UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ … · utilizando a linhagem Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta, sendo analisada por SDS-PAGE e Western Blot. A proteína foi purificada

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

VIDYLEISON NEVES CAMARGOS

Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do DC-SIGN

(sDC-SIGN1A tipo III) em Escherichia coli e sua função no

processo de infecção do Dengue virus 2 em monócitos e

macrófagos

DIVINÓPOLIS-MG MAIO-2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

VIDYLEISON NEVES CAMARGOS

Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do DC-SIGN

(sDC-SIGN1A tipo III) em Escherichia coli e sua função no

processo de infecção do Dengue virus 2 em monócitos e

macrófagos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre

Orientadora: Drª Jaqueline Maria Siqueira Ferreira

Co-orientadora: Drª Luciana Lara dos Santos

DIVINÓPOLIS-MG MAIO-2016

iv

AGRADECIMENTOS

Meus sinceros agradecimentos...

À grande amiga e orientadora Jaqueline, pelo apoio, ensinamentos, paciência e

magnífica orientação desde o primeiro ano da graduação. Deixo aqui o meu mais

sincero muito obrigado!

À Luciana pela oportunidade de desenvolver esse trabalho e também pela excelente

orientação, paciência e conhecimentos compartilhados durante essa jornada.

Ao Prof. Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho por fornecer a linhagem celular usada na

etapa final deste trabalho e, sobretudo, juntamente com o Prof. Dr. Rafael Gonçalves

Teixeira Neto, pelas ótimas contribuições no trabalho e também compreensão e

disponibilidade em aceitarem o convite de fazer parte da banca mesmo com o prazo

apertado.

À Profa. Dra. Débora de Oliveira Lopes pela orientação nos experimentos de

expressão e contribuições essenciais neste projeto. Á todos que também

contribuíram com o trabalho, Prof. Dr. Alexandro Sobreira Galdino, Prof. Dr. Leandro

Augusto de Oliveira Barbosa, Dr. Carlos Eduardo Calzavara e Dra. Andréa Teixeira.

Aos órgãos de fomento CNPq, CAPES, FAPEMIG e, principalmente, a UFSJ por

proporcionar a realização deste trabalho. Aos professores do Programa de Pós

Graduação em Ciências da Saúde pelo ensino e reflexões em suas disciplinas.

Aos amigos Cássio, Rodrigo, Diego, Lailah, Bruno, Bárbara, Rafael e todos os outros

membros do laboratório de Biologia Molecular, pelo auxílio nos experimentos desde

o primeiro dia no laboratório, pelas discussões e amizade dentro e fora do

laboratório.

Aos amigos do laboratório de Microbiologia. Álan, Camyla e Michelli não só pela

grande amizade e companheirismo, mas também pelo auxílio na cultura de células.

Karina, por ser tão prestativa e calma para auxiliar a todos no laboratório. E todos os

outros companheiros que de alguma forma me ajudaram nessa jornada.

Aos pesquisadores, funcionários e colegas que contribuíram direta e indiretamente

para a realização desse trabalho.

À minha família, em especial à Maria José, minha queria mãe, e meu irmão Verlison

pela compreensão, incentivo e apoio constante durante todos esses anos.

Igualmente, à todos meus amigos de longa data, Leonardo, Dênis, Adilson, Paulo e

Vinícius.

A todos, muito obrigado!

v

“Don’t let your dreams be dreams”

(Jack Johnson)

vi

RESUMO

A dengue é um grave problema de saúde pública mundial, que é causada pela

infecção pelo Dengue virus (DENV). O DENV se adere às células hospedeiras por

meio da interação da glicoproteína E viral com o receptor DC-SIGN (Dendritic Cell-

Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin) da célula hospedeira, através do seu

Domínio de Reconhecimento de Carboidratos. Este receptor é codificado pelo gene

CD209, que sofre splicing alternativo gerando diversas isoformas solúveis ou de

membrana. Embora estudos envolvendo o DC-SIGN na infecção do DENV já terem

sido descritos, o papel das isoformas solúveis neste processo ainda não é bem

conhecido. Então, a fim de contribuir para maiores esclarecimentos sobre as funções

do DC-SIGN e do mecanismo de infecção do DENV, o objetivo deste trabalho é

avaliar o papel de uma isoforma solúvel deste receptor no processo de infecção do

DENV. A sequência de cDNA da isoforma sDC-SIGN1A tipo III foi sintetizada e

clonada no vetor de expressão pJ414 pela empresa DNA 2.0 (EUA). A expressão

heteróloga foi realizada a 18 ºC, por 18h após a indução por 0,5 mM de IPTG,

utilizando a linhagem Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta, sendo analisada por SDS-

PAGE e Western Blot. A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade em

coluna de cobalto e analisada novamente por SDS-PAGE e Western Blot. A

isoforma foi produzida com sucesso, obtendo 1,09 mg da proteína recombinante.

DENV-2 foi mutiplicado na linhagem celular C6/36 de Aedes albopictus e

quantificado pelo ensaio de TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) em células

BHK-21, obtendo um título viral de 1,6 x 106 TCID50/mL. Ensaios funcionais in vitro

com a proteína recombinante foram realizados para verificar a sua capacidade de

alteração da infecção do DENV em monócitos da linhagem THP-1 e macrófagos,

obtidos através da estimulação das células THP-1 com acetato miristato de forbol. A

diferenciação foi analisada pelas alterações na aderência e morfologia celular. A

quantificação viral dos ensaios funcionais foi realizada pela titulação por TCID50.

Devido à baixa expressão de DC-SIGN, as células utilizadas nos ensaios funcionais

não são altamente permissíveis ao vírus, por isso a carga viral não foi detectada

pela técnica de TCID50. Portanto, testes com outras linhagens celulares, serão

necessários para melhor avaliação do efeito da isoforma sDC-SIGN1A tipo III no

processo de infecção do DENV.

Palavras chave: DC-SIGN, CD209, Dengue virus, expressão heteróloga, infecção

do DENV.

vii

ABSTRACT

Dengue is a major global public health problem, which is caused by infection with

Dengue virus (DENV). The virus adheres to host cells through interaction of viral

glycoprotein E with DC-SIGN receptor (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-

integrin), by its Carbohydrates Recognition Domain. This receptor is encoded by the

CD209 gene which undergoes alternative splicing generating several different

membrane and soluble protein isoforms. Although studies involving DC-SIGN in

DENV infection have been described, the role of soluble isoforms in this process is

not well known. Thus, in order to contribute to further clarification on DC-SIGN

functions and DENV infection mechanism, the aim of this study is to evaluate the role

of a soluble isoform of this receptor in DENV infection process. The cDNA sequence

of sDC-SIGN1A type III isoform was synthesized and cloned into expression vector

pJ414 by DNA 2.0 company (USA). The heterologous expression was carried out at

18 °C for 18 hours after induction with 0,5 mM IPTG, using Escherichia coli BL21

DE3 Rosetta strain, and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The protein was

purified by affinity chromatography in cobalt column and analyzed again by SDS-

PAGE and Western blot. The protein isoform was successfully produced, yielding

1.09 mg of the recombinant protein. DENV-2 was multiplied in Aedes albopictus

C6/36 cell line and quantified by the TCID50 assay (50% Tissue Culture Infective

Dose) in BHK-21 cells, obtaining a viral titer of 1.6 x 106 TCID50/mL. In vitro functional

assays with the recombinant protein were performed to evaluate its capacity of

changing DENV infection in monocytes of THP-1 cell line and macrophages,

obtained by stimulation of THP-1 cells with phorbol myristate acetate. Differentiation

was assessed by changes in cell adhesion and morphology. The viral quantitation in

functional assays was performed by TCID50 titration. Due to the low DC-SIGN

expression, the cells used in functional assays are not highly permissive to the virus,

hence, the viral load was not detected by the TCID50 technique. Therefore, new tests,

including other cell lines, will be needed to further evaluate any effect of sDC-

SIGN1A type III on DENV infection process.

Keywords: DC-SIGN, CD209, Dengue virus, heterologous expression, DENV

infection

viii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................xii

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1

1.1) Aspectos gerais da Dengue ...................................................................1

1.2) O processo de infecção do Dengue virus e o DC-SIGN ........................4

1.3) O gene CD209 .......................................................................................12

1.4) Domínio de Reconhecimento de Carboidratos ......................................15

1.5) Funções do DC-SIGN no sistema imune ...............................................17

1.6) Produção de proteínas recombinantes ..................................................18

1.7) Justificativa ............................................................................................20

2. OBJETIVOS ........................................................................................................24

2.1) Objetivo geral ........................................................................................24

2.2) Objetivos específicos .............................................................................24

3. METODOLOGIA .................................................................................................25

3.1) Análises in silico ....................................................................................25

3.2) Síntese do gene e vetor de expressão ..................................................26

3.3) Ensaios de Biologia Molecular ...............................................................27

3.3.1) Obtenção de bactérias eletrocompetentes ...............................28

3.3.2) Transformação de bactérias eletrocompetentes ......................29

3.3.3) Extração plasmidial ..................................................................30

3.3.4) Confirmação da clonagem .......................................................30

3.3.5) Expressão da proteína recombinante em pequena escala ......31

ix

3.3.6) Expressão da proteína recombinante em larga escala ............32

3.3.7) Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE ...................33

3.3.8) Western blot .............................................................................34

3.3.9) Purificação da proteína recombinante ......................................35

3.3.10) Dosagem de proteínas ...........................................................35

3.4) Cultura de células ..................................................................................36

3.4.1) Células e vírus .........................................................................36

3.4.2) Produção e purificação parcial de DENV-2 ..............................37

3.4.3) Titulação de DENV-2 ...............................................................37

3.4.4) Diferenciação da linhagem THP-1 em macrófagos ..................38

3.4.5) Ensaios funcionais ...................................................................38

3.4.6) Quantificação de RNA viral ......................................................39

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................42

4.1) Caracterização da sDC-SIGN1A tipo III através de análise in silico ......42

4.2) Expressão e purificação da sDC-SIGN1A tipo III ..................................45

4.3) Multiplicação e quantificação de DENV-2 ..............................................55

4.4) Ensaios funcionais .................................................................................59

5. CONCLUSÕES ...................................................................................................66

6. PERSPECTIVAS .................................................................................................66

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................67

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mapa mundial de distribuição de Dengue ................................................1

Figura 2: Nova classificação clínica da dengue de acordo com a Organização

Mundial da Saúde ...................................................................................................3

Figura 3: Estrutura genômica do Dengue virus .......................................................5

Figura 4: Ciclo de multiplicação do Dengue virus ....................................................8

Figura 5: Representação esquemática do gene CD209 ..........................................13

Figura 6: Estrutura do DC-SIGN ..............................................................................14

Figura 7: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos e sua interação com o

Dengue virus ...........................................................................................................16

Figura 8: Mapa do plasmídeo pJ414 .......................................................................27

Figura 9: Mapa do plasmídeo pRARE .....................................................................28

Figura 10: Sequência gênica e proteica da isoforma sDC-SIGN1A tipo III ..............42

Figura 11: Predições de glicosilações e peptídeo sinal ...........................................44

Figura 12: Alinhamento da sequência proveniente do sequenciamento do produto de

miniprep ..................................................................................................................46

Figura 13: Análise da expressão da sDC-SIGN1A tipo III recombinante ................48

Figura 14: Análise da solubilidade da proteína recombinante expressa a 18 ºC por

18 h .........................................................................................................................51

Figura 15: Expressão em larga escala da sDC-SIGN1A tipo III recombinante ........52

Figura 16: Purificação da proteína sDC-SIGN1A tipo III recombinante ...................54

Figura 17: Multiplicação de DENV-2 em células C6/36 de Aedes albopictus ..........55

Figura 18: Titulação de DENV-2 por TCID50 em células BHK-21 ............................56

Figura 19: Análise de produtos de PCR por PAGE .................................................57

xi

Figura 20: Análise de qPCR para quantificação de RNA viral .................................58

Figura 21: Diferenciação de macrófagos a partir da linhagem monocítica THP-1 ...60

Figura 22: Avaliação da carga viral pelo ensaio de TCID50 .....................................62

xii

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

ADE: aumento da infecção dependente de anticorpos

Ala: aminoácido alanina

AgNO3: nitrato de prata

Asn: aminoácido asparagina

Asp: aminoácido ácido aspártico

BHK-21: fibroblastos de Rim de Hamster Bebê

BOD: estufa de Demanda Bioquímica de Oxigênio

B(OH)3: ácido bórico

BSA: albumina bovina sérica

C: proteína do capsídeo do Dengue virus

CD: cluster de diferenciação

CD209: gene que codifica o receptor DC-SIGN

cDNA: DNA complementar

CHO: Células de Ovário de Hamster Chinês

CMV: citomegalovírus

CO2: dióxido de carbono

CO(NH2)2: amônia

Cq: cicle quantification

Cys: aminoácido císteína

DCs: células dendríticas

DC-SIGN: Receptor Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-

Grabbing Non-integrin

DENV: Dengue virus

DF: febre do dengue

DHF: febre hemorrágica do dengue

DMEM: meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco

DRC: domínio de reconhecimento de carboidratos

DSS: síndrome do choque do dengue

DTT: (2S,3S)-1,4-Bis-sulfanilbutano-2,3-diol

E: glicoproteína do envelope do Dengue virus

ECP: efeito citopático

EDTA: ácido etilenodiamina tetracético

xiii

Fc: fragmento cristalizável

FcRII: receptor de IgE de baixa afinidade

FcR: receptores Fc gama

gp120: glicoproteína gp120 do HIV

Glu: aminoácido ácido glutâmico

GRAVY: grande média de hidropaticidade

HCl: ácido clorídrico

HEPES: [N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-ácido etanosulfônico]

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

ICAM-3: Moléculas de Adesão Intercelular-3

iDCs: células dendríticas imaturas

IFN-: interferon beta

IL: interleucina

IMAC: cromatografia de afinidade por íons metálicos

IPTG: isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo

KH2PO4: fosfato monopotássico

KCl: cloreto de potássio

L-15: meio Leibovitz L-15

mDC: células dendríticas maduras

M (proteína): proteína de membrana do Dengue virus

M (unidade): molar

mDC-SIGN: isoforma de membrana do DC-SIGN

MgCl2: cloreto de magnésio

MOI: multiplicidade de infecção

NaCl: cloreto de sódio

Na2HPO4: fosfato dissódico

NaH2PO4: fosfato monossódico

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NF-B: fator nuclear de transcrição kappa B

(NH4)SO4: sulfato de amônio

NS: proteína não estrutural do Dengue virus

OD: densidade óptica

PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida

xiv

PAMPs: Padrões Moleculares Associados a Patógenos

PBMC: células mononucleares de sangue periférico

PBS: tampão fosfato-salino

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase

PMA: acetato miristato de forbol

prM: proteína precursora de membrana do Dengue virus

PRR: Receptores de Reconhecimento de Padrões

qPCR: Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

RPMI: Meio Roswell Park Memorial Institute 1640

RT-PCR: Transcrição Reversa por Reação em Cadeia da Polimerase

sDC-SIGN: isoforma solúvel do DC-SIGN

SDS: dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS

SFB: soro fetal bovino

TCID50: 50% Tissue Culture Infective Dose

TLR: receptores do tipo Toll

THP-1: linhagem monocítica humana THP-1

TNF-: fator de necrose tumoral alfa

Tris: 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol

1

1. INTRODUÇÃO

1.1) Aspectos gerais da Dengue

A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem atualmente,

causada pela infecção por um dos quatro tipos do Dengue virus (DENV 1-4) que são

transmitidos por vetores artrópodes do gênero Aedes. A doença é considerada um 5

grave problema de saúde pública mundial, gerando um grande impacto econômico

para os países localizados em regiões endêmicas (GUZMAN e HARRIS, 2015).

Cerca de 390 milhões de infecções pelo DENV ocorrem todos os anos, sendo

aproximadamente 96 milhões de casos com sintomas aparentes da doença (BHATT

et al., 2013). Aproximadamente 3,97 bilhões de pessoas vivem atualmente em áreas 10

de risco de transmissão do vírus, compreendidas em 128 países (Figura 1; BRADY

et al., 2012). Desta forma, há um alto custo relacionado à dengue no mundo,

estimado em cerca de US$2,1 bilhões anuais nas Américas e quase US$1 bilhão na

Ásia, desconsiderando, ainda, os gastos com o controle do vetor, o que subestima o

custo total associado à doença (SHEPARD et al., 2011; SHEPARD et al., 2013). 15

Figura 1: Mapa mundial de distribuição de Dengue. Regiões em vermelho apresentam maior prevalência de dengue. A presença da doença é menor nas regiões com tons mais fracos de vermelho. Fonte: Guzman e Harris (2015). 20

Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde, até a semana

epidemiológica 52 de 2015, foram registrados 2.326.829 casos suspeitos de dengue

nas Américas no ano, ocorrendo 1.181 mortes. Os quatro tipos do vírus foram

2

encontrados em diversos países do continente (PAHO, 2016). No Brasil, foram

registrados 1.649.008 casos suspeitos de dengue em 2015, dos quais foram

confirmados 1.569 casos de dengue grave e 20.329 casos de dengue com sinais de

alarme, além de 863 fatalidades. Houve um grande aumento destes números

quando comparados com o mesmo período de 2014, quando foram notificados 5

589.107 casos de dengue, sendo confirmados 764 casos de dengue grave, 8.436

casos de dengue com sinais de alarme e 473 óbitos. Os quatro tipos do vírus

circulam no país, sendo os tipos 1 e 4 mais prevalentes, com 93,8% e 5,1%,

respectivamente. Além disso, de todos os casos registrados, 62,2% destes foram

somente na região Sudeste do país. Em Minas Gerais, 189.378 casos foram 10

notificados, o segundo maior número entre todos os estados brasileiros (SAÚDE,

2015). Em Divinópolis, município localizado no centro-oeste de Minas Gerais, foram

notificados 4.686 casos de dengue em 2014, sendo 4.143 casos confirmados e 6

óbitos. Em 2015 houve uma redução no número de casos no município, uma vez

que foram notificados 2.270 casos, com 1.774 casos confirmados e um caso fatal. 15

Porém, o número de casos aumentou em 2016. Até o início de maio, 3.732 casos

foram notificados, dos quais 1.226 foram confirmados, e ocorreram três mortes

(SEMUSA, 2016).

