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Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós Graduação em Ciências Morfológicas Departamento de Anatomia
FATOR DE CRESCIMENTO DO TECIDO CONJUNTIVO (CTGF) PROMOVE AGREGAÇÃO, MIGRAÇÃO E
QUIMIOATRAÇÃO EM TERATOCARCINOMA EMBRIONÁRIO P19.
Dissertação de Mestrado
Diego Pinheiro Aguiar
Orientador: José Garcia Ribeiro Abreu Júnior
Rio de Janeiro – 2008
Livros Grátis
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Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo (CTGF) promove agregação, migração e quimioatração em teratocarcinoma embrionário P19.
Diego Pinheiro Aguiar Universidade Federal do Rio de Janeiro Programa de Pós Graduação em Ciências Morfológicas - Mestrado Orientador: Prof. Dr. José Garcia Ribeiro Abreu Jr.
UFRJ/ICB
2008
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Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo (CTGF) promove agregação, migração e quimioatração em teratocarcinoma embrionário P19.
Diego Pinheiro Aguiar
Dissertação de mestrado submetida ao corpo docente do Programa de Pós Graduação em Ciências Morfológicas. Universidade Federal do Rio de Janeiro- UFRJ, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de mestre.
Prof. Dr. José Garcia Ribeiro Abreu Jr – Orientador. Prof. Dr. Stevens Kastrup Rehen – Examinador. Prof. Dr. Marcelo Felippe Santiago – Examinador. Prof. Dr. Gilberto Weissmüller – Examinador. Profa. Dra. Helena Lobo Borges – Revisor a Suplente. Prof. Dr. Marcelo Einicker Lamas – Suplente.
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Rio de Janeiro 2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
Aguiar, Diego Pinheiro Fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) promove agregação,
migração e quimioatração em teratocarcinoma embrionário P19 / Diego Pinheiro Aguiar. – Rio de Janeiro: UFRJ / ICB, 2008.
xvi, 135f. : il. ; 31 cm. Orientador: José Garcia Ribeiro Abreu Júnior
Dissertação (mestrado) – UFRJ/ICB, Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2008.
Referências bibliográficas: f. 62-88 1. Movimento celular. 2. Aderência celular. 3. Teratocarcinoma – embriologia. 4. Proteínas quinases S6 ribossômicas 90-kDa. 5. Peptídeos e proteínas de sinalização intercelular. 6. Linhagem celular tumoral. 7. Camundongos. 8. Ciências Morfológicas – Tese. I. Abreu Júnior, José Garcia Ribeiro. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, ICB, Programa de Pós-Graduação Ciências Morfológicas. III. Título.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu Orientador e amigo José Garcia Ribeiro Abreu Jr. Por
esses quase cinco anos juntos na vida científica, no qual pude aprender muito
sobre a carreira científica. É uma grande honra e prazer ter participado da
construção do Laboratório de Embriologia de Vertebrados (LEV) e fazer parte
desse grupo. Obrigado pelos ensinamentos e por ter exigido o máximo de mim.
Aos amigos do Laboratório de Embriologia de Vertebrados que
participaram da minha formação, Marcos Pacheco, Karla Loureiro, Fábio
Mendes, Alice Helena e recentemente Débora Malta. Obrigado pelos debates
que enriqueceram a minha formação profissional e pessoal. Às meninas do
LEV, Mariana Louza e Nathália Amado.
Aos amigos do Laboratório de Morfogênese Celular (LMC), Professor
Vivaldo, Bruno, Rose, Luciana, Gisele, Sheila, Rossana, Ana e Nathan. Por
estar sempre dispostos a ajudar nas horas difíceis.
Aos amigos do Laboratório de Neurobiologia Celular (LNBC), Flávia
Gomes, Vivian, Joice, Tânia, Aline, Cristiane, Rômulo, Fernando, Juliana e
Ismael. Por terem colaborado com o meu crescimento profissional.
A Professora Helena Borges, pela excelente revisão. Aos membros da
banca, Professores Stevens Rehen, Marcelo Santiago e Gilberto Weissmuller.
Por contribuir com de maneira construtiva.
Agradeço à minha querida namorada Juliana Coelho, pela dedicação,
compreensão, amizade, carinho e apoio nessa caminhada.
7
Meu agradecimento especial à minha querida família que sempre me
apoiou, confiou em mim e sofreu junto em todos os momentos difíceis. Muito
obrigado meus pais, Lourenço Aguiar e Vera Lúcia Pinheiro, avós Maria Luiza e
José e meus queridíssimos irmãos, Tiago Aguiar e Ramon Aguiar. Um
muitíssimo obrigado sem vocês tudo isso seria muito difícil.
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Lista de abreviaturas
AR - Ácido Retinóico
ATCC - American Type Culture Collection
BMP - Proteína Morfogenética do Osso
CTGF - Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo
CYR61 - Rico em Cisteína 61
DMSO - Dimetil Sulfoxi
DNA - Ácido Desoxiribonucleico
ERK – Proteína Quinase Reguladora de Sinais Extracelulares
FN – Fibronectina
LN - Laminina
MAPK - Proteína Quinase Ativadora de Mitose
MEK - MAP-quinase-quinase-quinase
MSS - Meio Sem Soro
NOV - Nefroblastoma Superexpresso
P38 – Proteína de 38 kDa
PI3K - Fosfoinositol 3 quinase
PKB/Akt - Protína Quinase B
RAF - MAP-quinase-quinase
Ras - Proteína Moduladora de GTPase
RNA - Ácido Ribonucleico
RNAm - Ácido Ribonucléico mensageiro
SFB - Soro Fetal Bovino
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SIRNA - Pequeno RNA de interferência
TGF-beta - Fator de Crescimento Transformante - beta
WISP1 - Wnt-inducible signaling pathway protein-1
WISP2 - Wnt-inducible signaling pathway protein- 2
WISP3 - Wnt-inducible signaling pathway protei- 3
10
SUMÁRIO
Ficha Catalográfica...........................................................................................iii
Agradecimentos................................................................................................iv
Lista de abreviaturas........................................................................................vi
Índice de figuras..............................................................................................xii
Índice de tabelas.............................................................................................xiv
Resumo.............................................................................................................xv
Abstract...........................................................................................................xvi
1- INTRODUÇÃO
1.1 - Relevância da tese: porque estudar migração e adesão celular?........1
1.2 - Locomoção celular....................................................................................2
1.3 - Orientação dos movimentos celulares por moléculas
quimioatratoras..................................................................................................2
1.4 - Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo (CTGF) em processos
fisiológicos e patológicos.................................................................................3
1.5 - CTGF durante o desenvolvimento dos vertebrados..............................7
1.6 - A célula de teratocarcinoma embrionário P19 como modelo de
estudo.................................................................................................................8
1.7 - CTGF e as vias de sinalização ERK e P38 MAPK, e PKB/AKT............10
11
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral...........................................................................................14
2.2 - Objetivos específicos..............................................................................14
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Cultura de células....................................................................................15
3.2 - Método de contagem de células e análise estatística..........................15
3.3 - Manutenção, indução e purificação da proteína recombinante
CTGF.................................................................................................................16
3.4 - Tratamento das esferas com meio condicionado enriquecido com
CTGF recombinante.........................................................................................17
3.5 - Eletroforese e Imunodetecção...............................................................18
3.6 - Ensaio de Proliferação celular por incorporação de timidina tritiada
[3H].....................................................................................................................23
3.7 - Microscopia eletrônica de varredura.....................................................23
3.8 - Ensaio de migração e invasão celular...................................................24
3.9 - Protocolo de revestimento protéico das esferas de poliestireno......25
3.10 - Pinça óptica e medida do tempo característico de adesão...............25
4 - RESULTADOS
12
4.1 - Células P19 preferencialmente aderem e agregam-se a esferas de
agarose tratadas com CTGF recombinante..................................................27
4.2 – O número de células aderidas e próximas às esferas tratadas com
CTGF é significantemente maior....................................................................31
4.3 - Análise morfológica do fenômeno de agregação.................................33
4.4 - CTGF não induz proliferação durante o fenômeno de agregação......35
4.5 - CTGF age como fator quimioatrator para células de teratocarcinoma
embrionário P19...............................................................................................37
4.6 - A proteína CTGF é extremamente adesiva............................................41
4.7 - CTGF promove aumento na fosforilação de PKB/AKT e P38, mas não
de ERK..............................................................................................................46
4.8 - A quimioatração promovida pelo CTGF é dependente das vias de
MAPK e PKB/Akt..............................................................................................48
5 - DISCUSSÃO
5.1 - Desenvolvimento embrionário e migração...........................................53
5.2 - Migração, quimioatração e metástase tumoral.....................................54
5.3 - Hipótese de ativação da migração, quimioatração causada pelo
CTGF.................................................................................................................56
6 - CONCLUSÃO.........................................................................................60-61
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................62
13
ANEXO II
CCN2/CTGF-Modulated cell adhesion and chemoattraction in embryonal carcinoma cell. Diego P. Aguiar; Fábio A. Mendes; Leonardo R. Andrade; Bruno A. Pontes; Nathan B. Viana and José G. Abreu. ANEXO II Dynamic analysis of th expression of the TGF-β/SMAD2 pathway and CCN2/CTGF during early steps of tooth development. Marcos S, Pacheco; Alice H. dos Reis; Diego P. Aguiar; Karen M. Lyons and José G. Abreu.
