos e pesquisas com plantas medicinais estão
demostrando a sua importância. Ressalta-se que, em um desses estudos identificou-se que num
total de 126 espécies utilizadas como medicinais, seis pertenciam ao gênero Poincianella (Agra
et al. 2008). E dentro desse gênero, a P. pyramidalis é ainda uma das espécies que carecem de
estudos, pois apresenta múltiplas utilidades, tais como, potencial madeireiro, medicinal, uso
veterinário, restauração florestal, forragem para gado e aplicações industriais (Maia, 2012).
2.3. Aspectos gerais sobre a espécie Poincianella pyramidalis
Poincianella pyramidalis (Tul.) L. P. Queiroz, sinônimo botânico Caesalpinia
pyramidalis Tul., é uma espécie presente no bioma Caatinga pertencente à família
Leguminosae, subfamília Caesalpinioideae (Figura 2, p. 8). Conhecida por diversos nomes
populares tais como, catinga-de-porco, catingueira-das-folhas-largas, mussitaiba, pau-de-
porco, pau-de-rato e catingueira, este último devido ao cheiro desagradável de suas folhas
verdes (Queiroz, 2009).
Esta planta é descrita como uma árvore de porte médio, sem espinhos, com 4-6 metros
de altura, podendo atingir 12 metros. Esta possui copa aberta e irregular, ramos verdes, com
abundantes lenticelas esbranquiçadas e, sua casca é de cor cinza-claro, às vezes levemente
8
castanho, largando a camada superficial em lâminas um pouco alongadas, de bordo irregular,
dando à casca um aspecto liso com coloração de “camuflagem”, com manchas de cor amarelo,
verde e branco. As folhas da P. pyramidalis são bipinadas, com 5-11 folíolos alternos ou
opostos, 1-3 cm nas folhas de ramos adultos e com menos de 1 cm em folhas de rebrotos, sendo
que as folhas novas têm coloração rosada e, só depois de se tornarem verdes apresentam um
cheiro desagradável, característico. Essa espécie possui flores amarelas, dispostas em racimos
curtos e, o fruto é uma vagem achatada, pontada, de 8-11 cm de comprimento e 2 cm de largura,
de cor castanho claro, contendo 5-7 sementes (Figura 3, p. 9). A madeira branco-amarelada com
cerne escuro, muito pesada, contendo grandes quantidades de lignina e celulose (Maia, 2012).
Figura 2. Fotos da árvore da P. pyramidalis nos períodos chuvosos e de estiagem. Fotos:
belezadacaatinga.blogspot.com, 2015.
A catingueira tem ocorrência no norte e nordeste do Brasil, sendo encontrada no
Maranhão e, do Ceará até a Bahia, com uma disjunção no estado do Amazonas (Queiroz, 2009).
Considerada endêmica da Catinga, ela pode ser encontrada em diversas associações vegetais,
crescendo tanto nas várzeas úmidas, onde chega a atingir 10 metros de altura, ou, como no
Seridó do semiárido, quando reduz-se a arbustos de menos de dois metros de altura (Maia,
2012). Devido a essas caraterísticas e facilidade em ser encontrada, tem-se essa espécie como
uma das que mais contribuem para fisionomia desse Bioma.
9
Figura 3. Fotos das folhas, frutos e flores da P. pyramidalis. Fotos:
belezadacaatinga.blogspot.com, 2015.
A espécie P. pyramidalis perde suas folhas na estação seca e, é uma das primeiras
árvores a rebrotar com o início das chuvas, isso ocorre em, aproximadamente, 30 dias após o
começo da estação chuvosa. A floração ocorre na época de transição seca-chuvosa e chuvosa,
seguida pela frutificação (Maia, 2012). A propagação se dá por sementes, e a germinação ocorre
dentro de uma ou duas semanas. Devido ao tipo de madeira que oferece, pode ser usada como
lenha, carvão, estacas, mourões, na construção de casas de taipa, como também para a produção
de álcool combustível e coque metalúrgico. Na medicina popular as folhas, flores e cascas são
utilizadas no tratamento das infecções catarrais, nas diarreias, hepatite e anemia. Em animais
domésticos, no tratamento de verminoses. Além disso, por ser uma planta de crescimento rápido
e com bom potencial de rebrota, é indicada para a primeira e segunda fase de recomposição
florestal mista de áreas degradadas (Queiroz, 2009; Maia, 2012).
2.4. Química do gênero Poincianella
A utilização de plantas para curar os mais diversos males é tradicionalmente conhecida
e utilizada desde sempre pela espécie humana, mostrando ser uma atividade atávica dessa
espécie e de outros primatas. A origem, portanto, desse conhecimento, confunde-se com a
própria história da humanidade. A busca pela indústria farmacêutica por novas drogas cresce,
sendo que os vegetais são uma excelente fonte dessas novas substâncias bioativas, pois
oferecem uma vasta diversidade molecular de produtos naturais e, a demonstração do interesse
nesses compostos, pode ser verificado pelo grande avanço científico envolvendo os estudos
10
químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos compostos com
propriedades terapêuticas (Cavalheiro et al., 2009).
Nesse contexto, o gênero Poincianella possui espécies que sintetizam algumas dessas
moléculas bioativas importantes para a indústria farmacêutica, sendo comprovada atividades
biológicas interessantes, tais como a ação como antibióticos (Saaede e Sabir, 2001) e
antidiabéticos para a P. bonducella (Sharma et al., 1997), antimaláricos (Kuria et al. 2001; para
P. volkensii e P. pluviosa (Deharo et al., 2001), anti-inflamatória (Hikino et al., 1997; Carvalho
et al., 1996) para P. sappan e P. ferrea. Além disso, as espécies desse gênero são amplamente
utilizadas na medicina popular, como por exemplo P. pyramidalis que é usada para tratar a
tosse, bronquite, infecção respiratória, asma, gastrite, cólica, febre, azia, diarreia, diabetes, dor
de estômago, além de ser usada como um afrodisíaco (Albuquerque et al., 2007) (Figura 4, p.
10).
Figura 4. Forma explorada comercialmente da P. pyramidalis para fins medicinais, no Mercado
Municipal Albano Franco, Aracaju, SE. Fotos: Kicia Gomes-Copeland.
Os constituintes químicos relatados do gênero Caesalpinia totalizam 280 compostos,
incluindo diterpenos, triterpenos, flavonóides, fenóis aromáticos, fenilpropanóides,
biflavonóides, dentre outros (Wu et al., 2011). A Tabela 1 (p. 11) apresenta algumas estruturas
químicas encontradas na espécie em estudo, Poincianella pyramidalis.
11
Tabela 1. Compostos químicos predominantes na espécie P. pyramidalis encontrados em
diferentes partes da planta (Mendes et al., 2000; Bahia et al., 2005; Bahia et al., 2010).
12
Apesar da diversidade de metabólitos especiais da espécie P. pyramidalis, para este
trabalho de pesquisa foram estudados apenas dois desses compostos, a agatisflavona e
amentoflavona, biflavonóides que apresentam um alto potencial farmacológico, uma vez que,
pesquisas demonstraram que esses compostos suprimem a expressão de moléculas pró-
inflamatórias. Portanto, devido a esta propriedade única, biflavonóides são promissores como
drogas anti-inflamatórias, especialmente para tratamento de doenças inflamatórias crônicas
(Kim et al., 2008). Por isso, o grande interesse da pesquisa em buscar meios alternativos para
aumentar a produção desses bioativos.
2.5. Uso da cultura de tecidos de plantas na produção de metabólitos secundários.
O conceito sobre metabolismo secundário foi descrito por Kossel (1891) como opostos
ao metabolismo primário, ou seja, são compostos estruturalmente diferentes, não sendo
essenciais para todas as plantas, embora desempenhem um papel na interação da célula
(organismo) com seu meio ambiente decorrente da sobrevivência do organismo em seu
ecossistema (Verpoorte, 2000), diferentemente do que acontece no primário, no qual produz
substâncias como aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios e ácidos nucléicos, que tem a
função de manter as estruturas celulares, armazenamento e utilização de energia, fatores esses,
imprescindíveis à vida. Os produtos desse metabolismo primário têm um papel fundamental na
13
adaptação das plantas aos seus ambientes, proporcionando assim, um aumento da probabilidade
de sobrevivência de uma espécie (Fumagali et al., 2008). Com isso, esses produtos oriundos de
uma situação de estresse ou defesa da planta, proporcionam usos tanto na medicina popular,
como para serem comercializados como medicamentos, cosméticos, matéria-prima para a
química fina, ou mais recentemente, como nutracêuticos.
Ao longo dos últimos anos, tem havido um grande número de drogas sintéticas usadas
na medicina moderna, mas a necessidade para encontrar novas substâncias em face a um grande
número de doenças, abriu espaço para a exploração de outros tipos de drogas naturais, dos quais
os metabólitos secundários de plantas constituem a maior parte. Eles representam uma fonte
importante de produtos farmacologicamente ativos, e isso faz gerar diferentes estratégias,
usando sistemas in vitro, com o objetivo de melhorar a produção de substâncias de interesse.
Os compostos recebidos a partir de plantas ou de culturas de células e de tecidos in vitro, podem
ser utilizados diretamente como drogas, sem quaisquer alterações, ou esses compostos podem
sofrer novas modificações, os chamados semissintéticos (Stafford et al., 1986, Bourgaud et al.,
2001). Neste sentido, a espécie Poincianella pyramidalis (Bahia et al., 2005), os membros da
família Asteraceae (Grech-Baran et al., 2012), e o gênero Erythrina (Gonçalves et al., 2014)
destacam-se por produzirem bioativos importantes para a indústria farmacêutica, tais como
biflavonóides, flavonóides, isoflavonoóides, alcaloides, dentre outras classes de compostos.
Nesse contexto, a técnica de cultura de tecidos de plantas se apresenta como uma
ferramenta vantajosa do ponto de vista ecológico e econômico, pois pode proporcionar uma
maior potencialização de produção desses bioativos, uma vez que é possível controlar
condições do meio de cultivo, temperatura, luz, fontes de carbono, entre outros fatores.
Permitindo ainda, ser uma alternativa sustentável para algumas espécies, principalmente em
ecossistemas ameaçados, bem como, estabelecer protocolos padrão para a multiplicação massal
de várias espécies (Morais et al., 2012). É sabido que existem empresas como a Nitto Denko
Co., Japão, com produção comercial de biomassa de células de ginseng (Panax ginseng) em
biorreatores de tanque agitado de 20 m3 com produção de 500 – 700 mg/L/dia (DiCosmos e
Misawa, 1995; Wu e Zhong, 1999), e a Ajinomoto e Nippon Shin-Yaku, que vem concentrando
esforços para aumentar os níveis de acumulação de alcalóides, esteróides e outros produtos
secundários em cultura de células (Misawa, 1994).
Assim, entende-se que a técnica de cultura de tecidos de plantas se baseia na
totipotencialidade da célula vegetal, ou seja, na sua capacidade de, por si só, originar uma nova
planta, devido às mesmas apresentarem em seu núcleo, toda informação genética (Grattapaglia
e Machado, 1998). Apesar dessa ferramenta exigir profissionais treinados, laboratórios
14
próprios, reagentes, dentre outros, ainda assim, torna-se vantajoso seu uso, pois os benefícios
proporcionados são superiores à técnica convencional, quando se trata da produção desses
metabólitos secundários que tenham relevância do ponto de vista terapêutico e que, por algum
tipo de impedimento, não são sintetizados, ou quando isso ocorre, sua produção apresenta
baixas concentrações pelas plantas cultivadas no modo tradicional (Pereira, 2009).
A cultura de tecidos de plantas tem como princípios básicos para a obtenção de culturas
assépticas de plantas, a escolha do explante, a assepsia, o meio nutritivo e as condições
ambientais de cultivo. Como fontes de explantes são usados ápices caulinares, ápices
radiculares, gemas axilares ou gemas laterais, segmentos foliares, cotilédones, entrenós,
anteras, ovários, óvulos, nucelos, embriões zigóticos, inflorescências e, inclusive, tecidos
altamente diferenciados, como os provenientes de frutos (Mroginski e Roca, 1991; Barrueto
Cid, 2000; Moraes et al., 2007).
Figura 5. Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: Paul M. Dewick. (2009).
