universidade federal juiz de fora instituto de ciências biológicas

UNIVERSIDADE FEDERAL JUIZ DE FORA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

IMUNOLOGIA E DOENÇAS INFECTO - PARASITÁRIAS

Marjorie Raquel Anariba Sarmiento

AVALIAÇAO COMPARATIVA DO RESISTOMA CLINICO FECAL EM INDIVIDUOS EUTROFICOS, COM SOBREPESO E OBESOS

JUIZ DE FORA

2016

MARJORIE RAQUEL ANARIBA SARMIENTO

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO RESISTOMA CLÍNICO FECAL EM

INDIVIDUOS EUTRÓFICOS, COM SOBREPESO E OBESOS

Dissertação de Mestrado do Curso de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas:

Área de Imunologia e Doenças Infecto-

Parasitárias, para obtenção do Título de

Mestre em Ciências Biológicas na área

de Imunologia e Doenças Infecto-

Parasitárias.

Orientação:

Prof. Dr. Cláudio Galuppo Diniz (Orientador) Co-orientadores:

Profa. Dra. Vania Lúcia Silva Profa Dra. Dioneia Evangelista Cesar

Dra. Alessandra Barbosa Ferreira Machado

JUIZ DE FORA

2016

DESENVOLVIMENTO

Laboratório de Fisiologia e Genética Molecular Bacteriana

Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia

Instituto de Ciências Biológicas - Universidade Federal de Juiz de Fora

Laboratório de Ecologia e Biologia Molecular de Microrganismos

Departamento de Biologia


COLABORAÇÃO

Profa . Dra. Juliana Alves Resende

Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia


Laboratório Côrtes Villela

Laboratório de Análises Clínicas

Juiz de Fora, MG

APOIO FINANCEIRO

FAPEMIG: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Bendiga Dios la pródiga tierra en que nací.

Há esperança... Nós somos a esperança.

AGRADECIMENTOS

Como posso retribuir ao Senhor toda a sua bondade para comigo? Só existe

agradecimento no meu coração pela maravilhosa oportunidade que eu tive, porque

Ele guiou-me cada segundo do caminho.

A mi familia, mis guerreros y mi mayor bendición. Gracias por su apoyo y amor

indicional, esta es sólo una muestra de que somos grandes y que nuestro pasado

no decide nuestro futuro,

A Héctor, mi compañero, mi amigo, mi amor. Gracias por haber hecho estos años

más ligeros y más felices, gracias por recordarme que todo es posible cuando uno

decide que así sea.

À Organização de Estados Americanos (OEA) e à Universidade Federal Juiz de

Fora, por ter aberto suas portas para mim, e me oferecer o maior presente: O

conhecimento.

Ao Professor Cláudio, professora Vania e professora Dionéia, obrigada por ter

acreditado em mim, mesmo sem me conhecer. Obrigada pela paciência e por abrir

meus olhos a uma perspectiva diferente da vida, podem ter certeza que cada

momento compartilhado é um tesouro para mim.

À Alessandra, Juliana, Carol, Michelle vocês são as melhores! Obrigada pela ajuda

infinita e pela amizade, vocês são uma inspiração para mim.

À Thaís e Francis; minhas companheiras de luta, obrigada pelo carinho e pela

paciência em cada dia de bancada.

À Bia, Bruna, Cinthia, Andresa, Lud, Aline; Deus escolheu vocês para serem anjos

no meu caminho, obrigada por tudo. Amo vocês!

Obrigada Brasil, seu lindo!

RESUMO

A obesidade é uma doença de grande impacto para saúde pública e está relacionada com alterações na fisiologia, com reflexo no intestino, sobretudo do ponto de vista ecológico. Nestas condições, alterações na estrutura da comunidade microbiana podem ocorrer, mas pouco se sabe sobre suas implicações no fenômeno da resistência aos antimicrobianos, que atualmente figura como uma grande ameaça à medicina moderna. É aceito que a microbiota intestinal atue como reservatório de genes de resistência. Por outro lado, a exposição a diferentes xenobióticos pode alterar a composição da microbiota e atuar como agente de pressão seletiva no intestino, selecionando bactérias resistentes. Considerando as alterações no estilo de vida, dieta e microbiota que acontecem em pacientes com excesso de peso, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a ocorrência de marcadores genéticos representativos do resistoma clínico no metagenoma intestinal de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos, sem história de antibioticoterapia recente. Foram avaliados 72 pacientes classificados em eutróficos, com sobrepeso e obesos, de acordo com o IMC. Medidas antropométricas, avaliação sócio-demográfica e nutricional dos pacientes foi realizada. Reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional a partir do DNA metagenômico fecal extraído foi utilizada para avaliar a presença de 59 genes de resistência pertencentes a diferentes famílias de antibióticos. A densidade de diferentes grupos bacterianos foi avaliada por hibridização fluorescente in situ (FISH). Do total de genes pesquisados, foram detectados 27 tipos de genes, dos quais 17 genes de resistência são compartilhados entre os três grupos (eutróficos, com sobrepeso e obeso), o que indica a presença de um núcleo comum no resistoma formado principalmente por genes de resistência a tetraciclinas e beta-lactâmicos. Além disso, o grupo com obesidade que apresentou maior quantidade de genes detectados e variedade de genes (176:26), em comparação com o grupo sobrepeso (145:21) e o grupo eutrófico (132:0). A análise da densidade bacteriana mostrou principalmente a presença de bastonetes Gram negativos anaeróbios, seguido por bastonetes Gram negativos e cocos Gram positivos, os quais estiveram aumentados no grupo obeso, especialmente para Escherichia coli e Acinetobacter. Foi calculada a proporção de genes de resistência em comparação com as espécies bacterianas, mostrando uma maior probabilidade do surgimento de genes de resistência para o grupo dos bastonetes Gram negativos. Foi realizado o análise de correlação (Odds Ratio) entre os genes de resistência o IMC, ingesta calórica, consumo de xenobióticos, e uso de edulcorantes, e uma correlaçao positiva entre o surgimento dos genes de resistência e esses fatores foi observada. Os resultados sugerem que fatores relacionados ao excesso de peso como o IMC, dieta e a exposição a diferentes xenobióticos afetam a composição da microbiota intestinal, permitindo uma maior probabilidade da ocorrência de marcadores genéticos de resistência a drogas antimicrobianas no metagenoma fecal. Palavras-chave: microbiota intestinal, obesidade, resistência aos antibióticos

ABSTRACT

Obesity is a disease of great impact to public health and is related to changes in physiology, reflected in the gut, especially from an ecological point of view. Under these conditions, changes in microbial community structure may occur, but little is known about its implications in the antimicrobial resistance phenomenon, which currently ranks as a major threat to modern medicine. It is accepted that the intestinal microbiota acts as resistance genes reservoir. Moreover, exposure to different xenobiotics can change the composition of the microbiota and act as an agent of selective pressure in the intestine selecting resistant bacteria. Considering the changes in lifestyle, diet and microbiota that happen in overweight patients, the objective of this research was to evaluate the occurrence of genetic markers representative of the clinical resistoma in the gut metagenome of normal weight, overweight and obese individuals, with no history of recent antibiotic therapy. 72 patients were evaluated and classified as normal weight, overweight and obese according to BMI. Also, anthropometric, sociodemographic and nutrition evaluation of patients was performed. Conventional polymerase chain reaction (PCR) from the fecal metagenomic DNA extracted was used to assess the presence of 59 resistance genes belonging to different families of antibiotics. The density of different bacterial groups was assessed by fluorescence in situ hybridization (FISH). Of the total surveyed genes were detected 27 types of genes, of which 17 resistance genes are shared among the three groups (normal weight, overweight and obese), which indicates the presence of a common core in resistoma mainly made up of genes that confere resistance to tetracyclines and beta-lactams. Moreover, the obese group presents the highest amount of detected genes and variety of genes (176:26), compared to the overweight (145:21) and eutrophic group (132:0). The bacterial density analysis showed mainly the presence of Gram negative anaerobes, followed by Gram negative rods and Gram positive cocci, which were increased in the obese group, particularly Escherichia coli and Acinetobacter baumannii. Also, was calculated the ratio of resistance genes in comparison with the bacterial species showing more likely the emergence of resistance genes for the group of Gram negative rods. We performed the correlation analysis (odds ratio) between resistance genes BMI, caloric intake, consumption of xenobiotics, and use of sweeteners, and a positive correlation between the emergence of resistance genes and these factors was observed. The results suggest that factors related to overweight as BMI, diet and exposure to different xenobiotics affect the composition of the intestinal tract, allowing for a greater likelihood of genetic markers of antimicrobial drug resistance in fecal metagenome.

Keywords: Antimicrobial resistance, intestinal microbiota, gut, faecal resistome

LISTA DE ILUSTRAÇOES Pág

Fluxograma 1: Representação esquemática da estratégia experimental para o

estudo de ocorrência de genes de resistência bacterina às drogas no metagenoma

intestinal de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos e sua correlação com

ocorrência de grupos bacterianos de interesse e características antropométricas,

sociodemográfica e nutricional dos indivíduos. 39

Quadro1. Agrupamento dos marcadores de resistência a drogas antimicrobianas

avaliados e os grupos bacterianos relacionados a eles. 54

Figura 2. Média da ingestão de grupos de macronutrientes pelos indivíduos dos

grupos em estudo. 59

Figura 3. Distribuição de medicamentos e suplementos alimentares em uso pelos

indivíduos dos grupos em estudo, segundo declaração durante o inquérito

nutricional. 60

Figura 4. Distribuição de edulcorantes em uso pelos indivíduos dos grupos em

estudo, segundo declaração durante o inquérito nutricional. 61

Figura 5. Avaliação comparativa da quantidade de marcadores genéticos de

resistência a drogas antimicrobianas amplificados a partir metagenoma fecal,

representativo do resistoma clínico dos indivíduos. 62

Figura 6. Distribuição de marcadores genéticos de resistência a drogas

antimicrobianas avaliados a partir metagenoma intestinal, representativo do

resistoma clínico de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos. 63

Figura 7. Ocorrência de marcadores genéticos, por grupo farmacológico de drogas

antimicrobianas, entre os diferentes grupos, amplificados a partir metagenoma

intestinal representativo do resistoma clínico de indivíduos eutróficos, com

sobrepeso e obesos. 64

Figura 8. Diagrama de Venn com a distribuição dos marcadores genéticos de

resistência a drogas antimicrobianas amplificados a partir metagenoma fecal,

representativo do resistoma clínico dos indivíduos. 65

Figura 9. Densidade bacteriana relativa detectada a partir do metagenoma fecal, de

indivíduos eutróficos, sobrepeso e obesos. 66

Figura 10. Densidade bacteriana relativa dos diferentes grupos taxonómicos

detectados a partir do metagenoma fecal, de indivíduos eutróficos, sobrepeso e

obesos. 67

LISTA DE TABELAS Pág

Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados 45

Tabela 2. Marcadores específicos utilizados para análise da composição da

comunidade bacteriana por FISH 52

Tabela 3. Características sócio-demográficas dos participantes 56

Tabela 4. Características antropométricas dos participantes 57

Tabela 5. Correlação entre os parâmetros nutricionais dos pacientes

e os marcadores de resistência detectados 65

Tabela 6. Razão entre o número de detecções de marcadores de resistência a

drogas antimicrobianas no metagenoma fecal de indivíduos eutróficos, com

sobrepeso e obesos, e a frequência relativa da densidade dos diferentes grupos

bacterianos associados a esses marcadores. 69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DNA: Ácido desoxirribonucleico

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

FISH: Fluorescent In Situ Hybridization (Hibridação Fluorescente In Situ)

HDL: High density lipoprotein

ICB: Instituto de Ciências Biológicas

IMC: Índice de masa corporal

LDL: Low density lipoprotein

LPS: Lipopolissacarídeo

MG: Minas Gerais

MLS: Macrolídeos, lincosamida e streptoGramina

PCR: Reação em cadeia da polimerase

QQFA: Questionário de frequência alimentar

TBE: Tris Borato EDTA

UFJF: Universidade Federal Juiz de Fora

UV: Ultra Violeta

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO………………………………………………………………………….13

2 REVISÃO DE LITERATURA…………………………………………………………..16

2.1 Microbiota Intestinal: homeostase e disbiose ................................................. 16

2.2 Antimicrobianos e Resistência Bacteriana ..................................................... 20

2.2.1 O Resistoma ............................................................................................ 23

2.2.3 O Resistoma fecal .................................................................................... 25

2.3 Obesidade ...................................................................................................... 28

2.4 Obesidade e microbiota intestinal .................................................................. 30

2.4 Metabólitos e Xenobióticos no Intestino ......................................................... 32

2.5 Justificativa .................................................................................................... 35

3 OBJETIVOS …………………………………………………………………………….37

3.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 37

3.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 37

4 MATERIAIS E MÉTODOS…………………………………………………………….39

4.1 Delineamento Experimental ........................................................................... 39

4.2 Seleção de pacientes, coleta e preparo de amostras. ................................... 40

4.3 Extração de DNA das amostras fecais. .......................................................... 42

4.3 Detecção dos genes de resistência ............................................................... 43

4.4 Avaliação quantitativa e qualitativa das espécies bacterianas por hibridização

fluorescente in situ (FISH). ................................................................................... 50

4.5 Análise estatística .......................................................................................... 53

5 RESULTADOS………………………………………………………………………….55

5.1 Características Sócio-demográficas, antropométricas e nutricionais dos

participantes ......................................................................................................... 55

5.2 Detecção de marcadores genéticos de resistência a antimicrobianos ........... 62

5.3 Avaliação quantitativa de espécies bacterianas por FISH ............................ 66

5.4 Relação entre os parâmetros clínico-epidemiológicos e nutricionais,

distribuição de grupos bacterianos e os marcadores de resistência a drogas

observados nos metagenomas obtidos................................................................68

7. DISCUSSÃO…………………………………………………………………………..70

8 CONCLUSSOES……………………………………………………………………...79

9 REFERENCIAS…………………………………………………………………………80

8

Anexos…………………………………………………………………………………..100

8.1 Anexo 1: Parecer Cosubstanciado do

CEP…………………………………….100

8.2 Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .............................. 102

8.3 Anexo 3: Ficha de anamnese e dados cadastrais........................................ 104

8.4 Anexo 4. Questionário quantitativo de frequência alimentar ........................ 107

13 1 INTRODUÇÃO

Os avanços científicos relacionados ao estudo dos microrganismos

associados a superfícies internas e externas de hospedeiros, definidos como

microbiota residente, tem permitido uma compreensão mais profunda do papel

desses microrganismos na manutenção do estado geral de saúde dos seus

hospedeiros. Neste contexto, sabe-se que a microbiota intestinal participa de várias

funções vitais para a fisiologia de seres humanos e outros animais. Além disso, a

microbiota coexiste em um ambiente extremamente complexo, com relações

ecológicas bem definidas entre os procariotos, células intestinais e o

comportamento do hospedeiro, representado pela sua fisiologia e pelo fluxo de

substâncias ou seus metabólitos, que atuam como substrato para estes

microrganismos anfibiônticos.