A infecção pelo DENV causa quadros clínicos que variam desde formas

assintomáticas até formas graves. Durante muitos anos, a doença foi categorizada de 20

acordo com as manifestações clínicas em: febre indiferenciada, febre do dengue (DF)

e febre hemorrágica do dengue (DHF). DHF ainda era classificada em 4 graus de

gravidade, sendo os dois últimos definidos como síndrome do choque do dengue

(DSS). No entanto, a dificuldade de classificação de alguns casos na prática clínica

levou a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2009, a propor uma nova 25

classificação. Atualmente, baseada em parâmetros clínicos e laboratoriais, a doença

é classificada em três grupos mais bem definidos: dengue sem sinais de alarme,

dengue com sinais de alarme e dengue grave. Os critérios adotados para o

diagnóstico da dengue de acordo com essa classificação estão resumidos na Figura

2. 30

3

Figura 2: Nova classificação clínica da dengue de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Manifestações clínicas de pacientes com dengue (com ou sem sinais de alarme) e dengue grave. Pacientes de ambos os subgrupos de dengue podem desenvolver dengue grave. Fonte: adaptado de WHO (2009). 5

Indivíduos que viajaram ou vivem em áreas endêmicas de dengue que

apresentam dois ou mais sinais ou sintomas da doença, incluindo sinais de alarme,

são considerados casos suspeitos de dengue. Ambos os pacientes, com e sem sinais

de alarme, podem evoluir para dengue grave (WHO, 2009). 10

De acordo com Simmons e colaboradores (2012), os sintomas da dengue

aparecem abruptamente após o período de incubação e seguem três fases: febre

inicial, fase crítica e fase de recuperação. Na primeira fase, são observados os sinais

e sintomas clássicos da doença, como febre alta, comumente acima de 38,5 ºC,

cefaleia, mialgia, dor nas articulações, manifestações hemorrágicas brandas, entre 15

outros. Esta fase perdura por aproximadamente 2 a 7 dias. A fase crítica se inicia

entre os dias 3 e 7 da doença, quando ocorre o aumento da permeabilidade vascular.

Manifestações hemorrágicas são mais comuns nessa fase. Uma pequena proporção

dos pacientes ainda pode desenvolver uma síndrome de liberação plasmática

sistêmica, evidenciada pelo aumento da hemoconcentração, hipoproteinemia, 20

derrame pleural e ascite. Por último, pode ocorrer a reversão do quadro de alteração

da permeabilidade vascular do paciente em torno de 48 a 72 horas, com a melhora

4

dos sintomas rapidamente, apesar de que adultos podem ter fadiga excessiva por

várias semanas após a recuperação.

Epidemias de dengue já foram registradas desde o século XVIII, apesar de a

doença não ser considerada um problema de saúde pública, exceto quando

ocorriam epidemias esporádicas, pois naquela época circulavam apenas um ou dois 5

tipos virais na maioria das regiões tropicais. Após a Segunda Guerra Mundial,

especialmente nas últimas décadas, a dengue vem acometendo populações em

várias regiões do mundo. Com a expansão geográfica dos vírus e mosquitos

vetores, a frequência e magnitude das epidemias de dengue também aumentaram.

Isso pode ser devido a vários fatores, como decadência da infraestrutura de saúde 10

pública, mudanças no estilo de vida, alterações evolutivas dos vírus, entre outros.

Entretanto, três fatores são considerados principais: ineficácia do controle vetorial,

urbanização não planejada e a globalização. Desta forma, o DENV encontrou um

ambiente propício para a sua sobrevivência. Grandes centros urbanos que não

apresentam controle vetorial eficiente e com aeroportos modernos, que transportam 15

milhões de pessoas, muitas delas infectadas, transportam também o vírus, para

diversas regiões do mundo (GUBLER, 2011).

Assim, o controle da dengue requer uma série de medidas que precisam ser

adotadas ou reforçadas, como a vigilância epidemiológica e controle vetorial, nas

quais necessitam de um esforço político para serem efetivadas, além de 20

contribuições no âmbito científico (GUBLER, 2011). No entanto, ainda é necessário

aperfeiçoar o conhecimento relacionado às interações vírus-hospedeiro e vírus-

vetor, a fim de contribuir com o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico,

abordagens terapêuticas, marcadores de prognóstico, novos inseticidas e vacinas.

Nesse contexto, também é necessário compreender os mecanismos de patogênese 25

da doença, que ainda não são completamente elucidados. Por exemplo, alguns

pacientes se curam da infecção rapidamente e sem complicações, enquanto outros

desenvolvem quadros hemorrágicos graves e potencialmente fatais (ST. JOHN et

al., 2013).

30

1.2) O processo de infecção do Dengue virus e o DC-SIGN

O DENV é membro da família Flaviviridae, na qual estão inseridos vários

outros vírus de relevância médica humana, como o Zika virus, vírus da Febre

5

Amarela, vírus do Oeste do Nilo, vírus da Encefalite Japonesa e vírus da Encefalite

Transmitida por Carrapatos, entre outros (ST. JOHN et al., 2013). O DENV é

constituído de RNA fita simples e polaridade positiva, com um genoma de 10,7 kb

contendo regiões 3’ e 5’ não traduzidas que flanqueiam a sequência de uma única

poliproteína, que, após o processamento por proteases virais e do hospedeiro, gera 5

3 proteínas estruturais [capsídeo (C), precursora de membrana (prM)/membrana (M)

e envelope (E)] e 7 não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5;

Figura 3; GUZMAN et al., 2010). A partícula viral madura é esférica, com diâmetro

aproximado de 50 nm, contendo múltiplas cópias das proteínas E, C e M, gerada

após processamento da prM (WHO, 2009). Já as proteínas NS são expressas na 10

célula hospedeira infectada e estão envolvidas, principalmente, na replicação do

genoma viral, processo que ocorre intimamente às membranas celulares (WELSCH

et al., 2009).

Figura 3: Estrutura genômica do Dengue virus. O genoma é constituído de RNA 15 de polaridade positiva e possui uma única janela aberta de leitura, flanqueada por regiões 3’ e 5’ não traduzidas, que codifica uma poliproteína, na qual gera 3 proteínas estruturais (C, prM/M e E) e 7 proteínas não-estruturais após o seu processamento por proteases celulares e virais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Fonte: Guzman et al. (2010). 20

Na fase inicial da dengue, fêmeas do vetor infectadas liberam as partículas

virais durante o repasto sanguíneo, que infectam inicialmente células dendríticas

(DCs) e macrófagos presentes na pele, além de monócitos recém-recrutados para a

derme (SCHMID e HARRIS, 2014). 25

Monócitos, macrófagos e DCs são células que compõem o sistema

mononuclear fagocitário. Estas desempenham um papel importante na manutenção

da integridade dos tecidos, seja no seu desenvolvimento ou na recuperação após

uma lesão, e também nas respostas imune inata e adaptativa (YONA et al., 2013).

Monócitos são células originadas da medula óssea que circulam na corrente 30

sanguínea e podem migrar para tecidos periféricos durante a homeostase e

6

inflamação. Após o seu recrutamento, os monócitos podem se diferenciar em

macrófagos ou DCs (SHI e PAMER, 2011). Os monócitos são o alvo primário de

infecção e replicação ativa do DENV in vivo entre células mononucleares de sangue

periférico (PBMC), tanto em infecções primárias, como secundárias (DURBIN et al.,

2008; KOU et al., 2008). 5

Os macrófagos são células fagocitárias residentes em tecidos linfoides e não

linfoides envolvidas na homeostase desses tecidos, realizando a remoção de células

apoptóticas e produzindo fatores de crescimento (GEISSMANN et al., 2010). Os

macrófagos também possuem um papel importante no processo de infecção da

dengue, uma vez que são alvos do DENV e também são a principal fonte de 10

produção de citocinas inflamatórias (WU et al., 2013). Estudos indicaram a infecção

pelo DENV em macrófagos do baço e linfonodos, humanos e murinos, entre outras

células de diferentes órgãos e tecidos humanos (BLACKLEY et al., 2007; KYLE et

al., 2007; BALSITIS et al., 2009).

As DCs fazem parte do sistema imune inato e estão presentes em sítios de 15

invasão de patógenos, como pele e mucosas. Quando não ativadas, elas

apresentam alta atividade fagocítica, englobam antígenos e reconhecem patógenos

através de Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRR – pattern-recognition

receptors). Uma vez ativadas após o reconhecimento de patógenos, as DCs

produzem citocinas, migram para os linfonodos e apresentam os antígenos para as 20

células T (SCHMID et al., 2014; MERAD et al., 2013). Entre as DCs presentes na

pele, as células de Langerhans são um tipo de células dendríticas imaturas (iDCs)

consideradas o alvo inicial do DENV (WU et al., 2000). Essas células possuem

grande capacidade de infecção pelo vírus, devido à sua alta expressão do receptor

DC-SIGN (Dendritic Cell-specific ICAM-3 Grabbing Non integrin), o que sugere que 25

esse receptor seja um fator crítico no início da infecção do DENV (NAVARRO-

SANCHEZ et al., 2003; TASSANEETRITHEP et al., 2003).

A interação do vírus com a célula hospedeira ocorre, principalmente, por meio

da ligação da glicoproteína E do vírus ao DC-SIGN (NAVARRO-SANCHEZ et al.,

2003). Outro receptor envolvido na infecção do DENV é o Receptor de Manose 30

(MR), que, assim como o DC-SIGN, se liga à glicoproteína E viral (MILLER et al.,

2008). A importância desses receptores foi demonstrada por Alen e colaboradores

(2011), onde o bloqueio do DC-SIGN por anticorpos monoclonais em iDCs

7

promoveu a inibição da infecção do DENV em 80%, enquanto o bloqueio de ambos

os receptores, DC-SIGN e MR, reduziu a infecção em mais de 90%. Isso também

sugere a existência de outros receptores envolvidos. Segundo Hidari e Suzuki

(2011), diversos receptores presentes em células de mamíferos já foram propostos,

como GRP78 (78 kDa glucose-regulated protein), HSP70/HSP90 (heat shock 5

protein), proteínas associadas a CD14, entre outros.

Após essa interação inicial, o vírus move na superfície celular até entrar na

célula hospedeira por endocitose clatrina-dependente, mediada por receptor (VAN

DER SCHAAR et al., 2008 – Figura 4). Apesar do DC-SIGN ser responsável pela

ligação do vírus à superfície celular, a endocitose da partícula viral não é 10

essencialmente dependente desse receptor (LOZACH et al., 2005). Após a

endocitose, ocorre a acidificação do endossomo, que induz uma alteração

conformacional drástica na glicoproteína E, que promove a fusão entre as

membranas viral e endossomal, liberando o nucleocapsídeo do vírus no citoplasma

celular (MODIS et al., 2004). No citoplasma, ocorre a tradução de proteínas virais e 15

replicação do genoma viral em estruturas vesiculares associadas ao retículo

endoplasmático (WELSCH et al., 2009). Por fim, ocorre a associação do RNA viral

às proteínas do capsídeo e o brotamento para dentro do retículo endoplasmático.

Neste processo, o nucleocapsídeo adquire a membrana lipídica com as proteínas

prM/M e E e as partículas virais passam pelo processo de maturação para serem 20

liberados da célula por via secretória do hospedeiro (GUZMAN e HARRIS, 2015).

8

Figura 4: Ciclo de multiplicação do Dengue virus. Esquema demostrando as principais etapas do ciclo de multiplicação do DENV: uma partícula viral (passo 1) é adsorvida à superfície da célula hospedeira por meio de um receptor celular (passo 2) e o vírus penetra na célula por endocitose mediada por receptor (passo 3). 5 Posteriormente, após a acidificação do endossomo, ocorre a liberação do RNA viral no citoplasma celular (passo 4). O RNA viral é traduzido, produzindo uma única poliproteína (passo 5), que após o processamento por proteases celulares e virais, forma o complexo de replicação (passo 6). Com a replicação e tradução do RNA viral, novas partículas virais (passos 7 e 8) são formadas, que após maturação no 10 complexo de Golgi (passo 9), são liberadas no meio extracelular por exocitose. Adaptado de Screaton et al. (2015).

As partículas virais produzidas durante a infecção de uma célula hospedeira

podem conter níveis variados da proteína prM, a qual é normalmente convertida na 15

proteína M durante a maturação dos vírions. Esse processo é muito importante para

o vírus, uma vez que partículas completamente imaturas são consideradas não-

infecciosas, possivelmente devido à interação vírus-receptor e o evento de fusão de

membranas serem afetados (ZYBERT et al., 2008; RICHTER et al., 2014). Apesar

disso, a presença de anticorpos contra a proteína prM, durante uma infecção 20

secundária, por exemplo, pode facilitar a ligação e penetração de partículas virais

9

imaturas em células expressando Receptores Fc (FcR), restaurando a capacidade

infecciosa desses vírus (RODENHUIS-ZYBERT et al., 2010). A expressão de DC-

SIGN também pode contribuir para a infecção de partículas virais imaturas. Richter e

colaboradores (2014) mostraram que partículas do DENV imaturas foram capazes

de infectar iDC e células Raji, uma linhagem de células B, transfectadas 5

eficientemente com DC-SIGN, enquanto não foi possível em iDC com DC-SIGN

bloqueado por anticorpos, nem em células Raji não-transfectadas com DC-SIGN.

Existem diversos fatores que podem estar relacionados à fisiopatologia da

dengue, como a infecção e ativação de células da resposta imune inata, ativação do

sistema do complemento, células T e B, produção de anticorpos autoimunes e 10

presença de anticorpos não neutralizantes derivados de uma infecção primária

(GUZMAN e HARRIS, 2015). Este último fator é considerado um dos principais

responsáveis pela maior gravidade da doença, embora não seja unanimidade na

literatura (LIBRATY et al., 2009).

Após a infecção primária por um sorotipo do DENV, o indivíduo desenvolve 15

imunidade protetora permanente contra o sorotipo infectante e proteção cruzada

temporária contra sorotipos heterólogos (GUZMAN e HARRIS, 2015). Em

concentrações subneutralizantes, os anticorpos heterólogos podem desempenhar o

papel inverso, contribuindo para o aumento da infecção, um efeito denominado

“aumento da infecção dependente de anticorpos” (ADE, antibody-dependent 20

enhancement). Neste caso, esses anticorpos, adquiridos ativamente (por infecção

primária) ou passivamente (crianças nascidas de mães imunes à dengue), podem

formar complexos com o vírus, facilitando a infecção de células expressando FcR,

via interação com a porção Fc dos anticorpos. Com esta interação, há um aumento

nas células infectadas que leva a uma carga viral maior do que ocorre em indivíduos 25

infectados na ausência de tais anticorpos (GUZMAN et al., 2013). Desta forma, a

expressão de FcR modula a infecção nas células durante ADE, ocorrendo maior

infecção nessas células na presença de anticorpos não neutralizantes do que na

ausência destes, como, por exemplo, acontece em células dendríticas maduras

(mDC), macrófagos e monócitos (SCHMID et al., 2014). 30

Além disso, durante a infecção com ADE, o DENV é capaz de alterar diversos

componentes do sistema imune, inibindo vias de sinalização, como de receptores do

tipo Toll (TLR – Toll-like receptors) e fator nuclear de transcrição kappa B (NF-B –

10

Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), suprimindo a

resposta antiviral mediada por interferon. O vírus também pode estimular a

expressão de citocinas imunossupressoras, como interleucina (IL) -10, que leva à

redução da produção de IFN e óxido nítrico (MODHIRAM et al., 2010, UBOL et al.,

2010). De uma forma geral, vários componentes do sistema imune são alterados, a 5

fim de facilitar a multiplicação do vírus, gerando uma alta carga viral no hospedeiro.

Boonnak e colaboradores (2008) detectaram uma alta produção das citocinas

pró-inflamatórias IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-) em mDC cultivadas

com uma concentração ótima de soro que causa ADE nessas células. Inclusive, a

produção elevada destas citocinas não foi detectada quando o receptor FcRIIa foi 10

bloqueado por anticorpos, nem quando a mesma linhagem celular foi cultivada na

ausência do soro, mesmo quando uma alta carga viral (e. g.: multiplicidade de

infecção [MOI] de 1 versus 5) foi utilizada para infectá-las. De fato, não apenas a alta

carga viral está associada com dengue grave, mas também uma alta produção de

citocinas pelo sistema imune do paciente, como TNF- (GAGNON et al., 2002). Uma 15

vez que as características hemorrágicas graves da dengue iniciam coincidentemente

com a diminuição da carga viral, juntamente com o aumento da produção de

citocinas, majoritariamente derivadas de células T, é possível que a dengue grave

seja uma síndrome mediada pelo sistema imune do paciente (MATHEW e

ROTHMAN, 2008; DUANGCHINDAA et al., 2010). 20

Apesar do fenômeno de ADE possibilitar que várias células diferentes sejam

infectadas pelo DENV, nem todas as células normalmente permissíveis ao vírus

possuem essa capacidade de aumento da infecção. Ao contrário das mDC, as iDC

não possuem capacidade de ADE, apesar de sua expressão de FcRs. Isso

provavelmente é devido ao nível de expressão do DC-SIGN. Apesar de ambas as 25

células expressarem níveis similares de FcRIIa, o nível de expressão de DC-SIGN

é menor nas mDC. Inclusive, é considerado que o ADE seja correlacionado

inversamente com a expressão de DC-SIGN (KOU et al., 2008; BOONNAK et al.,

2008).

