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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÍTALO CORDEIRO DE TOLEDO
Goiânia
2014
SÍNDROME DA ARDÊNCIA BUCAL (SAB): AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES
NERVOSAS PERIFÉRICAS EM LÍNGUA
ÍTALO CORDEIRO DE TOLEDO
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título Mestre em Odontologia.
Linha de Pesquisa: Estudo das manifestações clínicas e tratamento das lesões do sistema estomatognático
Orientadora: Profª. Drª. Rejane Faria Ribeiro-Rotta Co-orientador: Prof° Dr. Luciano Alberto de Castro
Goiânia
2014
SÍNDROME DA ARDÊNCIA BUCAL: UM ESTUDO SOBRE O
PROCESSO DE DIAGNÓSTICO, A CANDIDOSE ATRÓFICA
SUBCLÍNICA E O EFEITO TERAPÊUTICO DO CLONAZEPAM
SÍNDROME DA ARDÊNCIA BUCAL (SAB): AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES
NERVOSAS PERIFÉRICAS EM LÍNGUA
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÂO DE MESTRADO
Aluno (a): Ítalo Cordeiro de Toledo
Orientador (a): Rejane Faria Ribeiro-Rotta
Membros:
1. Rejane Faria Ribeiro-Rotta (Presidente)
2. Aline Carvalho Batista (Membro)
3. Danilo Rocha Dias (Membro)
3. Luciano Alberto de Castro (Co-orientador)
4. Nádia do Lago Costa (Suplente)
5. Robson Rodrigues Garcia (Suplente externo)
Data: 27/02/2014
Aos meus pais e meu irmão que sempre apoiaram as minhas decisões de aprimorar
o conhecimento na profissão desde a época da residência e agora no mestrado,
mostrando ter a confiança necessária para que eu enfrentasse as dificuldades.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a DEUS, minha família e minha namorada, nos
momentos mais difíceis me fizeram entender quais são as etapas essenciais para
vencermos os obstáculos. Obrigada pela minha vida.
À minha orientadora, professora Rejane Faria Ribeiro-Rotta, pela atenção,
dedicação, pelos conselhos pessoais, profissionais e pelo carinho.
Aos professores Luciano e Aline, por terem me mostrado caminhos para
sempre alcançar o melhor.
Aos colegas de mestrado Diego e Alisson que me ajudaram e estimularam
nos desafios deste trabalho. Em especial ao Diego que acabou se transformando em
um amigo.
A Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, Centro
Goiano de Doenças da Boca, Laboratório de Patologia, em espacial ao Erildo, todo o
meu orgulho e carinho a cada um de seus docentes, técnico-administrativos e
discentes que me acompanharam nesta jornada. Meu agradecimento especial à
equipe de Diagnóstico Bucal, laboratório de patologia e Centro Goiano de Doenças
da Boca.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de
Goiás, a todos os docentes e servidores pelos ensinamentos da prática docente e
científica e mais ainda pelo carinho do acolhimento e pelos exemplos.
Aos meus colegas de pós-graduação meu eterno carinho e amor por vocês.
As palavras seriam poucas para agradecer todos os momentos que passamos
juntos.
Aos pacientes, meu agradecimento especial por terem feito parte desse
sonho.
SUMÁRIO
FIGURAS, QUADRO E TABELAS, SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1.0 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ............................................................... 15
2.0 OBJETIVOS ........................................................................................................ 32
3.0 HIPÓTESE .......................................................................................................... 32
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32
4.1 População e seleção da amostra ..................................................................... 32
4.2 Técnicas utilizadas ............................................................................................ 35
4.2.1 Realização das biópsias no grupo SAB ....................................................... 35
4.2.2 Técnica de rotina (Hematoxilina e Eosina) ................................................... 36
4.2.3 Técnica de Imuno-histoquímica.....................................................................36
4.3 Avaliações qualitativa e quantitativa dos cortes microscópicos..................37
4.4 Análise estatistica dos dados .......................................................................... 37
5.0 RESULTADOS – PUBLICAÇÕES ...................................................................... 38
6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................ 55
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 56
ANEXOS E APENDICES .......................................................................................... 65
FIGURAS, QUADRO E TABELAS
Quadro 1: Divisão funcional do sistema nervoso sensorial/sensitivo 19
Figura 1. Mecanismo nociceptivo da dor da região orofacial, essencialmente pelos ramos do trigêmeo
21
Figura2. Anatomia e detalhamento esquemático das camadas microscópicas do nervo
26
Figura 3. Diagrama histológico do nervo 27
Figura 4. Inervação sensorial da língua, no seus terços médio-anterior e posterior
29
Figura 5. Fluxograma de trabalho evidenciando a metodologia após diagnóstico da SAB primária
35
RESULTADOS - PUBLICAÇÃO
Figura1. Fotomicroscopias de mucosa lingual do grupo controle evidenciando revestimento epitelial e queratinização normais (A) e do grupo SAB (B). Hematoxilina e Eosina, aumento original de 200X. (A) e 100X (B)
51
Figura 2. Fotomicroscopias de espécimes obtidos de mucosa lingual do grupo SAB. Hematoxilina e Eosina, aumento original de 200X (A). Imuno-histoquímica, aumento original de 200X (B) e 400X (C) Figura 3. Fotomicroscopias ilustrando densidade similar de filetes nervosos (FN) S100+ (seta pontilhada), FN PGP 9.5+ (seta contínua) e mastócitos triptase+ (ponta de seta), distribuídos na região subepitelial, entre amostras de mucosa lingual de pacientes com SAB (A-C) e de pacientes saudáveis (D-F). Imuno-histoquímica, aumento 40x (A-F). Tabela 1. Comparação da densidade de filetes nervosos (mm2) dos grupos SAB e controle, quantificados pelas técnicas de imunohistoquímica (S100, PGP9.5) e HE, expressos pela média, desvio padrão, valores mínimo e máximo, razão S100/PGP9.5
52 53 54
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
CGDB Centro Goiano de Doenças da Boca
COEP Comitê de ética e pesquisa
DAB
ENE FN
Diaminobenzidina
Enolase Neuronio Específica
Filetes Nervosos
FO/UFG Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás
HE
H2O2
NP
Hematoxilina e Eosina
Peróxido de Hidrogênio
Nervo Periférico
PBS-BSA Soro albumina bovina (Bovine serium albumin)
SAB
SNP SNC
Síndrome da ardência Bucal
Sistema Nervoso Periférico
Sistema Nervoso Central
TBS Solução salina tamponada de Tris
TCLE
TSQ
MST
EAV
SD
Termos de Consentimento Livre e Esclarecido Teste Sensorial Quantitativo Mastócitos triptase positivos
Escala analógica visual
Desvio padrão
RESUMO
A síndrome da ardência bucal (SAB) é uma condição dolorosa crônica, de origem
incerta que pode afetar vários sítios da mucosa bucal, sendo a língua o sítio mais
frequente. Alguns estudos têm sugerido que a ardência lingual nos pacientes
portadores de SAB pode estar associada a alterações nervosas periféricas.
Objetivo: Avaliar a densidade e integridade de filetes nervosos (FN) na região
subepitelial da mucosa lingual de pacientes com diagnóstico de SAB primária.
Materiais e Métodos: A densidade (por mm²) de FN periféricos foi avaliada
comparativamente em amostras de mucosa lingual de pacientes clinicamente
diagnosticados com SAB primária (n=12) e de indivíduos com ausência de sinais e
sintomas de ardência (grupo controle) (n=11). FN S100+ (células de Schwann
positivas) e PGP 9.5+ (axônios íntegros positivos) foram identificados pela técnica da
imuno-histoquímica (métodos de polímeros). Resultados: Os achados revelam que
pacientes com SAB apresentam densidades similares de FN periféricos S100 +
(mediana= 3,7/mm²) quando comparados ao grupo controle (mediana= 2,6/mm²)
(P=0,65). A densidade de FN íntegros ou PGP 9.5+ também foi semelhante entre os
grupos avaliados (mediana= 0,7 e 0,8mm², respectivamente; P=0,72). Além disso, a
relação entre FN S100+ / PGP 9.5+ nos pacientes com diagnóstico clínico de SAB e
controles foi igual (P=0,7). Conclusão: Pacientes com diagnóstico clínico de SAB
primária não apresentaram alterações em morfologia, densidade e integridade de
axônios de FN periféricos em regiões sintomáticas da língua. A SAB primária é uma
doença complexa, debilitante, cujo conhecimento de fatores envolvidos na sua
etiopatogenia pode proporcionar que novas modalidades terapêuticas sejam
instituídas a partir de bases cientificas sólidas em beneficio do paciente. Os dados
clínicos permanecem como mais relevantes no processo de diagnóstico de SAB.
Palavras-Chave: Síndrome da ardência bucal, Biopsia em língua, PGP 9.5, Proteína
S-100
ABSTRACT
The burning mouth syndrome (BMS) is a painful chronic condition of unknown
origin that can affect various sites of the oral mucosa, and tongue the most
frequent site. Some studies have suggested that the burning tongue in patients
with BMS may be associated with peripheral neuropathic changes. Objective:
To evaluate the density and integrity of nerve endings (FN) in the subepithelial
region of the lingual mucosa of patients with primary diagnosis of BMS.
Materials and Methods: The density (mm²) of peripheral FN was
comparatively evaluated in samples of lingual mucosa of patients clinically
diagnosed with primary BMS (n = 12) and subjects with no signs and symptoms
of burning (control group) (n = 11). FN S100 + (positive Schwann cells) and
PGP 9.5 + (positive intact axons) were identified by the technique of
immunohistochemistry (methods of polymer). Results: The findings show that
patients with BMS have similar densities FN peripheral S100 + (median = 3.7 /
mm ²) compared to the control group (median = 2.6 / mm ²) (P = 0.65). The
density of intact FN or PGP 9.5 + was also similar among the groups (median =
0.7 and 0.8 mm ², respectively, P = 0.72). Furthermore, the relationship
between S100 FN + / + PGP 9.5 in patients clinically diagnosed with BMS and
controls was similar (P = 0.7). Conclusion: Patients with primary clinical
diagnosis of BMS showed no changes in morphology, density and integrity of
axons of FN in symptomatic peripheral regions of the tongue. The primary BMS
is a complex, debilitating illness, whose knowledge of factors involved in its
pathogenesis may provide new therapeutic modalities that are imposed on solid
scientific basis for the benefit of the patient. Clinical data remain as the most
important in the diagnosis of BMS process.
Keywords : Burning mouth syndrome, neuropathy, immunohistochemistry
15
1.0 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
1.1. SAB: definições, epidemiologia, classificação, etiologia e diagnóstico
As ardências na cavidade bucal são descritas há várias décadas,
entretanto, as primeiras publicações científicas sobre ardência idiopática na
língua só ocorreram no início do século XX (FOX, 1935; ZISKIN & MOULTON,
1946). Em 1994 a “International Association for the Study of Pain (IASP)”,
definiu a Síndrome da Ardência Bucal (SAB) como ardência na língua ou em
outros sítios da mucosa bucal, que persiste por pelo menos quatro meses, na
ausência de achados clínicos e laboratoriais (MERSKEY & BOGDUK, 1994).
