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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
THAÍS PAIVA PORTO DE SOUZA
EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE UMA ISOFORMA SOLÚVEL DO RECEPTOR DC-SIGN E AVALIAÇÃO DE SUA CAPACIDADE DE LIGAÇÃO À MANOSE.
DIVINÓPOLIS-MG SETEMBRO DE 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
THAÍS PAIVA PORTO DE SOUZA
EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE UMA ISOFORMA SOLÚVEL DO RECEPTOR DC-SIGN E AVALIAÇÃO DE SUA CAPACIDADE DE LIGAÇÃO À MANOSE.
Orientador: Profª. Dr. Luciana Lara dos Santos Co-orientador: Profª. Dr. Débora de Oliveira Lopes
DIVINÓPOLIS-MG SETEMBRO DE 2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Ciências da Saúde, da
Universidade Federal de São João Del Rei,
como requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre.
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Defesa da dissertação de mestrado da aluna ―Thaís Paiva Porto de Souza‖,
intitulada: ―Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do receptor DC-SIGN e
avaliação de sua capacidade de ligação à manose‖, orientado pela Profa.Dr. Luciana
Lara dos Santos, apresentado à banca examinadora designada pelo Colegiado do
Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde da UFSJ, em 08 de setembro
de 2016.
Os membros da Banca Examinadora consideraram a candidata: ___________________ .
Banca Examinadora: __________________________________________
Doutora Luciana Lara dos Santos (Presidente da Banca Examinadora)
__________________________________________
Doutor Carlos Eduardo Calzavara Silva (Membro Titular Externo)
__________________________________________
Doutora Jaqueline Maria Siqueira Ferreira (Membro Titular Interno)
iii
Agradecimentos
“Pois tu formaste o meu interior, tu me teceste no seio de minha mãe. Graças te dou,
visto que por modo assombrosamente maravilhoso me formaste; as tuas obras são
admiráveis, e a minha alma o sabe muito bem.” Salmos 139-13, 14. Bíblia Sagrada.
Primeiramente eu agradeço ao Mestre dos Mestres Jesus Cristo, ao qual
devo minha vida e tudo que sou. Ao Criador da vida que sustenta e governa a terra.
Agradeço à minha orientadora prof. Dra. Luciana Lara dos Santos pela
presença e apoio, pelo carinho e pela tamanha paciência em me orientar. Por sua
generosidade em passar ao longo desses anos o seu conhecimento e ser um
exemplo pra mim. Obrigada de coração! Também à prof. Dra. Débora de Oliveira
Lopes pela co-orientação e boa vontade em compartilhar seus conhecimentos. Aos
profs. Dr. Leandro Augusto de Oliveira Barbosa, Dra. Hérica Lima dos Santos, Dra.
Jaqueline Ferreira e Dr. Carlos Eduardo (Fiocruz) pelas contribuições e
colaborações. A todos os professores que passaram por minha vida, sem os quais
nunca conseguiria obter qualquer êxito.
“Professores brilhantes ensinam para uma profissão, professores fascinantes
ensinam para a vida”. Augusto Cury.
Agradeço aos meus pais Cléa e Moacir pelo apoio. Sem vocês com certeza
não teria passado por esta jornada e conseguido chegar até aqui.
Ao meu marido Rogério por ser meu apoio, meu chão. Por nunca me deixar
desistir! Pelo amor e paciência em cada momento de nossa vida. A você todo meu
amor.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, à UFSJ, e a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) por esta
inestimável oportunidade de busca pelo conhecimento.
Ao laboratório de Biologia Molecular da UFSJ pela oportunidade de trabalho e
conhecimento. Aos amigos de curso e laboratório.
Enfim, por cada pessoa que de alguma forma passa por nossa vida e deixa
sua marca!
iv
“Eu descobri em mim mesmo desejos os quais
nada nesta terra pode satisfazer. A única
explicação lógica é que eu fui feito para outro
mundo.”
C. S. Lewis
v
Resumo
O DC-SIGN é um receptor de lectina do tipo C, que contém um domínio de
reconhecimento a carboidratos (DRC), envolvido no reconhecimento de vários
patógenos, incluindo o Dengue virus (DENV). Este receptor é codificado pelo gene
CD209 que sofre splicing alternativo gerando diversas isoformas da proteína, que
podem ser de membrana ou solúveis. O splicing alternativo pode causar alterações
em regiões importantes de interação entre o receptor DC-SIGN e o DENV. O
objetivo deste estudo foi avaliar se a isoforma sDC-SIGN1B tipo III, que contém
alterações na região do DRC devido ao splicing alternativo, perde a capacidade de
se ligar a resíduos de manose. A sequência de nucleotídeos que codifica para a
isoforma sDC-SIGN1B tipo III foi obtida no Genbank e foram usados diversos
softwares de bioinformática para análise físico-química. A proteína apresentou um
ponto isoelétrico de 7,12, um peso molecular de aproximadamente 34,7 kDa e um
coeficiente de hidropaticidade de -0,714. A sequência do gene da isoforma sDC-
SIGN1B tipo III foi sintetizada e clonada no vetor de expressão pET28a pela
empresa Epoch Life Science (Missouri City, Texas, EUA). A expressão heteróloga da
proteína foi realizada a 37° C durante 4 horas após a indução com IPTG utilizando a
linhagem de E. coli BL21 DE3 Rosetta. Os resultados foram analisados por SDS-
PAGE seguido por Western blot. A proteína foi purificada com sucesso por
cromatografia de afinidade em coluna de cobalto e quantificada pelo ensaio de
Bradford, pelo qual foi obtido aproximadamente 1,0 mg dessa proteína. O ensaio
funcional para avaliar a capacidade de ligação da isoforma sDC-SIGN1B tipo III aos
resíduos de manose foi realizado em uma coluna de afinidade de manose,
previamente equilibrada com tampão contendo íons Ca2+. Todas as frações de
proteínas recuperadas na coluna de afinidade foram medidas por Bradford. A
isoforma sDC-SIGN1B tipo III (0,26 μg / uL) foi aplicada à esta coluna e foi
totalmente recuperada após as lavagens. Não foi observada a presença da proteína
nas eluições contendo EDTA, indicando a perda da capacidade de ligação a
manose. A isoforma sDC-SIGN1A tipo III, produzida por nosso grupo de pesquisa,
foi utilizada como controle positivo, uma vez que não possui mudanças na região do
DRC e espera-se que a mesma se ligue aos resíduos de manose. Como esperado,
não foi verificada a presença da isoforma sDC-SIGN1A tipo III (0,17 μg / uL) após
as lavagens na coluna. No entanto, a mesma foi completamente recuperada após a
eluição, indicando a sua capacidade em se ligar aos resíduos de manose. Desta
forma, foi comprovada a perda da capacidade da isoforma sDC-SIGN1B tipo III de
se ligar à resíduos de manose. Futuros ensaios de infecção in vivo usando o DENV
serão realizados com as isoformas solúveis com e sem modificações do DRC para
melhor entendimento de suas funções e participação no processo de internalização
do DENV em células dendríticas.
Palavras-Chave: Dengue virus, DC-SIGN, isoforma sDC-SIGN1B tipo III, manose.
vi
Abstract
The DC-SIGN receptor is a lectin C-type, which contains a carbohydrate recognition
domain (CRD) involved in the recognition of various pathogens, including Dengue
virus (DENV). This receptor is encoded by the CD209 gene which undergoes
alternative splicing generating different soluble or membrane isoforms. Alternative
splicing can cause changes in important regions of interaction between DC-SIGN
receptor and DENV. The aim of this study was to evaluate if the isoform sDC-
SIGN1B type III, which contains alterations in the CRD due to alternative splicing,
loses the ability to bind to mannose residues. The nucleotide sequence encoding the
isoform-sDC-SIGN1B type III was obtained from Genbank and were used several
bioinformatics software for physical and chemical analysis. The isoelectric point of
the protein was 7.12, with a molecular weight of approximately 34.7 kDa and
Hydropathicity coefficient of -0.714. The sequence of sDC-SIGN1B type III isoform
was synthesized and cloned into the vector pET28a expression by the company
Epoch Life Science (Missouri City, Texas, USA). Heterologous protein expression
was carried out at 37 ° C for 4 hours after induction with IPTG using E. coli strain
Rosetta BL21 DE3. The results were analyzed by SDS-PAGE followed by Western
blot. The protein was successfully purified by affinity chromatography cobalt column
and quantitated by Bradford assay. Through this technique 1,0 mg of the protein was
obtained. The functional assay to evaluate the binding ability of the sDC-SIGN1B
type III isoform in mannose residues was performed on a mannose affinity column,
previously equilibrated with buffer containing Ca2 + ions. All fractions recovered in the
affinity column were measured by Bradford. The sDC-SIGN1B type III isoform (0.26
ug / uL) was applied to this column and was fully recovered after washing. There was
not observed the presence of the protein in EDTA elutions, indicating the loss of
mannose-binding ability. The sDC-SIGN1A type III isoform, produced by our research
group, was used as positive control, since it does not has alterations in the CRD
region and it is expected that it binds to mannose residues. As expected, it was not
verified the presence of sDC-SIGN1A type III isoform (0.17 ug / uL) after washing the
column. However, it was completely recovered after elution, indicating its ability to
bind to mannose residues. Thus, it was proven loss of capacity of the sDC-SIGN1B
type III isoform to bind to mannose residues. Future in vivo infection assays using
DENV will be conducted with the soluble isoforms with and without changes in the
CRD for a better understanding of their role and participation in the process of DENV
internalization in dendritic cells.
Keywords: Dengue virus, DC-SIGN, isoform sDC-SIGN1B type III, mannose.
