Uso de Ferramentas Moleculares Em Estudos Da Diversidade de Microrganismos Do Solo

ISSN 1517 - 5111Dezembro, 2002 51

Uso de Ferramentas Moleculares em Estudos da Diversidade de Microrganismos do Solo

Documentos 51

Fbio Bueno dos Reis JuniorIda de Carvalho MendesKtia Regina dos Santos TeixeiraVeronica Massena Reis

Uso de Ferramentas Molecularesem Estudos da Diversidade deMicrorganismos do Solo

Planaltina, DF2002

ISSN 1517-5111

Dezembro, 2002Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuriaEmbrapa CerradosMinistrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

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Superviso editorial: Nilda Maria da Cunha SetteReviso de texto: Maria Helena Gonalves Teixeira /

Jaime Arbus CarneiroNormalizao bibliogrfica: Rosngela Lacerda de CastroCapa: Chaile Cherne Soares EvangelistaEditorao eletrnica: Leila Sandra Gomes AlencarImpresso e acabamento: Divino Batista de Souza

Jaime Arbus Carneiro

1a edio1a impresso (2002): tiragem 100 exemplares

Todos os direitos reservados.A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou emparte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610).

U86

Embrapa 2002

Uso de ferramentas moleculares em estudos da diversidade demicrorganismos do solo / Fbio Bueno dos Reis Junior... [et al.]. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2002.

33p. (Documentos / Embrapa Cerrados, ISSN 1517-5111; 51)

1. Solo - microbiologia. 2. Biologia molecular.I. Reis Junior, Fbio Bueno dos. II. Srie.

631.46 - CDD 21

CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.Embrapa Cerrados.

Autores

Fbio Bueno dos Reis JuniorEng. Agrn., Ph.D., Embrapa Cerrados,[email protected]

Ida de Carvalho MendesEng. Agrn., Ph.D., Embrapa Cerrados,[email protected]

Ktia Regina dos Santos TeixeiraBil., Ph.D., Embrapa Agrobiologia,[email protected]

Veronica Massena ReisEng. Agrn., Ph.D., Embrapa Agrobiologia,[email protected]

Apresentao

O interesse pelo estudo dos microrganismos presentes no solo cada vez maior,uma vez que esses representam papel crucial na regulao e funcionamento dosecossistemas. Alm disso, esses microrganismos tambm podem apresentarvalores biotecnolgico e econmico, representando uma grande fonte deprodutos farmacuticos, corantes, enzimas, cidos orgnicos e muitos outrosrecursos ainda inexplorados. No entanto, apesar de sua importncia, o solo temsido considerado um dos habitats menos estudados do planeta. As limitaesdos mtodos microbiolgicos tradicionais, aliadas ao avano tecnolgico na reade biologia molecular, fazem com que as tcnicas moleculares sejam, nomomento, muito utilizadas para o estudo da diversidade microbiana do solo. Estedocumento vem colocar disposio de estudantes e profissionais da rea demicrobiologia um resumo atualizado dessas tcnicas, destacadas por sua amplautilizao por vrios pesquisadores.

Carlos Magno Campos da RochaChefe-Geral da Embrapa Cerrados

Sumrio

Introduo ................................................................................ 9

Importncia do uso de ferramentas moleculares em estudos de

diversidade ........................................................................... 10

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) ...................................... 11

O Uso do RNA Ribossmico como Marcador Filogentico ................... 12

PCR-clonagem-seqenciamento ................................................ 13

ARDRA - Anlise de restrio do DNA ribossomal amplificado ........ 13

Outros Genes e Mtodos Utilizados em Anlises Filogenticas ............ 14

Gene nifH ............................................................................ 14

Gene gyrB ............................................................................ 15

RFLP - Polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrio ......... 16

T-RFLP - Polimorfismo do tamanho e composio de bases de

fragmentos terminais de restrio ............................................. 17

AFLP - Polimorfismo de tamanho do fragmento amplificado ........... 18

RAPD - DNA polimrfico amplificado ao acaso ............................ 18

REP, ERIC e BOX ................................................................... 19

A Utilizao de Sondas para Estudo da Diversidade Microbiana ........... 19

Microarray ou Microchips de DNA................................................. 20

DGGE - Eletroforese em gel de gradiente desnaturante ................. 21

TGGE - Eletroforese em gel de gradiente de temperatura .............. 21

SSCP - Polimorfismo conformacional da fita simples ......................... 23

Limitaes Metodolgicas ............................................................ 24

Referncias Bibliogrficas ............................................................ 25

Abstract .................................................................................. 34

Uso de FerramentasMoleculares em Estudos daDiversidade deMicrorganismos do SoloFbio Bueno dos Reis JuniorIda de Carvalho Mendes

Introduo

cada vez maior o interesse pelo estudo dos microrganismos presentes no solouma vez que esses representam papel-chave na ciclagem de nutrientes e namanuteno de sua fertilidade. Existem, ainda, microrganismos que soimportantes no controle biolgico de doenas e pragas da agricultura (o principalexemplo o Bacillus thurigiensis comumente referido como Bt que tem sidoutilizado, h vrios anos, para o controle de insetos) na degradao dexenobiontes (Xeno = estranho; bitico = vida. Compostos sintticos comodetergentes, plsticos, pigmentos, agrotxicos e outros), na disponibilizao desubstncias promotoras de crescimento para as plantas (rizobactrias promotorasde crescimento das plantas - PGPRs), no aumento da eficincia da planta naabsoro de fsforo, gua e outros nutrientes (fungos micorrzicos) ou nafixao do nitrognio atmosfrico, fornecendo-o para as plantas (bactriasdiazotrficas). Alm disso, esses microrganismos tambm podem apresentarvalor biotecnolgico, sendo um manancial de frmacos, corantes, enzimas,cidos orgnicos e muitos produtos ainda inexplorados. Apesar de suaimportncia, o solo ainda tem sido considerado um dos habitats menosestudados do planeta e apenas recentemente comeou-se a entender que suabiodiversidade fator crucial na regulao e no funcionamento dos ecossistemas(Copley, 2000).

