UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · A Deus, meu Pai, meu Amigo e meu Conselheiro, que pelas suas infinitas ... que estende as raízes para o ribeiro que não receia

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

WALICYRANISON PLINIO DA SILVA

CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS E FENOTÍPICAS DE Candida albicans

ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL DE PACIENTES TRANSPLANTADOS

RENAIS COM ÊNFASE NA AÇÃO DO EXTRATO BRUTO DE Eugenia uniflora

NOS FATORES DE VIRULÊNCIA

NATAL-RN

2013

WALICYRANISON PLINIO DA SILVA

CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS E FENOTÍPICAS DE Candida albicans

ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL DE PACIENTES TRANSPLANTADOS

RENAIS COM ÊNFASE NA AÇÃO DO EXTRATO BRUTO DE Eugenia uniflora

NOS FATORES DE VIRULÊNCIA

Dissertação apresentada à Coordenação do

Programa de Pós-graduação em Ciências

Farmacêuticas da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, como requisito para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Guilherme Maranhão

Chaves.

NATAL-RN

2013

DEDICATÓRIA

A todos que comigo fizeram deste sonho

uma realidade. Em especial à minha

família pelos valores que me ensinaram e

me transmitiram, pelo que sou.

AGRADECIMENTOS

A Deus, meu Pai, meu Amigo e meu Conselheiro, que pelas suas infinitas

misericórdias, me conduz e me guia por todos os dias de minha vida.

À minha família, que nunca abriu mão de apoiar em todas as minhas decisões,

pelo amor e carinho com que me tratam, pelos momentos de alegrias e tristezas que me

fazem cada dia mais fortalecido.

À minha esposa Lediana, que Deus colocou em minha vida para dividir comigo

todos os dias, as maravilhas que Ele tem feito em nosso viver, pelo grande amor que

tem transmitido a mim, carinho, compreensão e amizade.

Aos meus irmãos em Cristo, guerreiros da batalha espiritual, que me suprem em

oração e fazem dos meus dias difíceis, momentos de desfrute e paz interior.

Aos companheiros do Laboratório de Micologia Médica e Molecular, que

diariamente me ajudam nos experimentos, nos momentos de diversão e

companheirismo. Agradeço em especial ao amigo Vitor Lemos por me acompanhar nos

experimentos desde a graduação, pela dedicação e responsabilidade no desenvolver

deste projeto.

Ao grupo do Laboratório Especial de Micologia (UNIFESP), sob

responsabilidade do Prof. Arnaldo Lopes Colombo por cederem o software para

construção do dendrograma e pelo treinamento em sequenciamento molecular e teste de

sensibilidade à antifúngicos.

Ao Professor Ivanaldo Silveira, pela paciência e bondade com que me trata e me

acolheu no Laboratório de Microbiologia, bem como na disciplina de Microbiologia

Clínica.

Ao Professor Luiz Alberto Soares e à Magda Rayanne, por gentilmente nos

fornecerem o extrato de pitanga utilizado em todo este projeto.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) que

através do edital PROCAD-NF 08/2008, financiou este projeto e, especificamente às

Profas. Eveline Pipolo Milan e Terezinha Estivalet Svidzinski pela doação das cepas

clínicas de Candida albicans obtidas da cavidade oral de pacientes transplantados

renais.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pelo financiamento deste Projeto, através do Edital Universal 14/2011.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, pela

oportunidade em realizar em tempo hábil este mestrado.

Ao meu orientador, Prof. Guilherme Chaves, pela confiança em minha pessoa,

pela oportunidade que me deu de realizar este trabalho, por ser para todos os alunos do

LMMM, um exemplo a ser seguido em seriedade, compromisso, respeito e ética ao

trabalho. Agradeço por estar moldando o meu perfil de pesquisador e guiando os meus

passos na área acadêmica. Obrigado por tudo.

Bendito o homem que confia no Senhor,

e cuja esperança é o Senhor.

Porque ele é como árvore plantada junto às águas,

que estende as raízes para o ribeiro

que não receia quando vem o calor,

mas sua folha fica verde; e no ano de sequidão

não se perturba nem deixa de dar o seu fruto.

Jeremias 17:7-8.

ÍNDICE

RESUMO

ASBTRACT

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 18

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..................................................................... 20

2.1 A candidíase bucal................................................................................................. 20

2.2 Aspectos epidemiológicos da candidíase bucal..................................................... 21

2.3 A prevalência da candidíase bucal em pacientes transplantados renais................ 23

2.4 A perspectiva do agente patogênico: fatores de virulência de Candida albicans. 24

2.4.1 Morfogênese como fator de virulência em C. albicans......................................... 25

2.4.2 Atividade de fosfolipase........................................................................................ 26

2.4.3 Resistência à fagocitose por PMN......................................................................... 27

2.5 Utilizações de métodos moleculares para a avaliação epidemiológica de infecção

por Candida albicans..............................................................................

29

2.6 Utilização de extratos vegetais para a descoberta de novos alvos antifúngicos.... 31

3 OBJETIVOS........................................................................................................ 33

3.1 Objetivos gerais..................................................................................................... 33

3.2 Objetivos específicos............................................................................................. 33

4 METODOLOGIA................................................................................................ 34

4.1 Seleção de microrganismos................................................................................... 34

4.1.1 Verificação de viabilidade e pureza das leveduras armazenadas nos Laboratório

de Micologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e identificação

fenotípica das amostras..........................................................................................

34

4.2 Ensaios moleculares para genotipagem de espécies de leveduras......................... 35

4.2.1 Extração de DNA genômico de leveduras a partir de culturas.............................. 35

4.2.2 Ensaios moleculares para a tipagem de leveduras................................................. 36

4.2.3 Eletroforese em gel de agarose.............................................................................. 37

4.2.4 Avaliação da similaridade dos padrões de bandas................................................. 38

4.3 Determinação dos fatores de virulência de leveduras na presença e ausência do

extrato bruto de E. uniflora....................................................................................

39

4.3.1 Caldo NGY para padronização do inoculo............................................................ 39

4.3.2 Análise micromorfológica das leveduras crescidas em meio NGY na presença e

na ausência do E.B de E. uniflora..........................................................................

40

4.3.3 Ensaio de morfogênese em meio líquido............................................................... 40

4.3.4 Análise microscópica e mensuração do tamanho das hifas formadas no ensaio de

morfogênese......................................................................................................

41

4.3.5 Ensaio de morfogênese em meio sólido................................................................ 42

4.3.6 Atividade de fosfolipase........................................................................................ 42

4.3.7 Ensaio de fagocitose de C. albicans por PMN...................................................... 43

4.3.8 Análise estatística dos resultados.......................................................................... 45

5 RESULTADOS.................................................................................................... 45

5.1 Prevalência de C. albicans em isolados da cavidade oral..................................... 45

5.2 Genotipagem ABC................................................................................................. 47

5.3 Tipagem molecular pela técnica de Microssatélite................................................ 49

5.4 Análise dos padrões de bandas geradas por microssatélites versus genotipagem

ABC de Candida albicans

52

5.5 Correlação entre os fatores de virulência de Candida albicans crescidos na

ausência do extrato bruto de E. uniflora, com os genótipos A, B e C.................

55

5.5.1 Morfogênese em meio líquido............................................................................... 55

5.5.2 Avaliação da atividade de fosfolipase por C. albicans.......................................... 58

5.5.3 Fagocitose de C. albicans por polimorfonucleares................................................ 60

5.5.4 Atributos de virulência de isolados de Candida albicans oriundos de duas

diferentes regiões geográficas do Brasil (Nordeste e Sul).....................................

63

5.6 Análise da expressão dos fatores de virulência in vitro pelos isolados de Candida

albicans na presença do extrato bruto de Eugenia

uniflora...................................................................................................................

64

5.6.1 Morfogênese em meio líquido na presença do extrato bruto de Eugenia

uniflora.....................................................................................................................

64

5.6.2 Observação microscópica de células de C. albicans durante a transição entre

levedura-hifa (morfogênese), previamente crescidas em presença de E.B de E.

uniflora...................................................................................................................

65

5.6.3 Análise microscópica do tamanho das hifas formadas na presença e na ausência

de E.B de E. uniflora.............................................................................................

67

5.6.4 Evaginação lateral na presença do extrato bruto de E. uniflora............................ 70

5.6.5 Índice de morfologia (I.M) na presença do extrato bruto de E. uniflora .............. 73

5.7 Morfogênese em meio sólido do isolados crescidos na presença do extrato bruto

de E. uniflora................................................................................................

76

5.8 Ensaio de fagocitose de C. albicans por PMN crescidos na presença do extrato

bruto de E. uniflora................................................................................................

79

5.9 Avaliação da atividade de fosfolipase por C. albicans em presença de extrato

bruto de E. uniflora................................................................................................

83

6. DISCUSSÃO 86

7 CONCLUSÕES 99

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Separação de camadas de células por gradiente de

concentração,utilizando os reagentes Histopaque® 1077 e

Histopaque® 1119 com centrifugação a 500g durante 30 minutos à

25°C.

44

Figura 2. Perfil de bandas obtidas por meio da PCR utilizando os “primers” CA

INT-L e CA INT-R em cepas oriundas de Natal-RN. O genótipo A

apresenta uma única banda de 450pb, enquanto o genótipo B apresenta

uma banda de 840pb e o genótipo C, as duas bandas, uma de 450pb e

outra de 840 pb. PM-Peso molecular, C1-ATCC90028, C2-SC5413

(cepas de referência), B-Branco (controle negativo).

47

Figura 3. Distribuição dos genótipos de C. albicans obtidos pela metodologia da

genotipagem ABC. O genótipo A foi o mais prevalente, seguido do

genótipo C e do genótipo B.

48

Figura 4. Genotipagem por Microsatélite dos isolados clínicos de C. albicans

oriundos da cavidade oral de pacientes transplantados renais da cidade

de Maringá/PR. C1- C. albicans ATCC 90028; C2 – C. albicans

SC5314

50

Figura 5. Dendrograma dos 48 isolados clínicos de C. albicans, além das cepas

ATCC90028 e a SC5314, gerado através da matriz de similaridade

com 2% de tolerância.

54

Figura 6. Índice de morfologia (I.M) de células de C. albicans após 3h de

incubação em meio YPD líquido + 20% SFB, 37°C – 200 rpm

56

Figura 7. Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de C. albicans).

58

Figura 8. Fagocitose de células de C. albicans por PMN quando incubadas em

meio EMEM + 20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* =

Estatisticamente significante. Teste Mann-Whitney. P<0,05 ‡=Desvio

padrão)

61

Figura 9. Micromorfologia das células de C. albicans crescidas “overnight” em

presença de extrato bruto de E. uniflora, quando incubadas a 30 °C,

200 rpm., As setas indicam alteração na forma ovalada dos

blastoconídios e a presença de grandes vacúolos citoplasmáticos

(Objetiva de 40x).

64

Figura 10. C. albicans SC5314 previamente crescida na ausência de E.B de

E.uniflora, quando inoculada no meio YPD líquido+20%SFB, 37°C –

200rpm. 11A) Emissão de tubo germinativo após 1h de incubação.

11B) Hifa verdadeira formada após 3h de incubação

65

Figura 11. C. albicans 111R previamente crescida na ausência (A) e na presença

(B) de E.B de E.uniflora e posteriormente incubadas em meio YPD

líquido+20%SFB, 37°C – 200rpm. 12A) Hifas verdadeiras longas

formadas após 3h de incubação na ausência de E.B. 12B) Hifas

verdadeiras de tamanho reduzido após 3h de incubação na presença de

E.B. (Objetiva de 40x).

66

Figura 12. Mensuração do tamanho de hifa formada pela cepa ATCC 90028

formadas após 3h de incubação em meio YPD líquido+20% SFB

(37°C – 200 rpm) com células previamente crescidas na ausência e na

presença do E.B de E.uniflora.

67

Figura 12. Média dos tamanhos das hifas verdadeiras formadas após 3h de

incubação em meio YPD líquido+20% SFB (37°C – 200 rpm) com

células previamente crescidas na ausência e na presença do E.B de

E.uniflora.

68

Figura 13. Porcentagem de células que emitiram tubo germinativo por meio de

evaginação lateral nas leveduras de C. albicans quando incubadas em

meio YPD+SFB 20%, 37°C 200 rpm, por 1h. As cepas que cresceram

em presença do E.B de E.uniflora demonstraram uma acentuada

redução na emissão dos tubos germinativos.

70

Figura 14. Índice de morfologia (I.M) de células de C. albicans crescidas na

ausência e na presença de E.B de E. uniflora após 3h de incubação em

meio YPD líquido + 20% SFB, 37°C – 200 rpm.

74

Figura 15. Formação de hifa em meio sólido YPD+20% SFB. A.1) ATCC90028

sem E.B – A.2) ATCC90028 com E.B. B.1) SC5314 sem E.B – B.2)

SC5314 com E.B. C.1) Cepa 06L sem E.B – C.2) Cepa 06L com E.B.

D.1) Cepa 15g sem E.B – D.2) Cepa 15g com E.B. E.1) Cepa 15L sem

E.B – E.2 Cepa 15L com E.B. F.1) Cepa 111R sem E.B – F.2 Cepa

111R com E.B. Incubação à 37°C por 7 dias

78

Figura 16. Células de C. albicans crescidas na ausência do E.B de E. uniflora

eficazmente fagocitadas após co-incubação de ambas as células a 37

°C, por 3 h, 200 rpm. As setas indicam leveduras emitindo tubo

germinativo mesmo no interior das células fagocíticas. Objetiva de

40x.( Seta vermelha: C. albicans emitindo tubo germinativo no interior

do PMN; seta branca: PMN, seta amarela: blastoconídios fagocitados)

79

Figura 17. Células de C. albicans crescidas na presença do E.B de E. uniflora

não fagocitadas após co-incubação de ambas as células a 37 °C, por 3

h, 200 rpm. As células de C.albicans crescidas na presença do E.B de

E. uniflora tiveram uma acentuada diminuição no número de células

fagocitadas. As figuras mostram PMN com ausência de leveduras

fagocitadas em seu interior. Objetiva de 40x (Seta vermelha: PMN;

seta branca: C. albicans).

80

Figura 18. Fagocitose de células de C. albicans por PMN quando incubadas em

meio EMEM + 20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* =

Estatisticamente significante. Teste T de student. P<0,05 ‡=Desvio

padrão)

81

Figura 19. Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de C. albicans crescidas

na presença e na ausência do E.B de E .uniflora (* = Estatisticamente

significante. Teste T de student. P<0,05 ‡=Desvio padrão)

84

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Distribuição dos isolados clínicos de C. albicans quanto as

condições clínicas dos pacientes e a região geográfica de origem

46

Tabela 2. Distribuição das cepas de C. albicans oriundas de duas diferentes

cidades do Brasil (Natal-RN e Maringá-PR).

49

Tabela 3. Média dos fatores de virulência dos isolados clínicos de C.

albicans quando comparados pela região geográfica de origem

das cepas.