vii
Sumário
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................ xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 14
1.1. Revisão da Literatura ...................................................................................................... 16
1.1.1. Dengue: Histórico e Epidemiologia ............................................................................... 16
1.1.2. Características gerais do DENV ................................................................................... 18
1.1.3. Multiplicação viral e imunopatogênese ......................................................................... 20
1.1.4. Estrutura e funções do DC-SIGN ................................................................................. 21
1.1.5. Gene codificador do DC-SIGN e as isoformas geradas pelo processo de splicing
alternativo ................................................................................................................................ 23
1.1.6. Isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-SIGN ................................................................ 27
1.2. JUSTIFICATIVA ...................................................................................................................... 30
1.3. OBJETIVOS GERAIS .............................................................................................................. 32
1.4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 32
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................... 33
2.1. Análises in silico .................................................................................................................. 34
2.2. Testes in vitro....................................................................................................................... 35
2.2.1. Síntese in vitro da sequência do transcrito da isoforma sDC-SIGN1B tipo III (Isoforma
12) do DC-SIGN ...................................................................................................................... 35
2.2.2. Linhagem Bacteriana e Condições de Cultivo .............................................................. 36
2.2.3. Preparação de bactérias eletrocompetentes ................................................................ 37
2.2.4. Transformação bacteriana por eletroporação .............................................................. 37
2.2.5. Purificação do plasmídio (Miniprep) e sequenciamento de DNA plasmidial................ 38
2.2.6. Expressão heteróloga da isoforma sDC-SIGN1B tipo III em pequena escala............ 39
2.2.7. Eletroferese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) .............................. 40
2.2.8. Western Blotting ............................................................................................................ 41
2.2.9. Expressão heteróloga da isoforma sDC-SIGN1B tipo III em larga escala e teste de
solubilidade ............................................................................................................................. 42
2.2.10. Purificação da isoforma sDC-SIGN1B tipo III recombinante ..................................... 42
2.2.11. Dosagem de proteínas pelo método de Bradford ...................................................... 43
2.2.12. Avaliação da capacidade de ligação da isoforma 12 do DC-SIGN em coluna de
manose .................................................................................................................................... 43
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................. 45
3.1. Análises in silico da isoforma sDC-SIGN1B tipo III (Isoforma 12) do DC-SIGN ................. 45
3.2. Testes in vitro....................................................................................................................... 48
viii
3.2.1. Purificação do DNA plasmidial e sequenciamento da isoforma 12 do DC-SIGN no
vetor de expressão pET28a .................................................................................................... 48
3.2.2. Expressão e purificação da isoforma 12 do DC-SIGN ................................................. 49
3.2.3. Teste funcional de ligação da isoforma 12 do DC-SIGN à coluna de manose ............ 55
4. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 59
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 60
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Número de sorotipos do DENV circulando nas Américas...........................17
Figura 2: Distribuição mundial das áreas de risco e notificações dos casos de
Dengue em 2015........................................................................................................18
Figura 3: Estrutura da partícula viral e organização genômica do DENV..................19
Figura 4: Esquema das funções do receptor DC-SIGN.............................................22
Figura 5: Representação estrutural do DC-SIGN ......................................................23
Figura 6: Estrutura do Domínio de Reconhecimento a carboidratos do DC-SIGN
ligada a um oligossacarídeo rico em manose............................................................26
Figura 7: Esquema das regiões exônicas que codificam cada parte específica da
proteína DC-SIGN......................................................................................................26
Figura 8: Alinhamento da sequência de aminoácidos correspondente ao DRC da
proteína completa DC-SIGN com a isoforma sDC-SIGN1B tipo III que possui
modificações...............................................................................................................28
Figura 9: Modelos tridimensionais construídos por Pereira, 2013.............................29
Figura 10: Esquema representativo das etapas experimentais desenvolvidas neste
projeto.........................................................................................................................32
Figura 11: Mapa do vetor pET28a..............................................................................35
Figura 12: Sequência gênica e proteica da isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-
SIGN...........................................................................................................................44
Figura 13:Predição de O e N-glicosilações e peptídeo sinal da isoforma 12 do DC-
SIGN...........................................................................................................................45
Figura 14: Predição de hidropaticidade da isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-
SIGN...........................................................................................................................47
Figura 15: Análise da expressão da isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-SIGN.....49
x
Figura 16: Imunodetecção da isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-SIGN................50
Figura 17: Verificação da fração celular onde a isoforma sDC-SIGN1B tipo III é
encontrada..................................................................................................................51
Figura 18: Expressão em larga escala e verificação da fração celular onde a
isoforma sDC-SIGN1B tipo III é encontrada, após a adição de ureia........................52
Figura 19: Purificação da isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-SIGN......................53
Figura 20: Dosagens da Isoforma 12 nas frações de lavagens e eluições após
passagem pela coluna de manose.............................................................................54
Figura 21: Dosagens da Isoforma 8 nas frações de lavagens e eluições após
passagem pela coluna de manose.............................................................................55
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características das isoformas transcritas do gene CD-209.......................24
Tabela 2: Isoformas do DC-SIGN que possuem modificações na região do DRC....28
Tabela 3: Programas de bioinformática utilizados para realização dos estudos in
silico............................................................................................................................33
Tabela 4: Leitura por espectrofotometria do produto de miniprep.............................48
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
2xYT BSA BCIP Ca2+ CD-209 DRC DC-SIGN DCSA DNA DENV DG His.Tag HCl HIV ICAM-2 ICAM-3 IFN-ϒ IPTG Kb mDC-SIGN mRNA mW NBT NCBI NE RNA pb PDB PEG pH pI PVDF sDC-SIGN sDC-SIGN1B SDS SDS-Page snRNA OD ORF TEMED TNF-α Tris UniProt mL μM
Duas vezes Extrato de Levedura e Triptona Albumina do soro bovino 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato Íon cálcio Gene CD-209 Domínio de Reconhecimento de Carboidratos Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-Integrin, do inglês Dengue com sinais de alarme Ácido desoxiribonucléico Dengue virus Dengue Grave Cauda de Histidina Ácido Clorídrico Vírus da Imunodeficiência Humana Molécula de Adesão Intercelular 2 Molécula de Adesão Intercelular 3 Interferon-ϒ Isopropil B-D-1 tiogalactopiranosideo Kilobases Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-Integrin of membrane Ácido Ribonucléico mensageiro Peso molecular Nitro-blue Tetrazolium, do inglês Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia Não estruturais Ácido Ribonucléico Pares de bases Protein Data Bank Polietilenoglicol Potencial Hidrogeniônico Ponto Isoelétrico Fluoreto de Polivinilideno Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-Integrin soluble Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-Integrin soluble group 1B Dodecil Sulfato de sódio Eletroferese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio RNA‘s nucleares Densidade Ótica Quadro de leitura aberta Tetrametiletilenediamina Fator de necrose tumoral 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol Universal Protein Resource MiliLitros Micrômetro
xiii
µL ß-GlcNAc ng nm ° C Rpm V kDa μg M ™ EDTA
Microlitro Beta N-acetilglicosamina Nanograma Nanômetro Graus Celsius Rotações por minuto Volt KiloDalton Micrograma Molar Trade Mark Ácido etilenodiamino tetra-acético
14
1. INTRODUÇÃO
Os vírus pertencentes à família Flaviviridae, do gênero Flavivirus como o
Dengue virus (DENV), apresentam importância clínica uma vez que possuem
significativa representação no cenário mundial de graves epidemias e problemas de
saúde pública. Os quatro sorotipos do DENV: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4,
fazem parte desta família e podem causar desde infecções inaparentes, até mesmo
formas hemorrágicas podendo levar ao óbito (Marijke, 2012; Fang et al., 2013;
Chotiwan et al., 2014). As formas clínicas da doença podem ser divididas em três
categorias: Dengue, Dengue com sinais de alarme (DCSA) e Dengue grave (DG)
(WHO, 2015). As manifestações mais comuns para os casos suspeitos de dengue
são: aparecimento de febre usualmente por 2 a 7 dias, exantema, cefaleia, vômitos,
leucopenia, dentre outros. Já os casos suspeitos de dengue com sinais de alarme,
devem possuir os seguintes sinais: dor abdominal intensa, acúmulo de líquidos,
sangramento de mucosas, hipotensão postural, queda no número de plaquetas,
dentre outros. A forma mais grave da doença (DG) se manifesta por aparecimento
de choque devido ao extravasamento de plasma, sangramentos graves e
comprometimento grave de órgãos (WHO, 2015).
Estima-se que aproximadamente 390 milhões de infecções ocorrem por ano,
gerando altos custos relacionados à doença para os países que estão localizados
em regiões endêmicas (Bhatt et al., 2013). Existe recentemente um empenho em
relação ao estudo da patogênese da dengue, visto que esta acomete uma enorme
parcela da população mundial (Kyle, 2008; Salazar et al., 2014; Schmid et al., 2014;
Wibawa et al., 2015).
Atualmente, têm-se estudado os receptores virais presentes nas células
dendríticas, como por exemplo, o receptor DC-SIGN, (Dendritic Cell-Specific
Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) que faz parte da família
das lectinas ligadoras de manose do tipo C, dependentes de íons cálcio (Schmid et
al., 2014; Diamond, Pierson, 2015). A molécula precursora de RNA mensageiro do
gene que codifica para o DC-SIGN, também conhecido como CD-209, sofre o
processo de splicing alternativo, gerando diferentes isoformas da proteína. Mummidi
et al., 2001, descreveu treze isoformas diferentes da proteína, sendo que essas
podem existir acopladas à membrana citoplasmática das células, ou podem existir
15
de forma solúvel. O processo de splicing alternativo pode ocasionar alterações nas
regiões da proteína DC-SIGN, inclusive, nos sítios de ligação de cálcio (Ca2+),
presentes no domínio de reconhecimento a carboidratos (DRC), que são
necessários para a interação com o vírus.
Estudos realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa do Laboratório de
Biologia Molecular da Universidade Federal de São João del Rei Campus Centro-
Oeste Dona Lindu, coordenado pela Profa. Luciana Lara, revelaram que cinco
isoformas do receptor DC-SIGN possuem alterações no DRC, o que levou a sugerir
a perda da interação destas proteínas ao ligante. Portanto, o melhor entendimento
das funções das diferentes isoformas da proteína DC-SIGN é fundamental no
esclarecimento sobre como elas interagem com os diversos patógenos, inclusive o
DENV.
Neste trabalho, a isoforma solúvel sDC-SIGN1B tipo III, com alterações no
DRC, foi produzida e purificada por expressão heteróloga e foi avaliada a sua
capacidade de ligação com a manose através de coluna cromatográfica de
afinidade. O trabalho aqui apresentado trata-se da continuação de um estudo do
grupo de pesquisa citado acima em que foram feitos estudos in silico das alterações
apresentadas nos transcritos do gene CD-209.
16
1.1. Revisão da Literatura
1.1.1. Dengue: Histórico e Epidemiologia
A Dengue é uma doença viral transmitida aos humanos por fêmeas de
mosquitos do gênero Aedes sendo o Aedes aegypti seu principal vetor. A doença
possui um alto impacto na saúde pública do Brasil e de outros países tropicais e
subtropicais, podendo causar altas taxas de mortalidade em humanos (Kyle, Harris,
2008; Dias, et al, 2010).
Os primeiros registros de epidemias possivelmente causadas pelo DENV
foram descritos entre os anos de 1779 e 1780 atingindo a Ásia, África e América
(Gubler, 1998). O registro da primeira epidemia de dengue grave ocorreu em Manila,
Filipinas entre 1953-1954. A etiologia viral e a transmissão por mosquitos só foram
decifradas no século XX, sendo que o impacto socioeconômico da Segunda Guerra
Mundial resultou em grandes epidemias, devido ao processo incontrolável de
urbanização e industrialização, bem como condições precárias de saneamento
básico, permitindo assim, o aumento da dispersão do vetor transmissor da doença e
alterações da epidemiologia global. Por muito tempo, a dengue e a forma grave da
dengue constituíram problemas restritos aos países do Sudeste Asiático e da
Oceania. Somente a partir da década de 1980, a doença disseminou-se pelas
Américas. No Brasil, nesta mesma década, iniciou-se um processo de intensa
circulação viral, com epidemias explosivas que atingiram todas as regiões brasileiras
(Braga, Valle, 2007).
A incidência da dengue tem aumentado significativamente, sendo que nas
Américas, o número dos sorotipos circulantes do vírus aumentou entre as décadas
de 1990 a 2014, como mostrado na Figura 1 (OPAS/OMS, 2015). No século XXI, as
frequentes epidemias transformaram-se num caso problemático, com altas taxas de
prevalência da doença em regiões tropicais e sub-tropicais do planeta, e com a
possibilidade de disseminação para regiões isentas de infecção (Harris, et al., 2013).