A qualidade do solo pode ser definida como sua capacidade de sustentar aprodutividade biolgica e manter a qualidade ambiental. Estudos sobre a

dilmeneCopley, 2000).

10 Uso de Ferramentas Moleculares...

qualidade do solo so importantes como ferramenta de auxlio para osagricultores e como medida de sustentabilidade de diferentes ambientes. Noentanto, nossa habilidade em qualificar o solo e identificar as propriedades queservem como indicadores fica complicada pela multiplicidade de fatoresqumicos, fsicos e biolgicos que controlam os processos biogeoqumicos esuas variaes no espao e no tempo. Os microrganismos do solo sopotencialmente os marcadores biolgicos mais sensveis e disponveis e podem,portanto, ser muito teis na classificao de ecossistemas perturbados. Elesconstituem a parte viva e mais ativa da matria orgnica, podendo atuar comoindicadores capazes de refletir mudanas sutis nas propriedades do solo bemantes que alteraes nos teores de matria orgnica possam ser observadas.Todavia, sabendo-se que os microrganismos so parte integrante da qualidadedo solo, um melhor entendimento da dinmica e das estrutura das comunidadesmicrobianas necessrio.

Vrias metodologias so propostas para estudos que envolvem a ecologiamicrobiana do solo. A diversidade biolgica geralmente utilizada como ndiceque reflete a qualidade do ecossistema, de modo que as metodologias quepossibilitam o estudo da diversidade microbiana tambm possam indicardiferenas entre solos tanto com respeito as suas populaes quanto a suasfunes (Turco et al., 1994). Por isso, ao acessar a biodiversidade importantesconsideraes devem ser feitas, no apenas no que se refere ao nmero edistribuio das espcies, mas tambm quanto a sua diversidade funcional (Yinet al., 2000).

Importncia do uso de ferramentas moleculares emestudos de diversidadeTradicionalmente, a deteco e a identificao de bactrias eram feitas de acordocom os principais meios de obteno de carbono e energia, suas exignciasnutricionais e meio de cultivo para seu crescimento, alm da observao diretavia microscpio (Kennedy, 1999; Herbert, 1990). No entanto, a utilizaodessas metodologias fornecia informaes limitadas com necessidade de maiorrefinamento (Zak et al., 1994). Como alternativas para esses mtodos, foramdesenvolvidas vrias tcnicas, dentre as quais destacam-se aquelas baseadas noscidos nuclicos.

As limitaes s tcnicas tradicionais de deteco e de identificao demicrorganismos so ainda maiores quando se quer estudar a diversidade demicrorganismos associada a determinado ambiente. Sabe-se que a diversidade das

dilmeneTurco et al., 1994).

dilmeneYin

dilmeneet al., 2000).

dilmeneKennedy, 1999;

dilmeneHerbert, 1990).

dilmeneZak et al., 1994).

11Uso de Ferramentas Moleculares...

bactrias maior que a de qualquer outro grupo de organismos, no entanto, osmeios de cultivo so, em maior ou menor extenso, seletivos a gruposparticulares. At mesmo quando se quer utilizar um meio seletivo paradeterminado organismo-alvo, algumas estirpes no culturveis, provavelmente,sero excludas das anlises (Coutinho et al., 1999). Amann et al. (1995)sugerem que apenas 1-10% das espcies bacterianas do planeta tenham sidoidentificadas, deixando vasta poro dessa biota desconhecida e no estudada.

Torsvik et al. (1990) utilizaram tcnicas moleculares para estudar populaesbacterianas de solo sob uma floresta descdua. No estudo, os autoresencontraram 4000 diferentes genomas, sendo uma estimativa 200 vezes maiordo que a obtida de anlises convencionais.

Pode-se dizer que, indiscutivelmente, o maior celeiro de genes no planeta residena frao microbiana da biodiversidade. As limitaes dos mtodos tradicionais,aliadas ao avano tecnolgico na rea de biologia molecular, fazem com que astcnicas moleculares sejam, no momento, muito utilizadas para o estudo dadiversidade microbiana (Elsas et al., 1998). Estudar-se- um conjunto dessastcnicas, destacadas por sua ampla utilizao por vrios pesquisadores.

A Reao em Cadeia da Polimerase(PCR)

Os mtodos moleculares receberam grande impulso com o desenvolvimento datcnica conhecida como PCR. Essa tcnica descrita por Saiki et al. (1985),permite amplificar pequenos e especficos segmentos do genoma, permitindo aobteno, in vitro, de vrias cpias de determinada regio do DNA. Como areao de PCR especfica, pode-se obter a amplificao de seqncias denucleotdeos-alvo mesmo em uma amostra com grande diversidade deseqncias, permitindo a deteco de organismos especficos em misturasheterogneas. Seqncias do DNA de determinados microrganismos podem seramplificadas, utilizando-se primers (seqncias iniciadoras) complementaresquelas localizadas em locais especficos do genoma. O que ocorre a extensodo fragmento de DNA a partir dos primers, pela ao de uma DNA polimerasetermoestvel, a Taq DNA polimerase (isolada originalmente do microrganismoThermus aquaticus). Antes da extenso, o DNA desnaturado e o primeranelado, sendo o ciclo (desnaturao - anelamento - extenso) repetido vriasvezes, permitindo a amplificao exponencial daquela seqncia especfica (Saikiet al.,1985).

dilmeneCoutinho et al., 1999).

dilmeneAmann et al. (1995)

dilmeneTorsvik et al. (1990)

dilmeneElsas et al., 1998).

dilmeneSaiki et al. (1985),

dilmeneSaiki

dilmeneal.,1985).

dilmeneet al.,


A deteco de organismos especficos em extratos de planta ou de solo pode serdeterminada utilizando-se essa tcnica. Nesse tipo de estudo, os primersespecficos so usados em uma PCR com o DNA extrado dos extratos comomolde. A deteco de determinado organismo indicada pela formao de umproduto de amplificao de tamanho definido. Para a confirmao daespecificidade dessa amplificao, pode-se fazer uma hibridizao ou oseqenciamento do produto de PCR (Kirchhof et al., 1997b).