63

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

Als: Agglutinin-like sequence

ATCC: American Type Culture Collection

BSA: Bovine Serum Albumine

C.: Candida

CO2: Gás carbônico

Cph: Candida pseudohyphal regulator

ºC: Grau Celsius

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dATP: Desoxiadenosina trifosfato

dCTP: Desoxicitosina trifosfato

dGTP:Desoxiguanina trifosfato

dTTP: Desoxitimidina trifosfato

DO: Densidade óptica

EDTA: Ácido etileno diaminotetracético

Efg: Enhanced filamentous growth

et al.: Colaboradores

g/l: Grama por litro

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

h: Hora

Hwp: Hyphal wall protein

Hyr: Hyphally regulated protein

IM: Índice Morfológico

ITS: Internal Transcript Spacer

Kb: Kilobase

KCl: Cloreto de Sódio

KH2PO4: Fosfato de potássio monobásico

M: Molar

min: Minuto

mL: mililitro

mL/L: mililitro por litro

MLST: Multilocus Sequence Typing

mM: Milimolar

mm: Milímetro

MgCl2: Cloreto de magnésio

mg/mL: Miligrama por mililitro

μg/mL: Micrograma por mililitro

μL: microlitro

μM: micromolar

Nº: número

NaCl: Cloreto de sódio

Na2HPO3: Fosfato de sódio dibásico

NGY: Neopeptone – yeast extract - glucose

ng/μL: nanograma por microlitro

nm: nanômetro

PAMPs: Padrões moleculares associados a patógenos

PBS: Phosphate Buffered Saline

PCR: Polymerase Chain Reaction

pH: Potencial hidrogeniônico

PMNs: Polimorfonucleares

pmol/μL: Picomol por microlitro

®: marca registrada

rDNA: DNA codificador do RNA ribossomal

RFPL: Restriction Fragment Lenght Polymorphism

RNA: Ácido ribonucléico

rRNA: RNA ribossomal

ROS: Espécies reativas de oxigênio

Rpm: Rotações por minute

SDA: Sabouraud Dextrose Agar

spp.: Espécies

TAE: Tris acetato EDTA

TM: Trade Mark

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

U/mL: Unidade por mililitro

UV: Ultravioleta

YPD: Yeast Peptone Dextrose

YCB: Yeast Carbon Base

YNB: Yeast Nitrogen Base

Resumo

Candida albicans é uma levedura diplóide que em certas circunstâncias pode causar

infecções da cavidade oral e da orofaringe. A investigação de produtos naturais é

fundamental para a descoberta de novos alvos para o desenvolvimento de drogas

antifúngicas. Este estudo objetivou determinar os genótipos de 48 isolados clínicos de

C. albicans obtidos da cavidade oral de pacientes transplantados renais de duas distintas

regiões geográficas do Brasil. Além disso, foram investigados três fatores de virulência

in vitro: atividade de fosfolipase, morfogênese e a capacidade de escapar do ataque de

neutrófilos polimorfonucleares. A expressão destes fatores de virulência também foi

investigada na presença do extrato bruto de Eugenia uniflora. O genótipo A foi o mais

prevalente (30 isolados; 62,5%), seguido do genótipo C (15 isolados; 31,5%) e do

genótipo B (3 isolados; 6,25%). Quando a técnica do microssatélite com o primer M13

foi empregada, 80% dos isolados da região Sul foram agrupados no mesmo cluster.

Todos os isolados do genótipo C foram agrupados juntos em dois diferentes clusters

bem definidos. Isolados do genótipo C foram considerados mais resistentes à ação de

PMNs do que os dos genótipos A e B. As cepas isoladas do Sul do Brasil demonstraram

maior habilidade em combater a fagocitose por PMNs. Encontrou-se uma alta taxa de

isolados do genótipo C da cavidade oral deste grupo de pacientes. O extrato bruto de E.

uniflora inibiu a formação de hifa e fagocitose por PMNs, mas não apresentou efeito

significativo na atividade de fosfolipase. Este estudo caracterizou isolados clínicos de C.

albicans da cavidade oral de pacientes transplantados renais, contribuindo para um

melhor entendimento da patogênese e terapêutica alternativa para a candidíase oral.

Palavras-chave: Candida albicans, candidíase oral, pacientes transplantados renais,

genotipagem, fatores de virulência, Eugenia uniflora, produtos naturais.

Abstract

Candida albicans is a diploid yeast that in some circumstances may cause oral or

oropharyngeal infections. The investigation of natural products is mandatory for the

discovery of new targets for antifungal drugs development. This study aimed to

determine the genotypes of 48 clinical isolates of C. albicans obtained from the oral

cavity of kidney transplant patients from two distinct geographic regions of Brazil. In

addition, we investigated three virulence factors in vitro: phospholipase activity,

morphogenesis and the ability to evade from polymorphonuclear neutrophils. The

expression of these virulence factors in vitro was also investigated in the presence of the

crude extract of Eugenia uniflora. The genotype A was the most prevalent (30 isolates;

62.5%), followed by genotype C (15 isolates; 31.5%) and genotype B (3 isolates;

6.25%). When microsatellite technique with primer M13 was applied, 80% of the

isolates from the South were placed within the same cluster. All Genotype C strains

were grouped together within two different clusters. Genotype C was considered more

resistant to PMNs attack than genotypes A and B. Strains isolated from the South of

Brazil showed higher ability to combat PMNs phagocytosis. We found a high rate of

genotype C strains isolated from the oral cavity of this group of patients. The crude

extract of E. uniflora inhibited proper hypha formation and phagocytosis by PMNs, but

had no significant effect on phospholipase activity. This study characterized oral C.

albicans strains isolated from kidney transplant recipients and will contribute for the

better understanding of the pathogenesis and alternative therapeutics for oral

candidiasis.

Keywords: Candida albicans, oral candidiasis, kidney transplant recipients, genotyping,

virulence factors, Eugenia uniflora, natural products.

18

1 INTRODUÇÃO

Candida albicans é uma levedura diplóide que faz parte da microbiota normal da

cavidade oral e do trato gastrointestinal humano. Apesar de sua co-evolução junto com

o homem, como comensal, em determinadas ocasiões esta levedura pode sofrer uma

transição entre o estado de colonizante e passar a ser infectante. Esta alteração irá

depender de uma série de fatores associados tanto à fisiologia do micro-organismo,

quanto ao sistema imune do hospedeiro. Em relação ao patógeno, existe uma série de

características que estão diretamente associadas à sua patogenicidade, que são

denominados de fatores de virulência (Chaves et al,2012; Younes & Khalaf, 2013).

Os fatores de virulência de C. albicans contribuem tanto para uma manutenção

das cepas colonizantes como também para o dano e invasão tecidual, estabelecendo

assim a infecção. Entre os principais fatores de virulência de C. albicans estão a

capacidade de emitir estruturas filamentosas, transitando assim, da forma de levedura à

hifa verdadeira (morfogênese), fator este que contribui para a invasão dos tecidos, além

da secreção de enzimas hidrolíticas, como as fosfolipases, que irão degradar os

fosfolipídios de membrana. Associados a estes fatores está a capacidade de C. albicans

em resistir ao ataque de células fagocíticas, contribuíndo para evasão do sistema imune

(Yan et al., 2013).

Os pacientes nefropatas que são submetidos ao procedimento de transplante de

rim, ficam sujeitos ao uso de esquemas de imunossupressão medicamentosa, com o

objetivo de evitar uma rejeição do enxerto. O uso prolongado de imunossupressores, de

fato, torna este grupo de pacientes mais vulneráveis ao desenvolvimento de infecções

fúngicas oportunistas, sendo a candidíase oral, um dos quadros infecciosos oportunistas

mais prevalentes. (Carvalho et a. 2003. Al-Mohaya et a. 2002).

19

Com a finalidade de melhor entender os aspectos fisiológicos e história natural

relacionados aos micro-organismos, as técnicas moleculares são ferramentas muito úteis

para avaliar as rotas de infecção, variabilidade genética intra e interespecíficas, bem

como as chamadas microevoluções (Escribano et al. 2013)

O uso de produtos naturais que visam o tratamento de doenças tem aumentado nos

últimos tempos, frente à grande diversidade de plantas que existem em todo o planeta.

Por conseguinte, o número de publicações que estudam o comportamento de produtos

de origem vegetal tem ganhado destaque. De fato, ainda pouco se sabe a respeito dos

extratos vegetais no tratamento das infecções fúngicas, principalmente na candidíase,

bem como a relação dos compostos extrativos de plantas nos fatores de virulência de C.

albicans. Modelos alternativos de tratamento precisam ser investigados, uma vez que

Candida spp. podem se tornar resistentes a antifúngicos sintéticos convencionalmente

empregados na medicina contemporânea (Ishida et al,. 2006).

Diante destes fatos, o presente trabalho teve como objetivo avaliar

genotipicamente isolados clínicos de C. albicans oriundos da cavidade oral de pacientes

transplantados renais provenientes de duas regiões geográficas brasileiras distintas:

Natal, no estado do Rio Grande do Norte, região Nordeste e de Maringá, no estado do

Paraná, região Sul. Além disto, foi realizada a caracterização de fatores de virulência

(morfogênese, atividade de fosfolipase e resistência ao ataque de fagócitos) bem como

investigada a relação da atividade do extrato bruto de Eugenia uniflora nestes na

expressão destes atributos de patogenicidade.

20

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. A candidíase bucal

Apesar de algumas espécies de Candida, principalmente C. albicans fazerem

parte da microbiota normal de seres humanos, estas podem se tornar patogênicas, a

depender das condições imunológicas do indivíduo, associadas a fatores de virulência

do próprio micro-organismo (Odds, 1998; Calderone, 2002). C. albicans pode causar

infecções superficiais ou sistêmicas, levando o paciente a correr risco de vida nas

infecções mais graves, como a candidemia, cujos indivíduos acometidos podem

apresentar mortalidade atribuída da ordem de 40 a 60% (Gudlaugsson et al., 2003).

Dentre as infecções de mucosa, encontra-se a candidíase bucal. De fato, a

candidíase bucal é conhecida provavelmente há vários séculos, uma vez que a doença

clínica foi descrita por Hippocrates em 400 a.C., inicialmente designada como úlcera

oral. Embora Candida spp. vivam como comensais em 30 a 60% dos indivíduos

saudáveis, são capazes de causar infecção na presença de condições predisponentes do

hospedeiro, como doenças sistêmicas que levam a imunossupressão, uso de agentes

imunossupressores e citostáticos e transplante de órgãos (Colombo et al., 2007).

Usualmente, em resposta a mudanças fisiológicas no hospedeiro, as leveduras

bucais comensais podem causar infecção. A patogenicidade de Candida está

relacionada à aderência e multiplicação nas superfícies mucosas, com a formação de

tubo germinativo e filamentação, no caso de C. albicans (Calderone, 2002). A adesão

do micro-organismo à superfície da mucosa bucal do hospedeiro é um pré-requisito para

a instalação de uma infecção e também pode servir como reservatório para a

disseminação de infecções fúngicas (Calderone & Gow, 2002).

21

2.2 Aspectos epidemiológicos da candidíase bucal

A candidíase bucal pode ocorrer tanto em pacientes imunocomprometidos, quanto

imunocompetentes. Desde o surgimento da AIDS tem se reportado o aumento da

candidíase oroesofágica (COE), sendo este um importante marcador da progressão da

evolução clínica da infecção pelo vírus HIV (Chaves et al. 2013). Não obstante, é

importante ressaltar que esta tendência esteja diminuindo em recentes anos, em virtude

do emprego das terapias antiretrovirais (TARVs). Entretanto, não se pode negligenciar

os pacientes com HIV que vivem em países onde os recursos para estas terapias são

limitados, além das falhas terapêuticas e falta de resposta imunológica, mesmo em

pacientes recebendo TARV. Por conseguinte, é importante distinguir quais as

características clínicas e história natural do patógeno em pacientes HIV positivos, ou de

imunossuprimidos em geral, incluindo os pacientes transplantados (Milan et al., 2001).

A colonização oral por Candida em pessoas saudáveis, bem como portadores de

enfermidades é bastante estudada. Acredita-se que 5,7 % dos bebês estejam colonizados

durante o nascimento, sendo que este número aumenta para 14,2 % no momento em que

os mesmos deixam o ambiente hospitalar, voltando a regredir após um ano de idade, e

aumentando durante a senilidade. O uso de dentaduras definitivamente contribui para

este achado, além do aumento do uso de medicamentos e substituições prostéticas

dentárias. Vários autores têm relatado variadas taxas de colonização por Candida na

cavidade oral e alguns estudos sugerem que desde 2 até 71% de indivíduos adultos

saudáveis e de 13 até 73% de pacientes podem estar colonizados por esta levedura,

segundo os mais variados estudos. A grande variabilidade da freqüência de colonização

encontrada por diferentes autores é devido ao método de coleta (ex: swab oral ou da

22

faringe ou bochecho). Além disso, hábitos de higiene influenciam na taxa de

colonização (Ruhnke, 2002).

Estudos mais antigos sempre relataram a vasta predominância de C. albicans

como agente colonizante da cavidade bucal (Ruhnke, 2002), tendência ainda observada

nos dias de hoje, embora de maneira geral, tenha ocorrido o aumento do isolamento de

espécies de Candida não-Candida albicans (Chaves et al., 2013). Entretanto, em 1995

surge uma nova espécie de Candida, C. dubliniensis, altamente relacionada

geneticamente a C. albicans (Sullivan et al., 2005). Este fato pode ter influenciado na

avaliação epidemiológica principalmente de trabalhos mais antigos, uma vez que pode

ter havido uma identificação não acurada dos isolados de Candida colonizantes da

cavidade bucal, superestimando a prevalência de C. albicans sobre C. dubliniensis

(Runhke, 2002).

C. dubliniensis pode colonizar a cavidade bucal e vaginal de indivíduos saudáveis,

além de HIV-positivos. Ainda antes das TARVs, um estudo irlandês demonstrou que C.

dubliniensis foi isolada em 27% de pacientes HIV positivos e 32% de pacientes com

AIDS avançada (total de 192 pacientes), apresentando lesões típicas de COE (Coleman

et al., 1997).

Estudos moleculares indicam que várias cepas e até espécies diferentes podem

colonizar membranas mucosas de seres humanos. Colonização por até 3 genótipos

distintos de C. albicans pode ocorrer no mesmo indivíduo paralelamente ou

sequencialmente (Jacobsen et al., 2008). Entretanto, acredita-se que um genótipo

“dominante” persista nas mucosas e seja responsável por infecções recorrentes. Estas

cepas persistentes podem ser passadas de um indivíduo a outro sexualmente e mudanças

fenotípicas podem ocorrer, como por exemplo, pela exposição a drogas antifúngicas.

Um estudo recente escocês demonstrou que colônias distintas de C. albicans obtidas de

23

voluntários saudáveis e pacientes com COE e candidíase vaginal podem sofrer

microevolução ou serem completamente substituídas em indivíduos saudáveis, mas não

infectados, sugerindo mais uma vez a necessidade de crescimento seletivo de um único

genótipo para que a infecção por Candida aconteça (Jacobsen et al., 2008).

Alguns fatores de risco foram descritos como associados à COE. Com relação aos

fatores locais, temos como exemplo: composição da microbiota; dietas ricas em

carboidratos; hábito de tabagismo; alterações na saliva, como xerostomia e radioterapia;

alterações nas células epiteliais, como: atrofia, hipertrofia e displasia; presença de

dentaduras e hábitos de higiene. Quanto aos fatores sistêmicos, podemos citar:

fisiológicos (infância, senilidade e gravidez), distúrbios endócrinos (diabetes mellitus,

hipotireoidismo), deficiências nutricionais (ferro, vitamina B12 e ácido fólico), doenças

hematológicas malignas (leucemia e agranulocitose) e imunossupressão (AIDS, aplasia,

uso de corticosteróides e quimioterápicos; Campisi et al., 2008).