17
Figura 1: Número de sorotipos do DENV circulando nas Américas, no período de 1990-2014. As áreas mais escuras do mapa indicam o aumento do número dos sorotipos circulantes, com a presença dos quatro sorotipos. Fonte: Organização Panamericana de Saúde/OMS, 2015.
Segundo a Organização Mundial de Saúde, em 2015, foram registrados mais
de 1,7 milhões de casos de dengue nas Américas, sendo que destes, mais de 4 mil
casos foram de dengue grave (WHO, 2015). Atualmente, a doença está disseminada
em regiões tropicais e subtropicais, com uma crescente incidência nas regiões da
Ásia, África e Américas Central e do Sul. Contudo, a concentração de casos e a
distribuição das áreas de risco estão nas Américas Central e do Sul (Figura 2).
Na região das Américas, somente o Brasil foi responsável por mais de 60%
dos casos relatados entre 2000 a 2007 relacionados aos sorotipos DENV1-3. Em
2010, reapareceram os casos de infecções relacionadas ao DENV-4 em Boa Vista -
Roraima, sendo que este já havia circulado em 1982 na mesma região (San Martín
et al., 2010). Atualmente, os quatro sorotipos circulam na maioria dos estados do
Brasil, sendo que em 2015, segundo o Ministério da Saúde, a maior prevalência foi
do sorotipo DENV-1 com 94,1% dos casos, seguido do DENV-4 com 4,8% dos
casos. Houve um aumento na incidência dos casos de dengue entre os anos de
1990 a 2015 no país, sendo que no ano de 2015 foram notificados mais de
1.649.008 casos suspeitos de dengue, com um aumento de 82,5% de casos de óbito
comparados ao mesmo período em 2014 (Ministério da Saúde, 2016).
18
Figura 2: Distribuição mundial das áreas de risco e notificações dos casos de dengue. Os pontos em vermelho mostram os artigos e relatórios sobre a incidência dos casos de dengue locais ou importados recolhidos a partir de dados oficiais. Fonte: http://www.healthmap.org/dengue/pt/. Centers for Disease Control and Prevention-EUA. Atualizado em Março de 2016.
1.1.2. Características gerais do DENV
O DENV pertence à família Flaviridae, gênero Flavivirus e apresenta
características distintas que o difere em quatro sorotipos antigenicamente diferentes
(DENV 1-4). Ele apresenta morfologia esférica, com aproximadamente 50 nm de
diâmetro e seu genoma é constituído por RNA de fita simples, com
aproximadamente 11 Kilobases (Kb) apresentando polaridade positiva (Figura 3b). O
genoma viral codifica para 3 proteínas estruturais e 7 não estruturais. As proteínas
estruturais são representadas pela proteína do capsídeo viral (C), a proteína
precursora de membrana (prM) que é glicosilada e clivada durante a multiplicação
viral gerando a proteína estrutural M, e que juntamente com a proteína do envelope
(E) forma o revestimento externo da partícula viral (Figura 3a). Já as proteínas não-
estruturais (NE), estão envolvidas no processo da multiplicação viral (Malavige et
al., 2004; Halsey et al., 2012). A proteína E é fundamental para a ligação do DENV
ao receptor de membrana das células dendríticas e é rica em resíduos de manose
em sua superfície, essenciais para o reconhecimento e entrada viral (Figura 3c)
(Kuhn, 2002; Modis et al., 2003; Faheem, 2010; Rodenhuis-Zybert, 2010).
19
Figura 3: Estrutura da partícula viral e organização genômica do DENV. a) Partícula do DENV mostrando a localização e configuração das proteínas estruturais C, M e E, bem como o seu material genético de RNA fita simples. b) Esquema do genoma do DENV, mostrando sua organização em única fase de leitura. Ele codifica para uma poliproteína, na qual gera 3 proteínas estruturais (C, prM/M e E) e 7 proteínas não-estruturais após o seu processamento por proteases celulares e virais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). c) Dímero de glicoproteína E do DENV, ligado à resíduos de manose mostrados em vermelho Fonte: (Expasy: ViralZone, 2001; Adaptado de Ashfaq, Idrees, 2012 e Modis et al., 2003).
a)
b)
c)
20
1.1.3. Multiplicação viral e imunopatogênese
Após a inoculação através da picada do mosquito, o DENV tem como alvo
primário para a infecção e multiplicação, as células dendríticas residentes na pele
conhecidas como células de Langerhans apresentadoras de antígenos, as quais têm
se mostrado permissivas à infecção (Richter, et al., 2014). Essas células expressam
alguns receptores responsáveis pelo reconhecimento e endocitose viral, sendo que
o receptor DC-SIGN é o mais bem caracterizado. Este receptor se liga à
glicoproteína E do vírus e após a ligação a partícula viral é internalizada em um
compartimento endossomal. Após a tradução e o processamento das proteínas
virais, a replicase viral é montada a partir de proteínas NE atuando sobre o RNA viral
(Acosta, et al., 2014; Bartenschlager, Chatel-Chaix, 2014).
A replicação começa com a síntese da fita negativa do RNA, a qual serve de
molde para a síntese das fitas positivas de RNA genômico, que então é envolto por
proteínas virais para compor a partícula viral. A montagem das partículas virais
ocorre em associação com o retículo endoplasmático da célula hospedeira, sendo
então, liberadas adquirindo uma membrana lipídica até chegarem ao complexo de
Golgi, onde são liberadas em vesículas até a membrana plasmática e, por fim,
exocitadas para o meio extracelular. Antes da exocitose, ocorre o processo de
maturação da partícula viral através da clivagem proteolítica da proteína prM em M
pela protease celular furina (Chambers et al., 1990; Clyde et al., 2006).
Os sintomas gerais da dengue surgem após o período de incubação entre
dois a sete dias, relacionados a níveis séricos elevados de citocinas liberadas por
macrófagos ativados. A fisiopatologia da doença pode estar relacionada com alguns
fatores, como a ativação do sistema do complemento e de células da resposta
imune inata, a ativação de células T e B, além da presença de anticorpos não
neutralizantes advindos de uma infecção primária (Harris, et al., 2013; Diamond,
Pierson, 2015).
A infecção com um dos sorotipos do DENV produz imunidade de longa
duração para esse mesmo sorotipo, porém não gera imunidade permanente
protetora contra os outros sorotipos existentes (Gubler, 1998). Atualmente, a teoria
mais aceita para explicar a forma grave da doença é a dos anticorpos
21
potencializadores da infecção (antibody dependent enhancement, ADE). Referida
inicialmente por Halstead em 1970, as pessoas que apresentam uma segunda
infecção pelo vírus de sorotipo heterólogo, possuem maiores chances de
desenvolver dengue grave. Segundo esta teoria, os anticorpos heterólogos
produzidos em resposta à primeira infecção, reconhecem o vírus infectante, e
formam complexos antígeno-anticorpo, os quais acabam sendo reconhecidos e
internalizados por células mononucleares, especialmente macrófagos, através de
seus receptores para a porção constante dos anticorpos (Fc), não havendo então a
neutralização do vírus. As partículas virais se replicam dentro do macrófago, o que
permite um aumento do número de células infectadas, podendo levar a uma grande
carga viral. A infecção celular permite a secreção de citocinas, em especial o Fator
de Necrose Tumoral (TNF), as interleucinas (IL-2, IL-6, IL-8 e IL-10) e interferon
gama, facilitando assim, o extravasamento de plasma e eritrócitos (Vaughn, 1977;
Kyle et al., 2008).
1.1.4. Estrutura e funções do DC-SIGN
As lectinas são proteínas que compartilham a característica comum de
ligação a carboidratos e estas estão amplamente descritas em diversos organismos.
Em animais, estas são classificadas de acordo com suas características estruturais
(Mason, Tarr, 2015). A proteína DC-SIGN descrita pela primeira vez por Curtis et al.
1992, é uma longa proteína de membrana caracterizada como lectina tipo C com
dependência de íons cálcio e com alta afinidade de ligação a moléculas de
carboidratos como manose, presente em diversos patógenos (Anderluh, et al., 2012;
Zhang, et al., 2015). Este receptor foi relacionado primeiramente com a infecção
pelo vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV) pela sua interação com a
glicoproteína do envelope viral. Além do HIV, o receptor também está associado
com a ligação a outros patógenos como DENV, Vírus Ebola, Citomegalovírus, Virus
da Hepatite C, bactérias como Klebsiella pneumonae, Helicobacter pylori,
Mycobacterium tuberculosis, dentre outros (Lin, et al., 2003; Bergman et al., 2004;
Plazolles et al., 2011).
O DC-SIGN também interage com moléculas de adesão intercelular ICAM-2,
expressas no endotélio de vasos sanguíneos e linfáticos, permitindo o acoplamento
22
e posterior deslocamento ao longo do endotélio, atribuindo ao receptor importantes
papeis na adesão e migração celular do interior de vasos sanguíneos e linfáticos, a
locais e sítios inflamatórios (Svajger, 2010).
Além disso, o DC-SIGN também é responsável pelo contato inicial das células
dendríticas às células T, através da ligação de alta afinidade com moléculas de
ICAM-3, sendo então, relacionado ao desenvolvimento primário da resposta imune
através das células dendríticas apresentadoras de antígeno (Soilleux, et al., 2002;
Guo, et al., 2004; Phanthanawiboon, et al., 2014). As principais funções descritas do
DC-SIGN estão resumidas na figura 4.
Estruturalmente, a proteína DC-SIGN está organizada em três regiões
distintas: um domínio citoplasmático, um domínio transmembranar e um domínio
extracelular. Este é composto por uma região repetida chamada de região de
pescoço e pelo domínio de reconhecimento de carboidrato (DRC) (Figura 5).
Figura 4- Esquema das funções do receptor DC-SIGN. Além da função de captura de patógenos como o DENV, mostrado pelas esferas em lilás, o DC-SIGN também está relacionado com a interação a moléculas de adesão intercelular ICAM-2 no endotélio e ligação de alta afinidade com moléculas de ICAM-3 em células T.
Fonte: Adaptado de Van Vliet et al., 2008.
DENV
23
Figura 5: Representação estrutural do receptor DC-SIGN. Receptor DC-SIGN com o dominio citoplasmático, o domínio transmembranar, a região do pescoço e o domínio de reconhecimento a carboidratos. Fonte: Anderluh et al., 2012.
1.1.5. Gene codificador do DC-SIGN e as isoformas geradas pelo processo de
splicing alternativo
O gene responsável por codificar o receptor DC-SIGN é o gene CD-209
localizado no braço curto do cromossomo 19, região 19p13.3 com 7,617Kb de
tamanho (NCBI-AY042232.1). O gene possui seis éxons e cinco íntrons (Mummidi et
al., 2001).
Após a transcrição do gene CD-209, ocorre o splicing da molécula precursora
de RNA (pré-mRNA), onde esta é submetida à retirada da parte intrônica, ou seja,
da região não codificante, para posterior união dos éxons (parte codificante para
produção de proteínas). Este processo pode ocorrer de forma alternativa,
recompondo os éxons de formas diferentes e acarretando na formação de RNAm
distintos e consequentemente, proteínas distintas (Moreno et al., 2015).
24
Segundo Mummidi et al., 2001, o gene que codifica para a proteína DC-SIGN
através do processo de splicing alternativo pode gerar treze isoformas diferentes da
proteína. Estas isoformas podem estar inseridas na membrana citoplasmática ou
podem ser solúveis nos fluidos biológicos. Os transcritos e proteínas codificados
pelo CD-209 foram revisados recentemente e suas características se encontram
descritas na Tabela 1 (Mummidi et al., 2001).