A sensibilidade e a especificidade da PCR pode ser aprimorada com um mtodoconhecido por nested PCR em que as amplificaes iniciais so realizadas comum par de primers sem grande especificidade: os universais por exemplo. Com oproduto amplificado, uma segunda rodada de amplificaes conduzida, dessa vezcom os primers especficos. Essa tcnica foi utilizada, com sucesso, por Rosado etal. (1998), para aumentar a probabilidade de amplificao especfica do DNA donifH de Paenibacillus azotofixans com base em amostras de solo.

Grande parte das tcnicas moleculares hoje utilizadas apropriam-se da PCR ou desuas variaes para o estudo da diversidade de bactrias nos mais diferentesambientes.

O Uso do RNA Ribossmico comoMarcador Filogentico

Os cidos ribonuclicos ribossomais (rRNA) so considerados os biopolmerosmais adequados para estudos de diversidade. Seus genes, os rDNAs, souniversalmente distribudos entre os diferentes grupos de seres vivos, sendo amolcula com o maior grau de conservao existente. Sua variabilidade podeapresentar-se em maior ou menor extenso em diferentes regies da molcula(Lane at al., 1985). Uma das vantagens de se usar informaes sobre asseqncias do rRNA sua disponibilizao em bases de dados (RDP, Gen-Bank,EMBL), na maioria dos casos, acessveis, gratuitamente, permitindo acomparao de novas seqncias obtidas com as seqncias presentes nessasbases (Coutinho et al., 1999).

O 16S rRNA (1500 nucleotdeos) gera grande quantidade de informaesteis para inferncias filogenticas. Apesar de o 23S rRNA (3000nucleotdeos) conter duas vezes mais informao e, portanto, gerar maioracurcia nas inferncias filogenticas, a molcula menor (16S rRNA), por causa

dilmeneKirchhof et al., 1997b).

dilmeneRosado et

dilmeneal. (1998),

dilmene(Lane at al., 1985).



da maior facilidade de seqenciamento, tornou-se referncia. Porm, o 23S rRNAtem sido utilizado como suplemento para os dados gerados do 16S rRNA emestudos de organismos intimamente relacionados (Stahl, 1997).

As primeiras aplicaes de tcnicas baseadas em cidos nuclicos no estudo deecologia microbiana foram concernentes a relaes filogenticas entremicrorganismos determinada pela anlise da seqncia do 16S rDNA (Macrae,2000). Atualmente, outras tcnicas vm sendo desenvolvidas, com base nautilizao desses marcadores (ARDRA, Hibridizao in situ), fazendo com quesejam as ferramentas moleculares mais utilizadas para a explorao da diversidade eda anlise da estrutura de comunidades microbianas (Kozdroj & Elsas, 2000).

PCR-clonagem-seqenciamentoA clonagem e seqenciamento do gene do 16S rRNA considerado o mtodomais poderoso para a explorao da diversidade microbiana em amostras naturais(Muyzer, 1999). Com a utilizao da PCR, fragmentos do gene do 16S rRNA,presentes em amostras complexas, podem ser seletivamente amplificados. Umabiblioteca genmica derivada da amplificao dessas amostras produzida pelomtodo de clonagem. Esses clones contm fragmentos definidos que podem serrapidamente seqenciados. Outra rota para esse tipo de caracterizao molecular a clonagem e o seqenciamento do cDNA transcrito a partir do 16S rRNA comutilizao da enzima transcriptase reversa (Amann et al., 1995).

Provou-se que os microrganismos predominantemente isolados em meio decultura com base em amostras ambientais, no correspondem queles maisfreqentemente identificados depois da PCR e seqenciamento do gene do 16SrRNA (Giovannoni et al., 1990; Stackebrandt et al., 1993; citados por Heuer &Smalla, 1997). Pode-se concluir que os microrganismos, provenientes doisolamento por mtodos tradicionais que utilizam meio de cultura, podem norepresentar os microrganismos que esto realmente presentes em maior nmeronessas amostras.

ARDRA - Anlise de restrio do DNA ribossomalamplificado

Esta tcnica, um tipo de RFLP (ver neste documento), baseada no grau deconservao dos stios de restrio do rDNA que reflete padres filogenticos. AARDRA bastante til para uma rpida anlise da diversidade de um

dilmeneStahl, 1997).

dilmeneMacrae,

dilmene2000).

dilmeneKozdroj & Elsas, 2000).

dilmeneMuyzer, 1999).

dilmeneAmann et al., 1995).

dilmeneSmalla, 1997).

dilmeneHeuer &


ambiente (Grifoni et al., 1995). No entanto, recomenda-se cuidado na escolhado fragmento de rDNA a ser amplificado e analisado por esse mtodo. No casoda anlise de diversidade intra-especfica ou entre grupos de isolados comelevada afinidade filogentica, o fragmento amplificado deve incluir o espaointergnico 16S-23S rDNA. Essa regio intergnica apresenta maior variabilidadetanto na sua composio de bases quanto no seu tamanho quando comparadascom a 16S ou 23S rDNAs. Quando o estudo em questo, tratar da diversidadeentre isolados distantes, filogeneticamente, os fragmentos amplificados podemser o 16S ou 23S rDNAs. Esses genes geram padres de bandeamento maissimples, dependendo das enzimas de restrio utilizadas (Rosado et al., 1999).

Laguerre et al. (1996) promoveram, com a utilizao da ARDRA (16S-23SrDNA), a caracterizao de 43 estirpes de Rhizobium leguminosarum dediferentes biovares. A anlise dos padres de restrio da regio intergnica16S-23S rDNA amplificada permitiu a diferenciao das estirpes no nvel intra-especfico. Os autores afirmaram que por meio dos padres de bandeamentofacilmente analisveis e reproduzveis, gerados da restrio da regio intergnica,foi possvel discriminar as estirpes at o limite determinado pela elevadasimilaridade existente.