Em uma infecção secundária, outra teoria complementar à ADE que pode 30

contribuir com maior gravidade da dengue é o “pecado do antígeno original” (original

antigenic sin). Neste fenômeno, células T e B de memória geradas após uma

11

infecção primária (“antígeno original”) são estimuladas pelo sorotipo viral heterólogo,

expandindo e produzindo uma resposta mais rápida que as novas células

específicas contra este vírus (ROTHMAN, 2011; SCREATON et al., 2015). Uma vez

que essas células apresentam baixa avidez contra o novo sorotipo infectante, é

gerada uma resposta imune celular e humoral inadequada, ocorrendo um aumento 5

na produção de citocinas inflamatórias e também atraso na resolução da infecção

viral (ROTHMAN, 2011; GUZMAN e HARRIS, 2015).

Durante o processo de ativação de células T, as moléculas de adesão

intercelular-3 (ICAM-3) desempenham um papel importante na adesão entre estas

células e DC. Geijtenbeek e colaboradores (2000b) estudaram receptores de adesão 10

celular envolvidos neste processo de ativação de células T e identificaram o DC-

SIGN. Esse receptor mediava à adesão entre DC e ICAM-3 expressas por células T

em repouso através de um mecanismo integrina-independente que requer cálcio

(Ca2+), no qual é característico de lectinas do tipo C. Os autores estenderam seus

achados, mostrando que o DC-SIGN se ligava com a glicoproteína gp120 do 15

envelope do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Apesar do receptor não

promover a penetração do vírus em DC, ele promovia infecção in trans de células

que expressavam CD4 e receptores de quimiocinas. Desta forma, o vírus poderia se

ligar às DC nas mucosas através do DC-SIGN, ser transportado para órgãos

linfoides secundários e, então, infectar células T CD4+ por um mecanismo in trans 20

(GEIJTENBEEK et al., 2000a).

Posteriormente às publicações de Geijtenbeek e colaboradores, Mummidi e

colaboradores (2001) descreveram um extenso repertório de transcritos do gene que

codifica para a proteína DC-SIGN (CD209). Além disso, eles também identificaram

outro gene com grande homologia com o DC-SIGN, designado como DC-SIGN2 25

(CD209L), que também foi descrito por Soilleaux e colaboradores (2000),

coincidentemente no mesmo ano e nomeado como DC-SIGNR (DC-SIGN related

gene). Esse alto número de transcritos eram gerados pelo splicing alternativo do pré-

mRNAdo gene CD209.

O splicing alternativo é um mecanismo de controle da expressão gênica, que 30

desempenha um papel fundamental de regulação entre os processos de transcrição

e tradução (KORNBLIHTT, 2013). Neste processo, enquanto o pré-RNA é

sintetizado no núcleo, os íntrons (sequências não codificantes) são reconhecidos e

12

removidos da molécula de RNA de formas alternativas, possibilitando que alguns

éxons também sejam retirados, ou que sejam realizados cortes em sítios de splicing

5’ ou 3’ alternativos. Desta forma, após conectados e transportados para o citosol,

os transcritos alternativos podem gerar uma gama de proteínas DC-SIGN diferentes

(KELEMEN et al., 2013). 5

Considerando que cerca de 95% dos genes humanos multiéxons sofrem

splicing alternativo e que ocorrem, em média, sete eventos de splicing alternativo por

gene humano multiéxon, é de se esperar que haja uma ampla gama de proteínas

que podem ser expressas pelas diferentes células em um organismo humano (PAN

et al., 2008). Deste modo, aumentando a diversidade de mRNA expresso pelas 10

células, isoformas diferentes de uma determinada proteína podem ser geradas. Essa

nova proteína pode não ter uma função específica, ou a evolução pode selecioná-la

para desempenhar uma função bem definida ou até mesmo apresentar alguma

funcionalidade somente quando ela for expressa juntamente com outra isoforma em

um evento de splicing coordenado (KELEMEN et al., 2013). 15

1.3) O gene CD209

O gene CD209 (Figura 5) está localizado no braço curto do cromossomo 19,

região 1, banda 3, sub-banda 3 (19p13.3), próximo aos genes CD209L e CD23

(receptor de IgE de baixa afinidade - FcRII) e todos estão sujeitos a eventos de 20

splicing alternativo. O gene CD209 possui seis éxons (I-VI) e cinco íntrons, sendo

que os eventos de splicing alternativo podem gerar, pelo menos, 14 transcritos

diferentes, codificando proteínas associadas à membrana ou solúveis (MUMMIDI et

al., 2001). Apesar de Geijtenbeek e colaboradores (2000b) terem detectado a

expressão de DC-SIGN somente em DC, segundo Mummidi e colaboradores (2001), 25

a sua expressão é mais ampla, incluindo placenta, PBMCs e monócitos da linhagem

THP-1.

13

Figura 5: Representação esquemática do gene CD209. O gene CD209 apresenta seis éxons (algarismos romanos na porção inferior) e cinco íntrons (algarismos romanos na porção superior). Os números relacionados ao éxon III mostram o número de repetições em sequência deste éxon. +1 e +101 indicam os potenciais 5 sítios de início da tradução. Asterisco (*) no éxon VI indica o códon de término da tradução dos transcritos DC-SIGN1A, m- e sDC-SIGN1B. Asterisco no éxon Ib indica o códon de término da tradução dos transcritos tDC-SIGN1B. Adaptado de Mummidi et al. (2001).

10

Considerando que (i) o gene CD209 apresenta dois sítios de início da

tradução, localizados nas porções “a” e “b” do éxon I, (ii) que a porção “b” do éxon

pode ser removida durante o splicing alternativo e (iii) que o éxon II codifica o

domínio transmembrana do DC-SIGN e também pode ser eliminado durante o

splicing alternativo, gerando uma isoforma solúvel, Mummidi e colaboradores (2000) 15

classificou as isoformas do DC-SIGN em 5 grupos distintos: mDC-SIGN1A, sDC-

SIGN1A, mDC-SIGN1B, sDC-SIGN1B e tDC-SIGN1B. Os transcritos que mantinham

tanto o códon de iniciação da tradução do éxon Ia, como o éxon II, foram

classificados como mDC-SIGN1A, enquanto aqueles que iniciavam a tradução no

éxon Ia, mas perdiam o éxon II, como sDC-SIGN1A. Já aqueles que mantinham a 20

porção “b” do éxon I e também o éxon II foram agrupados como mDC-SIGN1B,

enquanto os que continham o éxon Ib, porém perdiam o éxon II, foram classificados

como sDC-SIGN1B. Finalmente, o uso do sítio de início da tradução localizado no

éxon Ia pelos transcritos DC-SIGN1B geram uma isoforma truncada de 41

aminoácidos, classificada como tDC-SIGN1B. Logo, as isoformas dos grupos m- e 25

sDC-SIGN1B iniciam a tradução no sítio localizado no éxon Ib. De forma geral, os

transcritos foram agrupados observando se mantinham o éxon II (mDC-SIGN) ou

não (sDC-SIGN) e também se continham o éxon Ib (DC-SIGN1B) ou não (DC-

SIGN1A).

O DC-SIGN apresenta basicamente quatro componentes: domínio 30

citoplasmático na região N-terminal, domínio transmembrana, região de pescoço e

Domínio de Reconhecimento de Carboidratos (DRC) na região C-terminal (Figura 6).

Cada um destes componentes é codificado por um éxon diferente, exceto o DRC,

14

que é codificado pelos últimos três éxons, IV, V e VI (GEIJTENBEEK, 2000b;

MUMMIDI et al., 2001).

Figura 6: Estrutura do DC-SIGN. O DC-SIGN possui quatro componentes 5 principais: o domínio citoplasmático, codificado pelo éxon I, o domínio transmembrana, codificado pelo éxon II, a região de repetições (ou região de pescoço), codificado pelo éxon III, e o DRC, codificado pelos éxons IV, V e VI. Adaptado de Wu e KewalRamani (2006).

10

O éxon I codifica para a maioria da cauda citoplasmática do DC-SIGN. Como

mencionado anteriormente, ele apresenta três porções distintas, Ia, Ib e Ic, sendo

que algumas isoformas podem manter ou perder o éxon Ib. Além do códon ATG na

porção exônica Ia (+1), há uma forte sequência de Kozak flanqueando a posição

+101 para o início da tradução na porção Ib (GCCATGG; MUMMIDI et al., 2001). 15

Alguns estudos mostram uma importância do domínio citoplasmático no processo de

internalização de algumas moléculas ou vírus, onde células expressando um DC-

SIGN mutante que não contém o domínio citoplasmático apresentaram uma

internalização significativamente reduzida de partículas semelhantes a vírus ou até

mesmo impediram a internalização de vírions HIV-1 (SMITH et al., 2007; MANZO et 20

al., 2012).

O éxon II do gene CD209 codifica para todo o domínio transmembrana, além

de 5 aminoácidos do domínio citoplasmático, e a sua eliminação do mRNA durante o

splicing alternativo gera isoformas solúveis do DC-SIGN. Uma possibilidade a ser

considerada é de que estas isoformas poderiam ser secretadas no meio extracelular 25

e inibir competitivamente a interação entre o DC-SIGN e seu ligante (como ICAM-3

15

ou HIV) in vivo ou regulando a expressão das isoformas de membrana do DC-SIGN

(MUMMIDI et al., 2001).

O éxon III codifica para uma região de pescoço extracelular do DC-SIGN,

constituída por 7 repetições e meia em sequência de 23 aminoácidos (MUMMIDI et

al., 2001; POKIDYSHEVA et al., 2006). Na superfície celular, o DC-SIGN apresenta-5

se em um estado oligomérico, formando um tetrâmero, enquanto somente o DRC se

apresenta como um monômero (MITCHELL et al., 2001). Uma vez que a

oligomerização contribui com a afinidade pelo seu ligante, essa região possui grande

importância para a funcionalidade da proteína, uma vez que ela é responsável pela

tetramerização do DC-SIGN (SNYDER et al., 2005; FEINBERG et al., 2005). A partir 10

do uso de técnicas bioquímicas e biofísicas mais avançadas, pesquisadores

puderam explorar ainda mais o nível de organização do DC-SIGN na superfície

celular, que vai além da tetramerização, demonstrando que o DC-SIGN não apenas

formam microdomínios, como também nanodomínios na superfície celular. A

formação e a estabilidade destes domínios são dependentes da região de pescoço e 15

do DRC, sendo que essa clusterização contribui para maior interação com o ligante

do DC-SIGN, provavelmente permitindo a ligação de patógenos de diferentes

tamanhos (LIU et al., 2012; MANZO et al., 2012).

Por fim, o DRC, que forma o ectodomínio do DC-SIGN juntamente com a

região de pescoço, é codificado pelos éxons IV, V e VI. Esta é a porção mais externa 20

da molécula, sendo responsável, de fato, pela interação com o seu ligante

(MUMMIDI et al., 2001). Desta forma, o DC-SIGN se liga a diversos patógenos,

como bactérias, fungos, helmintos e vírus, por meio de estruturas contendo manose

ou fucose na presença de Ca2+ (GEIJTENBEEK et al., 2009).

25

1.4) Domínio de Reconhecimento de Carboidratos

Análises cristalográficas do DC-SIGN complexado com ligantes carboidratos

mostram que o DRC apresenta uma estrutura mista / com duas folhas

antiparalelas principais, sendo que, afastado das terminações amino e carboxila,

vários loops se agrupam para formar o sítio de ligação do DRC (Figura 7A; 30

POKIDYSHEVA et al., 2006). O DRC está compreendido no domínio extracelular

entre os resíduos Cys253 e Ala404, e apresenta três sítios de ligação a íons Ca2+,

16

sendo que a interação com o ligante é dependente de pelo menos dois íons Ca2+, o

qual não pode ser substituído por outro cátion bivalente (GEIJTENBEEK et al.,

2000b).

Entre os três sítios de ligação ao Ca2+ (sítios 1-3), o sítio 2 é considerado o

sítio primário, onde quatro resíduos de aminoácidos, Glu347, Asn349, Glu354 e Asn465, 5

se interagem com o íon bivalente através de seus grupos carbonila. O resíduo

Asp366 coordena a ligação ao Ca2+, mas não contribui para a interação com o ligante,

apesar de ser essencial para a ligação, uma vez que a substituição de Asp para um

resíduo de Ala resulta na perda total da interação com o ligante (GEIJTENBEEK et

al., 2002a). 10

Com relação ao DENV, o DRC se liga ao vírion através dos resíduos

glicosilados Asn67 de duas glicoproteínas E adjacentes (Figura 7B). Uma unidade

icosaédrica do DENV, constituída por três monômeros de glicoproteína E, possui

seis sítios de glicosilação, três Asn67 e três Asn153, mas o DRC se liga apenas a dois

Asn67 próximos, pois os outros sítios são distantes entre eles, impossibilitando a sua 15

ligação (POKIDYSHEVA et al., 2006).

Figura 7: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos e sua interação com o Dengue virus. A) Estrutura cristalográfica do monômero do DRC, mostrada em 20 vermelho e verde, ligado a um oligossacarídeo, representado em amarelo. Íons Ca2+ ligados estão representados em azul. B) Esquema demonstrando as interações do DRC com o DENV, representadas pelos círculos em azul, que ocorrem por meio da sua ligação aos resíduos Asn67 de duas glicoproteínas E adjacentes. Adaptado de Pokidysheva et al. (2006). 25

17

1.5) Funções do DC-SIGN no sistema imune

O DC-SIGN possui uma ampla capacidade de reconhecimento de patógenos,

desde vírus a parasitos. Além disso, este receptor também funciona como um PRR,

reconhecendo Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs) e induzindo

ou modulando a expressão gênica em resposta aos patógenos reconhecidos. A 5

resposta imune modulada pelo DC-SIGN é dependente do patógeno que está

envolvido (GEIJTENBEEK et al., 2009).

Em DC, DC-SIGN pode capturar e internalizar Mycobacterium bovis através

de um componente da parece celular de micobactérias chamado

lipoarabinomanana. Além disso, a ligação desse componente ao DC-SIGN previne a 10

maturação de DC por meio da alteração da sinalização de TLR, causando

imunossupressão do paciente (GEIJTENBEEK et al., 2002b). Essa modificação na

sinalização por TLR também pode ocorrer em diferentes patógenos, mas a

sinalização celular produzida antes e após essa alteração pode variar. Patógenos

que expressam glicoproteínas ricas em manose, como Mycobacterium tuberculosis e 15

HIV-1, modulam a sinalização de TLR diferentemente de patógenos que expressam

fucose, como Helicobacter pylori, levando a expressão de diferentes níveis de

citocinas pró- e anti-inflamatórias (GRINGHUIS et al., 2009).

Apesar de diversos estudos terem sidos publicados envolvendo a isoforma

mais comum do DC-SIGN, que é associada à membrana, a função das outras 20

isoformas desse receptor, especialmente as isoformas solúveis, ainda não é bem

conhecida. Existem trabalhos prévios envolvendo estas isoformas, mas os

resultados ainda não foram esclarecedores. Por exemplo, alguns estudos mostraram

que a incubação de sDC-SIGN com células expressando DC-SIGN inibiram a

infecção ou a ligação do HIV a estas células (KWON et al. 2002; BIGGINS et al., 25

2007). Em contraste, Hijazi e colaboradores (2011) demonstraram que o sDC-SIGN

inibia a infecção de HIV em células PM1 (linhagem contínua de células T CD4+) em

concentrações nanomolares, porém aumentou a infecção viral em concentrações

sub-nanomolares. As hipóteses sugeridas pelos autores foram que em altas

concentrações, o excesso de DC-SIGN ligado à gp120 do HIV bloquearia o sítio de 30

ligação ao CD4, um receptor essencial para a infecção do vírus. Em baixas

concentrações ocorreria a potencialização da infecção devido ao aumento da

afinidade do complexo gp120-DC-SIGN pelo CD4. No entanto, mais estudos são

18

necessários para confirmar estas hipóteses. Outros trabalhos demonstraram que a

incubação de iDC com o DRC do DC-SIGN inibiu mais de 90% da infecção do

DENV, entretanto Plazolles e colaboradores (2011) evidenciaram que a isoforma

sDC-SIGN1A tipo I promoveu um aumento da infecção de Citomegalovírus (CMV)

humano nestas mesmas células (NAVARRO-SANCHEZ et al., 2003; PLAZOLLES et 5

al., 2011). Diante disso, ainda são necessários mais estudos para validar a

verdadeira função dessas isoformas.