14
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Domínios das proteínas pertencentes à família CCN..........................5
Figura 2. Via de Sinalização MAPK e PKB/Akt.................................................13
Figura 3. Imunodetecção contra o epítopo Flag da proteína recombinante
CTGF.................................................................................................................17
Figura 4. Imunodetecção contra o epítopo (Flag) presente na proteína CTGF
ligada às esferas de agarose após a incubação com o meio
condicionado......................................................................................................18
Figura 5. Representação esquemática da esfera de agarose..........................29
Figura 6. Células P19 preferencialmente aderem e agregam-se às bilhas de
agarose tratadas com CTGF recombinante.......................................................30
Figura 7. Gráfico do número de células P19 aderidas às esferas tratadas ou
não com CTGF..................................................................................................32
Figura 8. CTGF gera adesão e projeção de lamelipódio das células P19 sobre
as esferas tratadas com CTGF..........................................................................34
Figura 9. CTGF não promove aumento na proliferação das células de
teratocarcinoma embrionário P19......................................................................36
Figura 10. Representação esquemática da Câmara de Boyden......................39
15
Figura 11. CTGF promove quimioatração dose dependente...........................40
Figura 12. Representação esquemática da aproximação da esfera de
poliestireno com a pinça óptica..........................................................................43
Figuira 13. Imunodetecção contra a proteína CTGF (A), Laminina (LN) (B) e
Fibronectina (FN)...............................................................................................43
Figura 14. Tempo de adesão característico das moléculas CTGF, Fibronectina
e Laminina.........................................................................................................44
Figura 15. CTGF promove o aumento da fosforilação de PKB/Akt e P38, mas
não de ERK........................................................................................................47
Figura 16. Fotomicrografia da porção inferior da membrana de
policarbonato.....................................................................................................49
Figura 17. Quantificação do número de células presentes na porção inferior da
membrana de policarbonato..............................................................................50
Figura 18. Representação esquemática da hipótese de atuação do CTGF na
promoção da migração, quimioatração..............................................................59
16
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Características dos anticorpos primários utilizados..........................21
Tabela 2. Características dos anticorpos secundários utilizados......................22 Tabela 3. Características das sondas e corantes utilizados.............................22
Tabela 4. Medidas do tempo de adesão característico.....................................46
17
RESUMO
O Fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) é uma proteína secretada que esta envolvida em múltiplos fenômenos celulares como proliferação, diferenciação, migração, remodelamento da matriz extracelular e diversos processos mais complexos como angiogênese, condrogênese e cicatrização. Essas observações sugerem que o CTGF pode influenciar na migração e agregação, podendo funcionar como um importante agente quimiotático, durante a interação célula-célula e célula-matriz. Neste estudo investigamos a influência do CTGF como agente quimiotático e promotor da adesão celular em cultura de células de teratocarcinoma embrionário (P19). Nossos resultados mostram que as células P19 preferencialmente são atraídas e aderem a esferas tratadas com a proteína CTGF, as análises físicas por microscopia eletrônica de varredura e a caracterização do tempo de adesão revelaram a adesão física e adesão morfológica das células P19 sobre as esferas tratadas com CTGF. Além disso, ensaio de migração usando a câmara Boyden mostrou que as células P19 são atraídas pela proteína CTGF solúvel e que este evento pode envolver a fosforilação de PKB/AKT e P38, mas não a fosforilação de ERK1/2MAPK. Esses resultados mostram que a proteína CTGF é um potente indutor da quimioatração e adesão e que este evento é dependente deda via de P38 MAPK e PKB/AKT. Palavras Chave: Agregação celular, família CCN, teratocarcinoma embrionário, migração, quimiotaxia, pinça ótica.
18
ABSTRACT
Connective Tissue Growth Factor (CTGF) is a matricellular secreted protein involved in complex processes such as wound healing, angiogenesis and chondrogenesis by regulating cell proliferation, migration, adhesion and extracellular matrix remodeling. Although several reports have shown CTGF adhesive/migratory properties in different cell types, it was not reported CTGF functioning in adhesion and migration of embryonal carcinoma cells neither physical feature involved in this processes. In this study, we investigated the adhesion and chemoattraction role of CTGF protein bound to beads using embryonic teratocarcinoma cells (P19). The results showed that P19 cells surrounded and attached to CTGF-treated beads. Scanning electron microscopy and optical tweezers analysis of characteristic time adhesion revealed morphological and physical attachment of P19 cells to CTGF-treated beads. P19 cells adhesion time on CTGF was 9.6 seconds, which was 5 to 3.5 folds slower than laminin and fibronectin, respectively. Furthermore, Boyden chamber experiments showed that P19 cells are attracted by CTGF protein and that this event may involve the phosphorylation of AKT and P38, but not phospho-P44/42 MAPK (Erk1/2). Together, these data suggest that CTGF also influence adhesion and chemoattraction in pluripotent P19 cells and reveal important morphological and physical properties of P19 cell adhesion. Keywords: Cell aggregation, CCN family, teratocarcinoma cells, migration, chemotaxis, optical tweezers.
19
20
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Relevância da tese: por que estudar migração e adesão celular?
De acordo com Lodish et al., 2002, a mobilidade celular é uma das
realizações capitais da evolução. As células primitivas não tinham movimento
próprio, eram transportadas por correntes no meio primordial. Com a evolução
dos organismos multicelulares, órgãos primitivos foram formados por
migrações de células isoladas de partes remotas do embrião. Em organismos
adultos, o movimento de células isoladas em busca de microorganismos é
fundamental contra as infecções; por outro lado a migração celular
descontrolada é um sinal funesto de uma célula cancerosa.
Quase todas as células do corpo têm uma situação fixa, podendo exibir
alterações dramáticas na sua morfologia, como a contração de células
musculares, alongamento de axônio dos neurônios, formação de projeções na
superfície celular e constrição de uma célula durante a mitose.
Esses movimentos celulares são essenciais no crescimento e na
diferenciação celular e devem ser cuidadosamente controlados pelas células
para que sejam específicos e ocorram em locais determinados (Lodish et al.,
2002).
Neste trabalho nós utilizamos esferas de agarose como um meio sólido
contendo a proteína de estudo é uma ferramenta que nos permite avaliar o
potencial indutor de agregação e migração celular em pontos específicos da
cultura de células. Da mesma maneira as esferas de poliestireno constituem
ferramenta primorosa, sendo determinante neste trabalho, nos permitindo
estudar o tempo relativo de adesão em pontos da superfície celular.
21
1.2 - Locomoção Celular
Diferentes mecanismos são utilizados pelas células para a criação de
movimento, como a montagem de filamentos de actina sob a forma de feixes e
redes complexas, e a contração desses feixes sobre moléculas de miosina
(Stålhand et al., 2007). Esses mecanismos representam os principais
processos pelos quais as células geram as forças necessárias para a sua
migração.
Ao se movimentarem as células exibem uma seqüência de mudanças na
morfologia celular. A etapa inicial é a protrusão de um lamelipódio, onde ocorre
a polimerização controlada de filamentos de actina na margem de ataque da
célula e, subseqüentemente, interligação destes filamentos em feixes e redes.
Depois de concluir as fixações para o avanço, a maior parte do conteúdo
celular sofre translocação para frente. Finalmente a última etapa do movimento
é o deslocamento, onde as aderências focais são rompidas e a parte traseira
da célula é transportada para frente (Lodish et al., 2002). Esses processos são
controlados por diversas vias de sinalização.
1.3 - Orientação dos movimentos celulares por moléculas
quimioatratoras.
A migração celular é um evento crítico para o desenvolvimento
embrionário normal, para a resposta imune, para a reparação de feridas e
durante os eventos de metástase (Tanaka et al., 1995; Cohen-Hillel et al.,
2007). A atração quimiotáxica é baseada em um gradiente de um determinado
22
fator ou substância que, por meio de sinais intracelulares gerados a partir de
receptores presentes na membrana celular, promovem eventos de motilidade
celular (Cohen-Hillel et al., 2007; Kamiya et al., 2007). Sob certas condições,
essas trilhas químicas extracelulares orientam o movimento de uma célula em
determinada direção (Lodish et al., 2002). A motilidade é regulada
fundamentalmente por duas maneiras: por contato das células com a matriz
extracelular e por fatores de crescimento solúveis que se ligam aos receptores
na superfície celular (Entschladen et al., 2006). Em alguns tipos celulares como
os queratinócitos ou fibroblastos, a migração celular é iniciada pela matriz
extracelular, que promove adesões focais e a migração propriamente dita, não
necessitando de fatores de crescimento solúveis. Em contraste, alguns eventos
migratórios são iniciados por fatores de crescimento solúveis, que dependem
posteriormente da matriz extracelular (Entschladen et al., 2006).
1.4 - Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo (CTGF) em processos
fisiológicos e patológicos.
A proteína CTGF foi descoberta em 1991 por Bradham e colaboradores
e descrito como um novo polipeptídio secretado por células endoteliais
humanas em cultura e que estimulava a síntese de DNA e a quimiotaxia em
fibroblastos. Atualmente o CTGF participa de uma família de proteínas
chamada de CCN, cujos membros são: CYR61/CCN1, CTGF/CCN2,
NOV/CCN3, WISP-1, WISP-2 e WISP-3. As proteínas da família CCN são
caracterizadas por possuírem quatro domínios específicos extremamente
conservados, domínio idêntico a uma porção do fator de crescimento
23
semelhante à insulina (IGF) (módulo I), um outro domínio semelhante a
trombospondina-1 (TSP-1) (módulo II), um terceiro domínio que corresponde a
repetição do Fator de Von Willenbrand tipo C (VWF) (módulo III) e por fim, o
domínio C-terminal, rico em cisteína (módulo IV) (Essam et al., 2000, Moussad
e Brigstock, 2000, Abreu et al., 2002) (Figura 1). Esses módulos são
importantes na modulação de outros fatores, como TGF-beta, BMP e
fibronectina (Abreu et al, 2002; Hoshijima et al., 2006), e promovem diferentes
eventos como migração e adesão celular em células satélites do fígado (Gao e
Brigstock, 2006), proliferação e diferenciação de miofibroblasto (Asano et al.,
2005), condrogênese e angiogênese durante o desenvolvimento esquelético
(Ivkovic et al., 2003) deposição de matriz extracelular (di Mola et al., 2002). O
domínio CT do CTGF interage com a fibronectina aumentando a adesão celular
em condrócitos através da integrina α5β1 (Hoshijima et al., 2006), controla
adesão em plaquetas pela ação sinérgica de CTGF e Cyr61 através da
interação com integrinas αIIbβ3 (Jedsadaynmata et al., 1999), e estimula a
deposição de colágeno via modulo III através de subunidades de integrinas αVII
e β1 (Heng et al., 2006).
O CTGF está presente e superexpresso em alguns tipos de fibroses
como: a esclerose sistêmica, esclerose da pele e quelóides (Igarashi et al.,
1995, Igarashi et al., 1996 e Sato et al., 2000), está também presente em
outras condições patológicas, como: a displasia tumoral, a regeneração de
ferida e a regeneração do fígado (Brigstock, 1999), além de eventos
metastáticos, pois anticorpos neutralizadores contra a proteína CTGF podem
controlar a metástase em tumores pancreáticos (Dornhofer et al, 2006).
24
Estudos in vivo mostraram superexpressão do RNA mensageiro e da proteína
CTGF em muitos órgãos e tecidos fibróticos, incluindo fígado (Paradis et al.,
1999), rim (Ito et al., 1998), pulmão (Lasky et al., 1998), sistema cardiovascular
(Oemar et al., 1997), pâncreas (Di Mola et al., 1999), intestino (Dammeier et al.,
1998), olho (Lee e Joo, 1999) e gengiva (Hong et al., 2000). O progresso dos
estudos sobre os mecanismos de ação do CTGF tem sido considerado
pequeno, pois até o presente momento não existe nenhuma descrição sobre
receptores e vias de sinalização específica para o fator. Sendo assim, as
publicações sobre o CTGF aparecem de maneira descritiva e indireta.