Azevedo (1998) analisou os perfis de restrio da regio intergnica 16S-23SrDNA de 71 estirpes de Azospirillum amazonense. Pelos resultados, observa-se,no nvel intra-especfico, grande diversidade gentica entre essas estirpes.

Outros Genes e Mtodos Utilizadosem Anlises Filogenticas

Gene nifH um dos genes que, em conjunto, codificam a formao da protena FeMo,componente da enzima nitrogenase, responsvel pelo processo de fixaobiolgica de nitrognio. Esse gene apresenta seqncias extremamenteconservadas, sendo considerado um dos genes funcionais existentes maisantigos (Rosado et al., 1999). As relaes filogenticas entre bactrias,baseadas em divergncias na seqncia do nifH, apresentam-se de maneirasemelhante ao que ocorre com o 16S rDNA. A vantagem da utilizao dessegene para o estudo de populaes microbianas no ambiente que, neste caso,trata-se de um gene funcional, permitindo uma correlao entre a estrutura e afuno da comunidade microbiana (Rosado et al., 1999). Sua utilizao permite

dilmeneGrifoni et al., 1995).

dilmeneRosado et al., 1999).

dilmeneLaguerre et al. (1996)

dilmeneAzevedo (1998)




tambm o estudo especfico de bactrias diazotrficas, possibilitando oconhecimento sobre a diversidade desse grupo especial de microrganismosassociados a diferentes ambientes.

Gene gyrBEste gene que codifica uma topoisomerase tipo II (enzima que participa dahelicoidizao do DNA), apresenta grande potencial para inferir a filogenia demicrorganismos (Paitan et al., 1998). Desde 1995, quando primers universaispara esse gene tornaram-se disponveis, em vrias publicaes,tm-se sugerido sua utilizao (Watanabe et al., 2001). Esse gene apresenta pr-requisitos importantes como limitada transferncia horizontal e presena emtodos os grupos de bactrias (Watanabe et al., 2001). Para a diferenciao dealgumas espcies, variaes muito pequenas entre os rRNAs 16S e 23Sparecem no ser suficientes para permitir o desenho de sondas espcie-especficas (Yamada et al., 1999). Yamamoto et al. (1999) afirmam, ainda, quea resoluo da anlise de seqncias do gene do 16S rRNA, algumas vezes, insuficiente para a distino de espcies com genoma intimamente relacionados,isto se deve lenta razo de substituio de bases no 16S rRNA. Ademais,anlises filogenticas, baseadas em genes que codificam a formao deprotenas, proporcionam maior grau de resoluo, pois esses genes evoluemmais rapidamente.

Kasai et al. (2000) assumiram que os resultados de seqenciamento do 16SrRNA no so suficientemente divergentes para a distino do gneroMicromonospora no nvel de espcie. Trabalhando com o gyrB esses autoresconcluram que as estruturas filogenticas deduzidas de seqncias desse geneeram consistentes com os resultados de estudos com hibridizao DNA-DNA.Utilizando uma combinao de PCR para o gene gyrB com a tcnica de RFLP,Niemann et al. (2000) encontraram um meio rpido e fcil de discriminao entreMycobacterium tuberculosis, M. africanum tipo II, M. africanum tipo I,M. microti, M. bovis e subtipos de M. bovis. Os autores concluram, ainda, queo polimorfismo apresentado pelo gene gyrB representa o nico marcador quefacilita a diferenciao de Mycobacterium por seqenciamento de DNA ou poruma simples anlise de PCR-RFLP.

Apesar do crescente nmero de trabalhos que vm utilizando o gene gyrB emestudos de anlise filogentica e da existncia de um banco de dados comseqncias de cidos nuclicos e aminocidos de aproximadamente mil estirpes

dilmenePaitan et al., 1998).

dilmeneWatanabe et al., 2001).

dilmeneWatanabe et al., 2001).

dilmeneYamada et al., 1999).

dilmeneYamamoto et al. (1999)

dilmeneKasai et al. (2000)

dilmeneNiemann et al. (2000)


diferentes (Watanabe et al., 2001), ainda no existem relatos da sua aplicaoem amostras de solo ou rizosfera (Rosado et al., 1999).

Alm do nifH e do gyrB, outros genes tm sido propostos para seremutilizados como marcadores filogenticos, principalmente, para o estudo dedeterminados grupos especficos de organismos. Mcdonald & Murrel (1997),por exemplo, propuseram o uso do gene da metano monoxigenase (pmoA) comomarcador gentico para identificao de metanotrofos do tipo II em amostrasambientais.

RFLP - Polimorfismo do tamanho de fragmentos derestrioEsta metodologia baseada na digesto do DNA ou de seqncias especficasdesse DNA por enzimas de restrio, seguida por separao eletrofortica em geldos fragmentos resultantes. As enzimas de restrio, tambm chamadasendonucleases de restrio, reconhecem seqncias especficas de bases nadupla hlice do DNA e clivam ambos os fragmentos duplex em pontosespecficos (Stryer, 1996). O RFLP baseado em padres de restrio com ouso de enzimas selecionadas com base na sua habilidade de revelar polimorfismonos fragmentos de DNA analisados.

Quando so feitos estudos de RFLP com o DNA bacteriano total, gera-seuma enorme quantidade de fragmentos. Portanto, as diferenas nos tamanhosdos fragmentos no podem ser visualizadas diretamente no gel, posto que osinumerveis fragmentos resultantes do tratamento com a enzima de restrioproduzem, nesse gel, um efeito de arraste contnuo. Para se fazer a deteco dosmarcadores RFLP, os fragmentos do gel so transferidos para uma membrana denylon (ou nitrocelulose) por um processo denominado Southern Blot. Por fim, avisualizao de fragmentos polimrficos possvel por meioda hibridizao contra sondas de DNA que apresentam seqnciashomlogas s do DNA imobilizado na membrana (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Gndish et al. (1993) analisaram os resultados de RFLP obtidos depois dadigesto do DNA total de estirpes de Azospirillum por enzimas de corte raro.Esses autores utilizaram uma tcnica especial de eletroforese, conhecida comoEletroforese de Gel com Campo Pulstil (PFGE). Devido a mudanas peridicas nocampo eltrico, essa tcnica permite separar fragmentos de alto peso molecular,resultando em um padro de restrio bastante claro do genoma bacteriano.