Posteriormente, em 2004, e sendo o conceito mais atual, a “International
Headache Society (IHS)” descreveu a SAB como uma sensação de ardência
intrabucal não associada a causas médicas ou odontológicas e que pode estar
associada à xerostomia, parestesia e disgeusia (INTERNATIONAL
HEADACHE SOCIETY, 2004; BALASUBRAMANIAM, 2009). Várias são as
denominações utilizadas para designar a SAB, as quais incluem: glossodínia,
glossopirose, estomatopirose, estomatodínia e distesia oral, porém, apesar de
questionada por alguns estudiosos, a expressão Síndrome da Ardência Bucal é
a denominação mais amplamente utilizada (SILVERMAN, 1967; ELI et al.,
1994.; GREMEAU-RICHARD C et al., 2004).
A SAB tem uma prevalência na população em geral que varia de 0,7%
a 20,6% (LIPTON et al., 1993; BERGDAHL & BERGDAHL, 1999; DANGORE-
KHASBAGE et al., 2012), sendo uma desordem tipicamente observada em
mulheres (7:1), na faixa etária de 38 a 78 anos de idade (GRUSHKA, 1987;
BERGDAHL & BERGDAHL, 1999; SCALA et al., 2003), sem predileção por
etnia ou classe socioeconômica (BARKER & SAVAGE, 2005).
Diversas classificações têm sido propostas para a SAB, sendo a
sintomatologia e a evolução clínica dos pacientes os principais parâmetros de
avaliação. Com base no exame da cavidade bucal, Burket (1973) classificou as
algias linguais em dois grupos: pacientes com e sem alterações observáveis
clinicamente, considerando a etiologia deste último grupo de natureza
psicogênica. Alguns anos mais tarde, com o intuito de ampliar a observação
clínica, Lamey e Lewis (1989) propuseram a classificação da SAB em três tipos
16
distintos: no tipo 1, os pacientes conseguem dormir e acordam sem a ardência,
que surge pela manhã e vai se intensificando no decorrer do dia, atingindo o
pico no final da tarde ou início da noite; o tipo 2 é caracterizado por ardência
contínua durante o dia e a noite, dificultando o sono dos pacientes; e o tipo 3
tem um curso clínico irregular, no qual os sintomas são intermitentes e os
pacientes podem experimentar horas ou dias sem ardência.
A classificação da SAB mais utilizada foi proposta por Scala et al 2003
e consiste em duas formas clínicas: a forma primária, essencial ou idiopática na
qual não podem ser identificadas causas locais ou sistêmicas para a ardência,
estando possivelmente relacionada a alterações neuropáticas dificilmente
detectáveis, e a forma secundária, na qual estaria associada com fatores locais
ou sistêmicos.
A etiologia da SAB primária ainda não é totalmente compreendida e a
maioria dos estudos aponta para uma complexa associação de fatores locais,
sistêmicos e psicológicos, suportando uma gênese multifatorial na qual haja a
participação de constituintes salivares, distúrbios hormonais, alterações
nervosas periféricas e centrais, bem como fatores psicogênicos (GRUSHKA et
al.,1987; BERGDAHL & BERGDAHL, 1999; HERSHKOVICH & NAGLER, 2004;
AL QURAN, 2004; GRANOT & NAGLER, 2005; PATTON et al., 2007;
SCARDINA et al., 2008; WANDEUR et al., 2009; MATSUOKA, 2010; WODA et
al., 2009; JÄÄSKELÄINEN 2012).
Mais recentemente, estudos neurofisiológicos, psicofisiológicos,
neuropatológicos e com ressonância magnética funcional têm evidenciado que
o mecanismo essencial para a instalação da SAB está associado a alterações
sensitivas a nível central, periférico ou misto. Esses estudos indicam a biopsia
incisional da área afetada, geralmente a língua, para avaliação microscópica
das alterações neuropáticas a nível periférico, por meio de técnicas
laboratoriais como imuno-histoquímica e imunofluorescência, podendo
contribuir para o diagnóstico e direcionamento de terapias específicas (LAURIA
et al., 2005; YILMAZ et al., 2007; PENZA 2010).
O primeiro grande desafio para o tratamento da SAB é exatamente o
seu diagnóstico (MIGNOGNA et al., 2005), visto que não existe qualquer teste
clínico ou laboratorial que possa determinar, de maneira inequívoca, o seu
17
diagnóstico definitivo. Assim, o processo de identificação da SAB converte-se
em um exercício de raciocínio clínico minucioso, sendo necessária uma coleta
sistemática de informações e aplicação de testes diagnósticos diversos para
atingir, pelo método da exclusão, um possível diagnóstico (BARKER e
SAVAGE, 2005; MIGNOGNA et al., 2005; CASTRO, 2013).
O algoritmo para o diagnóstico da SAB deve iniciar-se com a
anamnese detalhada seguida pelo exame físico minucioso da mucosa bucal.
No entanto, o diagnóstico final deve ser confirmado por meio de exames
hematológicos, testes de hipersensibilidade, biópsia lingual e exames
microbiológicos para identificação e cultura de fungos (PENZA et al., 2010).
Após a identificação e exclusão de todos os prováveis fatores locais e
sistêmicos associados à ardência, tem-se o diagnóstico final da SAB primária
(SCALA et al., 2003; MINOR & EPSTEIN, 2011; CASTRO, 2013).
1.2. Evidência para etiologia neuropática da SAB
A dor em queimação ou ardência é característica de muitas condições
associadas à lesão do tecido nervoso e alterações somatosensoriais. A
hipótese de que a SAB pode tratar-se de uma condição envolvendo o sistema
nervoso periférico e/ou o central tem recebido, ultimamente, uma atenção
especial.
1.2.1. Revisitando a neurofisiologia da dor Uma compreensão da inervação sensitiva e motora das estruturas
bucais e da face e, consequentemente, da atividade nociceptiva (transdução,
transmissão, percepção e inibição) da região é essencial para diferenciar um
processo fisiológico de um patológico e possibilitar o diagnóstico e tratamento
eficaz de uma neuropatia. O sistema nervoso (nervos periféricos sensitivos e
motores, a medula espinhal, o tronco cerebral e o cérebro) forma uma
complexa rede de vias aferentes e eferentes para transmitir e reagir aos
impulsos que o cérebro “percebe” como dolorosos. Todas as informações
advindas do meio que cada indivíduo é exposto são percebidas/sentidas por
18
ele de forma específica, por meio do seu sistema nervoso sensorial (Quadro
1). A dor é uma experiência desagradável complexa, eminentemente sensorial
e emocional, que ocorre em resposta a um estímulo nociceptivo (nocivo ou
potencialmente nocivo) detectado pelos chamados nociceptores. Os
nociceptores compõem o grupo dos receptores sensoriais, os quais são células
ou estruturas especializadas que, funcionalmente, convertem estímulos
diversos em sinais elétricos (transdução) (BERNE & LEVY, 2009).
A sensibilidade da região orofacial, incluindo a sensibilidade dolorosa,
é transmitida essencialmente pelos três ramos do nervo trigêmio. Após o
estímulo nociceptivo, as fibras aferentes primárias (neurônio de primeira ordem
– fibras A-delta: mielinizadas, rápidas, dor em “pontada”; fibras C: amielínicas,
lentas, dor em “queimação”) recebem estímulo e o conduzem para o tronco
cerebral, onde fazem sinapse com o neurônio de segunda ordem, no complexo
sensorial trigeminal. Esse complexo se divide em núcleo Principal e Núcleo do
Trato Espinhal, que consiste de 3 subnúcleos: oral, interpolar e caudal. O
subnúcleo caudal parece ser o principal local para o processamento e
transmissão da dor orofacial (Figura 1). Esses estímulos transmitidos são
interpretados pelo cérebro como dolorosos, extremamente desagradáveis e
desencadeiam ações protetoras, memórias e emoções (BARON, 2000).
A sensação de dor quando gerada no tecido neural propriamente dito,
tendo como característica a ausência de qualquer fonte obvia de nocicepção, é
denominada neuropática, comumente associada a outros sintomas
neurológicos como queimação, hiperalgesia (Figura 1) e disestesia. A
investigação clínica é realmente um desafio, uma vez que este tipo de dor
apresenta-se sem um substrato clínico evidente. Dentre as sensações
dolorosas, a manifestação em queimação ou ardência presente na SAB, em
conjunto com a ausência de possíveis fatores locais, tem sido caracterizada
como uma dor neuropática (BARON, 2000; OKESON, 2006).
19
Quadro 1 – Divisão funcional do sistema nervoso sensorial/sensitivo. Fonte: o autor (GRAY, C.; GOSS, C. M. Anatomia. 29. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1998.; KAHLE, W.; FROTSCHER, M. Anatomia - Texto e Atlas (Sistema nervoso e órgãos dos sentidos). v.3. 9. ed. Porto Alegre: Artmed. 2008.)
Categoria Origem do estímulo
Organização Sensibilidade Tipo de Receptores
Estímulo / Estrutura
Somático Exteroceptivo (Superfície do corpo – pele e mucosas)
Geral (Somestesia)
Calor / Frio
Termoreceptores Resultam da estimulação de diferentes receptores desigualmente distribuídos na pele; corpúsculos de Kauser; corpúsculos de Ruffini.
Tato Mecanoceptores
Corpúsculos de Meissner: contatos leves, são distribuídos na pele e principalmente na língua, lábios, testa e ponta dos dedos;
Pressão
Mecanoceptores
Corpusculos de Paccini: localizados mais profundamente
Dor Nociceptores
São os mais abundantes no organismo humano, respondem a estímulos mecânicos, químicos e térmicos. Além das superfícies, estão também nos músculos esqueléticos, tendões e vísceras
Especial (Sentidos especiais)
Olfação
Gustação
Audição
Visão
Equilíbrio
Receptores específicos
Órgãos sensoriais localizados na cabeça, que são estimulados por substancias voláteis dispersas no meio ambiente (epitélio olfativo), substancias químicas que se solubilizam na saliva (botões gustativos), ondas mecânicas sonoras (células ciliadas da cóclea), imagens dos objetos no meio ambiente (cones e bastonetes na retina), aceleração da cabeça (células ciliadas ouvido interno)
Proprioceptivo (músculos, tendões, articulações)
Geral (Cinestesia)
Propriocepção Proprioceptores Modificações do próprio corpo: posição, equilíbrio (órgãos tendinosos de Golgi, fusos musculares, receptores articulares)
20
Visceral Interoceptivo (Vísceras)
Geral Sentido visceral
Receptores viscerais
Sensações de fome e sede (homeostasia), alterações provocadas por extensão das paredes (receptores elásticos), sensação de bexiga cheia (vários receptores na pleura e peritônio)
21
Figura 1 – Mecanismo nociceptivo da dor da região orofacial, essencialmente pelos ramos do trigêmeo (mandibular – azul; maxilar – verde; oftálmico – rosa). A1 e A2) Estímulo ativa receptores nociceptivos da língua (pela liberação de substancias da inflamação como prostaglandinas, histamina, substancia P, serotonina, etc) que geram um potencial de ação (transdução), o qual é B) conduzido pelas fibras aferentes para a C) raiz dorsal da medula espinhal/ complexo sensorial trigeminal, onde fazem sinapse com o neurônio de segunda ordem que transmitem o estímulo (transmissão) para áreas mais superiores do D) sistema nervoso central (trato espinotalâmico, hipotálamo, tálamo e córtex cerebral), onde os estímulos são interpretados e as reações/sensações ocorrem.