15
Com isso, a produção de metabólitos secundários associada a cultura de tecidos de
plantas, vem crescendo o interesse pelo estudo (Charlet et al., 2000) com maior atenção em
plantas com grande potencial químico e farmacêutico. Uma vez que, grandes quantidades de
metabólitos secundários podem ser sintetizadas dentro de um período de cultivo de duas
semanas, por exemplo. Isto se torna muito favorável em relação a produção na planta, para as
quais o espaço de tempo para o acúmulo desses metabólitos pode variar de uma estação para
plantas anuais ou diversos anos no caso de plantas perianuais (Crouteau et al., 2000; Santos et
al., 2007), a exemplo de Hypericum perforatum que no inverno a produção de hiperecina e
pseudo-hiperecina aumentam de 100 ppm para mais de 3000 ppm no verão (Southwell e
Bourke, 2001). A Artemisia sp, para a qual diversas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com
modificações no meio de cultivo in vitro, a fim de aumentar a produção de massa e de
artemisinina (Aslam et al., 2006, Nin et al., 1996, Liu et al., 2003, Liu et al., 2004). André et al
(2003) fizeram um estudo comparativo da produção de metabólitos secundários em cultura de
células e na planta in natura de Gomphrena globosa (Amaranthaceae) e observaram que calos
possuem potencial para a produção de vários metabólitos in vitro, inclusive compostos não
observados na planta matriz.
Deste modo, pode-se acreditar que a concentração de determinados metabólitos
secundários pode estar relacionada aos estágios de desenvolvimento do vegetal, ocorrendo o
acúmulo de diferentes compostos devido a processos de síntese e transporte nas diferentes
etapas do desenvolvimento da planta (Figura 5, p. 14). Nesse sentido, trabalhos envolvendo
calogênese e cultivo de células in vitro para a P. pyramidalis são necessários, já que protocolos
de produção de massa de calos para essa espécie, são o ponto inicial para a obtenção de
substâncias como a amentoflavona e agatisflavona, que são biflavonóides e, que, mostraram-se
farmacologicamente ativos para diversas doenças.
2.6. Estratégias aplicadas ao cultivo in vitro de plantas para aumentar a produção dos
metabólitos secundários.
Nos últimos anos, percebeu-se uma crescente popularidade dos medicamentos
fitoterápicos, que segundo a legislação sanitária brasileira, são medicamentos obtidos
empregando exclusivamente matérias-primas ativas vegetais (Brasil, 2015). Além disso, houve
também o aumento do interesse por moléculas bioativas oriundas de plantas, uma vez que se
percebeu que essas substâncias não apenas desempenham um papel no crescimento e
16
desenvolvimento da planta, mas também, apresentam um papel relevante na produção de
compostos farmacologicamente ativos de grande importância para a medicina.
Apesar dos grandes avanços na química sintética, ainda assim, por muito tempo, a
produção de metabólitos secundários de plantas vem sendo realizada pelo cultivo da planta em
campo, principalmente, de folhas, caules, raízes. Entretanto, esse tipo de coleta para fins
medicinais apresentava desvantagens como plantas de biótipo específico, que podem ter muita
dificuldade em crescer fora de seus ecossistemas locais; algumas espécies podem não ser
cultivadas em larga escala, devido à sua susceptibilidade a patógenos (Fumagali et al., 2008);
rendimentos baixos, e as flutuações nas concentrações devido às condições geográfica, sazonal
e ambiental (Murthy et al., 2014); além do extrativismo exacerbado, podendo provocar extinção
da espécie coletada. Isto tem conduzido os cientistas e biotecnologistas a considerar as culturas
de células, tecidos e órgãos como uma maneira alternativa para produzir os correspondentes
metabólitos secundários em um sistema in vitro.
A cultura de tecidos vem sendo apontada como valioso instrumento para estudos dos
metabólitos primários e especiais, constituindo um sistema apropriado para a produção de
compostos farmacológicos importantes. Pesquisas têm demonstrado sucesso na produção de
metabólitos especiais em diferentes órgãos e culturas não organizadas como calos e suspensão
celular, que nada mais são que um grupo ou massa de células, com crescimento desordenado
que podem apresentar certo grau de diferenciação (Torres et al., 2000; Schripsema e Verpoorte,
1994; Karam et al., 2003; Furden et al., 2005; Gyorgy et al., 2005). As principais vantagens
dessa produção in vitro são a independência de fatores ambientais, o aumento do controle da
produção, o uso de linhagens celulares que garanta uma qualidade consistente do produto, a
viabilização econômica de produtos oriundos de espécies de difícil cultivo e a utilização de
elicitores ou indutores no direcionamento da produção (Ayako et al., 2004).
Nos últimos anos, têm sido desenvolvidas várias estratégias para acumulação de massa
e a síntese de compostos secundários, tais como, otimização do meio de cultura (Tabela 2, p.
18), elicitores, nutrientes e precursor de alimentação, permeabilização, imobilização, e métodos
de biotransformação (Murthy et al., 2014). Drapeau et al. (1986) verificaram que a concentração
de açúcar no meio influencia fortemente a taxa de crescimento e a razão entre peso fresco e
peso seco de células de Dioscorea deltoidea e de Catharanthus roseus. Ainda estes mesmo
autores, citam que a biossíntese de diosgenina é acrescida com o aumento de 2,4-D no meio de
cultura.
A variedade de meios para o cultivo de células e órgãos vegetais é enorme,
normalmente, para cada cultura existe um meio que se adapta melhor, ou até mesmo, dentro da
17
mesma cultura, há um meio próprio para ela. E isso ocorre devido a composição de nutrientes
que constitui esse meio de cultura. Por exemplo, o meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi
adequado para culturas de células em suspensão de Sylvestre gymnema para acúmulo de massa
e produção de ácido gimnemico (Nagella et al., 2011). Werner et al. (2010) obtiveram melhores
resultados na calogênese da espécie C. echinata (pau-brasil) com os meios de cultura White
(White 1943), MS e B5 (Gamborg et al., 1968), e muito embora o meio WPM (Lloyd e
Mccown, 1981) seja bastante utilizado na promoção da calogênese e da organogênese em
lenhosas (Glocke et al., 2006), para o pau-brasil não se mostrou eficiente. De qualquer modo,
a comparação de meios de cultura é uma tarefa complexa, devido as interações entre os
nutrientes minerais, potencial osmótico do meio e as exigências nutricionais de cada planta
(Werner et al., 2010). Em todo o meio de cultivo, além dos nutrientes presentes na sua
formulação, é sempre necessário suplementá-lo com uma fonte de carbono, geralmente utiliza-
se a sacarose, um dissacarídeo que gera energia e carbono nos processos biossintéticos. Mas,
outros carboidratos estão sendo utilizados não apenas como fonte de energia para a planta
metabolizar seus nutrientes, mas também para modificar esse metabolismo, e favorecer a
biossíntese dos metabólitos secundários. Os mais comumente usados são, a frutose, glicose,
maltose, galactose e lactose.
Em culturas de células em suspensão de Gymnema sylvestre, a utilização de vários
açúcares foi testada, e a sacarose foi considerada a fonte de carboidrato ideal para acumulação
de massa (11,56 g.L-1) e produção de ácido gimnemico (9,95 mg.g-1) (Nagella et al., 2011).
Wang e Weathers (2007) verificaram o efeito de concentrações equimolares (30 g.L-1) de
açúcares individuais, tais como a sacarose, glicose, frutose ou na produção da artemisinina
culturas de raiz de Artemisia annua e relataram uma melhoria significativa na acumulação de
artemisinina em meio suplementado com glicose.
Esses açúcares adicionados ao meio de cultura, além de estimular o crescimento, podem
atuar como moléculas de sinalização que regulam a divisão, diferenciação e o metabolismo das
células (Ong et al., 2011). Estes mesmos autores, observaram em estudos com Ficus deltoidea
que, a glicose (0,167 M) foi a fonte de carbono que melhor favoreceu a produção da rutina,
quercetina e naringenina. Iranbakhsh et al. (2007), usando a concentração de 0,167 M de glicose
em cultura de células de Datura stramonium, obtiveram uma ótima quantidade de alcaloides.
Portanto, cada cultura vai demandar um tipo de fonte de carbono diferente, dependendo também
do que se pretende obter com aquela cultura. Embora, os efeitos dos tipos dos carboidratos e
concentrações sejam visíveis, ainda não há entendimento claro sobre o que eles promovem no
metabolismo da planta (Grech-Baran e Pietrosiuk, 2012).
18
Tabela 2. Algumas estratégias para aumentar a produção de metabólitos secundários em células
vegetais e cultura de órgãos otimizando o meio de cultura. Fonte: Murthy et al. (2014).
Otimização do meio
- Influência da fonte de carbono e suas concentrações
- Influência da fonte de nitrogênio
- Influência de nutrientes no meio de cultivo
- Influência dos tipos e concentrações dos reguladores de crescimento
- Influência da densidade do inóculo
- Otimização do ambiente de cultivo
- Influência da temperatura
- Influência da qualidade e intensidade da luz
- Influência do pH no meio de cultivo
- Influência da aeração e agitação do meio de cultivo.
Cultura de calos e células vegetais de uma maneira geral, requerem um fornecimento
exógeno de reguladores de crescimento para o desenvolvimento, proliferação de massa e
acúmulo de metabólitos. Uma das características mais notáveis das plantas está na capacidade
de suas células somáticas desdiferenciar e retomar a divisão celular e produzir novas plantas.
Entretanto, a alteração do programa ontogenético não é tão simples assim, pois nem todas as
células adquirem competência para expressar a desdiferenciação celular. Assim o uso de
reguladores de crescimento torna-se indispensável nesse processo.
Reguladores de crescimento como auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico,
etileno, entre outros são bastante conhecidos por terem os maiores efeitos sobre os
metabolismos primário e secundário, pois são capazes de desencadear processos específicos
para cada desenvolvimento da célula ou parte de um segmento da planta. Dentre esses, as
auxinas, destacam-se por estimular os processos de desdiferenciação (modelo indireto) e
rediferenciação (modelo direto) in vitro, alterando a determinação e conferindo novas
competências às células responsivas dos explantes (Fehe´r et al., 2003). Resultados
experimentais recentes têm mostrado que a aplicação exógena de reguladores de crescimento
19
também influencia o crescimento e o acúmulo dos metabólitos em culturas de raízes (Vanhala
et al., 1998; Weathers et al., 2005). E, novamente, a relação planta e tipo de regulador usado é
o que vai influenciar na produção ou não do metabólito em questão. Por isso, diversos são os
experimentos apresentados no mundo científico para a produção de massa e, principalmente,
para o acúmulo de metabólitos secundários. Ong et al. (2011) verificaram um maior acúmulo
de flavonóides em Ficus deltoidea quando adicionaram ao meio de cultura 10,74 µM de ANA.
Ionkova (2009) observou que o conteúdo de flavonóides em cultura de células de Astragalus
missouriensis foi severamente diminuído com o aumento da concentração de 2,4-D. Duangpon
e Siripong (2009) relataram que o 2,4-D e o ANA tiveram efeito significativo sobre a produção
de philantusol A em calos. Chinnamadasamy et al. (2010) verificaram que aumentando o nível
de 2,4-D, estimulava a acumulação de vincristina enquanto o ANA produzia resultados
contrários.
Outro fator que também afeta a produção de massa e de metabólitos secundários é a luz.
As condições de iluminação são fatores conhecidos que afetam o metabolismo primário e
secundário em cultura de células de plantas (Ramakrishna e Ravishankar, 2011). Por exemplo,
Kokotkiewicz et al. (2014) provaram que as condições de luz afetaram significativamente o
acúmulo de biflavonóides em Cyclopia subternata. Chan et al. (2010) investigaram os efeitos
de diferentes fatores ambientais, tais como a intensidade e irradiação da luz (irradiação contínua
e escuro contínuo) sobre o rendimento de massa celular e produção de antocianina em culturas
de Melastoma malabathricum, e perceberam que a intensidade moderada da luz (300-600 Lux)
induziu um aumento na acumulação de antocianinas nessa espécie. Guo et al. (2007)
constataram que estimular culturas de calos na espécie Saussurea medusa, aumenta a produção
de flavonóides.
2.7. Biflavonóides na espécie Poincianella pyramidalis
A primeira biflavona foi isolada em 1929 e é conhecida como ginkgentina. Desde então,
mais de mil ocorrências de biflavonóides foram registradas em plantas e muitas atividades
biológicas, têm sido relacionadas a essa classe de substâncias. De acordo com Simões et al.
(1999) os biflavonóides são espécies diméricas formadas por monômeros idênticos ou distintos,
os quais podem ainda ser mistos quanto à categoria das unidades, e podem apresentar vários
tipos de conectividades entre si. A possiblidade de atropisomerismo (estereoisomeria de eixo)
entre os monômeros também contribui para a diversidade de estruturas biflavonoídicas.
20
A nomenclatura dos biflavonóides é feita de modo análogo a dos flavonoides
monoméricos, obedecendo a mesma ordem de numeração. No entanto, há duas possibilidades
de denominação dos anéis aromáticos: na primeira, as unidades são referidas através de
algarismos romanos (I e II), na segunda, a estrutura é subdividida em dois conjuntos de anéis
(1- A, B e C; 2- D, E e F). As posições são diferenciadas apenas pelo acréscimo de linhas
sobrescritas (”). Os carbonos 9 e 10 também podem ser chamados 8a e 4a, respectivamente
(Simões et al., 1999). Esta classe são substâncias polares, solúveis em solventes hidrofílicos
(metanol, DMSO, piridina), por isso suas metodologias de isolamento, em geral, requerem a
aplicação de cromatografia de adsorção de fase reversa (octadecilsilano, ciano) e de exclusão
(Sephadex LH-20) (Simões et al., 1999).