A análise da microbiota intestinal permitiu ainda estabelecer grupos bacterianos

relativamente fixos em determinadas condições fisiológicas nesse ambiente, e os

benefícios que estão associados a eles. No entanto, esta relação benéfica pode ser

afetada se a microbiota é alterada. Esta condição de quebra na homeostase é

conhecida como disbiose, e pode ser causada por vários fatores, como a dieta,

localização geográfica e principalmente o uso de antibióticos. Além disso, a disbiose

pode estar associada com o desenvolvimento de diferentes doenças, tais como o

diabetes, a síndrome metabólica e obesidade.

O ecossistema intestinal representa um ambiente polimicrobiano susceptível a

ação de diferentes xenobióticos, como as drogas antimicrobianas, cuja exposição em

níveis terapêuticos ou sub-terapêuticos pode influenciar na seleção de marcadores de

resistência. Como um todo, o conjunto dos marcadores de resistência presentes em

14 uma dada população microbiana é definido como resistoma e os genes de resistência

a antibióticos de importância clinica é conhecido como o resistoma clínico, e seu

estudo é fundamental para compreensão do papel dos diferentes ecossistemas como

reservatórios de resistência, e as condições que levam às diferentes formas de

pressão seletiva, que contribuem para sua persistência na ausência de

antimicrobianos, o que pode impactar a terapêutica em situações de doenças

infecciosas.

Atualmente, a contenção do fenômeno da resistência aos antibióticos

representa um dos grandes desafios na saúde pública, de acordo com dados da

Organização Mundial da Saúde. Assim, o estudo dos fatores relacionados à

resistência aos antimicrobianos e seus reservatórios é fundamental e poderá permitir

melhor entendimento sobre a origem, causas e fatores ambientais envolvidos na

propagação deste fenômeno, o que poderá contribuir no desenvolvimento de novas

estratégias, medicamentos e medidas de controle que permitam um futuro melhor

para a população em geral.

Embora o intestino seja descrito como um dos maiores reservatórios de genes

de resistência, e constitui um ambiente propício para a transferência desses

marcadores entre bactérias, a influência de condições fisiológicas do hospedeiro que

resultem em rompimento da homeostase intestinal, como a obesidade, permanece

ainda não elucidada. Estudos recentes apontam a microbiota intestinal como

importantes componentes participantes da fisiopatologia da obesidade, à medida que

os microrganismos atuam no superávit energético para o hospedeiro, interferem com

a permeabilidade intestinal, com o trânsito e degradação de substâncias,

especialmente no intestino grosso, além de modularem localmente e sistemicamente

padrões imunológicos do hospedeiro.

15

Neste sentido, considerando-se a necessidade de contenção do fenômeno da

resistência bacteriana às drogas e o entendimento da influência das condições

fisiológicas que possam estar relacionadas a este fenômeno; é necessário o

conhecimento de fatores bióticos e abióticos que possam atuar como fatores de

pressão seletiva para seleção e persistência de marcadores de resistência. Essa

abordagem pode contribuir para novas estratégias terapêuticas e a minimização dos

impactos associados.

Neste estudo, com uma abordagem independente de cultivo, pretendeu-se

investigar a influência do estado de obesidade na persistência de marcadores

genéticos de resistência a drogas antimicrobianas no ecossistema intestinal,

representado pelo metagenoma fecal, comparativamente em indivíduos eutróficos,

com sobrepeso e obesos.

16 2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Microbiota Intestinal: homeostase e disbiose

O corpo humano depende da presença dos microrganismos para desenvolver

características fisiológicas essenciais para a sua sobrevivência, co-evoluindo e

mantendo a estabilidade e o equilíbrio ecológico dinâmico com a população

microbiana. A maioria desses microrganismos é residente, e são definidos como

populações microbianas de maior ou menor complexidade, estáveis em determinadas

áreas anatômicas, considerando-se idade, fisiologia e o comportamento dos

hospedeiros (XU e GORDON, 2003; GRICE e SEGRE 2012).

Esses microrganismos, também chamados de microbiota residente, indígena

ou autóctone, possuem importantes funções para a saúde dos hospedeiros, uma vez

que atuam como barreiras contra instalação de microrganismos patogênicos,

modulam o sistema imunológico, produzem ou degradam substâncias prejudiciais ou

úteis aos hospedeiros, e, ainda, podem participar do seu metabolismo energético

(QIN et al., 2010).

Como um todo, o chamado microbioma, que compreende o total de genes da

microbiota de um dado indivíduo, contém genes responsáveis por funções

bioquímicas essenciais para a fisiologia do hospedeiro. É considerado um órgão

multifuncional adquirido, e coexiste, assim, em uma relação homeostática com seu

hospedeiro (O’HARA e SHANAHAN, 2006; HOOPER, LITTMAN e MACPHERSON,

2012).

Nos seres humanos e outros animais de sangue quente, o trato gastrintestinal

representa um ecossistema peculiar de interação entre microbiota e seus hospedeiros

17 pela quantidade e diversidade de microrganismos nas diferentes porções anatômicas.

Neste sítio, observam-se diferentes formas de pressão seletiva e aporte nutricional

disponíveis para os microrganismos, cuja população microbiana é estimada em 100

trilhões de células (LEY, PETERSON e GORDON, 2006). O cólon está associado ao

maior número e diversidade de microrganismos, com estimativas de 1011 – 1012 cél/ml

do conteúdo intestinal (WHITMAN, COLEMAN e WIEBE, 1998). Além disso, acredita-

se que esses microrganismos, em conjunto, totalizem em seus genomas em torno de

150 vezes mais genes do que o genoma humano (SOMMER e BACKHEAD, 2013).

A microbiota intestinal exerce várias funções sobre a fisiologia de seu

hospedeiro, tais como: (i) processamento de componentes alimentares não digeríveis,

principalmente carboidratos, que são convertidos em ácidos graxos de cadeia curta

(acetato, propionato, butirato) (QUIN et al., 2010; SCHEPPACH, 1994); (ii) síntese de

fatores nutricionais, tais como vitaminas e aminoácidos (TAN e O’TOOLE, 2015); (iii)

processamento de xenobióticos; (iv) desenvolvimento e maturação do sistema imune

(KABAT, SRINIVASAN e MALOY, 2014); (v) renovação do epitélio intestinal e

manutenção da sua integridade; (vi) e resistência à colonização (SOMMER e

BACKHEAD, 2013). Além disso, acredita-se que a microbiota intestinal possua outras

funções ainda não bem estabelecidas, como papel auxiliar na síntese de metabólitos

disponibilizados aos hospedeiros (FISCHBACH, WALSH e CLARDY, 2007).

No intestino, a variabilidade taxonômica microbiana, entretanto, é maior que a

variabilidade funcional. Acredita-se que o número de espécies bacterianas varia entre

1.000 e 1.500, das quais 160 são amplamente compartilhadas, definindo-os como um

"núcleo comum" entre os indivíduos adultos com microbiota estável (QUIN et al 2010).

Nesta situação, a microbiota intestinal estável nos seres humanos é representada,

majoritariamente, pelos filos Bacteroidetes (20-25%), Firmicutes (60–65%),

18 Proteobacteria (5-10%), Actinobacteria (3%), e em menor quantidade, bactérias do filo

Verrucomicrobia e Fusobacteria (WOPEREIS et al., 2010 ; ROSENBAUN, KNIGHT e

LIEBEL, 2015). Apesar disso, todas as funções necessárias são realizadas no trato

gastrintestinal, o que indica que essas variações não afetam funcionalmente o

microbioma. Porém, essas diferenças podem afetar a eficácia da função realizada

(MARCHESI et al., 2015). Além disso, microbiota intestinal apresenta um caráter

anfibiôntico e pode estar associada a doenças infecciosas de origem endógena,

geralmente polimicrobianas, em situações de desequilibro ou ao alcançar sítios não

colonizados (UNDERWOOD, 2014; AL-SAFFAR et al., 2015). Já foi demostrado que

as alterações na microbiota (disbiose) também têm um papel importante no

aparecimento de várias doenças, não só no intestino, mas também em órgãos

distantes, como resultado da ruptura do equilíbrio na comunidade microbiana e na

homeostase atingida pelo hospedeiro (SUN e CHANG, 2014; BEIRAO et al., 2014).

Esse desequilíbrio, conhecido como disbiose, é um termo que foi utilizado pela

primeira vez em 1900 por Elie Metchnikoff para descrever alterações na fisiologia dos

hospedeiros em função de mudanças na microbiota. De acordo com Hawrelak e

Myers (2004), a disbiose pode afetar o hospedeiro devido a: (i) mudanças qualitativas

e quantitativas na microbiota; (ii) alterações em suas atividades metabólicas e; (iii)

alterações na distribuição das bactérias no intestino, o que resulta em mudanças na

diversidade e metabolismo bacteriano, com aumento de bactérias potencialmente

patogênicas.

A disbiose está associada a muitas doenças importantes, como câncer de

cólon, doença inflamatória intestinal, enterocolite necrotizante, síndrome metabólica,

doenças reumáticas, alergias, doenças cardíacas, asma, ovário policístico, diabetes,

esquizofrenia e obesidade (RUSELL et al., 2012; TREMELLEN e PEARCE, 2012;

19 ZHANG e ZHANG, 2013; SEVERANCE et al., 2013; UNDERWOOD, 2014;

BIEDERMANN e ROGLER, 2015). Portanto, é aceito que o conhecimento gerado

através do estudo da microbiota intestinal e as doenças relacionadas a sua alteração

poderá servir para um melhor conhecimento da fisiopatologia das doenças e

desenvolvimento de novas ferramentas e estratégias de prevenção, diagnóstico e

tratamento (NICHOLSON, HOLMES e WILSON, 2005).

Estudos recentes sobre composição e função da microbiota intestinal utilizaram

como parâmetro populações indígenas peculiares, como os índios da tribo Yanomami

na Amazônia venezuelana, os quais não tinham tido contato anterior com pessoas

fora da sua comunidade. Os autores demostraram a maior diversidade e

funcionalidade genética descrita em um grupo humano, indicando o impacto da vida

moderna das populações humanas na microbiota (CLEMENTE et al., 2015). Assim,

acredita-se que a microbiota residente é dinâmica e, como outros componentes

microbianos autóctones, pode ser influenciada por fatores como sexo, a idade, região

geográfica, condição imunológica e comportamento. Acredita-se ainda, que esses

fatores possam afetar a simbiose entre a microbiota e seu hospedeiro, alterando a

fisiologia do hospedeiro, e consequentemente, seu estado geral de saúde. Em alguns

casos, pode contribuir negativamente, tanto local, como sistemicamente (PHAM e

LAWLEY, 2014; YATZUNENKO et al., 2012).

O desenvolvimento e diversificação da microbiota intestinal é um processo

complexo que começa com o nascimento. A colonização inicial é crucial para o

desenvolvimento e maturação das características do sistema imunológico, de modo

que doenças tais como asma, diabetes e obesidade podem estar relacionadas com

mudanças na microbiota (COX et al., 2014; WOPEREIS et al., 2014; RUSSELL et al.,

2012). Estudos de análise do mecônio e da placenta tem mostrado a presença de

20 DNA de bactérias do gênero Bifidobacterium de procedência intestinal, o que sugere

uma transferência vertical deste material e o começo dos estímulos bacterianos no

corpo humano antes do nascimento (JIMENEZ et al., 2008; SATOKARI et al., 2009).

Após o nascimento, a implantação da microbiota, tanto qualitativamente quanto

quantitativamente, está relacionada, sobretudo, ao modo de alimentação do recém-

nascido e ao ambiente que ele vive (FALLANI et al., 2011). Theodore Escherich, um

dos pioneiros no estudo da microbiota em crianças, mostrou que a colonização

intestinal está diretamente relacionada com o meio ambiente nas primeiras 3 -24

horas após o nascimento, e modifica-se ao longo do desenvolvimento da criança

(SHULMAN, FRIEDMANN e SIMS, 2007). Assim, a microbiota vai se diversificando

cada vez mais, até alcançar uma microbiota mais estável e próxima à da vida adulta,

sendo estabelecida em torno de 2,5 anos (KOENIG et al., 2010).

2.2 Antimicrobianos e Resistência Bacteriana

Antimicrobianos são compostos que matam (bactericidas) ou inibem o

crescimento do microrganismo (bacteriostáticos). O termo antimicrobiano inclui

compostos produzidos naturalmente pelos microrganismos como moduladores nas

comunidades microbianas (antibióticos) e também compostos sintéticos ou semi-

sintéticos ou produzidos pela indústria farmacêutica (quimioterápicos). A resistência

antimicrobiana é a capacidade que os microrganismos tem de se multiplicar em

presença de drogas antimicrobianas, em concentrações iguais ou superiores às doses

terapêuticas (WHO, 2001).

De acordo com Gillings e Stokes (2012), os antibióticos representam diversas

famílias estruturais e moleculares com a capacidade de inibir o crescimento

21 bacteriano em altas concentrações. São considerados moléculas sinalizadoras e de

comunicação bacteriana, e só tem funções antimicrobianas em concentrações muito

mais altas do que aquelas necessárias para desempenhar a sua função original

(DANTAS, 2008). Seus efeitos podem ser diferentes dependendo das concentrações

em que se encontram no ambiente, e esta característica é definida como hormese

(ROMERO et al., 2011).

A maioria dos antibióticos são produtos secundários do metabolismo

bacteriano, e sua síntese é ativada durante momentos de estresse, como escassez

de nutrientes, ativando as vias metabólicas que produzem estes metabólitos . Nos

diferentes ecossistemas, a função destas moléculas pode variar desde matar ou inibir

os competidores até modular o crescimento e a morfologia bacteriana (DEMANECHE

et al., 2008).

Análises dos genomas bacterianos sugerem que apenas 1% do arsenal

antimicrobiano entre os microrganismos foi descrito, e a maior parte destas

substâncias são naturalmente produzidas nos processos fisiológicos microbianos

(FISCHBACH, 2009; OSBOURN, 2010). Os grupos de genes (clusters) que codificam

esses metabólitos podem não ser expressos (crípticos) em condições de laboratório

que não forneçam as condições para desencadear sua expressão (FISCHBACH,

2009).

O solo, um dos maiores reservatórios de resistência, é ao mesmo tempo o

hábitat de bactérias produtoras de antibióticos, principalmente bactérias do gênero

Actinomyces, que são as responsáveis pela produção de 80% dos antimicrobianos

utilizados na prática clínica (D’COSTA, GRIFFITHS e WRIGHT, 2007).