Tabela 1 - Características das isoformas transcritas do gene CD-209.
Dependendo do evento de splicing gerado, alguns éxons podem não estar
presentes na proteína, gerando então isoformas diferentes entre si. O domínio
transmembranar codificado pelo éxon II, por exemplo, promove a interface entre os
domínios intra e extra-celulares. Àquelas isoformas que perdem o éxon II, são
chamadas de isoformas solúveis ou sDC-SIGN e aquelas que mantém o éxon II são
chamadas de isoformas de membrana ou mDC-SIGN. Ainda não são bem descritos
na literatura quais os papéis das isoformas solúveis do DC-SIGN, sendo que das
* Tamanho da sequência contendo as regiões não codificantes 5‘ UTR e 3‗ UTR (AceView).
Fonte: Pereira, 2013.
(Aminoácidos) *
25
treze isoformas geradas pelo processo de splicing alternativo do gene CD-209, oito
são isoformas do tipo solúveis (Mummidi et al., 2001; Pereira, 2013).
O domínio citoplasmático codificado pelo éxon I representa a região N-
terminal da proteína e está associado ao processo de internalização dos ligantes,
bem como a transdução de sinais. O éxon I pode ainda ser subdividido em Ia, Ib e
Ic. O gene CD-209 possui dois sítios possíveis de início da tradução localizados na
posição +1 na porção Ia do éxon I, e na posição +101 na porção Ib, sendo que
àquelas isoformas que perdem a porção Ib do éxon I, são designas como tipo 1A e
aquelas isoformas que mantém a porção Ib e iniciam a tradução no sítio Ib do éxon I
são designadas como tipo 1B (Mummidi 2001; Anderluh, 2012). Segundo Mummidi e
colaboladores (2001), os eventos de splicing podem ocorrer em diferentes sítios nas
sequências das isoformas, podendo levar à perda de diversas sequências ou
mesmo a perda de demais éxons, sendo então classificadas em tipo I-IV (Tabela I).
O domínio extracelular é composto por duas partes principais: Região de
repetição correspondente ao pescoço da proteína (―neck‖) e a região do domínio de
reconhecimento a carboidratos. A região do pescoço é codificada pelo éxon III e
consiste em uma estrutura em alfa-hélice, formada por sete repetições completas e
uma incompleta, organizadas in tandem, correspondentes a 23 aminoácidos
altamente conservados (Mason, Tarr, 2015). Nesta região podem haver variações no
número de repetições dos aminoácidos, sendo esta responsável pela tetramerização
da estrutura do DRC, projetando-o para além da membrana citoplasmática. Isto
confere a capacidade de interação à superfície dos patógenos, sendo, então, o DC-
SIGN uma molécula flexível na interação ao ligante (Anderluh, 2012).
O DRC por sua vez, é codificado pelos demais éxons: IV, V e VI e é a parte
C-terminal da molécula. O DRC é a porção responsável pelo reconhecimento e
ligação aos oligossacarídeos presentes nas superfícies glicoprotéicas dos
patógenos, principalmente resíduos de manose (Mason, Tarr, 2015). Além disso,
para a garantia do reconhecimento específico dos carboidratos presentes nos
patógenos, no DRC existem três sítios de ligação para íons Ca2+, sendo que o sítio 2
é considerado o sítio primário, o qual interage com quatro aminoácidos: (Glu347,
Asn349, Glu354, e Asn365), através de seus grupos carbonila e que parece ser crucial
na interação com o ligante, como mostrado na Figura 6 (Geijtenbeek et al., 2000;
Feinberg et al., 2001; Drickamer et al., 2004; Pereira, 2013).
26
Existem algumas isoformas geradas pelo processo de splicing alternativo que
perdem porções de aminoácidos no DRC e o sítio de Ca2+, como a sDC-SIGN1B tipo
III , deste trabalho. O esquema resumido das estruturas exônicas responsáveis por
cada porção da proteína DC-SIGN se encontra na Figura 7.
Figura 7- Esquema das regiões exônicas que codificam cada parte específica da proteína DC-SIGN. O gene CD209 apresenta seis éxons numerados de 1-6. O éxon 1 codifica a região citoplasmática, o éxon 2 codifica o domínio transmembranar, bem como o éxon 3 codifica a região de repetição. Os demais éxons (4, 5 e 6) codificam a região do DRC do DC-SIGN. Adaptado de Mason, Tarr, 2015.
Figura 6- Estrutura do Domínio de Reconhecimento a carboidratos do DC-SIGN ligada a um oligossacarídeo rico em manose. Estrutura cristalográfica do monômero do DRC, mostrada em azul, ligado a um oligossacarídeo rico em resíduos de manose, representado em amarelo. Os íons Ca2+ estão representados pelas esferas azuis. Fonte: Feinberg, et al., 2001.
27
Atualmente, na literatura, não há um consenso geral das possíveis respostas
geradas frente à presença de diferentes isoformas nas infecções com o dengue
vírus, HIV, citomegalovírus, dentre outros (Liu, et al., 2005; Navarro-Sanchez, et al.,
2003; Plazolles et al., 2011). Alguns destes estudos demonstraram diferentes
respostas quanto à interação dessas isoformas na presença de um determinado
patógeno. Segundo Navarro-Sanchez, et al., (2003) o DRC de algumas isoformas
solúveis incubadas com o DENV, geram o bloqueio da infecção em células que
expressam o DC-SIGN em sua membrana. Em outra análise, Plazolles et al., 2011,
demonstrou que a isoforma sDC-SIGN1A tipo I promoveu um aumento significativo
da taxa de infecção de Citomegalovírus humano em células dendríticas imaturas.
Sendo assim, estas isoformas podem ter diversas implicações no
mecanismo de patogênese da dengue, sendo necessário então, um maior
esclarecimento das bases moleculares deste processo, que permitiria um importante
avanço no entendimento da doença.
1.1.6. Isoforma sDC-SIGN1B tipo III do DC-SIGN
Nos estudos realizados anteriormente pelo nosso grupo de estudo, Pereira,
2013 analisou in silico as isoformas que sofrem alterações no domínio de
reconhecimento a carboidratos do DC-SIGN. Cinco isoformas geradas pelo splicing
alternativo possuem modificações no DRC, mostradas na Tabela 2. Das cinco
isoformas, duas são de membrana (2 e 4), e três são solúveis (9,12 e 13). Estas
isoformas foram estudadas por modelagem molecular comparativa, sendo que a
isoforma 1, também chamada de canônica, foi utilizada como protótipo para a
realização dos estudos, por ser a isoforma mais completa com as quais as demais
isoformas foram comparadas. O domínio de reconhecimento a carboidratos
compreende a sequência de aminoácidos do DC-SIGN de 263 a 378 (UniProt;
Mummidi et al., 2001; Pereira, 2013). A isoforma 12 (sDC-SIGN1B tipo III), além de
perder o éxon II, perde também o éxon V e sofre uma mudança na sequência dos
aminoácidos da porção C-terminal.
28
Além disso, foi verificado que a isoforma 12 do grupo 1B, tipo III (sDC-
SIGN1B tipo III) possui 297 aminoácidos e sofre uma troca de aminoácidos da
posição 1 a 15, além de perder a sequência de aminoácidos de 36 a 59. Outra
sequência que compreende os aminoácidos 301 a 320 é trocada, e a partir do
aminoácido 321 toda a sequência é perdida (Figura 8) (Pereira, 2013).
Tabela 2- Isoformas do DC-SIGN que possuem modificações na região do DRC.
Figura 8- Alinhamento da sequência de aminoácidos correspondente à proteína completa do DC-SIGN com a isoforma 12 que possui modificações. A região compreendida entre os aminoácidos 263 e 378 refere-se ao DRC. (Alinhamento gerado pelo software MultAlin).
29
A estrutura tridimensional do DRC da isoforma 12 também foi construída por
modelagem comparativa por Pereira, 2013 mostrando 79,4 % de identidade com o
molde comparado, que corresponde à estrutura cristalográfica do DRC da isoforma
canônica do DC-SIGN complexado à uma estrutura de manose depositada no PDB
(Figura 9a). Na estrutura do DRC da isoforma 12, existem três alfa-hélices, duas
beta-folhas sendo que, os íons Ca2+ são perdidos (Figura 9b) (Pereira, 2013).
Sendo assim, tendo em vista as observações realizadas por Pereira, 2013 do
nosso grupo de pesquisa, se faz importante a realização de experimentos in vitro
que comprovem ou não a hipótese de que a ligação daquelas isoformas que sofrem
alterações na região do DRC, como a isoforma sDC-SIGN1B tipo III, poderia estar
comprometida na ligação ao seu ligante.
Figura 9- Modelos tridimensionais do domínio de reconhecimento a carboidratos correspondentes as isoformas 1 e 12 do DC-SIGN. a) Estrutura do DRC da isoforma canônica do DC-SIGN utilizado como molde para a modelagem, mostrando: Três alfa-hélices em vermelho, sete folhas-beta em azul e três íons Ca2+ em cinza. b) Estrutura do DRC da isoforma 12 do DC-SIGN. Três alfa-hélices em vermelho e duas folhas-beta em azul. Os sítios de ligação para os íons Ca2+ são perdidos. Fonte: Pereira, 2013.
a) b)
30
1.2. JUSTIFICATIVA
A Dengue é uma arbovirose que atinge uma parcela grande da população
mundial. Sua transmissão vem se intensificando ao longo das últimas décadas, o
que a torna um problema de saúde pública. Após a picada do mosquito vetor
transmissor da doença, as partículas virais reconhecem receptores expressos na
superfície de células presentes nos tecidos primários de exposição aos patógenos.
O receptor DC-SIGN, expresso na superfície de células dendríticas, é de grande
importância na interação com o Dengue vírus. As células dendríticas imaturas
presentes na pele, possuem alta susceptibilidade ao DENV, provavelmente devido
aos seus altos níveis de expressão de DC-SIGN (Richter et al., 2014). Este receptor
também atua reconhecendo diferentes patógenos, além de reconhecer moléculas de
adesão intercelular expressas em outras células, podendo gerar diferentes respostas
nesse reconhecimento.
Atualmente, são escassos os estudos que mostram qual o papel das diversas
isoformas geradas no processamento sofrido pelo mRNA correspondente ao gene
CD-209 que o codifica, além das funções das isoformas solúveis. As variações
ocorridas nas diferentes isoformas levam a questões importantes relacionadas ao
processo de infecção e a forma de interação das mesmas junto ao vírus. Até o
momento, poucos são os estudos sobre as isoformas que sofrem alterações no
domínio de reconhecimento a carboidratos (DRC) relatando qual seria a
consequência dessas alterações no que se refere à ligação ao patógeno. Os poucos
estudos existentes apresentam resultados contrastantes. Alguns apoiam a hipótese
de que isoformas solúveis poderiam aumentar a taxa de infecção viral e outros de
que estas isoformas poderiam atuar inibindo este processo. Entretanto, estes
estudos foram realizados com outros vírus, permanecendo desconhecido o papel
destas isoformas na infecção pelo DENV.