A1
B
A2
C
D
22
Fonte: modificado de http://www.medicinanet.com.br/imagens/20121218101957.jpg; http://www.medicinanet.com.br/imagens/20121218101940.jpg
23
1.2.2. Indícios de disfunção neuropática na SAB
O diagnóstico de dor neuropática associada à neuropatia periférica
pode ser difícil ou até impossível com apenas o exame clínico. Nesses casos, a
investigação clínica neurofisiológica pode contribuir de forma importante para o
diagnóstico, especialmente quando usada em combinação com testes
sensoriais quantitativos (TSQ) (ROBINSON, 2000; TEERIJOKI-OSKA et al.,
2004; ENGLAND et al., 2005; KEHLET et al., 2006; LOSETH et al., 2006;
JAASKELAINEN, 2009).
Grushka et al. (1987) realizaram o primeiro estudo psicofísico
detalhado em pacientes com SAB, utilizando métodos para investigar
modalidades sensoriais táteis e térmicas na região orofacial, incluindo a
mucosa lingual, denominados testes sensoriais quantitativos (TSQ)1. Apesar de
não terem demonstrado diferença significante entre o grupo de pacientes e
controle, os autores observaram que pacientes com SAB apresentavam
diminuição da tolerância a dor pelo calor na região anterior da língua quando
comparados aos pacientes saudáveis, ou seja, a dor se tornava insuportável
em menos tempo e com temperaturas mais elevadas especificamente na
região anterior da língua dos pacientes com SAB. Porém, sem qualquer relação
com sexo, idade, raça ou variações atitudinais. Eles concluem que esses
resultados não sugerem uma origem psicogênica, mas que possíveis
alterações específicas nas funções sensoriais periféricas ou centrais dos
pacientes com SAB poderiam estar presentes.
Evidências mais convincentes do envolvimento local de pequenas
fibras nervosas podem ser observadas num estudo de TSQ utilizando
estimulador de laser de argônio (SVENSSON et al., 1993), o qual identificou
limiares sensoriais (quantidade de estímulo suficiente para a sua percepção)
significativamente maiores (hipoestesia e hipoalgesia, ou seja, sinais negativos)
e a razão entre dor e limiares sensoriais significativamente menor em pacientes
com SAB em todas as regiões testadas (região anterior da língua, mucosa
labial, mucosa bucal, palato duro e dorso da mão) de pacientes com SAB,
quando comparados ao grupo controle. Por outro lado, as variações dos
1 TSQ – Teste sensorial quantitativo é o melhor teste psicofísico disponível para avaliar clinicamente a
função das fibras sensoriais aferentes (ex: estímulo termo-elétrico) (VERDUGO & UCHOA, 1993)
24
limiares sensoriais e de dor das diferentes regiões intrabucais e de pele
testadas foram semelhantes em ambos os grupos, exceto para região anterior
da língua onde ocorreu diferença estatística em pacientes com SAB. Esses
achados caracterizaram a presença de percepções anormais do estimulo
prévias à sensação de dor e distúrbios na percepção de estímulos térmicos
nociceptivos e não-nociceptivos, tanto nas regiões acometidas pela SAB como
em regiões normais. Isso sugere que embora haja uma alteração de natureza
sensorial, ela não está relacionada à mecanismos fisiopatológicos específicos
da SAB (KEHLET et al., 2006) e os autores sugerem que uma explicação
psicosomática poderia ser utilizada com cautela. (SVENSSON et al., 1993).
Estes achados poderão ser melhor esclarecidos ou confirmados com novos
estudos.
A SAB tem sido sugerida ser um tipo de dor fantasma induzida em
indivíduos susceptíveis que apresentam alterações do sistema gustativo
(BARTOSHUK et al, 1999). Sinais positivos de distúrbios da vasoreatividade a
estímulos frios em pacientes com SAB, a qual se encontra aumentada em
relação ao grupo controle, também tem sido descritos (HECKMANN et al.,
2001), o que está alinhado com o fenômeno sensorial de redução da tolerância
a dor.
Estudo com a combinação de testes eletrofisiológico convencional (ex.:
reflexo de piscar2) e psicofísico (TSQ) tem fortalecido e contribuído para o
melhor entendimento da hipótese do mecanismo neural e do nível dessa
disfunção nos pacientes com SAB (FORSSEL et al., 2002). Este fato deve-se à
possibilidade desse tipo de estudo (FORSSEL et al., 2002) avaliar não apenas
a função das fibras nervosas mielinizadas (reflexo de piscar) (JAASKELAINEN
et al., 1997), mas também a das fibras sensoriais finas aferentes (VERDUGO &
UCHOA, 1993), bem como a documentação objetiva do fenômeno sensorial
positivo na forma de alodínia e hiperalgesia térmicas. Os resultados desse
2 REFLEXO DE PISCAR: Reflexo ou arco reflexo é uma resposta eferente a um estímulo aferente. O ramo aferente
do reflexo de piscar (blink reflex) é mediado por fibras sensoriais do nervo oftálmico (V) divisão do trigêmeo e o
ramo eferente é mediado por fibras motoras do nervo facial (VII). Assim, estudo do reflexo de piscar é uma técnica
eletrofisiológica convencional útil para avaliar pacientes com: envolvimento dos nervos trigemio e facial; uma
variedade de polineuropatias demielinizantes e lesões do tronco encefálico. Esse reflexo possui dois componentes:
(1) um primário (R1), ipsilateral ao lado do estímulo, cuja alteração ou ausência indica comprometimento do nervo
trigêmeo e/ou facial do lado estimulado e (2) um tardio (R2), presente no dois lados após estímulo unilateral, que
indica o sítio da lesão quando R1 está anormal. ( Kimura J. Eletrodiagnosis in diseases of nerve and muscle:
principles and practice. Philadelphia: FA Davis, 1983.)
25
estudo que avaliou a trajetória neural periférica e central do sistema trigeminal,
em uma amostra ampla de pacientes com SAB (FORSSEL et al., 2002),
revelaram quatro diferentes categorias: aqueles com neuropatia do tronco
encefálico ou trigeminal periférica (19%) – anormalidade do reflexo de piscar;
(2) com aumento da excitabilidade do sistema trigeminal (21%) – habituação
deficiente do componente R2 do reflexo de piscar e alodínia no TSQ; (3) com
disfunção exclusiva das fibras finas (76%) - hipoestesia e (4) aqueles com
testes eletrofisiológicos normais (11%).
1.2.3. Alterações neurohistopatológicas na SAB
O sistema nervoso é constituído de uma parte central (SNC), no interior
do cérebro e coluna vertebral e de um sistema nervoso periférico (SNP),
distribuído por todo corpo. É no SNC que está a grande maioria das células
nervosas, seus prolongamentos e os contatos que fazem entre si. No sistema
nervoso periférico estão relativamente poucas células, mas um grande número
de prolongamentos chamados fibras nervosas, agrupados em conjuntos de
filetes alongados chamados nervos.
1.2.3.1. Histofisiologia dos Nervos Periféricos
Os nervos periféricos são linhas condutoras que levam informações
sensoriais da pele, mucosas e de outras regiões ao SNC e informações
motoras do SNC para os músculos somáticos e órgãos efetores controlados
pelo sistema nervoso autônomo. São feixes de fibras nervosas mielinizadas ou
não, unidos por tecido conjuntivo. Microscopicamente os nervos são
constituídos por axônios e células de Schwann (fibras nervosas) localizados
nos compartimentos endoneurais, que são circundados pelo perineuro (filete
nervoso - FN); este por sua vez forma fascículos individuais que são envoltos
por tecido fibroso epineural (nervo) (Figura 2) (RIET-CORREA 2001,
JUNQUEIRA 2006).
O epineuro é um tecido conjuntivo que tem a função de manter os
fascículos neurais reunidos e funciona como uma barreira semipermeável.
Além de fibroblastos, esse tecido também apresenta mastócitos, colágeno,
vasos sanguíneos e fibras elásticas. O perineuro, por sua vez, é formado por
26
camadas concêntricas de células planas que são separadas por lâminas de
colágeno. Essas células perineurais, eventualmente, fundem-se com os
axônios dos nervos sensitivos na sua porção terminal e são contráteis, pois
apresentam microfilamentos característicos das células musculares lisas. No
endoneuro se localizam os axônios envoltos pelas células de Schwann, bem
como fibras colágenas, fibroblastos, capilares e alguns mastócitos. O espaço
endoneural é interno ao perineuro e contém uma matriz extracelular constituída
de glicoproteínas. Essa matriz, produzida pelas células endoneurais, é
responsável pela manutenção do ambiente iônico das fibras nervosas favorável
à condução do impulso nervoso (RIET-CORREA, 2001, JUNQUERIA 2006)
(Figura 3).
Figura 2 - Anatomia e detalhamento esquemático das camadas microscópicas (corte transversal) do nervo (A,B). Ep = epineuro; P = perineuro; En = endoneuro; Seta = axônio; círculo = células de Schwann (B).
Fonte: Adaptado de:
A=Alila Medical Media/ Shutterstock.com;
B= http://minerva.ufpel.edu.br/~mgrheingcd_histologia/geral/snp.htm;
A
B
27
Durante o processo de desenvolvimento embrionário, as células da
crista neural migram do pólo dorsal do embrião e se diferenciam em uma
variedade de tipos celulares. Esses tipos celulares incluem melanócitos, células
endócrinas, músculos lisos, cartilagem, tecido ósseo, neurônios periféricos e
células de Schwann, sendo estas últimas fundamentais na formação dos
nervos periféricos (SHAN et al., 1994).
Figura 3. Diagrama histológico do nervo. O epineuro (EP) contém colágeno, vasos
sangüíneos e algum tecido adiposo. As células do perineuro (PN) são unidas por
junções oclusivas (adesão) formando camadas lamelares separadas por fibras de
colágeno. As células de Schwann, localizadas no endoneuro (EN) formam lamelas de mielina (M) que circundam os axônios de maior diâmetro. Múltiplos axônios não mielinizados (UM) são invaginados através do citoplasma das células de Schwann. Outros elementos, incluindo fibroblastos (Fb), mastócitos (Mc), capilares (cap) e colágeno (col) também são vistos. Fonte: Ortiz-Hidalgo & Weller, 1997.