Paradoxalmente, as bactérias que vivem nestes ambientes coexistem na presença de

doses sub-terapêuticas de antibióticos, utilizando-os como vias de comunicação e

22 regulação genética entre espécies. Além disso, concentrações sub-terapêuticas de

alguns antimicrobianos, como os beta-lactâmicos e aminoglicosídeos, podem induzir a

produção de biofilmes (ROMERO et al., 2011), e sugere-se que as bactérias tem

diversificado seu repertório genético para responder eficazmente a certas moléculas,

dependendo do ambiente em que se encontram (WRIGHT, 2007).

Do ponto de vista biotecnológico e médico, os antimicrobianos são,

provavelmente, o recurso quimioterapêutico de maior sucesso desenvolvido no século

XX. Desde a sua instituição como suporte terapêutico, as drogas antimicrobianas têm

reduzido a mortalidade, mas não a persistência de doenças infecciosas. Além disso,

esses agentes antimicrobianos sejam naturais ou sintéticos apresentam efeitos

ecológicos (OSBOURN, 2010), principalmente atuando como agentes de pressão

seletiva, que aliada à habilidade de rápida replicação das bactérias e da transferência

horizontal de genes, faz da multirresistência bacteriana um fato inevitável (WRIGHT,

2007). Assim, a disseminação de genes de resistência aos antimicrobianos é um

problema global de saúde pública (FAO/OIE/WHO, 2003; ASM, 2009).

A introdução da penicilina no início dos anos 40, indicada na terapêutica de

infecções estafilocócicas, marca o início de uma nova era (TAVARES, 2000). No

entanto, linhagens do gênero Staphylococcus resistentes à penicilina foram

rapidamente detectadas, e dez anos depois, cerca de 50 a 60% dos isolados

tornaram-se resistentes (CDC, 2002; LIVERMORE, 2003)

O fenômeno da multirresistência aos antimicrobianos é uma das principais

características observadas entre linhagens bacterianas hospitalares, e têm incluído

além da resistência à oxacilina e a outros beta-lactâmicos, também a resistência à

eritromicina, clindamicina, tetraciclina, clorafenicol, rifampicina, aminoglicosídeos e

quinolonas (PEACOCK, 2005). Os microrganismos podem ser resistentes por

23 mecanismos intrínsecos ou adquiridos (POIREL, BONINN e NORDMANN, 2011),

resistência adaptativa (BRAOUDAKI e HILTON, 2004), co-resistência (SCHWABER et

al., 2005) e resistência cruzada (CHUANCHUEN et al., 2001).

Atualmente, microrganismos conhecidos como "super bactérias" tais como

Staphylococcus aureus MRSA, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae

KPC, causam milhares de mortes por ano, tornando a resistência bacteriana aos

antimicrobianos um grave problema de saúde pública (WHO, 2014; CARLET et al.,

2012).

2.2.1 O Resistoma

O desenvolvimento de técnicas microbiológicas independentes de cultivo

revelou uma nova abordagem para o conhecimento dos determinantes genéticos

relacionados à resistência aos antibióticos (GRICE e SEGRE, 2012), e revelou o

impacto que tem produzido o surgimento deste fenômeno (GILLINGS e STOKES,

2012). As terapias antimicrobianas foram concebidas para tratar os agentes

patogênicos em situações específicas, mas a sua utilização tem um impacto

ambiental significativo, cujo principal efeito é atuar como um agente de pressão

seletiva, motivando a evolução dos microrganismos em direção à resistência. Além

disso, outros agentes antimicrobianos, como biocidas e desinfetantes, também

desempenham essa função (GILLINGS, PAULSEN e TETU, 2015). Porém, o

surgimento de genes de resistência em ambientes que não são afetados diretamente

pela presença de antibióticos ainda não é claro (SENGUPTA, CHATTOPADHYAY e

GROSSART, 2013)

24

O microbioma humano interage com o pangenoma bacteriano, é a totalida de

genes presentes em todos os genomas de todos os procariotas na biosfera

(GILLINGS, 2013), e alguns autores descreveram que a troca genética é tão intensa

que o mundo bacteriano pode ser visto como um grande organismo multicelular, no

qual as células trocam seus genes com facilidade (LEVY, 1998). A porção do

pangenoma que contém os genes de resistência destes microrganismos é chamado

resistoma, e inclui todas as bactérias, sejam patogênicas ou comensais, em qualquer

ambiente do planeta. (FORSLUND et al., 2014) e os genes de resistência à

antibióticos de importância clínica que estão dentro do resistoma, são definidos como

o clínico. Análises metatranscriptômicas realizadas por Versluis et al. (2015)

mostraram a expressão de genes de resistência em condições naturais, em diferentes

ambientes e cuja presença não está relacionada com a presença de metabólitos

secundários relevantes, e que constituem um reservatório importante para bactérias

patogênicas.

O resistoma pode ser classificado em intrínseco e ambiental. O resistoma

intrínseco refere-se aos genes chamados de pré-resistência, que fazem parte das vias

metabólicas bacterianas e que eventualmente podem participar na resistência aos

antibióticos. Além disso, também podem tornar-se genes de resistência reais sob a

pressão seletiva adequada. Uma vez que estes determinantes atingem ambientes

humanos ou relacionados com atividades humanas, como resultado da contaminação

por xenobióticos, sofrem uma aceleração no seu processo de seleção, tornando-se

genes de resistência (PERRY e WRIGHT, 2014). Portanto, o conceito de resistoma

intrínseco permite expandir nossa compreensão dos mecanismos de resistência

potenciais e também como os efeitos na produção de antibióticos influenciam o

25 desenvolvimento destes mecanismos, atuando como agentes selecionadores

(FAJARDO et al., 2008).

O resistoma ambiental constitui um grande reservatório de resistência aos

antibióticos e está distribuído globalmente, mesmo em lugares sem atividade humana.

D’costa et al. (2006) mostraram que diferentes espécies de Actinomycetes são

resistentes a todos os tipos de antibióticos disponíveis comercialmente, incluindo os

mais recentes. Isso demonstra que estes determinantes existem há muito tempo e

que podem ser transferidos no seu ambiente por meio de mecanismos de

transferência horizontal (PERRY, WESTMAN e WRIGHT, 2014). Essa seleção será

acelerada na presença de ambientes com atividades humanas (GALAN et al., 2013).

2.2.3 O Resistoma fecal

A administração de antibióticos é capaz de produzir alterações profundas na

microbiota intestinal, principalmente a perda de diversidade microbiana e da

resistência à colonização. Os sítios disponíveis podem ser ocupados por bactérias

resistentes que previamente encontravam-se em baixas concentrações, ou até

mesmo por bactérias patogênicas. Os efeitos dessas alterações dependerão de

fatores como o espectro do agente antimicrobiano; a dose e duração do tratamento; a

via de administração e as propriedades farmacocinéticas da droga (JERNBERG et al.,

2010). Fouhyi et al. (2012) demostraram que recém-nascidos tratados com

gentamicina e ampicilina apresentaram diminuição de bactérias benéficas do

intestino, como as bifidobactérias e lactobacilos, que foram substituídas por

proteobactérias, ricas em elementos genéticos móveis envolvidos na resistência aos

antibióticos (BAQUERO, TEDIM e COQUE, 2013).

26

As bactérias que habitam normalmente o intestino de seres humanos e de

outros animais carreiam a maioria dos determinantes genéticos. Este reservatório de

genes de resistência aos antibióticos denomina-se resistoma fecal, que é definido por

Dantas e Sommer (2012) como um sistema aberto que é alterado constantemente

pela transferência de determinantes de resistência entre as espécies bacterianas por

meio de elementos genéticos móveis. Este processo é agravado pelo tratamento oral

com antibióticos de amplo espectro, que tem efeito também nas bactérias comensais,

enriquecendo o reservatório de genes de resistência disponível para os patógenos

(WILLMAN et al., 2015). No intestino, as bactérias compartilham genes de resistência

e podem receber e doar esses determinantes a bactérias transitórias (LESTER et al.,

2006; LINDBERG et al., 2000; NAKAO et al., 2014). Além disso, no intestino estão

presentes bactérias anfibiônticas, como Escherichia coli, Clostridium spp. e

Enterococcus spp., que também podem doar e receber material genético, além de

causar infecções, tais como bacteremia, endocardite, contaminação cirúrgica, entre

outras (TACONELLI, 2012).

No entanto, sabe-se pouco sobre a presença de genes de resistência no

intestino na ausência de estímulo. Estudos realizados por Moore et al. (2015)

mostraram que o resistoma fecal é estabelecido entre um a dois meses após o

nascimento, e seu enriquecimento está associado com fatores relacionados ao

ambiente de criança. Além disso, já foi descrito o resistoma fecal de populações

indígenas isoladas que não tem recebido tratamento antibiótico, indicando que os

genes são mantidos na ausência de pressão seletiva atribuída pelos antibióticos

(CLEMENTE et al., 2015). Já foi demonstrado que esses genes não estão

relacionados com sínteses de metabólitos secundários, o que indica que eles

27 poderiam ser expressos constitutivamente e realizar outras funções, além da

resistência aos antibióticos no intestino.

De acordo com Ruppé e Andremont (2014), o resistoma fecal pode ser dividido

em resistoma residente, que é composto pelos genes de resistência naturalmente

presentes nos membros permanentes da microbiota intestinal, tais como os do gênero

Bacteroides; e resistoma variável, composto de genes exógenos de bactérias

transitórias ou adquiridos por transferência horizontal. Esses elementos móveis de

transferência genética presentes em procariotas formam parte do mobiloma, e são

responsáveis pela manutenção e transferência horizontal de genes de resistência na

microbiota intestinal (SALYERS, GUPTA e WANG, 2004).

Os três principais mecanismos de transferência horizontal de genes são a

conjugação, a transformação e a transdução. A conjugação é o principal mecanismo

de transferência horizontal no intestino, e permite a transferência de material genético,

como plasmídeos, transposons e integrons (ARUTYUNOV e FROST, 2013). É aceito

que a conjugação seja altamente importante para disseminação de marcadores

genéticos de resistência a drogas antimicrobianas entre as bactérias intestinais, com

grande impacto na prática clínica (SHOEMAKER et al., 2001).

A transformação permite a recepção de DNA plasmidial e cromossômico, por

isso é um mecanismo importante na evolução dos microrganismos. Neste processo,

as células bacterianas podem capturar o DNA livre no ambiente e incorporá-lo no seu

genoma. Estima-se que existem pelo menos 80 espécies que utilizam este processo,

dos quais, pelo menos 12 são patogênicas, isolados no ambiente clínico (LORENZ e

WACKERNAGEL, 1994).

28

A transdução é outro mecanismo importante envolvido na aquisição de genes

de resistência, no qual os bacteriófagos desempenham um papel crucial na

transferência de material genético (MUNIESA, LLUCH e JOFRE, 2013).

2.3 Obesidade

A obesidade é definida pela Organização Mundial da Saúde como um acúmulo

anormal ou excessivo de gordura, que apresenta um risco para a saúde (WHO, 2014),

Estima-se que em 2025, cerca de 2,3 bilhões de adultos estejam com

sobrepeso; e mais de 700 milhões, obesos. Além disso, o número de crianças com

sobrepeso e obesidade no mundo poderia chegar a 75 milhões, caso nada seja feito

(ABESO, 2015). Uma das formas de se diagnosticar a obesidade é a avaliação do

índice de massa corporal (IMC), que mede a relação peso/altura do indivíduo. Um

indivíduo com um IMC de 30 ou mais é geralmente considerado obeso, enquanto uma

pessoa com um IMC igual ou superior a 25 apresenta sobrepeso (LIN et al., 2002).

De acordo com o relatório global de doenças não transmissíveis da

Organização Mundial da Saúde (WHO, 2014), a prevalência mundial da obesidade

duplicou-se entre 1980 e 2014, e atualmente o Brasil ocupa a quinta posição mundial

em relação a esta doença. De acordo com pesquisas realizadas pelo Ministério da

Saúde do Brasil, 52.5% da população do Brasil está na faixa de sobrepeso, e 17.9%

podem ser caracterizados como obesos. Além disso, 3,4 milhões de mortes por ano

estão relacionadas com a obesidade, com alta concentração de casos na região das

Américas (LIM et al., 2014).

A obesidade tem causas multifatoriais relacionada com fatores genéticos,

metabólicos, sociais, comportamentais e culturai (REF). Acredita-se que fatores

29 genéticos podem estar relacionados à eficiência no aproveitamento, armazenamento

e mobilização dos nutrientes ingeridos, ao gasto energético, em especial à taxa

metabólica basal, ao controle do apetite e ao comportamento alimentar (SCHIERRI et

al., 1994). A obesidade pode estar associada também a algumas desordens

endócrinas, como o hipotireoidismo e problemas no hipotálamo (GIGANTE et al.,

1997). Além disso, as pessoas que referem obesidade materna e paterna

apresentaram risco quase duas vezes mais alto de tendência à obesidade do que

aqueles cujos pais não são obesos (MOTTA et al., 2004). O crescimento acelerado

da obesidade nas populações tem destacado a modernização das sociedades, a qual

tem provocado mais oferta de alimentos aliada à melhoria das formas de trabalho

devido à mecanização e à automação das atividades (MANCINI, 2001). O modo de

viver foi alterado pela economia do gasto energético no trabalho e nas atividades de

vida diária, associada à maior oferta de alimentos. Por essas razões, a obesidade

vem sendo denominada "doença da civilização" ou "síndrome do Novo Mundo".

(MANCINI, 2001; TAVARES, NUNES e SANTOS, 2010).

A obesidade está associada com uma grande quantidade de doenças crónicas

como: i) Doenças cardiovasculares que sao a causa de um terço das mortes no Brasil

(Rodrigues, 2008). ii) Diabetes Mellitus que corresponde a um grupo de doenças

metabólicas caracterizadas por hiperglicemias resultantes de defeitos na secreção de

insulina, na ação da insulina ou em ambas (SILVA, 2007). Iii) A hipertensão arterial

que é uma doença crônica que se caracteriza pelo aumento dos valores de pressão

sistólica e/ou distólica (JESUS, 2009) entre outras.

30 2.4 Obesidade e microbiota intestinal

Os microrganismos intestinais possuem a capacidade de degradar carboidratos

não digeríveis pelas enzimas do hospedeiro, fornecendo calorias “extras”

(SONNENBURG et al., 2005; FLINT et al., 2008). Harley e Karp (2012) propõem

vários mecanismos biológicos para definir o papel da microbiota no desenvolvimento

da obesidade, tais como: (i) o aumento da capacidade de extrair energia dos

alimentos; (ii) alteração direta dos mecanismos energéticos do hospedeiro

(armazenamento e uso de energia) através de metabólitos microbianos; (iii)

intervenção direta no sistema imune do hospedeiro e; iv) regulação da insulina e

colesterol (CANI, 2013).