25
IGFB TSP
IGFB TSP
IGFB TSP
IGFB TSP
IGFB TSP
IGFB TSP
Figura 1. Domínios das proteínas pertencentes à família CCN. CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP-1, WISP-2 e WISP-3. As proteínas da família CCN são caracterizadas por possuírem quatro domínios específicos extremamente conservados, domínio idêntico a uma porção do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) (módulo I), um outro domínio semelhante a trombospondina-1 (TSP-1) (módulo II), um terceiro domínio que corresponde a repetição do Fator de Von Willenbrand tipo C (VWF) (módulo III) e por fim, o domínio C-terminal, rico em cisteína (módulo IV) (Essam et al., 2000 (Modificado a partir de Moussad e Brigstock 2000).
Módulo I Módulo II Módulo III Módulo IV CT
CT
CT
CT
CT
VWF
VWF
VWF
VWF
VWF
VWF
WISP-3/CCN6
WISP-2/CCN5
WISP-1/CCN4
CYR61/CCN1
NOV/CCN3
CTGF/CCN2
26
1.5 - CTGF durante o desenvolvimento de vertebrados.
O CTGF pode ser encontrado em vários tecidos durante o
desenvolvimento do embrião e na fase adulta dos indivíduos, exercendo papel
primordial na padronização das estruturas do embrião e na manutenção da
homeostasia do sistema adulto. O CTGF é fortemente expresso em
camundongo na região anterior, central e posterior do mesênquima de meckel
em embriões de 12 dias de gestação, essa expressão diminui nos embriões de
15 dias de gestação e reaparece nos condrócitos hipertróficos localizado na
região anterior e na metade rostral da região central (Shimo et al., 2004).
No decorrer do desenvolvimento, encontra-se expressão moderada nas
meninges, expressão passageira na camada neuroepitelial e mais tarde no
epitélio do ventrículo, desaparecendo após a idade de E18 em ratos (Heuer et
al., 2003). No animal adulto, CTGF aparece em neurônios da camada VII do
córtex cerebral de ratos (Heuer et al., 2003). Também é encontrado no
desenvolvimento da notocorda de embriões de peixe zebra, sendo condição
obrigatória para o desenvolvimento desta, pois em embriões cuja expressão de
CTGF fora bloqueada a notocorda se desenvolveu com defeitos morfológicos
graves (Chio et al., 2006). Em embriões de Xenopus leavis, a expressão de
27
CTGF aparece nos blastômeros já nas primeiras clivagens, especificamente na
região dorsal do embrião, sugerindo que o CTGF é um gene maternal. Esta
expressão desaparece e torna a aparecer na placa neural, placa do assoalho e
notocorda. Em estágios mais avançados como a nêurula, o CTGF aparece nos
somitos. A expressão de CTGF pode também ser encontrada no coração, no
placóide nasal e nos arcos branquiais em Xenopus leavis (Abreu et al, 2002). O
desenvolvimento do esqueleto endocondral começa com a formação da
cartilagem onde células mesenquimais agregam-se e então, começam a
diferenciação. Neste momento, o CTGF age juntamente com o TGF-beta como
mediador da condensação endocondral (Song et al., 2007).
Nos tecidos onde expressão do CTGF é observada, existe uma
particularidade, que é o fato deles sempre se encontram densos e
compactados. Assim, é provável que a presença da proteína CTGF seja
importante na compactação dos tecidos. Desta forma, nosso objetivo foi
estudar os efeitos que a proteína CTGF possui na migração, agregação e
adesão das células embrionárias usando como modelo in vitro as células
provenientes de um teratocarcinoma embrionário P19.
1.7 - A célula de teratocarcinoma embrionário P19 como modelo de
estudo.
Teratocarcinomas podem desenvolver-se a partir de embriões em
estágios iniciais do desenvolvimento transplantados do útero para locais
ectópicos (Stevens, 1970). As células P19 são derivadas de um
teratocarcinoma formado a partir de um embrião de camundongo de 7,5 dias
28
implantado em testículo de camundongo adulto (McBurney and Rogers, 1982).
O tumor proveniente do implante do embrião cresceu rapidamente e as células
cultivadas permaneciam em um estado indiferenciado. Assim, estas células
foram classificadas como carcinoma embrionário P19 (Michael e McBurney,
1993). Muitos trabalhos têm mostrado o potencial destas células no estudo da
diferenciação celular. Este processo pode ser controlado por algumas drogas,
como o ácido retinóico (AR) que promove diferenciação de 85% das células
P19 em neurônios após seis dias de tratamento (McBurney et al., 1988).
Quando este tratamento com AR dura dez dias, células gliais maduras são
formadas (Jones-Villeneuve et al., 1982), ou seja, o AR é responsável por
diferenciar estas células em tipos celulares derivados do ectoderma e
fibroblastos.
Agregados de P19 expostos ao dimetil sulfóxido (DMSO) são
diferenciados em derivados endodermais e mesodermais (McBurney et al.,
1982; Edwards et al., 1983) incluindo músculo cardíaco e esquelético
(McBurney et al., 1982), queratinócitos e músculo liso (Smith et al., 1987).
Entender a diferenciação é tão importante quanto entender os processos
celulares que ocorrem antes e após este evento, como adesão e migração
após a identificação de um sinal químico, que chamamos de quimioatração.
A migração de células cancerígenas com a formação de uma nova lesão
tumoral a partir da primeira, mas sem continuidade entre as duas é um evento
conhecido como metástase (Plaza et al., 2007). Atualmente numerosos
estudos têm trabalhado com a hipótese de que diversos tipos de cânceres têm
origem nas célula-tronco adultas (Uemaetomari et al., 2005; Fomchenko et al.,
29
2005; Filip et al., 2006; Lasky et al., 2006; Silva et al., 2007; Webster et al.,
2007; Ward e Dirks 2007; Price et al., 2007). Estes trabalhos demonstram a
presença do fator de transcrição OCT-4 nas células cancerígenas, que por sua
vez é importante para a manutenção da pluripotência das células-tronco
(Webster et al 2007). Podemos observar marcadores de célula-tronco em
cânceres cerebrais de origem astrocitária (Lee et al., 2007), em mieloma
(Tonon, 2007), meduloblastoma (Raso et al., 2007), leucemia linfóide (Kayo et
al., 2007) câncer de próstata (Miki e Rhim, 2007), e câncer de mama (Polyak,
2007).
Sendo assim, estudar a migração, adesão e quimioatração em células
indiferenciadas é extremamente importante para melhor compreendermos
como células neoplásicas se desprendem do tumor primário, caminham através
do interstício e lá formam uma nova colônia, o que é conhecido como
metástase tumoral.
1.5 - CTGF e as vias de sinalização ERK, P38 e PKB/AKT.
Muitos sinais extracelulares produzidos por moléculas de origem
protéica são convertidos em sinais para o interior da célula através de
receptores conhecidos como integrinas (Juliano et al., 2004). As integrinas
além de funcionarem como moduladoras da citoarquitetura, por proporcionar
uma ligação das moléculas de actina no interior da célula às proteínas da
matriz extracelular (Webb et al., 2002), também são capazes de ativar as
proteínas cinase ativadoras de mitose (MAPK) (Johnson e Lapadat, 2002),
30
conduzindo a célula a organizar seus feixes de actina e miosina, produzindo a
migração celular (Pollard e Borisy, 2003).
A via de MAPK pode ser ativada por diferentes fatores, que produzem
diferentes respostas, como: aumento da proliferação, sobrevivência, migração
celular (Bergmann et al., 2002; Chrzanowska et al., 2007; Beisswenger et al.,
2007) e apoptose (Kralova et al., 2007). A ativação de via de MAPK é devido a
modificações dentro do loop de ativação no domínio cinase (Johnson e
Lapadat, 2002), que pode ser modificado pela ativação de moléculas
sinalizadoras como as GTPases, que por sua vez ativam RAS (Babic et al,
1999; Schwartz e Ginsberg, 2002) e assim desencadeiam a cascata de MAPK ,
onde MAP-cinase-cinase-cinase (RAF), ativa MAP-cinase-cinase (MEK), e esta
ativa MAPK (Huang et al, 2004). Dependendo do local de fosforilação dentro do
loop de ativação da MEK é determinado qual será a próxima molécula ativada,
que podem ser três diferentes moléculas, proteína cinase reguladora de sinais
extracelulares (ERK/MAPK), P38 e C-jun N-terminal cinase (JNK) (Huang et al,
2004). A regulação precisa dessa via é importante para desencadear eventos
como migração, proliferação e adesão celular (Kyriakis et al., 1994; Herlaar e
Brown., 1999; Senger e Krebs., 1995; Krueger et al., 2001) (Figura 2).
Outro importante regulador dos processos de migração celular é a
proteína cinase B/AKT (PKB/AKT), que é regulada pela fosforilação de
fosfatidilinositol-3 cinase (PI3K) (Bellacosa et al.,2005). A ativação da PKB/Akt
pode der produzida em resposta a diversos estímulos, incluindo fatores de
crescimento, citocinas (Manning e Cantley., 2007) e receptores tirosino cinase
(Katso et al., 2001). Essa via de sinalização vem sendo descrita como uma
31
importante reguladora da invasão e metástase tumoral (Higuchi et al., 2001)
(Figura 2). Recentemente alguns autores mostraram que a proteína CTGF é
um regulador determinante para a diferenciação celular, migração e
proliferação através das vias de P38 e ERK, e PKB/AKT (Crean et al., 2002;
Sharma et al., 2003; Crean et al., 2006), demonstrando, assim, a importante
regulação da proteína CTGF sobre essas vias de sinalização. A família das
cinase PKB/Akt estabelece relação reguladora importante nos eventos de
proliferação (Petzmann et al., 2006), controle do metabolismo (Song et al.,
2007), apoptose (wong et al., 2007), sobrevivência (Goel et al., 2007) e
migração celular (Okawa et al., 2007). Desta forma, entender os mecanismos
envolvidos na dinâmica desta função é extremamente valioso para podermos
estabelecer estratégias seguras para o controle exato desta via de sinalização.