1.6) Produção de proteínas recombinantes

No desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, a indústria 10

microbiológica tradicional se fundiu com a biologia molecular, dando origem a

processos recombinantes otimizados para a produção de variados produtos

celulares, especialmente enzimas e proteínas de interesse farmacológico. Para isto,

microrganismos são modificados geneticamente para a fabricação destes produtos

e, dentre os processos de recombinação nestes organismos, destaca-se a 15

transformação, na qual envolve a captação e expressão de um DNA por células

competentes. Essa competência pode ser induzida em laboratórios, alterando-se o

ambiente físico-químico onde as células se encontram, por exemplo, pelo tratamento

com cloreto de cálcio gelado, choque térmico, eletroporação, entre outros (ADRIO e

DEMAIN, 2010; TU et al., 2016). 20

Entre os vetores utilizados na transformação, destacam-se os plasmídeos.

Algumas características de um plasmídeo de expressão podem influenciar a taxa de

expressão do gene clonado neste vetor, sendo as principais: o seu promotor, o sítio

de ligação ao ribossomo, um gene que confere resistência a um antibiótico e o

número de cópias do plasmídeo, determinado pela origem de replicação. Desta 25

forma, a configuração do vetor de expressão deve ser analisada cuidadosamente a

fim de se obter um nível adequado de síntese proteica (MAKRIDES, 1996; ROSANO

e CECCARELLI, 2014).

A maioria dos biofármacos produzidos atualmente é de origem recombinante,

sendo que o sistema de expressão escolhido para a produção de determinada 30

proteína recombinante dependerá da sua qualidade, funcionalidade, rendimento e

velocidade de produção. Entre os sistemas biológicos mais utilizados para fins

19

biotecnológicos, destacam-se as células de mamíferos e insetos, leveduras e

bactérias (ADRIO e DEMAIN, 2010, SANCHEZ-GARCIA et al., 2016). Dentre estes,

Escherichia coli é um organismo já bem estabelecido para a expressão de proteínas

recombinantes, além de ser a primeira escolha de organismos para essa finalidade,

uma vez que apresenta fácil manuseio e um longo histórico de uso na biotecnologia 5

(TEGEL et al., 2010, CHEN 2012). Entre os sistemas utilizados na produção de

proteínas recombinantes nos mercados dos Estados Unidos e Europa, cerca de 40%

são bactérias, sendo a grande maioria delas alguma linhagem de E. coli (RADER,

2008).

Mesmo que existam diversos sistemas de expressão disponíveis, muitos 10

ainda estão em desenvolvimento, tanto microrganismos convencionais, como E. coli

e Saccharomyces cerevisae, como também plataformas mais recentes, como

Pseudoalteromonas haloplanktis, Trichoderma reesei, Chlamydomonas reinhardtii,

Leishmania tarentolae, entre outros (CORCHERO et al, 2013; SANCHEZ-GARCIA et

al., 2016). Assim, há um grande número de opções disponíveis para a produção de 15

proteínas e dificilmente é possível alcançar uma combinação ideal, pelo menos

inicialmente. Condições para a produção de determinado produto gênico podem não

funcionar para outro produto gênico, nem modelos confiáveis de predição de

expressão proteica estão disponíveis, então o processo de produção de proteínas

continua empírico. Por isso, múltiplas condições são testadas para otimizar esse 20

processo e obter a proteína desejada (TEGEL et al., 2010; ROSANO E

CECCARELLI, 2014).

A expressão heteróloga em E. coli pode ser afetada por diversos fatores,

como características estruturais da sequência gênica, a estabilidade e eficiência da

tradução do mRNA, a capacidade de enovelamento proteico, a degradação da 25

proteína por proteases celulares, a diferença do uso de códons entre organismos, a

possível toxicidade da proteína produzida ao hospedeiro, entre outros (MAKRIDES,

1996, ROSANO E CECCARELLI, 2014). Diversas linhagens de E. coli já foram

modificadas, dando origem a novas cepas capazes de diminuir ou evitar as suas

desvantagens na produção de proteínas recombinantes. Linhagens deficientes em 30

proteases, o que confere maior estabilidade de proteínas heterólogas, como as

BL21(DE3) e outras derivadas são bastante utilizadas. Estirpes que melhoram a

formação de pontes dissulfeto também já foram desenvolvidas, bem como cepas

20

capazes de realizar glicosilação (CHEN, 2012; ROSANO e CECCARELLI, 2014). A

variação nos códons utilizados por eucariotos e procariotos no processo de tradução

também pode influenciar a produção de proteínas eucarióticas em E. coli. Esse viés

pode ser atenuado pela alteração dos códons raros no gene a ser expresso por

códons mais utilizados em E. coli ou pela utilização de linhagens capazes de realizar 5

a expressão de tRNAs raros (KOPANIC et al., 2013).

Apesar de otimizações serem realizadas para atingir uma alta expressão da

proteína de interesse, muitas vezes essa produção excessiva em E. coli pode

resultar na formação de agregados proteicos no citoplasma da célula bacteriana,

denominados corpos de inclusão, onde é necessário a sua solubilização, 10

renovelamento e purificação a fim de se obter a proteína funcionalmente ativa.

Porém, ainda que a formação de corpos de inclusão seja muitas vezes indesejada,

ela pode ser explorada como uma vantagem, uma vez que ocorrerá uma alta

expressão da proteína de interesse nesses agregados, nos quais, além de

prevenirem a degradação proteica por proteases celulares, podem ser facilmente 15

isolados e purificados em um número de etapas reduzido (SINGH e PANDA, 2005;

ROSANO E CECCARELLI, 2014).

A produção de proteínas recombinantes é uma área da ciência extensa, onde

um grande progresso nesse campo foi alcançado nas últimas décadas e ainda está

em constante desenvolvimento (CHEN, 2012). Vários sistemas de expressão estão 20

disponíveis e cada um deles, seja procarioto ou eucarioto, possui suas vantagens e

desvantagens. Então a escolha entre eles precisa ser analisada previamente de

acordo com a proteína de interesse. Nesse contexto, a utilização de E. coli é bem

estabelecida e se tornou o sistema de expressão mais popular atualmente

(ROSANO e CECCARELLI, 2014). Desta forma, com o constante acúmulo de 25

conhecimento e o desenvolvimento de novas estratégias biotecnológicas, espera-se

que a produção de proteínas biologicamente ativas seja cada vez mais exequível.

1.7) Justificativa

A dengue é considerada a arbovirose mais importante que afeta o homem 30

atualmente e que, mesmo sendo uma doença presente em quase todo mundo, ainda

continua em expansão. Desta forma, é esperado um aumento na frequência,

21

proporção e gravidade das epidemias nas regiões afetadas (GUBLER, 2011). O

desenvolvimento de vacinas ou fármacos contra o vírus seriam importantes

ferramentas no combate a doença, no entanto, para que isso seja possível, é

necessário elucidar os mecanismos de patogênese da dengue, que ainda não são

completamente conhecidos. 5

Durante a fase inicial da dengue, as partículas virais introduzidas na pele pelo

mosquito vetor infectam, principalmente, macrófagos e DCs presentes na pele

(SCHMID e HARRIS, 2014). Em seguida, o DENVse dirige aos linfonodos e corrente

sanguínea, infectando DCs, macrófagos e monócitos. Uma vez na corrente

sanguínea, o vírus pode se dispersar e infectar células em diversos órgãos, como 10

fígado, baço, cérebro, coração, entre outros (PRESTWOOD et al., 2012; SCHMID e

HARRIS, 2014). A alta susceptibilidade das iDCs ao vírus, em comparação aos

macrófagos e monócitos, se deve provavelmente ao seu alto nível de expressão do

receptor DC-SIGN (SCHMID e HARRIS, 2014). Este receptor atua reconhecendo,

ligando e/ou internalizando diferentes classes de patógenos, gerando diferentes 15

respostas nas células envolvidas nesse reconhecimento ou até mesmo no

organismo como um todo (GRINGHUIS et al., 2009).

Devido ao processo de splicing alternativo, o gene CD209 que codifica para

este receptor tem a capacidade de gerar diversas isoformas da proteína, tanto de

membrana quanto solúveis. Dentre os poucos estudos envolvendo as isoformas 20

solúveis, os resultados obtidos não elucidaram completamente a função dessas

proteínas. Alguns autores observaram que elas poderiam contribuir com o aumento

da infecção, enquanto outros encontraram o inverso, a inibição da infecção viral

(KWON et al., 2002; BIGGINS et al., 2007; HIJAZI et al., 2011; PLAZOLLES et al.,

2011). Consequentemente, ainda é necessário o desenvolvimento de novos 25

trabalhos para avaliar qual é, de fato, a função dessas isoformas do DC-SIGN,

especialmente com relação à infecção pelo DENV, uma vez que os estudos

realizados previamente são relacionados ao vírus HIV e citomegalovírus.

Além disso, estudos já revelaram que um mesmo indivíduo pode apresentar

diferentes níveis de expressão de mRNA das isoformas do DC-SIGN o que poderia 30

contribuir para a variabilidade fenotípica associada à infecção por dengue.

(MUMMIDI et al., 2001; PLAZOLLES et al., 2011). A expressão dessas isoformas

também pode variar em diferentes condições fisiológicas, como a maior expressão

22

de sDC-SIGN em amostras de tecidos sob inflamação versus não inflamados.

(PLAZOLLES et al., 2011; JIANG et al., 2014). Todos estes estudos sugerem um

grande nível de complexidade relacionado à expressão das isoformas do DC-SIGN

no organismo humano. Complexidade a qual ainda precisa ser melhor

compreendida, avaliando o papel das variantes do DC-SIGN em determinadas 5

condições fisiológicas, como no caso de infecções virais.

Estudos anteriores do grupo de pesquisa da Profa. Dra. Luciana Lara dos

Santos (CCO/UFSJ) avaliaram a expressão gênica do DC-SIGN em indivíduos

saudáveis e detectaram a expressão de cinco isoformas do DC-SIGN. A modelagem

comparativa de quatro delas mostrou que duas perdiam os três sítios de Ca2+ do 10

DRC, o que levou a sugerir a perda da interação destas proteínas ao ligante, no

caso o DENV. Várias isoformas estão sendo avaliadas in vitro por este grupo de

pesquisa, tanto as que possivelmente perdem a interação ao ligante quanto à

isoforma deste estudo, que não possui alteração no DRC, mas que ainda não tem

papel definido no processo de infeção viral. 15

O DENV é capaz de infectar células de variadas linhagens, especialmente

monócitos, macrófagos e DCs, sendo que o nível de infecção varia de acordo com a

subpopulação dessas linhagens e também com a condição fisiopatológica do

indivíduo, como durante uma infecção primária ou secundária (SCHMID et al., 2014).

Esta variação pode ser relacionada ao DC-SIGN, pois o DENV infecta 20

preferencialmente uma célula alvo através do DC-SIGN quando níveis suficientes

deste receptor estão presentes, não ocorrendo a entrada do vírus via FcR nessa

condição (BOONNAK et al., 2008).

Além disso, devido ao papel ambíguo de inibição e aumento da infecção viral

promovido pelo sDC-SIGN, Plazolles e colaboradores (2011) propuseram um 25

modelo hipotético onde (i) em altas concentrações da proteína, os vírions são

rapidamente complexados, impedindo a sua ligação e internalização pela célula

hospedeira, mas (ii) em concentrações menores, em uma estequiometria “ótima”, o

sDC-SIGN atua como uma opsonina, levando a internalização do maior número de

vírions ligados ao sDC-SIGN; já (iii) em concentrações muito baixas, a maioria dos 30

vírions estão livres e o nível de infecção é semelhante àquele na ausência de sDC-

SIGN.

23

Desta forma, considerando a grande variação do nível de expressão do DC-

SIGN nas diversas células alvo do vírus, além de que o sDC-SIGN pode ser

secretado durante uma infecção viral, é difícil prever o que pode ocorrer no

microambiente fisiológico de um paciente durante a infecção pelo DENV

(PLAZOLLES et al., 2011; SHMID et al., 2014). Assim, estudos por meio da 5

expressão proteica das variantes do DC-SIGN e sua incubação junto ao DENV em

diferentes células alvo poderiam trazer um melhor entendimento acerca da função

das isoformas solúveis na interação com o DENV.

Portanto, frente ao desafio que a dengue representa à saúde pública, faz-se

necessário compreender melhor sua etiopatogênese. Estudos avaliando a 10

participação do DC-SIGN e suas variantes neste processo são importantes para

maiores esclarecimentos sobre o mecanismo da doença e, consequentemente, para

a avaliação da possibilidade de bloqueio da multiplicação viral no hospedeiro.

24

2. OBJETIVOS

2.1) Objetivo geral:

Avaliar o papel da sDC-SIGN1A tipo III na capacidade de infecção do Dengue

virus em monócitos e macrófagos.

5

2.2) Objetivos específicos:

Caracterizar a isoforma sDC-SIGN1A tipo III através de análises in silico;

Produzir e purificar a sDC-SIGN1A tipo III por expressão heteróloga;

Verificar se existe alteração na capacidade de infecção celular do Dengue

virus na presença ou ausência da proteína recombinante sintetizada em 10

monócitos e macrófagos.

25

3. METODOLOGIA

3.1) Análises in silico

A sequência de nucleotídeos que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo

III, assim como a sequência de aminoácidos da proteína, foram obtidas através do

GenBank, sob código de acesso AY042227.1e AAK91852.1, respectivamente. 5

Análises in silico foram realizadas utilizando softwares de bioinformática, a fim

de se determinar algumas características estruturais e físico-químicas da proteína.

Todas as ferramentas utilizadas nas análises estão disponíveis na Plataforma

ExPASy (SIB Swiss Institute of Bioinformatics, Suiça – http://www.expasy.org/tools/).

Um dos softwares utilizados foi o ProtParam (SIB Swiss Institute of 10

Bioinformatics, Suiça – http://web.expasy.org/protparam/), uma ferramenta de

proteômica capaz de calcular parâmetros físico-químicos de uma proteína, como a

massa molecular, ponto isoelétrico teórico, hidropaticidade (índice GRAVY),

composição de aminoácidos e de átomos, entre outros (GASTEIGER, 2003).

A localização celular da proteína foi estimada pelo PSORT (Human Genome 15

Center, Japão – http://www.psort.org/). Este software requer uma sequência

completa de aminoácidos de origem bacteriana, leveduriforme, vegetal ou animal.

De acordo com a origem assinalada, o programa atribui possíveis sítios de

localização da sequência de aminoácidos inserida. Então, ele calcula o valor de

variáveis referentes a características da sequência, interpreta estes valores e estima 20

a possibilidade de localização em cada um dos sítios atribuídos inicialmente,

mostrando o(s) mais provável(eis) entre eles (NAKAI e HORTON, 1999).

A busca por domínios proteicos funcionais foi realizada pelo ScanProsite (SIB

Swiss Institute of Bioinformatics, Suiça – http://prosite.expasy.org/scanprosite/). Este

software faz a identificação de combinações proteicas contra assinaturas do 25

PROSITE database, que é uma base de dados constituída por uma grande coleção

de assinaturas com relevância biológica que são descritas como padrões ou perfis,

usados para a detecção de motivos curtos ou perfis generalizados para detecção

sensível de maiores domínios (CASTRO et al., 2006).

A presença de modificações pós-traducionais foi analisada por dois softwares 30

diferentes, YinOYang e NetNGlyc (Center for Biological Sequence Analysis,

Dinamarca). Em sequências proteicas eucarióticas, essas ferramentas produzem

26

previsões de redes neurais para determinar sítios de ligação de O--GlcNAc

(YinOYang – http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/) e N-glicosilação no contexto

de sequons Asn-Xaa-Ser/Thr (NetNGlyc – http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc),

respectivamente.

Por fim, a presença do peptídeo sinal, que é uma sequência sinalizadora para 5

que a proteína recém-sintetizada seja secretada pela célula, foi analisada pelo

software SignalP (Center for Biological Sequence Analysis, Dinamarca –

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Pela combinação de várias redes neurais,

essa ferramenta é capaz de distinguir peptídeos sinais e não-sinais, além de

reconhecer seus sítios de clivagem, predizendo, assim, a presença e localização do 10

peptídeo sinal em sequências de aminoácidos de diferentes organismos procariotos

e eucariotos (NIELSEN et al., 1997).

3.2) Síntese do gene e vetor de expressão

A síntese da sequência de nucleotídeos do gene que codifica para a isoforma 15

sDC-SIGN1A tipo III foi realizada pela empresa DNA 2.0 (EUA), sendo incluída uma

cauda de histidina na porção C-terminal, para auxiliar na posterior identificação e

purificação da proteína . A sequência foi fornecida pela empresa já modificada com

os códons preferenciais para expressão em E. coli, para otimização da expressão, e

ligada ao vetor de expressão pJ414 (série pJexpress 411-416), que contém o 20

promotor T7 e gene de resistência à ampicilina (Figura 8).

27

Figura 8: Mapa do plasmídeo pJ414. A) Mapa simplificado do vetor pJ414 da série pJexpress. B) Mapa completo do plasmídeo pJ414, que contém o gene de resistência à ampicilina (Ampicillin-r_*), origem de replicação (Ori_pUC) e o promotor T7 (P_T7). 5

28

3.3) Ensaios de Biologia Molecular

3.3.1) Obtenção de bactérias eletrocompetentes

A linhagem utilizada neste trabalho foi E. coli BL21 DE3 Rosetta [F- ompT

hsdSB(rB- mB

-) gal dcm (DE3) pRARE (CamR)]. Esta cepa é transformada com o

plasmídeo pRARE, no qual codifica genes de tRNAs de códons raros para E. coli, 5

permitindo, assim, uma maior expressão de proteínas de outros organismos (Figura

9). Como parte da classe BL21, ela possui os genes das proteases lon e ompT

deletados, o que garante maior estabilidade de proteínas recombinantes utilizando

essa estirpe bacteriana. Além disso, assim como outras linhagens DE3, ela

apresenta a sequência do fago λDE3, levando, assim, uma cópia cromossomal do 10

gene da T7 RNA polimerase sob controle do promotor lacUV5, o que a torna

adequada para a expressão de genes clonados em vetores sob o controle do

promotor T7, através da indução por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG –

NOVY et al., 2001; GOPAL e KUMAR, 2013).