Os biflavonóides são encontrados em grande variedade ou quantidade em diferentes
plantas e em muitos tecidos vegetais, acredita-se que essa quantidade seja superior a duzentas
substâncias dispersas, principalmente entre as plantas gimnospermas e angiospermas (Canuto,
2007). No entanto, seu papel biológico ainda não é claro. Dentre essa variedade de plantas, a
espécie P. pyramidalis se destaca, pois produz biflavonóides, entre esses destacando-se, a
amentoflavona e agatisflavona (Tabela 1, p. 11), substâncias raras para a família Leguminosae,
relatadas por Bahia et al. (2005).
Esta classe de substâncias é reconhecidamente de alto valor farmacológico, uma vez que
apresentam afinidade por receptores GABAA/benzodiazepínicos, sendo fortes candidatos para
o controle da epilepsia (Svenningsen et al., 2006). Atividades antivirais também foram relatadas
para a amentoflavona e agatisflavona em ensaios frente aos vírus Myxovirus influenzae (gripe),
Herpes simplex (Lin et al., 1999) e HIV (Lin et al., 1997), além de um potencial antineoplásico,
avaliado com sucesso, em testes de citotoxidade frente a linhas de células tumorais (Chen et al.,
2005; Lin et al., 2000; Silva et al., 1995; Lin et al., 1989) e mediante ensaios de inibição da
enzima DNA topoisomerase (Grynberg et al., 2002).
Diante do exposto, tem-se a necessidade urgente em definir protocolos de calogênese in
vitro de Catingueira para produzir as substâncias agatisflavona e amentoflavona em qualquer
período de tempo visando uma produção em escala industrial que pode ser obtida por exemplo,
com o uso de biorreatores.
2.8. Fatores que interferem no metabolismo secundário de plantas.
Desde muito tempo, carrascos gregos que coletavam amostras de veneno da cicuta
(Conium maculatum) perceberam que pela manhã os níveis desta substância eram maiores nas
21
plantas (Lopes e Gobbo-Neto, 2007). Assim sendo, têm-se que a biossíntese de metabólitos
secundários se encontra intimamente relacionada às variações sazonais, circadianas, intra e inter
planta, que mesmo existindo um controle genético, a expressão pode sofrer modificações
resultantes da interação de processos bioquímicos, fisiológicos e evolutivos (Darrow e Bowers,
1997; Bowers e Stamp, 1993; Waterman e Mole, 1989; Hartmann, 1996). Dessa maneira,
percebe-se que o metabolismo secundário segue atrelado a interface química das plantas e ao
ambiente.
Diversos são os fatores que alteram a síntese e a concentração dos metabólitos
secundários nas plantas (Figura 6, p. 21). A natureza química destes constituintes ativos pode
não se manter constante durante todo o ano, bem como atuar como fator limitante do
crescimento e da produtividade (Gobbo-Neto e Lopes, 2007; Atienza et al., 2004).
Figura 6. Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários. Fonte: Gobbo
Meto Lopes (2007).
Blank et al. (2007), estudando diferentes horários e épocas de coleta de folhas de
citronela de java (Cymbopogon winterianus Jowitt), concluíram que a época seca reduziu o
conteúdo de limoneno, citronelol, geraniol, e farnesol e aumentou o conteúdo de citronelal e
neral. Já Botrel et al. (2010), observaram que o maior teor de óleo essencial de Hyptis.
marrubioides aconteceu no verão, e, no entanto, no inverno apresentou a maior concentração
22
relativa (%) dos componentes majoritários de α e β-tujona. E de acordo com Ncube et al. (2010),
as maiores concentrações de flavonóides em Hypoxis hemerocallidea e Merwilla plumbea
acontecem no inverno, enquanto Tulbaghia violacea e Drimia robusta no verão.
Zobayed et al. (2005) verificaram que as temperaturas maiores que 35 ºC e menores que
15 ºC, reduziram a eficiência fotossintética das folhas de Hypericum perforatum, resultando na
alteração da concentração de metabólitos secundários dessa espécie. Ao avaliar a influência da
indução de UV-B na mudança na produção de metabólitos secundários em folhas de Ginkgo
biloba, Sun et al. (2010) constataram que houve um aumento no teor de flavonóides, à medida
que o tempo de exposição aumentava, chegando a 57,2% em 240 minutos com posterior
decréscimo de 40,7% aos 360 minutos de exposição.
2.9. Variabilidade Genética
Poincianella pyramidalis é uma espécie endêmica da caatinga, e que apresenta diversas
ações farmacológicas, tais como, atividade anti-inflamatória, antioxidante, antifúngica contra a
candidíase, além de um grande potencial como recuperação de áreas degradadas e madeiras
recomendadas para lenha, carvão e estaca (Bahia et al., 2005; Alviano et al., 2008; Luna et al.,
2005; Cruz et al., 2007). Por essas razões, esta espécie está sob pressão antrópica e pode se
tornar extinta, sendo assim, faz-se necessário um bom programa de conservação da floresta, a
fim de obter a proteção de sua variabilidade genética.
Nesse contexto, o uso da biologia molecular vem sendo determinante em estudos sobre
a variabilidade genética das populações e na estimativa da diferenciação genética existente entre
as espécies. Estudos sobre a identificação e caracterização da variabilidade genética em plantas
medicinais concentram-se em aspectos fenotípicos, tais como os caracteres morfológicos,
aspectos do DNA e seus fragmentos, genes mutantes, cromossomos e, finalmente, marcadores
genéticos, como o ISSR (Inter Repetições de Sequências Simples), que se baseiam na
amplificação de regiões entre sequências microssatélites adjacentes do DNA via PCR
(Polymerase Chain Reaction), por exemplo. Fatores externos influenciam na composição
fitoquímica dessas plantas (Frisvad et al., 2008; Spitaler et al., 2006), podendo ter reflexo no
efeito terapêutico final. Portanto, similaridades e variações no padrão fitoquímico
interpopulacional, poderão ser geneticamente determinadas, usando análises genéticas, a partir
da aplicação do marcador como anteriormente citado.
Esses marcadores não são afetados por condições ambientais, e tornaram-se cada vez
mais importantes para o levantamento da diversidade genética e para a identificação de
23
genótipos de plantas medicinais (Nybom e Weising, 2007). Sena Filho et al. (2010) propuseram
um marcador químico para o gênero Lantana, em que β-cariofileno foi o principal composto
detectado, juntamente com felandreno, cubebeno e elixeno como componentes menores em
uma análise de 15 espécies (β-cariofileno não foi detectado nas espécies de Lippia avaliadas;
em vez disso, sugeriu-se que as espécies pertencentes ao gênero Lippia conteria limoneno,
citral, carvacrol, β-mirceno, cânfora e timol como seus principais marcadores químicos).
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material Vegetal
As sementes de Poincianella pyramidalis foram coletadas de plantas nativas da BR 110
km 22 Jeremoabo-BA (-10°04’33,80”S; -38°20’28,00”O), e, do município de Petrolina, Estado
do Pernambuco, sob autorização do Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN),
processo n° 02000.000878/2007-55. Estas foram armazenadas sob temperatura ambiente em
papel pardo no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros Costeiros.
3.2. Germinação in vitro das sementes de Poincianella pyramidalis
Em câmara de fluxo laminar, realizou-se a desinfestação das sementes com álcool a
70%, por um minuto, hipoclorito de sódio comercial a 50%, por oito minutos, sob agitação e,
posteriormente, lavadas três vezes com água destilada estéril. Em seguida, inoculadas em tubos
de ensaio contendo 20 mL de meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962), suplementado
com 30 g.L-1 de sacarose, e ágar a 7%. O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8, antes da
autoclavagem a 120°C por 20 minutos. Depois de inoculadas, as sementes foram mantidas em
sala de crescimento a uma temperatura de 25 ºC ± 2 ºC, fotoperíodo de 16 horas, intensidade
luminosa de 50 µmol-2.m-2.s-1, obtida por lâmpadas fluorescentes brancas frias.
3.3. Estabelecimento in vitro e calogênese em diferentes explantes de Poincianella pyramidalis
Após 45 dias da germinação in vitro, utilizaram-se como explantes os segmentos nodal,
internodal e foliar das plântulas, oriundas do município de Jeremoabo, Bahia para os estudos
do efeito de 2,4-D na indução de calos. Em câmara de fluxo laminar, estes foram seccionados
e, inoculados em placas de Petri (90 x 15 mm) estéril e descartável contendo 20 mL meio MS,
suplementados com 30 g.L-1 de sacarose e 5 g.L-1 de ágar. O 2,4-D (ácido 2,4-
diclorofenoxiacético) foi adicionado no meio de cultura nas concentrações de 0; 2,5; 5 e 10
mg.L-1. Em seguida, as culturas foram mantidas em sala de crescimento a uma temperatura de
25 ºC ± 2 ºC, sem iluminação. Aos 30 e 60 dias após a inoculação, avaliou-se a oxidação por
meio de uma escala de notas definida com base na porcentagem da área do explante com
oxidação (nota 1: 0%; nota 2: 0 - 25%; nota 3: 25% - 50%; nota 4: 50% a 75%; nota 5: 75% -
25
100%), uma escala de notas para a intensidade de formação de calos nos explantes (nota 1: 0;
nota 2: 25% - 50%; nota 3: 50% - 75%; nota 4: 75% - 100%), e a porcentagem de explantes
nodal, internodal e foliar responsivos à indução de calos.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema
fatorial 3 x 4, sendo três tipos de explantes (nodal, internodal e foliar) e quatro concentrações
de 2,4-D, totalizando 12 tratamentos, com seis repetições contendo quatro explantes cada.
3.4. Produção de biflavonóides e de massa dos calos de Poincianella pyramidalis provenientes
de regiões do Nordeste Brasileiro
Após 45 dias da germinação in vitro, utilizaram-se os explantes foliares das plântulas
dos acessos de Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco para os estudos do efeito de 2,4-D
na indução de calos. Em câmara de fluxo laminar, estes foram seccionados e, inoculados em
placas de Petri (90 x 15 mm) estéril e descartável contendo 20 mL meio MS, suplementados
com 30 g.L-1 de sacarose e 5 g.L-1 de ágar. O 2,4-D foi adicionado ao meio de cultura nas
concentrações de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5 mg.L-1. Em seguida, as culturas foram mantidas em sala
de crescimento a uma temperatura de 25 ºC ± 2, sem iluminação.
Aos 30 e 60 dias após a inoculação, fez-se a pesagem das massas frescas dos calos,
individualmente, para cada tratamento, e os resultados expressos na unidade do SI (g).
Realizaram-se também, após 60 dias, duas análises: uma genética e outra química, a de
variabilidade genética, analisou se havia diferença genética ou não entre os indivíduos da Bahia
e Pernambuco, usando a técnica de Inter Sequencias Simples Repetidas (ISSR) e, no estudo da
composição química utilizou-se o HPLC/DAD para verificar a presença de amentoflavona e/ou
agatisflavona nos tratamentos estudados.
O delineamento experimental utilizado para a indução dos calos, foi o inteiramente
casualizado em esquema fatorial 2 x 5, sendo dois acessos da P. pyramidalis (Bahia e
Pernambuco) e cinco concentrações de 2,4-D, totalizando 10 tratamentos, com seis repetições
contendo quatro explantes cada.
3.5. Análise de diversidade genética entre espécies de Poincianella pyramidalis oriundas de
duas regiões do Nordeste Brasileiro.
3.5.1. Material vegetal
26
Folhas de plântulas cultivadas in vitro provenientes de sementes das populações de
Poincianella pyramidalis dos municípios de Jeremoabo e Petrolina, foram retiradas para análise
da variabilidade genética no Laboratório de Biologia Molecular.
3.5.2. Extração de DNA
Utilizou-se o método CTAB 2% (Doyle e Doyle, 1990) para a extração do DNA.
Portanto, cerca de 1 g das folhas de plântulas in vitro de Poincianella pyramidalis foi macerada
em almofariz, juntamente com nitrogênio líquido (-196 ºC), e 10 mL de tampão CTAB 2%,
posteriormente, as amostras foram incubadas a 65 ºC com 20 µL de β-mercaptoetanol por 60
minutos por 60 minutos. Em seguida foram retirados 1000 µL de cada amostra, e transferidos
para microtubos tipo eppendorf® de 2 mL, e nestes, adicionaram-se 1000 µL de clorofórmio :
álcool isoamílico (24:1). Os microtubos foram vertidos 50 vezes e, no intuito de homogeneizar
as amostras, centrifugados por 30 minutos a 7000 rpm a 4 ºC.