32
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral
Figura 2. Via de Sinalização MAPK e PKB/Akt. O receptor tirosina cinase após reconhecer seu ligante sofre fosforilação e conseqüentemente, os mensageiros secundários são ativados por fosforilação até que ocorra a fosforilação dos fatores de transcrição (MAP-cinase), efetores das vias de MAPK e PKB/Akt (ERK, P38, JNK e PKB/Akt). Com a ativação destes fatores de transcrição eles encaminham-se ao núcleo e assim regulam uma gama de genes alvos. U0126 inibidor de MEK, SB203580 inibidor de P38 e LY 294002 inibidor de PI3-cinase. (Katso et al., 2001; Johnson e Lapadat., 2002)
33
Uma vez que a proteína CTGF possui papel importante nos estágios
inicias do desenvolvimento embrionário e em eventos de metástase tumoral, é
de extremo valor entender qual o efeito do CTGF em processos adesivos e
migratórios de células indiferenciadas.
Desta forma, esse trabalho tem especial interesse em estudar os
mecanismos de ação da proteína CTGF na condução de processos migratórios
e quimioatratores em células de teratocarcinoma embrionário P19.
2.2 - Objetivos específicos
2.2.1 - Analisar os efeitos quimioatrativos do CTGF imobilizado em esferas
de agarose em células P19.
2.2.2 - Analisar o efeito quimioatrator do CTGF solúvel, sobre as células
P19.
2.2.3 - Analisar o efeito do CTGF na proliferação das células P19.
2.2.4 - Determinar o tempo de adesão característico do CTGF na superfície
de células P19.
2.2.5 - Investigar as sinalizações celulares envolvidas na adesão,
quimioatração e migração, promovidas pelo CTGF.
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
34
3.1 - Cultura de células.
As células de carcinoma embrionário P19 foram adquiridas da American
Type Culture Collection (ATCC). Essas células foram cultivadas em Minimum
Essential Medium Alpha Medium (Invitrogen/Gibco) e suplementadas com 10%
de Soro Fetal Bovino (Invitrogen/Gibco), com 500 unidades de penicilina e
estreptomicina para 1 litro de meio, as células P19 foram mantidas em uma
estufa humedecida a 5% de CO2 a uma temperatura de 37º. Foram repicadas a
cada 48h por tripsinização (0,05% tripisina e 0,53 mM de EDTA).
As células S2 foram obtidas da ATCC e mantidas de acordo com seu
protocolo. São provenientes de células de ovário de Drosophila melanogaster e
crescem em suspensão em meio Schneider (Invitrogen/Gibco) adicionados de
10% de SFB (Invitrogen/Gibco). As células S2 foram mantidas em estufa a
22oC sem CO2 e repicadas a cada 4 dias.
3.2 – Método de contagem de células e análise estatística.
A análise estatística e a contagem de células foram produzidas a partir
da marcação nuclear feita por DAPI (1mg/ml) e marcação citoplasmática feita
por panótico (Tabela 3). O número de células aderidas à esfera e/ou total de
células num raio de 160 µm e o número de células na face interna da
membrana de poliestireno, que migraram após 4 horas em cultura, foram
contadas e os valores obtidos para todas as condições, foram submetidas a
uma análise de distribuição de percentil e/ou barras que foram plotadas em
gráficos usando GraphPad Prism 4.0 software (www.graphpad.com). A análise
35
estatística foi feita comparando o nível de significância de cada condição
usando análise não paramétrica em teste de Mann-Whitney (Siegel, 1956).
3.3 – Manutenção, indução e purificação da proteína CTGF.
As células S2 recombinantes foram plaqueadas em placas 35 mm (TPP)
e acondicionadas em uma estufa não humedecida a 22ºC. Para a produção de
CTGF-FLAG nestas células adicionamos, por 48 horas, meio Schneider sem
soro contendo 250 µg/ml de sulfato de cobre (Abreu et al., 2002). O meio
condicionado foi recolhido, centrifugado a 1500rpm por 5 min e seu
sobrenadante foi armazenado a –70oC até o momento da purificação. Para a
purificação foi utilizado esferas de agarose conjugadas ao anticorpo anti-
FLAG® monoclonal (anti-FLAG M2 gel®, Sigma) que foram depositadas em
colunas de cromatografia de polipropileno de 9 cm de altura (BioRad). Nesta
coluna, as esferas foram lavadas 3 vezes com glicina HCl 0,1 M (pH 3.5) e
posteriormente lavadas 5x com TBS (50 mM de Tris HCl; 150 mM de NaCl, pH
7.4). Após a passagem do TBS, aproximadamente 50 ml do meio condicionado
de células S2 foi adicionado à coluna gradativamente e o fluxo de passagem foi
reduzido para alcançar um tempo de incubação total de 4 h do meio
condicionado com as esferas. Após a passagem do meio condicionado, as
esferas foram lavadas três vezes com TBS e posteriormente incubadas com
500 µl de peptídeo FLAG (octapeptídeo sintético, N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-
Asp-Asp-Lys-C) (Sigma) na concentração de 100 µg/µl em TBS (10 mM de Tris
HCl; 150 mM de NaCl) para a eluição por competição do peptídeo FLAG com
a proteína CTGF-FLAG pelo sítio de ligação com o anticorpo. A proteína
36
CTGF-FLAG eluída foi aliquotada e armazenada a –70oC (Abreu et al, 2002).
Para confirmarmos a presença da proteína recombinante CTGF, fizemos um
imunobloting (Figura 3).
3.4 - Tratamento das esferas com meio condicionado enriquecido com
CTGF recombinante.
As esferas de agarose conjugadas ao anticorpo anti-FLAG® monoclonal
(anti-FLAG M2 gel®, Sigma) foram lavadas com TBS (50 mM de Tris-HCl, 150
mM NaCl pH 7,4) por três vezes de cinco minutos, em seguida lavadas com
Glicina (0,1 M pH 3,5 HCl) por dez minutos e depois lavadas três vezes com
TBS por cinco minutos. Expõe-se as esferas previamente tratadas a 1 ml de
Figura 3. Imunodetecção contra o epítopo Flag da proteína recombinante CTGF. Coluna 1 - meio condicionada após passar pela coluna de purificação, coluna 2 - primeira lavagem da coluna de purificação, coluna 3 - segunda lavagem da coluna de purificação, coluna 4 - terceira lavagem da coluna de purificação e coluna 5 - eluição da coluna utilizando o peptídeo Flag.
37
meio condicionado de S2 rico em CTGF recombinante por 24 horas a 4ºC.
Após esse tempo as esferas foram lavadas uma vez com TBS por cinco
minutos. Para confirmar se a proteína está aderida à esfera, tratamos as
esferas que receberam ou não o tratamento com a proteína CTGF, com
tampão de amostra e aplicamos essa amostra num gel de eletroforese de 10%,
como explicado no item 3.2 deste trabalho. O resultado desta imunodetecção é
mostrado na Figura 4.
3.5 - Eletroforese e Imunodetecção.
Para a imunodetecção da proteína recombinante CTGF-Flag, de
fibronectina, laminina, PKB/AKT, ERK1/2 e P38 (Tabela 1). As amostras foram
tratadas com tampão de amostra [0,02 mM de ditiotreitol (DTT); 1,38mM de
dodecil sulfato de sódio (SDS); 125mM de tris HCl pH 6.8 e 20% de glicerol)].
As placas de cultura de 6 poços, contendo células P19 semi-confluente
Figura 4. Imunodetecção contra o epítopo (Flag) presente na proteína CTGF ligada às esferas de agarose após a incubação com o meio condicionado. Coluna 1 - Controle Positivo (Meio condicionado rico em CTGF), coluna 2 - esferas tratada com o meio condicionado controle e coluna 3 - esferas tratadas com o meio condicionado rico em CTGF.
38
previamente tratadas com CTGF-flag, foram solubilizadas, com 100 µl de
tampão de amostra. As amostras foram fervidas por 5 min e carregadas em gel
de poliacrilamida 10 % na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE),
segundo o método de Laemmli (1970). O gel de poliacrilamida consiste de gel
de entrada (25 mm de Tris/HCl, pH 6.8; 0,15% de SDS; 5% de acrilamida e
0,13% de bisacrilamida) e um gel de corrida (0,4mM de Tris/HCl pH8.8; 0,1%
de SDS; 12% ou 7% de acrilamida e 0,13% de bisacrilamida). A corrida
eletroforética foi realizada a 100 v (aproximadamente 25mA) em tampão Tris-
glicina (25mM Tris HCl; 192mM de glicina; 3,5mM de SDS) por
aproximadamente 2h. Após a corrida, as proteínas foram transferidas por
corrente elétrica para membrana de PVDF (fluoreto de polivinilideno)
(Amersham). O gel foi embebido em tampão de transferência (25 mm de
Tris/HCl; 192mM de glicina; 20% de metanol, 3,5mM de SDS) juntamente com
a membrana de PVDF. O gel foi colocado em contato com a membrana e a
transferência semi-seca ocorreu por 1h e 20mim a 2mA por cm2 de membrana.
Após a transferência, a membrana foi incubada com a solução de bloqueio
TBSt (20mM de Tris/HCl pH 7.6; 137mM de NaCl com 0,1% de Tween 20),
acrescidos de 5% de leite em pó desnatado, por 1h, lavada com TBSt por três
vezes e incubada durante a noite a 4oC com anticorpo anti flag monoclonal
(Sigma), anti laminina monoclonal (Sigma), anti-fibronectina (Sigma) anti-
ERK1/2, anti-PKB/AKT e anti-P38 (Cell Signaling), na diluição de 1:1000 em
TBSt-leite 5% ou TBSt-BSA 5%. Após a incubação, a membrana foi lavada
novamente três vezes com TBSt e incubada com o anticorpo secundário anti-
IgG feito em camundongo ou coelho conjugado a peroxidase (Promega) na
39
diluição de 1:2000 por 1h a temperatura ambiente. Após a incubação com o
secundário, novas lavagens foram feitas com TBSt e por fim a membrana de
PVDF foi revelada através do método de intensificação da quimioluninescência
pelo luminol (SuperSignal West Pico, Pierce). O método consiste na oxidação
de luminol, reação catalisada pela peroxidase, em presença de peróxido de
hidrogênio. Intensificadores químicos sustentam a emissão de luz do luminol
que imprime as bandas correspondentes às proteínas imunodetectadas em
filmes auto-radiográficos (Kodak). Esses filmes foram então revelados e fixados
com material específico Kodak. Em alguns casos, após a imunodetecção da
primeira proteína, a membrana passava por um processo de desligamento dos
anticorpos primários e secundários, utilizando o tampão Tris/SDS (62,5 mM de
Tris HCl pH 6.7; 69 mM de SDS; adicionando na hora, 1,4% de β-
mercaptoetanol) durante 30min a 45oC e posteriormente lavada 5 vezes com
TBSt. Assim, uma nova imunodetecção era feita para a proteína tubulina
seguindo o protocolo descrito acima e utilizando os anticorpos anti-tubulina
monoclonal (Sigma) na diluição de 1:2000 e o secundário anti-IgG de
camundongo (promega) na diluição de 1:2000 (Tabela 1 e 2).