dilmeneWatanabe et al., 2001),


dilmeneMcdonald & Murrel (1997),

dilmeneStryer, 1996).

dilmeneFerreira & Grattapaglia, 1998).

dilmeneGndish et al. (1993)


Laguerre et al. (2001) utilizaram essa metodologia para avaliar a diversidade deestirpes de rizbio. As anlises de RFLP dos genes simbiticos nodC e nifHmostraram, de maneira geral, sua correlao com o espectro hospedeiro eindependncia do status taxonmico, j que os resultados no foramconcordantes com aqueles baseados nas seqncias do 16S rDNA. Segundo osautores, esses resultados suportam a tese de que a transferncia lateral entreespcies de rizbio desempenha importante papel na diversidade e na estruturade suas populaes naturais.

T-RFLP - Polimorfismo do tamanho e composio debases de fragmentos terminais de restrioO T-RFLP tido como um mtodo molecular quantitativo para anlises rpidasde comunidades microbianas complexas (Liu et al., 1997). Nessa tcnica, ospassos iniciais de extrao do DNA, amplificao por PCR e restrioassemelham-se aos utilizados na tcnica de ARDRA. No entanto, um dos primersutilizados marcado com um fluorocrmo. Com o uso de um seqenciadorautomtico de DNA, o tamanho dos fragmentos terminais de restrio (T-RF)pode ser determinado, e a sua quantidade, estimada.

Com base na localizao terminal do marcador fluorescente nos produtos dePCR, pode-se garantir que apenas os fragmentos terminais sejam medidos. Ariqueza de espcies de comunidades microbianas estimada pela determinaodo nmero de fragmentos terminais, observados com a digesto dos rDNAstotais das comunidades amplificados por PCR. O padro de T-RFLP percebido(atuando como impresso digital das comunidades) um conjunto do nmero defragmentos com tamanho nico e a abundncia relativa de cada fragmento refletida pelo tamanho de cada pico no eletroferograma. As amostras so corridasem gel de poliacrilamida em um seqenciador. Cada banda fluorescentecorresponder a uma nica populao, e a intensidade de cada banda serdiretamente proporcional quantidade do produto de PCR, dando uma indicaoaproximada da abundncia da populao na comunidade.

Essa metodologia foi til na estimativa da diversidade filogentica e estudo dacomposio de comunidades em vrios ambientes, atuando como um meio paradeterminao do nmero e abundncia de ribotipos numericamente dominantesdentro de uma comunidade. Gardener & Weller (2001) utilizaram o mtodo de T-RFLP para observar mudanas nas populaes de bactrias da rizosfera emfuno da ocorrncia do mal-do-p em trigo (Gaeumannomyces graminis var.

dilmeneLaguerre et al. (2001)

dilmeneLiu et al., 1997).

dilmeneGardener & Weller (2001)


tritici), uma podrido-de-razes. O propsito desse estudo foi o de acessarmudanas na comunidade bacteriana rizosfrica que ocorrem quando as razes detrigo vo do estado saudvel ao doente. As comparaes dos padres deT-RFLP entre plantas doentes e saudveis revelaram diferenas em vrios sinaisfluorescentes. Na rizosfera das plantas de trigo, infectadas pelo patgeno,observaram-se maiores populaes de vrias espcies bacterianas. Os autoresconcluram que essas populaes, observadas na regio da rizosfera de plantasde trigo doentes, poderiam ser explicadas pela maior exsudao de substratos apartir dos tecidos infectados.

AFLP - Polimorfismo de tamanho do fragmentoamplificadoEsta tcnica, assim como a ARDRA, uma combinao da PCR com o RFLP,com base na anlise do padro de restrio (RFLP) e posterior amplificao viaPCR de fragmentos de DNA selecionados do total de fragmentos obtidos darestrio. A restrio conduzida utilizando-se duas enzimas que produzemfragmentos de DNA com terminaes diferentes. A essas terminaes deseqncia conhecidas, so acoplados oligonucleotdeos curtos (adaptadores) queserviro de molde para o PCR. A amplificao seletiva conduzida pelo uso dedois primers (seqncias iniciadoras) complementares aos adaptadores,acrescidos de algumas bases complementares a terminaes de restrio.Janssen et al. (1996) comprovaram a aplicabilidade da tcnica de AFLP comoferramenta taxonmica, estudando 147 estirpes distribudas nos gnerosXanthomonas, Aeromonas, Clostridium, Pseudomonas, entre outros.

RAPD - DNA polimrfico amplificado ao acasoO RAPD requer pequenas quantidades de DNA e capaz de revelar alto grau demarcas polimrficas, sendo um mtodo rpido e passvel de automatizao(Fungaro & Vieira, 1998). Esse mtodo, considerado mais simples e mais baratodo que o RFLP (Oliveira et al., 2000), baseia-se na amplificao de fragmentosno especficos de DNA. So utilizados primers com seqncias arbitrrias denucleotdeos que geram produtos de amplificao via PCR os quais soanalisados. O fato de as seqncias primers serem geradas arbitrariamentepermite a observao de perfis de RAPDs com vrios produtos de amplificao,decorrentes da existncia de vrios stios homlogos a esses primers espalhadosno genoma (Fungaro & Vieira, 1998). Fentipos moleculares, gerados de RAPD,podem servir para diagnosticar diferentes nveis taxonmicos, podendo apresentarpoder de discriminao at nveis intra-especficos.

dilmeneJanssen et al. (1996)

dilmeneFungaro & Vieira, 1998).

dilmeneOliveira et al., 2000),

dilmeneFungaro & Vieira, 1998).


Di Cello et al. (1997) utilizaram a metodologia de RAPD para estudar mudanasna estrutura de populaes de Burkholderia cepacia ao longo do crescimento deplantas de milho. Os autores mostraram o alto grau de polimorfismo, ou seja,diversidade gentica, entre os isolados. Nos estdios iniciais de crescimento dasplantas, a diversidade apresentada foi maior em comparao aos ltimos estdiosno final da maturao. Os autores explicaram que uma possvel razo para essefato seja a maior instabilidade de um ecossistema com plantas jovens emcomparao quele onde as plantas j esto desenvolvidas.