O sobrenadante proveniente da centrifugação foi coletado e transferido para outro
microtubo, e nele adicionou-se 1000 µL de uma solução de acetato de sódio (3 mol.L-1) e álcool
etílico (95 % v/v), na proporção de 1:6. Assim, manteve-se o material por 12 horas em freezer
a -20 ºC. Após esse período, centrifugou-se por 10 minutos a 14000 rpm a 4 ºC, e eliminou-se
a solução de acetato de sódio e álcool etílico. Adicionando-se, em seguida, 1500 µL de álcool
etílico a 70%. As amostras, permaneceram por 10 minutos em temperatura ambiente e, logo
após foram centrifugadas por 10 minutos a 4000 rpm e 4 ºC. Sendo, o álcool eliminado e, o
precipitado formado, seco ao ar por duas horas, e suspenso em 100 µL de TE (Tris-HCl 10 mM,
pH 8,0; EDTA 1 mM).
3.5.3. Quantificação e diluição do DNA
Para a quantificação do DNA utilizou-se um espectrofotômetro (Thermo Scientific
NANODROP 2000c) numa faixa de absorção de 260 a 280 nm. Calculou-se a pureza do
material vegetal através da relação OD260/OD280 e, a avaliação da qualidade do DNA foi
realizada por meio de eletroforese em gel de agarose 1%, visualizado em equipamento de
fotodocumentação Gel doc L-pix HE (Loccus Biotecnologia, Brasil).
Dessa forma, as amostras quantificadas foram diluídas em 100 µL de TE, e armazenadas
à -20 ºC para subsequente uso nas reações de ISSR (Inter Sequencias Simples Repetidas).
27
3.5.4. Iniciador e amplificação
3.5.4.1. Inter Sequencias Simples Repetidas (ISSR)
Inicialmente foram usados 12 iniciadores para a análise dos marcadores ISSR,
utilizando dois indivíduos (Tabela 3, p. 27).
Os parâmetros para otimização das amplificações, consistiram nas concentrações de
DNA (ng), MgCl2 (mM), iniciador (µL) e na temperatura de anelamento (ºC) de acordo com a
Tabela 2.
O volume total da reação foi de 20 µL, sendo: 2 µL da solução de DNA genômico (X),
2 µL de cada iniciador (Y), 12,8 µL de água ultrapura esterilizada, 0,6 µL de tampão MgCl2
(50 mM) (Z), 0,4 µL de dNTP (10 mM), 0,2 µL de Taq polimerase e 2 µL de 10X PCR buffer
minus Mg. Em seguida, o material foi amplificado usando um termociclador com o seguinte
programa: desnaturação a 95 ºC por cinco minutos, seguidos de 45 ciclos de desnaturação a 94
ºC por um minuto, anelamento a diferentes temperaturas por 45 segundos, e extensão a 72 ºC
por dois minutos, finalizando com uma extensão de 72 ºC por 10 minutos.
Tabela 3. Iniciadores ISSR testados, sendo a base Y (C, T) e R (A, G).
Iniciador Sequência 5’ – 3’
807 AGAGAGAGAGAGAGAGT
810 GAGAGAGAGAGAGAGAT
823 TCTCTCTCTCTCTCTCTCC
826 ACACACACACACACACC
828 TGTGTGTGTGTGTGTGA
834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT
835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC
841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC
843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA
845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG
848 CACACACACACACACARG
855 ACACACACACACACACYT
3.5.4.2. Eletroforese, visualização e fotodocumentação dos géis
Em microtubos contendo 20 µL de DNA amplificado, foram adicionados 3 µL de
tampão da amostra (azul de bromofenol 0,01%; glicerol 40%). Desta mistura, 10 µL foram
28
dispostos nas canaletas do gel de agarose 2%, dissolvida em TBE 1X – TRIS 89 mM, ácido
bórico 89 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8,3), posteriormente, submetidos à eletroforese horizontal,
em tensão de 100 V por, aproximadamente, duas horas e 30 minutos.
Após a eletroforese, os géis foram corados em solução contendo brometo de etídeo (0,02
µL/mL de água) por 60 minutos, para visualização sob luz ultravioleta. Para mensurar o padrão
de bandeamento, utilizou-se marcador de massa molecular (Promega) de i Kb. Por fim,
realizou-se a documentação dos géis no equipamento Loccus L-pix HE (Loccus Biotecnologia,
Brasil).
3.5.4.3. Análise estatística
O perfil eletroforético de cada gel de ISSR foi transformado em uma matriz binária,
sendo a presença do fragmento, representada por 1 e ausência 0. Os dados binários foram
empregados para estimar todas as análises subsequentes.
3.5.4.4. Número ótimo de fragmentos amplificados
O número ótimo de fragmentos amplificados foi analisado utilizando-se o software
GENES (Cruz, 2007). Nesta análise foram obtidas as estimativas de correlação de valores da
matriz de similaridade, a soma dos quadrados dos desvios em relação às re-amostragens e o
valor de estresse (E), que indica o ajuste entre a matriz original e a matriz simulada. O número
de bandas foi considerado ideal quando o estresse assumiu valor inferior a 0,05 (Kruskal, 1964).
3.5.4.5. Similaridade genética
A similaridade genética (Sji) entre os indivíduos de P. pyramidalis foi calculada pelo
coeficiente de similaridade de Jaccard empregando o programa NTSYS pc 2.1 (Rohlf, 2001),
com base na seguinte expressão:
𝑆𝑗𝑖 = 𝑎
𝑎+𝑏+𝑐
Onde, 𝑎 representa a presença de bandas em ambos os genótipos, 𝑏 representa a
presença de banda no primeiro genótipo e ausência no segundo e, 𝑐 a presença no segundo e
ausência no primeiro.
29
Com a matriz binária calculou-se a porcentagem de polimorfismo obtido com cada
oligonucleotídio utilizado por meio da fórmula:
𝑃 = 𝑛𝑏𝑝
𝑛𝑏𝑡 𝑥 100
Onde:
P = porcentagem de polimorfismo (ou taxa de polimorfismo);
nbp = número de fragmentos polimórficos;
nbt = número de fragmentos total.
Os erros associados a cada similaridade foram estimados segundo Skroch, Tivang e
Nienhuis (1992), pelas seguintes expressões:
V = ns (1- s)/(n- 1)
Erro padrão estimado = (V/n)1/2
em que:
V: variância da similaridade genética entre cada par de progênies;
s: similaridade genética entre cada par de progênies;
n: número total de bandas utilizadas na estimativa da similaridade genética.
A representação simplificada das similaridades foi feita por meio da construção de um
dendrograma obtido pelo método de agrupamento UPGMA (Rohlf, 2001).
Os indivíduos geneticamente diferentes foram identificados nos dendrogramas a partir
da estimativa do valor mínimo de similaridade, acima do qual os indivíduos são semelhantes,
ou o valor máximo significativo de similaridade (Sgm) (Castanheira, 2001). O (Sgm) foi estimado
por meio do teste t, no nível de 1% de probabilidade. Sendo representado no dendrograma por
meio da linha de corte.
𝑆𝑔𝑚 = 1 − (𝑡 − 𝑆̅𝑠𝑔𝑖𝑗)
Em que:
t= o valor tabelado de t com n-2 graus de liberdade;
𝑆̅𝑠𝑔𝑖𝑗 = erro médio das comparações consideradas nos dendrogramas.
Analisou-se também, a consistência de cada agrupamento (coeficiente de correlação
cofenética) por meio do teste Z de Mantel no programa NTSYS-pc 2.1 (Rohlf, 2001). Esse dado
possibilita avaliar o desempenho da análise de agrupamento, em função da obtida, ou seja, se
os grupos indicados para representar a classe de dissimilaridade podem ser considerados uma
boa representação dos dados originais.
30
Em análise de agrupamento, diversos autores, entre eles Bussad et al. (1990), sugerem
que um valor de coeficiente de correlação cofenética (cf) em torno de 0,8 pode ser considerado
um bom ajuste.
3.6. Efeito da interação de diferentes carboidratos com 2,4-D para a produção de amentoflavona
e agatisflavona em calos de Poincianella pyramidalis
Utilizou-se explantes foliares com 1 cm2, de plântulas provenientes da germinação in
vitro de Poincianella pyramidalis com 45 dias de idade após inoculação, oriunda do município
de Petrolina, Pernambuco, por apresentarem maior massa de calo nos tratamentos estudados
anteriormente. Os segmentos foram inoculados em placas de Petri descartável (90 x 15 mm),
contendo meio MS (Murashige e Skoog, 1962), com os seguintes tratamentos: T1 – Frutose 30
g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T2 – Frutose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T3 – Glicose 30 g.L-1 +
1 mg.L-1 de 2,4-D; T4 – Glicose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T5 – Sacarose 30 g.L-1 + 1 mg.L-
1 de 2,4-D; T6 – Sacarose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D. A cultura, foi mantida em sala de
crescimento a 25 ºC ± 2 ºC sem iluminação. Aos 20, 40 e 60 dias foram realizadas avaliações
de explantes responsivos para a formação de calo, bem como a pesagem das suas massas
frescas. E aos 60 dias uma análise química quantitativa dos extratos através de HPLC/DAD.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema
fatorial 3 x 2, sendo três carboidratos (frutose, glicose e sacarose) e duas concentrações de 2,4-
D, totalizando seis tratamentos, com seis repetições contendo quatro explantes cada.
3.6.1. Preparação dos extratos de Poincianella pyramidalis provenientes de calos.
Calos com 40 e 60 dias de idade, foram colocados em estufa de ar circulante a 40 ºC por
24 horas para secagem. Após esse período, pesou-se 0,1000 g de massa seca desses calos em
balança analítica e, em seguida, esse material foi macerado ao mesmo tempo em que se
adicionava 10 mL de metanol 99,9% (Synth), e deixado para extração por três dias.
Posteriormente, filtrados e colocados em frascos de vidro para total evaporação do solvente
(adaptado de Ong et al., 2011). A metodologia empregada encontra-se ilustrada no fluxograma
1 (p. 31).
Os extratos foram submetidos à análise em cromatógrafo DIONEX® modelo UltiMate
3000 acoplado com detector por arranjo de diodos (modelo SPD-M10A vp), com volume de
injeção de 10 µL. Foi utilizada uma coluna DIONEX C18 (120Å 3,0X 75mm) com partículas
31
de 3µm. No sistema eluente, foi adotada a eluição com gradiente envolvendo a mistura 50-
100% MeOH e 50-0% H2O. Foi utilizado um detector espectrofotométrico e a detecção foi feita
na região do UV/VIS 210, 275, 335 nm, tempo de eluição de 15 minutos e fluxo de 0,5 mL/min.
A quantificação dos compostos foi obtida através do método do padrão externo, o qual
consiste na construção de uma curva de calibração, a partir de solução-padrão de concentrações
conhecidas. Os parâmetros analíticos avaliados para o método de validação foram linearidade,
precisão, limite de detecção e limite de quantificação. A precisão do método foi avaliada pela
repetibilidade, injetando-se em triplicata os extratos metanólicos dos calos de P. pyramidalis,
registrando-se os valores e os picos cromatográficos e calculando-se o desvio padrão das
determinações.
32
Fluxograma 1. Metodologia de extração dos calos de P. pyramidalis aos 40 e 60 dias após
inoculação.
Calos com 40 e 60 dias de idade
Secos em estufa de ar circulante a
40 ºC por 24 horas
Pesados em balança analítica
Macerados juntamente com 10
mL de metanol 99,9% (Synth)
Extração por três dias
Filtração e evaporação do
solvente
Extrato bruto levado para análise
química em HPLC/DAD
33
3.7. Efeito dos fatores abióticos na produção de biflavonóides e massa dos calos da espécie
Poincianella pyramidalis
Explantes foliares de plântulas da espécie Poincianella pyramidalis, oriundas do
município de Petrolina, obtidas a partir da germinação in vitro de sementes. Em câmara de fluxo
laminar, tecidos foliares foram seccionados em 1 cm2 e, inoculados em placas de Petri (90x15
mm) estéril e descartável contendo 20 mL meio MS, suplementados com 1 mg.L-1 de 2,4-D, 5
g.L-1 de ágar e, 30 g.L-1 de glicose ou frutose, de acordo com os seguintes tratamentos: Escuro
– Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; Escuro –
Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D. Em seguida,
as culturas foram mantidas em sala de crescimento a uma temperatura de 25 ºC ± 2 ºC, com
uma parte do experimento ficando sem iluminação e uma outra com iluminação, fotoperíodo
de 16 horas e intensidade luminosa de 20 µmol-2.m-2.s-1, obtidas por lâmpadas fluorescentes
brancas frias.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema
fatorial 2 x 2, sendo dois carboidratos (frutose e glicose) e duas condições de luminosidade
(claro e escuro), totalizando quatro tratamentos, com seis repetições contendo quatro explantes
cada.
