Clonando o metagenoma do solo: uma estratégia para o acesso à diversidade genética e funcional de microrganismos não cultivados

Introdução Diversidade de microrganismos Métodos tradicionais de cultivo Conceito de METAGENOMA Importância e utilidade dos microrganismos Acesso ao DNA metagenômico do solo Uso de cromossomos artificiais de bactéria (BAC)

Características:

mantém insertos de grande extensão de DNA (> 100 kb)

apresenta poucas cópias (1 ou 2 por célula)

pode ser utilizado para expressar o DNA exógeno

Objetivo Avaliar a diversidade microbiana no ambiente através

da extração e análise do DNA metagenômico

Materiais e Métodos Linhagens de bactérias e plasmídeos:

- Escherichia coli DH10B

- BAC pBeloBAC11

- Bacillus subtilis BR151(pPL608)

Extração de DNA do solo:- coleta do solo

(Estação de pesquisa em Agricultura – Madison, Wis)

Materiais e Métodos Extração de DNA do solo:

- 5g suspendidas em 10 ml de tampão- Incubação a 60°C por 2 hs- Extração do DNA com clorofórmio e precipitação com isopropanol- Dissolução em água (500 μl)- Eletroforese em gel de agarose- Armazenamento em TE + poliaminas overnight

OBS: em numerosos experimentos esta metodologia produziu DNA de tamanho e limpeza apropriados para a clonagem subseqüente

Materiais e Métodos Construção das bibliotecas

- SL1 e SL2 SL1

- DNA X Gelase- Preparação do vetor- Digestão do DNA com Hind III- Ligação- Transformação

URL http://informa.bio.caltech.edu/idx_www_tree.html Rondon et. al (1999)

Materiais e Métodos SL2

- Preparação do vetor (digestão, ligação, gel, seleção e eluição)- DNA metagenômico: eletroforese do tipo pulsed-field (> 50 kb)

- Digestão com Hind III e eletroforese(insertos 40 kb)

- Ligação- Transformação- Armazenamento

Materiais e Métodos Amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento de genes

ribossomais 16S da SL1- PCR: 48 conjuntos de clones(primers específicos + oligonucleotídeo competitivo)- Clonagem - Seqüenciamento (ABI modelo 377)

Seleção de clones- SL1 testes para a detecção da atividade das seguintes enzimas: -lactamase, celulase, protease, queratinase, quitinase, lipase, esterase, amilase e Dnase

DH10B/pBeloBAC11 (controle -) e linhagens ou enzimas purificadas (controle +)

Materiais e Métodos Seleção de clones

- SL2 testes para a atividade hemolítica

OBS: Todos os clones com resultados positivos foram testados novamente

Seleção de atividade antibacteriana- colônias incubadas com B. subtilis BR151(pPL608)

Resultados SL1

- 3.648 clones arranjados em 38 placas de 96 poços- 100 Mb - 2% dos clones (n 8) foram analisados - 97% contém um inserto de DNA (27 kb)

SL2- 24.576 clones em 256 placas- 1000 Mb- 132 (0,5%) clones foram analisados- tamanho médio dos insertos: 44,5 kb (60% > 40 kb)

Considerando-se que em média um gene apresenta 1 kb pode-se dizer que a SL2 contém 1 milhão de genes

Resultados

Esses dados revelam que as melhorias feitas ao método original resultaram numa biblioteca com mais DNA metagenômico e com maiores insertos

Resultados Análise filogenética da SL1

Esses dados mostram que o método utilizado, pelos autores, para extração e clonagem de DNA recuperam o material genético de diversos procariotos, incluindo bactérias gram-positivas

Resultados Seleção da atividade biológica

- SL1 foram encontrados clones para: DNase (1)

lipase (2)

amilase (8)

atividade antibacteriana (1)

- Método que pode ser usado para extrair e identificar informações genéticas úteis de DNA de origem ambiental

- SL2 foram identificados 29 clones para a atividade hemolítica

1 a 8 clones com atividade amilásica, 9 e 10, lipásica

Resultados Caracterização do clone antibacteriano SL1-36C7

- Atividade inibitória para B. subtilis, fracamente inibitória para Staphylococcus aureus e sem atividade contra E. coli

- completamente seqüenciado

Discussão Os resultados mostram a possibilidade de clonar DNA

ambiental em bibliotecas BACs mantidas em E. coli, uma metodologia que é independente de métodos de cultivo e pode ser utilizada em larga escala

Esta técnica permite o estudo de propriedades filogenéticas, físicas e funcionais do metagenoma

Além da avaliação da diversidade no ambiente, esta metodologia possibilita a descoberta de novos grupos de organismos