REP, ERIC e BOXEstas metodologias so variaes da PCR em que se utilizam primerscomplementares a seqncias de DNA de ocorrncia natural altamenteconservada e repetitivas, presentes em mltiplas cpias nos genomas da maioriadas bactrias. Trs famlias de seqncias repetitivas foram identificadas,incluindo a REP de 35-40 pb, ERIC de 124-127 pb e, finalmente, o elementoBOX de 154 pb. O uso de primers, desenhados para essas regies, leva amplificao seletiva de regies distintas no genoma. Os primers BOX sogeralmente recomendados por gerar impresses digitais mais robustas e produzirum padro de fragmentos mais complexo. Os primers para REP geram menorcomplexidade, mas ainda produzem impresses digitais reproduzveis e quepermitem a diferenciao dos isolados. O conjunto de primers para o ERIC maissensvel a condies subtimas da PCR, como presena de contaminantes naamostra de DNA, porm gera padres de bandeamento altamentediscriminatrios (Rademaker & De Bruijn, 1996).

A Utilizao de Sondas para Estudoda Diversidade Microbiana

O uso de sondas moleculares um mtodo verstil que permite no s o estudode organismos isolados e cultivados como tambm o desses organismos emamostras ambientais.

Uma sonda consiste em fragmento marcado de DNA ou RNA complementar seqncia de um gene-alvo de interesse. Em condies controladas, ocorre ahibridizao entre a sonda e sua seqncia-alvo. A deteco da seqncia do gene-alvo depende da natureza do sistema de marcao da sonda que pode apresentarnucleotdeos marcados radioativamente (ex.: 32P) ou no (ex.: enzimas, molculas

dilmeneDi Cello et al. (1997)

dilmeneRademaker & De Bruijn, 1996).


fluorescentes) (Coutinho et al., 1999). Sondas de cidos nuclicos podem serconstrudas para deteco de genes especficos e ento serem usadas paradeteco de organismos com o genoma correspondente. A combinao da PCR,com a utilizao de sondas, aumenta significativamente a sensibilidade dosprotocolos de deteco (Rosado et al., 1999).

Testes de hibridizao, em fase slida ou colnias, usando-se sondas deoligonucleotdeos especficos, mostraram-se metodologias rpidas para a validaoe a confirmao de resultados morfolgicos e fisiolgicos em estudos deidentificao taxonmica de isolados (Kirchhof et al., 1997a). Um exemplo do usode sondas oligonucleotdicas dado por Kirchhof et al. (1997b) num trabalho deidentificao de bactrias endofticas, isoladas de Pennisetum purpureum,Miscanthus sinensis, M. sacchariflorus e Spartina pectinata. Vrios isolados foramidentificados como Azospirillum lipoferum e Herbaspirillum seropedicae. Outros,entretanto, foram identificados como pertencentes ao gnero Herbaspirillum,possivelmente representando nova espcie.

Amann et al. (1990) sofisticaram o uso de sondas ribossmicas, conjugandomarcadores fluorescentes com oligonucleotdeos. As sondas foram utilizadas emexperimentos de hibridizao in situ que consistem na imobilizao e napermeabilizao das clulas diretamente nas amostras ambientais. Depois dahibridizao, os oligonucleotdeos marcados so detectados atravs de microscopiade fluorescncia, revelando os microrganismos-alvo. A combinao dessa tcnicacom o poder de resoluo do microscpio confocal de varredura a laser trouxegrande contribuio para o estudo das comunidades microbianas em seusambientes naturais. Um timo exemplo de utilizao dessa tcnica o trabalhoconduzido por Amus et al. (1995), em que se estudou a colonizao da rizosferade plntulas de trigo por estirpes de Azospirillum brasilense. Nesse trabalho,mostrou-se que a estirpe Sp245 foi detectada repetidas vezes no interior dos plosradiculares, enquanto as estirpes Sp7 e Wa3 puderam colonizar apenas orizoplano.

Microarray ou Microchips de DNA

A tecnologia de microchips de DNA representa o ltimo avano dos mtodosmoleculares, com grande potencial para a elucidao de uma gama de aspectosda ecologia microbiana dos solos, incluindo identificao de variaes naestrutura de comunidades entre diferentes amostras (Ogram, 2000), identificao



dilmeneKirchhof et al., 1997a).

dilmeneKirchhof et al. (1997b)

dilmeneAmann et al. (1990)

dilmeneOgram, 2000),


de grupos filogenticos que podem estar ativos ou sem atividade durantedeterminado perodo ou sob determinado tratamento (Guschin et al., 1997) eidentificao de diferenas entre estirpes isoladas de diferentes ambientes(Murray et al., 1999).

Nessa metodologia, os microchips so preparados com sondas deoligonucleotdeos imobilizadas em uma matriz de gel de poliacrilamida ligada superfcie de uma placa de vidro (Yershov et al., 1996). Os oligonucleotdeossintetizados para serem utilizados nos microchips devem ser purificados poreletroforese em gel ou por cromatografia lquida de alta performance. Essaexigncia aumenta o controle sobre a qualidade da estringncia, assegurandogrande especificidade. As amostras de DNA ou RNA so marcadas comfluorocromos ou outros compostos que permitem sua quantificao. Centenas oumesmo milhares de oligonucleotdeos diferentes podem ser imobilizados em umnico microchip, permitindo a deteco simultnea de grande variedade demicrorganismos em uma amostra. Alm disso, um microchip pode ser utilizadopor at 30 vezes, sem deteriorao do sinal de hibridizao, bastando ser lavadocom gua destilada (Guschin et al., 1997).