3.8. Análise estatística
Os dados referentes ao material e métodos do item 3.1 (p. 23), foram submetidos a
análise de variância (ANOVA) e as médias dos tratamentos quantitativos avaliados por
regressão, com o programa de análise estatística Sisvar (Ferreira, 2011). Dados expressos em
percentuais foram previamente processados de acordo com arco seno (x / 100) 0,5. E para os
demais experimentos, foi realizada uma análise estatística dos dados, onde foram submetidos à
análise de variância (ANOVA), sendo os tratamentos avaliados pelo teste de Tukey com uso
do software estatístico SISVAR (Ferreira, 2011).
34
y = 0,1235x2 - 1,2684x + 4,7461
R² = 0,9049
y = 0,0771x2 - 0,6143x + 1,8656
R² = 0,8082
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 2,5 5 7,5 10
Oxid
ação d
e c
alo
s
2,4-D (mg.L-1)
Nodal Internodal Foliar
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Estabelecimento in vitro e calogênese em diferentes explantes de Poincianella pyramidalis
De acordo com análise de variância houve interação significativa (p < 0,05) entre a
concentração de 2,4-D e tipos de segmentos, independente do período de avaliação, para todas
as variáveis analisadas, com exceção da oxidação de calos aos 30 dias de cultivo, onde apenas
o 2,4-D apresentou efeito significativo.
Com relação à oxidação dos calos, aos 30 dias de cultivo in vitro houve uma resposta
linear crescente com o incremento do 2,4-D, com aumento significativo na concentração de 10
mg.L-1 (3,66), conforme a Figura 7A (p. 34). Estes resultados corroboram com os descritos na
literatura (Fonseca et al., 2012), para o cultivo in vitro de Erythrina velutina, onde a oxidação
dos explantes foi diretamente proporcional ao aumento da concentração de 2,4-D,
independentemente do tipo de explante.
Figura 7. Oxidação de calos em explantes nodal, internodal e foliar de P. pyramidalis aos 30
(A) e 60 (B) dias após inoculação.
y = 0,1538x + 2,032
R² = 0,9619
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 2,5 5 7,5 10
Oxid
açã
o d
e c
alo
s
2,4-D (mg.L-1)
ynodal=ns
A
B
35
Houve um comportamento quadrático da porcentagem de oxidação de calos aos 60 dias
em função das concentrações de 2,4-D (Figura 7B, p. 34), no qual os resultados para o segmento
nodal, não foram significativos. Entretanto, os segmentos internodal e foliar apresentaram os
valores mínimos de oxidação com 5,13 mg.L-1 e 3,98 mg.L-1 de 2,4-D, respectivamente.
A ocorrência de oxidação em culturas de plantas lenhosas é um problema comum
(Jaskni et al., 2008), e que também afeta a catingueira, sendo tanto a ocorrência quanto a
intensidade características inerentes ao tipo de explante utilizado. Os altos níveis de oxidação
devem-se a liberação de compostos fenólicos pelos tecidos em resposta aos ferimentos nos
momentos dos cortes, e as altas concentrações de fitohormônio no meio de cultivo, uma vez
que, naturalmente, os explantes possuem quantidades endógenas de auxina, e ao meio é
adicionado mais auxina sintética (Pious e Ravindra, 1997; Andrade et al., 2000; Sato et al.,
2001). No entanto, apesar da variação da oxidação nos explantes, não houve limitação para o
desenvolvimento dos calos nas concentrações de 2,5 mg.L-1 e 5,0 mg.L-1 de 2,4-D.
Flores et al. (2006) estudando indução de calos em Pfaffia tuberosa, observaram
porcentagens variadas de oxidação nos calos em função do tipo de explante utilizado,
registrando uma maior intensidade de oxidação em folhas (3,7%), seguido de raízes (2,4%),
segmento nodal (1,6%) e entrenó (1,0%) quando cultivados em meio com ácido naftaleno
acético (ANA) ou 2,4-D nas concentrações de 1 ou 10 μM.
Embora a P. pyramidalis seja uma espécie lenhosa, verificou-se que não houve a
necessidade de adicionar ao meio de cultivo MS substâncias antioxidantes, fato esse constatado
nas Figuras 9 e 10 (p.37 e 38) quando observou a indução de calos em todas as concentrações
de 2,4-D, e mesmo as que apresentaram áreas oxidadas, não deixaram de produzir o material
vegetal, apenas em porcentagens de intensidade menores em algumas concentrações estudadas.
Corroborando com esses resultados, Werner et al. (2007) estudando o cultivo de segmentos de
Caesalpinia echinata em meio MS sem adição de antioxidantes obtiveram menor taxa de
oxidação. Ainda estes mesmos autores, relataram ainda que nos tratamentos com essas
substâncias (carvão ativado, ácido ascórbico e PVP), o único que melhor controlou a oxidação
foi o carvão ativado, mas não favoreceu a formação de calos.
A indução de calos nos segmentos se iniciou entre 7 e 21 dias após a inoculação, sendo
observada a formação de calos compactos com poucas áreas friáveis (Figura 8, p. 36). Não
houve formação de calos na ausência de 2,4-D (Figuras 9A e 9B, p. 37). O efeito de
concentrações de reguladores de crescimento na consistência de calos também foi estudado em
plantas ornamentais da espécie Alocasia micholitziana Sander (Araceae), para a qual
36
concentrações reduzidas de BAP e 2,4-D levaram a formação de calos friáveis, enquanto
concentrações mais elevadas induziram calos compactos (Thao et al., 2003).
Aos 30 dias de cultivo in vitro, a porcentagem de explantes com indução de calos
apresentou um comportamento quadrático para todos os segmentos (nodal, internodal e foliar),
com aumento na formação de calos até a concentração de 6,28 mg.L-1, 6,49 mg.L-1 e 4,91 mg.L-
1 de 2,4-D, respectivamente e, a partir desses valores, todos apresentaram um decréscimo para
esta variável (Figura 9A, p. 37). Aos 60 dias (Figura 9B, p. 37) o comportamento foi
semelhante, onde os segmentos nodal, internodal e foliar mantiveram a continuidade na
formação de calos até a concentração de 7,04 mg.L-1, 4,92 mg.L-1 e 5,03 mg.L-1 de 2,4-D,
respectivamente, com posterior decréscimo na calogênese.
Em cultivo in vitro de Halicacabum cardiospermum (Thomas e Maseena, 2006) foi
obtida alta taxa de explantes responsivos (96 e 99%, respectivamente) para formação de calos
em segmentos nodal e foliar na presença de 5 μM de 2,4-D. Para a calogênese em Erythrina
velutina (Mulungu) foi constatado que a concentração de 9,73 μM de 2,4-D, independentemente
do tipo de explante favoreceu a maior formação de calos (Fonseca, 2012). A literatura relata
também que explantes de Caesalpinia echinata (Pau-brasil) levaram ao aproveitamento de
100% na formação de calos com a concentração de 10 mg.L-1 de 2,4-D (Werner et al., 2007).
Figura 8. (A) Aspecto de formação de calo compacto com poucas áreas friáveis de P.
pyramidalis aos 60 dias de cultivo in vitro. (Barra=0,5cm); (B) Micrografia eletrônica de
varredura mostrando calo de P. pyramidalis. Barras (Barra= 100 µm). Fotos: Kicia Gomes-
Copeland (A), Caroline Machado (B).
A adição da auxina 2,4-D ao meio de cultivo (Cid, 2000) age estimulando a
hipermetilação do DNA, processo fundamental na regulação da totipotencialidade. No entanto,
a partir de determinadas concentrações, as auxinas podem apresentar efeito fitotóxico (Figuras
9A e 9B, p. 36) inibindo a formação dos calos a partir das concentrações descritas acima.
A B
37
Provavelmente, o material vegetal utilizado por ser originado de plântulas germinadas in vitro,
apresente uma maior sensibilidade às baixas concentrações de 2,4-D, devido aos níveis
endógenos de auxinas (Taiz e Zeiger, 2009). Também foram observadas a necessidade do uso
de auxina para a indução de calos friáveis em explantes foliares de Uncaria guianensis - Unha
de Gato - (Pereira et al., 2007), e de Ocimum basilicum L. – Manjericão - (Gopi e
Ponmurumgan, 2006) na presença de 1,0 mg.L-1 de 2,4-D.
Figura 9. Porcentagem de explantes nodal, internodal e foliar de Poincianella pyramidalis,
responsivos à indução de calos em função da concentração de 2,4-D aos 30 (A) e 60 (B) dias
após inoculação.
Aos 60 dias os segmentos nodal, internodal e foliar de P. pyramidalis apresentaram
pontos máximos da produção de calos em 7,0 mg.L-1, 6,15 mg.L-1 e 5,08 mg.L-1 de 2,4-D,
respectivamente. Neste mesmo período de tempo, notou-se um decréscimo na produção de
calos no segmento foliar quando comparado aos 30 dias de cultivo após inoculação. Os dados
encontrados no presente trabalho estão de acordo com os encontrados na literatura por Pereira
et al. (2007) e Gopi e Ponmurumgan (2006) mostrando que o uso de auxina é indispensável
y nodal= -2.6061x2** + 33.848x** + 4.0901
R² = 0.9665
yinternodal = -2.8485x2** + 35.788x** + 7.7272
R² = 0.8938
yfoliar= -3.6362x2** + 35.756x** + 4.5453
R² = 0.9636
0
20
40
60
80
100
120
0 2,5 5 7,5 10
% e
xp
lan
tes
resp
on
sivos
a c
alo
gên
ese
2,4-D (mg.L-1)
Nodal Internodal Foliar
ynodal = -2,303x2** + 32,424x** + 4,5447
R² = 0,9633
yinternodal = -4,3636x2** + 42,909x** + 5,4545
R² = 0,9636
yfoliar = -3,8788x2** + 39,031x** - 1,8175
R² = 0,9946
0
20
40
60
80
100
120
0 2,5 5 7,5 10% d
e e
xp
lan
tes
resp
on
civ
os
a c
alo
gên
ese
2,4-D (mg.L-1)
Nodal Internodal Foliar
A
B
38
para a indução de calos friáveis em explantes de Uncaria guinensis J. F. Gmel e de Ocimum
basilicum L., respectivamente.
Figura 10. Notas de intensidade de formação de calos nos explantes nodal, internodal e foliar
de P. pyramidalis aos 30 (A) e 60 (B) dias.
O segmento foliar apresentou maior intensidade de formação de calo aos 30 dias e o
internodal aos 60 dias (Figuras 10A e 10B, p. 38). Alguns autores relatam que a posição e o
tipo do explante na planta matriz tem mostrado diferenças na capacidade morfogenética em
diferentes espécies (Poovaiah et al., 2006a, b; Wang et al., 2009), como também Monfort et al.
(2012) que constataram que há diferença no desenvolvimento dos segmentos de acordo com a
posição na planta, pois esses respondem diferentemente ao processo morfogenético in vitro.
O desenvolvimento de calo pode ser independente de auxinas e citocininas, dependente
de auxinas, dependente de citocininas ou dependente de ambas (Jain et al., 1995). No caso da
P. pyramidalis, a calogênese foi dependente da auxina 2,4-D, como verificado em trabalhos
ynodal = -0,0406x2** + 0,4947x** - 0,0417
R² = 0,9812
yinternodal = -0,0429x2** + 0,4998x** + 0,0952
R² = 0,9063
yfoliar = -0,0724x2** + 0,7123x** + 0,0905
R² = 0,9636
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 2,5 5 7,5 10
Inte
nsi
dad
e d
e c
alo
s
2,4-D (mg.L-1)
Nodal Internodal Foliar
ynodal = -0,0249x2** + 0,3486x** + 0,1211
R² = 0,8084
yinternodal = -0,0447x2** + 0,55x** - 0,0262
R² = 0,994
yfoliar = -0,0557x2** + 0,5657x** - 0,0644
R² = 0,9683
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 2,5 5 7,5 10
Inte
nsi
da
de d
e c
alo
s
2,4-D (mg.L-1)
Nodal Internodal Foliar
A
B
39
com Pau-Brasil (Werner et al., 2007). É importante ressaltar que não há registros de trabalhos
envolvendo calogênese in vitro para a espécie em estudo, apenas de espécies do mesmo gênero,
e que, ainda assim, apresentam comportamentos fisiológicos distintos, mas que se corroboram.
Portanto, este trabalho contribue não somente para estudos futuros sobre calogênese in vitro da
espécie P. pyramidalis.
40
4.2. Produção de biflavonóides e de massa nos calos de Poincianella pyramidalis em duas
regiões provenientes do Nordeste Brasileiro
De acordo com a análise de variância (p < 0,05), houve diferenças significativas em
relação às concentrações de 2,4-D, locais da coleta e tempo na produção de massa em calos
obtidos a partir de explantes foliares de P. pyramidalis. Mas, não houve interação significativa
entre esses fatores avaliados.