28
As células de Schwann e seus precursores têm um papel crucial no
desenvolvimento dos nervos periféricos, em especial as células mielinizantes,
fundamentais na manutenção da função e arquitetura dos axônios (MIRSKY &
JESSEN, 2001). Essa interação sináptica entre as células de Schwann e as
glicoproteínas da matriz endoneural inicia com um sinal do axônio, que age no
recrutamento, na diferenciação e proliferação de populações celulares
potencialmente mielinizantes e na iniciação da síntese e manutenção das
moléculas específicas da mielina (GRAÇA, 1988).
Outro evento importante, regulado pelas células de Schwann, é a
formação dos nodos de Ranvier. Há uma forte correlação entre a presença de
células de Schwann (não necessariamente em contato direto com o axônio), e
a presença de agregados focais de canais de sódio (Na+) nas membranas
axonais. Isto é visto em um grande número de situações: durante o
desenvolvimento do nervo, durante o reparo seguido por destruição química da
mielina e quando células de Schwann são acrescentadas a axônios in vitro
(MIRSKY & JESSEN, 2001).
1.2.3.2. Aspectos microscópicos e inervação da língua
Uma visão microscópica do dorso lingual normal, pela técnica de
hematoxilina e eosina (HE), revela uma mucosa com epitélio pavimentoso
estratificado queratinizado, com projeções papilares. Subjacente, observa-se o
tecido conjuntivo densamente colagenizado, contendo algumas células
inflamatórias e presença de pequenos FN (ramificações de nervos cranianos
maiores) dispostos na região subepitelial (JUNQUEIRA 2006).
A inervação sensitiva da língua é feita por três pares de nervos
cranianos: a) Trigêmio - sensibilidade geral (dor e temperatura) nos 2/3
anteriores; b) Facial - sensibilidade gustativa nos 2/3 anteriores; c)
Glossofaríngeo - sensibilidade geral e gustativa no 1/3 posterior. Entretanto,
como as fibras do facial chegam à língua através do nervo lingual, apenas três
nervos estabelecem contato direto com a língua, ou seja, o hipoglosso, o
glossofaríngeo e o nervo lingual, ramo da divisão mandibular (V3) do trigêmio.
Os receptores sensitivos especializados na gustação, os receptores
especializados em captar estímulos tácteis, de pressão, dor e temperatura
29
situam-se na membrana mucosa que reveste o dorso da língua (Figura 4)
(MADEIRA, 2001).
Figura 4 - Inervação sensorial da língua, no seus terços médio-anterior e posterior
Fonte: O autor.;
http://4.bp.blogspot.com/-WqvJXXnxeSU/TfaQnuJFuwI/AAAAAAAAAB8/5nyjvVfb5Lk/s1600/tato.jpg
http://wine4soul.files.wordpress.com/2013/03/papillae___tastebuds.jpeg
1.2.3.3. Proteínas neuronais: funções e sítio de imunomarcação
Algumas proteínas neuronais têm sido utilizadas como alvo de estudo
de patologias que acometem os tecidos neurais, como processos inflamatórios,
degenerativos e neoplásicos. Entre estas proteinas, destacam-se a S100
(HALAWI, 2013) e a 9.5 (DAY & THOMPSON, 2010).
A S100 é uma proteína ácida, ligante de cálcio, expressa por células
gliais como os astrócitos e células se Schwann, que ocorre em três formas
diméricas: S100ao, S100A e S100B compostas de αα, αβ e ββ subunidades,
respectivamente. Nos tecidos normais, as subunidades α e β estão associadas
às células gliais do SNC, às células estreladas da adenohipófise, melanócitos e
30
condrócitos. A subunidade α é expressa exclusivamente em macrófagos nodais
e neurônios, e a β é expressa exclusivamente em células de Schwann e células
satélites do sistema nervoso periférico (SHÄFER & HEINZMAN, 1996). Essa
proteína possui como principais funções a manutenção da homeostasia do
citoesqueleto, fosforilação de proteínas, regulação do fluxo de cálcio,
crescimento celular, quimiotaxia e controle da condução do impulso nervoso.
Estas funções podem estar associadas aos monócitos/macrófagos/microglia,
astrócitos, células de Schwann, neurônios, mastócitos, linfócitos, neutrófilos,
condrócitos, células endoteliais e vascular do músculo liso, células epiteliais e
mioblastos. (HALAWI, 2013). O anticorpo monoclonal anti-S100 humano tem
sido bastante utilizado para avaliação de tecidos de origem nervosa, sendo
este um marcador de células de Schwann (HALAWI, 2013). No entanto, a baixa
especificidade deste marcador, contribui para que outros marcadores nervosos
sejam utilizados em estudos de alterações de fibras nervosas.
O PGP 9.5 é uma proteína citoplasmática presente em neurônios e
células de origem neuroendócrina, inicialmente descrita no cérebro e depois no
sistema nervoso periférico, cuja função ainda é desconhecida (THOMPSOM
1983). Através das técnicas de imunomarcação é possível visualizar esta
proteína em axônios íntegros e observar a densidade destas estruturas na
região subepitelial e em terminações nervosas epiteliais. Mediante uma
diminuição da expressão do PGP 9.5, sugere-se uma possível degeneração
axonial, como esperado nas neuropatias (DAY & THOMPSON, 2010). A
utilização do anticorpo monoclonal anti-PGP 9.5 humano em associação com
outros marcadores neurais como, por exemplo, o uso do anticorpo anti-S100
humano, pode contribuir para a avaliação de estruturas nervosas e de sua
integridade.
1.2.3.4. Utilização de proteinas neuronais na SAB: imuno-histoquímica e imunofluorescência
O conhecimento das características morfológicas do sítio mais
frequentemente acometido na SAB, o dorso lingual, juntamente com alguns
achados científicos que caracterizam a síndrome como uma possível
neuropatia periférica foram os principais aspectos que motivaram estudos por
meio de biópsias em áreas sintomáticas da língua de pacientes com
31
diagnóstico de SAB primária e, posteriormente, a realização de técnicas
laboratoriais para análise microscópica da densidade de FN intra e subepiteliais
(LAURIA et al., 2005; YILMAZ et al., 2007; BENENG et al., 2010; PENZA et al,
2010; PUHAKKA et al., 2010).
A utilização das técnicas laboratoriais de imunomarcação, como a
imunofluorescência e imuno-histoquímica, para a identificação de
neurotransmissores como a substância P (produto gênico relacionado ao gene
da calcitonina), a Enolase Neurônio Específica (ENE) e, principalmente, o
produto gênico anti-proteico (PGP 9.5) têm se mostrado métodos de destaque
e de grande sensibilidade para estudar FN terminais, tanto em padrões normais
de distribuição da inervação, quanto em situações patológicas do sistema
nervoso periférico, em especial nos processos que comprometem as fibras
mielínicas de pequeno calibre e as amielínicas (LAURIA et al., 2005).
Guarneri et al (2008) realizaram um estudo utilizando a técnica de
imuno-histoquímica em amostras de áreas afetadas pela ardência bucal
revelando a presença de alterações nas fibras nervosas de pequeno diâmetro
(tipo C) em pacientes com SAB, corroborando com a possível etiologia
neurológica periférica. Tais alterações, segundo este estudo, poderiam estar
relacionadas com a densidade e/ou a funcionalidade dos receptores de
membrana presentes nas terminações nervosas da mucosa bucal.
Alguns estudos têm mostrado que uma diminuição da densidade das
terminações nervosas amielínicas na mucosa bucal, e um desarranjo difuso
dos axônios na SAB o qual apresenta uma associação negativa com a duração
dos sintomas da SAB, uma vez que quanto maior a duração dos sintomas
menor era a densidade de FN. Além disso, a degeneração axonal pode induzir
uma sensibilização de fibras nervosas e ser responsável pela hiperalgesia
persistente (LAURIA et al., 2005, YILMAZ et al., 2007; BENENG et al., 2010).
Embora alguns estudos tenham demonstrado que a SAB está
associada a alterações nos FN periféricos (LAURIA et al., 2005; YILMAZ et al.,
2007; PENZA 2010) e uma tentativa de caracterização microscopica das
alterações morfológicas presentes nessa patologia tenha sido sugerida
(GUARNERI et al., 2008; PUHAKKA et al., 2010), muitos aspectos do
mecanismo fisio e histopatológico precisam ser elucidados, o que vem justificar
os objetivos desse estudo, cujo resultados poderão contribuir para o
32
esclarecimento da etiopatogenia da SAB levando á tratamentos mais
adequados e efetivos.
2.0 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a densidade e integridade de FN na região subepitelial da
mucosa lingual de pacientes com diagnóstico de SAB primária.
3.0 HIPÓTESE
Espera-se encontrar diminuição da densidade dos FN periféricos em
áreas sintomáticas para ardência dos pacientes com diagnostico inicial de SAB
primária em relação ao grupo controle assintomático.
4.0 MATERIAIS E MÉTODOS
Este subprojeto originou-se do estudo intitulado: “Estudo clínico, microbiológico
e terapêutico da candidose atrófica subclínica em dorso lingual de pacientes
com SAB“, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFG (COEP-UFG)
pelo protocolo de número 053/11 (Anexo 1). Todos os indivíduos que
concordaram em participar da investigação assinaram os Termos de
Consentimento Livre e Esclarecidos (TCLE) do projeto original (Apêndice 1) e
dessa nova pesquisa (Apêndice 2).
4.1 População e seleção da amostra
A população elegível para o estudo foi constituída por indivíduos com
diagnostico prévio de SAB e que estão em acompanhamento regular no Centro
Goiano de Doenças da Boca da Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal de Goiás (CGDB-FO-UFG). O novo TCLE foi apresentado aos
pacientes incluídos no estudo original durante as visitas de retorno dos
mesmos, para que o provável sujeito da pesquisa, no momento do primeiro
encontro e após a leitura e possíveis esclarecimentos, assinasse o TCLE caso
concordasse em participar da referida etapa da pesquisa. O termo foi assinado
em duas vias, sendo uma entregue ao paciente e outra arquivada pelo
33
pesquisador. Foi garantido o sigilo que assegura a privacidade dos sujeitos
quanto aos dados confidenciais envolvidos na pesquisa, bem como a
confidencialidade, que se refere à responsabilidade sobre as informações
obtidas em exames e observações pelo pesquisador em relação aos dados
pessoais dos sujeitos da pesquisa.