Diferentes estudos têm mostrado que o desenvolvimento da obesidade está

relacionado a mudanças na abundância relativa de dois filos dominantes no intestino,

Bacteroidetes e Firmicutes. Os indivíduos eutróficos possuem uma população

predominante de Bacteroidetes, enquanto indivíduos obesos possuem maior

proporção de Firmicutes (LEY et al., 2006). Os microrganismos pertencentes ao filo

Firmicutes possuem enzimas que degradam polissacarídeos que não são digeridos

por humanos, e essa energia adicional contribui para a obesidade no hospedeiro

(DAS, 2010). Assim, indivíduos com uma comunidade microbiana mais eficiente na

extração de energia ou com capacidade de promover a adiposidade podem estar

predispostos à obesidade. Esta hipótese foi confirmada por diversos estudos, onde

camundongos germ free, a princípio mais resistentes à obesidade, quando

transplantados com bactérias intestinais, sem aumento na quantidade de alimentos

ingeridos, apresentaram adiposidade aumentada, sugerindo que a colonização

bacteriana induz o aumento da lipogênese hepática e aumento no armazenamento de

gordura pelos adipócitos (BACKHED et al., 2007; HARLEY e KARP, 2012;

31 REINHARDT). Além disso, alterações na extração de energia pela microbiota

intestinal já foram descritas por Shin, Whon e Bae (2015) com um incremento no filo

Proteobacteria.

O sistema imunológico é responsável por controlar e regular a relação entre o

hospedeiro, a mucosa intestinal e sua população bacteriana residente, e quando há o

desequilíbrio, pode resultar em um estado de inflamação baixo grau, característico da

obesidade. Estudos têm mostrado que a microbiota intestinal pode provocar este

estado inflamatório através da atividade do lipopolissacarídeo (LPS), um componente

da parede celular de bactérias Gram-negativas (MOREIRA et al., 2012) relacionado

principalmente ao consumo de gorduras saturadas (LAM et al., 2015). Além disso, o

estado de obesidade esta relacionado com um aumento de leptina circulante

associado ao decréscimo nos níveis de grelina e adipocitocina, estão correlacionados

com a manutenção dessa inflamação (MANCO et al., 2007; SMITH et al., 2007;

VALERA MORA , 2007; ZHANG et al., 2009).

Devido a esta inflamação crônica de baixo grau, indivíduos obesos possuem

maiores níveis de citocinas inflamatórias circulantes. O tecido adiposo dos obesos se

torna um sítio de células inflamatórias, principalmente macrófagos (MФ) do tipo M1,

que secretam grandes quantidades de citocinas inflamatórias e quimiocinas que, por

sua vez, atraem um maior número de células, aumentando assim os níveis destas

moléculas, que contribuem ativamente para a inflamação sistêmica nestes indivíduos

(LUMENG, BODZIN e SALTIEL, 2007)

Cani et al. (2007) demonstraram que camundongos alimentados com dieta rica

em gordura apresentaram endotoxemia metabólica, que corresponde ao aumento de

LPS no plasma. Entretanto, foi 10-50 vezes menor do que os níveis encontrados em

um choque séptico. A relevância do complexo CD14/TLR4 no processo inflamatório

32 foi confirmada quando camundongos CD14KO (CANI et al., 2007) e TLR4KO foram

protegidos contra a obesidade e doenças metabólicas (SHI et al., 2006). Este LPS

endógeno é liberado no intestino após a morte de bactérias Gram-negativas e seu

acesso à circulação ocorre principalmente por duas vias: ou através de difusão direta,

devido ao aumento da permeabilidade intestinal, uma vez que o aumento na ingestão

de gordura saturada e carboidratos simples podem inibir a produção de proteínas de

ligação intestinal (MOREIRA et al., 2012; LAM et al., 2015) ou por absorção e

incorporação do LPS na estrutura dos quilomicrons (VREUGDENHIL et al., 2003).

2.4 Metabólitos e Xenobióticos no Intestino

Os xenobióticos são definidos como substâncias químicas estranhas ao

hospedeiro que entram no corpo através da pele, ingestão ou inalação, não sendo

considerados como nutrientes (DORRESTEIN, MAZMANIAN e KNIGHT, 2014). De

acordo com Apajalathi, (2005) são classificados em: (i) químicos naturais presentes

na dieta; (ii) poluentes do ar e da água, constituídos por substâncias químicas

inorgânicas e orgânicas complexas e; iii) drogas e produtos químicos agrícolas, como

pesticidas e fertilizantes, aditivos alimentares, metais pesados, plastificantes, produtos

químicos domésticos e industriais. A principal via de exposição à xenobióticos é a

oral, pela ingestão de agentes terapêuticos e exposição não intencional à poluentes

ambientais presentes nos alimentos e água. Assim, os xenobióticos presentes em

fontes alimentícias representam uma fonte significativa de químicos com capacidade

de influenciar a microbiota intestinal, causando disbiose (POSSEMIERS et al., 2009).

O metabolismo é o processo pelo qual esses metabólitos são processados. Os

xenobióticos administrados por via oral são metabolizados por enzimas da microbiota

33 intestinal, e esse processo depende da composição da microbiota intestinal e da

quantidade do xenobiótico que alcança o cólon, onde podem ser transformados em

metabólitos ativos, inativos ou tóxicos (SWANSON, 2015; KIM, 2015).

Por exemplo, o arsênico é um dos xenobióticos mais estudados, é já foi

mostrado que pode causar alterações não só na composição da microbiota, mas no

microbioma e nos metabólitos presentes no intestino, o que pode afetar diretamente o

hospedeiro (LU et al., 2014). Maurice, Haiser e Turnbaugh (2012) observaram a

influência de diferentes xenobióticos, entre eles etanol, ácidos, e drogas

antimicrobianas no comportamento microbiano intestinal, e concluíram que os

antibióticos apresentaram o maior efeito na microbiota intestinal, induzindo alteração

nos padrões regulares de transcrição, tradução, biosíntesse de vitaminas e transporte

de fostatos; já os outros xenobióticos foram capazes de induzir alterações nas

funções microbianas relacionadas ao transporte transmembrana, metabolismo (via

pentose-fosfato) e mecanismos catabólicos relacionados à biodegradação dessas

substâncias.

Além disso, estudos realizados por Kohanski (2007) mostraram que os

xenobióticos podem induzir estresse metabólico, sugerindo que a exposição a esses

agentes pode ser um fator de pressão seletiva, e é possível que as respostas

expressadas pelo microbioma na presença de xenobióticos estejam relacionadas com

respostas a outros alvos naturais. A microbiota intestinal produz uma grande

quantidade de metabólitos, como ácidos graxos de cadeia curta, exotoxinas e

enzimas, proteínas relacionadas ao quorum sensing, metabólitos secundários e

outros que ainda não foram caracterizados, mas que tem capacidade de afetar o

microambiente intestinal (VOGT, DIAZ e FINLAY, 2015), e sua síntese depende de

uma comunicação cruzada entre o hospedeiro, microrganismos e xenobióticos

34 (DORRESTEIN, MAZMANIAN e KNIGHT, 2014). Esses produtos metabólicos podem

ser tóxicos. Por exemplo, os ácidos graxos de cadeia curta podem inibir a colonização

de bactérias patogênicas, e, além disso, altas concentrações de ácidos graxos de

cadeia curta e pH externo baixo promovem o acúmulo destes ácidos no citoplasma

bacteriano, dissipando a força próton-motiva envolvida na síntese de ATP e

mobilidade dos microrganismos(VOGT, DIAZ e FINLAY, 2015).

Diferentes alimentos também podem ter produtos finais tóxicos, como é o caso

das proteínas, que no final do seu processo metabólico (putrefação) gera substâncias

potencialmente tóxicas, como amônia, aminas, fenóis e tióis (GUARNER e

MAGALEGADA, 2003). No caso da amônia, concentrações baixas afetam a

morfologia e metabolismo das células intestinais, além da síntese de DNA. Outro

derivado do metabolismo da carne, o fecapentano, induz mutações, aberrações nos

cromossomos, mudanças nas cromátides e reduz o tempo de vida das células

(HUGHES e ROWLAND, 2000). Outros fatores relacionados com o estilo de vida

como o estresse, podem alterar a quantidade de bactérias potencialmente benéficas,

como as do gênero Lactobacillus (GUR e BAILEY, 2016).

No caso da obesidade, estudos em camundongos eutróficos e com exceso de

peso mostraram mudanças nos padrões metabólicos. Níveis aumentados de ácido

oxolitocólico, oxocolenóico e colandienóico foram observados exclusivamente em

camundongos com obesidade, o que permite sugerir a correlação entre a dieta, a

microbiota e os metabólitos presentes no intestino (WALKER et al., 2014). Apesar

disso, sabe-se pouco sobre todas as funções que esses metabólitos realizam no

ambiente intestinal, e quais são as consequências dessas alterações na microbiota

intestinal.

35 2.5 Justificativa

Do exposto, dando sequência à linha de pesquisa “Epidemiologia da

resistência e resposta bacteriana aos antimicrobianos”, do Laboratório de Fisiologia e

Genética Molecular Bacteriana do ICB/UFJF e considerando-se:

• A importância da obesidade nos dias de hoje, considerada uma pandemia pela

Organização Mundial da Saúde;

• Os estudos que relacionam a obesidade com a disbiose e seu impacto na

microbiota intestinal, bem como fatores associados que podem contribuir para

este estado, como o estilo de vida, alimentação, exposição aos antimicrobianos e

outros xenobióticos;

• A importância do fenômeno da resistência às drogas antimicrobianas e a

necessidade de estudos regionais sobre sua epidemiologia para proposição de

medidas de prevenção e controle;

• A carência de informações sobre os impactos da obesidade na seleção ou

persistência de marcadores genéticos relacionados à resistência bacteriana às

drogas no ecossistema intestinal;

A investigação da influência do comportamento e da fisiologia de indivíduos com

sobrepeso e obesos no fenômeno da resistência bacteriana aos antimicrobianos,

torna-se altamente relevante. A literatura atual é carente de informação científica,

36 sobretudo, considerando-se o ecossistema intestinal nestes indivíduos de fisiologia

alterada, como reservatório de genes de resistência relacionados à drogas

antimicrobianas de uso clínico.

37 3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

• Avaliar a ocorrência de marcadores genéticos de resistência a drogas

antimicrobianas do resistoma clínico bacteriano em espécimes fecais obtidos

de indivíduos categorizados como obesos, com sobrepeso e eutróficos,

residentes em Juiz de Fora, MG, e a correlação da sua ocorrência com grupos

bacterianos representativos de espécies que comumente albergam esses

marcadores no seu genoma.

3.2 Objetivos Específicos

• Recrutar indivíduos, realizar medidas antropométricas, avaliação sócio -

demográfica e avaliação nutricional para caracterização de participantes

eutróficos, com sobrepeso e obesos na cidade de Juiz de Fora, MG;

• Obter DNA representativo do metagenoma intestinal a partir de espécimes

fecais dos indivíduos participantes categorizados em eutróficos, com

sobrepeso e obesos;

• Avaliar a presença de marcadores de resistência a drogas antimicrobianas do

resistoma clínico nos metagenomas obtidos, por PCR;

38

• Avaliar a distribuição de grupos bacterianos associados aos genes de

resistência pesquisados, nos metagenomas obtidos, por FISH;

• Correlacionar os parâmetros clínico-epidemiológicos dos participantes, a


observados nos metagenomas obtidos.

39 4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Delineamento Experimental

A estratégia experimental é descrita no fluxograma 1.

Fluxograma 1: Representação esquemática da estratégia experimental para o estudo de ocorrência de

genes de resistência bacterina às drogas no metagenoma intestinal de indivíduos eutróficos, com

sobrepeso e obesos e sua correlação com ocorrência de grupos bacterianos de interesse e

características antropométricas, sociodemográfica e nutricional dos indivíduos.

Coleta de amostras fecais e obtenção de DNA metagenômico.

Seleção de pacientes

• Serviço de Nutrição HU/UFJF

• Comunidade

Determinação de medidas antropométricas,

avaliação sociodemográfica e nutricional.

Quantificação e análise de integridade do DNA extraído.

Avaliação da ocorrência de genes

de resistência aos antimicrobianos Avaliação das espécies bacterianas

relacionadas aos genes de resistência.

Correlação dos parâmetros clínico-epidemiológicos dos participantes, distribuição de grupos

bacterianos e os marcadores de resistência.

40 4.2 Seleção de pacientes, coleta e preparo de amostras.

Este estudo é do tipo transversal, prospectivo, descritivo e observacional,

realizado com indivíduos adultos, selecionados na comunidade e no ambulatório do

serviço de nutrição do Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora.

Os critérios de inclusão foram: idade entre 18 e 60 anos e Índice de Massa Corporal

(IMC) a partir de 18,5 kg/m2. Os critérios de exclusão foram: doenças intestinais, uso

de antibióticos no ultimo mês e diagnóstico confirmado de diabetes. O estudo foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade

Federal de Juiz de Fora (Anexo 1). Todos os voluntários foram informados a respeito

dos objetivos do estudo e assinaram o termo de consentimento livre esclarecido

(Anexo 2).

Para avaliação antropométrica, foram aferidos o peso, a estatura, as

circunferências da cintura (CC), abdominal (CA) e quadril (CQ). O peso dos

participantes foi aferido em balança digital com o indivíduo em posição central, ereto,

descalço, com os pés juntos, e usando o mínimo de roupa possível. A altura foi

verificada utilizando-se um estadiômetro vertical fixo à balança, também descalço e

ereto, com calcanhares unidos, com a cabeça livre de adereços e olhando para o

horizonte. O IMC foi calculado a partir da relação peso (kg)/altura (m2) e avaliado de

acordo com o proposto pela Organização Mundial de Saúde (1998).

As aferições das circunferências foram feitas usando fita métrica flexível e

inextensível de 150cm de comprimento, estando no plano horizontal e no mesmo

nível em todas as partes, com o individuo em pé, ereto, braços estendidos ao longo

do corpo e sem comprimir os tecidos. A circunferência da cintura foi aferida a 2 dedos

acima da cicatriz umbilical e com a roupa afastada, sendo analisada segundo os

41 pontos de OMS (1998), onde CC ≥ 94 cm e ≥ 80cm indica risco cardiovascular para

homens e mulheres respectivamente. Já circunferencia abdominal foi medida na

altura da cicatriz umbilical também com a roupa afastada e a circunferencia do quadril

foi aferida na área de maior proeminência da região glútea. A relação cintura quadril é

obtida pela divisão da circunferência da cintura pelacircunferência do quadril, sendo

usado para análise com valores de corte considerados pela OMS (1995), onde RCQ

>1 para homens e >0,85 para mulheres são indicativos de obesidade andróide e risco

aumentado de doenças relacionadas com a obesidade. Para diminuir o viés neste

estudo, as medidas foram tomadas sempre pelo mesmo profissional de nutrição,

usando a mesma cinta métrica e balança. Assim, com base nesses critérios, 72

indivíduos foram selecionados e divididos em 3 grupos: eutróficos (IMC = 18.5 – 25),

com sobrepeso (IMC= 25 – 30) e obesos (IMC > 30).