15

Figura 9: Mapa do plasmídeo pRARE. Mapa do plasmídeo pRARE utilizado na transformação de linhagens E. coli para a criação de hospedeiros da série Rosetta™ para a maior expressão de genes contendo códons raros de E. coli. Adaptado de Novy et al. (2001). 20

O meio de cultura utilizado para o cultivo microbiano foi 2xYT [0,5% (p/v)

NaCl, 1% (p/v) extrato de levedura e 1,6% (p/v) peptona de carne], cujo pH foi

ajustado para 7,2. No caso de meio sólido para utilização em placas de Petri, foi

adicionado 1,5% (p/v) de ágar bacteriológico ao meio 2xYT. 25

29

Para obtenção de bactérias eletrocompetentes, primeiramente, foi realizado

um pré-inóculo de bactérias E. coli BL21 DE3 Rosetta em 10 mL de meio 2xYT

líquido e incubado em shaker orbital (Solab, Brasil) a 37 ºC a 180 rpm por 18 h. Após

este período, uma alíquota de 5 mL desta cultura foi transferida para 500 mL de

meio 2xYT e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a densidade ótica de 600 nm 5

(OD600) entre 0,20 e 0,25. Posteriormente, as células foram sedimentadas por

centrifugação a 1250 g, 4 ºC por 20 min. Então, foram realizadas sucessivas

lavagens do pellet: O meio de cultura foi descartado, o pellet ressuspendido em 80

mL de glicerol 10% gelado e nova centrifugação foi feita a 1250 g, 4 ºC por 20 min.

Esse processo de lavagem foi repetido com volumes decrescentes de glicerol 10%: 10

80 mL, 40 mL, 20 mL, 10 mL e 1 mL. Por fim, 25 L dessa suspensão celular foram

transferidos para 10 mL de glicerol 10% e a sua OD600 foi verificada, com valor

esperado de 0,15. Então, a suspensão celular de 1 mL foi aliquotada em microtubos

e armazenadas a -80 ºC.

15

3.3.2) Transformação de bactérias eletrocompetentes

As células eletrocompetentes de E. coli BL21 DE3 Rosetta foram

transformadas através de eletroporação. Em banho de gelo, 1 a 10 ng de DNA (vetor

com o gene de interesse) foram adicionados a 30 L das bactérias

eletrocompetentes. Após homogeneização, a mistura foi transferida para uma cubeta 20

de eletroporação de 0,2 cm (BioRad, EUA) e submetidas a um pulso elétrico de 250

V utilizando o programa Ec2 do eletroporador MicroPulser (BioRad, EUA). Em

seguida, as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio 2xYT, transferidas para

um microtubo de 1,5 mL e incubadas por 45 min, a 37 ºC, sob agitação constante de

180 rpm. Posteriormente, 75 L da cultura foram semeados em ágar 2xYT 25

suplementado com ampicilina (100 g/mL) e as placas foram incubadas em estufa a

37 ºC por 18 h.

Além da eletroporação com o plasmídeo recombinante, o mesmo

procedimento foi realizado utilizando o plasmídeo pUC18 sem inserto, a fim de

comprovar a eficiência das células (controle positivo), bem como também sem 30

adicionar qualquer amostra de DNA, permitindo detectar contaminações que possam

ocorrer no procedimento (controle negativo).

30

3.3.3) Extração plasmidial

Após o cultivo dos microrganismos submetidos à eletroporação, as colônias

que se cresceram no meio provavelmente haviam sido transformadas com o

plasmídeo recombinante. A partir destas colônias, um novo cultivo desses

microrganismos foi realizado para a sua purificação plasmidial em pequena escala 5

(miniprep).

Uma colônia isolada foi transferida para um tubo cônico de 15 mL estéril

contendo 10 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100 g/mL) e

incubado a 37ºC, por 18h a 180 rpm. Como controle negativo, para se detectar

contaminações, um tubo cônico contendo apenas meio de cultura suplementado 10

com ampicilina foi incubado nas mesmas condições anteriores. Após este período,

as células foram sedimentadas através de centrifugação a 18.000g por 10 min e o

DNA plasmidial foi extraído usando o kit comercial PureLink Quick Plasmid Miniprep

Kit (Invitrogen, EUA) de acordo com o protocolo fornecido pela fabricante.

O produto da extração foi quantificado por espectrofotometria utilizando o 15

NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, EUA). O comprimento de onda para

dosagem de DNA foi de 260 nm. Além disso, foram utilizadas as razões 260/280 e

260/230 para a avaliação de contaminação do DNA com proteínas e contaminantes

orgânicos, respectivamente.

20

3.3.4) Confirmação da clonagem

Para a confirmação da presença do plasmídeo contendo a sequência da

isoforma sDC-SIGN1A tipo III nos microrganismos transformados, o DNA plasmidial

obtido no procedimento anterior (item 3.3.3) foi sequenciado pelo método de Sanger.

O sequenciamento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular (CCO/UFSJ). 25

A reação de sequenciamento foi realizada utilizando o kit BigDye® Terminator

v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, EUA), seguindo as instruções

do fabricante. A reação foi preparada em um volume total de 10 L, contendo 100 ng

de DNA plasmidial e 1 mM do iniciador do promotor T7(5’-

TAATACGACTCACTATAGGG-3’). O programa usado no termociclador continha os 30

seguintes passos: desnaturação a 96 ºC por 1 min, 35 ciclos de desnaturação a 96

31

ºC por 15 s, anelamento a 50 ºC por 15 s e extensão a 60 ºC por 3 min. Por fim, o

produto foi mantido a 4 ºC por 4 min.

Após a retirada das amostras do termociclador, estas foram purificadas pelo

método de etanol/EDTA e ressuspendidas em 10 L de formamida HiDi® (Thermo

Fisher Scientific, EUA). Em seguida, foram levadas ao termociclador, permanecendo 5

a 95 ºC por 5 min e, posteriormente, resfriadas. Por fim, as amostras foram

analisadas por eletroforese capilar utilizando o sequenciador automático Genetic

Analyser 3500xL (Thermo Fisher Scientific, EUA). A sequência obtida foi analisada

no software Sequence Scanner Software 2.0 e MultAlin

(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/), para confirmar a qualidade do 10

sequenciamento e a similaridade entre a sequência obtida e aquela fornecida pelo

fabricante do vetor de expressão.

3.3.5) Expressão da proteína recombinante em pequena escala

Inicialmente, uma expressão em pequena escala em diferentes temperaturas 15

foi realizada para otimizar as condições experimentais da produção da proteína

recombinante, para que, posteriormente, fosse feita uma expressão em larga escala

para a sua purificação e utilização nos testes in vitro.

Uma colônia isolada após transformação com o vetor de expressão foi

inoculada em 10 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100 g/mL) e 20

incubada a 37 ºC, por 18 h a 180 rpm. Em seguida, uma alíquota de 200 L desta

cultura foi transferida para 20 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100

g/mL) e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a fase exponencial de crescimento,

com OD600 entre 0,6 e 0,8, cerca de 5 h. Ao atingir a OD desejada, 2 mL de cada

cultura foram retirados e armazenados a 4 ºC para utilização como controle (não-25

induzido; T0). A expressão foi induzida através da adição de 0,5 mM de IPTG à

cultura remanescente, seguida de incubação à 18 ºC por 18 h sob agitação

constante de 180 rpm. Novas alíquotas de 2 mL foram retiradas após 4 (T4) e 18 h

de indução (tempo final; T18), sendo armazenadas a 4 ºC. Com o objetivo de

padronizar a temperatura de expressão, todo o procedimento descrito acima foi 30

repetido, porém a incubação após a indução com IPTG foi realizada a 37 ºC por 4 h,

sendo as alíquotas retiradas após 2 (T2) e 4 h de indução (tempo final; T4).

32

Para a confirmação da expressão, as amostras foram centrifugadas a 18.000

g por 10 min, o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido em 40 L de água

Milli-Q e 40 L de tampão de amostra DTT 2X (100 mM Tris-HCl pH 6,8; 200 mM

DTT; 4% dodecil sulfato de sódio [SDS]; 0,2% azul de bromofenol; 20% glicerol).

Posteriormente, as amostras foram fervidas a 100 ºC por 5 min para lise das células, 5

centrifugadas a 18.000 g por 3 min e analisadas através de eletroforese em gel de

poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) e Western blot (procedimentos descritos

abaixo, nos itens 3.3.7 e 3.3.8).

Para verificar a necessidade de purificação em condições desnaturantes,

posteriormente, uma nova expressão foi realizada a 18 ºC por 18 h e a cultura ao 10

final da expressão foi submetida a outro tratamento. Após uma centrifugação inicial a

1250 g por 20 min a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em

2 mL de tampão de ligação da coluna (50 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl; pH 7,4). Em

seguida, essa amostra foi submetida a 5 ciclos de congelamento e

descongelamento, a -20 e 37 ºC, para lise inicial das células. A seguir, as células 15

foram sonicadas com 5 pulsos de 30 s, na potência de 45 do Desruptor de Célula

Ultrassônico (UNIQUE, Brasil) para a liberação das proteínas de corpos de inclusão.

Posteriormente, a amostra foi centrifugada novamente a 1250 g por 20 min a 4ºC,

sendo o sobrenadante coletado, no qual foi adicionado tampão de amostra DTT 2X

(relação 1:1 amostra/tampão). O pellet foi ressuspendido em 40 L de água Milli-Q e 20

40 L de tampão de amostra DTT 2X. Por fim, as amostras foram fervidas a 100 ºC

por 5 min, centrifugadas a 18.000 g por 3 min e analisadas por SDS-PAGE e

Western blot.

3.3.6) Expressão da proteína recombinante em larga escala 25

A expressão em larga escala foi realizada para produção da proteína

recombinante em quantidade suficiente para a sua purificação. Uma colônia isolada

após transformação com o vetor de expressão foi inoculada em 10 mL de meio 2xYT

suplementado com ampicilina e incubada a 37 ºC, por 18 h a 180 rpm. Em seguida,

uma alíquota de 5 mL desta cultura foi transferida para 500 mL de meio 2xYT 30

suplementado com ampicilina e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a fase

exponencial de crescimento, com OD600 entre 0,6 e 0,8, cerca de 5 h. Então, a

33

expressão foi induzida através da adição de 0,5 mM de IPTG à cultura

remanescente, seguida de incubação a 18 ºC por 18 h sob agitação constante de

180 rpm. Alíquotas de 2 mL foram retiradas antes (T0) e após 18 h de indução

(tempo final; T18), sendo armazenadas a 4 ºC.

Decorrido o tempo necessário para a expressão da proteína recombinante, a 5

cultura restante foi centrifugada a 1250 g por 20 min a 4ºC, o sobrenadante foi

descartado e o pellet ressuspendido em 100 mL de tampão de ligação da coluna

acrescido de 5 M de ureia. Para facilitar o manejo nos procedimentos seguintes, a

amostra foi dividida em 4 tubos cônicos com volumes iguais. Em seguida, as

amostras foram submetidas a 5 ciclos de congelamento e descongelamento, a -20 e 10

37 ºC, e sonicadas com 5 pulsos de 30 s, na potência de 45 do desruptor de células

para a liberação das proteínas de corpos de inclusão. Após isso, as amostras foram

centrifugadas novamente a 1250 g por 20 min a 4 ºC e os sobrenadantes

transferidos para novos tubos falcon. A expressão foi confirmada através da análise

por SDS-PAGE e Western blot antes de iniciar a purificação. 15

3.3.7) Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE

Para avaliar a expressão da proteína recombinante, uma das técnicas

empregadas neste trabalho foi a SDS-PAGE, que permite avaliar a possível

produção da proteína de interesse através da comparação com um padrão de peso 20

molecular.

As amostras foram submetidas à SDS-PAGE constituída de um gel de

empacotamento (5%) e um gel de separação (15%), sendo aplicadas 10 L de cada

amostra, exceto as alíquotas antes da indução, que foram 20 L para manter uma

proporção aproximada de células por amostra, e 7 L do padrão de peso molecular 25

BenchMark 10-220 kDa (Thermo Fisher Scientific, EUA). A corrida foi efetuada a 80

V em tampão tris-glicina (25 mM Tris base; pH 8,3; 250 mM glicina; 0,1% SDS) até

as amostras passarem o gel de empacotamento (cerca de 45 min), e então, a tensão

elétrica foi alterada para 100 V e mantida até as amostras chegarem ao final do gel

(aproximadamente 3 h). Por fim, o gel foi corado com uma solução de Azul de 30

Coomassie (0,25% Azul de Coomassie R250; 50% metanol; 10% ácido acético) por

34

cerca de 4 h e lavado várias vezes com solução descorante (50% metanol; 10%

ácido acético) até que fosse possível visualizar as bandas nitidamente.

3.3.8) Western blot

A confirmação da expressão da proteína de interesse foi realizada através da 5

imunodetecção por Western blot, que permite a sua identificação através da ligação

de um anticorpo (conjugado à fosfatase alcalina) à cauda de histidina, a qual está

presente principalmente nas proteínas recombinantes, revelando-as na membrana

somente quando estão presentes na amostra, ou seja, quando forem expressas.

Inicialmente, as amostras foram separadas por SDS-PAGE conforme descrito 10

anteriormente (item 3.3.7) e transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose

com poro de 0,45 m de diâmetro (Thermo Fisher Scientific, EUA) em um tampão de

transferência tris-glicina (20% metanol; 25% tampão 4X –0,025 M Tris base, 0,192 M

glicina, pH 8,3) por 3 h, com corrente elétrica fixada em 300 mA.

A transferência foi confirmada através da coloração da membrana com 15

solução de Ponceau (1,6x10-4 M ponceau xilidina; 5% ácido acético glacial). Após a

confirmação, a membrana foi lavada com água destilada e incubada por 18 h em

solução de bloqueio (10% leite desnatado em pó; 0,05% de Tween 20; PBS 1X – 5,8

M NaCl, 7,4 M KCl, 14,2 M Na2HPO4, 13,6 M KH2PO4) sob agitação constante.

Posteriormente, a membrana foi lavada 3X por 10 min com solução de 20

lavagem (PBS 1X; 0,05% Tween 20; pH 8) e incubada com anticorpo monoclonal

anti-histidina conjugado à fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich, EUA) em solução de

lavagem na proporção 1:2000 por 2 h sob agitação constante. Após este período, a

membrana foi novamente lavada 3X por 10 min com solução de lavagem e incubada

com a solução substrato NBT/BCIP (0,02% Nitro Blue Tetrazolium; 0,016% 5-bromo-25

4-cloro-3-indolil-fosfato; tampão fosfatase alcalina – 100 mM tris-HCl pH 9,5, 100 mM

NaCl, 5 mM MgCl2) (Thermo Fisher Scientific, EUA) até o aparecimento das bandas

na membrana. Por fim, a mesma foi lavada com água deionizada e mantida em

temperatura ambiente até que secasse completamente, antes de ser fotografada.

30

35

3.3.9) Purificação da proteína recombinante

A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade

utilizando a coluna HiTrap TALON® crude (GE Healthcare, EUA), de acordo com o

protocolo fornecido pela fabricante. Esta coluna é constituída de uma resina de

agarose e íons cobalto imobilizados, a qual permite a sua ligação às proteínas 5

contendo uma cauda de histidina, com capacidade de ligação de até 20 mg de

proteínas. A coluna foi acoplada a uma bomba peristáltica, cujo fluxo foi ajustado

para 1 mL/min. Primeiramente, a coluna foi equilibrada com 10 mL do tampão de

ligação contendo ureia 5 M (50 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl; 5 M CO(NH2)2; pH 7,4).

Posteriormente, 50 mL do lisado celular foram aplicados, com fluxo de 0,4mL/min. 10

Em seguida, foram feitas sucessivas lavagens para remoção de proteínas com

interações inespecíficas com o íon cobalto, ao mesmo tempo em que era promovido

o reenovelamento da proteína recombinante, uma vez que o tampão de ligação

continha ureia como agente desnaturante (SINGH e PANDA, 2005). Para isto, foram

aplicados, consecutivamente, 30 mL de cinco soluções contendo concentrações 15

decrescentes de ureia: 4, 3, 2, 1 e 0 M. Por fim, a proteína foi eluída da coluna com

10 mL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl; 500 mM imidazol; pH

7,4) e armazenadas a -20 ºC. As alíquotas foram dosadas pelo método de Bradford

e analisadas por SDS-PAGE e Western blot para verificação da sua pureza.

20

3.3.10) Dosagem de proteínas

Inicialmente, uma curva padrão de concentração de proteínas utilizando

albumina bovina sérica (BSA) foi preparada em uma placa de 96 poços. As

concentrações de BSA variaram de 0 a 100 g/mL, no volume de 20 L. Com

relação às amostras, foram adicionados 5 L de cada alíquota e 15 L de água Milli-25

Q. Também foram utilizados 20 L de água Milli-Q como branco das reações. Em

seguida, foram adicionados 180 L de reagente de Bradford em todos os poços. As

reações foram realizadas em duplicata. Por fim, a absorbância foi mensurada em

comprimento de onda de 595 nm utilizando o leitor de microplacas PowerWave XS2

(Biotek, EUA) e a concentração proteica determinada com base na curva padrão de 30

BSA.