Também foram selecionadas amostras controle de mucosa lingual
normal, obtidas dos arquivos de lâminas e blocos do Laboratório de Patologia
Bucal do CGDB-FO-UFG, as quais são oriundas de lesões em língua, não
neoplásicas, onde tivesse sido realizada técnica de biopsia excisional com
margem de segurança. Esses espécimes são provenientes de pacientes que
foram atendidos no ambulatório de Estomatologia do CGDB-FO-UFG, os quais
possuem prontuários com todas as informações clínicas para permitir a
identificação daqueles que não apresentavam queixa de ardência bucal e para
o pareamento por sexo e idade.
No exame físico, inicialmente, os sinais vitais (pressão arterial, pulso e
temperatura) foram verificados e registrados. A avaliação extrabucal incluiu a
palpação dos linfonodos, da articulação temporomandibular e dos músculos da
mastigação. O exame intrabucal constou de inspeção e palpação da mucosa
bucal em todos os seus sítios, avaliação da condição geral dos dentes e do
periodonto, bem como o uso e estado de conservação de próteses removíveis
totais e parciais.
Nessa seleção da amostra, foram excluídos os pacientes que
apresentaram ardência lingual há menos de quatro meses e aqueles que
exibiam alterações físicas no dorso lingual, especificamente, língua geográfica,
língua fissurada, eritema, despapilação evidente e lesões sugestivas de líquen
plano. Todos os pacientes excluídos da pesquisa que necessitavam que algum
tipo de tratamento, deram continuidade ao mesmo no CGDB-FO-UFG ou foram
devidamente encaminhados.
Pacientes com história de Diabetes Mellitus foram temporariamente
excluídos e encaminhados para avaliação médica. Havendo comprovação
laboratorial de bom controle glicêmico, estes pacientes bem controlados eram
então reincluídos na pesquisa. De modo similar, os usuários de medicamentos
inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA), cujo uso crônico pode
causar ardência bucal como um efeito colateral (TRIANTOS & KANAKIS, 2004;
34
BROWN et al., 2006) foram encaminhados ao médico para a substituição do
medicamento. Se a ardência lingual persistisse mesmo após a interrupção do
uso dos inibidores da ECA, os pacientes eram também reincluídos na
pesquisa.
Os pacientes com sintomatologia de ardência ou disestesia lingual
persistente por quatro meses ou mais e que apresentavam o dorso lingual
clinicamente normal foram submetidos à avaliação hematológica sistemática
por meio dos seguintes exames complementares: hemograma completo,
glicemia de jejum, dosagens séricas de ferro, ferritina, vitamina B12, folato,
zinco, T3, T4 e TSH (MARAGOU & IVANY, 1991; JÄÄSKELÄINEN et al., 1997;
FEMIANO et al., 2008; BORELLI et al., 2010; JUST et al., 2010; GRÉMEAU-
RICHARD et al., 2010 e CHO et al., 2010). Pacientes com anormalidades
nesses exames foram excluídos da pesquisa e encaminhados para avaliação
médica. Após esse processo de diagnóstico por exclusão, aqueles pacientes
que apresentaram ardência lingual ou disestesia há pelo menos quatro meses,
acompanhada ou não de disgeusia e xerostomia, na ausência de alterações
patológicas locais e doenças sistêmicas foram incluídos como grupo portador
de SAB primária.
Considerando as amostras selecionadas, dois grupos foram
constituídos: grupo controle - amostras de mucosas saudáveis assintomáticas
(n=11); grupo SAB – espécimes de mucosa lingual de pacientes com
diagnóstico de SAB (n=12). Assim, os pacientes que foram diagnosticados com
SAB primária e aceitaram participar da pesquisa, foram orientados e
encaminhados para realização da biopsia incisional em região sintomática da
língua (Figura 5).
35
Figura 5 - Fluxograma de trabalho evidenciando a metodologia após diagnóstico da SAB primária.
4.2 TÉCNICAS UTILIZADAS
4.2.1 Realização das biópsias no grupo SAB
Os pacientes participantes da pesquisa que foram diagnosticados com
SAB, cujos sintomas em língua ainda persistiram, foram submetidos à biopsia
incisional na área sintomática, por um único cirurgião, e o espécime foi fixado
em formol 10% tamponado. As amostras foram enviadas, juntamente com uma
ficha contendo informações médicas e odontológicas desses pacientes, ao
Laboratório de Patologia Bucal do CGDB-FO-UFG.
Realização do exame anatomopatológico
(Hematoxilina/Eosina)
Seleção das amostras controle nos arquivos do Laboratório de Patologia
Bucal.
Pareamento por sexo e idade das amostras
histológicas de pacientes dos arquivos do CGDB-FO-
UFG sem queixa de ardência bucal
6
4
7
População elegível: Pacientes com
ardência bucal, que passaram pelo processo de
diagnóstico por exclusão, tiveram
diagnóstico final de SAB e estão em
acompanhamento no CGDG-FO-UFG
Inclusão de pacientes para biopsia incisional no grupo SAB
Realização de biopsias incisionais em área
sintomática da lingual no grupo SAB
+ Envio dos espécimes ao
laboratório de patologia FO-UFG
Avaliação microscópica da densidade de filetes nervosos
nos cortes em HE e imunomarcados
Analise qualitativa e quantitativa dos resultados
1
2
3
Técnica de imuno-histoquímica para identificação das priteínas
S100 e PGP 9.5
5
36
4.2.2 Técnica da Hematoxilina e Eosina
Os espécimes foram incluídos em parafina, seccionados em cortes
consecutivos de 5 µm (micrótomo Leica RM2165) e, posteriormente, colocados
sobre lâminas histológicas e corados pelo método de Hematoxilina e Eosina
(HE). Esses cortes foram utilizados para caracterização microscópica das
amostras e para quantificação da densidade de estruturas com morfologia de
FN.
4.2.3 Técnica da Imuno-histoquímica
A partir dos casos selecionados (Grupos controle e SAB), emblocados
em parafina, foram obtidos cortes seriados com aproximadamente 3µm de
espessura (micrótomo Leica RM2165), montados em lâminas silanizadas, eles
foram submetidos a técnica da imuno-histoquímica pelo método do polímero
(Starr Trek Universal HRP Detection System), para identificação das proteínas
PGP 9.5 e S100. Inicialmente, os cortes sobre as lâminas foram
desparafinizados em xilol e hidratados em banhos crescentes de álcool etílico.
Em seguida, as lâminas foram incubadas em citrato (pH=6.0) (SIGMA, P4809,
Saint Louis – USA), aquecido à uma temperatura de 95ºC com auxílio de
Banho Maria Digital (DeLeo) por 25 minutos, para exposição antigênica. Após
lavagem com TBS, as lâminas foram mergulhadas em peróxido de hidrogênio a
3%, por aproximadamente 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram
lavadas com TBS e, em seguida, incubadas com solução para bloqueio das
proteínas endógenas (BIOCARE's Background Sniper) por 15 minutos. Após
esta etapa, as lâminas foram incubadas com o anticorpo primário monoclonal
de camundongo anti-PGP 9.5 humano (CodeNo.Z 5116, Dako) a uma diluição
de 1:300 e anti-S100 humano a uma diluição de 1:1000 (Code N1573, Dako),
durante 8 horas a 40C. Passado o tempo, lavagens consecutivas foram
realizadas e, posteriormente, as lâminas foram incubadas com o Sistema Trek
Universal Link por 20 minutos. Novamente as lâminas foram lavadas com TBS
e incubadas com o Sistema TrekAvidin-HRP (Label) por 20 minutos. Em
seguida, procedeu-se à revelação da reação utilizando o 3.3’-Diaminobenzidina
(DAB) em uma solução cromogênica, por 1 minuto à temperatura ambiente. A
reação foi interrompida com água destilada e as lâminas contra-coradas com
37
hematoxilina, por 30 segundos, à temperatura ambiente. Após serem lavadas
com água corrente por 10 minutos, as lâminas foram desidratadas com álcoois,
passadas em xilol e montadas com solução de resina não aquosa (Entellan-
Mikroskopie-Merck). Controles negativos foram obtidos pela omissão do
anticorpo primário, que foi substituído por 1% PBS–BSA e soro de
camundongo (501 X-1, Dako).
4.3 Avaliações qualitativa e quantitativa dos cortes microscópicos
As lâminas coradas em HE foram submetidas à análise qualitativa,
investigando-se as seguintes características microscópicas: a espessura do
epitélio, presença de infiltrado inflamatório, queratinização, vascularização, a
morfologia e distribuição dos filetes nervosos. A densidade de FN (por mm²) foi
avaliada nos espécimes corados em HE. A densidade de FN S100+ , PGP 9.5 +
e corados em HE foi avaliada utilizando um microscópio óptico no aumento de
40x em aproximadamente 20 campos. Para a quantificação, utilizou-se um
reticulo de integração em rede quadrada (474068000000- Netzmikrometer
12,5X, Carl Zeiss, Göttingen, Germany) possibilitando assim a avaliação da
densidade de FN/mm². Dois examinadores previamente calibrados, numa
análise cega avaliaram todas as secções e a concordância entre examinadores
foi de 95% (kappa).
4.4 Análise estatística dos dados:
A normalidade dos dados foi realizada pelo teste de Shapiro-Wilk. A
mediana (valores mínimos e máximos) dos resultados de FN S100+/mm2, PGP
9.5+/mm2, da razão S100+mm2/PGP 9.5+mm2 e de FN corados em HE/mm2 do
grupo SAB e do grupo controle foram obtidas. A diferença entre os grupos foi
avaliada pelo Teste de Mann-Whitney para variáveis independentes. Foram
considerados significativos valores de P < 0,05. A análise estatística foi
realizada utilizando o software Statistical Package for the Social Sciences,
versão 20 (SPSS, Chicago, IL).
38
5.0 RESULTADOS - PUBLICAÇÃO
Investigação da densidade de filetes nervosos periféricos e mastócitos
em biópsias de língua de pacientes com síndrome da ardência bucal
Ítalo Cordeiro de Toledoa, Diego Antonio Costa Arantesb, Luciano Alberto de
Castroc, Aline Carvalho Batistad, Rejane Faria Ribeiro-Rottae
aDepartment of Stomatology (Oral Diagnosis), Dental School, Federal
University of Goiás, Goiânia, Brazil; E-mail: [email protected]
bDepartment of Stomatology (Oral Pathology), Dental School, Federal
University of Goiás, Goiânia, Brazil; E-mail: [email protected]
cDepartment of Stomatology (Oral Diagnosis), Dental School, Federal University
of Goiás, Goiânia, Brazil; E-mail: [email protected]
dDepartment of Stomatology (Oral Pathology), Dental School, Federal
University of Goiás, Goiânia, Brazil; E-mail: [email protected]
eDepartment of Stomatology (Oral Diagnosis), Dental School, Federal
University of Goiás, Goiânia, Brazil; E-mail: [email protected]
Correspondence to:
Dra. Rejane Faria Ribeiro-Rotta
Disciplina de Diagnóstico bucal, Faculdade de Odontologia, Universidade
Federal de Goiás
Praça Universitária S/N
Setor Universitário CEP: 74605-220
Phone/Fax: +55 62 32096067
E-mail: [email protected]
39
Resumo
Alterações na densidade de filetes nervosos periféricos e concentrações
alteradas de neuropeptídeos, produzidos por mastócitos, têm sido associados
aos sintomas da síndrome da ardência bucal (SAB). O objetivo deste estudo foi
avaliar comparativamente a densidade e integridade de filetes nervosos (FN) e
densidade de mastócitos em mucosa lingual sintomática de pacientes com SAB
(grupo SAB, n=12) e mucosa lingual clinicamente saudável (Controle, n=11). O
diagnóstico clínico de SAB foi realizado, após processo minucioso de exclusão.