2.3 A prevalência da candidíase bucal em pacientes transplantados renais

A terapia de escolha para o tratamento de pacientes com insuficiência renal

crônica é o transplante de rim. A possibilidade de rejeição do enxerto e o desafio de se

encontrar um equilíbrio nos esquemas de imunossupressão medicamentosa, de forma

que estes não sejam excessivos, a ponto de produzir infecções, nem tão pouco leves o

suficiente para permitir a rejeição do órgão constituem dificuldades desse procedimento

(Carvalho at al. 2003). Essa imunossupressão crônica apresenta, frequentemente,

repercussões na cavidade bucal, que podem ser localizadas ou fazer parte de um quadro

de doença disseminada (JIN et al., 2004).

24

Um dos efeitos colaterais do processo pós-transplante é o desenvolvimento de

infecções oportunistas, que são a maior causa de morbidade e mortalidade como

resultado da imunossupressão (Al-Mohaya et al, 2002; Hwang et al., 2004).

A prevalência de candidíase bucal em receptores de transplante renal encontrada

na literatura varia de 9,4% a 46,7% (Al-Mohaya et al., 2002; De La Rosa-Garcia et al.,

2005; Guleç et al., 2003; King et al., 1994). Essa variação bastante ampla pode ser

atribuída à sensibilidade dos distintos métodos de coleta e isolamento utilizados, às

diferenças dos níveis de imunossupressão, critérios diagnósticos e populações de

estudo. De la Rosa-García et al. (2005), em estudo realizado com 90 receptores de

transplante de rim no México, observaram uma prevalência de 18,7% de candidíase

bucal. Al-Mohaya et al. (2002) diagnosticaram candidíase bucal em 15,5% dos 58

receptores de transplante renal avaliados. Güleç & Haberal (2010) estudaram a

prevalência de lesões orais em 100 receptores de transplante renal e encontraram uma

prevalência de 26% de candidíase bucal.

2.4 A perspectiva do agente patogênico: fatores de virulência de Candida

albicans.

Acredita-se que a imunidade do hospedeiro seja o principal fator regulador do

status de C. albicans no organismo. Entretanto, esta espécie possui atributos de

virulência peculiares uma vez que ela é definitivamente mais virulenta que outras

espécies de Candida, em modelos animais de infecção superficial e disseminada. Os

principais fatores de virulência de C. albicans incluem capacidade de aderência às

células epiteliais e endoteliais humanas, morfogênse, secreção de hidrolases, rápidas

modificações fenotípicas e variações antigênicas (Calderone, 2002). Além dos fatores

25

de virulência bem estabelecidos na literatura, a habilidade das células de C. albicans de

sobreviver ao ataque de células fagocíticas humanas é um importante fator no

estabelecimento de candídiase disseminada (Romani, 2002, Chaves et al., 2007).

Vários estudos de deleção de genes específicos foram relatados na literatura. Para

ser considerado como fator de virulência, o gene nocauteado deve causar uma atenuação

na virulência da cepa mutante quando inoculado em animais em modelo de infecção

experimental. O estudo de virulência desta espécie tem progredido bastante, devido ao

fato de seu genoma estar completo (Navarro-Garcia, et al., 2001).

2.4.1 Morfogênese como fator de virulência de Candida albicans

Acredita-se que a transição de levedura à hifa seja importante no estabelecimento

da infecção, uma vez que mutantes incapazes de formar hifa são atenuados em

virulência em camundongos. A morfogênese em C. albicans pode ser mediada por

vários fatores ambientais. Os parâmetros que induzem modificações morfológicas in

vitro incluem: temperatura de crescimento acima de 35 ºC, pH acima de 6.5, escassez de

carbono ou nitrogênio, baixas concentrações de oxigênio e alguns compostos químicos

como N-acetyl-glucosamina (GlCNac) aminoácidos e álcool. Alguns hormônios

humanos como hormônio luteinizante, gonadotrofina coriônica, progesterona e estradiol

também induzem a formação de hifa. Entretanto, soro é o mais potente indutor de

filamentação. É importante enfatizar que é sempre necessária a combinação de mais de

um desses fatores para a indução de filamentação (Taschdjian, 1960; Navarro-Garcia et

al., 2001, Brown, 2002, Bassilana, et al., 2005).

Cinco vias metabólicas foram reportadas como importantes para a formação de

hifa. a) A via sinalizada por pH (El Barkani, et al., 2000); b) A via Czf1 (zinc finger

26

protein), que promove a formação de hifa em matrizes sólidas (Brown, et al., 1999); a

via envolvendo o fator de transcrição Cph2 (fator de transcrição basic helix loop Cph2)

(Lane et al., 2001); a via metabólica sinalizada por Ras-cAMP (Ras-AMP cíclico), cujo

principal componente são os fatores de transcrição Efg1 (Elongation factor growth 1)

(Stoldt et al., 1997) e Cph1, pertencendo à via metabólica de MAP kinase (Liu et al.,

1994). Por conseguinte, genes que codificam estes fatores de transcrição podem ser

considerados essenciais para a formação de hifa em C. albicans.

Alguns genes (específicos de hifa) são expressos durante a transição de levedura a

hifa, mas não são essenciais para o desenvolvimento da mesma. Por exemplo, os genes

ALS3 e ALS8, ambos pertencentes à família ALS (agglutinin-like sequences) são

ativados quando as células de C. albicans são estimuladas com soro e N-acetyl-

glucosamina. Entretanto, o mutante duplo Δals3/als3/als8/als8 ainda é capaz de formar

hifa. Por conseguinte, nem ALS3, nem ALS8 são requeridos na formação de uma hifa

viável (Brown, 2002).

2.4.2 Atividade de fosfolipase

Um dos principais mecanismos que conferem aos fungos a capacidade de aderir,

infectar e causar doença é a produção das enzimas extracelulares denominadas

fosfolipases. O termo “fosfolipase” se refere a um grupo heterogêneo de enzimas que

possuem em comum a capacidade de quebrar ligações do tipo éster nos

glicerolfosfolipídios. Embora todos os fosfolipídeos sejam alvo das fosfolipases, cada

enzima tem a capacidade de clivar específicas ligações (Ghannoum, 2000).

27

Estas enzimas se localizam na superfície dos fungos e na extremidade dos tubos

germinativos produzidos por blastoconídios. Estas degradam os fosfolipídios

constituintes da membrana das células do hospedeiro levando a alteração nas

características de superfície que facilita a adesão fúngica e subseqüente infecção ou até

mesmo a própria destruição da célula (Barrett-Bee, et al., 1985)

A maior ação da fosfolipase ocorre onde a hifa entra em contato direto com a

membrana celular e em geral apenas as hifas conseguem invadi-las com sucesso, sendo

assim as fosfolipases extracelulares são muito importantes no processo de invasão dos

tecidos (Ghannoum, 2000).

O método de detecção da atividade da fosfolipase em placas em C. albicans e

outras leveduras foi descrito por Price, et al., (1982). A gema de ovo possui grande

quantidade fosfolipídios, principalmente fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. Por

conseguinte, estes dois fosfolipídios podem ser incorporados ao meio base de Ágar

Sabouraud Dextrose (ASD). As colônias que são produtoras de fosfolipases quando

crescem neste meio, apresentam uma densa zona de coloração branca, bem definida ao

redor da colônia. Essa zona densa se deve provavelmente à reação entre o cálcio e os

ácidos graxos provenientes da degradação dos fosfolipídios da gema do ovo pela

fosfolipase produzida pelas leveduras (Ghannoum, 2000).

2.4.3 Resistência à fagocitose por neutrófilos polimorfonucleares

A imunidade inata dos hospedeiros contra os micro-organismos patogênicos está

associada à presença de células fagocíticas, que de fato são a primeira linha de defesa do

28

sistema imune contra estes agentes. Os componentes essenciais para que este sistema de

defesa atue de forma efetiva são as células fagocíticas, como por exemplo, os

neutrófilos polimorfonucleares. (PMN) e os fagócitos mononucleares (Netea et al.,

1999).

O processo de reconhecimento das células de Candida pelo sistema imune está

relacionado com a presença de receptores específicos encontrados na parede celular das

leveduras e que são reconhecidos por receptores padrão encontrados nas células

fagocíticas (Gow et al, 2012).

A parede celular das leveduras é composta por polímeros de manana

covalentemente associadas a proteínas formando as glicoproteínas, os polissacarídeos de

quitina, que juntamente com as β-1,3-glucanas conferem a morfologia da célula.

Também são encontradas as glicosilfosfatidilinositol e as β-1,6-glucanas, na região

central na parede celular (Gow et al., 2012).

A avaliação do processo de fagocitose é observada quando células de C.

albicans são co-incubadas com PMNs isodados de sangue total em condições que

favorecem o reconhecimento e a fagocitose (Fradin et al 2005). O processo de

fagocitose pode ser observado microscopicamente avaliando-se o número de PMNs

contados e a porcentagem de leveduras fagocitadas em seu interior (Fradin et al., 2005).

As leveduras podem sobreviver ao ataque dos fagócitos em processo que

envolve a resistência ao estresse oxidativo, onde em resposta aos radicais intermediários

de oxigênio produzidos pelas células de defesa, C. albicans produz enzimas que

degradam estes compostos, como as enzimas catalase, superóxido desmutase (Sods) e

29

glutationa-redutase (Grx2), impedindo assim o dano oxidativo (Chaves et al, 2007,

Chaves & Silva, 2012).

2.5 Utilizações de métodos moleculares para a avaliação epidemiológica de

infecção por Candida albicans

A análise da similaridade genética entre diferentes cepas de uma mesma espécie

de micro-organismo patogênico é ferramenta fundamental para permitir a investigação

da história natural de infecções, caracterizar suas fontes e mecanismos de transmissão,

monitorar a emergência de cepas resistentes a drogas e auxiliar na definição de surtos

(Soll, 2000).

Na tentativa de aprimorar a análise de variabilidade biológica intra-específica,

vários métodos já foram desenvolvidos e adaptados para detectar polimorfismo genético

em espécies de leveduras. Entre os métodos mais utilizados em micologia médica

podemos citar: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) sem hibridização,

RFLP com hibridização por sondas, MLEE (Multiloccus Enzyme Electrophoresis),

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) e PFGE (Pulsed Field Gel

Electrophoresis; Soll, 2000). Todos estes métodos geram padrões de bandas de

fragmentos de DNA (fingerprintings de DNA) cujos resultados podem ser armazenados

e analisados por programas de computadores específicos, para geração de dendrogramas

e estimativa das distâncias filogenéticas entre as cepas estudadas (Soll, 2000; Sullivan

& Coleman, 2002).

A disponibilidade da técnica de PCR, a tecnologia do seqüenciamento automático

de DNA e a existência de bancos genômicos, permitem avaliação de tipagem genotípica

30

baseada em seqüenciamento em estudos epidemiológicos (Soll, 2000). O MLST

(multilocus sequence typing) é um método de alta resolução baseado na análise de

polimorfismo de nucleotídeos de seqüências de aproximadamente 450-500 pb de

fragmentos internos (loci) de genes essenciais. Cada seqüência diferente de um alelo

define um perfil alélico para cada amostra analisada (Bougnoux et al., 2002, Tavanti et

al., 2005; Tavanti et al., 2005a ). Este método já foi bem caracterizado para estudo de

várias bactérias patogênicas (Dingle et al., 2001; Enright et al., 2000), bem como para

eucariotos como C. albicans (Bougnoux et al., 2002; Bougnoux et al., 2006).

Em estudo realizado por McCullough et al., (1999) foi proposta uma metodologia

para a genotipagem de C. albicans, denominada de Genotipagem A,B,C. Neste estudo,

foi observado que um inserto de 379 nucleotídeos no rDNA, codificando a subunidade

25S do RNA ribossomal é responsável por uma banda de 4.2-kb em alguns isolados de

C. albicans caracterizando um genótipo denominado de genótipo B. Em outros isolados

este inseto não é observado, sendo gerada uma banda menor, de 3.7-kb na PCR; estes

isolados foram caracterizados como sendo C. albicans do genótipo A. Além destes, há

um suposto genótipo em transição entre os genótipos A e B, onde provavelmente um

isolado do genótipo A recebeu o íntron e está se tornando o genótipo B, mas que

apresenta como resultado de PCR os dois padrões de bandas encontrados nos genótipos

A e B separadamente, sugerindo assim uma possível reprodução sexuada. Este foi

denominado de genótipo C. No mesmo estudo é observada maior prevalência do

genótipo A, seguida pelo genótipo B e posteriormente, pelo genótipo C.

Outra metodologia molecular utilizada para avaliar a variabilidade genética e

traçar perfis genotípicos em C. albicans é a técnica de microssatélite. Esta técnica se

baseia na amplificação por meio de PCR, de regiões conhecidas como microssatélites,

31

que são sequencias curtas, de dois a seis nucleotídeos em média, que se repetem em

tandem (Sampaio et al, 2005; Li et al, 2008). O produto de PCR é gerado com um

padrão de múltiplas bandas (fingerprint) onde o primer se anelou nas fitas de DNA. As

imagens geradas na eletroforese são analisadas por meio de programas específicos de

computador que geram um dendrograma baseado em cálculos de algoritmos de

proximidade entre as cepas utilizadas na análise. Esta técnica vem demonstrando

bastante segurança para avaliar as diferenças entre as espécies bem como observar os

polimorfismos que naturalmente ocorrem dentro de uma mesma espécie (Sampaio et al,

2005; Li et al, 2008, Chaves et al., 2012). Desde o surgimento da técnica de

microssatélite, esta metodologia vem sendo utilizada como importante ferramenta para a

caracterização genotípica de C. albicans.

O uso do primer M13 para a reação de PCR por microssatélite têm sido utilizado

em pesquisa para a diferenciação de cepas patogênicas de Candida e Sacharomyces

cerevisiae (Xu et al, 1999; Chaves et al., 2012), bem como para caracterizar

genotipicamente grupos, cepas de Cryptococcus neoformans (Casali et al, 2003).

2.6 Utilização de extratos vegetais para a descoberta de novos alvos

antifúngicos

C. albicans geralmente é sensível a todos os agentes antifúngicos disponíveis.

Entre as espécies de Candida não-Candida albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis são

também sensíveis aos azóis, entretanto C. tropicalis possui sensibilidade menor ao

fluconazol que C. albicans. C. lusitaniae, responsável por 1–2% das candidemias é

susceptível aos azóis, contudo possui alta resistência intrínseca a anfotericina B. Por

32

outro lado, C. krusei apresenta resistência intrínseca ao fluconazol e C. glabrata

desenvolve resistência rapidamente após contato com este fármaco. Ambas têm

emergido como importantes agentes em infecções sistêmicas em pacientes

hospitalizados (Pfaller et al., 2006; Brito et al., 2006 Andes & Safdar, 2005; Hajjeh et

al., 2004; Ostrosky-Zeichner et al., 2003; Sanglard & Odds, 2002; Pappas et al., 2004).

Pesquisas de novos agentes antibacterianos e antifúngicos obtidos a partir de

extratos de plantas se intensificaram devido ao arsenal relativamente pequeno de drogas

disponíveis para o tratamento das micoses principalmente, além da problemática

envolvendo cepas resistentes.