36

3.4) Cultura de células

3.4.1) Células e vírus

Células de linhagem contínua de larvas de mosquito Aedes albopictus C6/36

as quais foram obtidas originalmente da American Type Culture Collection (ATCC;

EUA) foram utilizadas para a multiplicação de DENV-2. As células foram cultivadas 5

em frascos de 25 cm² utilizando meio Leibovitz L-15 (Cultilab, Brasil) contendo 10%

de Soro Fetal Bovino (SFB; Sigma-Aldrich, EUA), 0,3% de solução penicilina-

estreptomicina-anfotericina B (10.000 U/mL + 10 mg/mL + 2 mg/mL; Sigma-Aldrich,

EUA). A cultura foi incubada em estufa de Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD)

a 28 ºC. 10

Para a realização da titulação do DENV-2, células Baby Hamster Kidney

fibroblasts (fibroblastos de Rim de Hamster Bebê – BHK-21; ATCC, EUA) foram

cultivadas em frascos de 25 cm², usando meio Mínimo Essencial de Eagle

Modificado por Dulbecco (DMEM; Cultilab, Brasil) contendo 5% SFB, 0,3% de

solução penicilina-estreptomicina-anfotericina B (10.000 U/mL + 10 mg/mL + 2 15

mg/mL; Sigma-Aldrich, EUA). As culturas foram incubadas em estufa de atmosfera

umidificada, de 5% de CO2, a 37 ºC.

As linhagens celulares foram repicadas a cada 2-3 dias. A monocamada

celular foi previamente lavada com tampão salina fosfato (PBS; 4 mM Na2HPO4, 2

mM KH2PO4, 150mM NaCl, pH 7,2), desprendida do frasco enzimaticamente com 20

tripsina/EDTA 0,05% (Thermo Fisher Scientific, EUA) e homogeneizada. Quando

necessário, a contagem do número de células foi realizada utilizando câmara de

Neubauer. Posteriormente, a suspensão celular foi transferida para outro frasco

estéril e adicionado o meio de cultura adequado.

A linhagem monocítica THP-1 foi utilizada para a realização dos ensaios 25

funcionais da sDC-SIGN1A tipo III produzida neste trabalho. As células foram

cultivadas em Meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI; Cultilab, Brasil),

suplementado com 10% SFB, 0,01 M de HEPES (Sigma-Aldrich, EUA), 0,3% de

solução penicilina-estreptomicina-anfotericina B (10.000 U/mL + 10 mg/mL + 2

mg/mL; Sigma-Aldrich, EUA), na concentração de 1 x 105 células/mL. 30

Posteriormente, as células foram transferidas para frascos de 25 cm² e incubadas

em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC. As células foram

37

cultivadas trocando metade do volume de cultura pelo volume equivalente de meio

de cultura suplementado a cada 2 dias.

3.4.2) Produção e purificação parcial de DENV-2

A produção de estoque viral utilizado nos ensaios de infecção foi realizada de 5

acordo com Souza e colaboradores (2009). Células C6/36 foram cultivadas em

frascos de 25 cm² até apresentar 80-90% de confluência, lavadas com PBS e

infectadas com DENV-2, com uma multiplicidade de infecção de 0,01, em 2 mL de

meio L-15 sem SFB. As células foram incubadas em estuda BOD a 28 ºC por 1 h

para adsorção do vírus, sendo agitadas a cada 10 min. Após esse período, 3 mL de 10

meio L-15 com 2% SFB foram adicionados e incubadas novamente em estufa BOD

a 28 ºC por 4-7 dias. Como cultura controle, o mesmo procedimento descrito acima

foi realizado em outro frasco de 25 cm², porém sem a adição do DENV-2.

As células foram monitoradas diariamente ao microscópio óptico invertido,

observando a apresentação de efeito citopático (ECP), que são a formação de 15

sincícios e vacuolizações, indicando a ocorrência de multiplicação viral nessas

células. Após apresentar ECP acima de 70% em relação à cultura controle (não

infectada), as células foram submetidas a ciclos de congelamento/descongelamento

(-20 ºC/28 ºC), o sobrenadante foi coletado e clarificado. Nesta etapa, os restos

celulares (pellet) foram separados da suspensão viral (sobrenadante) por 20

centrifugação a 1600 g a 4 ºC, por 30 min. O sobrenadante foi coletado e

armazenado a -80 ºC até o momento do uso.

3.4.3) Titulação de DENV-2

O título de DENV-2 foi estimado pelo método de TCID50 (50% Tissue Culture 25

Infective Dose) adaptado de Li e colaboradores (2011). Para isto, células BHK-21

foram semeadas em placas de 96 poços, em concentração final de 1 x 104

células/poço em meio DMEM com 5% SFB e incubadas em estufa de atmosfera

umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC, por 24 h. Posteriormente, o meio foi retirado e

100 L de cada uma das diluições seriadas (100 a 10-6) das amostras virais foram 30

adicionados em 4 replicatas. A placa foi incubada em estufa de atmosfera

umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC por 1 h, agitando-a a cada 10 min, para

38

permitir a adsorção do vírus. Em seguida, o sobrenadante foi descartado para

remover o excesso de vírus não adsorvido e a monocamada foi coberta com 200 L

de meio DMEM contendo 2% SFB. A placa foi novamente incubada em estufa de

atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC por 5 a 7 dias, observando-se o

desenvolvimento de ECP diariamente através de microscópio óptico invertido. O 5

título viral, expresso em TCID50/mL, foi calculado através do método de Spearman e

Kärber, descrito por Hierholzer e Killington (1996).

3.4.4) Diferenciação da linhagem THP-1 em macrófagos

Para a realização dos ensaios funcionais utilizando sDC-SIGN1A tipo III, 10

células THP-1 foram diferenciadas em macrófagos, de acordo com Chanput e

colaboradores (2013), com modificações.

As células THP-1 foram estimuladas por 48 h com acetato miristato de forbol

(PMA – phorbol 12-myristate 13-acetate), seguido por uma fase de repouso na

ausência de PMA por 24 h, antes da realização dos ensaios funcionais. Para isto, as 15

células THP-1 foram coletadas por centrifugação a 350 g, por 10 min, e

ressuspendidas em meio RPMI com 10% SFB na concentração de 1 x 105

células/mL. Posteriormente, 1 mL/poço da suspensão celular foram colocados em

placas de 24 poços e 100 ng/poço de PMA foram adicionados. Em seguida, as

células foram incubadas por 48 h em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de 20

CO2, a 37 ºC. Após este período, o sobrenadante foi removido e 1 mL de meio RPMI

com 10% SFB foi adicionado e as células foram novamente incubadas por 24 h em

estufa de atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC.

As células foram observadas diariamente em microscópio óptico invertido

para visualização da alteração da morfologia celular. Além disso, dois poços foram 25

utilizados como controle da diferenciação, sendo coletados os sobrenadantes após a

estimulação com PMA e a contagem foi feita na câmara de Neubauer para

determinar a aderência das células.

3.4.5) Ensaios funcionais 30

Os ensaios funcionais foram realizados utilizando monócitos e macrófagos, a

fim de avaliar uma possível alteração da isoforma sDC-SIGN1A tipo III sobre a

39

infecção do DENV-2. Estes ensaios foram baseados em testes realizados por

Diamond e colaboradores (2000) e Plazolles e colaboradores (2011).

Para os ensaios utilizando macrófagos, após a diferenciação das células

THP-1 descrita no item 3.4.4, o sobrenadante foi removido e as células aderentes

foram incubadas com DENV-2 (MOI de 1) na presença da proteína recombinante 5

(1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 ng/mL), volume total de 200 L em meio

RPMI sem SFB, em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC por 2

h, agitando-se a placa cada 15 min, para permitir a adsorção do vírus.

Posteriormente, o volume foi completado para 1 mL com meio RPMI 2% SFB e as

células foram novamente incubadas em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de 10

CO2, a 37 ºC por 72 h.

Para os testes com monócitos, as células THP-1 foram coletadas por

centrifugação a 350 g, por 10 min, ressuspendidas em meio RPMI 1640 e semeadas

em placa de 24 poços na concentração de 1 x 105 células/poço. Em seguida, as

células foram incubadas com DENV-2 e a proteína recombinante nas mesmas 15

condições do ensaio com macrófagos, descritas no parágrafo anterior.

Como controles, as células também foram incubadas com DENV-2 na

ausência da proteína recombinante (controle de infecção) ou adicionando-se o

volume equivalente de tampão da proteína recombinante (controle negativo – 50 mM

NaH2PO4; 300 mM NaCl; pH 7,4). Os ensaios foram realizados em duplicatas. Em 20

todos os testes, após a incubação final, o sobrenadante foi coletado e centrifugado a

350 g, por 10 min, previamente à quantificação da carga viral pelo ensaio de TCID50

(item 3.4.3) e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR – item

3.4.6).

25

3.4.6) Quantificação de RNA viral

Para a quantificação da carga viral nos ensaios funcionais, a construção de

uma curva padrão foi necessária para a quantificação relativa do RNA viral das

amostras. Para isto, o RNA de uma amostra de DENV-2 com título viral conhecido,

determinado por TCID50, foi extraído utilizando o kit RTP® DNA/RNA Virus Mini Kit 30

(STRATEC Molecular, Alemanha), segundo as instruções da fabricante. O produto

obtido foi quantificado por espectrofotometria usando NanoDrop 2000c (Thermo

40

Fisher Scientific, EUA), aliquotado em volumes de 10 μL e armazenados a -80°C até

a realização da Transcrição Reversa por Reação em Cadeia da Polimerase (RT-

PCR) em termociclador Veriti™ Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os

iniciadores utilizados neste trabalho foram descritos por Yong e colaboradores

(2007). 5

Na síntese de cDNA por RT-PCR, inicialmente foi realizada uma etapa de

linearização incubando 1 g da amostra de RNA e 30 pmoles de iniciador reverse

(5’-AAG ACA TTG ATG GCT TTT GA-3’), por 10 min a 70 ºC. Em seguida, 0,4 mM

de dNTP’s, o tampão de reação (50 mM Tris-HCl, 75 mM de KCl, 3 mM MgCl2 e 10

mM de DTT pH 8,3 a 25 °C) e 200 U de Moloney Murine Leukemia Virus Reverse 10

Transcriptase (MMLV-RT – New England BioLabs, EUA) foram adicionados ao RNA

linearizado e a reação foi incubada a 50 ºC por 50 min. O volume total de reação foi

25 L.

O cDNA foi amplificado através de PCR convencional para verificar o

resultado a RT-PCR. Para padronização da concentração de cDNA para 15

amplificação, o cDNA foi previamente diluído nas razões 1:10, 1:50 e 1:100, sendo

adicionados ao tubo de reação: 2 L de cDNA, 0,2 mM de dNTP’s, tampão da DNA

polimerase 10x (10mM Tris-HCl, 200mM de KCl, 50 mM (NH4)SO4, pH 8,3 a 25°C), 2

mM MgCl2, 10 pmoles de cada iniciador (forward: 5’-AGT TGT TAG TCT ACG TGG

ACC GAC A-3’; reverse: 5’-AAG ACA TTG ATG GCT TTT GA-3’) e 1 U de Taq DNA 20

Polimerase (Ludwig Biotecnologia, Brasil). O volume total de reação foi 25 L e as

condições de amplificação foram: uma etapa a 94 ºC por 1 min; 30 ciclos de

desnaturação a 94 ºC por 30 s, anelamento a 57 ºC por 30 s e extensão a 72 ºC por

30 s; etapa final a 72 ºC por 10 min.

Para visualização dos produtos da PCR, foi realizada a eletroforese em gel de 25

poliacrilamida 8%, sendo aplicados 8 L de cada amostra junto a 3 L de tampão de

amostra 6X (New England BioLabs, EUA), além de 5 L de padrão de massa

molecular de 100 pb (LowRanger 100 bp DNA Ladder – Norgen Biotek, Canadá) e 7

L de padrão de massa molecular de 50 pb (Ludwig Biotecnologia, Brasil) . A corrida

foi efetuada a 100 V em tampão tris-borato-EDTA (TBE – 89 mM Tris base; 89 mM 30

B(OH)3; 2 mM EDTA; pH 8,3), com duração de cerca de 3 h. Por fim, o gel foi

revelado por coloração com nitrato de prata, sendo ele imerso em 20 min em

41

solução fixadora (60% etanol e 0,3% ácido acético), 20 min em solução corante

(0,1% AgNO3) e, após lavagem com água destilada, mergulhado em solução

reveladora (3% NaOH e 0,1% formaldeído) até que fosse possível visualizar as

bandas.

Para quantificação do RNA viral, o cDNA foi diluído em série (10-1 a 10-5) e 5

amplificado por qPCR, cuja reação de volume final de 10 L continha: 2 L de cDNA,

10 pmoles de cada iniciador e 5 L de PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix

(Thermo Fisher Scientific, EUA). As condições da reação foram: 50 ºC por 2 min; 95

ºC por 2 min; 40 ciclos a 95 ºC por 30 s e 57 ºC por 30 s. Ao final da reação, as

amostras foram aquecidas gradualmente, de 57 ºC a 93 ºC, para a construção das 10

curvas melting. Os gráficos, curvas melting e valores de cycle quantification (Cq)

foram gerados automaticamente pelo equipamento Eco™ Real-Time PCR System

(Illumina, EUA).

42

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1) Caracterização da sDC-SIGN1A tipo III através de análises in silico

A sequência de nucleotídeos que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo

III e sua sequência de aminoácidos foram obtidas pelo GenBank e estão

apresentadas abaixo (Figura 10). 5

Figura 10: Sequência gênica e proteica da isoforma sDC-SIGN1A tipo III. A) Sequência do cDNA do sDC-SIGN1A tipo III gerado a partir do splicing alternativo do gene CD209. B) Sequência de aminoácidos da isoforma sDC-SIGN1A tipo III

10

Uma análise de bioinformática foi realizada utilizando os softwares

ProtParam, PSORT, ScanProsite, YinOYang, NetNGlyc e SignalP, o que possibilitou

determinar algumas características da proteína que seriam relevantes para os

experimentos in vitro realizados posteriormente.

Através da análise do programa ProtParam, foi verificado que a sDC-SIGN1A 15

tipo III é composta por 268 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 30,4

kDa e ponto isoelétrico (pI) teórico de 5,13. O grau de hidropaticidade calculado foi

de -0,693, indicando que a sequência possui um caráter hidrofílico, que seria de uma

proteína solúvel. Além disso, conforme análise pelo software PSORT, a localização

mais provável da proteína seria no citoplasma. Uma vez que a isoforma do DC-SIGN 20

em estudo é considerada solúvel por não possuir o domínio transmembrana, cujo

43

éxon codificante é eliminado no processo de splicing alternativo do seu pré-RNAm, o

resultado da análise pelo PSORT era esperado (MUMMIDI et al., 2001).

Com relação à estrutura da proteína em estudo, o ScanProsite indicou que

esta possui um domínio de lectina do tipo C entre os resíduos 127 e 242. Este

resultado era esperado, uma vez que o DC-SIGN é considerado um receptor de 5

lectina do tipo C (GEIJTENBEEK et al., 2000b). Além disso, foram indicadas duas

possíveis pontes dissulfeto envolvendo os resíduos 148-241 e 220-233. Essas

pontes provavelmente fazem parte do domínio de lectina do tipo C, uma vez que

esses resíduos estão compreendidos dentro da sequência deste domínio e também

porque quatro cisteínas são consideradas os resíduos mais conservados em 10

domínios proteicos desse tipo, formando dois loops em sua estrutura secundária, os

quais estão presentes na região envolvida com a ligação a carboidratos Ca2+-

dependente (ZELENSKY E GREADY, 2005).

Os programas YinOYang e NetNGlyc indicaram possíveis sítios de

glicosilação na sequência de aminoácidos da isoforma sDC-SIGN1A tipo III. 15

Especificamente, 6 possíveis sítios de O-glicosilação foram detectados pelo

YinOYang, sendo três deles com score de menor força (+) e um de maior força

(+++), conforme indicado na Figura 11A, onde os possíveis sítios possuem valores

de potencial (picos em verde) acima do limiar (linha em azul). Também foi detectado

um provável sítio de N-glicosilação pelo NetNGlyc (score de força +++; Figura 11B). 20

No entanto, essa modificação pós-traducional provavelmente não ocorreria in vivo,

uma vez que é improvável que a proteína seja exposta à maquinaria de N-

glicosilação da célula eucariótica devido à ausência do peptídeo sinal, resultado

indicado pelo software SignalP (Figura 11C). Na ausência do peptídeo sinal, a

proteína, que é sintetizada pelos ribossomos no citoplasma, não é reconhecida por 25

uma partícula de reconhecimento de sinal (SRP –signal recognition particle), etapa

inicial do endereçamento de proteínas SRP-dependente para o retículo

endoplasmático, e, consequentemente, não é transportada para este compartimento

celular, local onde ocorre o processo de N-glicosilação (KEENAN et al., 2001).