FN S100+ (células de Schwann+), FN PGP 9.5+ (axônios íntegros+) e mastócitos
triptase+ (MST) foram identificados pela técnica da imuno-histoquímica e a
densidade de células por mm2 estabelecida. Os achados revelaram densidade
similar de FN S100+ (mediana= 3,7/mm²) e de FN PGP 9.5+ (mediana =
0,7/mm²) no grupo SAB quando comparado ao controle (mediana= 2,6/mm²
(P=0,65) e 0,8/mm² (P=0,72), para S100 e PGP 9.5 respectivamente). Além
disso, a relação entre FN S100+/PGP 9.5+ nos pacientes com SAB e controles
foi proporcional (P=0,7). Foi observado também MST em todas as amostras
de SAB, em densidade semelhante entre este grupo (mediana= 29,24
MST/mm2) e o grupo controle (mediana= 26,01 MST/mm2) (P=0,64). Pacientes
com diagnóstico clínico de SAB não apresentaram alterações em morfologia e
densidade nos axônios de FN periféricos em mucosa lingual sintomática. Além
disso, a semelhança da densidade de MST entre o grupo SAB e grupo controle
pode indicar a não participação dessas células na sensibilização dos FN
periféricos, embora o status de ativação e secreção dos mediadores químicos
dos MST não tenha sido avaliado.
Keywords: Burning mouth syndrome; PGP 9.5; tongue biopsy; S-100 protein;
mast cells.
Abbreviations: SAB, síndrome da ardência bucal; FN, filetes nervosos; MST,
mastócitos triptase positivos, EAV, escala analógica visual; HE, hematoxilia e
eosina, SD, desvio padrão.
40
INTRODUÇÃO
Síndrome da ardência bucal (SAB) é caracterizada por uma sensação
de queimação intrabucal não associada a causas médicas ou odontológicas, e
que pode estar relacionada à xerostomia, parestesia, hipersensibilidade e
disgeusia (SCALA et al., 2003, BALASUBRAMANIAM et al., 2009). Esta
doença ocorre com maior frequência em mulheres, de meia idade e idosas, no
período de pós-menopausa, correspondendo 1,5 a 5,5% desta população
(RILEY et al., 1998 e BERGDAHL et al., 1999, ARAVINDHAN et al., 2014). Os
sítios mais afetados são a língua (região anterior e bordas laterais), lábios e
palato duro e mole (BERGDAHL, 1999, SCALA et al., 2003). Trata-se de uma
patologia complexa e debilitante, de etiologia desconhecida e até o momento
não há um tratamento satisfatório para controle da sintomatologia dos
pacientes (ZAKRZEWSKA et al., 2001, SCALA et al., 2003, ARAVINDHAN et
al., 2014).
Vários estudos têm investido em caracterizar a etiopatogenia da SAB
(YILMAZ et al., 2007, LAURIA et al., 2005, NASRI-HEIR et al., 2011, BENENG
et al., 2010, TAN et al., 2014, PEKINER et al., 2008, SARDELLA et al., 2011),
em especial investigando mecanismos neuropáticos, como alterações na
morfologia e densidade filetes nervosos (FN) periféricos (YILMAZ et al., 2007,
LAURIA et al., 2005) e a concentração de neuropeptídeos, produzidos por FN e
células do tecido conjuntivo como os mastócitos (BORELLI et al., 2010).
Acredita-se em geral, que um fator inicial não conhecido, induz as fibras
nervosas a produzirem e liberarem grande quantidade de Fator de Crescimento
Nervoso (NGF) e este mediador químico juntamente com outros neuropeptídios
(por exemplo, SP) (PAYAN et al., 1984, KULKA et al., 2008), parece induzir
uma hipersensibilidade agindo nos FN periféricos da mucosa bucal. Além
disso, estes neuropeptídios podem estimular a secreção de proteases e outros
mediadores químicos por mastócitos residentes na mucosa bucal, mantendo
assim a inflamação neurogênica (KULKA et al., 2008).
A base neuropática para SAB tem sido acompanhada por queixas de
alterações no paladar, na intensidade dolorosa ou em outras percepções
sensoriais (SCALA et al., 2003). Disfunções nociceptivas e térmicas na língua
(FORSSELL et al., 2002; GAO et al., 2000; GRUSHKA & SESSLE, 1991) e
41
anormalidades no reflexo trigêmeo-facial das fibras nervosas de pequeno
diâmetro (FORSSELL et al., 2002) tem sido relatados em pacientes com SAB.
Além disso, a biópsia tem sido indicada para investigação da etiologia e
diagnóstico dessa patologia (YILMAZ et al., 2007, LAURIA et al., 2005,
BENENG et al., 2010; PENZA et al., 2010) e alguns estudos observaram menor
densidade de fibras nervosas epiteliais em amostras de SAB e caracterizaram
a doença como uma neuropatia de pequenas fibras sensoriais (YILMAZ et al.,
2007, LAURIA et al., 2005; PENZA et al., 2010). Beneng et al. (2010)
descreveram uma maior densidade de fibras nervosas P2X3+ subepiteliais em
amostras teciduais de pacientes com SAB sugerindo que a expressão da
proteína P2X3 em FN possa participar dos sintomas da doença (BENENG et
al., 2010). Yilmaz et al. (2007), demonstraram ainda similaridade na densidade
de terminações nervosas subepiteliais entre pacientes SAB e controle (YILMAZ
et al., 2007).
Neste contexto de alterações neuropáticas, tem sido relatado ainda que
a secreção de neuropeptídios e outros produtos da degranulação de mastócitos
são base da patogênese de várias patologias idiopáticas e de algumas
desordens neuropáticas (PEJLER et al., 2010, THEOHARIDES et al., 2007),
levantando assim possibilidade de uma relação com a SAB. Recentemente, foi
demonstrado elevada concentração salivar de triptase em pacientes com SAB,
sugerindo uma participação dos mastócitos na sintomatologia da doença
(BORELLI et al., 2010). Entretanto, até o presente momento nenhum estudo
avaliou a densidade dessas células em mucosa bucal sintomática de pacientes
com SAB.
Estudos sobre a etiologia da SAB podem contribuir para o
estabelecimento do tratamento desta patologia em benefício dos pacientes.
Considerando o caráter debilitante dessa doença para pacientes com idade
avançada, a dificuldade no processo de diagnóstico clínico (ZAKRZEWSKA et
al., 2001, SCALA et al., 2003, ARAVINDHAN et al., 2014) e a sua etiologia
incerta e controversa (JÄÄSKELÄINEN et al., 2012), neste estudo nós
investigamos comparativamente a densidade e integridade de FN periféricos e
a densidade de mastócitos em amostras de mucosa lingual de pacientes com
diagnóstico clínico de SAB e de indivíduos saudáveis.
42
MATERIAIS E MÉTODOS
Seleção da amostra
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos (CEB/UFG Protocolo 053/2011). Neste estudo transversal, foram
incluídas amostras de mucosa lingual, provenientes de pacientes com
diagnóstico clínico de SAB (grupo SAB, n=12), submetidos à biópsia incisional
na região anterior do dorso de língua e amostras de mucosa lingual
clinicamente saudável (grupo controle, n=11), selecionadas do Centro Goiano
de doenças da Boca (Laboratório de Patologia Bucal), da Universidade Federal
de Goiás, Brasil.
Diagnóstico clínico da SAB
Os pacientes do grupo SAB foram selecionados do ambulatório de
Estomatologia do Centro Goiano de Doenças da Boca, Faculdade de
Odontologia, Universidade federal de Goiás, Brasil e todos previamente ao
inicio da pesquisa, assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido
(TCLE). O diagnóstico clínico de SAB foi realizado após processo minucioso de
exclusão, utilizando critérios clínicos e testes complementares conforme
apresentado na figura 1. Os pacientes foram submetidos à avaliação de
desordens metabólicas e infecciosas, deficiência vitamínica e outras doenças
sistêmicas. Infecções orais foram descartadas pela cultura microbiológica oral e
a severidade da dor foi avaliada utilizando a escala analógica visual (EAV).
Pacientes com sensibilidade ao contato com materiais odontológicos, alergias
alimentícias, lesões clínicas na língua e causas conhecidas para
polineuropatias foram excluídas do estudo.
Avaliação da Dor
A gravidade da dor foi avaliada pela EAV, conforme Yilmaz et al.,
(2007) previamente à biópsia de língua. A EAV consiste em uma linha
horizontal de 10 cm em que, à esquerda, há a indicação ausência de dor
(EVA=0) e, à direita, pior sintomatologia dolorosa possível (EVA=10). Os
43
pacientes foram assinalaram na reta o equivalente à intensidade da dor. Além
dessa escala, todos foram orientados a relatar qualquer outra sensação
alterada como anestesia, hipersensibilidade, parestesia e disgeusia.
Biópsia da mucosa lingual
As biópsias de todos os pacientes com SAB (n=12) foram realizadas
por um único Cirurgião dentista, em sítios sintomáticos da região anterior do
dorso de língua. Após anestesia local com lidocaína 2%, foi removido de cada
paciente um espécime de aproximadamente 5 mm, imediatamente fixado em
formol tamponado a 10% e encaminhado para análise histopatológica.
Análise Microscópica
Os espécimes obtidos pelas biópsias foram incluídos em parafina,
seccionados em cortes consecutivos de 5 µm (micrótomo Leica RM2165) e
posteriormente corados pelo método de Hematoxilina e Eosina (HE). Esses
cortes foram utilizados para caracterização microscópica das amostras e
quantificação da densidade (por mm²) de FN periféricos. A espessura da
queratina das amostras SAB e controle foram medidas (em mm) utilizando uma
régua milimétrica ligada a um microscópio de luz (200x).