Constatou-se um comportamento quadrático da curva, quando se avaliou a produção de
massa dos calos de P. pyramidalis em função das concentrações de 2,4-D (Figura 11, p. 41),
apresentando valor máximo estimado de concentração da auxina em 1,87 mg.L-1. Nessa figura
pode ser observado, o aumento da massa a partir da concentração de 1 mg.L-1 (0,1832 g),
decrescendo em 2 mg.L-1 (0,1709 g), 3mg.L-1(0,1083 g) e, voltando a crescer nas concentrações
de 4 mg.L-1 (0,1111 g) e 5 mg.L-1 (0,1367 g) de 2,4-D.
Apesar de ter havido um acréscimo a partir de 4 mg.L-1, a concentração de 1 mg.L-1
ainda se mostrou melhor para produção da massa dos calos para essa espécie. Esse fato
observado na curva pode ter acontecido, provavelmente, porque concentrações diversas,
oferecem respostas diferentes na morfogênese na espécie estudada. Assim, o tipo do explante,
concentração do regulador de crescimento, genótipo, entre outros fatores, agem diretamente na
variação da produção de massa em espécies de plantas.
Em estudos realizados com Sapium sebiferum a presença de 4,52 µM de 2,4-D no meio
de cultivo foi eficiente na indução dos calos e, esses calos apresentaram padrão de crescimento
três vezes maior (Neera et al., 1992). Aos 60 dias após inoculação são observados para o
barbatimão (Stryphnodendron adstringens) maiores valores de matéria fresca e seca dos calos
em meios contendo 9,05 µM e 18,10 µM de 2,4-D (Castro et al., 2009). A dose 2,4 mg.L-1 de
2,4-D atingiu cobertura máxima de 99,18% de calos, e concentrações acima e abaixo desse
valor, mostraram a tendência de redução da porcentagem de área coberta por calos (Nogueira
et al., 2007). Entretanto, calos cultivados em meios suplementados com baixas concentrações
de 2,4-D mostraram menores valores de matéria seca dos calos em Liquidambar styraciflua
(Neera et al., 1993).
A eficiência do 2,4-D na indução de calos, ainda que isoladamente, corrobora os
resultados obtidos por Berthouly e Michaux-Ferreiere (1996), que relatam a indução da
calogênese tanto em meios com concentrações elevadas de 2,4-D quanto em baixas
41
concentrações. Fato também observado em espécies do mesmo gênero da P. Pyramidalis
(Werner et al., 2007, 2009, 2010; Zanotti et al., 2012) que corroboram com esse estudo.
O 2,4-D é a auxina mais frequentemente usada na indução de calogênese e, no caso da
P. pyramidalis, explantes foliares responderam positivamente à sua presença. As auxinas são
indispensáveis à formação de calos, uma vez que são responsáveis pelo início da divisão celular
e pelo controle dos processos de crescimento e alongamento celular (Taiz e Zeiger, 2009). O
2,4-D tem efeito no metabolismo do RNA, induzindo a transcrição de RNAs mensageiros
capazes de decodificar para o crescimento e que podem induzir a proliferação celular
desordenada (George et al., 2008). Os calos, massa de células obtidas a partir de um explante,
dão suporte aos programas de melhoramento genético produzindo células que podem ser
utilizadas para manipulações genéticas, como a hibridação somática, poliploidização, produção
de metabólitos secundários, entre outros (Ferreira et al., 2007).
Figura 11. Produção de massa fresca dos calos em explantes foliares de P. pyramidalis em
função de diferentes concentrações de 2,4-D.
Conforme pode ser verificado (Figura 12, p. 42) a produção de massa fresca de calos
em explantes foliares de P. pyramidalis foi maior no acesso de Petrolina (Pernambuco) com
0,1882 g de massa fresca de calo, quando comparado ao acesso de Jeremoabo que apresentou
0,0959 g de massa fresca. Provavelmente, a variabilidade genética influenciou nessa diferença
significativa de massa fresca entre os acessos que, apesar de pertencerem à mesma espécie,
podem apresentar diferenças em seu DNA, e assim, agir diretamente nessa variação. Segundo
Andrade (2002) a cultura de tecidos pode aumentar a variabilidade genética pela variação
y = 0,0101x2 - 0,0759x + 0,2585
R² = 0,8079
0,05
0,07
0,09
0,11
0,13
0,15
0,17
0,19
1 2 3 4 5
Mas
sa f
resc
a d
os
calo
(g)
2,4-D (mg/L)
42
somaclonal. Vidal et al. (2012) evidenciaram diferenças significativas entre diferentes acessos
de mandioca (Manihot esculenta Crantz) na indução de calos.
Figura 12. Massa fresca dos calos em explantes foliares de P. pyramidalis oriundos de dois
acessos, Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco.
Teoricamente, considera-se que todas as células vegetais são capazes de expressar sua
totipotência, no entanto, os explantes são uma mistura de células em variados estados:
fisiológico, bioquímico e de desenvolvimento. Nesse sentido, espera-se que a exposição desses
explantes a um ambiente in vitro estimule reações diversificadas nos diferentes tipos celulares,
fazendo com que somente algumas células desse explante respondam às condições de cultura
in vitro (Mantell et al., 1994).
De acordo com a Figura 13 (p. 43) verificou-se uma diferença no acúmulo da
amentoflavona e agatisflavona nos acessos Bahia e Pernambuco quando a biossíntese dos
biflavonóides em estudo foi maior no acesso de Pernambuco, sendo ainda a amentoflavona o
bioativo presente em maior concentração, apresentando as concentrações de 2,33; 2,68; 4,09;
4,41 e 2,63 µg.mL-1 em 1; 2; 3; 4 e 5 mg.L-1 de 2,4-D, respectivamente. Sendo que as
concentrações de 5 mg.L-1 (2,75 µg.mL-1) e 4 mg.L-1 (4,41 µg.mL-1) de 2,4-D foram as melhores
para a produção de amentoflavona, para os acessos Bahia e Pernambuco, respectivamente. Uma
das principais vantagens em produzir metabólitos secundários in vitro, é o fato desse processo
não ser afetado por variações ambientais, localização geográfica, ataque de pragas e
instabilidade política, entretanto, esse estudo mostrou que mesmo controlando todos os fatores
físicos e químicos (meio de cultura), foi possível observar diferenças no acúmulo dos bioativos
0,0959b
0,1882a
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
BA PE
Mas
sa o
s ca
los
(g)
Acessos
43
0,280,1 0,12 0,1
2,01
1,46
0,08
2,75
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 5 mg/L
Con
cen
traç
ão e
m µ
g.m
L-1
Agatisflavona Amentoflavona
em questão entre os acessos, comparando com as mesmas concentrações de 2,4-D. Entretanto,
a literatura apenas relata diferenças na produção de compostos de interesse quando se utiliza
como explantes, a planta matriz cultivada naturalmente.
Figura 13. Produção de amentoflavona e agatisflavona em cultura de calos de P. pyramidalis,
aos 60 dias após inoculação, em diferentes concentrações de 2,4-D, nos acessos da Bahia (A) e
Pernambuco (B).
Talvez possa-se relacionar a variação somaclonal como um dos fatores que tenham
modificado a ordem das reações biossintéticas ocorridas nos calos de Catingueira, uma vez que,
é sabido que esse fator envolve alterações ao acaso no material genético, resultando em
variações genéticas (Flores, 2006). Segundo Rodrigues e Almeida (2010) é possível que a
expressão diferencial de genes seja responsável pela variação de respostas na biossíntese dos
metabólitos especiais. Ainda estes mesmos autores verificaram que o crescimento de calos é
desejável para induzir variação somaclonal e estudos fisiológicos, principalmente quando se
deseja relacionar a presença de bioativos com o crescimento celular. Ressalta-se que variação
somaclonal é influenciada pelo tipo e concentrações de reguladores de crescimento, em especial
0,22 0,2 0,140,36
0,17
2,33
2,68
4,094,41
2,63
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1 mg/L 2 mg/L 3 mg/L 4 mg/L 5 mg/L
Con
cen
traç
ão e
m µ
g.m
L-1
Agatisflavona Amentoflavona
A
B
44
as auxinas (Karp, 1992). O efeito das auxinas nas alterações genéticas pode decorrer do fato
das mesmas acelerarem a divisão celular, aumentando a taxa de mutações (Flores, 2006).
Kumar e Mathur (2004) constataram que o aumento na concentração de ANA aumentou a
frequência de alterações tanto no número quanto na estrutura dos cromossomos de Pisum
sativum.
Em plantas medicinais a produção de metabólitos secundários está sujeita a variação de
fatores exógenos e endógenos (Tetényi, 1983). Portanto, no cultivo de espécies medicinais,
deve-se levar em conta fatores genéticos e fisiológicos que podem influenciar na produção de
seus princípios ativos. A qualidade das plantas medicinais está relacionada aos teores de
princípios ativos, dessa maneira, o conhecimento e controle dos fatores que influenciam a
variação dos compostos químicos nessas plantas, permite obter uma matéria-prima de melhor
qualidade (Castro e Ferreira, 2000).
Os acessos Bahia e Pernambuco foram submetidos a uma análise de agrupamento
utilizando caracterização molecular por marcadores ISSR (Inter Sequencias Simples
Repetidas), e verificou-se nesse estudo que as impressões digitais ISSR distinguiram
claramente os dois acessos testados para a espécie P. pyramidalis (Figura 14, p. 45). O que deve
estar relacionado tanto com a produção de massa dos calos (Figura 12, p. 42) como com o
acúmulo da amentoflavona e agatisflavona (Figura 13, p. 43), já que se verificou variabilidade
genética entre esses acessos, com uma taxa de polimorfismo de 58,33% (Tabela 4, p. 44). Na
Figura 14 (p. 45) também pode-se ratificar essa diferença entre os indivíduos, quando no mesmo
primer aparece banda para o indivíduo B (Pernambuco) e não para o A (Bahia). Além do
número de bandas que variou de 2 a 8, totalizando 48 bandas, sendo 28 polimórficas. Essa
técnica é importante, pois tem sido utilizada para diferenciar espécies/subespécies em um
gênero ou para diferenciar gêneros numa família. E com isso, pode-se afirmar que essa técnica
possui sensibilidade para estudos envolvendo variabilidade genética entre espécies de P.
pyramidalis, e que corrobora com essa pesquisa, contribuindo para possíveis entendimentos de
comportamento de questões relatadas anteriormente.
Sena Filho et al. (2012), investigando a variabilidade genética entre indivíduos de
Lantana, sugeriram que a produção geneticamente dirigida de compostos voláteis está
correlacionada entre as espécies desse gênero. Gonçalves et al. (2014) realizando a
caracterização genética do mulungu (Erythrina velutina) com ISSR, relataram que houve
relação diretamente proporcional entre o número de fragmentos amplificados e a magnitude de
correlação dos valores da matriz de similaridade original obtida a partir de reamostragem com
diferentes números de fragmentos amplificados.
45
Tabela 4. Número de fragmentos gerados pelas reações de ISSR em dois acessos de
Catingueira.
Primer Nº de bandas
totais (NBT)
Nº de Bandas
Polimórficas
(NBP)
Porcentagem de
polimorfismo (%)
327 2 0 0
S10 4 4 100
823 2 2 100
828 4 3 75
848 3 2 66,66
B22 5 4 80
B26 3 2 66,66
B35 6 5 83,33
B41 5 1 20
843 8 3 37,5
845 6 2 33,33
Total 48 28 58,33
Figura 14. Produtos da amplificação de ISSR gerados em indivíduos de P. pyramidalis de
ocorrência nos municípios de Jeremoabo, Bahia e Petrolina, Pernambuco.
1Kb A B A B A B A B A B A B
1Kb A B A B A B A B A B A B
46
4.3. Efeito da interação de diferentes carboidratos com 2,4-D para a produção de amentoflavona
e agatisflavona em calos de Poincianella pyramidalis
De acordo com a análise de variância (ANAVA), houve interação significativa entre as
fontes de carbono (sacarose, glicose e frutose) e as concentrações de 2,4-D não combinadas
para a variável massa de calos. A combinação entre esses fatores, não foi significativa (Tabela
5, p. 48), independente dos períodos de tempo estudados.
Observou-se na calogênese de P. pyramidalis que, o crescimento e o aspecto dos calos
diferiam de acordo com a fonte de carbono e a concentração de 2,4-D empregadas (Figura 15,
p. 47). Os explantes submetidos ao tratamento com sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D, apresentou o
melhor desenvolvimento dos calos, o aspecto era rígido em ambas as concentrações de auxina
(1 ou 5 mg.L-1), no entanto, o T5 (Sacarose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D) mostrou áreas
oxidadas (Figura 15, p. 47). Nos explantes cultivados com glicose, constatou-se um menor
desenvolvimento (massa), quando comparados aos demais tratamentos, e também áreas com
oxidação, e isso era mais evidenciado no tratamento T4 (Glicose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D),
além de um aspecto rígido. E, nos tratamentos suplementados com frutose ao meio de cultivo,
os explantes apresentaram calos desenvolvidos, principalmente no T1 (Frutose 30 g.L-1 + 1
mg.L-1 de 2,4-D), com pontos de oxidação em ambas as concentrações de 2,4-D (Figura 15, p.