40
Anticorpos Primários Tipo Diluição
Utilizada Peso
Molecular Origem
Anti-Laminina Monoclonal Imunobloting 1:1000 400KDa Sigma
Anti-Fibronectina Monoclonal Imunobloting 1:1000 250KDa Sigma
Anti-Flag M2 -----------
Fluorescência 1:200
Imunobloting 1:1000
----------- Sigma
Anti-ERK Policlonal Imunobloting 1:1000 42KDa Cell Signaling
Anti-Phospho ERK Policlonal Imunobloting 1:1000 42KDa Cell Signaling
Anti-P38 Monoclonal Imunobloting 1:1000 43KDa Cell Signaling
Anti-Phospho P38 Monoclonal Imunobloting 1:1000 43KDa Cell Signaling
Anti-Akt Monoclonal Imunobloting 1:1000 60KDa Cell Signaling
Anti-Phospho Akt Monoclonal Imunobloting 1:1000 60KDa Cell Signaling
Tabela 1. Características dos anticorpos primários utilizados.
41
Anticorpos Secundários Diluição Utilizada Origem
Anti-IgG de Coelho-FITC 1:400 Promega
Anti-IgG de Camundongo-Cy3 1:800 Promega
Anti-IgG de camundongo conjugado a peroxidase 1:1000 Promega
Anti-IgG de coelho conjugado a peroxidase 1:1000 Promega
Sondas e Corantes Afinidade Diluição
utilizada Origem
Dapi DNA 1:10 Molecular Probes (EUA)
Tabela 2. Características dos anticorpos secundários utilizados.
42
Panótico Citoplasma -------------------- Laborclin (Brasil)
3.6 - Ensaio de proliferação celular por incorporação de timidina tritiada
T[H3].
Células P19 foram plaqueadas em placas de 24 poços em α-MEM com
10% de Soro Fetal Bovino numa concentração de cem mil células por poço.
Após 12 horas, o meio foi retirado e as células foram expostas a diferentes
condições: esferas de agarose tratadas com CTGF recombinante, esferas sem
tratamento com CTGF, e mitomicina-c (3 mM) (SIGMA), todas diluídas em α-
MEM com 1% de Soro Fetal Bovino. E 1µCi de [3H]-timidina foi adicionado aos
poços. Após um período de 6, 12 e 24 horas de incubação, o meio foi removido
e a cultura de células foram lavadas 2 vezes com PBS. Foram
adicionados,então, 300 µl de ácido tricloroacético 10%, e as células foram
mantidas a -20ºC por 1 hora. Então, a incorporação da [3H]-timidina foi aferida
em um cintilador beta (Packard 1600 TR). Esse experimento foi realizado três
vezes e cada condição com sua triplicata.
Tabela 3. Características das sondas e corantes utilizados.
43
3.7 - Microscopia eletrônica de varredura.
As células foram cultivadas por 24 horas sobre lamínulas de vidro de 15
mm em presença de esferas controle, sem a proteína CTGF, ou esferas
recobertas pela proteína CTGF. Foram fixadas em glutaraldeído 2.5% diluído
no tampão cacodilato de sódio a 0.1 M (pH 7.2) por 1 hora. Após 1 hora de
fixação, as amostras foram lavadas com o mesmo tampão e então pós fixadas
com tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato por 40 minutos. As
amostras foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol 70%,
80%, 90% e 100%. As lamínulas com células aderidas secaram através do
método do ponto crítico do CO2 (Balzers/Union CPD 030), depositadas sobre
uma fita condutiva de carbono aderida a suportes de alumínio (“stubs”) e
metalizadas com uma fina camada de ouro de aproximadamente 20 nm (Bal-
Tec SCD 050). As amostras foram observadas em um microscópio eletrônico
de varredura JEOL SEM 5310, operado a 15 ou 20 KV. Foi utilizada a distância
de trabalho de 10 mm para a aquisição das imagens (resolução de 1024 x 768
pixels) em modo de varredura lenta (“slow scan mode”).
3.8 - Ensaio de migração e invasão celular.
A quimiotaxia das células P19 foi testada na Câmara de Boyden (Lee et
al., 1999; Ohshima e tal, 2003). 50 µl de meio α-MEM com 1% de Soro Fetal
Bovino com 1,0 x 105 células/ml foi adicionado no compartimento superior da
Câmara de Boyden. No compartimento inferior foram adicionados 28,5 µl de
solução contendo: α-MEM com 10% de soro fetal bovino, α-MEM com1% de
soro fetal bovino, α-MEM sem soro fetal bovino e α-MEM contendo a proteína
44
CTGF em diferentes concentrações (0,5 nM, 2 nM e 10 nM). Os
compartimentos superior e inferior são separados por uma membrana de
policarbonato com poros de 10µm de diâmetro (PVP)-free polycarbonate filters
(Neuro Probe, Gaithersburg, MD). A câmara de boyden foi encubada por 4
horas em estufa humidificada com 5% de CO2 à 37ºC. Após as 4 horas a
membrana de policarbonato foi retirada, e a face da membrana voltada para o
compartimento inferior foi corada com Panótico (Laborclin), (Tabela 3).
3.9 - Protocolo de revestimento protéico das esferas de poliestireno.
Para testamos a adesão do CTGF, laminina e fibronectina às esferas de
poliestireno (diâmetro de 3.04 µm), primeiramente incubamos 0.5%
volume/volume da solução esfera/PBS com as respectivas proteínas na
concentração de 0,1 mg/ml, overnight e a 4ºC. No dia seguinte à incubação,
centrifugamos por 10 min a 10.000g e lavamos a solução três vezes com PBS,
ressuspendendo-as em 100 µl desse tampão. As células foram cultivadas 24
horas antes dos experimentos na pinça óptica.
3.10 - Pinça óptica e medida do tempo característico de adesão.
Para manipular uma única esfera de poliestireno e posicioná-la sobre
uma célula qualquer da cultura, usamos uma pinça óptica construída com um
laser de Nd:YAG (λ = 1.06 µm) que chega a uma objetiva Nikon Plan Apo
100X, NA1.4 acoplada a um microscópio Nikon Eclipse TE300, equipado com
uma câmara de CO2 que mantém a temperatura controlada a 37ºC e 5% de
CO2. Para medir o tempo de adesão característico, seguramos uma esfera de
45
poliestireno, controle ou previamente incubada com as proteínas de interesse,
usando a armadilha óptica, e em seguida, movendo o estágio do microscópio,
escolhemos aleatoriamente uma célula na cultura para pressionar a esfera de
poliestireno. A força axial realizada ao pressionar a esfera de poliestireno sobre
a membrana celular é da ordem de 20 pN. Mantemos a esfera de poliestireno
pressionada sobre a membrana celular por um intervalo fixo de tempo, t. Após
esse intervalo, desligamos o laser e observamos a imagem da esfera de
poliestireno para verificarmos sua adesão ou não. Para cada intervalo de
tempo, repetimos o procedimento dez vezes em três experimentos
independentes para cada uma das condições, e no final de cada experimento
contamos o número de esferas de poliestireno aderida, em relação ao número
total de esfera de poliestireno. Dessa forma, conseguimos montar um gráfico
do número relativo de adesões em função do tempo t. Para determinar o tempo
característico de adesão, ajustamos os resultados experimentais na equação
τt
eNN −
−=10
, onde N0 é o numero total de tentativas de adesões para um
específico intervalo de tempo, N é o numero de esferas de poliestireno
aderidas no final do intervalo de tempo e τ é o tempo característico de adesão.
46
4 - RESULTADOS
4.1 - Células P19 aderem e agregam preferencialmente às esferas de
agarose tratadas com CTGF recombinante.
Com o objetivo de determinar se o CTGF é capaz de promover a adesão
e a quimioatração das células de teratocarcinoma embrionário P19, nós
usamos uma esfera de agarose que possui um anticorpo anti-flag em toda a
sua superfície, que por sua vez reconhece um epítopo flag que está presente
na proteína CTGF recombinante (Figura 5). O meio condicionado contendo a
proteína CTGF-flag recombinante proveniente da transfecção de células de
ovário de Drosophila melanogaster (células S2) (Abreu et al, 2002), foi
colocada em contado com a esfera contendo o anticorpo contra o epitopo Flag
por aproximadamente duas horas a temperatura ambiente, e então sucessivas
47
lavagens com TBS (50mM) foram feitas com objetivo de retirar as ligações
inespecíficas e manter apenas a proteína CTGF a superfície da esfera.
Para comprovar a ligação entre a proteína CTGF-flag na superfície da
esfera foi realizado um ensaio de eletroforese contra a proteína Flag para
detectar a proteína recombinante na superfície das esferas que foram ou não
expostas ao meio condicionado rico em CTGF (Figura 4). Somente foi
observada a marcação por imunodetecção com o anticorpo anti-flag na
amostra que continha esferas tratadas com o meio condicionado rico em CTGF
recombinante (Figura 4, coluna 3). Não foi observada marcação na amostra
em que a esfera não foi tratada (Figura 4, coluna 2). Com a confirmação da
presença do CTGF-flag na superfície da esfera, experimentos com objetivo de
testar a quimioatração das células P19 pelo CTGF formam feitos. Em culturas
de células P19 com cerca de 50% de confluência foram adicionadas esferas
contendo CTGF e esferas sem o CTGF por um período de 24 horas. Então,
essas culturas foram fixadas com paraformaldeído 4% e expostas à sonda
DAPI por 5 minutos. Após a documentação das condições por microscopia
óptica e de fluorescência, quantificamos e observamos que esferas que não
contém CTGF em sua superfície apresentam poucas células próximas e
mantendo contato com as esferas (Figuras 6A e 6B). Todavia, as esferas
contendo o CTGF promoveram aparentemente um fenômeno de agregação,
quimioatração e migração nas células P19, pois um grande número de células
mantêm relação íntima de adesão com a esfera, como podemos notar ao
observarmos a mudança morfológica indicada pela seta nas Figuras 6C e 6D.
48
49
Figura 5. Representação esquemática da esfera de agarose que possui o anticorpo anti-flag em sua superfície, que por sua vez reconhece o epítopo flag presente na proteína CTGF recombinate.
- Anti-flag - Epitopo-flag
Legenda
50
Figura 6. Células P19 preferencialmente aderem e agregam-se às bilhas de agarose tratadas com CTGF recombinante. Fotomicrografias das células P19 (contraste de fase e DAPI) crescidas após 24 horas em cultura na presença de bilhas não tratadas (A e B) e bilhas tratadas com CTGF (C e D). Seta indicando mudança da morfologia da célula aderida à esfera tratada com CTGF. A barra corresponde a 50 µm. N = 6.