Para estimar a ingestão habitual dos participantes, aplicou-se um questionário

quantitativo de frequência alimentar (QQFA) adaptado. Para cada item do QQFA,

validado por Ribeiro e Cardoso (2002), os voluntários informaram a frequência média

de consumo habitual de alimentos (diária, semanal ou mensal) relativa aos últimos

seis meses e o tamanho da porção ingerida. Para ajudar os participantes na

estimativa das porções, usou-se o álbum fotográfico elaborado por Sales, Costa e

Silva (2004), que contém imagens dos alimentos questionados e diferentes tamanhos

das porções ingeridas.

Amostras fecais dos participantes foram coletadas em domicílio no início da

manhã, por demanda espontânea pelos participantes, em recipientes coletores

universais esterilizados e fornecidos pelos pesquisadores. Os recipientes com as

amostras fecais foram prontamente enviadas para o Laboratório de Fisiologia e

Genética Molecular Bacteriana do ICB/UFJF, onde foram aliquotadas.

42

Para extração de DNA metagenômico, foram pesados 200mg de fezes, e

armazenados em freezer -20°C; para análise dos grupos bacterianos de interesse, por

FISH, 150mg de fezes foram pesados e fixados em paraformaldeído 2%.

4.3 Extração de DNA das amostras fecais.

O DNA total foi extraído usando o kit comercial QIAamp™ DNA Stool Mini Kit e

a plataforma automatizada Qiacube (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as

instruções do fabricante, e algumas modificações para aumento no rendimento do

DNA metagenômico. Inicialmente, três pérolas de vidro foram adicionadas por

amostra na etapa de lise celular e homogeneizadas em vórtex durante 2 minutos. Em

seguida as amostras foram incubadas a 95°C, por 15 min, e subsequentemente

agitadas em vórtex, vigorosamente, por mais 2 minutos adicionais. Após esta etapa,

300 mL de tampão InhibiTex (fornecido no kit) foram adicionados às suspensões

fecais, seguido de homogeneização, incubação e centrifugação. Posteriormente, o

procedimento de obtenção dos extratos de DNA foram continuados na plataforma

automatizada Qiacube, de acordo com o proGrama específico para o QIAamp™ DNA

Stool Mini Kit. O DNA representativo do metagenoma intestinal foi eluído em volume

de 200µL e mantido em freezer a -70ºC para estudos posteriores.

A concentração e a pureza do DNA metagenômico foram determinadas por

fluorimetria usando-se o fluorímetro Qubit™ 2.0®, com o kit Qubit™ dsDNA HS Assay

(Life Technologies, California, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A

integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 0,8% em

tampão TBE (Tris-HCl-Borato-EDTA). O gel foi corado com brometo de etídio e

43 analisado em transiluminador de luz ultravioleta (GE Healthcare, Reino Unido). O

DNA extraído foi aliquotado e armazenado em freezer a -70°C.

4.3 Detecção dos genes de resistência

Os marcadores de resistência tet(A), tet(B), tet(E), tet(L), tet(K), tet(M),

tet(Q),tet(O), aacA-AphD, ampC, blaZ, blaCTX-M, ereA, ereB, linA, mecA, mphA,

mrsA, mef, mrsB, blaSHV, blaTEM, vatA, vatB, vatC, vga, vgb, bla-KPC, ermA, ermB,

ermC, mexB, mexD, mexF, mexY, blaOXA23, blaOXA51, blaOXA58, blaOXA24, blaOXA1,

blaOXA10, blaOXA2, blaOXA143, blaSPM-1, sul1, sul2, sul3, nim1, nim2, nim3, nim4, qnrS,

qnrB, cepA, cfxA, cfxA2, cfiA, qnrB, qnrS, representativos do resistoma clínico fecal,

foram pesquisados a partir do DNA metagenômico extraído das amostras fecais por

PCR convencional, utilizando oligoiniciadores específicos e condições de amplificação

já descritas na literatura (Tabela 1).

As reações de PCR foram realizadas em volumes de 25 µL, contendo 12,5 µL

de PCR Master Mix (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1µL de DNA

(~20ng/µL), o volume do primer foi de acordo com a referência usada e o volume foi

completado com água. Foi realizado em termociclador automatizado (Biometra T1

Thermal Cycler, Gttingen, Alemanha). Os amplicons foram visualizados em

transiluminador de luz ultravioleta (GE Healthcare, Reino Unido) após eletroforese em

gel de agarose 1.5% e corados com brometo de etídio. Foi utilizado o padrão de peso

molecular 100bp DNA ladder (Promega Corporation, Madison, WI, USA). As

condições de amplificação, bem como as concentrações de cada um dos

oligonucleotídeos iniciadores seguiram os protocolos das referências. O controle

negativo foi realizado a partir de reações sem DNA molde. Como controle positivo,

44 foram utilizadas amostras da coleção positivas para os genes: blaZ, tet(K), tet(M),

mecA, blaCTX-M, ereB, mrsa, blaTEM, aacA-aphD, mexB, mexD, mexF, mexY, blaOXA23,

blaOXA51, blaOXA143, blaOXA10, blaOXA2, blaSPM-1. Para os demais genes pesquisados

foram realizados ensaios de sequenciamento de amplicons selecionados numa

amostragem de 10% das reações específicas de cada um dos marcadores. Para as

reações do sequenciamento foram utilizados os produtos de PCR de cada gene

estudado em duas réplicas. As reações foram processadas em equipamento ABI

3730 DNA analyser (Applied Biosystems/USA).

45 Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados neste estudo, tamanhos dos fragmentos esperados e referências.

Gene alvo Antimicrobiano Sequência (5’ – 3’) Amplicon (bp) Referência

blaCTX-M Beta-lactâmico ATG TGC AGY ACC AGT AAA G

562 Jones et al., 2009 GGT CAC CAG AAG GAG C

blaKPC Beta-lactâmico ATG TCA CTG TAT CGC CGT CT

892 Jones et al., 2009 TTT TCA GAG CCT TAC TGC CC

blaSHV Beta-lactâmico CTT TAC TCG CCT TTA TCG GC

982 Jones et al., 2009 TTA CCG ACC GGC ATC TTT CC

blaTEM Beta-lactâmico GTG CGC GGA ACC CCT ATT

968 Jones et al., 2009 TTA CCA ATG CTT AAT CAG TGA GGC

blaOXA-23 Beta-lactâmico GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA

501 Woodford et al., 2006 ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT

blaOXA-51 Beta-lactâmico TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG

353 Woodford et al., 2006 TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG

blaOXA-24 Beta-lactâmico GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA

246 Woodford et al., 2006 AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT

blaOXA-143 Beta-lactâmico TGG CAC TTT CAG CAG TTC CT

149 Higgins et al., 2010 TAA TCT TGA GGG GGC CAA CC

blaOXA-58 Beta-lactâmico AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG

599 Woodford et al., 2006 CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC

blaOXA-10 Beta-lactâmico TCT TTC GAG TAC GGC ATT AGC

760 Naas et al., 2000 CCA ATG ATG CCC TCA CTT TCC

blaOXA-2 Beta-lactâmico GCC AAA GGC ACG ATA GTT G

701 De Champs et al., 2002 GCG TCC GAG TTG ACT GCC GG

46 Tabela 1. Continuação…

blaZ Beta-lactâmico ACT TCA ACA CCT GCT GCT TTC

173 Martineu et al., 2000. TGA CCA CTT TTA TCA GCA ACC

cfxA/cfxA2 Beta-lactâmico CGT AGT TTT GAG TAT AGC TTT

802 Morin, Madinier e Fosse, 2003. GAT GTT GCC TAT ATA TGT C

ampC Beta-lactâmico ATA ACC ACC CAG TCA CGC

630 Odeh et al., 2002 CAG TAG CGA GAC TGC GCA

blaSPM-1 Beta-lactâmico CCT ACA ATC TAA CGG CGA CC

649 Gales et al., 2003 TCG CCG TGT CCA GGT ATA AC

cfiA Beta-lactâmico TCC ATG CTT TTC CCT GTC GCA GTT AT

683 Sóki et al., 2004 GGG CTA TGG CTT TGA AGT GC

tet(A) Tetraciclina GCT ACA TCC TGC TTG CCT TC

210 Ng et al., 2001 CAT AGA TCG CCG TGA AGA GG

tet(B) Tetraciclina TTG GTT AGG GGC AAG TTT TG

659 Ng et al., 2001 GTA ATG GGC CAA TAA CAC CG

tet(E) Tetraciclina AAA CCA CAT CCT CCA TAC GC

278 Ng et al., 2001 AAA TAG GCC ACA ACC GTC AG

tet(K) Tetraciclina GTA GCG ACA ATA GGT AAT AGT

360 Strommenger et al., 2003 GTA GTG ACA ATA AAC CTC CTA

tet(L) Tetraciclina TCG TTA GCG TGC TGT CAT TC

267 Ng et al., 2001 GTA TCC CAC CAA TGT AGC CG

tet(M) Tetraciclina AGT GGA GCG ATT ACA GAA

158 Strommenger et al., 2003 CAT ATG TCC TGG GGT GTC TA


tet(O) Tetraciclina AGC GTC AAA GGG GAA TCA CTA TCC

1723 Trzcinski et al., 2000 CGG CGG GGT TGG CAA ATA

tet(Q) Tetraciclina TTA TAC TTC CTC CGG CAT CG

904 Ng et al., 2001 ATC GGT TCG AGA ATG TCC AC

mrsA Meticilina TCC AAT CAT AGC ACA AAA TC

163 Chaieb et al., 2007 AAT TCC CTC TAT TTG GTG GT

mecA Meticilina GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A

310 Zhang et al., 2004 CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A

mef Meticilina AGT ATC ATT AAT CAC TAG TGC

348 Chaieb et al., 2007 TTC TTC TGG TAC AAA AGT GG

ereA Eritromicina AAC ACC CTG AAC CCA AGG GAC G

420 Sutcliffe et al., 1996 CTT CAC ATC CGG ATT CGC TCG A

ereB Eritromicina AGA AAT GGA GGT TCA TAC TTA CCA

546 Sutcliffe et al., 1996 CAT ATA AAT CAT CAC CAC CAA TGG CA

mphA Eritromicina AAC TGT ACG CAC TTG C

837 Sutcliffe et al., 1996 GGT ACT CTT CGT TAC C

ermA MLS

AAG CGG TAA ACC CCT CTG A 190 Strommenger et al., 2003

TTC GCA AAT CCC TTC TCA AC

ermB MLS CTA TCT GAT TGT TGA AGA AGG ATG AAA

142 Martineau et al., 2003 GTT TAC TCT TGG TTT AGG ATG AAA

ermC MLS AAT CGT CAA TTC CTG CAT GT

299 Strommenger et al., 2003 TAA TCG TGG AAT ACG GGT TTG


qnrB Quinolona GAT CGT GAA AGC CAG AAA GG

476 Kim et al., 2009 ATG AGC AAC GAT GCC TGG TA

qnrS Quinolona GCA AGT TCA TTG AAC AGG GT

428 Kim et al., 2009 TCT AAA CCG TCG AGT TCG GCG

sul1 Sulfonamida ATG GTG ACG GTG TTC GGC ATT CTG A

815 Grape, Sundstrom e Kronvall, 2003. CTA GGC ATG ATC TAA CCC TCG GTC T

sul2 Sulfonamida CCT GTT TCG TCC GAC ACA GA

396 Hindi, Shubbar e Addos, 2013. GAA GCG CAG CCG CAA TTC AT

sul3 Sulfonamida GAG CAA GAT TTT TGG AAT CG

396 Grape, Sundstrom e Kronvall, 2003. CAT CTG CAG CTA ACC TAG GGC TTT GGA

nim1 Metronidazole ATG TTC AGA GAA ATG CGG CGT AAG CG

458 Trinh e Reysset, 1996. GCT TCC TTG CCT GTC ATG TGC TC







aacA - aphD Aminoglicosídeo TAA TCC AAG AGC AAT AAG GGC

227 Strommenger et al., 2003 GCC ACA CTA TCA TAA CCA CTA

vatA MLS*

TGG TCC CGG AAC AAC ATT TAT 268 Strommenger et al., 2003

TCC ACC GAC AAT AGA ATA GGG *Macrólido, Lincosamida e estreptoGramina


vatB MLS GCT GCG AAT TCA GTT GTT ACA

136 Strommenger et al., 2003 CTG ACC AAT CCC ACC ATT TTA

vatC MLS AAG GCC CCA ATC CAG AAG AA

467 Strommenger et al., 2003 TCA ACG TTC TTT GTC ACA ACC

vga MLS CCG AAC TGC TAT TAG CAG A

470 Lina et al., 1999 AAG TTC GTT TCT CTT TTC GA

vgb MLS ACT AAC CAA GAT ACA CAG GAC C

734 Lina et al., 1999 TTA TTG CTT GTC AGC CTT CC

linA MLS GGT GGC TGG GGG GTA GAT GT 323 Sutcliffe et al., 1996

GCT TCT TTT GAA ATA CAT GG

mrsB MLS TAT GAT ATC CAT AAT AAT TAT CCA ATC

334 Lina et al., 1999 AAG TTTA TAT CAT GAA TAG ATT GTC CTG TT

cepA MLS TTT CTG CTA TGT CCT GCC C

743 Nakano et al., 2011 ATC TTT CAC GAA GAC GGC

mexB * GTG TTC GGC TCG CAG TAC TC

244 Yoneda et al., 2005 AAC CGT CGG GAT TGA CCT TG

mexD * CGA GCG CTA TTC GCT GC

165 Xavier et al., 2010 CGA GCG CTA TTC GCT GC

mexF * GGC AGT TGC ACG TCG A

255 El Amin et al., 2005 CGC CTG GTC ACC GAG GAA GAG T

mexY * TAG TCC ATG GCT TGC GGG AAG C

250 Yoneda et al., 2005 CCG CTA CAA CGG CTA TCC CT

* Bombas de efluxo que conferem resistência cruzada a diferentes drogas antimicrobianas

50 4.4 Avaliação quantitativa e qualitativa das espécies bacterianas por

hibridização fluorescente in situ (FISH).