O grupo de pesquisa do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade
Federal de São João Del-Rei vem desenvolvendo estudos relacionados ao papel
que essas isoformas poderiam exercer frente ao processo de infecção viral. Em
estudo anterior por análises in silico, realizado por nosso grupo de pesquisa, foi
levantada a hipótese de que algumas isoformas com alterações em pontos
importantes para a ligação ao ligante, como os sítios de reconhecimento a
31
carboidratos, tenham a interação com o vírus comprometida (Pereira, 2013). A
isoforma sDC-SIGN1B tipo III deste trabalho, é uma isoforma que possui tais
alterações que poderiam comprometer sua ligação aos resíduos de manose, que
estão presentes na superfície do DENV. Frente à isto, faz-se necessário estudos
experimentais in vitro para apoiar ou rejeitar a hipótese descrita acima e que avaliem
a verdadeira função dessas isoformas.
32
1.3. OBJETIVOS GERAIS
Expressar a isoforma solúvel sDC-SIGN1B tipo III(isoforma 12) do receptor
DC-SIGN e avaliar sua capacidade de ligação à manose.
1.4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar in silico a isoforma solúvel sDC-SIGN1B tipo III;
Expressar e purificar a proteína solúvel sDC-SIGN1B tipo III;
Avaliar a capacidade de ligação da proteína sDC-SIGN1B tipo III purificada à
resíduos de manose.
33
2. MATERIAL E MÉTODOS
Segue abaixo a imagem do fluxograma para a realização deste trabalho
(Figura 10).
Figura 10- Esquema representativo das etapas experimentais desenvolvidas neste projeto.
Análises in silico Testes in vitro
Eletroporação
Extração plasmidial e
Sequenciamento
Expressão
Purificação
Síntese química e
clonagem do gene
Sequência gênica da isoforma sDC-SIGN1B tipo III
disponibilizada no GenBank
Teste Funcional de
ligação em coluna de
manose
34
2.1. Análises in silico
A sequência nucleotídica da isoforma sDC-SIGN1B tipo III foi obtida no
GenBank™ (AY042232.1NCBI), disponível em
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Posteriormente, uma série de ferramentas de
bioinformática foi utilizada para um melhor conhecimento da proteína a ser
estudada. Todos os programas utilizados e suas funções estão descritos na tabela
3.
Tabela 3- Ferramentas de bioinformática utilizadas para realização dos estudos in
silico.
Programa Função Referência
Translate Tool
Permite a tradução de uma
sequência nucleotídica
(DNA/RNA) para a sequência de
proteína correspondente.
http://web.expasy.org/translate/
Compute
pI/Mw
Prevê o ponto isoelétrico (pI) e
peso molecular (Mw) da proteína.
http://web.expasy.org/compute_pi/
YinOYang Programa que faz predições
sobre os locais de ligação O-β-
GLCNAc glicosídica em
sequências de proteínas
eucarióticas.
http://www.cbs.dtu.dk/services/
YinOYang/
Gupta, 2002
NetNGlyc Prevê locais de modificações de
N-glicosilação em proteínas
eucarióticas.
http://www.cbs.dtu.dk/services/
NetNGlyc/
Gupta, 2002
Protparam Permite o cálculo de vários
parâmetros físico-químicos de
proteínas, bem como a
composição dos aminoácidos
estimando o índice de
hidropaticidade.
http://web.expasy.org/protpara
m/
Gasteiger et al., 2005
35
ProtScale
Fornece o perfil físico-químico de
uma proteína através do cálculo
e representação gráfica do perfil
de hidropaticidade dos
aminoácidos presentes na
proteína.
http://web.expasy.org/protscale/
Gasteiger et al., 2005
InterProScan
SignaIP
Fornece uma análise funcional de
proteínas, classificando-as em
famílias, domínios e sítios
específicos conservados. Essa
classificação se dá pela busca de
modelos preditivos fornecidos por
diferentes bancos de dados.
Prevê a presença e localização de
sítios de clivagem do peptídeo
sinal em sequências de
aminoácidos.
http://www.ebi.ac.uk/interpro/s
earch/sequence-search
Mitchell et al., 2015
http://www.cbs.dtu.dk/services
/SignalP/
Petersen et al., 2011
2.2. Testes in vitro
2.2.1. Síntese in vitro da sequência do transcrito da isoforma sDC-SIGN1B tipo
III (Isoforma 12) do DC-SIGN
A sequência do cDNA da isoforma sDC-SIGN1B foi sintetizada in vitro pela
empresa Epoch Life Science (Missouri City, Texas, EUA), sendo que foi adicionada
uma sequência de seis códons que codifica para seis histidinas na porção C-
terminal, os quais foram utilizados para purificação por cromatografia de afinidade e
detecção por Western blotting. A sequência da isoforma, chamada de seq56973, foi
otimizada, sintetizada e ligada invertida no vetor de expressão pET28a. Este vetor é
constituído por 6144pb, apresenta em sua sequência um marcador de seleção para
o antibiótico canamicina, promotor do bacteriófago T7 e o sítio múltiplo de clonagem,
onde foi inserida a sequência de interesse (Figura 11).
36
Figura 11- Vetor de clonagem e expressão contendo a sequência da isoforma sDC-SIGN1B tipo III , sintetizado pela empresa Epoch Life Science (Missouri City, Texas, EUA).
2.2.2. Linhagem Bacteriana e Condições de Cultivo
A linhagem bacteriana utilizada para a expressão protéica foi Escherichia coli
BL21 DE3 Rosetta disponível em nosso banco de células (genótipo: F- ompT
hsdSB(rB- mB
-) gal dcm (DE3) pRARE2 [CamR]). As classes de bactérias BL21 são
deficientes nos genes lon e ompT que codificam proteases, garantindo maior
estabilidade na expressão de proteínas heterólogas. Esta cepa contém um plasmídio
pPARE2 que codifica genes envolvidos na produção de tRNA de códons raros para
E coli. Isto permite maior expressão de proteínas de outros organismos.
Essa linhagem de E. coli foi cultivada em meio 2xYT( 0,05% de cloreto de
sódio, 0,1% de extrato de levedura e 0,16% de peptona de carne). Para a produção
de meio sólido, 1,5% de ágar bacteriológico também foi adicionado para a confecção
das placas de cultura. Para ambos os casos, o pH foi ajustado para 7,2. Em caso de
meio seletivo, foi adicionado 50 μg/mL de canamicina pré-filtrada. As bactérias foram
incubadas por 18 horas para crescimento em agitador tipo shaker a 180 rpm em
temperatura de 37° C.
GS56973-2 pET28a-seq56973
6144 bps
1000
2000
3000
4000
5000
6000
BlpIPspXIXhoI
EagI
AhdINcoIXbaI
SgrAI
MluIBclI
BstEIIApaIPspOMINmeAIII
BssHIIEcoRV
HpaIPshAI
BglIFspAIFspI
PpuMI
Tth111IAccI
Bst1107ITatI
PciI
BssSI
NruIClaI
SmaIXmaI
AsiSIPvuI
PsiIDraIII
seq56973
lac\operator
lac\I
kan\sequence
37
2.2.3. Preparação de bactérias eletrocompetentes
Para obtenção das linhagens E. coli BL21 DE3 Rosetta eletrocompetentes, foi
feito um pré-inóculo em 10 mL de meio 2xYT com incubação da cultura a 37ºC, 180
rpm por 18 horas. Após este período, o pré-inóculo foi dividido em duas alíquotas de
5 mL que foram adicionadas em recipientes contendo 500 mL de meio 2xYT. Essas
culturas foram incubadas a 37ºC, 180 rpm até atingir a fase exponencial de
crescimento com densidade óptima (DO600) entre 0,2 e 0,25. Ao atingir a DO600
desejada, a cultura foi resfriada em recipiente com gelo e dividida em 4 alíquotas de
250 mL. Elas foram centrifugadas à 1250 g, 4°C por 30 minutos. Cada sobrenadante
foi descartado e o pellet ressuspendido em 50 mL de glicerol 10% gelado e estéril.
Essa suspensão homogeneizada foi centrifugada a 1250 g a 4°C por 30 minutos e,
em seguida, o sobrenadante foi descartado. Esse processo de lavagem foi repetido
mais três vezes e após a última lavagem, o pellet foi ressuspendido em 1 mL de
glicerol 30% gelado e estéril. Foi retirado um volume de 25 µL da suspensão e
adicionado a 10 mL de glicerol 30% para determinar a DO600 que deveria apresentar
um valor de 0,15. A suspensão foi dividida em alíquotas de 30 µL e armazenada à -
80°C.
2.2.4. Transformação bacteriana por eletroporação
A transformação bacteriana foi realizada de modo que 10 ng de plasmídeos
pET-28a foram adicionados numa alíquota de bactérias eletrocompetentes. Como
controle positivo da eletroporação, foram utilizados 10 ng do plasmídeo pUC-18.
Também foi feito um controle negativo onde nenhum DNA foi adicionado à alíquota
de bactérias eletrocompetentes. Essas misturas foram, então, levadas
separadamente a cubetas de eletroporação, previamente resfriadas em gelo, e, em
seguida, com o auxílio do eletroporador GenePulser Eletroporation System (Bio-
RAD), foi aplicado um pulso elétrico de 2,5kV. Após o pulso, foi adicionado 1 mL de
meio 2xYT dentro da cubeta e o conteúdo total foi recuperado e levado a um
microtubo de 2 mL. Em seguida, as bactérias foram incubadas a 37° C sob agitação
de 180 rpm por 45 minutos. Decorrido esse tempo, 70 μL desse conteúdo foi
plaqueado em meio 2xYT sólido contendo canamicina (50 μg/mL). Com o auxílio de
38
alças descartáveis, as placas foram incubadas a 37° C por 18 horas em estufa. A
seleção dos clones que continham o plasmídeo com a sequência de interesse foi
feita pela visualização das colônias crescidas nas placas, comparadas aos controles.
2.2.5. Purificação do plasmídio (Miniprep) e sequenciamento de DNA plasmidial
Uma colônia recombinante foi selecionada da placa réplica a fim de se extrair
o DNA plasmidial. Esta foi inoculada em 5 mL de meio 2xYT suplementado com
canamicina (50 μg/mL) e cultivada a 37°C, sob agitação constante a 180 rpm,
durante 18h. A recuperação dos plasmídeos recombinantes foi obtida através de
extração plasmidial em pequena escala (mini-prep) utilizando o protocolo fornecido
pelo fabricante PureLink® Quick Plasmid Miniprep Kit (GenElute™ Plasmid
Miniprep Kit-Novagen). Neste procedimento, as células foram lisadas utilizando um
processo alcalino e o lisado foi aplicado a uma coluna onde o DNA plasmidial foi
adsorvido à membrana de sílica. As impurezas foram removidas com tampão de
lavagem e o DNA puro foi eluído em pequeno volume de tampão de eluição. Após
extração plasmidial a quantificação foi determinada por meio do espectrofotômetro
de absorbância (NanoDrop® ND-1000, Thermo Scientific), no comprimento de onda
de 260nm. Para se avaliar o grau de pureza da amostra de DNA por proteínas,
utilizou-se a relação de 260/280 nm, onde 280 nm corresponde ao valor de
absorbância para proteínas. As amostras, então, foram armazenadas à -20°C.