51
4.2 - O número de células aderidas e próximas às esferas tratadas com
CTGF é significantemente maior.
Com o objetivo de comprovar a dimensão do fenômeno visto na cultura
de células P19 em presença de esferas contendo CTGF, analisamos as
fotomicrografias, quantificamos e fizemos a análise estatística desses valores,
que foram expostos num gráfico de distribuição em percentil que organiza os
valores em 95%, 75%, 50%, 25% e 5%, separando a amostra em cinco
diferentes grupos. Podemos observar que o número de células aderidas à
superfície da esfera contendo a proteína CTGF é três vezes maior (14 a 49
células), do que o número de células aderidas à superfície das esferas sem a
proteína CTGF (7 a 18 células) (Figura 7A). Quantificamos também o número
de células presentes num raio de 160 µm a partir do centro das esferas,
contendo ou não a proteína CTGF em sua superfície. Como podemos observar
nos gráficos abaixo, o número de células encontrado na superfície das esferas
tratadas com CTGF é duas vezes maior que o número de células encontradas
ao redor das esferas não tratadas. (Figura 7B).
52
Figura 7. Gráfico do número de células P19 aderidas às esferas tratadas ou não com CTGF. Aproximadamente 200 esferas tratadas e não tratadas foram adicionadas à cultura por 24 horas. Fotos individuais das esferas foram adquiridas e quantificadas. (A) O número de células tocando nas esferas ou (B) número de células presentes num raio de 160µm que compõe uma área de 8x104 µm2. O gráfico de distribuição de percentil na figura A mostra que o número de células aderidas às esferas tratadas com CTGF é três vezes maior do que o número de células aderidas às esferas não tratadas. A média da distribuição em percentil na figura B mostra que as células encontradas na área das esferas tratadas com CTGF é duas vezes maior do que o número de células encontradas na área das esferas não tratadas. N = 6, *P<0,033 e **P<0,022.
53
4.3 - Analise morfológica do fenômeno de agregação.
Nós também avaliamos o perfil morfológico da agregação e adesão das
células P19 sobre as esferas tratadas e não tratadas com CTGF recombinante,
por microscopia eletrônica de varredura (Figura 8). Como podemos observar
na Figura 8 A e B, um grande número de células aderidas tanto a superfície
quanto ao redor da esfera de agarose tratada com CTGF. Na Figura 8 C
(Setas), evidenciamos a grande adesão da célula de teratocarcimoma
embrionário P19 a superfície da esfera tratada com CTGF. Na Figura 8 D, não
conseguimos identificar qualquer tipo de interação ou efeito da esfera de
agarose que não foi tratada com a proteína CTGF. Importante notar que a
morfologia celular encontrada nas duas condições é diferente.
Esses resultados corroboram com os resultados encontrados nas
Figuras 6 e 7 que mostram um grande número células P19 sendo atraídas
fortemente e aderindo à superfície da esfera tratada com a proteína CTGF,
indicando que CTGF é uma proteína que promove a agregação e adesão em
células de teratocarcinoma embrionário P19.
54
Figura 8. CTGF gera adesão e projeção de lamelipódio das células P19 sobre as esferas tratadas com CTGF. Fotomicrografia eletrônica das células expostas às esferas tratadas (A-C) e não tratadas (D) com CTGF. As setas indicam a membrana da célula sobre a esfera.
55
4.4 – CTGF não induz proliferação durante o fenômeno de agregação.
Com objetivo de desvendar se o fenômeno de aumento do número de
células sobre e ao redor das esferas tratadas com a proteína CTGF é
realmente agregação ou simplesmente aumento na proliferação destas células,
adicionamos à cultura de células P19 semi-confluente, por 6, 12 e 24 horas,
200 unidades por poço de esferas de agarose não tratadas e tratadas com
CTGF recombinante e um agente anti-proliferativo, a mitomicina-c numa
concentração de 3 nM, diluída em meio alfa-MEM suplementado com 1% de
soro fetal bovino. A timidina tritiada T[H3] foi adicionada a estas culturas na
concentração de 1µCi por poço. Observamos que no período inicial de 6 horas,
não houve diferença representativa na proliferação celular após adição das
esferas (Figura 9 – Cabeça-de-seta). Entretanto, com 12 horas em cultura,
observamos um menor perfil proliferativo na condição com as esferas
conjugadas à proteína CTGF, quando comparada com a condição contendo
esferas não tratadas (Figura 9 - Seta). Nas últimas 24 horas, o perfil
proliferativo destas células, com esferas tratadas e não tratadas com CTGF,
não apresentou nenhuma diferença considerável (Figura 9). Como era de se
esperar as células tratadas com mitomicina-c mantiveram-se em baixo perfil
proliferativo nas três medidas de tempo. Desta forma, podemos concluir que a
56
proteína CTGF aderida às esferas de agarose não promove aumento na
proliferação durante o fenômeno de agregação das células P19.
Figura 9. CTGF não promove aumento na proliferação das células de teratocarcinoma embrionário P19. Ensaio de incorporação timidina tritiada T[H3], usando a concentração de 1µCi por poço com 200 unidades de esferas de agarose tratadas ou não com CTGF, as medidas foram feitas em três momentos 6 horas (Cabeça de seta), 12 horas (Seta) e 24 horas de exposição. N = 3.
57
58
4.5 – CTGF age como fator quimioatrator para células de teratocarcinoma
embrionário P19.
Para entendermos de que maneira o CTGF age sobre as células durante
o fenômeno de migração e quimioatração, usamos o modelo de Câmara de
Boyden para avaliar a quimiotaxia. A Câmara de Boyden consiste de duas
câmaras separadas por um filtro poroso, com poros de 12µm de diâmetro,
tamanho suficiente para permitir que as células o atravessem ativamente, com
gasto de energia, e não de forma casual ou passiva (Figura 10). Para este
experimento foram adicionadas 10x104 células no compartimento superior da
câmara de Boyden. Em cada compartimento inferior, foram adicionadas
diferentes concentrações de CTGF recombinante solúvel diluído em alfa-MEM,
0,5 nM,1nM, 2nM, 5nM,10nM, meio alfa-MEM (MSS) ou alfa-MEM com 10% de
soro fetal bovino (SFB10%). Então a Câmara de Boyden foi posta na estufa
humidificada a 37 ºC com 5% de CO2 por um período de 4 horas. Cada
condição foi feita em triplicata. A significância desse experimento é proveniente
da contagem do número de células encontradas na face inferior do filtro, ou
seja, a face que está em contato com o fator (Figuras 11A - MSS, 11B -
SFB10% e 11C - CTGF).
Nós podemos notar que o número de células presentes nas
fotomicrografias pertinentes as condições, MSS (25.28 ± 2.102) e SFB10%
(38.83 ± 2.766) são inferiores ao número de células encontradas na condição
contendo CTGF 5nM (45.12 ± 2.933).
O resultado da contagem do número de células presentes na face
inferior do filtro de cada uma das condições está representado no gráfico
59
(Figura 11D). Podemos identificar no gráfico, a ação quimioatratora da proteína
CTGF, sendo extremamente significante nas concentrações 2 nM, 5 nM e 10
nM. Além disso, a quimioatração ocorre de maneira dose dependente.
60
Figura 10. Representação esquemática da Câmara de Boyden. Porção superior da Câmara de Boyden, onde adicionamos 10x104 células por poço (A), membrana de silicone que proporciona vedação dos poços (B), membrana de policarbonato de poros de 12 µm (C) e porção inferior da Câmara de Boyden onde adicionamos o agente quimioatrator (D).
A
B C
D
61
Figura 11. CTGF promove quimioatração dose dependente. Meio Sem Soro (MSS) (A), Soro Fetal Bovino (SFB) (B). Fotomicrografias das células coradas com Panótico presentes na face interna da membrana voltada para o fator (A-C). Quantificação do ensaio de câmara de boyden durante um período de 4 horas (D). ***P<0,0001. N = 4.
62
4.6 – A proteína CTGF é extremamente adesiva
Uma vez que o CTGF promove fenômenos de agregação (Figuras 6, 7
e 8), quimioatração, migração (Figuras 8 e 11) e adesão (Figura 8, setas) nas
células de teratocarcinoma P19, buscamos examinar o tempo de adesão
característico do CTGF na membrana celular e a comparação deste tempo,
com o tempo de adesão de duas proteínas altamente adesivas da matriz
extracelular, a Fibronectina (FN) e Laminina (LN). Para isso, usamos a
tecnologia da pinça óptica, que consiste em manipular uma única esfera de
poliestireno e posicioná-la sobre uma única célula em cultura, com esse intuito
usamos uma pinça óptica construída com um laser de Nd:YAG (λ = 1.06 µm).
Com a esfera pinçada, aproximamos e pressionamos sobre a superfície celular
(Figura 12A-D). Note que o foco da esfera em relação à membrana da célula
muda quando pressionamos a esfera sobre a mesma (Figura 12D). É
importante frisar que, para cada ponto dessas medidas foram usadas trinta
células e trinta esferas diferentes em três diferentes experimentos.
Para assegurar que havia proteína na superfície das esferas tratadas
com as proteínas estudadas, fizemos imunodetecção contra a proteína CTGF
(Figura 13A), Laminina (Figura 13B) e Fibronectina (Figura 13C). Sendo
confirmada a presença das proteínas, realizamos os experimentos com a pinça
óptica. O primeiro passo foi analisar o tempo de adesão característico das
esferas sem nenhum tratamento. Este tempo foi de aproximadamente 3.3 + 0.3
minutos, que foi interpretado como uma adesão inespecífica. As esferas
tratadas com Laminina levaram fração de segundos para aderirem à membrana
da célula, cujo tempo médio é de 1.8 + 0.45s, enquanto as esferas tratadas
63
com Fibronectina levaram 2.7 + 0.44s. As esferas tratadas com CTGF tinham
um tempo de adesão característico de 9.6 + 1.9s, ou seja, bem próximo aos
tempos da Laminina e Fibronectina. Os resultados desses experimentos foram
expostos num gráfico (Figura 14A) que mede a adesão relativa em relação ao
tempo (min) em função logarítmica. Esses resultados nos mostram que o
tempo de adesão característico do CTGF é extremamente pequeno, quando
comparado as esferas não tratadas, possuindo tempo de adesão mais próximo
aos da Laminina e Fibronectina, comparativamente.