Eugenia uniflora pertence à família Myrtaceae que apresenta espécies com

compostos fenólicos com ação antioxidante e algumas com ação hipoglicemiante e anti-

reumáticas, também utilizadas em distúrbios estomacais e como anti-hipertensiva. E.

uniflora (pitangueira) é uma planta de frutos comestíveis muito conhecida e apreciada

no Brasil, e o chá de suas folhas tem aplicação na medicina popular principalmente

como hipotensor, antigota, estomáquico e hipoglicemiante. Considerando a investigação

científica das propriedades farmacológicas de espécies diversas, relatos são encontrados

na literatura, como por exemplo: analgésica, hipoglicemiante, anti-hipertensiva e

antimicrobiana (Adebajo et al., 1989)

Em estudo prévio conduzido por Ferreira et al. (2013), foi realizada uma triagem

da atividade antifúngica de plantas medicinais do nordeste do Brasil. Em um total de 30

extratos brutos obtidos, observou-se uma ação mais efetiva no extrato da E. uniflora,

com MIC variando entre 31.25 a 62.5 μg/mL contra C. albicans, de 15.62 a 31.25

μg/mL contra C. dubliniensis e 15.62 μg/mL para C. glabrata e C. krusei.

33

Recentemente, demonstrou-se que o óleo da canela tem efeito antifúngico contra

células sésseis e formadoras de biofilme de C. ortopsilosis e C. parapsilosis (Pires et

al., 2011).

3.0 OBJETIVOS

3.1 Objetivos gerais

Apesar dos avanços no entendimento dos fatores de virulência de Candida

albicans, pouco se sabe da expressão destes fatores na presença de extratos vegetais

com potencial antifúngico. Deste modo o presente trabalho objetivou caracterizar

genotipicamente isolados clínicos de C. albicans, bem como fenotipicamente os fatores

de virulência na presença do extrato bruto de E. uniflora.

3.2 Os objetivos específicos

3.1 Determinar os genótipos mais frequentes de isolados comensais e infectantes

de Candida albicans obtidas da cavidade oral de pacientes transplantados renais

oriundos das regiões Nordeste e Sul do Brasil.

3.2 Caracterizar fenotipicamente isolados de Candida albicans, quanto à atividade

de fosfolipase, a transição levedura-hifa (morfogênese) e à capacidade de resistir ao

ataque de fagócitos.

34

3.3 Correlacionar os dados obtidos dos fatores de virulência, com os diferentes

genótipos de C. albicans obtidos, bem como com a procedência dos isolados (Regiões

Nordeste e Sul do Brasil).

3.4 Avaliar a capacidade de expressão dos fatores de virulência previamente

mencionados, na presença do extrato bruto da E. uniflora, verificando diferenças entre

os mesmos.

4.0 METODOLOGIA

4.1 Seleção de micro-organismos

4.1.1 Verificação de viabilidade e pureza das leveduras armazenadas nos

Laboratório de Micologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e

identificação fenotípica das amostras

Previamente aos experimentos, 48 cepas de C. albicans oriundas de 154 pacientes

transplantados renais (38 isoladas em Natal-RN e 10 em Maringá-PR) isoladas e

identificadas pela Dra. Eveline Pipolo Milan (UFRN) e pela Prof.ª Terezinha

Svidzinsky (UEM). As cepas estavam estocadas em freezer à -80°C em YPD líquido

com 20% de glicerol. Os isolados clínicos foram submetidos à verificação de sua

pureza e viabilidade. Para isso, as cepas foram semeadas em meio ágar Sabouraud

dextrose (SDA / Oxoid, Cambridge, UK) contendo cloranfenicol (Ariston), com

repiques sucessivos, com a finalidade de que os testes fossem realizados com culturas

recentes.

35

Para avaliação da pureza, as leveduras foram semeadas com alça de níquel-cromo

pela técnica de esgotamento, em placas de Petri (90x15 mm) descartáveis contendo

meio CHROMagar Candida® (BD, NJ, USA), meio cromogênico seletivo, que permite

a identificação de culturas mistas de leveduras. Após 48 horas de incubação a 37°C, as

colônias isoladas tiveram sua identificação confirmada por identificação clássica

(Warren & Hazen 1995, Baumgartner et al.,1996).

4.2 Ensaios moleculares para genotipagem de espécies de leveduras

4.2.1 Extração de DNA genômico de leveduras a partir de culturas

As cepas de C. albicans foram crescidas overnight em meio YPD líquido

(Dextrose 20g/L, Peptona 20g/L, Extrato de Levedura 10 g/L) incubadas em Shaker

(TE-420, Tecnal®) a temperatura de 30°C sob rotação de 200 rpm. Em tubos de

microcentrifugação de volume 1,5 mL, foram adicionados 1 mL de cada cultura

crescida e as amostras foram centrifugadas à 1300 rpm por 2 minutos. O sobrenadante

foi então descartado e o pellet ressuspendido em 25 µl do reagente Prepman® Ultra

(Applied Biosystems). Os tubos foram submetidos à vigorosa agitação por 5 min em

agitador de tubos. Após a agitação as amostras foram incubadas por 10 minutos em

banho-maria (Q334M-28, Quimis®) a 100°C. Os tubos foram centrifugados a 1300 rpm

por 2 minutos e o sobrenadante com o DNA extraído foi transferido para um novo tubo

e armazenado a -20°C. Após a extração, o DNA genômico foi quantificado e seu índice

de pureza avaliado utilizando-se espectrofotômetro (NanoDrop Thermo Scientific 2000;

Amershan Pharmacia Biotech), no qual foi mensurada a absorbância em 260 nm

36

(Concentração do DNA em ng/μl = Absx100x50) e em 280 nm (quantificação de

proteínas).

4.2.2 Ensaios moleculares para a tipagem de leveduras

Os isolados clínicos de C. albicans foram submetidos às técnicas de genotipagem

para avaliação da similaridade genética entre as mesmas. Para tanto foram utilizadas as

técnicas de genotipagem ABC e microssatélites, utilizando-se o primer M13 (Casali et

al., 2003). Para as reações de PCR realizadas para a genotipagem ABC, foram

adicionados em tubos de microcentrifugação de 0,2 mL de capacidade os seguintes

componentes: 12,5 µl de PCR Master Mix 2X, PROMEGA [Taq DNA polimerase

50u/mL; deoxinucleotídios (dATP,dGTP,dCTP,dTTP, 400μM cada); MgCl2 3mM], 1uL

de cada oligonucleotídio na concentração inicial de 10 pmol/μL;], 9,5 µl de água milli-

Q esterilizada livre de nucleases (PROMEGA), 1 µl do primer CA-INT-L (5′-ATA

AGG GAA GTC GGC AAA ATA GAT CCG TAA-3′), 1 µl do primer CA-INT-R (5′-

CCT TGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTA GAT-3′), 1 µl DNA genômico

diluído a 40ng/uL, totalizando um volume de 25 µl.

A amplificação foi realizada em um termociclador (TX 96, Amplitherm

Thermocyclers). Foram utilizados os seguintes ciclos de PCR: ciclo de desnaturação

inicial de 94°C por 3 minutos, seguido de 30 ciclos a 94° C – 1 minuto (desnaturação);

55°C – 1 minuto (anelamento); 72°C- 1 minuto (extensão). Para o ciclo de extensão

final, foi utilizada a temperatura de 72°C por 5 minutos. Para a técnica de genotipagem

ABC, os primers CA-INT-L e CA-INT-R foram utilizados (McCullough et al., 1999).

37

Para as reações de microssatélite, foram adicionados em tubos de

microcentrifugação de 0,2 mL, os seguintes componentes: 11,5 µl de água milli-Q

esterilizada, 2,5 µl de 10X buffer MgCl2 (Invitrogen Corporation, CA, USA), 5 µl de

dNTP mix 1,25 mM (6,3 µl dATP 100mM, 6,3 µl dGTP 100mM, 6,3 µl dCTP 100mM,

6,3 µl dTTP 100mM, 475 H2O milli-Q esterilizada Invitrogen Corporation, CA, USA);

3,5 µl de MgCl2 (Invitrogen Corporation, CA, USA) 25 mM, 1 µl do oligonucleotideo

50 pmol/ µl (Integrated DNA Technologies ) 0,13 µl de Tween-20; 0,4 µl de Taq DNA

polimerase (500 U) (Invitrogen Corporation, CA, USA) e 1 µl de DNA diluído à 40 ng/

µl, totalizando em um volume de 25 µl. Foi utilizado o primer M13 (5’ – GAG GGT

GGC GGT TCT -3’ ) para a metodologia do microssatélite (Casali et al., 2003). A

amplificação foi realizada em um termociclador (TX 96, Amplitherm Thermocyclers)

utilizando-se os seguintes ciclos de PCR: 1 ciclo de 97 °C por 3 min (desnaturação

inicial); 40 ciclos de 93 ºC por 20 s (desnaturação), 50 ºC por 1 min (anelamento) e 72

ºC por 2 min (extensão) e 1 ciclo de 72 ºC por 5 min (extensão final).

4.2.3 Eletroforese em gel de agarose

O gel de agarose (Ultra Pure Agarose-Invitrogen Corporation, CA, USA) para a

eletroforese foi preparado na concentração de 1,2% em solução tampão TAE 1X (Tris,

4,84g; acetato, 1,14g; EDTA, 2mL). Os produtos amplificados por PCR foram diluídos

em tampão orange G (Sigma-Aldrich; 10uL da reação em 2uL do tampão orange G) e 1

µl do marcador de peso molecular (100 base pair Ladder / Invitrogen Corporation, CA,

USA), diluído em 9uL de água milli –Q esterilizada adicionada de 2µL do tampão

Orange G. Para a corrida eletroforética dos produtos de amplificação de microssatelites

foi utilizada uma corrente elétrica de 100 volts por 30 minutos e em seguida a 55 volts

38

por 270 minutos (Fonte LPS 600V, Cuba LCH 13x15, Loccus Biotecnologia). Após o

término da eletroforese, o gel de agarose foi corado com solução de brometo de etídio

(Sigma-Aldrich) durante 20 minutos (400 mL de TAE 1X + 20 µl de brometo de etídio

10 mg/mL) e descorado em água destilada por 15 minutos.

Os padrões de bandas contidos nos géis tiveram sua imagem visualizada em um

transiluminador de raios UV (KODAK Gel Logic 100 Imaging System, Carestream),

capturada e salva para posterior análise utilizando-se o programa Gel Compar II

(Bionumerics).

4.2.4 Avaliação da similaridade dos padrões de bandas

A análise dos resultados gerados pelo método de microssatelite foi realizada por

dendrograma utilizando o programa GEL COMPAR II versão 4.0 Bionumerics

(Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) através de análise de agrupamento, de acordo com a

similaridade dos padrões de bandas obtidos.

Os géis foram comparados entre si após o aporte de suas imagens pelo programa

Gel Compar II. Este programa fez correções de distorções do gel, como padrões de

sorriso, através da comparação com um padrão universal e selecionou automaticamente

as bandas presentes no gel. As imagens originais dos géis foram analisadas visualmente

para desconsiderar os artefatos. O coeficiente de Dice com tolerância de 2% foi

utilizado para esta análise que se baseia na presença e ausência de bandas, bem como do

maior peso para as bandas em comum entre as amostras analisadas para gerar a matriz

de similaridade. Para gerar o dendrograma, foi utilizado o método UPGMA

(unweighted pair-group method using arithmetic averages), que baseado na matriz de

similaridade, fez o grupamento par a par das amostras, gerando desta maneira o

39

grupamento em uma árvore enraizada. Esta análise foi realizada em colaboração com o

Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo, do Departamento de Infectologia, Universidade

Federal de São Paulo-UNIFESP.

4.3 Determinação dos fatores de virulência de leveduras na presença e

ausência do extrato bruto de Eugenia uniflora

4.3.1 Caldo NGY para padronização do inóculo

Para a caracterização fenotípica dos diferentes isolados, as amostras foram

inicialmente crescidas em meio NGY (Neopeptona Difco 1g/L; dextrose 4g/L; Extrato

de leveduras Difco 1g/L), sendo para cada cepa utilizados 2 tubos cônicos de 15 mL, 1

contendo apenas o NGY e outro contendo o NGY adicionado do extrato bruto de E.

uniflora na concentração de 1000 µg/mL. Quando as células são inoculadas por “wet

looping” neste meio (com uma alça em anel carregada por um filme de suspensão de

leveduras rapidamente imersa no meio e removida) e incubadas por 18-24 h em shaker a

30 °C, 200 rpm, um inóculo de aproximadamente 2 x 108 células/mL é produzido.

Obs.: O extrato bruto de E. uniflora foi gentilmente cedido pelo Prof; Luiz

Alberto Soares, da Universidade Federal de Pernambuco, quando às análises da

expressão dos fatores de virulência in vitro envolviam a presença do referido extrato.

40

4.3.2 Análise micromorfológica das leveduras crescidas em meio NGY na

presença e na ausência do extrato bruto de Eugenia uniflora.

Para efeitos comparativos, as células de C. albicans crescidas em meio NGY

(30°C – 200 rpm) na presença e na ausência do E.B de E. uniflora foram observadas em

microscopia óptica e os aspectos micromorfológicos das leveduras foram observados,

com a finalidade de se observar alguma alteração nas células quando incubadas na

presença do E.B.

4.3.3 Ensaio de morfogênese em meio líquido

O ensaio da morfogênese foi realizado segundo técnica descrita por Chaves et al.,

(2007). As células de C. albicans foram crescidas overnight em meio NGY (30°C - 200

rpm) na presença e ausência do extrato bruto de E. uniflora. A absorbância da

densidade óptica do crescimento foi determinada em espectofotômetro à 600 nm (Libra

S32, Biochrom), com a finalidade de padronizar a quantidade de células que foram

incubadas no experimento. O valor da absorbância obtido na leitura das amostras deve

estar compreendido entre 0,8 e 1,2, o que corresponde a uma concentração aproximada

de 2x108 células/mL. As células de C. albicans foram padronizadas para 1x10

6

células/mL, o que corresponde a 50 µl do crescimento compreendido entre 0,8 e 1,2 de

absorbância.

Para a indução da morfogênese, o volume total da suspensão de leveduras foi

inoculado em caldo YPD + Soro Fetal Bovino (Sigma-Aldrich), em concentração de

20% (4 mL YPD liquido, 1 mL SFB) e incubadas sob agitação mecânica à temperatura

de 37° C, 200 rpm, por um período de até 3h de incubação. Posteriormente, uma

41

alíquota de 500 µL da suspensão foi adicionada à igual volume de formalina a 10% em

PBS em tubos de microcentrifugação de 1,5 mL de capacidade, armazenados a 4°C para

posterior leitura em microscópio em dois diferentes intervalos de tempo (1h e 3h de

incubação).

Para as amostras retiradas com 1h de incubação foram observadas 100 leveduras

em microscopia óptica (400x de magnificação; CX21, Olympus) para a determinação da

porcentagem de evaginação lateral (formação de tubos germinativos).

Para as amostras incubadas por um período de 3h, as células também foram

observadas da mesma forma previamente descrita, para o cálculo do índice de

morfologia: às células esféricas de C. albicans que apresentavam morfologia de

blastoconídio foi atribuído o valor IM=1, células apresentando diâmetro com o dobro do

comprimento, IM=2, células com aparência de pseudo-hifas, IM=3 e longas hifas

verdadeiras de lados paralelos, I.M=4. Para a determinação do I. M. foi empregada a

seguinte fórmula:

Índice de morfologia I.M=(N°IM1x1)+(N° IM2 x2)+(N° IM3 x 3)+(N° IM4 x4)

100

4.3.4 Análise microscópica e mensuração do tamanho das hifas formadas no

ensaio de morfogênese.