Para a purificação através da precipitação do DNA para obtenção da amostra
livre de contaminantes, a amostra foi purificada com polietilenoglicol (PEG). As
amostras obtidas da extração pela miniprep foram transferidas para tubos de 1,5 mL
e então acrescentou-se o mesmo volume obtido das amostras de PEG 20%. Em
seguida, foram homogeneizadas em vortex e incubadas em banho-maria 37°C por
15 minutos. As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 4°C/16500 g.
Retirado o sobrenadante, foram acrescentado 125 µL de etanol 80%. Estes passos
foram, então, repetidos por mais duas vezes e, então, a amostra foi seca por 30
minutos a 37°C. O DNA foi, então, ressuspendido em água com metade do volume
inicial de amostra.
39
A reação de sequenciamento foi realizada utilizando o kit BigDye®
Termininator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), de acordo com as
instruções do fabricante. As amostras foram preparadas para um volume final de 10
μL, contendo 80,2 ng de DNA plasmidial e 1 mM do iniciador T7 Forward (5´-
TAATACGACTCACTATAGGG- 3´) e outra amostra contendo 1 mM do iniciador T7
Reverse (5‘- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3‘). A reação foi levada ao termociclador
sendo utilizado o seguinte programa: primeiro passo de desnaturação a 96° C por 1
minuto, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 96° C por 15 segundos, anelamento
a 50° C por 15 segundos e extensão a 60° C por 3 minutos. O produto foi, então,
colocado a 4° C durante 4 minutos. Os produtos da reação de sequenciamento
passaram por uma purificação com PEG. Inicialmente foi acrescentado o mesmo
volume (da amostra) de PEG 20% e, posteriormente, a amostra foi incubada em
banho-maria a 37°C por 15 min e centrifugada por 15 min a 4°C/1125 g. O
sobrenadante foi coletado cuidadosamente e foram adicionados 125 μL de etanol
80%. Os dois últimos passos foram repetidos mais duas vezes e, em seguida, a
amostra foi incubada à 37°C por 30 minutos até a secagem completa do etanol, e
ressuspendida em 30 μL de formamida HiDi® (Applied Biosystem). A reação foi
incubada por 5 minutos a 95° C, e posteriormente, resfriada no termociclador.
Após a purificação, as amostras foram sequenciadas no aparelho AB3500
(Applied Biosystem) por eletroforese capilar, utilizando polímero POP7. Os
resultados obtidos foram analisados utilizando os programas Sequence Scanner
Software 2 (Applied Biosystems) e MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/).
2.2.6. Expressão heteróloga da isoforma sDC-SIGN1B tipo III em pequena
escala
Para a expressão heterológa em pequena escala da isoforma 12 do DC-
SIGN, foi feito um pré-inóculo, onde uma colônia selecionada com o plasmídeo
recombinante foi coletada e inoculada em meio 2xYT contendo 50 μg/mL de
canamicina, durante 18 horas a 37º C e 180 rpm. Decorrido este tempo, foi feito um
inóculo em meio 2xYT na razão 1:100 utilizando-se o pré-inóculo anterior. O novo
inóculo foi crescido nas mesmas condições descritas anteriormente até que a leitura
de DO600 chegasse a valores entre 0,6 e 0,8. Após esta etapa, foi induzida a
40
expressão da proteína adicionando-se 0,8 mM de IPTG (Isopropil B-D-1
tiogalactopiranosideo). Anteriormente à indução, foi recolhido 1 mL do inóculo sem a
adição de IPTG, e esse foi chamado T0. Após esse evento, a cada 1 hora foi
recolhido 1 mL do inóculo. O tempo total de expressão foi de 4 horas e os tubos
foram nomeados T1 a T4. As amostras recolhidas foram centrifugadas a 1250 g e o
pellet recuperado foi ressuspendido em tampão de amostra contendo 60 mM Tris-
HCl pH 6.8, 10% glicerol, 5% β-Mercaptoetanol, 2% dodecil sulfato de sódio (SDS),
0.5% de azul de bromofenol. Por fim, essas amostras foram submetidas à
temperatura de 100º C por 5 minutos, e em seguida, armazenadas a -20° C.
2.2.7. Eletroferese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)
As amostras obtidas anteriormente foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS-PAGE preparado em duas concentrações diferentes de
acrilamida. A parte superior do gel (1/3 do volume total) foi composta por 5%
acrilamida, 0,37 M de Tris-HCl pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amônio e
0,002% TEMED (tetrametiletilenediamina). A região inferior foi composta por 15%
acrilamida, 0,37 M de Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amônio e
0,002% TEMED (tetrametiletilenediamina). Para análise dos resultados foi utilizado o
padrão pré-corado de massa molecular de proteína 4 a 250 kDa (Fermentas) como
parâmetro de comparação com a proteína sDC-SIGN1B (34,5 kDa). O volume de
cada amostra aplicado no gel foi de 10 μL e a corrida eletroforética foi efetuada em
tampão Tris-glicina (25 mM Tris-HCl pH 8,3, 250 mM glicina, 0,1% SDS) a 80V por
aproximadamente 1 hora. Decorrido esse intervalo foi então submetida uma
voltagem de 100 V até que o tampão de amostra saísse do gel. O gel foi corado com
Coomassie Blue (0,25% Coomassie Blue R250, 50% metanol, 10% ácido acético) e
lavado várias vezes em solução descorante (50% metanol, 10% ácido acético) até
que fosse possível a visualização nítida das bandas.
41
2.2.8. Western Blotting
Para o experimento de imunodetecção, foi preparado um gel SDS-PAGE,
exatamente como descrito no item 2.2.7, para ser utilizado neste procedimento. Para
comparação da massa molecular apresentada pela proteína, utilizou-se o padrão
pré-corado que continha proteínas de massa molecular de 10 a 230 KDa (New
England Biolabs-EUA). As proteínas foram transferidas do gel para uma membrana
de PVDF (fluoreto de polivinilideno), previamente ativada com metanol por 15
segundos, através do aparelho de transferência eletroforética (Loccus
Biotecnologia). Uma corrente constante de 350 mA, por aproximadamente 3h 30min,
foi aplicada de forma que as proteínas migrassem do gel para a membrana. Todos
os materiais utilizados na transferência foram previamente mergulhados em tampão
de transferência (20% de metanol e 25% de tampão 4X – 0,025 M Tris-HCl, 0,192 M
glicina pH 8,0) e a transferência também ocorreu na presença do próprio tampão de
transferência.
Em seguida, a membrana foi corada com solução de Ponceau (1,6x10-4 mol/L
de ponceau xilidina, 5% ácido acético glacial) para verificar a transferência das
proteínas e padrão de peso molecular. Uma vez confirmada a transferência, a
membrana foi lavada com água deionizada e, então, incubada por 16 horas com
solução de bloqueio contendo PBS 1X (5,8 M NaCl, 7,4 M KCl, 14,2 M Na2HPO4,
13,6 M KH2HPO4), 10% leite desnatado em pó e 0,05% de Tween 20, sob agitação.
Em seguida, a membrana foi lavada 3 vezes durante 10 minutos com solução de
lavagem (PBS 1X e 0,05% de Tween 20) e incubada com o anticorpo monoclonal
anti-histidina conjugado à enzima fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich- EUA) diluído na
proporção 1:2000 na solução de lavagem e mantido sob agitação por duas horas, à
temperatura ambiente. Após a incubação com anticorpo anti-histidina, a membrana
foi novamente lavada por 3 vezes de 10 minutos com solução de lavagem, e então
incubada com os substratos NBT/BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/Nitro Blue
Tetrazoliun) (Promega), em concentração de 0.02% e 0.016%, respectivamente.
Após o aparecimento das bandas na membrana, a mesma foi lavada com água
deionizada e deixada para secar antes de ser fotografada.
42
2.2.9. Expressão heteróloga da isoforma sDC-SIGN1B tipo III em larga escala e
teste de solubilidade
Para a obtenção em larga escala da proteína expressa, 500 mL de meio de
cultura foram feitos e a expressão foi realizada conforme o item 2.2.6. No último
passo, o meio foi removido por centrifugação a 1250 g em temperatura ambiente. O
pellet formado foi ressuspendido em 20 mL de tampão de ligação da coluna
cromatográfica contendo 50 mM de Tris-HCl , 300 mM de NaCl, 6M de ureia pH 7,4.
Para verificação do teste de solubilidade, a lise celular foi feita a partir de 5
séries de congelamento e descongelamento da ressuspensão celular, seguido por 5
sonicações de 1 minuto na potência 30 do Desrupitor de Células Ultra Sônico
(UNIQUE). O debri celular foi então separado do extrato celular através de uma
centrifugação a 1250 g por 20 minutos a 4° C e esse foi armazenado a -80° C. Este
procedimento foi realizado para verificar se a proteína estava na forma solúvel, ou
insolúvel presente em corpúsculos de inclusão.
2.2.10. Purificação da isoforma sDC-SIGN1B tipo III recombinante
Para a purificação da isoforma sDC-SIGN1B tipo III foi utilizada a coluna
HiTrap™ TALON® crude (GE Healthcare) e o protocolo foi seguido conforme
instruções do fabricante. A coluna foi acoplada a uma bomba peristáltica e o fluxo foi
ajustado para 1 mL/minuto. Posteriormente, a coluna foi equilibrada com 20 mL do
tampão de ligação composto por 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 6M de ureia
pH 7,4. Em seguida, 30mL do lisado celular foram aplicados e o fluxo foi reduzido
para 0,4 mL/minuto. Então, a lavagem foi feita com diferentes soluções de
concentrações reduzidas de ureia, para o remodelamento da proteína na própria
coluna, uma vez que a proteína na presença de ureia se encontra desnaturada
(Singh, Panda, 2004). A concentração inicial de ureia foi de 5 M e sendo reduzida de
1 em 1 M para cada 20 mL de solução que era passada pela coluna, até a remoção
total da ureia (0 M). A proteína, finalmente, foi eluída da coluna com 10 mL do
tampão de eluição composto por 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 150 mM de
imidazol pH 7,4. Ao final, as alíquotas obtidas foram dosadas pelo método de
43
Bradford (Bradford, 1976) e, então, submetidas à SDS- PAGE 15% para verificar a
pureza das amostras.
2.2.11. Dosagem de proteínas pelo método de Bradford
Uma alíquota de 5 μL de cada fração coletada foi diluída em 15 μL de água
deionizada e transferida para uma placa de microtitulação. Na mesma placa foi
preparada, em duplicata, uma curva padrão de concentração de proteínas,
utilizando-se BSA (Bovine Serum Albumin) nas concentrações de 0 mg/mL a 1,0
mg/mL, em volume final de 20 μL. O branco das reações, para calibrar o aparelho,
foi feito com 20 μL de água MilliQ. Todas as proteínas foram, então, incubadas na
presença de 180 μL de reagente de Bradford (Sigma-Aldrich) por 5 minutos. A
intensidade da coloração foi medida na absorbância de 595 nm no
espectrofotômetro de microplaca PowerWave XS2 (Biotek). As concentrações das
proteínas presentes nas frações coletadas foram obtidas com base na curva padrão
de albumina. As proteínas foram mantidas a -80° C até serem utilizadas.