Sabendo que CTGF interage com a Fibronectina pela porção C-terminal
durante processos de adesão celular (Hoshijima et al, 2006), analisamos a
adesão relativa de esferas tratadas com uma combinação de CTGF (0,1mg/ml)
e Fibronectina (0,1mg/ml), (Figura 14B), com o objetivo de quantificar o tempo
de adesão. Os resultados foram simplificados num gráfico de adesão relativa
por tempo (min) obedecendo a uma escala logaritma. Podemos observar que o
tempo de adesão relativa da combinação entre o CTGF e a Fibronectina foi de
5.5 + 0.5 que é mais lento que a Fibronectina 2.7 + 0.44s e mais rápido que o
CTGF 9.6 + 1.9s, nos levando a entender que a mistura entre essas duas
moléculas foi capaz de diminuir o tempo de adesão, nos permitindo acreditar
que a combinação da Fibronectina ao CTGF é capaz de potencializar a adesão
celular, ou seja, diminuir o tempo de adesão relativa do CTGF (Figura 14B),
nos indicado que a ação sinérgica entre FN e CTGF podem definir diferentes
intensidades de adesão. Os valores da quantificação da adesão relativa estão
expostos na tabela abaixo (Tabela 4)
64
Figura 12. Representação esquemática da aproximação da esfera de poliestireno com a pinça óptica. A esfera de poliestireno é pinçada com o laser (A), levada até a superfície da célula (B), pressionada sobre essa superfície (C) e, então, o laser é desligado (D). Após o desligamento do laser abre-se contagem.
Figura 13. Imunodetecção contra a proteína CTGF (A), Laminina (LN) (B) e Fibronectina (FN) (C). O controle positivo de cada condição é proveniente da proteína purificada utilizada em cada uma das condições. Confirmação da presença das proteínas na superfície das esferas de poliestireno (Controle positivo).
65
Figura 14. Tempo de adesão característico das moléculas CTGF, Fibronectina e Laminina. Gráfico de Adesão Relativa por tempo em minutos mostrando o tempo de adesão do CTGF, Laminina e Fibronectina (A) e o tempo de adesão da relação entre o CTGF e a Fibronectina (B). Controle negativo corresponde a esfera de poliestireno sem nenhum tratamento.
66
Tabela 4. Medidas do tempo de adesão característico. Laminina (LN), Fibronectina (FN), segundos (s) e minuto (min).
67
4.7 - CTGF promove aumento na fosforilação de PKB/AKT e P38, mas não
de ERK.
Com intuito de investigar de que maneira o CTGF age promovendo a
migração e adesão das células P19, investigamos se o CTGF é capaz de
promover ativação da via de MAPK e PKB/Akt, que vem sendo descrita como
vias reguladoras da migração e adesão celular (Crean et al., 2002; Sharma et
al., 2003; Crean et al., 2006). Para isso, adicionamos CTGF recombinante 2nM
a cultura de células semi-confluente por 20 minutos e, após esse tempo,
interrompemos a cultura de células com a adição do tampão de extração. Logo
após o tratamento das amostras, corremos um gel de eletroforese e
conseqüentemente fizemos imunodetecção para as proteínas fosforiladas e
não fosforiladas da via de MAPK e PKB/Akt. Podemos notar na Figura 15A,
coluna 2 e no gráfico correspondente, que após a adição do CTGF na cultura,
não ocorreu nenhuma alteração na fosforilação de ERK, todavia ocorre o
aumento da fosforilação e ativação de P38, como podemos observar na Figura
15B, coluna 2, quando comparamos com a condição não tratada (Figura 15B,
coluna 1 e gráfico). Além disso, CTGF promove o aumento na fosforilação e
ativação de PKB/Akt, como podemos observar quando comparamos com a
condição não tratada (Figura 15C, colunas 1 e 2 e gráfico).
68
A
B
C
Figura 15. CTGF promove o aumento da fosforilação de PKB/Akt e P38, mas não de ERK. Análise por Imunodetecção das proteínas ERK, total e fosforilada (A), P38, total e fosforilada (B) e PKB/AKT, total e fosforilada (C), das células expostas ao CTGF 2 nM por 20 min. Os gráficos foram produzidos a partir da densitometria da banda da proteína fosforiladas, subtraídas da densitometria da banda da proteína total. Unidade Arbitrária (AU).
69
4.8 - A quimioatração promovida pelo CTGF é dependente das vias de
MAPK e PKB/Akt.
Como o intuito de avaliar se a migração e quimioatração produzida pelo
CTGF é diretamente dependente das vias de MAPK e PKB/Akt, fizemos um
ensaio de Câmara de Boyden usando os inibidores de MAP-cinase-cinase
(MEK) U0126, P38 SB239063 e o de PI 3-cinase LY294002. Para esse
experimento, incubamos as células dissociadas com 0,02 % EDTA, por 20
minutos com os inibidores, e então lavamos com PBS por três vezes. Após os
tratamentos, adicionamos 10x104 células, tratadas ou não com os inibidores,
na porção superior da Câmara de Boyden e no compartimento inferior
adicionamos CTGF recombinante solúvel na concentração 2nM diluído em
meio alfa-MEM sem soro fetal bovino (MSS), ou meio alfa-MEM com 10% de
soro fetal bovino (SFB 10%). Em seguida, a Câmara de Boyden foi
acondicionada na estufa humidificada a 37 ºC com 5% de CO2 por 4 horas. As
células presentes na porção da membrana voltada para a solução contendo o
agente quimioatrator foram coradas com Panótico, e então foi feita a
documentação com auxílio do microscópio óptico (Figura 16). A partir da
avaliação e quantificação do número de células que migraram em cada uma
das condições (Figura 16 A-F), construímos um gráfico de média do número
de células por condição utilizada (Figura 17). Os dados obtidos confirmam a
ação quimioatrator do CTGF, além disso, podemos observar que quando
tratamos as células com os inibidores U0126, SB239063 e LY294002, CTGF
não foi capaz de atrair as células, indicando que a quimioatração
70
proporcionada pelo CTGF é dependente da via de MAPK e PKB/Akt (Figura
17).
Figura 16. Fotomicrografia da porção inferior da membrana de policarbonato. Meio alfa-MEM sem soro (MSS) (A), Meio Alfa-MEM com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB10%) (B), CTGF solúvel na concentração de 2nM (CTGF 2nM) (C), inibidor de MEK (U0126) (D), inibidor de P38 (SB203580) (E) e inibidor de Pi3-cinase (LY294002) (F).
71
Figura 17. Quantificação do número de células presentes na porção inferior da membrana de policarbonato. Contagem do número de células coradas com Panótico na face inferior da membrana. Soro fetal bovino (SFB), meio sem soro (MSS), U0
inibidor de MEK, SB inibidor de P38 e LY inibidor de Pi3-cinase. *** = P<0,0001; ** = P<0,01.
72
5 - DISCUSSÃO
Foi mostrado anteriormente que CTGF induzia a formação de agregados
esféricos em cultura de células P19 e 293T (Abreu et al., 2002). Neste trabalho
nós investigamos este fenômeno usando diferentes abordagens para
demonstrar que a proteína CTGF age promovendo quimioatração, migração e
adesão nas células P19. Os resultados mostraram que as células P19
preferencialmente migram e aderem às esferas que foram tratadas com CTGF
recombinante, e ensaios usando a Câmara de Boyden confirmam que a
quimioatração seguida de migração causada pala proteína CTGF ocorre de
maneira dose dependente. A morfologia das células aderidas à esfera tratada
com CTGF mostra uma sólida adesão. Nós comparamos o tempo de adesão
da proteína CTGF revestindo esferas de poliestireno com outras duas proteínas
da matriz extracelular, Laminina e Fibronectina, e observamos que o tempo de
adesão da proteína CTGF é tão pequeno quanto o tempo de adesão da
fibronectina, laminina. Levando-nos a concluir que CTGF é uma molécula
extremamente adesiva, podendo ser comparada a adesão promovida pelas
proteínas da matriz extracelular. Análise da fosforilação dos componentes da
via de MAPK [P44/42 (ERK), P38] e PKB/Akt demonstrou a ação do CTGF no
aumento da fosforilação de P38 e PKB/Akt. O bloqueio da via de MAPK e
PKB/Akt durante a quimioatração revelou que a quimioatração produzida pelo
CTGF é dependente da via de MAPK e PBK/Akt. Juntos, estes resultados
73
demonstram que o CTGF funciona como uma molécula adesiva, quimioatratora
em células de teratocarcinoma embrionário P19, e que esses eventos são
dependentes da fosforilação dos componentes da via de MAPK e PKB/Akt.
Muito pouco se sabe sobre as moléculas presentes durante o
desenvolvimento embrionário, que mantêm as células indiferenciadas nos
tecidos e órgãos adultos e as que determinam a especificidade celular
(Arnalich-Montiel et al., 2007; Barclay et al., 2007). A célula P19 é um
teratocarcinoma embrionário que possui propriedades pluripotentes, derivadas
de um teratocarcinoma maligno, podendo proporcionar um esplêndido sistema
in vitro, que nos permite estudar e avaliar uma gama de fenômenos da biologia
celular, tais como: migração celular, proliferação e diferenciação (Graham et
al., 1977). Quando tratamos as células P19 com dimetil sulfóxido (DMSO) em
um sistema de cultura usando “gotas pendentes” as células P19 diferenciam-se
em músculo liso (Edwards et al, 1983) e quando tratamos com ácido retinóico
às células P19 dão origem a neurônio e células gliais in vitro (Elizabeth et al.,
1982).
A proteína CTGF está envolvida em processos biológicos fundamentais,
sendo assim um alvo importante para a medicina molecular, pois anticorpos
monoclonais contra o CTGF poderiam ser usados em tecidos fibróticos e como
um inibidor de metástase (Perbal et al., 2003). O tratamento de camundongos
com um anticorpo neutralizador produziu uma diminuição na metástase, na
microvascularização, e suprimiu o crescimento de um tumor subcutâneo in vivo
(Shimo et al., 2006). Da mesma maneira, outros membros da família CCN
como Cyr61 e NOV têm sido implicados na adesão e migração celular
74
(Scotlandi et al., 2003), ativação da cinase de adesão focal (Lin et al., 2003) e
também na interação com moléculas de integrina em eventos de migração e
adesão (Moussad e Brigstock, 2000).
5.1 - Desenvolvimento embrionário e migração
Durante o desenvolvimento embrionário um grande número de células
progenitoras migra por longas distâncias antes de diferenciarem (Casazza et
al., 2007). A migração é orientada por um complexo número de fatores que
além de guiar o destino da migração, controlam a proliferação e diferenciação
das células durante o percurso (Sandell e Trainor 2006). Sendo a migração
celular extremamente relevante durante a morfogênese no embrião.