Small et al. (2001) utilizaram o mtodo de microarray para deteco do 16SrRNA intacto extrado de amostras de solo. RNAs totais de Geobacter chapellei eDesulfovibrio desulfuricans (redutores de ferro e sulfato, respectivamente) foramdetectados com sua hibridizao com sondas universais e espcie-especficas.Com base nos resultados desse trabalho, tambm, mostrou-se a possibilidade deaplicao da tcnica de microarray na deteco direta de microrganismos emamostras ambientais sem a necessidade de utilizao da PCR.

DGGE - Eletroforese em gel degradiente desnaturanteTGGE - Eletroforese em gel degradiente de temperatura

Estas tcnicas, introduzidas por Muyzer et al. (1993), permitem analisarprodutos de PCR de acordo com suas seqncias de pares de bases e no comdiferenas no tamanho dos produtos. Dessa maneira, permitem a determinaoda diversidade gentica de comunidades microbianas naturais e tambm aidentificao filogentica dos membros das comunidades (Rosado et al., 1999).

dilmeneGuschin et al., 1997)

dilmeneMurray et al., 1999).

dilmeneYershov et al., 1996).

dilmeneGuschin et al., 1997).

dilmeneSmall et al. (2001)

dilmeneMuyzer et al. (1993),



A DGGE utiliza gis de poliacrilamida contendo um gradiente linear dedesnaturantes (uria e formamida). Molculas de DNA com o mesmo tamanho,mas com seqncia diferente de nucleotdeos, apresentam comportamentoeletrofortico diferente quando expostas ao gradiente de agentes desnaturantes.A seqncia de nucleotdeos de um fragmento de DNA definir a posio nogradiente em que o DNA de fita dupla ir desnaturar-se passando a fita simples,interrompendo sua migrao no gel. Uma vez que molculas de DNA, comseqncias diferentes, apresentam taxas de migrao diferentes em gisdesnaturantes, essa metodologia uma poderosa ferramenta para estudosecolgicos com microrganismos. Uma variao dessa tcnica, conhecida comoTGGE, utiliza um gradiente trmico com concentrao constante de uria eformamida. A identificao dos membros das comunidades microbianas podeser dada pelo seqenciamento das bandas excisadas ou por hibridizao comsondas especficas (Muyzer, 1999).

Em princpio, DGGE e TGGE podem ser utilizadas para anlise de qualquergrupo de genes amplificados por PCR. No entanto, para estudos sobre adiversidade estrutural de comunidades microbianas, o gene 16S rRNA especialmente til por apresentar as caractersticas j citadas anteriormente,como alto grau de conservao e presena de regies variveis entre asespcies (Heuer & Smalla, 1997). Porm, se o objetivo do estudo acompanhar a dinmica populacional de grupos especficos de microrganismos,o desenho e a aplicao de primers que permitam a amplificao de fragmentosparticulares do gene do 16S rRNA ou outros genes relacionadosespecificamente a esses microrganismos parece ser o mtodo mais promissor(Heuer & Smalla, 1997). Um exemplo o estudo feito por Lovell et al. (2000)que utilizou a DGGE depois da amplificao do gene nifH em suas amostraspara examinar a complexidade e a estabilidade de organismos diazotrficos narizosfera de Spartina. Esses autores concluram que a comunidade diazotrficapresente era bastante diversa e aparentemente constituda por organismosdesconhecidos.

Hoje as tcnicas de DGGE e TGGE esto bem estabelecidas como ferramentasmoleculares para estudos de microbiologia ambiental, permitindo o estudo dacomplexidade e do comportamento das comunidades microbianas em grandenmero de amostras, de maneira rpida, relativamente barata e reproduzvel(Muyzer, 1999).


dilmeneHeuer & Smalla, 1997).

dilmeneLovell et al. (2000)

dilmeneHeuer & Smalla, 1997).



SSCP - Polimorfismoconformacional da fita simples

Esta tcnica, semelhana da DGGE, baseada na diferenciao da conformaoque uma fita simples de DNA assume, dependendo de sua seqncia denucleotdeos. Essa diferena conformacional, quando a molcula submetida auma corrida eletrofortica, resulta em taxas de migrao diferentes parafragmentos de DNA do mesmo tamanho, porm com diferentes conformaessecundrias. O mtodo foi originalmente desenvolvido para deteco demutaes no genoma humano por Orita et al. (1989), gerando fitas simples deDNA por meio de uma desnaturao realizada antes de aplicar as amostras deDNA no gel. No entanto, a desnaturao do DNA no costuma perdurar por todaa corrida e, por esta razo, Schwieger & Tebbe (1998), visando otimizao daanlise, acrescentaram uma etapa de digesto de uma das hlices proveniente deamplificao com primer fosforilado no terminal 5'. Dessa forma, adiciona-se aogel um DNA de fita simples que toma diferentes conformaes de acordo comsua seqncia de bases nucleotdicas.

Essa tcnica, aplicao mais recente que a DGGE em estudos de microrganismosem amostras ambientais, tem ganhado destaque rapidamente (Schwieger &Tebbe,1998; Peters et al., 2000; Schwieger & Tebbe 2000). Peters et al.(2000) utilizaram o SSCP para monitorar a diversidade de bactrias,actinomicetos e fungos em sucesses de comunidades durante diferentesestdios de uma compostagem orgnica, utilizando trs diferentes pares deprimers especficos para regies hipervariveis do rDNA 18S (fungos) e rDNA16S (bactrias e actinomicetos). Os autores concluiram que houve sucesso eincremento na diversidade de microrganismos ao longo do perodo decompostagem.

Schwieger & Tebbe (2000), usando o mtodo de SSCP, analisaram os perfisgenticos do gene rRNA 16S e detectaram a especificidade das comunidades darizosfera com diferentes plantas, demostrando o potencial da tcnica para omonitoramento de Sinorhizobium meliloti (L33) utilizado como inoculante emMedicago sativa e Chenopodium album. Simon et al. (1993), usando primersespecficos para determinados txons, conseguiram discriminar fungosmicorrzicos arbusculares e examinaram a especificidade do hospedeiro pelatcnica de SSCP.

dilmeneOrita et al. (1989),

dilmeneSchwieger & Tebbe (1998),

dilmeneSchwieger &

dilmeneTebbe,1998;

dilmenePeters et al., 2000;

dilmeneSchwieger & Tebbe 2000).

dilmeneSchwieger & Tebbe (2000),

dilmeneSimon et al. (1993),

dilmenePeters et al.