2.2.12. Avaliação da capacidade de ligação da isoforma 12 do DC-SIGN em
coluna de manose
Após a quantificação da proteína purificada, as frações com concentrações
conhecidas foram aplicadas a uma coluna de manose-agarose (SIGMA-USA). Esta
matriz é apresentada na forma de suspensão aquosa de agarose em NaCl 0,05 M,
contendo 0,02% (m/v) de timerosal. A molécula de manose está acoplada aos
grupos hidroxil da resina. A coluna foi previamente preparada no laboratório de
forma que o gel de afinidade manose-agarose foi fixado à coluna, com um volume
de 1,5 mL. O protocolo de utilização da coluna de manose-agarose foi realizado de
acordo com as instruções do fabricante, onde primeiramente, para retirar a solução
de preservação, lavou-se a coluna com 15 mL de água destilada por três vezes. A
coluna foi então equilibrada com tampão composto por 50mM de Tris-HCl, 150mM
de NaCl e 10mM de CaCl2 pH 7,4. Posteriormente 1 mL da amostra contendo
44
0,26µg/µL da isoforma sDC-SIGN1B tipo III (previamente equilibrada no tampão da
coluna) foi depositada na coluna, de modo que após isto, foram realizadas 10
lavagens com um volume de 500 μL cada, com tampão de lavagem contendo 50mM
de Tris-HCl, 150mM de NaCl e 10mM de CaCl2 pH 7,4. Para a eluição, passou-se
pela coluna 10 mL do tampão de eluição contendo 50mM de Tris-HCl, 150mM de
NaCl e 50mM de EDTA pH 7,4. Todas as amostras, tanto as lavagens, como as
eluições foram dosadas por Bradford. O mesmo experimento foi realizado utilizando-
se como controle positivo a isoforma sDC-SIGN1A tipo III (isoforma 8), que é uma
isoforma solúvel que não possui alterações no DRC, expressa e purificada pelo
nosso grupo de pesquisa. Esta isoforma também foi pré-equilibrada no mesmo
tampão de equilíbrio da coluna. Posteriormente a coluna foi regenerada por lavagem
com 15 mL do tampão contendo 50mM de Tris-HCl, 150mM de NaCl e 0,2 M de
manose pH 7,4, seguindo-se uma lavagem com 10 mL de NaCl 2,0M, e por último,
uma lavagem com 30 mL de água destilada.
45
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Análises in silico da isoforma sDC-SIGN1B tipo III (Isoforma 12) do DC-
SIGN
Através das análises de bioinformática, foi possível prever o comportamento
da isoforma sDC-SIGN1B tipo III. A sequência nucleotídica (AY042232.1) e protéica
(AAK91857.1) da isoforma sDC-SIGN1B tipo III estão apresentadas abaixo e foram
obtidas do banco de dados GenBank (Figura 12).
Figura 12: Sequência gênica e protéica da isoforma sDC-SIGN1B tipo III. a) Sequência gênica codificante da proteína ; b) Sequência de aminoácidos da proteína.
Primeiramente, foram estudadas as propriedades físico-químicas da
proteína, onde através do programa Compute pI/Mw na plataforma Expasy, foi
observado um ponto isoelétrico teórico de 7,12 e peso molecular de
aproximadamente 34,7 kDa. Através do programa YinOYang foi possível prever os
locais prováveis de O-glicosilação , onde são esperados pelo menos cinco resíduos
de aminoácidos O-glicosilados, sendo que um deles com score de maior força(+++),
46
conforme indicado na Figura 13a. Os possíveis sítios possuem valor de potencial
(picos em verde) acima do limiar (linha azul).
Figura 13: Predição de O e N-glicosilações e peptídeo sinal da isoforma 12 do DC-SIGN. a) Através do software YinOYang foram detectados cinco possíveis sítios de O-glicosilação. Estes estão presentes nos resíduos: 8 (+++), 33 (+), 37 (++), 42 (++) e 44 (+). A força do score é classificada de forma qualitativa em +, ++, +++, ++++. b) Através do software NetNGlyc foi previsto um sítio de N-glicosilação no resíduo 56 (+++). c) A predição de peptídeo sinal foi feita pelo software SignaIP, o qual não detectou a presença do mesmo, indicado no gráfico pela ausência do sinal de score acima do limiar (linha tracejada em roxo).
a)
b)
c)
47
Através do programa NetNGlyc foi possível também, prever um local de N-
glicosilação mostrado na Figura 13b, com score de maior força (+++). Porém, esta
modificação pós-traducional possivelmente não ocorreria in vivo, uma vez que, como
há a ausência de peptídeo sinal demonstrado pelo programa SignaIP (Figura 13c),
há uma ausência de endereçamento para o retículo endoplasmático e a proteína não
estaria exposta à maquinaria de N-glicosilação, que ocorre no retículo
endoplasmático (Luirink, 2004). Através do programa Protparam, foi observado que
o gene da isoforma 12 codifica para uma proteína que contém 297 aminoácidos e
coeficiente de hidropaticidade de -0.714, indicando um perfil solúvel (Gasteiger, et
al., 2003). A fim de observar os domínios conservados presentes na sequência da
proteína o programa InterProScan foi utilizado.. A partir das análises foi observado
que a sequência possui domínios referentes às lectinas tipo C. Como todas as
lectinas extracelulares, lectinas do tipo C se ligam a epítopos de carboidratos
terminais de glicanos que se originam a partir de qualquer agente patogénico ou de
outras células (Anderluh, 2012).
Para realizar uma previsão do perfil de hidropaticidade, também foi utilizado
o programa ProtScale. De acordo com este programa, os picos acima do limiar zero
representam os aminoácidos hidrofóbicos na sequência, e os picos abaixo, os
aminoácidos hidrofílicos (Kyte, Doolittle, 1982). No caso da isoforma 12, foi obtido
um resultado que corrobora com os números apresentados no programa ProtParam
que caracterizou essa proteína com caráter solúvel. Pode-se observar no gráfico
gerado pelo programa ProtScale, que a maioria dos picos se encontram bem
distribuídos abaixo do limiar zero e alguns picos se encontram acima do limiar zero,
de forma que ela apresenta um perfil mais hidrossolúvel na distribuição de seus
aminoácidos (Figura 14).
Esta informação é relevante quando se trata de expressão heteróloga, pois o
caráter hidrofílico reduz a chance de formação de corpos de inclusão durante o
procedimento de expressão.
48
3.2. Testes in vitro
3.2.1. Purificação do DNA plasmidial e sequenciamento da isoforma 12 do DC-
SIGN no vetor de expressão pET28a
Após a eletroporação das linhagens bacterianas E. coli BL21 DE3 Rosetta
com o plasmídio contendo a sequência de interesse, a extração plasmidial (mini-
prep) foi realizada obtendo-se o plasmídeo de interesse purificado. A razão
A260/280 indica a pureza da amostra em relação a restos de proteínas,
quantificadas na faixa de absorbância de 280 nm, enquanto o DNA é quantificado
em 260 nm. Já a razão A260/230 indica a pureza das amostras em relação a restos
orgânicos do processo de extração, como sais e fenol, quantificados na faixa de 230
ProtScale
Posição
Figura 14: Predição de hidropaticidade da isoforma 12 do DC-SIGN. Gráfico do perfil de hidropaticidade da sequência de aminoácidos da proteína, gerado pelo software ProtScale. Os sinais de score acima do limiar zero representam os aminoácidos hidrofóbicos distribuídos na sequência da proteína. Bem como abaixo do limiar zero, estão os aminoácidos hidrofílicos presentes na sequência protéica, sendo estes de maior número.
49
nm. O valor para ambas as razões foi em torno de 2,00, sendo considerada uma
amostra pura (Tabela 4) (Thermo Scientific, 2011).
Em seguida à confirmação da pureza da amostra, a clonagem da ORF de
interesse no plasmídeo pET28a foi confirmada através da análise por
sequenciamento. Foi realizado o alinhamento da sequência referência no vetor de
expressão da isoforma 12 com o resultado obtido pelo sequenciamento, através do
software MultAlin e não foram observadas alterações nas sequências de
nucleotídeos.
3.2.2. Expressão e purificação da isoforma 12 do DC-SIGN
De posse então destes resultados, foi realizada a expressão heteróloga da
proteína para realização do teste funcional. Os resultados da expressão podem ser
visualizados pelo gel de SDS-PAGE (Figura 15).
Foi possível observar um aumento gradual de uma banda em relação ao
tempo de indução na altura de aproximadamente 34,7kDa, compatível com o
tamanho esperado nas análises in silico, sugerindo que a proteína está sendo
expressa em maior quantidade em relação às proteínas do próprio organismo que se
mantiveram em níveis normais de expressão.
Tabela 4- Leitura por espectrofotometria do produto de miniprep.
50
Figura 15: Análise da expressão da isoforma 12 do DC-SIGN. Gel de SDS-PAGE 15% corado com Comassie blue: 1: Padrão de peso molecular; 2: lisado celular antes da indução (To); 3: lisado celular após 1 hora da indução (T1); 4: lisado celular após duas horas da indução (T2); 5: lisado celular após três horas da indução (T3); 6: lisado celular após quatro horas da indução (T4). A seta vermelha mostra a expressão da proteína de interesse.
Para confirmar a presença da proteína sDC-SIGN1B tipo III recombinante no
extrato celular, foi realizado o ensaio de Western blot através do anticorpo anti-
histidina. Este anticorpo encontra-se conjugado à enzima fosfatase alcalina, à qual
converte o BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato) em um intermediário indoxil que
interage com NBT (Nitro Blue Tetrazoliun) dando origem a NBT diformazam
insolúvel, com coloração que varia de azul a roxo, sendo possível então a
visualização das bandas como mostrado na Figura 16. Como já dito, foram
adicionadas seis histidinas na sequência da porção C-terminal da isoforma 12,
confirmando então, através do Western blot, a expressão da isoforma 12 que está
fusionada à cauda de histidina.
50kDa
40kDa
30kDa
20kDa
34,7kDa
P T0 T1 T2 T3 T4
1 2 3 4 5 6
51
Figura 16: Western blot para detecção da isoforma sDC-SIGN1B tipo III. Membrana de PVDF contendo: Canaleta 1 - Padrão Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ (BioRad) 10-250kDa; Canaleta 2 - expressão antes da indução; Canaleta 3 - expressão após 1 hora da indução; Canaleta 4 - expressão após 2 horas da indução; Canaleta 5 - expressão após 3 horas da indução; Canaleta 6 - expressão após 4 horas da indução.
Após a confirmação da presença da isoforma sDC-SIGN1B tipo III
recombinante, o próximo passo foi a expressão da mesma em ―larga‖ escala, ou
seja, em uma volume maior de meio cultura, a fim de se obter maiores quantidades
para posterior purificação. Para isto, as células foram cultivadas em meio e, assim,
confirmada a expressão da proteína em maiores quantidades (Figura 17).
Em seguida, foi realizado o teste de solubilidade para verificar se a proteína
estava na forma solúvel ou insolúvel, presente em corpúsculos de inclusão. Pode-se
observar a presença da proteína em maiores quantidades, na forma insolúvel após a
lise, no debri celular (pellet) em corpúsculos de inclusão. Este resultado pode ser
observado na Figura 17, onde as amostras do pellet e sobrenadante se encontram
nas canaletas 5 e 6, respectivamente.