Os isolados clínicos de C. albicans submetidos ao ensaio de morfogênese foram

analisados microscopicamente e o tamanho das hifas formadas após 3h de ensaio de

morfogênese foi determinado. Para isto, utilizando microscopia óptica em 400x de

magnificação (Leitz, Leica Biomed). 100 hifas verdadeiras foram posicionadas em

42

régua graduada em 200x200 µm e seus tamanhos foram registrados. Para cada cepa, a

média de 100 hifas foi calculada para os isolados crescidos na presença e na ausência do

E.B de E. uniflora.

4.3.5 Ensaio de morfogênese em meio sólido

O ensaio de morfogênese de C. albicans em meio sólido foi realizado de acordo

com Chaves et. al (2007). Células de C. albicans foram crescidas overnight (30°C - 200

rpm) em meio NGY na presença e na ausência do extrato bruto de E. uniflora para a

padronização do inóculo. Cinco microlitros de células foram inoculados na superfície de

meio YPD sólido (dextrose 20g/l, peptona 20g/l, extrato de levedura 10g/l, Agar 15g/l)

adicionado de 20% de SFB em placas de Petri 90x15mm, incubadas a 37°C por até 7

dias. A análise macroscópica das colônias quanto à capacidade de formação de hifa foi

realizada utilizando-se cada cepa previamente crescida na presença e ausência de

extrato bruto de E. uniflora para fins comparativos.

4.3.6 Atividade de fosfolipase

Para detecção de atividade de fosfolipase, foi utilizado o método de Price et al.

(1982). Culturas crescidas overnight em NGY na presença e na ausência do extrato

bruto de E. uniflora foram diluídas e padronizadas a uma concentração de 2 x 105

cells/mL e a suspensão de células inoculada em triplicata em superfície de ágar

fosfolipase (peptona 10g, dextrose 40g, Agar 16g, Egg Yolk Emulsion (Fluka) 80 mL).

As placas foram incubadas por 72h. Após o período de incubação, os diâmetros das

43

colônias e os halos formados foram medidos. O Pz (zona de fosfolipase) foi

determinado pela seguinte equação:

Pz = diâmetro da colônia (cm)______________

Diâmetro da colônia (cm) + zona de precipitação (cm)

As amostras com valores de Pz=1.0 são consideradas fosfolipase negativas,

enquanto valores mais baixos indicam cepas produtoras de fosfolipase

4.3.7 Ensaio de fagocitose de Candida albicans por neutrófilos

polimorfonucleares

O ensaio de fagocitose de C. albicans por neutrófilos polimorfonicleares foi

realizado segundo metodologia proposta por Fradin et al., (2007). As células de C.

albicans foram crescidas overnight em meio NGY (30°C - 200 rpm) na presença e

ausência do extrato bruto de E. uniflora para a padronização do inóculo. As células de

C. albicans foram lavadas três vezes com solução salina e ressuspendidas em meio

EMEM (Sigma-Aldrich) + 20mM HEPES (Sigma-Aldrich), pH 7,2, sendo

posteriormente ajustadas para uma concentração final de 5x106 células/mL. Os PMNs

foram isolados por gradiente de concentração utilizando-se os reagentes Histopaque

1119® e Histopaque 1077® (Sigma Aldrich). O sangue total foi coletado sempre de um

mesmo doador saudável, utilizando-se tubos contendo EDTA. Em tubo de ensaio

estéril, foram adicionados 2,5 mL do Histopaque 1119® e em seguida 2,5 mL do

Histopaque 1077®. Gentilmente, 5 mL do sangue foram adicionados sobre o

44

Histopaque 1077®, sendo o tubo de ensaio centrifugado a 500g durante 30 min. A

camada superior de plasma foi isolada para opsonizar as células de C. albicans. As

camadas de mononucleares e plaquetas foram desprezadas. A camada de PMNs foi

isolada (Fig. 01), lavada com solução salina 3 vezes e as células ressuspendidas para

uma concentração 8x105 cel/mL (determinada em contagem em câmara de Neubauer).

Às células de C. albicans foi adicionado 10% do volume de plasma e incubadas a

37°C por 10 min para opsonização. Após a opsonização, 250µL das células opsonizadas

foram co-incubadas com igual volume da suspensão de PMNs à temperatura de 37°C –

Figura 1. Separação de camadas de células por gradiente de concentração,utilizando os reagentes

Histopaque® 1077 e Histopaque® 1119 com centrifugação a 500g durante 30 minutos à 25°C

45

50 rpm sob agitação mecânica por um período de 3h de incubação. Após a incubação,

500 µL de formalina 10% em PBS foram adicionados e as amostras armazenadas à 4°C.

Foram contados 100 neutrófilos e o número de células de C. albicans fagocitadas

no interior de cada PMN, com o auxílio de microscopia óptica (400 x de magnificação;).

4.3.8 Análise estatística dos resultados

Para comparação dos valores dos fatores de virulência entre dois isolados,

aplicou-se o teste t de Student, utilizando-se o Programa Microsoft Office Excel® 14.0

(Microsoft Corporation).

Para comparação entre grupos de isolados quanto aos fatores de virulência em

diversas situações, aplicou-se o teste t não paramétrico de Mann-Whitney, utilizando o

GraphPad Instat® (GraphPad Software, USA).

Em todos os testes estatísticos, considerou-se diferença significativa quando

p<0,05.

5 RESULTADOS

5.1 Prevalência de Candida albicans em isolados da cavidade oral

As amostras foram coletadas da cavidade oral de pacientes transplantados renais

de duas diferentes regiões do Brasil, Natal-RN (Nordeste) e Maringá-PR (Sul). Um total

de 48 cepas de C. albicans foi isolado de 154 pacientes. A presença de lesões

pseudomembranosas ou eritematosas foi associada com 11 isolados (22,9%), enquanto

46

que 37 (77,10%) eram cepas colonizantes, onde não foi possível se observar a presença

de lesões. Apenas uma única amostra de cada paciente foi coletada, exceto para três

pacientes de Maringá. Do paciente 37, a cepa 06A foi obtida da saliva, enquanto que o

isolado 06L foi obtido de lesão da cavidade oral. Do paciente 38 foram obtidos 2

isolados de C. albicans a partir de uma mesma lesão, cujas colônias eram

fenotipicamente distintas (10Li, lisa e 10S, rugosa). O Paciente 40 apresentou 2 lesões

diferentes, de onde duas cepas foram obtidas, uma da língua e outra da gengiva (15L e

15G, respectivamente), além de outra amostra da saliva (15A; Tabela 1).

Paciente Cepa Condição

clínica

Região

geográfica

Paciente Cepa Condição

clínica

Região

geográfica

1 1 Colonização Natal 25 46 Colonização Natal



4 5 Infecção Natal 28 53 Colonização Natal









13 21 Colonização Natal 37 06A Colonização Maringá

14 23 Colonização Natal 37 06L Infecção Maringá

15 24 Infecção Natal 38 10S Colonização Maringá

16 28 Infecção Natal 38 10Li Colonização Maringá




20 34 Colonização Natal 40 15G Infecção Maringá


22 40 Infecção Natal 41 18A Colonização Maringá

23 41 Colonização Natal 42 111L Colonização Natal

Tabela 1. Distribuição dos isolados clínicos de Candida albicans quanto às condições clínicas dos

pacientes e a região geográfica de origem.

47

24 44 Infecção Natal 42 111R Colonização Natal

5.2 Genotipagem ABC

O DNA genômico das 48 cepas de C. albicans isoladas da cavidade oral de

pacientes transplantados renais, sendo 38 oriundas de Natal-RN (79,17%) e 10 oriundas

de Maringá-PR (20,83%) foram amplificadas utilizando-se o método de genotipagem

ABC utilizando-se os primers CA INT-L e CA INT-R. Para efeitos comparativos, as

cepas de referência utilizadas foram a ATCC90028 e a SC5314, ambas do genótipo A.

Esta técnica é baseada na amplificação de regiões específicas de um íntron

localizado no gene 26S do DNA ribossomal que apresenta tamanho variável segundo os

diferentes genótipos de C. albicans.

O genótipo A possui um perfil de amplificação de banda de peso molecular de

450pb, enquanto o genótipo B apresenta uma banda de 840pb e o genótipo C apresenta

as duas bandas (Figs.2 A e B).

Figura 2.A - Perfil de bandas obtidas por meio da PCR utilizando os primers CA INT-L e CA INT-R

em cepas oriundas de Natal-RN. O genótipo A apresenta uma única banda de 450pb, enquanto o

genótipo B apresenta uma banda de 840pb e o genótipo C, as duas bandas, uma de 450pb e outra de

840 pb. PM-Peso molecular, C1-ATCC90028, C2-SC5413 (cepas de referência), B-Branco (controle

negativo).

A

48

O genótipo mais prevalente entre todas as cepas de C. albicans foi o A, com 30

cepas (62,5%), seguido do genótipo C com 15 cepas (31,25%) e o genótipo B, com 3

cepas (6,45%; Fig. 3.)

Figura 3. Distribuição dos genótipos de Candida albicans obtidos pela metodologia da genotipagem

ABC. O genótipo A, representado foi o mais prevalente, seguido do genótipo C e do genótipo B

Figura 2.B - Perfil de bandas obtidas por meio da PCR utilizando os primers CA INT-L e CA INT-R em cepas

oriundas de Natal-RN. O genótipo A apresenta uma única banda de 450pb, enquanto o genótipo B apresenta

uma banda de 840pb e o genótipo C, as duas bandas, uma de 450pb e outra de 840 pb. PM-Peso molecular,

C1-ATCC90028, C2-SC5413 (cepas de referência), B-Branco (controle negativo).

B

49

A distribuição dos genótipos em relação às duas diferentes cidades em que foram

isolados segue como descrita na Tabela 2.

5.3 Tipagem molecular pela técnica de microssatélite

A tipagem molecular das cepas clínicas isoladas de pacientes transplantados

renais oriundos das duas mencionadas cidades das regiões Norte e Sul do Brasil,

também foi realizada por meio da metodologia de microssatélite, a qual amplifica

regiões em que sequencias curtas de nucleotídeos se repetem em tandem. O DNA

genômico de todos os isolados foi amplificado com o primer M13. A amplificação do

DNA gerou padrão de bandas bem definidos, variando de 100 pb a 2 KB, sendo que a

técnica de microssatélite demonstrou satisfatório poder discriminatório. Os padrões de

bandas gerados após a PCR revelaram a presença de fragmentos de alta intensidade

comuns a todas as cepas (600 pb), caracterizando-as como C. albicans, ressaltando as

bandas que são conservadas nesta espécie, além disto, é visível a variação entre as

bandas que não são conservadas, demonstrando a variabilidade genética intra-

específica (Figs. 4 A a 4 E ).

Tabela 2. Distribuição das cepas de Candida albicans oriundas de duas diferentes cidades do Brasil (Natal-

RN e Maringá-PR) .

50

Fig 4.A – Genotipagem por Microsatélite dos isolados clínicos de Candida albicans oriundos da cavidade

oral de pacientes transplantados renais da cidade de Maringá/PR. C1- Candida albicans ATCC 90028;

C2 – Candida albicans SC5314

Fig 4.B – Genotipagem por Microsatélite dos isolados clínicos de Candida albicans oriundos da

cavidade oral de pacientes transplantados renais das cidades de Maringá/PR e de Natal/RN. C1-

Candida albicans ATCC 90028; C2 – Candida albicans SC5314.

A

B

51

Fig 4.C – Genotipagem por Microsatélite dos isolados clínicos de Candida albicans oriundos da

cavidade oral de pacientes transplantados renais da cidade de Natal/RN. C1- Candida albicans ATCC

90028; C2 – Candida albicans SC5314

Fig 4.D – Genotipagem por Microsatélite dos isolados clínicos de Candida albicans oriundos da

cavidade oral de pacientes transplantados renais da cidade Natal/RN. C1- Candida albicans ATCC

90028; C2 – Candida albicans SC5314.

C

D

52

5.4 Análise dos padrões de bandas geradas por microssatélites versus

genotipagem ABC de Candida albicans

Como esperado, os controles externos de C. albicans, SC5314 e ATCC90028,

foram agrupados em clusters completamente diferentes, através das análises por

dendrograma utilizando-se o programa GelCompar II, comprovando a eficácia da

técnica em discriminar isolados de diferentes regiões geográficas. As cepas de

referência apresentaram 75% de similaridade, sendo agrupadas juntas em um cluster

diferente de todos os demais isolados clínicos (Fig. 5).

Não foi possível detectar nenhum cluster que agrupasse apenas isolados

colonizantes ou infectantes. Além disso, em ambos os casos, isolados apresentando

Fig 4.E – Genotipagem por Microsatélite dos isolados clínicos de Candida albicans oriundos da

cavidade oral de pacientes transplantados renais das cidade de Natal/RN. C1- Candida albicans

ATCC 90028; C2 – Candida albicans SC5314.

E

53

100% de similaridade, mesmo sendo obtidos de pacientes diferentes, foram

encontrados. Com relação às comparações sobre o relacionamento genético dos isolados

obtidos das duas regiões geográficas do Brasil, observou-se um cluster composto pela

grande maioria dos isolados de Maringá-PR (80% destes). Além disso, estes isolados

apresentaram de 80 a 93% de similaridade em cada cluster (Fig. 5).

Foi possível observar uma correlação entre o mesmo genótipo ABC de C.

albicans e uma alta porcentagem de similaridade entre os isolados comparados pela

técnica de microssatélite. Na maioria dos casos, isolados considerados altamente

relacionados pela técnica de microssatélite, observando-se os padrões de banda obtidos

com o primer M13, também apresentaram o mesmo genótipo A ou C, com exceção de 2

casos: os isolados 02 e 85 de Natal, além das cepas 15 L e 18 A, de Maringá;

genótipos A e C, em ambos os casos). Além disso, as cepas de C. albicans do genótipo

C de Natal foram agrupadas em 2 clusters completamente distintos, com mais de 90 %

de similaridade entre os isolados pertencentes a cada cluster. Em relação ao genótipo B,

dois de três isolados demonstraram uma similaridade de 94%, sendo agrupados no

mesmo cluster (Fig. 5).

Além disso, quando mais de um isolado foi obtido de diferentes amostras de um

mesmo paciente, todos estes apresentaram o mesmo genótipo ABC (genótipo A).

Entretanto, estes isolados não foram considerados idênticos pela técnica de genotipagem

por Microssatélite utilizando-se o primer M13, onde certo grau de variabilidade

genética foi observado (Fig. 5).

54

Fig. 5 – Dendrograma dos 48 isolados clínicos de Candida albicans, além das cepas ATCC90028 e a

SC5314, gerado através da matriz de similaridade com 2% de tolerância.

55

5.5 Correlação entre os fatores de virulência de Candida albicans crescidos na

ausência do extrato bruto de Eugenia uniflora, com os genótipos A, B e C.