30

44

Figura 11: Predições de glicosilações e peptídeo sinal. A) Seis possíveis sítios de O-glicosilação foram detectados pelo software YinOYang, sendo eles nos resíduos 2 (+), 17 (++), 22 (++), 24 (+), 172 (+) e 262 (+++). A força do score é classificada qualitativamente em +, ++, +++ ou ++++. B) O software NetNGlyc 5 detectou um potencial sítio de N-glicosilação, localizado no resíduo 36 (+++). C) A predição de peptídeo sinal pelo software SignalP não detectou um peptídeo sinal na sequência analisada, conforme indicado pela ausência de valores de score acima do limiar (linha tracejada em roxo). 10

45

4.2) Expressão e purificação da sDC-SIGN1A tipo III

Após a obtenção de bactérias eletrocompetentes e sua transformação com o

vetor de expressão contendo o gene que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo

III, o DNA plasmidial foi extraído a fim de amplificar o estoque do vetor de

expressão. A leitura por espectrofotometria do produto de miniprep apresentou 5

valores das razões (260/280 e 260/230) próximos de 2,00, sendo considerada como

uma amostra pura (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Além disso, não foi observada

qualquer alteração na sequência de nucleotídeos, conforme análise do

eletroferograma do sequenciamento e do alinhamento da sequência obtida com a

sequência referência do vetor de expressão (Figura 12). Ademais, anterior ao códon 10

de parada da tradução (TAA, destacado no quadrado em verde na Figura 12),

podem ser observados os nucleotídeos correspondentes à cauda de histidina (CAT

CAC CAC CAC CAT CAT, destacados no quadrado em azul na Figura 12),

constituída de 6 resíduos deste aminoácido, adicionada à sequência como estratégia

para a realização das etapas posteriores de imunodetecção e purificação da 15

proteína recombinante.

46

Figura 12: Alinhamento da sequência proveniente do sequenciamento do produto de miniprep. As sequências do plasmídeo fornecida pela empresa (pJ414), do produto de miniprep (seq_miniprep) e da sDC-SIGN1A tipo III acrescida dos nucleotídeos referentes à cauda de histidina (gene_sDC-SIGN1A_III) foram 5 alinhadas. Nenhuma alteração na sequência foi observada. As sequências da cauda de histidina e do códon de parada da tradução foram destacadas nos quadrados azul e verde, respectivamente. O alinhamento foi realizado pelo software MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/).

10

Uma vez que a sequência estava correta, foi realizada a expressão da

proteína recombinante. Inicialmente, foram realizadas duas expressões “piloto” em

pequena escala, sendo uma a 37 ºC por 4 h e outra a 18 ºC por 18 h, para analisar

qual temperatura seria mais adequada para a produção da proteína. Para confirmar

a expressão, foi feito um gel SDS-PAGE 15% (Figura 13A) e a imunodetecção por 15

Western blot (Figura 13B), onde foram aplicadas as amostras coletadas nos tempos

0 (não-induzido), 2 e 4 h de expressão a 37 ºC e nos tempos 0, 4 e 18 h de

expressão a 18 ºC.

47

Foi possível observar no SDS-PAGE (Figura 13A) o aparecimento de uma

banda de massa molecular compatível com a análise in silico (30,4 kDa) nos tempos

intermediários (2 e 4 h) e finais (4 e 18 h) de expressão. Isso indica que, em ambas

as condições testadas, a proteína estava sendo mais expressa em relação às outras

proteínas constitutivas da célula bacteriana, que mantiveram o mesmo nível de 5

produção nos tempos analisados.

Utilizando a estratégia de fusão da cauda de histidina à proteína

recombinante, foi possível realizar a confirmação da expressão da sDC-SIGN1A tipo

III através da sua imunodetecção utilizando anticorpos anti-histidina. Isso pode ser

visualizado na Figura 13B, onde houve a revelação de uma banda na altura 10

esperada (30,4 kDa) em ambas as condições de expressão avaliadas.

48

Figura 13: Análise da expressão da sDC-SIGN1A tipo III recombinante. A) Gel SDS-PAGE 15% corado por Coomassie blue: 1 – padrão de proteínas; 2 e 5 – lisado celular antes da indução da expressão por IPTG 0,5 mM; 3 e 4 – lisado após 2 e 4 h de expressão a 37 ºC, respectivamente; 6 e 7 – lisado após 4 e 18 h de expressão a 5 18 ºC, respectivamente. B) Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose: 1 – padrão de proteínas; 2 – controle positivo (proteína Mug, de Corynebacterium pseudotuberculosis, com massa molecular de 25 kDa); 3 e 6 – lisado celular antes da indução da expressão por IPTG; 4 e 5 – lisado após 2 e 4 h de expressão a 37 ºC, respectivamente; 7 e 8 – lisado após 4 e 18 h de expressão a 10 18 ºC, respectivamente. Indicações de massa molecular em kDa.

49

A produção de proteínas pode ser realizada utilizando diversos organismos,

como bactérias, leveduras, fungos filamentosos, células de mamíferos e vegetais,

entre outros (DEMAIN e VAISHNAV, 2009). Entre estes sistemas, a produção de

uma proteína eucariótica utilizando um organismo procarioto apresenta uma

desvantagem, que é a incapacidade de grande parte das bactérias realizarem 5

glicosilação, uma modificação pós-traducional comum em proteínas eucarióticas,

devido à ausência da maquinaria de pós-tradução necessária para esse processo.

Consequentemente, a produção de proteínas glicosiladas utilizando um organismo

procarioto pode não ser adequada (SAHDEV et al., 2008). Assim, a produção em E.

coli é preferencial quando a proteína de interesse não é glicosilada. Porém, há 10

alguns anos, Wacker e colaboradores (2002) realizaram a descoberta de um sistema

de N-glicosilação em Campylobacter jejuni e a sua transferência com êxito para E.

coli. Ainda que os glicanos sejam diferentes daqueles encontrados em eucariotos,

esse avanço pode representar um importante marco na produção de proteínas

recombinantes. Desta forma, linhagens mutantes E. coli podem vir a ser utilizadas 15

na produção de proteínas glicosiladas para aplicações na pesquisa e indústria

(CHEN, 2012).

Apesar de sistemas eucariotos serem a alternativa mais apropriada para

contornar esse problema, leveduras, fungos filamentosos e células de insetos, por

exemplo, são geneticamente incapazes de realizar glicosilações como as células de 20

mamíferos. Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) são capazes de mimetizar

a glicosilação humana, no entanto, esse processo tem um custo elevado e as

glicoproteínas produzidas não possuem exatamente o mesmo padrão de

glicosilação humana (DEMAIN e VAISHNAV, 2009). Isso ocorre, por exemplo,

devido às células CHO apresentarem menor taxa de sialilação de proteínas quando 25

comparada com células humanas, a utilização de ácido N-glicosilneuramínico, que é

uma forma de ácido siálico não encontrado em células humanas, entre outras

diferenças (BROOKS, 2006).

A bactéria E. coli é uma importante opção utilizada, geralmente, para a

produção de pequenas proteínas, até 30 kDa, enquanto as maiores são expressas 30

em organismos eucariotos (DEMAIN e VAISHNAV, 2009). O uso desse

microrganismo como maquinaria para a produção de proteínas recombinantes

apresenta diversas vantagens, como rápido crescimento celular a partir de

50

substratos de baixo custo, genoma bem conhecido, alto nível de expressão, entre

outras (SAHDEV et al., 2008; ROSANO e CECCARELLI, 2014). Além disso, outros

estudos envolvendo o DC-SIGN foram desenvolvidos utilizando E. coli como sistema

de expressão heteróloga, obtendo-se proteínas plenamente funcionais (KWON et al.,

2002; HALARY et al., 2002; NAVARRO-SANCHEZ et al., 2003; HIJAZI et al., 2011; 5

PLAZOLLES et al., 2011). Por isso, esse microorganismo foi selecionado para a

produção recombinante neste trabalho.

Em contraste com o alto rendimento de expressão em E. coli, a formação de

corpos de inclusão é um problema que surge frequentemente durante a super

expressão de genes heterólogos utilizando esse organismo, onde as proteínas-alvo 10

formam agregados insolúveis no citoplasma da célula bacteriana (DE GROOT et al.,

2008). Uma vez que a proteína também foi produzida na menor temperatura testada

(18 ºC, por 18 h), as expressões subsequentes foram realizadas nessa condição, a

fim de minimizar a formação de corpos de inclusão (MAKRIDES, 1996). Altas

temperaturas provavelmente favorecem a formação de interações intermoleculares 15

em detrimento das interações intramoleculares, promovendo a formação de

agregados proteicos estáveis (DE GROOT e VENTURA, 2006). Em temperaturas

mais baixas e um maior tempo de expressão, esperava-se que ocorresse a redução

da formação de corpos de inclusão, permitindo a expressão da proteína

recombinante de forma solúvel no citoplasma. Para avaliar essa possibilidade, as 20

células foram lisadas por ciclos de congelamento/descongelamento e sonicação

após a expressão e, em seguida, o debri celular (pellet) foi separado do lisado

(sobrenadante) por centrifugação e ambos analisados por SDS-PAGE (Figura 14A)

e Western blot (Figura 14B).

25

51

Figura 14: Análise da solubilidade da proteína recombinante expressa a 18 ºC por 18 h. A) Gel SDS-PAGE 15% corado por Coomassie blue e B) Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose. Em ambas as Figuras: 1 – extrato celular antes da indução da expressão por IPTG; 2 – extrato celular após 18 h de 5 expressão; 3 – padrão de proteínas; 4 – lisado celular (sobrenadante); 5 – debri celular (pellet). Indicações de peso molecular em kDa.

Foi observado que a maior parte da proteína produzida não se encontrava

solúvel no citoplasma, ou seja, possivelmente estavam em corpos de inclusão. A 10

formação destes corpos pode ocorrer por diversas causas, como o alto nível de

expressão em relação às proteínas nativas, produção de proteínas contendo pontes

dissulfeto ou proteínas altamente hidrofóbicas, entre outras (ROSANO e

CECCARELLI, 2014). Para a recuperação de proteínas funcionais a partir desses

depósitos, é necessário promover a sua solubilização utilizando agentes 15

52

desnaturantes, a remoção deste agente para renovelar as proteínas e, por fim, a

purificação dessas proteínas solubilizadas (SINGH e PANDA, 2005). Por isso, o

extrato celular foi ressuspendido em tampão de ligação da coluna contendo 5M de

ureia, com o objetivo de solubilizar as proteínas presentes nos corpos de inclusão.

Sabendo-se que a proteína recombinante estava sendo produzida sob a 5

forma de corpos de inclusão, foi realizada a expressão utilizando um maior volume

de cultura para obter quantidades suficientes da proteína que permitiria a sua

purificação. Após o período de indução da expressão, as células foram lisadas em

um tampão de ligação da coluna cromatográfica contendo ureia como agente

desnaturante. 10

A presença de ureia no gel de SDS-PAGE ou o excesso de sais na amostra

pode alterar a mobilidade eletroforética das proteínas no gel (FONTES et al., 1984;

PORTER et al., 2015). Como as amostras foram ressuspendidas em um tampão

contendo uma alta concentração de ureia (5 M), a separação das proteínas pelo

SDS-PAGE pode ter sido afetada, não sendo possível realizar uma análise 15

adequada por este método. Assim, a expressão em larga escala foi analisada

somente por Western blot (Figura 15).

Figura 15: Expressão em larga escala da sDC-SIGN1A tipo III recombinante. 20 Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose. 1 – padrão de proteínas; 2 – extrato celular após 18 h de expressão; 3 – extrato celular antes da indução da expressão por IPTG; 4 – debri celular (pellet); 5 – lisado celular (sobrenadante) ressuspendido em tampão de ligação contendo 5 M de ureia. Indicações de peso molecular em kDa. 25

53

A expressão da proteína também foi confirmada utilizando um maior volume

de cultura, como pode ser observado pelo aparecimento de uma banda no tamanho

esperado após o período de expressão. Além disso, uma banda forte foi observada

na canaleta da amostra coletada antes da indução por IPTG (Figura 15, canaleta 3).

Isto pode ter ocorrido devido ao maior número de células presentes na cultura nesse 5

momento em relação à expressão em pequena escala, evidenciando mais a

expressão basal das proteínas desse organismo. Ademais, a proteína se encontrava

solúvel no tampão de ligação contendo ureia, conforme demonstrado pelo

aparecimento de uma banda na canaleta correspondente a essa amostra.

A partir da obtenção da proteína solúvel, foi possível realizar a sua 10

purificação. Esta etapa foi feita por cromatografia de afinidade por íons metálicos

(IMAC – Immobilized Metal Affinity Chromatography), onde se utiliza uma coluna

constituída frequentemente por um suporte baseado em uma matriz de gel, como

agarose, celulose ou outros polissacarídeos, e um grupo quelante coordenado com

um íon metálico divalente, como níquel ou cobalto, para purificação de proteínas 15

com cauda de histidina (CHEUNG et al., 2012). O mecanismo de adsorção de

proteínas com cauda de histidina se baseia na interação entre o íon metálico

imobilizado pelo ligante (tri- tetra- ou pentadentado) e os resíduos de histidina, onde

ocorre a coordenação entre o metal e os anéis imidazólicos desses resíduos, que

desempenham o papel de doadores de elétrons para a formação dessa ligação 20

(BLOCK et al., 2009).

Como a proteína foi solubilizada a partir de corpos de inclusão utilizando

ureia, seria necessária a sua remoção para que a proteína atingisse a sua

conformação nativa e funcional. Para isto, durante o processo de purificação, a

proteína foi lavada com tampões com concentrações decrescentes de ureia 25

consecutivamente até que ela fosse totalmente removida. Esse método, também

chamado de protein folding liquid chromatography, permite o enovelamento gradual

da proteína até atingir a sua conformação nativa ainda ligada à coluna (WANG et al.,

2014). Por fim, as eluições foram coletas e analisadas por SDS-PAGE e Western

blot para avaliar o sucesso da purificação e a pureza das amostras obtidas (Figura 30

16).

54

Figura 16: Purificação da proteína sDC-SIGN1A tipo III recombinante. A) Gel SDS-PAGE 15% corado por Coomassie blue e B) Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose. Em ambas as Figuras: 1 – extrato celular após 18 h de expressão; 2 – padrão de proteínas; 3-10 – eluições da proteína purificada. 5 Indicações de peso molecular em kDa.

A presença de bandas na altura esperada de 30,4 kDa foi observada em 7

eluições coletadas (Figura 16, canaletas 4 a 10) tanto na eletroforese como na

imunodetecção, indicando que a proteína foi purificada com êxito. As proteínas 10

foram dosadas pelo método de Bradford e as alíquotas apresentaram um total de

1,09 mg de proteínas em 10 mL de tampão de eluição, quantidade considerada

suficiente para a realização dos testes posteriores. Com isso, ensaios in vitro

poderiam ser realizados para avaliar se esta isoforma solúvel do DC-SIGN exerce

alguma influência sobre a capacidade de infecção do DENV em células humanas. 15

55

4.3) Multiplicação e quantificação de DENV-2

Para a realização de ensaios virais utilizando a sDC-SIGN1A tipo III

recombinante produzida neste trabalho, foi necessária a obtenção de amostras de

DENV-2 titulado para a sua utilização nestes testes. O vírus foi produzido em células

de insetos, cuja infecção pôde ser acompanhada observando-se o ECP que essas 5

células apresentam devido à multiplicação viral.

O ECP pôde ser notado, inicialmente, a partir do 3º dia de infecção, sendo

proeminente no 5º dia, como pode ser observado na Figura 17. Apesar de produzir

partículas virais contendo uma grande quantidade de prM, que pode prejudicar a

taxa de infecção viral, a linhagem C6/36 de A. albopictus é amplamente utilizada 10

para produção de DENV, sendo inclusive utilizada no diagnóstico clínico (JUNJHON

et al., 2008; JARMAN et al., 2011; RICHTER et al., 2014).

Figura 17: Multiplicação de DENV-2 em células C6/36 de Aedes albopictus. Microscopia óptica de monocamada de células C6/36 controle não infectada (A) e 15 infectada após o 5º dia de infecção com MOI de 0,01 (B). Como indicado pelas setas vermelhas, o ECP, como sincícios e vacuolizações, também pode ser visto em todo o campo de visão das células infectadas. Aumento de 100X.

Após a multiplicação do DENV-2, a titulação viral foi feita pelo ensaio de 20

TCID50. A Figura 18 ilustra a realização deste ensaio, que é baseado na visualização

de ECP em células BHK-21 gerado pela infecção do DENV-2, em sucessivas

diluições seriadas da amostra viral. A partir deste ensaio, as amostras de DENV-2

56

produzidas apresentaram um título de 1,6 x 106 TCID50/mL, em volume suficiente

para a realização dos ensaios funcionais com a proteína recombinante também

produzida nesse trabalho.

5

Figura 18: Titulação de DENV-2 por TCID50 em células BHK-21. Microscopia óptica de monocamada de células BHK-21 controle não infectado (A), controle viral (B) e amostra na diluição 10-2 (C) após o 5º dia de infecção. Setas azus indicam o ECP, como sincícios e vacuolizações causados pela multiplicação do DENV. Aumento de 40X. 10

Diversos ensaios para titulação de DENV já foram desenvolvidos, como os

ensaios de formação de placas e de TCID50, e também testes modernos baseados

em métodos imunoenzimáticos e imunoflurescentes. Embora o ensaio de TCID50

apresente algumas desvantagens, como a ausência de ECP durante a infecção de 15

alguns isolados clínicos de DENV e ser uma técnica trabalhosa e demorada, é um

método confiável e considerado “padrão ouro” para a titulação de DENV (LI et al.,

2011).

Além da titulação pelo ensaio de TCID50, a carga viral também seria

quantificada por qPCR. Esta técnica molecular altamente sensível permite detectar e 20

quantificar o RNA viral de diversas amostras, sendo que já é utilizada atualmente

tanto para objetivos clínicos como na rotina laboratorial (CONCEIÇÃO et al., 2010).