Limitaes Metodolgicas

Os primeiros requisitos da maioria dos mtodos moleculares utilizados nosestudos de ecologia microbiana, e os primeiros obstculos a serem superadosso a extrao e a purificao dos cidos nuclicos. A eficincia na lise dasclulas, a purificao e o tamanho dos cidos nuclicos isolados so cruciaispara o sucesso na aplicao desses mtodos (Ogram, 2000). A composio doDNA isolado dependente da eficincia da lise celular, sabendo-se que essa lise mais difcil em certos grupos bacterianos (More et al., 1994). Os mtodosbaseados nas reaes de PCR dependem da pureza das amostras uma vez que aPCR inibida por contaminantes como os cidos hmicos (Tebbe & Vahjen,1993). O tamanho do DNA extrado tambm influencia a PCR, j que oisolamento de pequenos fragmentos pode aumentar a freqncia na formao deartefatos nessas reaes (Zhou et al., 1996).

medida que a eficincia das tcnicas moleculares possibilita anlisescomparativas de comunidades microbianas, considervel ateno deve ser dada padronizao dos parmetros ligados ao processamento das amostras, poisqualquer diferena detectada entre os padres dessas comunidades atribuda adiferenas na estrutura gnica das comunidades e no a diferenas na preparaodas amostras (Marsh et al., 2000). Os solos so altamente variveis em relaoa suas caractersticas fsicas e qumicas, por isso, um procedimento que separeeficientemente os compostos hmicos de uma amostra de solo pode no sereficiente quando utilizado em uma amostra distinta. A divergncia entre ostcnicos responsveis pela extrao e purificao do DNA do solo tambm considerada uma fonte de variabilidade do DNA recuperado entre diversoslaboratrios, estimulada pelo desenvolvimento de novos e variados protocolospor laboratrios isolados (Ogram, 2000). Um nico mtodo para extrao epurificao do DNA oriundo dos mais variados matizes ambientais seria degrande proveito para o avano da utilizao generalizada das ferramentas debiologia molecular (Ogram, 2000).

As ferramentas moleculares aqui apresentadas, na maioria das vezes, no soapropriadas para resgatar a riqueza ou a abundncia total das espciesbacterianas presentes em determinado ambiente, o que se deve naturezaaltamente complexa da maioria das comunidades (Ogram, 2000). Apesar disso,poucos estudos tm-se referido a metodologias que combinam mtodostradicionais e mtodos moleculares para avaliaes de diversidade microbiana

dilmeneOgram, 2000).

dilmeneMore et al., 1994).

dilmene1993).

dilmeneTebbe & Vahjen,

dilmeneZhou et al., 1996).

dilmeneMarsh et al., 2000).





(Dunbar et al., 1999). Estudos comparativos como este podem ser necessrios,pois as metodologias ainda apresentam, individualmente, limitaes que podemdistorcer as informaes sobre a composio, a riqueza e a estrutura dascomunidades (Bull et al., 2000). Na verdade, os mtodos moleculares norepresentam uma panacia para as dificuldades encontradas nos estudos deecologia microbiana (e nunca foram apresentados como tal), assim sendo, umaanlise polifsica pode ser requerida para uma descrio mais fiel da ecologiamicrobiana dos solos, incorporando resultados de anlises de vriasmetodologias (utilizao de meios de cultura, BIOLOG, mtodos imunolgicosetc.) com os resultados obtidos com ferramentas moleculares.

Outro fator importante que deve ser discutido que apesar de as ferramentasmoleculares fornecerem nova perspectiva para as avaliaes da diversidademicrobiana dos solos, elas no possibilitam que organismos, com potencial valorbiotecnolgico, sejam cultivados e trabalhados, mostrando a necessidade de sedesenvolver tcnicas de cultivo que permitam o estudo e a utilizao dessesorganismos para propsitos biotecnolgicos

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Abstract - In spite of its importance, the soil still one of the least studiedhabitats of the planet and only recently we began to understand that itsbiodiversity is a crucial factor for the regulation and operation of the ecosystems.Traditionally, the detection and identification of bacteria were made observingtheir principal means of obtaining carbon and energy, their nutritional demandsand cultivation media for growth, besides direct observation in the microscope.However, the use of these methodologies provided limited information with needof larger refinement.

The traditional techniques of detection and identification of micro-organismsshow even more limitations when we want to study all the diversity of micro-organisms associated to a certain environment. It is known that the diversity ofbacteria is larger than the diversity of any other group of organisms, however,the cultivation media are, in larger or smaller extension, selective to particulargroups. Estimates point that only 10% of the planets bacterial species havebeen identified, leaving a vast portion of this biota ignored and not studied.

Use of Molecular Tools inDiversity Studies of SoilMicro-organisms

Sumrio: escolha o item desejado e clique diretamente sobre ele.AbstractIntroduoImportncia do uso de ferramentas moleculares em estudos de

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) O Uso do RNA Ribossmico como Marcador Filogentico PCR-clonagem-seqenciamento ARDRA - Anlise de restrio do DNA ribossomal amplificado

Outros Genes e Mtodos Utilizados em Anlises Filogenticas Gene nifH Gene gyrB RFLP - Polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrio T-RFLP - Polimorfismo do tamanho e composio de bases de fragmentos terminais de restrio AFLP - Polimorfismo de tamanho do fragmento amplificado RAPD - DNA polimrfico amplificado ao acaso REP, ERIC e BOX

A Utilizao de Sondas para Estudo da Diversidade Microbiana Microarray ou Microchips de DNA DGGE - Eletroforese em gel de gradiente desnaturante TGGE - Eletroforese em gel de gradiente de temperatura

SSCP - Polimorfismo conformacional da fita simples Limitaes Metodolgicas Referncias Bibliogrficas

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Uso de Ferramentas Moleculares Em Estudos Da Diversidade de Microrganismos Do Solo