Imuno-histoquímica
A técnica de imuno-histoquímica foi realizada conforme descrito por
Aikaterini et al. e Costa et al. (2009). Cortes seriados com aproximadamente
3µm de espessura (micrótomo LeicaRM2165) foram obtidos dos casos
selecionados e montados em lâminas silanizadas. Para recuperação antigênica
das proteínas S100 e PG 9.5, as seções foram imersas em tampão citrato
(pH=6.0), aquecido à uma temperatura de 95ºC, por 25 minutos. Não foi
realizada recuperação antigênica para a proteína Triptase. Em seguida, os
cortes foram incubados com seus respectivos anticorpos primários previamente
submetidos à etapa de padronização: anticorpo monoclonal de camundongo
anti-PGP 9.5 humano (Z5116, Dako, diluição 1:300), anti-S100 humano
(N1573, Dako, Diluição 1:1000) e anti-triptase humano (M7052, DAKO,
Glostrup, Denmark, diluição 1:2000) durante 8 horas à 40C. Posteriormente, as
seções foram incubadas com o Kit Starr Trek Universal HRP Detection System
(Biocare Medical, CA, EUA). Em seguida, procedeu-se à revelação da reação
utilizando o 3.3’-Diaminobenzidina (DAB) em uma solução cromogênica, por 40
segundos à temperatura ambiente. Os controles negativos foram obtidos pela
44
omissão do anticorpo primário, o qual foi substituído por solução salina
tamponada com fosfato (PBS; NaCl 0,4 mM , NaPO4 10 mM) contendo 1% de
soro albumina bovino (BSA) e por soro não-imune de coelho (X0902 ,DAKO)
ou camundongo (X501-1, DAKO).
Avaliações qualitativa e quantitativa dos espécimes
As lâminas coradas em HE foram submetidas à análise qualitativa,
investigando as seguintes características microscópicas: integridade do
revestimento epitelial, ausência ou presença de queratina e sua espessura,
intensidade do infiltrado, colagenização e distribuição e morfologia dos FN na
região subepitelial, avaliando a presença dos envoltórios neurais e células de
schwann. Foi quantificada também em HE, a densidade de FN periféricos
utilizando microscópio óptico (aumento 400x) na região subepitelial.
As amostras imunomarcadas foram submetidas à análise quantitativa,
em aproximadamente 20 campos microscópicos alternados (aumento 400x),
avaliando-se a densidade de FN S100+, FN PGP 9.5+ e de mastócitos triptase+
(MST) na região subepitelial, utilizando microscópio óptico, com retículo de
integração em rede quadrada (474068000000- Netzmikrometer 12,5X, Carl
Zeiss, Göttingen, Germany). Todas as seções foram analisadas de forma cega
por dois examinadores previamente calibrados.
Análise estatística dos dados
Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do
programa IBM SPSS 20.0 (Corporation, New York, USA) e Prism (GrahPad
Prism 5; GrahPad Software, California, USA). O teste de Shapiro-Wilk revelou
uma distribuição não-normal dos dados. Para a análise comparativa da
densidade de filetes nervosos e de mastócitos entre os grupos SAB e controle
foi utilizado o Teste de Mann-Whitney. Foram considerados estatisticamente
significativos valores de P < 0,05.
RESULTADOS
Todos os pacientes com diagnóstico clínico de SAB (n=12) eram
mulheres (100%), com idade média de 67 anos e apresentavam sintomatologia
dolorosa de queimação nos ⅔ anteriores do dorso de língua com intensidade
média de 6,8 ± 0,94 (SD), segundo a EAV. Nenhuma paciente relatou perda do
45
paladar e da sensação térmica da boca ou outra alteração sensorial. A queixa
de xerostomia foi relatada por 9 pacientes (75%) durante a avaliação inicial da
anamnese. Não foi observada infecção oral em nenhuma das culturas
microbiológicas avaliadas.
A análise do grupo controle (n=11) revelou predomínio do sexo
feminino (78%), com idade média de 62 anos (IC: 51-73). Fragmentos de
mucosa lingual oriundos de lesões em língua, não neoplásicas, onde tivesse
sido realizada técnica de biopsia excisional com margem de segurança, foram
utilizados como tecido saudável.
A análise dos cortes em HE da região anterior da língua revelaram
similaridade quanto à integridade do revestimento epitelial, espessura da
camada de queratina e colagenização entre os casos do grupo SAB e controle
(Figura 2 A-F). Foram observados FN íntegros na região subepitelial em todas
as amostras de SAB avaliadas, com distribuição e morfologia semelhante aos
FN observados no grupo controle (Figura 2 C e F). Todas as amostras do
grupo SAB apresentaram estruturas basofílicas na superfície epitelial
sugestivas de biofilme (Figura 2 A).
A presença de um possível biofilme em todas as amostras de SAB e a
queixa de xerostomia pela maioria dos pacientes do mesmo grupo gerou a
necessidade de se investigar a presença de fungos nos cortes histológicos.
Esse procedimento, não havia sido previsto na metodologia, considerando que
os pacientes do grupo SAB passaram pelo critério de exclusão da presença de
infecção subclínica por Candida. As colorações por impregnação de prata (PAS
e Grocott) não revelaram a presença de fungos.
Todas as amostras de SAB apresentaram estruturas como morfologia
de FN S100+ (células de schwann+) e FN PGP 9.5+ (axônios íntegros+), na
região subepitelial, com padrão de coloração acastanhado e homogêneo. A
análise quantitativa revelou que pacientes com SAB apresentam densidades
similares de FN periféricos S100+ (mediana= 3,7/mm²) quando comparados ao
grupo controle (mediana= 2,6/mm²) (P=0,65). A densidade de FN íntegros ou
PGP 9.5+ também foi semelhante entre os grupos avaliados (mediana= 0,7 e
0,8mm², respectivamente; P=0,72). Além disso, a relação entre FN S100+/PGP
9.5+ nos pacientes com diagnóstico clínico de SAB e controles foi igual (P=0,7)
(Tabela 1, Figura 3).
46
A técnica de imuno-histoquímica, revelou também células triptase+ com
coloração acastanhada e morfologia de mastócitos, na região subepitelial
próximo a vasos sanguíneos em todas as amostras de SAB avaliadas, em
densidade similar entre este grupo (mediana= 29,24 MST/mm2) e o grupo
controle (mediana= 26,01 MST/mm2) (P=0,64) (Tabela 1, Figura 3).
DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou similaridade da densidade de FN S100+, FN PGP
9.5+ e mastócitos triptase+ entre amostras de mucosa lingual sintomáticas de
pacientes com SAB e amostras controle. Estes achados sugerem que a
integridade e densidade de FN periféricos não se alteram em pacientes com
SAB. Além disso, possivelmente os mastócitos não participem de forma direta
na sensibilização destes FN e consequentemente na sintomatologia da doença.
Em relação à densidade das terminações nervosas periféricas e
corroborando com nossos achados, Yilmaz et al. (2007), observaram
densidade similar de fibras nervosas na região subepitelial entre amostras de
mucosa lingual sintomáticas de pacientes com SAB e amostras controle
(YILMAZ et al., 2007). Contrapondo nossos dados Lauria et al. (2005),
observaram baixa densidade de fibras nervosas epiteliais PGP 9.5+ nos ⅔
anteriores da língua de pacientes SAB em relação ao controle, sugerindo ser
uma neuropatia de fibras trigeminais (LAURIA et al.,2005). Adicionalmente,
Penza et al., 2010 também demonstraram um redução significativa da
densidade de terminações nervosas epiteliais em 75% (n=38) dos pacientes
sintomáticos e indicam a biópsia como procedimento auxiliar no diagnóstico da
SAB (PENZA et al., 2010). No entanto, a análise quantitativa desses estudos
(LAURIA et al.,2005; PENZA et al., 2010) foi restringida somente às fibras
nervosas epiteliais.
Beneng et al. (2010) demonstraram ainda maior densidade de fibras
nervosas P2X3+, na região subepitelial de amostras SAB em relação ao grupo
controle, embora não tenha sido especificado os critérios de diagnóstico
utilizados para caracterização clínica da doença (BENEG et al., 2010). Esses
resultados também devem ser analisados com cautela, devido à diferença na
média de idade entre os pacientes e controle que variou em 22 anos (BENENG
et al., 2010). Nosso estudo não revelou diferenças na morfologia e densidade
de FN periféricos entre amostras SAB e controle analisadas. Embora não
47
tenhamos caracterizado a SAB como uma neuropatia, devemos considerar que
a nocicepção é um processo amplo, pode envolver sítios mais abrangentes
como o tronco nervoso central e não somente os sítios periféricos e esta
relacionada a uma série de outros fatores como, por exemplo, à secreção e
ação de neuropeptídios. (VERMA et al.,2014).
Recentemente, visando investigar a concentração de neuropeptídeos em
pacientes com SAB, Borelli et al. (2010), observaram maior concentração
salivar de triptase em pacientes com a doença e sugeriu a participação de
mastócitos na etiologia da SAB (BORELLI et al., 2010). Para o nosso
conhecimento, o presente estudo foi o primeiro que avaliou a densidade de
MST em mucosa lingual sintomática de pacientes com SAB. Foram observados
MST em todas as amostras de SAB e em densidade semelhante ao grupo
controle. Alguns estudos têm mostrado a participação dos mastócitos em
doenças idiopáticas e em algumas condições neuropáticas (PEJLER et al.,
2010, THEOHARIDES et al., 2007). Estas células residentes no tecido
conjuntivo, são importantes na secreção de neuropeptídeos (KULKA et al,
2008) e existe forte evidência de interações funcionais entre MTS e FNs na
mucosa oral em humanos (WALSH, 2003).
Nossos achados indicam a não participação dos MTS na sensibilização
dos FN periféricos, embora o status de ativação e secreção de mediadores
químicos por essas células não tenha sido avaliado. Proteínas, como o NGF,
estimulam mastócitos a secretar vários mediadores como, por exemplo, a
triptase, envolvidos na inflamação (GALLI et al, 2005; KULKA et al, 2008) e na
dor neuropática (KAWABATA et al, 2001) atuando de forma direta nestes
eventos patológicos. Possivelmente a quantidade de mediadores químicos
secretados por mastócitos, dependente da sua ativação e não
necessariamente da sua densidade, possa desempenhar um papel importante
na sintomatologia da SAB. No entanto, mais estudos deverão ser realizados
para melhor compreensão da relação do perfil de ativação e secreção destas
células com a SAB.
A etiopatogenia, os critérios de diagnóstico e tratamento eficaz da SAB
ainda não estão esclarecidos. Estudos futuros deverão ser realizados para
investigar outros testes sensoriais, a ação de novos medicamentos sobre os
receptores nervosos periféricos e a concentração salivar de outros
48
neuropeptídios e citocinas, que atuam sobre as vias nociceptivas e possam ser
considerados biomarcadores de diagnóstico e prognóstico na SAB. Estes
estudos poderão auxiliar na melhor compressão da fisiopatologia da SAB e na
indicação de terapêuticas mais eficazes para melhor qualidade de vida dos
pacientes com idade avançada.