No embrião de vertebrado, muitos tipos celulares são originados a partir
de uma estrutura comum, a crista neural (Burns e Douarin., 1998). Células
migratórias originárias da crista neural de galinha e camundongo colonizam
diversas porções do embrião, e então diferenciam dando origem a diversos
tipos de células especializadas, tais como: neurônios a células gliais do sistema
nervoso periférico (Schreine et al., 2007; Dupin et al., 2007), células
pigmentadas da pele (Lacosta et al., 2007), células das glândulas tireóide e
adrenal (Martinez et al., 2005). A migração das células da crista, também é
responsável pela formação das estruturas gerada a partir de células
mesênquimais, como: cabeça e pescoço (Creuzet et al., 2006; Rizzoti e Lovell-
Badge., 2007), cartilagem craniofacial (Rizzoti e Lovell-Badge., 2007), osso
(Han et al., 2007), derme (Eames e Schneider., 2005), tecido adiposo (Le
Lièvre e Le Douarin., 1975) e células de músculo liso (Wiegreffe et al., 2007).
75
Diversas moléculas têm sido apontadas como responsáveis pela migração e
especialização das células provenientes da crista neural. Os genes Hox
possuem papel crítico na morfogênese da cabeça (Santagati et al., 2005), da
mesma maneira o fator de crescimento fibroblástico 8 (FGF8) apresenta papel
central na formação do esqueleto facial (Creuzet et al., 2006).
A proteína CTGF tem sido estudada durante o desenvolvimento
embrionário. O padrão de expressão do CTGF em Xenopus Leavis que este é
um gene maternal expresso no pólo animal do embrião de quatro células. Sua
expressão é silenciada durante o processo de gastrulação, e durante a
neurulação é transcrito na notocorna e no assoalho do tubo neural, e mais
tardiamente, é fortemente transcrito na região dorsal dos somitos (Abreu et al.,
2002). Ivkovich e colaboradores em 2003 desenvolveram, através da técnica
de deleção de genes (Knock out, KO), um camundongo com deleção total do
gene CTGF. Os autores observaram que o gene CTGF é letal, isto é, o
camundongo morre ao nascer e, além disso, apresenta deformidades crânio
faciais e encurtamento dos ossos longos. A superexpressão de CTGF através
da injeção de RNA mensageiro em embriões de Xenopus Leavis provoca um
embrião com fenótipo extremamente anteriorizado, com aumento da região da
cabeça e do tubo neural (Mercúrio et al., 2004). Os fenótipos de
superexpressão em embriões de Xenopus Leavis bem como os fenótipos
apresentados pelos camundongos KO, sugerem a participação de CTGF na
modulação de vias de sinalização durante a morfogênese do embrião.
76
Como podemos observar a expressão da proteína CTGF apresenta-se
em locais e momentos específicos onde o tecido encontra-se denso e
compactado, e prestes a migrar para a colonização de outras estruturas.
5.2 - Migração, quimioatração e metástase tumoral.
Quimiotaxia é o fenômeno cujas células identificam sinais químicos do
ambiente e migram na direção a este sinal (Barthel et al., 2007). A
quimioatração foi descrita inicialmente por Pan e colaboradores em 1975, onde
observaram uma gama de moléculas atraindo bactérias. Desde então uma
diversidade de moléculas vem sendo descrita como responsáveis pela
quimioatração de células procarióticas e eucarióticas.
Entender sobre a formação de novas colônias neoplásicas a partir de um
primeiro foco tumoral vem sendo motivo de estudo de muitos pesquisadores. A
descoberta de que células desprendidas de tumores podem ser atraídas por
alguns fatores presentes no plasma e no tecido conjuntivo adjacente (Weber et
al., 2007). Esses agentes quimioatratores vêm sendo motivo de muitas
investigações.
Diversas moléculas têm sido descrita com ativadoras da quimioatração e
migração, entre elas está o CTGF (Bradhan et al., 1991). CTGF foi encontrado
em grande quantidade em células metastáticas de melanoma (Hashimoto et al.,
1998), bem como aparece como uma das moléculas mais expressas em
cânceres de mama que migraram para os ossos (Kang et al., 2003; Shimo et
al., 2006) e a sua inibição é descrita como um atenuante do crescimento,
metástase e angiogênese (Aikawa et al., 2006). Ainda em 2006, Shimo e
77
colaborados mostraram que a proteína CTGF é largamente produzida pelas
células metastáticas de câncer de seio, e Dornhöfer e colaboradores
publicaram resultados mostrando que anticorpo neutralizador contra a proteína
CTGF é capaz de inibir o crescimento e metástase em tumores pancreáticos.
Esses resultados fornecem suporte suficiente para apontar o CTGF como uma
molécula extremamente importante no estudo da migração, quimioatração e
metástase tumoral.
5.3 - Hipótese de ativação da migração, quimioatração e agregação
causada pelo CTGF.
Nas ultimas décadas diversos trabalhos tem definido uma imensa gama
de ligantes para os receptores da via de MAPK e PKB/Akt, entretanto, as
possibilidades não estão esgotadas. A combinação dos mecanismos
regulatórios das vias de sinalização MAPK e PKB/Akt são os maiores
responsáveis pela ativação destas vias (Caunt et al., 2006), podendo ser
considerados o tempo de exposição aos ligantes (Caunt et., al 2006) e sua
diversidade. O controle da ativação da via de MAPK pode ser feito por diversos
fatores dentre eles estão: TGF-beta, fator de crescimento epidermal (EGF)
(Uttamsingh et al., 2007), Trombina, fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) (Kinney et al., 2007), fator de crescimento do fibroblasto (FGF) (Beh et
al., 2007), metaloproteinases (Hecht et al., 2007), fator de necrose tumoral-alfa
(TNF-alfa) (Turner et al., 2007), fator de crescimento semelhante à insulina
(IGF) (Fu et al., 2007), interferon-alfa tipo II (INF-alfa II) (Avraamides et al.,
78
2007), fator de crescimento ligador de heparina (HGF) (Lai et al., 2004) e CTGF
(Crean et al., 2002; Furlong et al., 2007; Secker et al., 2007).
A via de PKB/Akt também é um grande responsável pelo controle da
ativação da migração celular, sendo esta ativação produzida por zoledronate
(Hasmim et al., 2007), fator de crescimento de fibroblasto (Schmidt et al.,
2006), beta-arrestina (Buchanan et al., 2006) e CTGF (Crean et al., 2006).
A superativação destas vias de MAPK e PKB/Akt está diretamente
relacionada à metástase tumoral (Bao et al., 2004; Yoeli et al., 2006; Leonis et
al., 2007; Mirmohammadsadegh et al., 2007), onde após analise patológica
encontraram a presença nuclear dos fatores de transcrição, PKB/Akt e P38,
efetores destas vias em câncer de seio e próstata (Yoeli et al., 2006; Mendes
et al., 2007). Sendo assim a provável inibição das vias de MAPK e PKB/Akt
com inibidores específicos U0126, LY297002 e o SB203580, através de
técnicas pontuais de ação destes inibidores, pode ser uma estratégia
inteligente para evitar a metástase tumoral nos diferentes cânceres.
Existem três principais receptores responsáveis pela ativação das vias
de MAPK e PKB/Akt, entre eles estão as integrinas beta3 (Lerea et al., 2007),
alfaV beta 3, alfa V beta 5 (Naik and Naik, 2006), os receptores tirosina cinase
(Mehdi et al., 2007) e os receptores acoplados a proteína G (Oak et al., 2001;
Yamauchi et al., 2001). Baseado nos nossos achados somados aos dados
discutidos na literatura, nós desenvolvemos um modelo de discussão para a
ação do CTGF durante a migração e quimioatração celular. Ainda não foi
descrito receptor específico para a proteína CTGF, desta forma, o aumento da
fosforilação produzida pela molécula CTGF durante a migração e
79
quimioatração, poderia ser, devido a ligação do CTGF a receptores descritos
como tradutores de sinal intracelular para as vias de MAPK e PKB/Akt. Como
mostramos na Figura 17 a inibição destas vias poderia evitar o efeito do CTGF
na estimulação da migração e quimioatração, constituindo uma importante
estratégia para evitar a migração e metástase de tumores. Desta forma,
entender os mecanismos pelos quais as células respondem ao estímulo
produzido pelo CTGF e seu efeito em vias ativadoras da migração, bem como
a inibição, tanto do CTGF como dos componentes efetores das vias de MAPK
e PKB/Akt é algo imprescindível para novas perspectivas ao estudo da
migração, quimioatração e metástase tumoral.
80
Figura 18. Representação esquemática da hipótese de atuação do CTGF na promoção da migração, quimioatração. Primeiro passo da ativação é o reconhecimento do CTGF pelo receptor que podem ser integrinas, receptores tirosina cinase e/ou receptores acoplados a proteína G. Com o reconhecimento do CTGF, os receptores sofrem fosforilação e ocorre o desencadeamento da cascata de sinalização, com a ativação dos mensageiros secundários até a ativação por fosforilação dos fatores de transcrição, P38 e PBK/Akt que agirão no núcleo e ativarão a transcrição de uma gama de genes responsáveis pela migração gerada por um agente quimioatrator.
81
CONCLUSÃO
1. Células de teratocarcinoma embrionário P19 preferencialmente aderem
e agregam-se às esferas de agarose tratadas com CTGF recombinante.
2. O número de células aderidas e ao redor das esferas tratadas com
CTGF é significantemente maior do que o número de células aderidas e
ao redor das esferas não tratadas com CTGF.
3. Analise morfológica por microscopia eletrônica de varredura das células
P19 aderidas a esferas, revelou grandes interações das células na
superfície das esferas tratadas com a proteína CTGF.
4. Ensaio de incorporação de Timidina Tritiada T[H3] mostrou que as
esferas tratadas com CTGF não alteram a proliferação das células de
teratocarcinoma embrionário P19. Confirmando que o aumento do
número de células ao redor das esferas tratadas com CTGF é um
fenômeno de agregação.
5. CTGF é uma molécula quimioatratora em células P19, agindo de
maneira dose dependente.
82
6. Tempo de adesão característico da proteína CTGF é baixo, podendo ser
comparada à adesão promovida por moléculas da matriz extracelular,
como: Fibronectina e Laminina.
7. CTGF promove aumento na fosforilação e ativação de PKB/Akt e P38,
mas não de ERK.
8. A inibição das vias de sinalização de MAPK e PKB/Akt impede a
quimioatração promovida pelo CTGF
83
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFIA
ABREU, J.G., KETPURA, N.I., REVERSADE, B., AND DE ROBERTS, E.M.,
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