5.5.1 Morfogênese em meio líquido

Quando o índice de morfologia (I.M) foi utilizado para atribuir scores à

morfologia das células, não foi possível de se observar diferenças entre os isolados

pertencentes aos três diferentes genótipos A, B ou C. A capacidade de morfogênese dos

isolados (mudança da forma de blastoconídio à hifa verdadeira) foi verificada na

presença de YPD+20% de soro. Os diferentes isolados apresentaram células

predominantemente na forma de pseudo-hifa, com um I.M variando de 2,66 ± 0,61

(genótipo C) a 2,77 ± 0,69 (genótipo A). O I.M médio de isolados do genótipo B foi

2,67 ± 0,71 (Figs. 6A a 6D). Não se observou diferença significativa entre a capacidade

dos isolados em formar hifa verdadeira.

56

Fig 6.A – Índice de morfologia (I.M) de células de Candida albicans após 3h de incubação em meio

YPD líquido + 20% SFB, 37°C – 200 rpm.

Fig 6.B – Índice de morfologia (I.M) de células de Candida albicans após 3h de incubação em meio


A

B

57

Fig 6.C – Índice de morfologia (IM) de células de Candida albicans após 3h de incubação em meio


Fig 6.D – Índice de morfologia (I.M) de células de Candida albicans após 3h de incubação em meio


C

D

58

5.5.2 Avaliação da atividade de fosfolipase por Candida albicans

Observou-se uma positiva atividade de fosfolipase para todos os isolados,

determinada quando os isolados de C. albicans foram incubados em ágar fosfolipase, à

temperatura de 30ºC. Não houve diferença significativa quanto à atividade de

fosfolipase dos isolados do genótipo A (Média= 0,51± 0,04), genótipo C (Média= 0,55±

0,05) e do genótipo B (Média= 0,57± 0,07; Figs. 7A a 7D).

Fig 7.A – Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans.

59

Fig 7.B – Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans.

Fig 7.C – Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans.

C

B

60

5.5.3 Fagocitose de Candida albicans por polimorfonucleares

Houve uma grande variabilidade dos isolados de C. albicans, quanto à capacidade

em resistir ao ataque de fagócitos por PMNs, determinada pelo número de células de C.

albicans fagocitadas por 100 PMNs, após 3 h de co-incubação dos dois tipos de células,

isolados pertencentes ao genótipo C foram significativamente mais resistentes ao ataque

das células fagocíticas que os isolados pertencentes aos dois outros genótipos (A e B)

(Média= 109,93 ± 12,29). A média do número de leveduras do genótipo A, fagocitadas

por 100 PMNs foi de 121,67 ± 16,06 e do genótipo B de 141,33 ± 14,27 (Fig. 8A a 8D).

Fig 7.D – Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans

D

61

Fig 8.A – Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio EMEM +

20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* = Estatisticamente significante. Teste Mann-

Whitney. P<0,05 ‡ =Desvio padrão)

Fig 8B – Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio EMEM +

20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. . (* = Estatisticamente significante. Teste Mann-


A

B

62

Fig 8C – Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio EMEM +

20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* = Estatisticamente significante. Teste Mann-


Fig 8D – Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio EMEM +

20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. . (* = Estatisticamente significante. Teste Mann-


C

D

63

5.5.4 Atributos de virulência de isolados de Candida albicans oriundos de

duas diferentes regiões geográficas do Brasil (Nordeste e Sul).

Quando os fatores de patogenicidade foram comparados entre todos os isolados

obtidos das duas regiões geográficas, as cepas oriundas de Maringá expressaram mais

ativamente todos os fatores de virulência avaliados. Esta diferença foi considerada

estatisticamente significativa para resistência à fagocitose por PMNs (Tabela 3).

Interessantemente, 40% dos isolados obtidos de Maringá foram infectantes, enquanto

que apenas 18,4% dos isolados de Natal foram infectantes.

*Teste Mann-Whitney. P<0,05 ‡ =Desvio padrão

Fator de virulência Natal vs Maringá

Atividade de fosfolipase

Pz

0.53 ± 0.05 vs 0.51 ± 0.04

Índice de morfologia

I.M

2.70 ± 0.65 vs 2.85 ± 0.72

Número de células de C. albicans fagocitadas

por 100 PMNs*

125.61 ± 14.61 vs 96.50 ± 16.36*

Tabela 3. Média dos fatores de virulência dos isolados clínicos de Candida albicans quando comparados

pela região geográfica de origem das cepas.

64

5.6 Análise da expressão dos fatores de virulência in vitro pelos isolados de

Candida albicans na presença do extrato bruto de Eugenia uniflora.

5.6.1 Morfogênese em meio líquido na presença do extrato bruto de Eugenia

uniflora

As células de C. albicans que foram crescidas em meio NGY overnight a 30°C e

200 rpm na presença do extrato bruto de E. uniflora foram observadas à microscopia

óptica sob objetiva de 40x. Estas apresentaram alterações nas morfologias, modificando

a forma convencional esférica ou oval típica dos blastoconídios. As células de levedura

também apresentaram um aumento na quantidade de vacúolos citoplasmáticos (Fig. 9).

Figura 9. Micromorfologia das células de Candida albicans ATCC90028 crescidas overnight em presença de

extrato bruto de Eugenia uniflora, quando incubadas a 30 °C, 200 rpm., As setas indicam alteração na forma

ovalada dos blastoconídios e a presença de grandes vacúolos citoplasmáticos (Objetiva de 40x).

65

5.6.2 Observação microscópica de células de Candida albicans durante a

transição entre levedura-hifa (morfogênese), previamente crescidas em presença

do extrato bruto de Eugenia uniflora

Foi possível observar a evaginação lateral (emissão do tubo germinativo) na

primeira hora de incubação na ausência de E.B (Fig. 10A). Após 3 h de incubação, o

tamanho das hifas formadas era consideravelmente maior, com vários isolados

apresentando a habilidade de formar hifas verdadeiras, com IM de 4, a exemplo da cepa

de referência SC5314 (Fig. 10B).

Quando observadas através de microscopia óptica, as cepas de C. albicans

crescidas na presença do EB de E. uniflora apresentaram uma menor porcentagem de

células que emitiam tubo germinativo (evaginação lateral) à 1h de incubação, a 37 °C

bem como uma redução no índice de morfologia observado após 3h de incubação, para

a grande maioria dos isolados.

Figura 10. Candida albicans SC5314 previamente crescida na ausência de extrato bruto de Eugenia

uniflora, quando inoculada no meio YPD líquido+20%SFB, 37°C – 200rpm. 10(A) Emissão de tubo

germinativo após 1h de incubação. 10(B) Hifa verdadeira formada após 3h de incubação. (Objetiva de

40x).

A B

66

Quando avaliamos os isolados separadamente, a cepa 111R, oriunda de Natal-RN

apresentou uma notável habilidade na formação de hifa verdadeira, podendo ser

observado quando a mesma foi crescida na ausência de E.B de E. uniflora (Fig 11A).

Apesar de ser um isolado altamente formador de longas hifas verdadeiras, quando as

células foram crescidas na presença do E.B e realizado o ensaio de morfogênese,

também foi observada visualmente uma redução no comprimento das hifas formadas,

onde a cepa 111R apresenta hifas mais curtas do que quando crescidas na ausência de

E.B de E. uniflora (Fig. 11B).

Figura 11. Candida albicans 111R previamente crescida na ausência (A) e na presença (B) de extrato bruto

de Eugenia uniflora e posteriormente incubadas em meio YPD líquido+20% soro fetal bovino, 37°C –

200rpm. 11(A) Hifas verdadeiras longas formadas após 3h de incubação na ausência de E.B. 11(B) Hifas

verdadeiras de tamanho reduzido após 3h de incubação na presença de extrato bruto. (Objetiva de 40x).

A B

67

5.6.3 Análise microscópica do tamanho das hifas formadas na presença e na

ausência de extrato bruto de Eugenia uniflora.

Uma vez que verificamos visualmente que células de C. albicans crescidas na

presença e na ausência de E.B de E. uniflora apresentaram hifas verdadeiras mais

curtas, durante o experimento de morfogênese, foi realizada a medição do tamanho das

hifas formadas após 3h de incubação, para 14 isolados do presente estudo, além das

cepas de referência. Para tanto, escolheram-se aleatoriamente isolados com alta, média e

baixa redução do IM, quando as células foram incubadas na presença do extrato bruto

de E. uniflora. Houve uma nítida redução do tamanho das hifas, quando os isolados

foram pré-crescidos na presença do extrato bruto de E. uniflora (Média de 21 µm na

ausência versus 14 µm na presença do E.B (Figs. 12A a 12D; P<0,05).

A figura 12 ilustra a redução no tamanho da hifa formada pela cepa de C. albicans

ATCC90028 quando realizado o ensaio de morfogênese com células crescidas na

presença e na ausência do E.B de E. uniflora.

Figura 12. Mensuração do tamanho de hifa formada pela cepa de Candida albicans ATCC90028

formadas após 3h de incubação em meio YPD líquido+20% soro fetal bovino (37°C – 200 rpm)

com células previamente crescidas na ausência e na presença do extrato bruto de Eugenia uniflora.

68

Figura 12A - Média dos tamanhos das hifas verdadeiras formadas após 3h de incubação em meio

YPD líquido+20% SFB (37°C – 200 rpm) com células previamente crescidas na ausência e na

presença do extrato bruto de Eugenia uniflora.

Figura 12B - Média dos tamanhos das hifas verdadeiras formadas após 3h de incubação em meio



69

Figura 12C. - Média dos tamanhos das hifas verdadeiras formadas após 3h de incubação em meio



Figura 12D. Média dos tamanhos das hifas verdadeiras formadas após 3h de incubação em meio YPD

líquido+20% SFB (37°C – 200 rpm) com células previamente crescidas na ausência e na presença do

extrato bruto de Eugenia uniflora.

70

5.6.4 Evaginação lateral na presença do extrato bruto de Eugenia uniflora

A avaliação da morfogênese foi realizada com os 48 isolados clínicos e as duas

cepas de referência neste estudo. Após 1h de incubação, 100 células de C. albicans que

foram previamente crescidas em meio NGY na presença e na ausência do E.B de E.

uniflora foram observadas, para a determinação da porcentagem de células que emitiam

o tubo germinativo (evaginação lateral).

Foi observado que dentre as 50 cepas testadas, 43 (86%) apresentaram uma

grande redução na porcentagem de células que emitiam tubo germinativo a 1h de

incubação (Figs. 13A a 13E). A cepa 24 (colunas em amarelo) apresentou a maior

redução na porcentagem de células que emitiam tubo germinativo após 1h de incubação

(evaginação lateral).

Figura 13A. - Porcentagem de células que emitiram tubo germinativo por meio de evaginação lateral

nas leveduras de Candida albicans quando incubadas em meio YPD+ soro fetal bovino 20%, 37°C 200

rpm, por 1h. As cepas que cresceram em presença do extrato bruto de Eugenia uniflora demonstraram

uma acentuada redução na emissão dos tubos germinativos.

A

71

Figura 13B. - Porcentagem de células que emitiram tubo germinativo por meio de evaginação

lateral nas leveduras de Candida albicans quando incubadas em meio YPD+ soro fetal bovino

20%, 37°C 200 rpm, por 1h. As cepas que cresceram em presença do extrato bruto de Eugenia

uniflora apresentaram uma acentuada redução na emissão dos tubos germinativos. A coluna

tracejada representam cepa que teve maior redução na evaginação lateral.

Figura 13C. - Porcentagem de células que emitiram tubo germinativo por meio de evaginação

lateral nas leveduras de Candida albicans quando incubadas em meio YPD+ soro fetal bovino

20%, 37°C 200 rpm, por 1h. As cepas que cresceram em presença do extrato bruto de Eugenia

uniflora tiveram uma acentuada redução na emissão dos tubos germinativos.

B

C

72

Figura 13E. - Porcentagem de células que emitiram tubo germinativo por meio de evaginação lateral nas

leveduras de Candida albicans quando incubadas em meio YPD+ soro fetal bovino 20%, 37°C 200

rpm, por 1h. As cepas que cresceram em presença do extrato bruto de Eugenia uniflora tiveram uma

acentuada redução na emissão dos tubos germinativos.

Figura 13D. - Porcentagem de células que emitiram tubo germinativo por meio de evaginação

lateral nas leveduras de Candida albicans quando incubadas em meio YPD+ soro fetal bovino 20%,

37°C 200 rpm, por 1h. As cepas que cresceram em presença do extrato bruto de Eugenia uniflora

tiveram uma acentuada redução na emissão dos tubos germinativos.

D

E

73

5.6.5 Índice de morfologia (I.M) na presença do extrato bruto de Eugenia

uniflora

Entre as 50 cepas analisadas (48 isolados clínicos, a ATCC 90028 e SC5314) 41

apresentaram redução no IM (82%). Embora essa redução tenha sido discreta, onde as

células apresentaram IM médio de 2,764 (D.P ± 0,52) para as cepas crescidas na

ausência do E.B e 2,34 (D.P ± 0,29) para as cepas crescidas na presença do E.B de E.

uniflora (Fig 14).

Apesar de algumas cepas que foram crescidas na presença do E.B de E. uniflora

terem apresentado um IM igual ou superior ao controle (cepas crescidas na ausência do

E.B), observou-se uma redução no tamanho das hifas (sendo em algumas cepas

mensuradas, como previamente descrito), apesar terem apresentando IM semelhante

(Figs. 14A a 14E).

O isolado clínico que apresentou maior redução no índice de morfologia foi a

cepa 37 (coluna tracejada – Fig. 14C) A cepa 111R, teve redução no índice de

morfologia I.M=4, para I.M =3,11, como previamente descrito (Fig. 14E).

74

Figura 14A. - Índice de morfologia (I.M) de células de Candida albicans crescidas na ausência e na presença

de extrato bruto de Eugenia uniflora após 3h de incubação em meio YPD líquido + 20% soro fetal bovino,

37°C – 200 rpm.

Figura 14B. - Índice de morfologia (IM) de células de Candida albicans crescidas na ausência e na

presença de extrato bruto de Eugenia uniflora após 3h de incubação em meio YPD líquido + 20% soro

fetal bovino, 37°C – 200 rpm.

A

B

75

Figura 14C. - Índice de morfologia (IM) de células de Candida albicans crescidas na ausência

e na presença de extrato bruto de Eugenia uniflora após 3h de incubação em meio YPD líquido

+ 20% soro fetal bovino, 37°C – 200 rpm.

Figura 14D - Índice de morfologia (I.M) de células de Candida albicans crescidas na

ausência e na presença de extrato bruto de Eugenia uniflora após 3h de incubação em

meio YPD líquido + 20% soro fetal bovino, 37°C – 200 rpm.

D

C

76

5.7 Morfogênese em meio sólido do isolados crescidos na presença do extrato

bruto de Eugenia uniflora

O ensaio para avaliar a capacidade das colônias de C. albicans formarem

filamentações em meio indutor sólido (YPD+20%SFB) quando crescidas em meio

NGY na ausência e na presença de E.B de E. uniflora foi realizado com todas as 50

cepas do estudo. Entre os isolados clínicos, 05 apresentaram colônias com aspecto

fenotípico de produção de filamentos quando incubadas a 37°C, enquanto que as demais

apresentaram fenótipo liso, demonstrado que a indução da formação de hifa em YPD +

20% SFB é menos eficiente que o meio líquido de YPD + 20% SFB.