47).
Embora, alguns tratamentos citados tenham apresentado oxidação, isso não impediu o
desenvolvimento da calogênese. Em todos os tratamentos, foi observado calos compactos e com
poucas áreas friáveis (Figura 15, p. 47). Vasconcelos et al. (2012) também não observaram em
nenhum dos tratamentos com adição da auxina 2,4-D calos friáveis em explantes foliares de
aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Fr. All). Estes mesmos autores, observaram ainda
calos formados a partir de segmentos foliares de aroeira-do-sertão com variações na coloração,
consistência e morfogênese, conforme a concentração de 2,4-D utilizada. Em Plectranthus
ornatos foi evidenciado que o crescimento, o aspecto e a consistência dos calos diferiram de
acordo com o tipo e a concentração da auxina empregada (Passinho-Soares et al., 2013). Os
calos podem apresentar consistência compacta ou friável e variam quanto a cor, ao tamanho, ao
tipo, conteúdo celular e espessura da parede (Chiavegatto, 2014). Assim o grau de diferenciação
celular e o potencial embriogênico podem ser influenciados pelo meio de cultura utilizado, do
explante de origem, do requerimento do regulador de crescimento e da fonte de carbono usada
como suplemento no meio de cultivo.
47
Entretanto, Zouzou et al. (2008) relataram que a massa seca e a porcentagem de indução
de calo em Gossypium hirsutum (algodão) foi mais significativa com glicose (157,33 mg)
seguido de frutose (122,03 mg) e sacarose (94,87 mg). A glicose é a mais importante fonte de
produção de energia assimilada pelas células de plantas (Richter, 1993). Embora a frutose seja
também um monossacarídeo, como a glicose, assimilado pelas células das plantas, mas a sua
reatividade parece ser menor em comparação com a glicose.
Figura 15. Calos de P. pyramidalis aos 60 dias após inoculação, em seis diferentes tratamentos:
T1 – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T2 – Frutose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T3 – Glicose 30
g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D; T4 – Glicose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D; T5 – Sacarose 30 g.L-1 + 1 mg.L-
1 de 2,4-D; T6 – Sacarose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D. Fotos: Kicia Gomes-Copeland.
De acordo com a Tabela 5 (p. 48), a produção da massa dos calos foi influenciada
diretamente pela adição das diferentes fontes de carbono ao meio de cultivo. Sendo o T6
(sacarose 30 g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D), o tratamento que apresentou um aumento da massa dos
calos aos 20, 40 e 60 dias após inoculação. Fato não observado nos demais tratamentos
estudados que apresentaram diferença apenas dos 20 aos 60 dias. Embora os demais tratamentos
não apresentassem as mesmas considerações do T6 diante da estatisticamente, foi possível
inferir que os dados de todos os outros tratamentos, mostraram um aumento numericamente
crescente da massa dos calos de P. pyramidalis (Tabela 5, p. 48). Provavelmente, a sacarose
era hidrolisada primeiro em glicose e frutose e, estes dois monossacarídeos foram então,
simultaneamente, consumidos, por isso uma maior massa nos tratamentos que envolvem esse
dissacarídeo.
48
Tabela 5. Efeito de diferentes fontes de carbono combinados com duas concentrações de 2,4-
D na produção de massa em calos de P. pyramidalis. Média seguida de mesma letra minúscula
na coluna para tratamentos e, maiúsculas na linha para tempo, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
Carboidrato
(30 g.L-1)
2,4 D
(mg.L-1) Massa (g)
Tratamento 20 dias 40 dias 60 dias
T1 Frutose 1 0,0085 aB 0,0382 bAB 0,1062 bA
T2 Frutose 5 0,0164 aB 0,0675 bAB 0,1517 bA
T3 Glicose 1 0,0161 aB 0,0564 bAB 0,1215 bA
T4 Glicose 5 0,0184 aB 0,0620 bB 0,1479 bA
T5 Sacarose 1 0,0274 aB 0,1071 abAB 0,2048 bA
T6 Sacarose 5 0,0388 aC 0,1909 aB 0,3612 aA
CV (%) 5,92
Os resultados obtidos por Ong et al. (2011), relatam que, a produção de massa de Ficus
deltoidea foi, estatisticamente, igual para a sacarose, glicose e frutose, no entanto, a sacarose
apresentou uma massa ligeiramente maior do que as outras fontes de carbono testadas. Nagela
et al. (2011) trabalhando com diferentes fontes de carbono na produção de massa de calos de
Gymnema sylvestre R. Br, observaram que a sacarose é a fonte de carbono mais indicada para
produção de massa para essa espécie com 125,67±2,20 g/L, seguidos de 118,00±4,03 e
100,91±3,69 g/L para glicose e frutose, respectivamente. Weathers et al. (2004) constataram
que o crescimento de massa usando a sacarose como fonte de carbono em Artemisia annua, era
equivalente ao seu crescimento em frutose e foi significativamente melhor do que em glicose.
Singh (2014) verificou que o efeito da sacarose na produção de calos em B. purpúrea foi mais
eficaz, seguido por maltose, glicose, galactose, lactose e frutose.
Em relação ao tempo de inoculação dos explantes de P. pyramidalis (Tabela 5, p. 48),
constatou-se uma diferença significativa dos 20, 40 e 60 dias para o tratamento T6 (sacarose 30
49
g.L-1 + 5 mg.L-1 de 2,4-D), bem como entre os 20 e 60 dias de cultivo para os demais
tratamentos, ou seja, dos 20 aos 40 dias, não foi observado diferença no aumento da massa nos
calos nos tratamentos, exceto o T6. Passinho-Soares et al. (2013), evidenciaram o ganho de
massa nos calos de Plectranthus ornatus entre o vigésimo e o quadragésimo dia após a
inoculação. E, de acordo com Nogueira et al. (2008), aos 20 dias após a inoculação, houve 95%
do crescimento dos calos de murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.), dos 20 aos 40
dias de cultivo, houve 88% de crescimento.
De acordo com a Figura 16 (p. 49), as diferentes fontes de carbono (frutose, glicose e
sacarose) bem como as concentrações de 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético) testadas, mostraram
influência direta no crescimento e produção dos metabólitos secundários. A amentoflavona
apresentou uma maior concentração (µg.mL-1) em todos os tratamentos estudados, exceto na
frutose + 5 mg.L-1 de 2,4-D e glicose + 5 mg.L-1 de 2,4-D, que apresentaram valores muito
próximos da agatisflavona. Provavelmente, o uso dessa auxina para produção desse metabólito
não foi adequado, pois o 2,4-D pode ter sido usado também para a biossíntese de outros
compostos secundários ou até mesmo primários.
Figura 16. Produção de amentoflavona e agatisflavona em cultura de calos de P. pyramidalis,
aos 60 dias após inoculação, com diferentes fontes de carbono e concentrações de 2,4-D.
Neste trabalho, pôde-se observar uma baixa produção de agatisflavona em todos os
tratamentos (Figura 16, p. 49), e isso pode ter ocorrido devido a essa via poder produzir
precursores para a biossíntese do indol, compostos aromáticos, aminoácidos, alcalóides,
0,1 0,1 0,2 0,1 0,2 0,58
2,68
0,09
8,6
0,09
8,6
16,44
0
1,5
3
4,5
6
7,5
9
10,5
12
13,5
15
16,5
Frut+1 mg/L Frut+5 mg/L Glic+1 mg/L Glic+5 mg/L Sac+1 mg/L Sac+5 mg/L
Co
nce
ntr
ação
em
ug.m
L-1
Agatisflavona Amentoflavona
50
ligninas, metabólitos aromáticos e flavonóides e é, portanto, uma via essencial para os
metabolismos primários e secundários em plantas (Ljung, 2013).
Ong et al. (2011), suplementaram o meio de cultivo de calos de Ficus deltoidea com
2,4-D, e observaram um aumento significativo na produção de rutina. Em culturas de Panax
ginseng, foi constatada ótima produção de massa bem como o mais alto conteúdo de
ginsenosídeo, na presença de sacarose (Odnevall e Bjork, 1989). Gerber (2013) constatou que,
o crescimento dos calos de Cedrela fissilis Vellozo, assim como as classes dos compostos
produzidos, estão relacionados com as diferentes fontes de carbono e nitrogênio, reguladores
de crescimento e tipos de explantes. No entanto, Ong et al. (2011) sugeriram o uso de glicose
no meio de cultura de indução de calos de Ficus deltoidea, como uma ótima fonte de carbono
na produção de flavonóides, como rutina, quercetina e naringenina; a sacarose se apresentou
como melhor fonte de carbono para o aumento de massa, mas não, na produção dos flavonoides
estudados. E, além de proporcionar o crescimento, a sacarose, glicose e frutose adicionadas ao
meio de cultura, podem agir como moléculas de sinalização na regulação celular, diferenciação,
e metabolismo das células (Sherson et al., 2003), assim como também, o uso de reguladores de
crescimento pode influenciar no crescimento e na produção dos metabólitos secundários em
cultura de células em plantas (Ong et al., 2011).
O tratamento que continha sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D, foi o que melhor se destacou
em termos de produção da agatisflavona e amentoflavona com 0,58 µg.mL-1 e 16,44 µg.mL-1,
respectivamente (Figuras 16, p. 49), sendo a produção de amentoflavona superior em todos os
tratamentos. Chinnamadasamy et al. (2010), observaram um acúmulo de vincristina em calos
de Catharanthus roseus aumentando o nível de 2,4-D no meio de cultivo. Entretanto, Ionkova
(2009) mostrou que o conteúdo de flavonóides em cultura de células de Astragalus
missouriensis foi severamente diminuída com o aumento da concentração de 2,4-D.
Diferentes fontes de carbono podem ter diferentes funções reguladoras em processos
fisiológicos, e o estágio de desenvolvimento da planta, determina ainda mais a resposta desses
açúcares (Rolland et al., 2006; Eveland e Jackson, 2012; Tognetti et al., 2013). Muito embora
sejam as explicações sobre o que pode favorecer a produção de massa e metabólitos secundários
em calos, ainda assim, seus exatos efeitos não foram entendidos (Grech-Baran e Pietrosiuk,
2012), portanto, experimentos envolvendo a adição de fontes de carbono e reguladores de
crescimento ao meio de cultivo, precisam ainda, ser bastante estudados, uma vez que, cada
cultura tem a sua especificidade, e em especial, às espécies lenhosas (Mosaleeyanon et al.,
2004).
51
Figura 17. Cromatograma dos padrões da agatisflavona e amentoflavona (A); UV/VIS dos
padrões da agatisflavona (B) e amentoflavona (C).
0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0
-3,0
0,0
2,0
4,0
7,0mAU
minA
gatisflavona -
6,0
47
Am
ento
flavona -
7,9
77
WVL:335 nm
Min
Ar
= 0
,000
Agatisflavona 100% at 6.05 min
-10,0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
60,0
190 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
%
nm
192.8
197.4
334.1338.8202.8 225.3273.7
Amentoflavona 100% at 7.98 min
-10,0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
60,0
190 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
%
nm
194.1
191.0 340.1336.2343.2332.2223.0224.9 269.3
(A)
(B)
(C)
52
Peak #33 100% at 8.93 min
-10,0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
60,0
190 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
%
nm
193.4
208.7
362.5360.0
325.5
234.8232.2
398.5
0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0
-1,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0mAU
min
Agatisflavona -
5,9
97
Am
ento
flavona -
8,0
40
WVL:335 nm
Min
Ar
= 0
,000
(B1)
(A1) Amentoflavona
Agatisflavona
(A2)
53
Figura 18: Cromatogramas da agatisflavona e amentoflavona e seus respectivos UV/VIS
referentes aos tratamentos de glicose + 1 mg.L-1 de 2,4-D (A1 e A2); sacarose + 1 mg.L-1 de
2,4-D (B1 e B2); sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D (C1 e C2).
Peak #44 100% at 8.97 min
-10,0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
60,0
190 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
%
nm
193.8
205.9200.5196.1
362.1357.0
338.2334.4331.9321.3
237.5
398.5
Peak #28 100% at 8.92 min
-10,0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
60,0
190 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
%
nm
193.6
207.4
361.2
324.3
236.6
398.5
0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0
-2,0
2,5
5,0
7,5
10,0
14,0
T6M2 4C UV_VIS_5
mAU
min
WVL:335 nm
...