Para a construção da curva padrão e quantificação do RNA viral, inicialmente,

o RNA de uma amostra viral produzida neste trabalho foi extraído, quantificado por

espectrofotometria e o cDNA foi produzido por RT-PCR. Em seguida, o cDNA foi 25

diluído (1:10, 1:50 e 1:100), amplificado por PCR convencional e os produtos foram

visualizados por PAGE (Figura 19).

57

Figura 19: Análise de produtos de PCR por PAGE. Gel de PAGE corado por prata: 1 e 7 – padrões de massa molecular de 50 e 100 pb, respectivamente; 2 a 5 – amplificações de cDNA, sendo (2) amostra não diluída, (3) diluições 1:10, (4) 1:50 e (5) 1:100; 6 – controle negativo (sem adição de cDNA). 5

A partir dos iniciadores utilizados neste trabalho, a produção de um fragmento

de 251 pb era esperada (Yong et al., 2007). No entanto, a análise por PAGE

mostrou que o fragmento esperado possivelmente não foi produzido, uma vez que

duas bandas evidentes de aproximadamente 300 pb foram observadas. Além disso, 10

a amplificação de produtos inespecíficos pela PCR também foi detectada, devido ao

aparecimento de bandas em diferentes alturas no gel.

Mesmo com os resultados inesperados na amplificação por PCR, a qPCR foi

realizada, pois a construção da curva melting poderia contribuir para o

esclarecimento de que o fragmento visualizado por PAGE teria sido gerado por 15

amplificação inespecífica ou apenas por um padrão atípico de migração no gel,

devido à alguma condição inadequada na corrida do mesmo.

Assim, a amostra de cDNA, utilizada anteriormente por PCR, foi novamente

diluída (10-1 a 10-5) e submetida a qPCR, utilizando o fluoróforo SYBR® Green I

(Figura 20). Este marcador fluorescente se liga a moléculas de ácido nucleico, 20

emitindo fluorescência majoritariamente quando ligado a uma molécula de dupla fita

de DNA (ZIPPER et al., 2004). Devido a esta propriedade, o SYBR Green I é

utilizado na análise de curva melting em conjunto com qPCR, uma vez que permite o

58

monitoramento da estabilidade da dupla fita de DNA à medida que a temperatura da

solução é aumentada. Desta forma, diferentes produtos de PCR podem ser

distinguidos pela análise de variações na temperatura de dissociação (melting

temperature) (WITTWER, 2009).

5

Figura 20: Análise de qPCR para quantificação de RNA viral. Curvas de amplificação (A) e melting (B) geradas a partir do resultado da amplificação das amostras de cDNA por qPCR.

Como pode ser observado na Figura 20A, a amplificação de todas as 10

amostras de cDNA testadas (diluições 10-1 a 10-5) foi observada. No entanto, a

análise da curva melting indicou a presença de diversos produtos inespecíficos,

devido à presença de picos de fluorescência em diferentes temperaturas. Inúmeras

variações na RT-PCR, PCR convencional e qPCR foram realizadas, como a

concentração de ácido nucleico, concentração dos reagentes, temperatura e 15

duração dos ciclos de amplificação, entre outras (dados não mostrados). No entanto,

não foi possível obter uma condição ideal para a realização da qPCR e,

consequentemente, da quantificação de RNA viral por esta técnica.

Uma hipótese para o problema encontrado pode ser relacionada aos

iniciadores utilizados neste trabalho. Apesar de que as condições da reação e o 20

preparo do material genético possam influenciar uma PCR, é essencial a utilização

de um par de iniciadores adequados. A sua especificidade é essencial e a

possibilidade de mutações, como polimorfismos de nucleotídeo único na sequência-

alvo deve ser ponderada. Por isso, essas regiões devem ser evitadas, buscando a

amplificação a partir de regiões conservadas no genoma de interesse (YE et al., 25

59

2012). Embora os iniciadores desse trabalho amplifiquem um fragmento do DENV-2

a partir de regiões conservadas em seu genoma, a possibilidade de variação da

região alvo por diferenças genotípicas entre a linhagem amplificada e aquelas

usadas no desenho dos iniciadores não deve ser desconsiderada (YONG et al.,

2007). Assim, a realização de novos testes, como o sequenciamento do cDNA 5

produzido e o alinhamento da sequência obtida com os iniciadores, a obtenção de

outros iniciadores ou ainda novas condições de reação, serão necessários para

avaliar esta hipótese.

4.4) Ensaios funcionais 10

Com o objetivo de avaliar uma possível alteração da isoforma sDC-SIGN1A

tipo III sobre o processo de infecção do DENV, ensaios funcionais foram realizados

para avaliar essa hipótese. Para isto, dois tipos celulares que possuem importância

na patogênese da dengue foram utilizados, os monócitos e macrófagos (DURBIN et

al., 2008; KOU et al., 2008; BLACKLEY et al., 2007; KYLE et al., 2007; BALSITIS et 15

al., 2009). A linhagem monocítica THP-1 foi utilizada, tanto nos ensaios funcionais

em si, como também para a sua diferenciação em macrófagos a partir da sua

estimulação com PMA. Assim, células THP-1 foram cultivadas na presença de PMA

(100 ng/mL) durante 48 h para a diferenciação em macrófagos, seguida de uma fase

repouso na ausência de PMA por 24 h (Figura 21). 20

60

Figura 21: Diferenciação de macrófagos a partir da linhagem monocítica THP-1. Microscopia óptica de células THP-1 (A e B) e macrófagos diferenciados após estimulação com PMA (C e D). Aumento de 40 (A e C) e 200X (B e D).

5

Após a estimulação das células THP-1 com PMA, o sobrenadante de cultura

foi coletado e realizado a contagem de células em câmara de Neubauer. No entanto,

não foi possível realizar a contagem devido à ausência de células na amostra

coletada, nem mesmo quando sobrenadante foi concentrado por centrifugação, tanto

após a estimulação inicial com PMA, como após a fase de repouso (dados não 10

mostrados). Isso indica que, virtualmente, todas as células se tornaram aderentes, o

que era esperado com a diferenciação em macrófagos. As células também foram

analisadas por microscopia e elas apresentaram diferenças morfológicas marcantes,

quando comparadas antes (Figura 21 A e B) e após a sua estimulação com PMA

(Figura 21 C e D). 15

A diferenciação da linhagem monocítica humana THP-1 em macrófagos

através da estimulação por PMA é bem estabelecida e utilizada em diversos estudos

como alternativa ao cultivo primário dessas células (SCHWENDE et al., 1996; PARK

61

et al., 2007). O tratamento de células THP-1 com PMA promove a ativação da

proteína quinase C, induzindo a aderência e a expressão de marcadores de

superfícies relacionados com a diferenciação dessa linhagem em macrófagos

(SCHWENDE et al., 1996). Além disso, algumas características morfológicas são

associadas a essa diferenciação, como a expansão citoplasmática e de organelas, 5

como mitocôndrias e lisossomos. O tratamento da linhagem THP-1 com PMA

seguido de um período de cultivo na ausência desse agente também é importante,

uma vez que direciona as células obtidas para um fenótipo mais próximo ao

observado em macrófagos derivados de monócitos ex vivo (DAIGNEAULT et al.,

2010). Assim, a partir do conjunto de dados obtidos, foi considerado que as células 10

THP-1 se diferenciaram em macrófagos, permitindo a sua utilização nos ensaios

funcionais com sDC-SIGN1A tipo III.

As células THP-1 e macrófagos derivados dessa linhagem foram incubados

com o DENV (MOI = 1) na presença da proteína recombinante em diferentes

concentrações, sendo elas: 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 ng/mL. Após 15

o período de incubação, o sobrenadante foi coletado e a carga viral foi avaliada pelo

ensaio de TCID50. Entretanto, o ECP não foi observado em nenhum dos

sobrenadantes testados, tanto aqueles referentes às amostras (infecção viral na

presença da proteína recombinante) como aos controles de infecção (infecção viral

na ausência da proteína recombinante) dos ensaios funcionais. Como pode ser 20

observada na Figura 22, no 7º dia do ensaio de TCID50, a monocamada de células

BHK-21 ainda era observada, mas predominava-se um grande número de células

mortas, que possuem morfologia esférica, de forma similar na amostra testada e no

controle não infectado. Desta forma, a morte das células no ensaio de TCID50 não foi

atribuída à infecção viral, como pode ser observada na Figura 18, mas sim ao longo 25

período de cultura dessas células neste procedimento.

62

Figura 22: Avaliação da carga viral pelo ensaio de TCID50. Microscopia óptica de monocamada de células BHK-21 controle não infectado (A) e amostra referente ao controle de infecção dos ensaios funcionais (B) no 7º dia de infecção. Aumento de 100X. 5

Uma hipótese que pode explicar a não detecção da carga viral pelo ensaio de

TCID50 é a baixa susceptibilidade de infecção de monócitos e macrófagos. Embora

essas células possuam grande relevância na dengue, devido à produção de

citocinas inflamatórias e a maior capacidade de infecção devido ao ADE, elas 10

apresentam uma infecção baixa na ausência de anticorpos subneutralizantes

(SCHMID et al., 2014). Segundo Kou e colaboradores (2008), a infecção do DENV

em monócitos é ineficiente, sendo detectada a infecção em apenas 3,5% dessas

células, mesmo utilizando uma MOI alta (5) durante um período de cultura de 2 dias.

Outros autores também encontraram resultados semelhantes. Wu e colaboradores 15

(2000) observaram que apenas 1-2% de macrófagos eram infectados após a sua

exposição ao DENV em uma MOI de 0,2, sendo que em uma MOI 10 vezes maior,

apenas 5% dos macrófagos foram infectados. Blackley e colaboradores (2007)

encontraram uma taxa de infecção ainda menor em macrófagos esplênicos, sendo

que apenas cerca de 0,77% das células são infectadas, enquanto na presença de 20

anticorpos neutralizantes este valor foi de 5,41%.

A baixa capacidade de infecção dessas células pode ser devido à ausência

ou baixa expressão de receptores cognatos do DENV, como o DC-SIGN, nessas

células (KOU et al., 2008; DURBIN et al., 2008; SCHMID et al., 2014). Isso foi

evidenciado por Tassaneetrithep e colaboradores (2003), onde observaram que 25

menos de 5% de monócitos da linhagem THP-1 foram infectados pelo DENV após

63

48 h de exposição ao vírus em uma MOI de 1. Porém, utilizando uma linhagem de

THP-1 transfectada para a expressão de DC-SIGN, a infecção foi de

aproximadamente 80% das células no mesmo período e carga viral testada

inicialmente.

Em um dos poucos estudos sobre as isoformas solúveis do DC-SIGN e seu 5

envolvimento em infecções virais, Plazolles e colaboradores (2011) analisaram o

efeito de uma isoforma solúvel do DC-SIGN (sDC-SIGN1A tipo I) na infecção do

CMV em iDC. Foi observado que essa proteína era capaz de promover um aumento

da infecção nessas células em uma concentração ótima de 50 ng/mL.

Concentrações acima de 100 ng/mL e abaixo de 50 ng/mL não alteraram a taxa de 10

infecção de iDC. Isso levou aos autores proporem um modelo hipotético onde altas

concentrações do sDC-SIGN poderia impedir a internalização viral pela célula

hospedeira, enquanto em uma determinada faixa de concentrações mais baixas

(entre 100 e 10 ng/mL), a proteína contribuiria com a internalização do maior número

de vírions. Já em concentrações muito baixas (abaixo de 10 ng/mL), a influência do 15

sDC-SIGN seria quase nula e o nível de infecção seria semelhante àquele na

ausência dessa proteína. No entanto, detalhes sobre essa possível e complexa

função do sDC-SIGN precisam ser melhor investigados.

O modelo proposto por Plazolles e colaboradores (2011) sugere algumas

hipóteses que possam explicar a capacidade de aumento da infecção viral pelo sDC-20

SIGN. Uma delas seria a existência de um ou mais receptores, ainda

desconhecidos, para a internalização das partículas virais associadas ao sDC-SIGN.

Além disso, sabe-se que o domínio de pescoço do DC-SIGN é essencial para a sua

tetramerização, que, por sua vez, é fundamental para a interação plena com o seu

ligante (SNYDER et al., 2005; MENON et al., 2009). Com isso, outra hipótese 25

plausível seria a associação do sDC-SIGN, ou de vírions ligados a essa proteína,

com dímeros ou trímeros de mDC-SIGN pré-existentes na membrana da célula

hospedeira, facilitando a internalização das partículas virais (PLAZOLES et al.,

2011).

É importante ressaltar que no trabalho desenvolvido por Plazolles e 30

colaboradores (2011), embora o aumento na taxa de infecção do CMV em iDC tenha

sido tenha sido significante, a taxa de de células infectadas foi aproximadamente

duas vezes maior que o controle de infecção, 33,1±6% e 14,8±7,2%,

64

respectivamente. Então, considerando que as linhagens celulares utilizadas neste

trabalho apresentam uma baixa taxa de infecção pelo DENV, possivelmente abaixo

de 5%, em uma situação hipotética onde a sDC-SIGN1A tipo III aumentaria a

infecção do DENV nas células testadas em duas vezes, a taxa de infecção ainda

seria baixa. Assim, mesmo com essa elevação da infecção, a carga viral produzida 5

poderia não ser detectada no ensaio de TCID50. Com isso, torna-se necessária a

realização de novos testes utilizando linhagens mais susceptíveis à infecção pelo

DENV, como iDCs e mDCs, e também a padronização da qPCR, pois a associação

desta técnica mais sensível com a titulação por TCID50, proporcionará maior

confiança nos resultados obtidos neste trabalho. 10

Estudos a respeito das isoformas solúveis do DC-SIGN e seu envolvimento

em infecções de outros vírus foram publicados. Enquanto Biggins e colaboradores

(2007) mostraram que o ectodomínio do DC-SIGN era capaz de inibir a ligação de

HIV-1 às células 293T expressando a isoforma completa do DC-SIGN, Hijazi e

colaboradores (2011) demonstraram que em concentrações sub nanomolares este 15

ectodomínio aumentou a infecção do HIV em células PM1. Navarro-Sanchez e

colaboradores (2003) mostraram que o sDC-SIGN possui a capacidade de inibir a

infecção do DENV em iDC. Porém, a proteína que os autores avaliaram era

constituída somente do DRC, ou seja, uma parte do DC-SIGN. Assim, não foi

considerada uma suposta participação do restante da proteína no processo de 20

infecção viral.

Sabe-se que o domínio citoplasmático é importante no processo de

internalização do HIV (KWON et al., 2002; SMITH et al., 2007). Células expressando

uma forma truncada do DC-SIGN que perde sua cauda citoplasmática foram

susceptíveis à infecção pelo DENV, enquanto células expressando o receptor 25

completo produziram uma taxa de infecção muito maior (75%) que a forma truncada

(TASSANEETRITHEP et al., 2003). Então, semelhante ao que ocorre com o HIV,

embora esse domínio não seja completamente essencial para infecção do DENV,

sua presença parece contribuir favoravelmente para este processo.

Contudo, a maioria desses estudos foi realizada considerando a isoforma 30

completa do DC-SIGN e variantes com a presença ou ausência total da região de

pescoço. Uma vez que não foram avaliados os possíveis efeitos de outras isoformas

do sDC-SIGN sobre o processo de infecção do DENV, além de que a sDC-SIGN1A

65

tipo III perde parcialmente a região de pescoço (repetições 3 a 6), almeja-se obter

um melhor entendimento da função do DC-SIGN com este trabalho. Desta forma,

espera-se ampliar o conhecimento do processo de patogênese da dengue, bem

como avaliar uma possível estratégia de combate ao vírus por meio da alteração da

função desta proteína, objetivando a diminuição a multiplicação do vírus no 5

organismo humano.

66

5. CONCLUSÕES

A partir das análises in silico, foi possível analisar algumas características

estruturais e físico-químicas da sDC-SIGN1A tipo III, que foram úteis para a

avaliação da produção desta proteína por expressão heteróloga. Essas

análises indicaram que era uma proteína hidrofílica de peso molecular de 30,4 5

kDa, pI de 5,13, apresentava um domínio lectina do tipo C, sítios de O- e N-

glicosilação e não possuía peptídeo sinal;

A sDC-SIGN1A tipo III recombinante foi purificada com sucesso após sua

recuperação a partir de corpúsculos de inclusão, obtendo-se 1,09 mg da

proteína, quantidade considerada suficiente da proteína recombinante para a 10

realização dos ensaios funcionais;

O DENV-2 foi produzido e quantificado, apresentando título viral de 1x106

TCID50/mL;

A estimulação da linhagem monocítica THP-1 por PMA induziu a sua

diferenciação em macrófagos, evidenciada por alterações na adesão e 15

morfologia celular;

A carga viral nos ensaios funcionais da sDC-SIGN1A tipo III recombinante

não foi detectada por titulação possivelmente devido à baixa taxa de infecção

viral de monócitos e macrófagos.

20

6. PERSPECTIVAS

Padronizar a reação de qPCR para quantificar o DENV-2;

Diferenciar células THP-1 em células dendríticas imaturas (iDCs) e maduras

(mDCs), bem como confirmar o fenótipo destas células por citometria de fluxo

a partir da expressão de marcadores específicos; 25

Avaliar o efeito da sDC-SIGN1A tipo III no processo de infecção do DENV

através de ensaios funcionais em iDCs e mDCs.

67

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ … · utilizando a linhagem Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta, sendo analisada por SDS-PAGE e Western Blot. A proteína foi purificada