Figura 14E - Índice de morfologia (I.M) de células de Candida albicans crescidas na ausência e na

presença de extrato bruto de Eugenia uniflora após 3h de incubação em meio YPD líquido + 20% soro

fetal bovino, 37°C – 200 rpm.

E

77

As cepas que apresentaram fenótipos filamentosos (SC5314, 06L, 15g, 15L e

111R), apresentaram aspecto nitidamente mais liso, quando as células foram crescidas

na presença de E.B de E. uniflora (Fig. 15)

78

Figura 15. Formação de hifa em meio sólido YPD+20% SFB. A.1) ATCC90028 sem E.B – A.2) ATCC90028

com E.B. B.1) SC5314 sem E.B – B.2) SC5314 com E.B. C.1) Cepa 06L sem E.B – C.2) Cepa 06L com E.B.

D.1) Cepa 15g sem E.B – D.2) Cepa 15g com E.B. E.1) Cepa 15L sem E.B – E.2 Cepa 15L com E.B. F.1) Cepa

111R sem E.B – F.2 Cepa 111R com E.B. Incubação à 37°C por 7 dias.

A1

.1.

1

A2

B1 B2

C1 C2

D1 D2

E1 E2

F1 F2

79

5.8 Ensaio de fagocitose de Candida albicans por PMN crescidos na presença

do extrato bruto de Eugenia uniflora

Foi observado através de microscopia óptica que as células de C. albicans

crescidas na ausência de E.B de E. uniflora e co-incubadas com PMN, sob condições

experimentais descritas na metodologia, foram satisfatoriamente fagocitadas, mesmo

quando emitiam tubos germinativos curtos, na tentativa de resistir assim ao estresse

oxidativo no interior dos PMNs e escapar dos mesmos (Fig. 16)

Quando crescidas na presença do E.B de E. uniflora e co-incubadas com

neutrófilos, interessantemente, observou-se uma diminuição do número de células

fagocitadas pelos PMNs, sendo observados inúmeros neutrófilos sem nenhuma célula

de C. albicans em seu interior (Fig. 17).

Figura 16. Células de Candida albicans crescidas na ausência do E.B de E. uniflora eficazmente

fagocitadas por PMNs após co-incubação de ambas as células a 37 °C, por 3 h, 200 rpm. As setas

indicam leveduras emitindo tubo germinativo mesmo no interior das células fagocíticas. Objetiva de 40x

(Seta vermelha: Candida albicans emitindo tubo germinativo no interior do PMN; seta branca: PMN, seta

amarela: blastoconídios fagocitados)

80

Todas as 50 cepas submetidas ao ensaio na presença do E.B de E. uniflora

apresentaram uma redução na quantidade de células de C. albicans fagocitadas pelos

neutrófilos.

A redução no número de células de C. albicans fagocitadas por 100 PMNs foi

estatisticamente significativa quando comparados o grupo submetido ao teste na

ausência do extrato bruto de E. uniflora e o grupo onde o E.B foi utilizado (Teste T de

student. P<0,05; Figs 18A a 18E).

Figura 17. Células de Candida albicans crescidas na presença do extrato bruto de Eugenia uniflora

não fagocitadas após co-incubação de ambas as células a 37 °C, por 3 h, 200 rpm. As células de

Candida albicans crescidas na presença do extrato bruto de Eugenia uniflora tiveram uma acentuada

diminuição no número de células fagocitadas. As figuras mostram um PMN com ausência de

leveduras fagocitadas em seu interior. Objetiva de 40x (Seta vermelha: PMN; seta branca: C.

albicans).

81

Figura 18A. - Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio EMEM +

20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* = Estatisticamente significante. Teste T de student.

P<0,05 ‡ =Desvio padrão)

Figura 18B - Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio EMEM

+ 20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* = Estatisticamente significante. Teste T de

student. P<0,05 ‡ =Desvio padrão)

A

B

82

Figura 18C - Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio

EMEM + 20 mM HEPES, pH 7,2, a 37°C – 50 rpm, por 3h. (* = Estatisticamente significante.

Teste T de student. P<0,05 ‡ =Desvio padrão)

Figura 18D - Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio



C

D

83

5.9 Avaliação da atividade de fosfolipase por Candida albicans em presença

de extrato bruto de Eugenia uniflora

A avaliação da atividade de fosfolipases produzidas e secretadas pelas cepas de C.

albicans foi determinada através da medição da zona de precipitação ao redor das

colônias crescidas em ágar fosfolipase, incubadas por 30°C durante 72h, em células pré-

crescidas na presença do E.B de E. uniflora.

Os isolados clínicos apresentaram ligeira diminuição na produção de fosfolipase,

mas quando comparadas com as cepas que não foram tratadas com o extrato, não houve

diferença estatisticamente significativa para todos os isolados clínicos, exceto para as

Figura 18E - Fagocitose de células de Candida albicans por PMN quando incubadas em meio



E

84

duas cepas de referência de C. albicans (ATCC 90028 e SC5314; Teste T- student,

P>0,05; Fig 19A a 19E).

Figura 19A - Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans crescidas na presença e

na ausência do E.B de E .uniflora (* = Estatisticamente significante. Teste T de student. P<0,05 ‡

=Desvio padrão)

Figura 19B - Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans crescidas na presença e na

ausência do extrato bruto de Eugenia uniflora (* = Estatisticamente significante. Teste T de student.


A

B

85

Figura 19C - Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans crescidas na presença e na

ausência do extrato bruto de Eugenia.uniflora (* = Estatisticamente significante. Teste T de student.


Figura 19D - Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans crescidas na presença e na

ausência do extrato bruto de Eugenia uniflora (* = Estatisticamente significante. Teste T de student. P<0,05 ‡

=Desvio padrão)

86

6 DISCUSSÃO

Os principais objetivos deste trabalho foram caracterizar genotipicamente cepas

de C. albicans isoladas da cavidade bucal de pacientes transplantados renais oriundos

das cidades de Maringá-PR e Natal-RN, com finalidade a de traçar um perfil

epidemiológico destes isolados, utilizando as metodologias de Genotipagem ABC e

microssatélite, bem como avaliar a capacidade destes isolados em produzirem hifa

verdadeira (morfogênese), apresentarem atividade de fosfolipase e resistir ao ataque de

fagócitos.

O extrato bruto de E. uniflora, conhecida popularmente como pitanga, cujas

propriedades antifúngicas foram determinadas pela Msc. Magda Rayanne Ferreira, sob

responsabilidade dos Profs. Terezinha Svidzinsky, da UEM e Luiz Alberto Lira Soares,

Figura 19E - Atividade de fosfolipase de isolados clínicos de Candida albicans crescidas na presença e na

ausência do extrato bruto de Eugenia uniflora (* = Estatisticamente significante. Teste T de student. P<0,05 ‡

=Desvio padrão)

E

87

da UFPE, foi utilizado neste trabalho com a finalidade de se avaliar uma provável

interação com as células de C. albicans e verificar se havia alguma interferência na

expressão dos fatores de virulência previamente descritos.

Em relação à genotipagem ABC, observamos que ocorreu uma maior prevalência

do genótipo A (62,5%), entre as cepas de C. albicans, seguida pelo genótipo C com

31,25% e do genótipo B com 6,54%. Esta distribuição na prevalência genotípica foi

observada quando analisadas as duas cidades separadamente, onde em relação aos 10

isolados provenientes de Maringá-PR, 09 foram pertencentes ao genótipo A, e 1

genótipo C e nenhum foi caracterizado como pertencente ao genótipo B. Em relação as

38 cepas isoladas de pacientes oriundos da cidade de Natal-RN, o genótipo A também

foi o mais prevalente, com 21 cepas, seguido pelo C, com 14 isolados e o B ocorrente

em 3 cepas.

Em estudo realizado por McCullough et al. (1999) com 430 cepas de C. albicans

cedidas pelas American Type Culture Colection (ATCC) pertencentes ao genótipos A,

B e C, foi observado que o genótipo A foi o mais prevalente, com 289 cepas, seguido

pelo B, com 85 e pelo genótipo C, 56 isolados.

Chaves et al., (2012) em estudo com isolados clínicos de pacientes críticos

internos em UTI com colonização em diversos sítios anatômicos que desenvolveram ou

não candidemia, observaram que dentre as 51 cepas utilizadas na genotipagem ABC,

25, pertenciam ao genótipo A, seguido pelo genótipo B com 18 cepas e do genótipo C,

com 8 isolados. Estes dados corroboram com o presente trabalho, onde o genótipo A

foi o mais prevalente. Também se pode observar uma alta prevalência de cepas

pertencentes ao genótipo C. Este é um achado diferente da maioria dos outros estudos.

Por exemplo, na investigação de Sardi et al., (2012), cepas do genótipo C não foram

88

encontradas. Este fato também foi observado pelo estudo de Jacobsen et al., (2008). Em

um total de 32 indivíduos C. albicans com colonização oral, candidíase oral e outras

infecções superficiais, apenas um isolado do genótipo C foi encontrado. De fato, Odds

et al., (2007) descrevem este genótipo como raro, tendo sido encontrado em apenas 173

dos 1931 isolados de C. albicans obtidos de diferentes origens geográficas e sítios

corporais do mundo inteiro.

Para a avaliação intra-específica de C. albicans também utilizou-se a metodologia

de microsatéllite, utilizando o primer M13. Os padrões de bandas observados foram

suficientemente diferentes para assegurar que o primer possui um bom poder

discriminatório, podendo ser aplicada para estudos epidemiológicos de infecções por C.

albicans com baixo custo e suficiente eficácia. Esta técnica ainda não vem sendo

largamente empregada para a genotipagem desta espécie, Chaves et al. (2012), mas tem

sido empregado largamente para tipar Cryptococcus neoformans, Casali et al., (2003),

Ferrera-Paim et al., (2011).

Outros loci de microssatélite vêm sendo descritos na literatura para estudos de

genotipagem para leveduras. Em estudo realizado por Costa-de-Oliveira, et al, 2011,

utilizou-se um total de 35 cepas de C. albicans isoladas de 12 pacientes com fungemia

com a finalidade de avaliar a variabilidade genética entre estas cepas utilizando quatro

loci de microssatélites. Os isolados de sangue foram comparados com cepas isoladas de

urina, secreção de trato respiratório e de cateter. Os isolados de sangue apresentaram

alta similaridade entre eles e entre os isolados de outros sítios, indicando assim uma

possível recorrência nas fungemias devido à mesma cepa e uma possível falha na

resposta terapêutica a estes pacientes.

89

A amplificação de fragmentos de DNA genômico que se repetem em tandem

utilizando o primer M13 neste estudo, revelou que cepas classificadas como

pertencentes aos genótipos A, B e C de C. albicans apresentaram variações nos perfis

de bandas formados. Esta variação entre as cepas se deve ao fato de que as áreas do

DNA onde apresentam as repetições múltiplas serem altamente polimórficas e às

variações no número de repetições que ocorrem intra-especificamente (Sampaio et al,

2005), mostrando-se superior à genotipagem ABC.

Em estudo realizado por Wang et al. (2003) avaliou-se genotipicamente isolados

de C. albicans utilizando a metodologia de microssatélite com o primer M13 e a relação

destes isolados com a resistência ao fluconazol. Dentre os 41 isolados clínicos, 11 cepas

foras sensíveis ao fluconazol, 8 cepas foram dose-dependente e 22 foram resistentes.

Entre estas cepas, duas das doze bandas puderam ser observadas e a análise por clusters

dos padrões formados no gel revelaram associação entre as cepas resistentes e o local

geográfico de origem destas.

Outro fator interessante é que, exceto em dois casos, todos os isolados do

genótipo C foram agrupados em 2 clusters distintos, bem separados. Mccullough et al.,

(1999) sugerem que os isolados de C. albicans do genótipo C são provavelmente

pertencentes ao genótipo A que ocasionalmente tenham adquirido um íntron. Este fator

pode explicar, pelo menos em parte, porque estes isolados foram considerados idênticos

pela técnica do microssatélite em duas ocasiões. Estes dados sugerem peculiaridades na

distribuição dos genótipos de C. albicans oriundos da cavidade oral de pacientes

transplantados renais, analisados, pela primeira vez no presente estudo.

O fato de terem sido encontrados alguns isolados obtidos de pacientes diferentes,

considerados indistinguíveis (100% de similaridade) não é fora do comum. Outros

90

autores têm descrito a possibilidade de cepas não relacionadas geneticamente possuírem

o mesmo genótipo. Por exemplo, Sampaio et al. (2003) utilizando a técnica de

microssatélite com o locus CAI4 observaram que em 73 isolados vaginais

independentes, 44 genótipos diferentes puderam ter sido detectados. Além disso, não se

pode excluir a possibilidade de transmissão cruzada entre os pacientes, durante o

período de internação hospitalar.

Um dos nossos achados mais importantes foi o agrupamento da maioria dos

isolados do Sul do Brasil em um mesmo cluster do dendrograma gerado pela técnica de

microssatélite. Estes isolados também apresentaram o mesmo genótipo ABC (genótipo

A). Este achado pode ser explicado, pois C. albicans co-evoluiu junto com seres

humanos de determinadas regiões geográficas, uma vez que esta espécie pertence à

microbiota normal humana (Odds et al., 2007).

Um certo grau de correlação do relacionamento genético entre os isolados foi

encontrado quando ambas as técnicas de genotipagem foram empregadas. Em apenas

duas ocasiões, isolados pertencentes aos genótipos A ou C foram considerados idênticos

pela técnica de microssatélite. Esta diferença reforça a necessidade da combinação de

pelo menos duas técnicas diferentes para tipagem de C. albicans. (Soll, 2000).

Além do fato do alto isolamento de cepas pertencentes ao genótipo C de C.

albicans, estes isolados também se mostraram mais resistentes à fagocitose pelos PMNs

de que as cepas dos genótipos A e B. Embora no momento da coleta das amostras,

apenas um isolado do genótipo C foi considerado infectante (obtido de paciente

apresentando lesão), o fato de se tratarem de indivíduos imunossuprimidos e

colonizados por cepas que expressaram os fatores de virulência in vitro pode

influenciar, futuramente, no desfecho clínico destes pacientes.

91

Outro fato interessante a ser observado em relação à fagocitose de células de C.

albicans por polimorfonucleares é que as cepas pertencentes ao genótipo A foram mais

sensíveis ao ataque das células fagocíticas, devido ao elevado número de células de C.

albicans contadas no interior dos PMNs. No tocante às cepas pertencentes ao genótipo

B, percebemos que todos os isolados também foram bastante sensíveis à fagocitose.

Estudos incluindo um maior número de isolados do genótipo B são necessários para

verificar se estes achados são encontrados em populações maiores.

Em estudo realizado na Dissertação de Mestrado de Santos et al. (2009) sobre

genotipagem e fatores de virulência de 51 cepas de C. albicans isoladas de diferentes

sítios anatômicos de pacientes internados em hospital terciário de São Paulo, foi

observado que as cepas pertencentes ao genótipo A apresentaram em geral uma maior

capacidade de expressão de fatores de virulência quando comparadas aos isolados dos

genótipos B e C. Sendo assim, a alta resistência de isolados de C. albicans do genótipo

C ao ataque de fagócitos trata-se de um importante achado do presente estudo.