A partir das amostras fixadas previamente com paraformaldeído 2%, foram

adicionados 1100µL de TWEEN 0,001%, e incubadas a temperatura ambiente

durante 60 min. Posteriormente, as amostras foram sonicadas (Sonicador Vibra Cell

VCX 130PB), imersas em gelo, a uma amplitude de 90% por 3 vezes com pulsos de

duração de 60 segundos e vórtex de 60 segundos entre cada pulso. Após, foi

realizada centrifugação por 5 min, o sobrenadante foi coletado em tubo do tipo

Falcon de 50 mL, e lavados duas vezes com 5 mL de água destilada, e novamente

centrifugados por 5 min. O sobrenadante foi filtrado em filtro de policarbonato de

25mm de diâmetro, 0.2 µm de poro (Whatman GE Healthcare, Maidstone, Reino

Unido).

A câmara de hibridização foi preparada com um lenço de papel no fundo de

um tubo tipo Falcon de 50mL e saturado com 1mL de solução de hibridização. Após,

20µL de cada sonda foi colocado em uma lâmina coberta com parafilme junto com o

filtro e mais 20µL de sonda foram colocados no papel de filtro. A lâmina foi colocada

na câmara de hibridização e incubada a 42ºC, por 16 h. Para a lavagem dos filtros

após a hibridização, foi adicionado 1mL da solução de lavagem correspondente a

concentração da sonda, e os filtros foram colocados a 48ºC durante 15 min e

corados durante 3 min com 30µL de DAPI e lavados 3 vezes com etanol 80%.

Os filtros corados com DAPI foram secados e colocados em uma nova lâmina,

com uma gota de glicerol e lamínula por cima. A presença de bactérias no filtro foi

visualizada em microscópio de epifluorescência Olympus IX-71 com o filtro UV para

51 o DAPI e filtro de acrilamida para as sondas. As sequências das sondas utilizadas

estão disponíveis na Tabela 2.

52 Tabela 2: Marcadores específicos utilizados para análise da composição da comunidade bacteriana por FISH

Nome Bactérias Grupo Sequência (5’ – 3’) Formamida (%) Referência

Bfra602 Grupo B. fragilis B. Gram negativos anaerobios GAG CCG CAA ACT TTC ACA A 30% Franks et al., 1998.

Bfrag998 Bacteroides fragilis B. Gram negativos anaerobios GTT TCC ACA TCA TTC CAC TG 30% Rigottier-Gois et al., 2003.

ECO1167 Escherichia coli Bastonetes Gram negativos

GCA TAA GCG TCG CTG CCG 40% Neef, Amann e Schleifer, 1995.

Enc1259 Enterococcus spp. Cocos Gram positivos GAA GTC GCG AGG CTA AGC 35% Behr et al., 2000.

FUS664 Fusobacterium sp Gram negativos anaerobios CTT GTA GTT CCG CYT ACC TC 40% Gmur et al., 2004.

PINT649 Prevotella intermedia Gram negativos anaerobios GCC GCC RCT GAA STC AGG CC 40% Gmur e Thurnheer, 2002.

PNG675 Prevotella nigrescens Gram negativos anaerobios TCC GCC TGC GCT GCG TGT A 40% Gmur e Thurnheer, 2002.

Pae997 Pseudomonas sp. Bastonetes Gram negativos TCT GGA AAG TTC TCA GCA 35% Amman et al., 1996.

KO218 S. aureus, S. haemolyticus Cocos Gram positivos

GAA GCA AGC TTC TCG TCC G 20% Franke, Klammer e Insam, 2005.

Str Streptococcus spp. Cocos Gram positivos CAC TCT CCC CTT CTG CAC 30% Trebesius et al., 2000.

ACA652 Gênero Acinetobacter B. Gram negativos ATC CTC TCC CAT ACT CTA 35% Wagner et al., 1994.

53 4.5 Análise estatística

Foi realizado teste t de Student, para comparação entre médias, considerando-

se valores de p < 0,05 para as análises, utilizando-se a calculadora estatítica do

Social Science Statistics, 2015.

O teste de Wilcoxon foi utilizado para determinar se houve diferenças

significativas na frequência de detecção dos marcadores de resistência,

considerando-se valores de p < 0,05 para as análises e utilizando-se o programa de

análise estatística Biostat 5,0.

Foi estudada a relação entre a densidade dos grupos bacterianos estudados e

a frequência de detecção dos marcadores de resistência os quais foram agrupados de

acordo com as referências usadas. Posteriormente foi calculada uma razão entre o

número absoluto de detecção dos marcadores de cada conjunto e a frequência

relativa de cada grupo bacteriano (Quadro 1).

A análise da correlação entre a ocorrência dos marcadores de resistência, e

características antropométricas e nutricionais dos indivíduos eutróficos, com

sobrepeso e obesos foi avaliada calculando-se razão de Odds (OR) (BLAND e

ALTMAN, 2000). Valor de OR igual a 1 indica que a condição sob estudo é

igualmente provável de ocorrer nos dois grupos. OR maior do que 1 indica que a

condição tem maior probabilidade de ocorrer no primeiro grupo, e valor de OR menor

do que 1 indica que a probabilidade é menor no primeiro grupo do que no segundo.

54 Quadro1. Agrupamento dos marcadores de resistência a drogas antimicrobianas avaliados e os grupos

bacterianos relacionados a eles.

Grupo Bacteriano Marcadores associados

Bastonetes Gram negativos Anaeróbios cfiA, cepa, cfxA, cfxA2, nim1, nim2, nim3, nim4

Bastonetes Gram negativos

blaOXA2, qnrB, qnrS, sul1, sul2, mexY, tet(Q), tet(B),

ampC, tet(L), tet(A), tet(E), tet(O), blaCTX-M, blaTEM,

tet(M), blaSHV, blaOXA143, mexY, tet(M), blaOXA23,

blaOXA51, blaOXA58, blaOXA24, blaOXA1, blaOXA10, blaSPM-1,

mexB, mexD, sul3, blaKPC, tet(K), mexF

Cocos Gram positivos

aaca-aphd, mef, ereB, mphA, vgb, blaZ, ereA, vatA,

vatB, vatC, mecA, erma, ermB, ermC, mrsB, linA, vga,

vgb, vatA, vatB, vatC, mrsA.

55 5 RESULTADOS

5.1 Características Sócio-demográficas, antropométricas e nutricionais dos

participantes

Dos 72 indivíduos participantes deste estudo, totalizando 24 indivíduos em

cada grupo amostrado (eutróficos, com sobrepeso e obesos), 62.5% pertenciam ao

sexo feminino e 37.5% ao masculino, com uma média de idade de 39,61 anos. Os

dados de gênero e idade por grupo, além do estado civil, raça, renda mensal e

escolaridade dos pacientes, estão apresentados na Tabela 3.

Em relação às características antropométricas, existe um aumento gradual

nas medidas de circunferência abdominal, cintura, quadril, relação cintura quadril e

IMC de acordo com os grupos estudados. Assim, a menor medida foi a achada no

grupo eutrófico, e a maior no grupo obeso, sendo o grupo de transição o grupo com

sobrepeso (Tabela 4).

56 Tabela 3. Características sócio-demográficas dos participantes.

Variáveis analisadas Eutróficos (n=24)

Sobrepeso (n=24)

Obeso (n= 24)

Idade média (anos; variação) 37,91; ± 12 38,12; ± 13.38 42,79; ± 11.67

Sexo: n (%)

Masculino 7 (30%) 12 (50%) 9 (37,5%)

Feminino 17 (70%) 12 (50%) 15 (62,5%)

Estado civil: n (%)

Solteiro 12 (50%) 10 (41,6%) 10 (41,6%)

Casado 11 (45.8%) 13 (54,1%) 13 (54,1%)

Outro 1 (4,1%) 1 (4,1%) 1 (4,1%)

Raça (cor da pele): n (%)

Branca 16 (66,6%) 15 (62,5%) 12 (47,4%)

Parda 5 (20,8%) 5 (20,8%) 7 (42,1%)

Negra 2 (8,3%) 3 (12,5%) 5 (10,5%)

Indefinido* 1 (4,1%) 1 (4,1%) 0

Renda mensal**: n (%)

1-3 10 (41,7%) 13 (54,1%) 20 (83,3%)

4-6 2 (8,3%) 8 (33,3%) 0

7-9 3 (12,5%) 1 (4,1%) 2 (8,3%)

10-13 9 (37,5%) 2 (8,3%) 2 (8,3%)

Escolaridade: n (%)

Fundamental completo 2 (8,3%) 6 (25%) 3 (12,5%)

Fundamental incompleto 4 (16,6%) 7 (29,1%) 3 (12,5%)

Médio completo 4 (16,6%) 7 (29,1%) 7 (29,1%)

Médio incompleto 1 (4.1%) 0 1 (4,1%)

Superior completo 11 (45,8 %) 3 (12,5%) 7 (29,16%)

Superior incompleto 2 (8,3 %) 1 (4,1%) 3 (12,5%) * O participante não soube definir; ** Renda mensal em salários mínimos de referência, Brasil em 2015 (R$788,00).

57 Tabela 4. Características antropométricas dos participantes.

Variáveis analisadas

(n; variação; sexo)

Valores de

referencia

Eutróficos

(n=24)

Sobrepeso

(n=24)

Obeso

(n= 24)

IMC * 22.82 ± 1,77 29.79 ± 14,05 36,98 ± 6,04

Circunferência

abdominal

Homens Normal

≥ 94cm

82,0 ± 4,9

98,0 ± 3.1

88,6 ± 3,8

97,4 ± 2,0

0

98,6 ± 3,2

Mulheres Normal

≥ 80cm

77,0 ± 2,4

83,7 ± 2,0

0

84,5 ± 2,1

0

0

Circunferência

cintura

Homens Normal

≥ 80cm

0

92,4 ± 6,3

0

90,54 ± 5

0

106,5 ± 9,5

Mulheres Normal

≥ 90cm

74,27 ± 3,7

0

0

84,44 ± 4,3

0

115,8 ± 18,4

Circunferência

quadril

**

**

99,2 ± 4,6

105,4 ± 4,2

114,9 ± 25,0

Relação

cintura/quadril

Homens Normal

>1

0.73 ± 0.4

0

0

0.88 ± 0.7

0

1.02 ± 0.2

Mulheres Normal

>0,85

0.71 ± 0.3

0

0

0.89 ± 0.4

0

1.1 ± 0.8

*Valores de referência e classifição de acordo com a Organização Mundial de Saúde (1998); ** Não há valores de referência. H = Homem; M = Mulher

Em relação à avaliação nutricional, foi determinado o consumo calórico e de

macronutrientes dos pacientes (carboidratos, proteínas, lipídios e fibras). Em relação

à ingestão calórica diária, observou-se uma diferença significativa entre a quantidade

de calorias médias ingeridas pelos indivíduos dos grupos eutrófico e obeso, sendo o

consumo médio de calorias pelos eutróficos 1891.58kcal/dia, enquanto que os obesos

relataram ingestão média de 2191.33kcal/dia. O grupo formado pelos indivíduos com

sobrepeso apresentou uma ingestão média de calorias de 2018.79kcal/dia

caracterizando um grupo de transição semelhante tanto ao grupo eutrófico, quanto ao

grupo obeso (Figura 1).

58

Figura 1. Média da ingestão calórica pelos indivíduos dos grupos em estudo. As letras a e b indicam diferença significativa no consumo calórico entre os grupos (p<0.05).

Em relação à ingesta de carboidratos e fibras totais, os resultados mostraram

que existe uma diferença significativa no consumo destes nutrientes entre os grupos

de indivíduos eutrófico e obeso, que apresentaram médias de consumo diário de

carboidratos de 54 e 57%, e de fibras 23 e 30%, respectivamente. Já considerando-se

o grupo de indivíduos com sobrepeso, foi observado um consumo diário destes

nutrientes semelhante aos os dois primeiros grupos, na forma de uma transição

(carboidratos 55% e fibras 25%) (Figuras 2A e 2D). Para a avaliação do consumo

diário de proteínas e lipídios não foi observada diferença significativa entre os

indivíduos avaliados (Figura 2B; 2C).

59

Figura 2. Média da ingestão de grupos de macronutrientes pelos indivíduos dos grupos em estudo. As letras a, b e c indicam diferença significativa no consumo de diferentes nutrientes entre os grupos (p<0.05). A – ingestão média de carboidratos; B – ingestão média de proteínas; C – ingestão média de lipídios; D – ingestão média de fibras.

60

Os pacientes relataram não ter usado antibióticos no último mês, porem, foi

identificado o uso de diferentes medicamentos, suplementos nutricionais e adoçantes

artificiais (edulcorantes). Em geral, os indivíduos do grupo obeso relataram uso de

antidepressivos, antiácidos, anti-inflamatórios, diuréticos, barbitúricos, e outros

medicamentos sem descrição dos princípios ativos ou nomes comerciais. Os

indivíduos do grupo com sobrepeso relataram uso de antidepressivos, anti-

inflamatórios, tamoxifeno, anticoncepcionais e suplementos nutricionais. Com uso

menor de medicamentos, os indivíduos eutróficos relataram apenas o uso de

antidepressivo e suplementos nutricionais como: whey protein, sulfato de glicosamina

e condroitina. (Figura 3).

Figura 3. Distribuição de medicamentos e suplementos alimentares em uso pelos indivíduos dos grupos em estudo, segundo declaração durante o inquérito nutricional.

61

Além dos medicamentos e dos suplementos nutricionais, foi investigado, ainda,

o uso de outros xenobióticos, como os adoçantes artificiais (edulcorantes), os quais

foram classificados de acordo com sua composição. Todos os grupos de indivíduos

relataram fazer uso dessas substâncias, embora seu uso, no geral, foi menos relatado

entre os eutróficos (Figura 4).

Figura 4. Distribuição de edulcorantes em uso pelos indivíduos dos grupos em estudo, segundo declaração durante o inquérito nutricional.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Sucralose +Acesulfame K

Steviosídio + sacarinae ciclamato

Sacarina + ciclamato Outros

Eutroficos

Sobrepeso

Obeso

62 5.2 Detecção de marcadores genéticos de resistência a antimicrobianos

O resistoma clínico referido neste estudo foi composto de 59 marcadores

genéticos de resistência, representativos de antimicrobianos de uso corrente na

medicina humana e animal no Brasil. Esses marcadores são tanto de origem

cromossômica, quanto de origem extracromossômica. Desse total, 27 tipos de

marcadores foram observados no metagenoma fecal dos indivíduos amostrados,

sendo que entre os indivíduos obesos foram detectados maior número desses

marcadores (Figuras 5 e 6).

Figura 5. Avaliação comparativa da quantidade de marcadores genéticos de resistência a drogas antimicrobianas amplificados a partir metagenoma fecal, representativo do resistoma clínico de indivíduos eutróficos, sobrepeso e obesos. As letras a e b indicam diferenças estatísticas significativas (p>0,05).

63

Figura 6. Distribuição de marcadores genéticos de resistência a drogas antimicrobianas avaliados a partir metagenoma intestinal, representativo do resistoma clínico de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos. A: resistoma clínico avaliado; B: marcadores detectados.