Agatisflavona
Amentoflavona (C1)
(B2)
(C2)
54
4.4. Efeito dos fatores abióticos na produção de biflavonóides e massa dos calos da espécie
Poincianella pyramidalis
De acordo com a análise de variância (ANAVA), houve interação significativa entre as
fontes de carbono (glicose e frutose) e as condições de iluminação (ausência e presença de luz
não contínua) combinadas ou não.
Na Figura 19 (p. 54) observou-se um aumento crescente da massa dos calos com o
decorrer do tempo (20, 40 e 60 dias após inoculação), diferindo os tratamentos estatisticamente
entre si aos 40 e 60 dias após inoculação. Não houve diferença estatística da massa entre os dois
monossacarídeos aos 20 dias. Sendo a frutose o tratamento que melhor produziu massa aos 40
dias (0,1185 g) e 60 dias (0,2407 g). Neste estudo, a glicose foi o tratamento que menos
produziu massa (Figura 19, p. 54). Ong et al. (2011) também encontraram o mesmo resultado
para a glicose na produção de massa de Ficus deltoidea. Entretanto, Nagela et al. (2011)
encontraram uma maior produção de massa, quando o meio de cultura para Gymnema sylvestre
era suplementado com glicose. Açúcares diferentes podem ter diferentes funções reguladoras
em processos fisiológicos, e o estágio de desenvolvimento da planta determina ainda mais a
resposta aos açúcares (Rolland et al., 2006; Eveland e Jackson, 2012; Tognetti et al., 2013).
Figura 19: Efeito da glicose e frutose na produção da massa dos calos aos 20, 40 e 60 dias após
inoculação da P. pyramidalis. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
0,0215a
0,1185a
0,2407a
0,0227a
0,0849b
0,153b
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
20 dias 40 dias 60 dias
Mas
sa n
os
calo
s (g
)
Tempo
frut glic
55
Os efeitos dos açúcares no crescimento e desenvolvimento da planta são diversificados,
os quais variam em função do tipo de cultura, da concentração do carboidrato adicionado ao
meio de cultivo, dentre outros fatores, uma vez que, as redes moleculares de condução a divisão
celular e expansão dependem, em grande parte, da disponibilidade de hidratos de carbono para
fornecer energia e massa (Lastdrager et al., 2014). Sendo envolvido nesse processo, diversos
níveis de transcrição de milhares de genes para responder à alteração dos níveis de açúcar (Price
et al., 2004; Bläsing et al., 2005; Osuna et al., 2007; Usadel et al., 2008). Apesar da glicose e
frutose serem monossacarídeos e isômeros, pois apresentam a mesma fórmula molecular, estes
apresentam disposições dos seus átomos diferentes, e por essa razão, muda completamente as
características de como as plantas absorvem essas fontes de carbono para a regulação celular,
diferenciação, metabolismo celular e até a biossíntese de metabólitos. Assim, uma fonte de
hidrato de carbono adequada, bem como sua concentração, pode otimizar a produção de
metabólitos secundários em cultura de células e órgãos (Murthy et al., 2014).
Para a massa de calos houve uma diferença estatística significativa entre os tratamentos
com e sem luminosidade (Figura 20, p. 56). Apenas aos 20 dias de inoculação não se constatou
uma diferença estatística. Dessa forma, a ausência de luminosidade proporcionou ótimo
desenvolvimento e aumento de massa em calos de P. pyramidalis aos 40 e 60 dias (Figura 19,
p. 53). Esse resultado pode ser ratificado pelas observações de Golle (2010), registrando que a
ausência de luz foi extremamente favorável à formação de calos em Eugenia involucrata. Fato
também verificado por Nogueira et al. (2007), os quais verificaram, na calogênese in vitro de
B. intermedia, melhores resultados quando os explantes foram cultivados no escuro. Em
contrapartida, Chan et al. (2010) em culturas de Melastoma malabathricum, observaram que a
luz foi um fator importante na produção de massa celular, a intensidade da luz na faixa de 301-
900 lux estimulou o crescimento e produção de massa fresca dos calos. Liu et al. (2002) também
não obtiveram bons resultados sem iluminação ou com iluminação contínua em experimentos
de produção de massa nos calos de A. annua.
56
Figura 20: Efeito das condições de luminosidade na produção da massa nos calos aos 20, 40 e
60 dias após inoculação de P. pyramidalis. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre
si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A massa celular pode ser afetada por vários fatores físicos como, intensidade da luz,
fotoperíodo, temperatura e pH inicial do meio de cultivo. Nesse trabalho, pôde-se verificar que
a luz é uma fonte de energia que afeta o crescimento da massa e o acúmulo de metabólitos
secundários de células e órgãos (Murthy et al., 2014). Uma vez que, quando as células são
cultivadas na presença da luz, em certo período há o consumo total dos carboidratos, tornando
as concentrações da fonte de carbono do meio de cultura escasso, e como consequência, as
células atingem a fase de desaceleração do crescimento (Valle et al., 2006).
Neste estudo os resultados mostraram que há um acúmulo de agatisflavona e
amentoflavona nos calos suplementados com glicose ou frutose, combinados com as condições
de ausência e presença de luz (Figuras 21, p. 57 e 22, p. 58). Do ponto de vista quantitativo, os
calos cultivados em meio contendo glicose e incubação no escuro no período de 70 dias se
destacaram com concentrações de 5,87 µg.mL-1 e 6,27 µg.mL-1 de agatisflavona e
amentoflavona, respectivamente (Figuras 21, p. 57 e 22, p. 58). Wang e Weathers (2007)
verificaram o efeito de concentrações equimolares de açúcares individuais tais como sacarose,
glicose ou frutose na produção de artemisinina de culturas de Artemisia annua e relataram uma
melhoria significativa na acumulação desse metabólito em meio suplementado com glicose.
0,0125a
0,0689b
0,1107b
0,0317a
0,1345a
0,283a
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
20 dias 40 dias 60 dias
Mas
sa n
os
calo
s (g
)
Tempo
Claro Escuro
57
Figura 21. Concentrações da agatisflavona nos calos de Poincianella pyramidalis aos 40, 60 e
70 dias após inoculação, submetidos a diferentes tratamentos.
Tratamentos: Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT1); Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-
1 de 2,4-D (GT3); Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT2); Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1
mg.L-1 de 2,4-D (FT4).
A presença da luz afeta a produção de compostos na cultura mesmo sob curta exposição,
a luz pode induzir vias biossintéticas (Mustafa et al., 2011). Alguns trabalhos corroboram com
o relatado neste estudo, como Chan et al. (2010) que observaram um aumento na acumulação
de antocianinas em M. malabathricum quando se tinha uma intensidade de luz moderada (300-
600 lux). O mesmo foi registrado por Guo et al. (2007) em calos de Saussurea medusa, onde o
efeito estimulador da luz acumulou compostos fenólicos e flavonóides. E, segundo
Kokotkiewicz et al. (2014) a acumulação de biflavonóides em C. subternata mostrou-se
fortemente influenciada pela luz. Efeito da irradiação de luz sobre a produção de antocianina
em suspensão de células de Perilla frutescens foi relatada (Zhong et al., 1993). Recentemente
foi mostrado que a luz e a sinalização do carboidrato interagem com o metabolismo do ácido
indolacético (IAA) em Arabidopsis (Ljung, 2013). No entanto, a luz pode também ter um efeito
inibitório sobre a produção dos metabólitos especiais como por exemplo, a nicotina e chiconina
em Lithospermum erythrorhizon (Tabata et al., 1974), e em monoterpenos de Limon citrus
(Mulder-Krieger et al., 1988).
0,33 0,45 0,460,510,76
5,87
1,38
0,35
0,740,630,33 0,43
0
1
2
3
4
5
6
40 dias 60 dias 70 dias
Co
nce
ntr
ação
ug/m
L
GT1 GT3 FT2 FT4
58
Figura 22. Concentrações da amentoflavona nos calos de Poincianella pyramidalis aos 40, 60
e 70 dias após inoculação, cultivados em diferentes tratamentos.
Tratamentos: Escuro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (GT1); Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-
1 de 2,4-D (GT3); Escuro – Frutose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D (FT2); Claro – Frutose 30 g.L-1 + 1
mg.L-1 de 2,4-D (FT4).
Um relato interessante foi observado na Figura 22 (p. 58), no qual mostrou um aumento
da produção de amentoflavona aos 40 dias, decréscimo aos 60 e acréscimo novamente aos 70
dias após inoculação. Provavelmente, o declínio na produção da amentoflavona e agatisflavona
em todos os tratamentos aos 60 dias possa ser atribuído ao consumo de nutrientes para a síntese
de proteínas exigidas no crescimento celular. E após esse período de tempo, os calos podem ter
entrado na fase de estabilização, etapa esta em que pode ocorrer o acúmulo de metabólitos
secundários (Conceição, 2000; Lameira, 1997). Nogueira et al. (2008) investigando a curva de
crescimento de calos de murici-pequeno, verificaram que a concentração elevada de
aminoácidos aos 60 dias de cultivo coincide com a fase de desaceleração, época indicada para
a repicagem de calos e transferência para um novo meio nutritivo, indicando também uma
possível exigência metabólica do calo para o crescimento.
E por fim, ressalta-se que esse trabalho descreve pela primeira vez, a produção de massa
em calo e biflavonóides oriundos da espécie Poincianella pyramidalis, com modificações no
seu meio de cultivo e fonte de luz, sugerindo diante do exposto, mais estudos para o
estabelecimento de um protocolo próprio para este fim.
5,2
1,12
2,66
4,79
0,73
6,27
4,79
0
3,08
5,68
0,71
3,59
0
1
2
3
4
5
6
7
40 dias 60 dias 70 dias
Co
nce
ntr
ação
ug/m
L
GT1 GT3 FT2 FT4
59
5. CONCLUSÕES
- O 2,4-diclorofenoxiacético induz calos em explantes nodal, foliar e internodal de P.
pyramidalis;
- Concentrações de 6,28 mg.L-1; 6,49 mg.L-1 e 4,91 mg.L-1 de 2,4-D nos segmentos
nodal, internodal e foliar, respectivamente, favorecem, aos 30 dias, uma maior formação de
calos;
- A concentração de 10 mg.L-1 de 2,4-D proporciona maior oxidação nos calos aos 30
dias de cultivo;
- A maior formação de calos ocorre na concentração de 4,91 mg.L-1 de 2,4-D para o
explante foliar aos 30 dias de cultivo in vitro;
- O acesso de Pernambuco, produz maior massa (0,1882 g) dos calos de Catingueira;
- Em ambos os acessos, a produção de amentoflavona é maior que a de agatisflavona
em todos os tratamentos;
- Há variabilidade genética entre os acessos da Bahia e Pernambuco para a mesma
espécie.
- A maior massa em calos de P. pyramidalis ocorre no tratamento com sacarose + 5
mg.L-1 de 2,4-D;
- O período de tempo de 60 dias é ideal para a produção da massa em calos de P.
pyramidalis;
- Sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D favorece uma maior produção de amentoflavona (16,44
mg.L-1) e agatisflavona (0,58 mg.L-1);
- O tratamento GT3 (Claro – Glicose 30 g.L-1 + 1 mg.L-1 de 2,4-D) é ótimo para a
biossíntese de agatisflavona (5,87 mg.L-1) e amentoflavona (6,27 mg.L-1) aos 70 dias após
inoculação;
- A biossíntese da amentoflavona é superior a agatisflavona em todos os tratamentos
estudados;
- O tratamento com frutose e o mais indicado para a produção de massa em calos de P.
pyramidalis (0,2407 g) no período de 60 dias de cultivo;
- A ausência de luz proporciona ótimo desenvolvimento e aumento de massa em calos
de P. pyramidalis aos 40 e 60 dias de cultivo.
60
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante dos resultados apresentados pode-se concluir de maneira geral que as melhores
condições para a P. pyramidalis na indução, produção de massa nos calos e acúmulo dos
metabólitos especiais em estudo são: sacarose + 5 mg.L-1 de 2,4-D; manutenção da cultura no
escuro; uso do explante foliar; e por um período de tempo de 60 dias após inoculação sem
subcultivo.
Embora os resultados apresentados nesse trabalho contribuam grandemente para a
definição de um protocolo padrão de indução e produção de calos, como também para o
acúmulo de amentoflavona e agatisflavona na espécie P. pyramidalis, ainda assim, mais estudos
são necessários, já que cientificamente foi comprovado que os compostos produzidos por essa
espécie são farmacologicamente ativos e de grande importância. Portanto, pode-se dizer que a
biotecnologia associada com a cultura de tecidos de plantas cresce exponencialmente para
contribuir com às necessidades de uma população que a cada dia que passa precisa de drogas
com efeitos mais potentes ou com novas ações medicamentosas. Sendo interessante para
indústrias farmacêuticas a futura comercialização desses biativos.
61
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ANEXO – Autorização de Atividade de Acesso ao Patrimônio Genético, realizada de acordo
com a Resolução CGEN nº 35/2011, nº 08/2012.
79