P T0 T1 T2 T3 T4
37kDa
~34,7kDa
25kDa
50kDa
1 2 3 4 5 6
52
Figura 17: Verificação da fração celular onde a isoforma sDC-SIGN1B tipo III foi encontrada. Gel de SDS-PAGE 15% corado com Comassie Blue, contendo: Canaleta 1 – Padrão de peso molecular; Canaleta 2 – Amostra antes da indução da expressão; Canaleta 3 – Amostra após 2 horas da indução; Canaleta 4 – Amostra após 4 horas da indução; Canaleta 5 – Amostra do pellet bacteriano após a lise; Canaleta 6 – Amostra de sobrenadante após a lise. A seta vermelha mostra a expressão da proteína de interesse.
A proteína insolúvel em corpúsculos de inclusão ocorre provavelmente pelo
alto nível de expressão proteica nas células, devido ao forte promotor de expressão
presente no plasmídeo utilizado que é o promotor do bacteriófago T7. Nos sistemas
de plasmídeos pET, os genes são posicionados à montante (―upstream‖) do
promotor T7. Além disso, a bactéria utilizada para a expressão possui um gene
oriundo do prófago (λDE3) que codifica para uma T7 RNA polimerase, de alta
capacidade de processamento controlada pelo promotor lacUV5 induzível por IPTG.
Os corpúsculos de inclusão são agregados proteicos que podem se formar
por diversas finalidades. Uma delas é a presença limitada de chaperonas quando
ocorrem altos níveis de expressão heteróloga. Nestas condições, uma quantidade
exarcebada de proteína alvo é produzida, conduzindo à sua deposição junto ao debri
1 2 3 4 5 6
34,7kDa
50kDa
40kDa
30kDa
P T0 T2 T4 Pel Sob
20kDa
53
celular (Betton, 2004). Diante disso, optou-se por realizar o processo de purificação
em condições desnaturantes com adição de ureia no tampão de ligação da coluna,
para a solubilização da proteína de interesse. A ureia é um dos agentes mais
utilizados na solubilização de proteínas, por aumentar a solubilidade em função do
rompimento das interações hidrofóbicas (Singh, Panda, 2004).
A expressão em larga escala foi realizada e novamente realizado o teste de
solubilidade após a adição de ureia para solubilização proteica. Pode-se observar
pela figura 18, que após a ressuspensão da amostra para o teste de solubilidade na
presença de ureia, foi possível encontrar a presença da proteína de forma solúvel no
sobrenadante, encontrado na canaleta 3.
Figura 18: Expressão em larga escala e verificação da fração celular onde a isoforma 12 é encontrada, após a adição de ureia. Gel de SDS-PAGE 15% corado com Comassie Blue, contendo: Canaleta 1 – Padrão de peso molecular; Canaleta 2 - Amostra de pellet bacteriano após a lise, com adição de ureia; Canaleta 3 – Amostra de sobrenadante após a lise, com adição de ureia; Canaleta 4 – Amostra antes da indução da expressão; Canaleta 5 – Amostra após 2 horas da indução; Canaleta 6 – Amostra após 4 horas da indução da expressão. A seta vermelha mostra a expressão da proteína de interesse.
Uma vez que a proteína foi expressa com sucesso e confirmada que a
mesma se encontrava solúvel no tampão de ligação, foi dado início ao processo de
purificação da mesma.
25kDa
37kDa
50kDa
P Pel Sob. T0 T2 T4
1 2 3 4 5 6
34,7kDa
54
A purificação da isoforma sDC-SIGN1B tipo III foi feita utilizando-se o método
de cromatografia de afinidade por íons metálicos. A coluna de purificação é
composta de agarose com um grupo quelante imobilizado carregado com íons
cobalto. O cobalto por sua vez, interage com grupos doadores de elétrons de
resíduos de aminoácidos expostos na superfície da proteína, tais como o anel
imidazol do aminoácido histidina (Bresolin, Miranda, Bueno, 2009). A interação do
íon à isoforma sDC-SIGN1B tipo III ocorre graças à presença na porção terminal de
seis histidinas, ocorrendo então uma forte e seletiva interação. Para a remoção na
conformação correta da proteína, durante o processo de purificação, foram aplicadas
soluções com concentrações decrescentes de ureia até que toda a ureia fosse
removida durante a lavagem. Esse método de lavagem permite que a proteína se
enovele lentamente até alcançar conformação ativa dentro da própria coluna
(Jungbauer, 2004). Após a eluição observou-se a presença de proteína em seis
alíquotas recolhidas, que foram aplicadas em SDS-PAGE 15% para análise de
pureza e para observar também se a proteína purificada apresentava o tamanho
esperado para a isoforma 12 do DC-SIGN, o que foi confirmado pelo tamanho da
banda na altura de 34,7kDa (Figura 19). As eluições foram dosadas pelo método de
Bradford, totalizando aproximadamente 1,0 mg.
Figura 19- Purificação da isoforma 12 do DC-SIGN. Gel SDS- PAGE 15% corado com Comassie Blue: 1- Padrão de peso molecular; 2- Extrato antes de passar pela coluna; 3 a 8- Proteína purificada na altura esperada de 34,7kDa, indicada pela seta vermelha.
1 2 3 4 5 6 7 8
25kDa
37kDa
34,7kDa
20kDa
55
3.2.3. Teste funcional de ligação da isoforma 12 do DC-SIGN à coluna de
manose
Uma amostra de eluição contendo 1 mL à 0,26 μg/ μL da isoforma 12, pré-
equilibrada no tampão de equilíbrio da coluna, foi depositada na coluna de manose,
de modo que cada lavagem e cada eluição foi dosada e os resultados estão
demonstrados na Figura 20. Se a hipótese de perda de ligação à manose estiver
correta espera-se que toda a proteína depositada na coluna seja liberada nos
tampões de lavagem.
Na Figura 20, pode-se observar que toda a proteína depositada foi liberada
juntamente ao tampão de lavagem da coluna que não contém EDTA. Este resultado
era esperado, devido às alterações presentes na região de ligação aos carboidratos
desta proteína. Isso também evidencia a importância da região do DRC na interação
com a manose, bem como demonstra que as alterações sofridas na região do DRC
Figura 20: Dosagens da Isoforma 12 nas frações de lavagens e eluições após passagem pela coluna de manose. Gráfico da concentração da isoforma 12 nas frações de lavagem após passagem pela coluna. Foram detectadas diferentes concentrações da proteína nas lavagens 5-9 (L5-L9), e nenhuma concentração nas eluições (E1-E9), demonstrando que a isoforma 12 não se ligou aos resíduos de manose presentes na coluna.
EDTA
56
devido ao processo de splicing alternativo, podem gerar consequências no que se
diz à ligação aos resíduos de manose. Estes resultados também levantam questões
a respeito da possível perda da interação desta isoforma junto ao DENV, sendo
necessários estudos futuros de infecção in vivo.
Como controle do experimento foi utilizada uma isoforma do DC-SIGN que
não possui alterações na região do DRC, a isoforma sDC-SIGN1A tipo III (Isoforma
8). Portanto, esta deve se ligar à coluna de manose, sendo desligada da mesma
apenas com o tampão de eluição. Como a proteína é uma lectina dependente de
íons Ca2+, após a passagem na coluna do tampão contendo EDTA, que é um agente
quelante de íons metálicos como o Ca2+, espera-se que a isoforma 8 seja
recuperada neste tampão pela ação do EDTA. Esta isoforma foi sintetizada pelo
nosso grupo de pesquisa de forma que passou-se pela coluna de manose 1 mL a
0,17 μg/ μL desta proteína, para a avaliação de sua capacidade de ligação aos
resíduos de manose presentes na coluna. Foi possível observar a ligação da
isoforma 8 aos resíduos de manose, pela presença da proteína somente nas
eluições (E1-E6), após a adição de EDTA como mostrado na Figura 21.
Figura 21: Dosagens da Isoforma 8 nas frações de lavagens e eluições após passagem pela coluna de manose. Gráfico da concentração da isoforma 8 nas frações de lavagem e eluição após passagem pela coluna. Foram detectadas diferentes concentrações da proteína nas eluições 1-6 (E1-E6), após a adição de EDTA e nenhuma concentração nas lavagens (L1-L10), demonstrando que a isoforma 8 se ligou aos resíduos de manose presentes na coluna.
EDTA
57
Desta forma, foi comprovado pelos experimentos apresentados acima a perda
da capacidade de ligação da isoforma 12 do DC-SIGN à manose. No mesmo
experimento, ainda foi comprovado a capacidade de ligação da isoforma 8 aos
resíduos de manose validando esta proteína para os futuros ensaios de infecção in
vivo, que serão realizados para melhor entendimento do papel das isoformas
solúveis no processo de internalização do DENV. Nestes ensaios, estas e outras
isoformas solúveis, em diferentes concentrações, serão incubadas juntamente com o
DENV e células dendríticas imaturas para avaliação de possíveis alterações no
processo de infecção do DENV.
Até o presente momento, não existem na literatura dados referentes aos
níveis de expressão das diferentes isoformas geradas pelo processo de splicing
alternativo do pré-RNAm do gene CD-209. Alguns estudos descrevem que um
mesmo indivíduo poderia apresentar níveis diferenciados da expressão do mRNA
das isoformas do DC-SIGN, sugerindo uma contribuição na variabilidade de
fenótipos associados à infecção por dengue (Mummidi et al., 2001; Plazolles et al.,
2011). Em estudo realizado por nosso grupo de pesquisa, Pereira, 2013 verificou a
presença de algumas isoformas frequentemente expressas em um grupo de 50
indivíduos controles e que as mesmas variam de um indivíduo para o outro. Foi
encontrada também, a presença da isoforma 13, em 98% das amostras analisadas.
Como já mencionado, a isoforma 13 possui alterações em sua sequência, bem como
a perda de todos os aminoácidos correspondentes à região do DRC. Entretanto,
não se conhece o perfil de expressão destas isoformas, principalmente as solúveis,
em situações de infecção pelo DENV.
Plazolles et al., 2011 descreve que a expressão dessas isoformas pode
também variar sob diferentes condições, como o aparecimento de maior expressão
de sDC-SIGN em tecidos sob inflamação, de pacientes que sofreram infecção por
citomegalovírus em comparação à tecidos não infectados.
Após os ensaios de infecção, a avaliação dos níveis de expressão destas
isoformas em indivíduos que apresentam quadros clínicos diferentes da dengue e
indivíduos não infectados, poderão trazer novos insights sobre a patogênese da
doença. Portanto, a continuação de estudos relacionados aos papeis das diferentes
isoformas do DC-SIGN são de extrema importância, para que as várias questões
58
geradas sobre o processo de infecção viral venham ser esclarecidas, bem como o
surgimento de novas alternativas para o bloqueio da infecção viral.
59
4. CONCLUSÕES
Foi possível a partir das análises in silico predizer o comportamento e
propriedades estruturais e físico-químicas da isoforma sDC-SIGN1B tipo III.
A expressão e purificação da proteína sDC-SIGN1B tipo III recombinante foi
realizada com sucesso e comprovada por imunodetecção.
O teste funcional de ligação em coluna de manose foi realizado, de modo que
se confirmou hipótese levantada neste trabalho de que a isoforma sDC-
SIGN1B tipo III perde a capacidade de ligação à manose.
60
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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