A

B

Obeso

Sobrepeso

Eutrófico

0 5 10 15 20 25

tet(Q)tet(A)tet(O)

blaTEMMef

tet(B)aacA – aphD

sul1qnrBsul2

cepAqnrS

ampCmphA

ereBblaCTX-M

OXA2tet(L)tet(E)mexY

cfiAtet(M)

vgbblaZ

blaSHVereA

OXA143mecA

OXA23OXA51OXA58OXA24

OXA1OXA10SPM-1MEXBMEXD

cfxAcfxA2

sul3nim1nim2nim3nim4

KPCermAermBermCtet(K)mrsBlinAvgavgb

vatAvatBvatC

mecAmexFmrsA

0 5 10 15 20 25

tet(Q)tet(A)tet(O)

blaTEMMef

tet(B)aacA – aphD

sul1qnrBsul2

cepAqnrS

ampCmphA

ereBblaCTX-M

OXA2tet(L)tet(E)mexY

cfiAtet(M)

vgbblaZ

blaSHVereA

OXA143

Marcadores genéticos detectados

Marcadores genéticos avaliados

64

Entre os marcadores detectados no resistoma clínico fecal dos individuos

eutróficos, com sobrepeso e obesos, aqueles referentes à resistência às tetraciclinas

foram os mais observados em todos os grupos, seguidos de marcadores de

resistência às drogas beta-lactâmicas, aminoglicosídeos, sulfonamidas e quinolonas.

Marcadores de resistência aos nitroimidazois, macrolídeos lincosaminas e

estreptoGraminas, além de bombas de efluxo ativo, também foram amostrados. De

maneira geral, os marcadores foram detectados em maiores frequências entre os

individuos do grupo obeso (Figura 7).

Figura 7. Ocorrência de marcadores genéticos, por grupo farmacológico de drogas antimicrobianas, entre os diferentes grupos, amplificados a partir metagenoma intestinal representativo do resistoma clínico de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos. As letras a e b indicam diferenças estatísticas significativas (p>0,05).

Foram observados 17 tipos de marcadores que são comuns entre todos os

grupos de indivíduos avaliados, pertencentes principalmente ao grupo das

tetraciclinas, beta-lactâmicos, quinolonas, sulfonamidas, macrolídeos e

aminogliosídeos. No grupo eutrófico, foram detectados 19 tipos de marcadores,

Grupos de indivíduos

Mar

cado

res g

enét

icos

det

ecta

dos

49 43 36

76

6764

13

89

11

56

12

810

14

137

1

1

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Obeso Sobrepeso Eutrófico

Bombas de efluxo

Sulfonamidas

Quinolonas

Nitroimidazois

MLS

Aminoglicosídeos

Tetraciclinas

Beta-lactâmicos

a abb

a

abb

65 enquanto que no grupo de indivíduos com sobrepeso, 21 tipos foram detectados, com

a presença exclusiva do gene blaOXA-143, relacionado com resistência a beta-

lactâmicos em bastonetes Gram negativos não fermentadores. No grupo de

indivíduos obesos, 26 tipos de genes foram detectados, com a presença exclusiva

dos marcadores blaZ, ereA, tet(M) e vgb, relacionados com resistência a beta-

lactâmicos, macrolídeos, lincosamidas e estreptroGraminas, além de tetraciclina

(Figura 8).

Figura 8. Diagrama de Venn com a distribuição dos marcadores genéticos de resistência a drogas antimicrobianas amplificados a partir metagenoma fecal, representativo do resistoma clínico de indivíduos eutróficos, sobrepeso e obesos (27 dos 59 marcadores amostrados).

Sobrepeso (21)

Obeso (26)

Eutrófico(19)

1

03

4

2 0

17

OXA-143

OXA-2SHVmexY

blaZ; ereA;tet(M); vgb

cfiAtet(L)

mef; aacA – aphD;ampC; CTX-M; TEM;cepA; ereB; mphA;qnrB; qnrS; sul1;

Sul2; tet(A); tet(B);tet(E); tet(O); tet(Q)

66 5.3 Avaliação quantitativa de espécies bacterianas por FISH

Foi realizada a análise por hibridização fluorescente in situ da densidade

relativa das espécies bacterianas relacionadas com os marcadores de resistência,

em relação à densidade bacteriana total. Para análise dos dados, posteriormente

os diferentes grupos taxonômicos foram agrupados em: (i) bastonetes Gram

negativos anaeróbios (Fusobacterium sp., Prevotella sp., Bacteroides sp.), (ii)

bastonetes Gram negativos (Acinetobacter sp., E. coli, Pseudomonas sp.), (iii)

cocos Gram positvos (Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Streptococcus sp.).

Como um todo, foi observado maior densidade bacteriana no grupo obeso,

seguido pelos grupos com sobrepeso e eutrófico; porém sem diferenças

significativas nos 3 grupos. Bastonetes Gram negativos anaeróbios foram

detectados em maior quantidade, seguido pelos bastonetes Gram negativos e

cocos Gram positivos. Os três grupos bacterianos estiveram aumentados no

metagenoma fecal dos indivíduos obesos (Figura 9).

Figura 9. Densidade bacteriana relativa detectada a partir do metagenoma fecal, de indivíduos eutróficos, sobrepeso e obesos. Não houve diferença significativa entre as densidades bacterianas avaliadas (p>0,05)

67

Os grupos bacterianos encontraram-se diferentemente distribuídos. Existe uma

maior densidade de bactérias do grupo Fusobacterium sp., principalmente no grupo

obeso, e diferenças significativas nas quantidades de Enterococcus sp. e E. coli entre

os grupos eutrófico e obeso. No caso das outras espécies bacterianas estudadas,

existem discretas diferenças na distribuição nos diferentes grupos, porém não são

significativas (Figura 10).

Figura 10. Densidade bacteriana relativa dos diferentes grupos taxonómicos detectados a partir do metagenoma fecal, de indivíduos eutróficos, sobrepeso e obesos. As letras a e b indicam diferenças estatísticas significativas (p>0,05).

68 5.4 Relação entre os parâmetros clínico-epidemiológicos e nutricionais,


observados nos metagenomas obtidos.

Para análise da relação entre os parâmetros clínico-epidemiológicos e

nutricionais e os marcadores de resistência a drogas observados nos metagenomas

obtidos; foram calculadas as razões de Odds entre os valores de IMC, ingesta

calórica, uso de xenobióticos e uso de edulcorantes, foi estabelecido arbitrariamente a

observação de pelo menos cinco marcadores genéticos de resistência a drogas

antimicrobianas como parâmetro de corte, valor que corresponde numericamente em

torno de 10% do total de marcadores avaliados.

Em todos os casos, foi observada correlação positiva entre uma detecção de

marcadores de resistência a drogas no metagenoma fecal dos indivíduos obesos e os

parâmetros avaliados

Tabela 5. Correlação entre os parâmetros nutricionais dos pacientes e numero marcadores de resistência detectados.

Parâmetros avaliados Odds ratio (Variação)

IMC >25 2,14 (0,75 – 6,07)

Calorias (2000 Kcal) 1,44 (0,51 - 4,07)

Uso de Xenobióticos 1,93 (0,55 – 6,67)

Uso de edulcorante 1,6 (0,40 – 6,64)

69

Na avaliação da relação entre a densidade de grupos bacterianos estudados e

a frequência de detecção de marcadores de resistência, a razão obtida sugere que os

bastonetes Gram negativos anaeróbios exibem um maior número de marcadores de

resistência no grupo dos indivíduos eutróficos, o que foi observado da mesma forma

observado nos cocos Gram positivos.

Considerando-se os bastonetes Gram negativos, existe um maior numero de

marcadores de resistência a antibióticos nos grupos de indivíduos com sobrepeso e

obesos em relação com a densidade bacteriana (Tabela 6).

Tabela 6. Razão entre o número de detecções de marcadores de resistência a drogas antimicrobianas

no metagenoma fecal de indivíduos eutróficos, com sobrepeso e obesos, e a frequência relativa da

densidade dos diferentes grupos bacterianos associados a esses marcadores.

Grupos Bastonetes Gram

negativos anaeróbios

Bastonetes Gram

negativos

Cocos Gram

positivos

Eutrófico 0,60 8,63 4,20

Sobrepeso 0,19 9,56 2,70

Obeso 0,35 9,36 3,51

70 7. DISCUSSÃO

A obesidade, atualmente, configura-se como um sério problema de saúde

pública (WHO, 2010), sendo reconhecida como um fator negativo associado a um

grande número de doenças, como diabetes do tipo 2, doenças vasculares, cardíacas

e câncer. Suas complicações e implicações metabólicas são consideradas os

principais desafios a serem combatidos no século XXI, uma vez que o número de

obesos é crescente em todo o mundo, atingindo inclusive os países mais pobres ou

em desenvolvimento (FLEGAL et al., 2007; DIXIT, 2008; PRENTICE, 2006).

Apesar de a obesidade ser historicamente associada a uma má alimentação

com ingestão de excesso calórico e sedentarismo, estudos atuais sugerem a doença

com alterações metabólicas, de causa multifatorial, com participação de hormônios,

neuropeptídeos e citocinas e, ainda, participação da microbiota residente intestinal

(MOREIRAS et al., 2013; PRENTICE, 2006; MOLLER et al., 2005).

Epidemiologicamente, é aceito que a obesidade seja uma forma de agravo à saúde,

relacionada, sobretudo, a pessoas do sexo feminino, com grande influência de fatores

econômicos com implicações diretas na educação e comportamento. Por outro lado, a

condição de sobrepeso é relatada ser mais comum em indivíduos do sexo masculino

(MINISTERIO de SAUDE DO BRASIL, 2014; IBGE, 2009).

Neste estudo, foram avaliados 72 indivíduos, em uma amostragem por

conveniência, recrutados na comunidade ou em serviço de nutrição de um hospital

universitário, em uma cidade de porte médio na região sudeste do Brasil. De acordo

com as recomendações da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1995), esses

indivíduos foram classificados em eutróficos, com sobrepeso e obesos, avaliando-se

suas características antropométricas, especialmente seu Índice de Massa Corporal

(IMC). Assim, o grupo de indivíduos obesos foi formado por pessoas com uma idade

71 média de 47 anos, principalmente do sexo feminino que recebem entre 1 e 3 salários

mínimos de referência no Brasil, em 2015. O grupo de indivíduos com sobrepeso

apresentou uma distribuição muito mais equilibrada entre os sexos, mas ainda com

predomínio de participantes de baixa renda, o que afeta a qualidade dos alimentos

ingeridos por esses indivíduos (SNYDER, 2004).

O consumo de macronutrientes está de acordo com o esperado para a região

sudeste do Brasil (ARAUJO et al., 2013). Porém, os pacientes obesos tiveram um

consumo significativamente aumentado de calorias, carboidratos, lipídios e fibras, em

comparação com os outros grupos. Uma alimentação rica em açucares é

característica da sociedade ocidental e já foi descrito amplamente que dietas

aumentadas em carboidratos, principalmente carboidratos simples; permitem um

balanço energético positivo, inflamação de baixo grau e modificações na

permeabilidade intestinal levando ao estado de obesidade (JONASSON et al, 2014).

Em relação ao consumo de no consumo de proteínas e lipídios, não houve diferença

significativa no consumo entre os grupos.

Além disso, foi observado um maior uso de xenobióticos pelos pacientes

obesos, entre eles anti-hipertensivos, anti-inflamatórios, anti-depressivos, anti-ácidos

e edulcorantes. Por outro lado, o grupo de indivíduos eutróficos foi caracterizado pelo

consumo de diferentes suplementos nutricionais como: whey protein, sulfato de

glicosamina e condroitina. Os dados relacionados com as alterações da microbiota

intestinal e o consumo de adoçantes artificias não calóricos foram descritos por Suez

et al. (2014). Porém, a presença de marcadores de resistência aos antibióticos no

intestino e o consumo desses xenobióticos não tem sido descrito anteriormente.

Apesar da literatura não discutir os efeitos destes xenobióticos sobre a

microbiota intestinal, e nem tão pouco foram dosados resíduos destas substâncias no

trato gastrintestinal, nossos dados permitem sugerir que a carga de xenobióticos

72 ingerida possa atuar como agentes de pressão seletiva locais, reforçando a maior

observação de genes de resistência a drogas antimicrobianas no metagenoma do

grupo de indivíduos obesos. Deve-se considerar, no entanto, que embora o não uso

prévio de antimicrobianos não possa garantir um ecossistema microbiano isento de

desestruturação, esse viés foi igualmente considerando em todos os participantes.

Avanços recentes nas metodologias de estudo de ecossistemas microbianos

tem permitido a caracterização da mudança na arquitetura da microbiota em seres

humanos e de organismos-modelo, em resposta à antibioticoterapia (SOMER e

DANTAS, 2011). Essas alterações incluem diminuição na diversidade filogenética do

ecossistema microbiano previamente estável (DETHLEFSEN et al., 2008). De acordo

com a literatura, embora a microbiota começa a se recuperar em direção aos estados

de equilíbrio iniciais, em espaços de tempo de uma semana após a exposição aos

antibióticos, esse estado de equilíbrio não é atingido antes de pelo menos meses ou

anos após a exposição (DETHLEFSEN e RELMAN, 2011). É importante destacar que

as alterações são mais ou menos persistentes, dependendo do espectro de ação dos

antimicrobianos, como observado em modelos murinos com administração de

diferentes regimes de uma ou várias drogas (ANTONOPOULOS et al., 2009).

Uma grande consequência da exposição repetida de antimicrobianos à

microbiota é a observação de um aumento na abundância de marcadores de

resistência, não apenas relacionado à continuidade da pressão seletiva, mas também

pelo favorecimento de transferência gênica entre os microrganismos pelos

mecanismos de recombinação genética bacteriana. Acredita-se, no entanto, que o

desenvolvimento dessa microbiota alterada seja dependente da existência de níveis

basais de resistência antibiótica entre os microrganismos daquele ecossistema.

Mesmo na ausência de exposição a antimicrobianos por vias antropogênicas, outros

73 xenobióticos poderiam atuar na resistência cruzada ou na co-seleção (READY et al.,

2004; ALLEN et al., 2010).

Ainda, especula-se sobre a presença de subpopulacões de microrganismos

resistentes na microbiota humana e de outros animais, independente de exposição

prévia de drogas ou outros xenobióticos, tal como observado em ecossistemas

ambientais mais primitivos ou isolados (VERSLUIS, 2015).

De acordo com a literatura, nos últimos 40 anos a prevalência de marcadores

como tet(Q), tet(M), ermF e ermG tem sido aumentada no ecossistema intestinal em

indivíduos que não receberam tratamento antimicrobiano, sugerindo a persistência

destes determinantes na ausência de seleção causada pela presença de antibióticos

(SHOEMAKER et al., 2001).