Com relação aos fatores de virulência expressos pelos isolados de Natal e

Maringá, foi possível de se observar que os isolados da região Sul expressaram todos

os fatores de virulência avaliados in vitro (diferença estatisticamente significante para

resistência à fagocitose por PMNs). Em um estudo recente relacionado à caracterização

de biofilmes da cavidade oral formado em superfícies mucosas, observou-se uma

intensa migração de PMNs, com agregados celulares justapostos aos biofilmes de

mucosa. Além disso, em locais da lesão onde os biofilmes eram mais expressos, os

neutrófilos migraram por toda a extensão da mucosa (Dongari-Bagtzoglou et al.,, 2009).

Sendo assim, este parece ser um importante fator de virulência a ser utilizado na

comparação de diferentes isolados clínicos de C. albicans.

92

A produção de fosfolipases por células de C. albicans neste estudo apresentou um

perfil homogêneo, com atividade média (Pz) de 0,56. Este é um valor que reflete uma

atividade enzimática moderada e que não foi correlacionada com nenhum genótipo

específico.

Em revisão realizada por Ghannoum (2000), o autor descreve o papel das

fosfolipases no processo de virulência de C. albicans, pois estas enzimas atuam nas

membranas celulares, hidrolisando os fosfolipídios, levando à lesão celular e morte.

Apesar deste fator de virulência ser importante, e o fato de que todas as nossas amostras

foram capazes de produzir fosfolipase, não foi possível observar associação de nenhum

genótipo específico e a produção desta enzima.

Em relação à emissão de tubos germinativos dos isolados clínicos após 1h de

incubação em meio YPD líquido + 20% SFB sem a presença do E.B de E. uniflora,

incubados a 37°C – 200 rpm, foi observado que a porcentagem de células que emitiam

tubo germinativo foi variada e não houve um padrão de distribuição entre os genótipos,

entretanto foi observado que as cepas provenientes de Natal-RN emitiam mais tubos

germinativos do que as cepas isoladas de Maringá-PR nos genótipos A e C.

Quando crescidas em meio NGY na presença de E.B de E. uniflora a porcentagem

de células de C. albicans que emitiam tubo germinativo após 1h de incubação em meio

YPD líquido + 20% SFB 37°C - 200 rpm foi significativamente reduzida, mesmo na

cepa 111R que é altamente formadora de hifas, a qual também apresentou uma redução

na evaginação de tubos germinativos, sugerindo que o E.B da E. uniflora deve interferir

em alguma forma na morfogênese. Quando analisado o índice de morfologia,

independentemente do genótipo observado, houve uma redução no valor de I.M após 3

horas de incubação no mesmo meio indutor.

93

O índice de morfologia observado no trabalho realizado mostrou que os isolados

clínicos de C. albicans apresentaram I.M médio de 2,76, o que indica uma prevalência

das formas de pseudo-hifas. No entanto, um número variável de hifas verdadeiras

também foi observado nos diferentes isolados. Embora as cepas isoladas de Natal-RN

tivessem uma maior porcentagem de emissão de tubo germinativos quando comparadas

às cepas oriundas de Maringá-PR, o índice de morfologia destas foi superior àquelas

independentemente do genótipo analisado.

Entre todas as cepas analisadas, o isolado 111R, oriundo de Natal formou 100%

de evaginações laterais e tubos germinativos após 1h de incubação. Esta característica

foi mantida pela cepa durante as 2h subsequentes de incubação, o que foi observado no

índice de morfologia (I.M) = 4; atribuído a esta cepa, dificultando determinar a

quantidade de hifas formadas, sendo possível de se visualizar hifas verdadeiras

altamente desenvolvidas. Esta cepa foi a única a apresentar esta característica.

Diversos estudos têm demonstrado o papel da filamentação de C. albicans na sua

virulência. Ken Haynes (2001) em sua revisão sobre fatores de virulência em Candida

relata que cepas mutantes em que são bloqueadas nas fases de blastoconídios e de

pseudo-hifas têm a sua virulência atenuada e que esta redução na virulência é atribuída à

incapacidade destas cepas em formarem hifas verdadeiras.

Estudo realizado por Liu et al., (2010) demonstra o papel da proteína quinase

CaSch9p na morfogênese e virulência de C. albicans. Os autores nocautearam o gene

que codifica a proteína CaSch9p e inocularam a cepa mutante em ratos. Foi observado

que a ausência desta proteína afetou a filamentação de C . albicans e a virulência desta

espécie foi diminuída.

94

Todas as cepas utilizadas nos experimentos foram crescidas “overnight ”em meio

de padronização de inoculo NGY à 30°C – 200 rpm, e algumas amostras deste

crescimento foram analisadas à microscopia óptica com a finalidade de se observar

alguma alteração morfológica nas células de C. albicans devido à ação do E.B de E.

uniflora. Algumas características como presença de grandes vacúolos citoplasmáticos e

células com aspecto morfológico anormal com as mais diferentes variações foram

observadas, o que sugere uma possível influencia do E.B na morfologia da parede

celular de C. albicans.

Ishida et al., (2006) em trabalho realizado utilizando subfração de extrato vegetal

de Stryphnodendron adstringens (barbatimão), demonstraram que células de Candida

tratadas com o referido extrato apresentaram alterações morfológicas em sua superfície,

onde foi observada a perda da integridade da parede celular das leveduras e as células

apresentaram deformações. As células que foram submetidas ao mesmo experimento,

porém não foram tratadas com o extrato, permaneceram intactas e sem nenhum

comprometimento estrutural (grupo controle).

Um fato interessante e que foi avaliado mais profundamente acontece com

algumas cepas, que quando crescidas na presença do E.B de E. uniflora apresentaram

I.M bastante similar de que quando crescidas na ausência do EB. Observou-se que

embora sob as duas diferentes condições de crescimento, as cepas receberam valor de

I.M=4, pois eram capazes de formar hifas verdadeiras. Entretanto, estas eram

consideravelmente menores quando as células cresceram na presença do E.B. Para

confirmar esta teoria, os isolados que produziam hifas verdadeiras após 3h de incubação

tiveram o comprimento destas estruturas mensurado e a hipótese foi confirmada, que

embora tenha formado hifa verdadeira na ausência e na presença do E.B de E. uniflora

95

as hifas tratadas com o E.B. apresentaram comprimento menor. Estes resultados

sugerem que o E.B de E. uniflora poderá atuar na parede celular das leveduras de C.

albicans confirmando os achados obtidos nas alterações micromorfológicas visualizadas

em microscopia óptica.

Quando cepas de Candida foram submetidas à avaliação da formação de hifas

(morfogênese) em presença da subfração do extrato de Stryphnodendron adstringens,

foi observado um aumento da porcentagem de blastoconídios em relação à quantidade

de hifas, indicando que ocorreu uma redução na transição de levedura à hifa (Ishida et

al., 2006).

Em estudo realizado por Bernardes et al., (2012) utilizando extrato bruto das

folhas de Aloe vera, planta conhecida popularmente como babosa, foi observado que

quando crescidas na presença de diferentes concentrações do extrato, células de C.

albicans apresentaram uma diminuição significativa no crescimento e multiplicação

(observadas a partir das densidades ópticas das culturas) bem como uma redução na

taxa de formação de tubos germinativos quando em contato com o extrato bruto das

folhas deste vegetal.

Ao serem induzidos o crescimento e a filamentação de C. albicans em meio

contendo purpurina, um derivado das raízes de Rubia tinctorum L, de onde é possível se

obter o condimento conhecido no Brasil como colorau; foi observado que houve uma

redução na quantidade de hifas formadas em meios líquidos indutores da morfogênese,

quando comparadas com o maciço crescimento e filamentação que ocorreu no controle

que foi realizado na ausência da purpurina. Este fato foi também macroscopicamente

observado em meios sólido suplementados com soro fetal bovino (Tsang et al. 2012).

Este estudo vem reforçar a interferência de compostos naturais na inibição do

96

crescimento celular, bem como do desenvolvimento de estruturas filamentosas de C.

albicans.

As cepas de C. albicans do presente estudo que foram submetidas ao teste de

formação de hifa (morfogênese) em meios indutores líquidos também foram semeadas

em placas de Petri com o mesmo meio (YPD+20% soro), porém com a adição de ágar

na formulação. Quando semeadas em meio sólido e incubadas à temperatura de 37°C

durante 7 dias, apenas 5 isolados apresentaram um fenótipo formador de hifa nestas

condições, demonstrando este meio não ser o mais específico para a avaliação da

morfogênese em meio sólido. Em meio sólido, as colônias que apresentaram aspecto

rugoso, característico de leveduras com colônias filamentosas, apresentaram também

uma mudança deste aspecto quando crescidas na presença do E.B de E. uniflora. As

colônias que possuías as extremidades com filamentos passaram a apresentar as suas

bordas lisas, indicando uma redução na filamentação. Nas colônias onde o centro era

mais apiculado, com aspecto cerebriforme e enrugado, houve uma atenuação nesta

característica, o que corrobora a hipótese de que efetivamente, o E.B está influenciando

na transição de levedura-hifa em C. albicans.

Em estudo realizado por Zucchi et al., (2010) foi demonstrado que a filamentação

de C. albicans em superfícies sólidas é dependente da sinalização que ocorre por meio

da proteína Cek1P, ativada via uma glicoproteína de superfície celular Dfi1 em

mecanismo que reconhece a matriz onde a levedura está inserida. Foi demonstrado que

mutantes que tiveram o gene DFI1 inativado, que codifica esta proteína, perderam a

capacidade de filamentação em meio sólido e tornaram-se atenuados em virulência. Os

dados apresentados neste estudo nos levam a supor a hipótese que de alguma forma, um

97

dano estrutural na superfície celular de C. albicans causado por E. uniflora pode ser

responsável por inibição de vias que levam a transição entre levedura-hifa

(morfogênese), o que foi observado quando os isolados de fenótipo filamentoso foram

submetidos as condições de indução de filamentação em meios YPD+SFB 20% liquido

e sólido.

Um fato interessante ocorreu com a cepa 111R, altamente formadora de hifas.

Enquanto que os demais isolados foram altamente fagocitadas, este isolado clínico

apresentou o menor número de C. albicans fagocitadas (11 células fagocitadas em 100

PMNs). Este fato reflete a importância da filamentação como auxiliar na redução do

ataque das células fagocíticas, corroborando com a ideia de que a emissão do tubo

germinativo é um fator crucial na evasão do sistema imune.

Fradin et al. (2003) reportaram que a grande quantidade de leveduras fagocitadas

por PMN reflete a rápida interação que ocorre entre as células de C. albicans e os PMNs

(neutrófilos, eosinófilos e basófilos), onde após 30 minutos de incubação torna-se

possível observar cerca de 90% de células de leveduras ligadas ou fagocitadas por estas

células do sistema imune.

Fradin et al. (2005), descreveram que quando incubadas em presença de PMNs,

95,6% das células de C. albicans ainda estão sob a forma de blastoconídios, destas 38%

encontram-se fagocitadas, enquanto que 57,5% estão ligadas aos PMNs após 30 min de

incubação. Baseado nestes dados apresentados pelos autores pode-se afirmar que a cepa

111R não foi efetivamente fagocitada devido ao fato de que ao ser crescida, durante o

pré-inóculo, a cepa já apresenta grande quantidade de hifas formadas, mesmo em

temperatura que não estimula a filamentação. Desta forma, quando incubada em

98

presença de PMNs, com muitas hifas previamente desenvolvidas, a mesma não foi

fagocitada eficientemente.

No ensaio de fagocitose, onde muitas leveduras foram fagocitadas pelos PMNs,

observamos um interessante resultado, pois em todas as cepas testadas, ocorreu uma

significativa redução na quantidade de células de Candida fagocitadas, se previamente

crescidas na presença do E.B. Este achado reforça nossa hipótese de que o E.B está

agindo na parede celular de C. albicans, pois o fato de que os PMNs não estarem

fagocitando as leveduras, pode estar associado ao não reconhecimento das mesmas,

fator este que ocorre por meio de um impedimento na interação com as β-glucanas,

mananas e receptores de manoses, que fazem parte da constituição da parece celular de

C. albicans e que os PMN não estariam reconhecendo estes componentes devido a um

possível dano que o E.B de E. uniflora possa estar causando na parede das leveduras.

No trabalho publicado por Gow et al., (2012), são relatadas as vias de sinalização

celular para o processo de reconhecimento das leveduras de Candida pelas células da

imunidade inata. Neste estudo são demonstrados os padrões moleculares associados ao

patógeno Candida (PAMP) encontrados na parede celular, que são reconhecidos pelos

receptores padrões de reconhecimento (PRP) encontrados na superfície das células de

defesa. Neste trabalho os autores destacam a importância do reconhecimento das

mananas, fosfolipomananas e β-1,3-glucanas de Candida pelo sistema imune. Estas

informações nos permitem sugerir que um possível dano estrutural na parece celular

possa interferir nos receptores envolvidos no reconhecimento das células de C. albicans

pelos PMNs e esteja associado ao baixo número de leveduras fagocitadas quando

tratadas com o E.B de E. uniflora.

99

Quando crescidas na presença de E.B e semeadas em ágar fosfolipase, foi

observado um ligeiro aumento no valor de Pz na maioria dos isolados, indicando uma

diminuição na produção das fosfolipase, entretanto, esta diferença, entretanto não foi

significativa na produção desta enzima.

Em revisão sobre fosfolipases e o seu papel na virulência e patogenia das

infecções fúngicas, Ghannoum (2000) relata que as enzimas fosfolipases são produzidas

e secretadas pelas células fúngicas, atuando em ligações éster específicas. Estas enzimas

atuam clivando os fosfolipídios de membrana, desestabilizando as mesmas e causando

dano ou até mesmo morte celular. O fato de que estas enzimas são geradas no interior

celular e que são secretadas para o meio externo onde atuam nas outras células, podem

ter influenciado no resultado do teste da avaliação da atividade de fosfolipase por C.

albicans na presença do E.B de E. uniflora, pois o extrato possivelmente está atuando

na parede celular das leveduras e como estas enzimas não são constituintes da parede

celular e sim enzimas secretadas, o E.B não estaria influenciando na produção destas

enzimas.

7.0 CONCLUSÕES

Os resultados do presente trabalho permitem as seguintes conclusões:

7.1 Utilizando-se a técnica de genotipagem ABC, embora o genótipo A tenha sido

o mais prevalente, ressalta-se a alta frequência de isolamento de cepas do genótipo

C da cavidade oral de pacientes transplantados renais

100

7.2 A técnica de microssatélite utilizando o primer M13 apresentou superior poder

discriminatório que a genotipagem ABC, reforçando a necessidade de se avaliar

diferentes loci na investigação do relacionamento genético dos isolados de C.

albicans.

7.3 Os isolados de C. albicans do genótipo C apresentaram-se significantemente

mais resistentes ao ataque de fagócitos

7.4 A maioria dos isolados da região Sul (Maringá-PR) foram agrupados em um

cluster distinto, por análises de dendrograma, e apresentaram-se mais resistentes a

ataque de PMNs que os isolados de Natal-RN.

7.5 O extrato bruto da pitanga (E. uniflora) parece influenciar na expressão de

fatores de virulência de C. albicans in vitro, reduzindo a formação de hifa

verdadeira e impedindo as células de leveduras serem fagocitadas por PMNs,

embora a ação na secreção de fosfolipase tenha sido mínima ou ausente, nas

condições testadas.

101

8.0 Referências bibliograficas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · A Deus, meu Pai, meu Amigo e meu Conselheiro, que pelas suas infinitas ... que estende as raízes para o ribeiro que não receia