Os resultados deste estudo mostram que não há diferença quanto a
morfologia e densidade de FN periféricos e de mastócitos triptase+ entre
amostras de pacientes com diagnóstico clínico de SAB e controle. Diante dos
nossos achados acreditamos que outros mecanismos neuropáticos estejam
associados à etiologia da SAB e a biópsia não está indicada para o diagnóstico
desta doença, sendo ainda os testes clínicos e complementares a conduta
mais favorável e menos invasiva para diagnóstico desta patologia.
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51
Figura 1. Fluxograma das etapas do processo de diagnóstico clínico da SAB em pacientes com
ardência lingual (adaptada de CASTRO LA, 2013).
Pacientes com SAB e ardência lingual
com Candidíase
Pacientes com SAB e ardência lingual sem Candidíase
Pacientes com SAB e ardência lingual que não
aderiram à pesquisa
Pacientes com SAB e ardência lingual que aderiram à pesquisa
Pacientes com SAB e
ardência lingual Pacientes com SAB sem
ardência lingual
Pacientes com diagnóstico
inicial de SAB Exclusão de pacientes com fatores local e/ou
sistêmicos para ardência bucal
Pacientes com queixa de
ardência bucal
Exames clínico e complementar
Exame clínico
EVA, Sialometria, Contagem de colônias
Terapia antifúngica, EVA, Sialometria, Contagem de
colônias
Pacientes selecionados para
o estudo
52
Figura 2. Representação microscópica da semelhança morfológica quanto ao revestimento epitelial e tecido conjuntivo entre amostras SAB (A-C) e
controle (D-F). Observam-se ainda estruturas basofílicas (ponta de seta) sugestivas de biofilme na superfície epitelial em amostra de SAB (A). Em maior
aumento nota-se a presença de FN íntegros (setas) e em densidade semelhante nos dois grupos (C e F). Hematoxilina e Eosina, aumento 10x (A e D), 20x (B
e E) e 40x (C e F).
53
Figura 3. Fotomicroscopias ilustrando densidade similar de filetes nervosos (FN) S100+ (seta pontilhada), FN PGP 9.5
+ (seta contínua) e mastócitos
triptase+ (ponta de seta), distribuídos na região subepitelial, entre amostras de mucosa lingual de pacientes com SAB (A-C) e de pacientes saudáveis (D-F).
Imuno-histoquímica, aumento 40x (A-F).
GRUPO SAB
GRUPO CONTROLE
54
Tabela 1. Comparação da densidade (em mm2) de FN S100
+ e
PGP 9.5
+, FN corados pela técnica de HE e de mastócitos triptase
+ entre os
grupos SAB e controle, expressos pela mediana e valores máximo e mínimo.
(*)Teste de Mann-Whitney, P<0,05
Mediana Valores
Mínimo ± Máximo
Mediana Valores
Mínimo ± Máximo
Valor P*
S100+ (FN ∕ mm
2) 3,7 0 ± 22,3 2,6 0 ± 10 0,66
PGP 9,5+ (FN ∕ mm
2) 0,7 0 ± 7,3 0,8 0 ± 5,2 0,72
Razão (FN S100+ ∕ FN PGP 9,5
+) 0,4 0 ± 12,4 0,4 0 ± 15,7 0,74
HE (FN ∕ mm2) 1,1 0 ± 9,7 2,08 0 ± 10,4 0,35
Mastócitos triptase+ (células ∕ mm
2) 29,24 5,2 ± 95,54 26,01 1,73 ± 87,4 0,64
55
6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A etiologia da SAB primária vem se concretizando no meio científico e tornando a neuropatia a principal responsável por
esta patologia. Apesar da nossa população do estudo ter sido pequena, os resultados mostram que a SAB é uma patologia de
natureza degenerativa, axonial crônica. Novos estudos devem ser execultados, tentando elevar o numero das amostras, acréscimo
de outras técnicas laboratoriais (avaliação microscópica das moléculas envolvidas na SAB, novas avaliações de marcadores
imuno-histoquímicos) e testes clínicos para ampliar o entendimento da etiopatogenia da SAB primária, objetivando melhores
opções de tratamento para oferecer uma maior qualidade de vida aos pacientes.
56
7.0 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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65
ANEXOS / APENDICES
66
ANEXO 1
67
APÊNDICE 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO - TCLE
Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário (a), de uma pesquisa. Meu nome é LUCIANO ALBERTO DE CASTRO,
sou o pesquisador responsável e minha área de atuação é Odontologia, especificamente, o diagnóstico e tratamento das doenças da boca. Após
receber os esclarecimentos e as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas
vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa, você não será penalizado (a) de forma alguma.
Para responder quaisquer dúvidas sobre a pesquisa, você poderá, a qualquer momento, entrar em contato comigo ou com a outra
pesquisadora responsável, a prof. REJANE FARIA RIBEIRO-ROTTA. Esse contato pode ser feito pelos seguintes telefones: (62) 3209 – 6067,
(62) 3086 – 2467 e (62) 8115 – 5430, você pode inclusive fazer ligação a cobrar. Em casos de dúvidas sobre os seus direitos como participante
nesta pesquisa, você poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás, nos telefones: 3521-1075
ou 3521-1076.
INFORMAÇÕES IMPORTANTES SOBRE A PESQUISA
Estudo clínico, microbiológico e terapêutico da candidose atrófica subclínica em dorso lingual de pacientes com síndrome da ardência
bucal.
68
A ardência ou queimação na boca, especialmente na língua é um problema comum em muitas pessoas. Existem várias doenças que podem
causar essa ardência, uma delas é conhecida como síndrome da ardência bucal. Essa doença é difícil de ser identificada, para isso é necessária a
realização de muitos exames. Só depois de descartar todas as possibilidades de ardência é que podemos afirmar que existe a síndrome da ardência
bucal. Exames importantes são aqueles para saber se essa ardência não é causada por alguns fungos (espécie de sapinho) que habitam a boca.
Muitas vezes, você sente ardência na língua devido a uma infecção por fungos, embora a sua língua tenha uma aparência normal.
Desse modo, o principal objetivo dessa pesquisa é identificar se existe infecção oculta por fungo em línguas com sintomas de queimação,
porém com aparência normal. Os procedimentos para identificar essa infecção são simples, rápidos, não causam desconforto e nem trazem risco à
sua saúde. Numa primeira consulta, você responderá a algumas perguntas para preenchimento de uma ficha clínica. Em seguida, serão solicitados
exames de sangue, os quais poderão serão realizados pelo SUS, sem custo para você. Na segunda consulta, você trará o resultado dos exames e
será reavaliado. Se o pesquisador julgar que dever ser feito, você será submetido à medição do fluxo de saliva e será feita a coleta de material da
sua língua. Parte da saliva coletada será guardada para pesquisas futuras sobre essa doença. O material colhido da língua será enviado ao
laboratório para saber se você está com infecção por fungos.
Se os resultados dos exames revelarem que você está com infecção por fungos, você receberá o tratamento para essa infecção, por meio
de remédios. Caso sinta algum problema com o uso dos remédios, entre em contato com os pesquisadores pelos telefones acima. Após o
tratamento ser concluído, nova coleta de material será feita na sua língua para confirmar o a cura da infecção. Independentemente, de aceitar ou
não participar da pesquisa e dos resultados dos exames, você será atendido e receberá o tratamento para a sua doença. Para participar dessa
pesquisa, você não receberá dinheiro ou outra forma de gratificação. Os seus dados são sigilosos e serão guardados em segredo pelo pesquisador.
_______________________________________
Nome e Assinatura do pesquisador
69
Apêndice 2
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA/CEP
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (Conselho Nacional de Saúde, Resolução 466/12)
Nome do participante:____________________________________________________ Documento de identidade:________________________Data de nascimento / / CPF nº: _____________________________________ Endereço:_______________________________________________N
o____Apto:____
Bairro:____________________CEP:_____________CIDADE:___________________ Telefone(s):____________________________________________________________
EU, acima qualificado CONCORDO em participar da pesquisa “Síndrome da ardência bucal (Sab): avaliação de alterações nervosas periféricas em
língua”, coordenada pelo pesquisador responsável Ítalo Cordeiro de Toledo do curso de Odontologia da Universidade Federal de Goiás. Explicaram-me que
esta pesquisa se justifica por que a SAB tem apresentado alterações nos nervos da língua e que mesmo assim sua causa é incerta se busca a necessidade
de novos estudos para direcionar a causa da SAB. Acreditamos que os resultados poderão contribuir para uma tomada de decisão clínica mais efetiva e
melhoria na qualidade de vida aos pacientes.
70
1. Ao ser convidado a participar, explicaram-me que os objetivos da pesquisa são: avaliar a alteração na quantidade de nervos na língua e avaliar alterações da características da língua. E que tais procedimentos não trarão quaisquer danos à minha saúde, entretanto estou ciente que biopsia tem suas complicação (dor pós operatória, dificuldade de cicatrização. 2. O procedimento de coleta de Biopsia consta de: anestesia local na língua, remoção de fragmento pequeno da área que o paciente sento o sintoma e sutura.; 3. Estou ciente de que os benefícios esperados por participar neste estudo são: esclarecer aos pacientes uma possível causa da ardencia bucal e direcionar para os devidos tratamentos; 4. Explicaram-me que o(s) pesquisador (es) garantirão o sigilo absoluto quanto a minha identidade, sobre o resultado da biopsia, sob sua responsabilidade e as penas sob previstas na Lei brasileira; 5. Sei que minha participação é livre não importando quaisquer prejuízos pessoais, e que não implica quaisquer tipos de recebimento de remuneração, auxilio ou subsídio, também sei que não tenho o dever de pagar por minha livre participação; 6. Estou ciente de que poderei, a qualquer momento, desistir da participação, sem que isso implique responsabilização, ou o cancelamento dos serviços oferecidos pelo Centro Goiano de doenças da Boca, Faculdade de odontologia, Universidade Federal de Goiás; 7. Terei o direito de me dirigir, a qualquer momento, ao(s) pesquisador(es) e ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás, para os esclarecimentos sobre dúvidas que surgirem durante a pesquisa, tendo portanto o direito à informação; 8. Por fim, receberei uma cópia deste documento com os nomes e telefones de contato do pesquisador e do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Franca. Declaro que concordo LIVREMENTE em participar desta pesquisa, pois fui totalmente esclarecido pelo pesquisador e entendi os objetivos, riscos e benefícios de minha participação neste estudo. ___________________________________________________ Assinatura do participante (Sujeito da Pesquisa)
Goiânia, de de 20
71
Nome do Pesquisador Responsável:__________________________________________ Tel para contato: ( )_____________________________________________________ E-mail:________________________________________________________________ Comitê de Ética em Pesquisa/CEP Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação/PRPPG-UFG, Caixa Postal: 131, Prédio da Reitoria, Piso 1, Campus Samambaia (Campus II) - CEP:74001-970, Goiânia – Goiás, Fone: (55-62) 3521-1215. E-mails: [email protected], [email protected]