Neste sentido, estudos mais recentes tem revelado a presença de

microorganismos resistentes às tetraciclinas e outros antimicrobianos na microbiota

oral de crianças que ainda não fizeram o uso de agentes antimicrobianos

(LANCASTER et al., 2003). De acordo com a literatura, foi relatado que

enterobactérias isoladas do trato gastrintestinal de voluntários humanos sem uso

prévio de antimicrobianos por pelo menos um ano mostraram a presença de

marcadores resistência à pelo menos 13 drogas antimicrobianas (SOMMER et al.,

2009). Ainda, mais recentemente, estudos realizados em índios da Amazonia

venezuelana que nunca receberam tratamento antibiótico, mostraram a presença de

marcadores de resistencia no intestino dos participantes sem estímulo aparente

(CLEMENTE, 2015).

No nosso estudo, foram avaliados 59 marcadores genéticos pertencentes ao

resistoma clínico representativo de drogas antimicrobianas de uso rotineiro no

tratamento e profilaxia de doenças infecciosas em serem humanos e outros animais.

Foram detectados 27 genes de diferentes famílias de antibióticos, dos quais 17 são

74 compartilhados ou aparecem pelo menos uma vez nos diferentes grupos, o que indica

a presença de um core ou núcleo comum de genes de resistência que está presente

em todos os pacientes, independentemente do grupo. Esse núcleo está formado

principalmente por marcadores de resistência a tetraciclina e beta-lactâmicos, seguido

pelas quinolonas, aminoglicosídeos e sulfonamidas, e esses achados estão de acordo

com diferentes pesquisas, que tem mostrado a existência de um núcleo comum de

marcadores de resistência (FORSLUND et al., 2013; VERSLUIS et al., 2015;

CLEMENTE et al., 2015;).

Porém, a frequência de detecção e a variedade nos marcadores foi

significativamente maior no grupo obeso, com a presença exclusiva de tet(M), ereA,

blaZ e vgb, que conferem resistência a tetraciclina, beta-lactâmicos e macrolídeos,

respectivamente. No grupo com sobrepeso, houve uma frequência de detecção e

variedade de genes maior, mas sem diferença significativa em comparação com o

grupo eutrófico, porém significativamente menor que no grupo obeso e além disso,

mostrou a presença exclusiva do marcador blaOXA-143, que confere resistência a beta-

lactâmicos em não fermentadores. No grupo eutrófico, a frequência de detecção foi

significativamente menor e não houve enriquecimento na variedade de marcadores

detectados nem presença exclusiva de genes para esse grupo.

De maneira semelhante, outros estudos tem mostrado a existência de um

núcleo de genes dentro do resistoma fecal, que é compartilhado pelos indivíduos

independentemente se tiveram exposição aos antibióticos ou não, sugerindo que

esses genes poderiam pertencer a bactérias comensais do intestino. Esse núcleo é

formado principalmente por genes que conferem resistência a tetraciclinas,

macrolídeos, amiglicosídeos, beta-lactâmicos e cloranfenicol (BARTOLINI et al., 2003;

MOORE et al., 2013; BENGSTON-PALMER et al., 2015; CLEMENTE et al., 2015;

RAYMOND et al., 2015; VERSLUIS et al., 2015). Além disso, análise metagenômica

75 realizada por Forslund et al. (2013) mostraram que os genes de resistência mais

abundantes no intestino estão relacionados aos antibióticos utilizados por tempo

prolongado na prática clínica, principalmente aqueles usados como promotores de

crescimento em animais, como é o caso da tetraciclina. As tetraciclinas são

antibióticos de amplo espectro que foram descobertos em 1945 e tiveram um uso

indiscriminado tanto na área clínica quanto na avicultura, sendo usados como

promotores de crescimento em animais. Com o aumento da prevalência de

resistência aos antibióticos, medidas para regular seu uso foram adotadas

(ROBERTS, 1996). Assim, no Brasil, o uso de cloranfenicol, penicilinas, tetraciclinas e

sulfonamidas foi proibido a partir de 1998; já no período de 2002 – 2004 foi proibido o

uso de arsénico, antimônio, nitrofurano e olanquindox (SANTANA et al., 2011).

Porém, o impacto ambiental do uso desses xenobióticos no ambiente tem tido

implicações ambientais importantes e já foi mostrada a ampla presença de

marcadores genéticos de resistência à tetraciclina no ambiente (VERSLUIS, 2015).

De maneira geral, as análises mostraram uma correlação positiva entre o IMC,

a ingesta calórica, uso de xenobióticos, uso de edulcorantes e a detecção de pelo

menos 5 marcadores genéticos no metagenoma amostrado. Estes resultados

sugerem uma inter-relação entre o excesso de peso e o incremento no número de

marcadores genéticos de resistência a antibióticos de importância clínica (resistoma

clínico), a qual poderia estar relacionada com diversos fatores de pressão seletiva

exclusivos do grupo obeso.

Embora alguns limites do intervalo interior sejam menores do que um (1), o que

poderia sugerir uma ausência de correlação, os limites do intervalo superior reforçam

a tendência de uma correlação fortemente positiva entre as características

antropométricas e nutricionais e a ocorrência dos genes de resistência entre os

grupos.

76 Apesar da carência de estudos disponíveis na literatura para comparação desses

resultados, os dados apresentados discordam daqueles descritos por Forslund et al

(2013); que não encontraram relação entre o IMC e a presença de marcadores de

resistência no intestino humano, em um estudo que avaliou o resistoma fecal de 252

indivíduos em 3 países. Porém, seus resultados em quanto aos marcadores geneticos

achados são similares aos nossos.

Em relação aos parâmetros nutricionais de ingestão de carboidratos, proteínas

e lipídios, a ampla variação nos níveis de consumo aceitáveis, de acordo com os

guias nutricionais disponíveis, impossibilitaram a definição de um ponto de corte para

as análises de correlação (IOM, 2005).

A avaliação da densidade de grupos bacterianos relacionados aos marcadores

genéticos avaliados mostrou diferentes níveis populacionais, ao considerar-se os

grupos de indivíduos amostrados. Considerando-se o agrupamento dos bastonetes

Gram negativos anaeróbios, representados pelos gêneros Bacteroides, Prevotella e

Fusobacterium, foi observado um aumento significativo de Fusobacterium no

metagenoma fecal dos indivíduos do grupo obeso; considerando-se o agrupamento

dos bastonetes Gram negativos, representados por E. coli, Pseudomonas sp. e

Acinetobacter sp., um aumento significativo na espécie E. coli foi também observado

no grupo de indivíduos obesos; e considerando-se o agrupamento dos cocos Gram

positivos, representado pelos gêneros Staphylococcus, Enterococcus e

Streptococcus, houve um aumento na densidade dos Staphylococcus e Enterococcus,

porém sem diferença significativas no grupo de indivíduos obesos em comparação

com grupos de indivíduos eutróficos e com sobrepeso.

Diferentes estudos tem demonstrado diferenças nas densidades bacterianas no

intestino de pacientes obesos, porém, coincidem no incremento de Enterococcus,

77 Prevotella, Staphylococcus, E. coli, Acinetobacter e Fusobacterium (ANGELAKIS et

al., 2012 ; CHIU et al., 2014). Bactérias do género Bacteroides têm sido extensamente

relacionadas com a presença de resistência a antibióticos, principalmente tetraciclinas

e macrolídeos (SHOEMAKER et al., 2001). Além disso, o aumento das bactérias do

grupo das Proteobacterias em desequilíbrios energéticos no intestino já foi descrito

por Shin, Won e Bae (2015), o que poderia explicar a presença aumentada de E. coli

no intestino e os níveis de observação de marcadores de resistência associados a

bastonetes Gram negativos, no nosso estudo.

Em relação à avaliação da relação entre os grupos bacterianos e a observação

dos marcadores genéticos de resistência a antimicrobianos, embora não existam

estudos disponíveis para comparação dos nossos resultados, a razão obtida permite

sugerir que existe uma maior probabilidade de associação dos marcadores genéticos

com os bastonetes Gram negativos principalmente nos grupos com sobrepeso e

obeso. Como relatado anteriormente, apesar da detecção desses marcadores possa

estar relacionada a níveis basais na população, ou consequência de pressão seletiva

antimicrobiana anterior ao critério estabelecido no estudo, todos os indivíduos

participantes estavam sujeitos ao mesmo viés. Assim, essa observação,

considerando-se os bastonetes Gram negativos poderia estar relacionada com os

diferentes xenobióticos ingeridos pelos indivíduos dos grupos com sobrepeso o

obeso.

A mesma observação não poderia ser extrapolada, no entanto, para o os

bastonetes Gram negativos anaeróbios e cocos Gram positivos, sugerindo um

aumento na pressão seletiva principalmente para o grupo dos bastonetes Gram

negativos.

De maneira geral, a distribuição dos genes de resistência parece ser

aumentada no metagenoma dos indivíduos eutróficos, considerando a densidade dos

78 bastonetes Gram negativos anaeróbios. Entretanto, é importante destacar que na

microbiota fecal dos indivíduos com sobrepeso e obeso, a densidade relativa desses

microrganismos estava aumentada. Esse fenômeno pode contribuir para uma

diminuição no valor da razão entre o número de eventos de detecção de marcadores,

e a frequência relativa bacteriana. O mesmo fenômeno foi observado para cocos

Gram positivos e a distribuição de marcadores detectados entre os indivíduos.

Por outro lado, mesmo que a razão entre o número de eventos de detecção de

marcadores e a frequência relativa dos bastonetes Gram negativos tenha sido maior

nos grupos de indivíduos com sobrepeso e obesos, há de se considerar que a

densidade desses microrganismos, nestes indivíduos, se mostrou aumentada. Esse

fenômeno reforça a ideia da maior pressão seletiva para persistência de marcadores

de resistência a drogas associados a enterobactérias e Gram negativos não

fermentadores nos indivíduos com excesso de peso, associado à sua fisiologia e

comportamento.

79 8 CONCLUSÕES

• Alteração na estrutura da microbiota residente intestinal está relacionada ao

excesso de peso e os fatores associados, na população amostrada;

• Existe no resistoma clínico fecal humano, de maneira geral, um núcleo de

genes de resistência que são compartilhados homogeneamente entre os

indivíduos, os quais correspondem aos antibióticos de maior uso rotineiro na

medicina humana e animal;

• Indivíduos com altos valores de IMC tem maior probabilidade da ocorrência

de marcadores genéticos de resistência a drogas antimicrobianas no

metagenoma fecal;

• Indivíduos com alta ingesta calórica diária e que fazem uso rotineiro de

xenobióticos, dentre eles adoçantes, tem maior probabilidade da ocorrência

de marcadores genéticos de resistência a drogas antimicrobianas no

metagenoma fecal;

• Entre indivíduos com sobrepeso e obesos, existe uma tendência de maior

ocorrência entre genes de resistência a drogas antimicrobianas nos

bastonetes Gram negativos intestinais em comparação com os bastonetes

gram negativos anaeróbios e os cocos Gram positivos.

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100 8 Anexos

8.1 Anexo 1: Parecer Cosubstanciado do CEP

101

102 8.2 Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

103

104 8.3 Anexo 3: Ficha de anamnese e dados cadastrais

FICHA DE ANAMNESE E DADOS CADASTRAIS

Entrevistador:____________________ DATA: _____/_____/_________

DADOS PESSOAIS E SOCIÓ-DEMOGRÁFICOS

PRONTUÁRIO N°:

1. Nome:

2. Idade: 3. Sexo ( ) 4. Estado civil:

6. Endereço:

_____________________________________________________________________________

_____________________________________Bairro:____________________

CEP:____________________

7. Telefone:

Residencial:__________________Trabalho:__________________Celular:_________________

8. Ocupação profissional atual:

______________________________________________________________

9. Renda mensal da família (salários mínimo): __________10. N°de pessoas que vivem desta

renda:_____

11. Escolaridade:

( ) Ensino Fundamental completo ( ) Ensino Fundamental Incompleto ( ) Ensino

Médio Completo

( ) Ensino Médio Incompleto ( ) Superior Completo ( ) Superior Incompleto

12. Cor: ( ) branca ( ) preta ( ) parda ( ) amarela ( ) outra

13 vida sexual ativa: ( ) não ( ) sim- parceiros ( ) 01 ( ) mais de um

16. Atualmente você tem:

a. Diabetes ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

b. Doenças do coração ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

c. Pressão alta ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

105 d. Insuficiência Renal ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

e. Doença no fígado ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

f. Depressão ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

g. Doença na tireóide ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

h. imunossupressão ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

i. soropositivo(a) para HIV ( 0 ) Não ( 1 ) Sim ( 7 ) Não sabe

j.Outras doenças: ______________________________________________

17. Você faz uso de medicamento ou de suplemento?

( 0 ) Não

(1) Sim –Qual (is)? (1) Anti-hipertensivo.

( 2 ) Hipoglicemiante oral.

( 3 ) Insulina.

( 4 ) Anti-depressivo.

( 5 ) Dislipidêmicos.

( 6 ) Antibióticos :

( ) antifúngico ( ) antibacteriano ( ) Antiprotozoário

Quanto tempo faz que tomou antibiótico por último?

( ) menos de 30 dias ( ) 30 dias ou mais

( 7 ) Outro (s). Qual (is)?

_______________________________________________

DADOS SOBRE ESTILO DE VIDA

1. Você pratica alguma atividade física?

(0) Não (1) Sim. Se SIM, qual

atividade?________________________________________

Com que freqüência? _________vezes/semana. Quanto tempo gasta praticando atividade

física?______horas

2. Em média, quanto tempo por dia você gasta assistindo TV ou fica no

computador?_____________horas.

3.Você fuma?

106 (0) Não (1) Sim. Se sim, há quanto tempo? _______________ Quantos cigarros fuma por dia?

____________

4. Você costuma consumir bebida alcoólica?

( 0 ) nunca

( 1 ) diariamente

( 2 ) 1 ou menos de uma vez por mês

( 3 ) pelo menos 1 vez por semana

(4 ) 2 a 4 vezes por mês

( 5 ) 2 a 3 vezes por semana

5. Qual o tipo de bebida você bebe?

( 0 ) Nenhuma ( 1 ) cerveja (2 ) vinhos ( 3 ) destilados (cachaça, whisky, vodca, licor) (

4 ) bebidas ice

6. Quantas doses contendo álcool você consome num dia típico quando você está bebendo?

( 0 ) Nenhuma ( 1 ) 1 a 2 doses ( 2 ) 3 a 5 doses ( 3 ) 6 a 8 doses ( 4 ) 10 ou mais

107 8.4 Anexo 4. Questionário quantitativo de frequência alimentar

108

109

110

Documents

universidade federal juiz de fora instituto de ciências biológicas