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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
WILSIONE JOSÉ CARNEIRO
BIOCONVERSÃO E DEGRADAÇÃO DA VENLAFAXINA
EM SEU METABÓLITO ATIVO
Goiânia
2010
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
2
WILSIONE JOSÉ CARNEIRO
BIOCONVERSÃO E DEGRADAÇÃO DA VENLAFAXINA
EM SEU METABÓLITO ATIVO
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal de Goiás, como
um dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de Concentração: Fármacos e
Medicamentos.
Orientadora: Profa. Dra. Valéria de Oliveira
Goiânia
2010
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WILSIONE JOSÉ CARNEIRO
BIOCONVERSÃO E DEGRADAÇÃO DA VENLAFAXINA
EM SEU METABÓLITO ATIVO
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal de Goiás, como
um dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e
Medicamentos.
Aprovado em Goiânia em ____/____/ 2010
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Profa. Dra. Valéria de Oliveira
______________________________________________________
Profa. Dra. Caridad Nóda Perez
______________________________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha
______________________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Menegatti
4
Agradecimentos
Simplesmente a Deus que sempre me iluma, me ouve e atende o que peço.
À professora Valéria de Oliveira, pelo seu profissionalismo e
competência. Pelas técnicas ensinadas e pelas horas de dedicação. O meu sincero agradecimento.
Aos meus pais e familiares, pessoas que cada vez mais me
ensinam que surpresas boas na vida sempre acontecem quando menos esperamos ou quando menos julgamos merecer. Amo vocês.
Ao grande amigo Emmanuel Carneiro de Oliveira que sempre
se dispôs a me ajudar e nunca mediu esforços. A todos os amigos do LabioCon pelas ajudas, pelas conversas,
pelas risadas e pelo tempo que passamos juntos. Esses momentos foram inexplicáveis.
Aos professores da banca de qualificação e defesa que
contribuíram para o enriquecimento deste trabalho. Aos meus amigos pessoais e profissionais.
5
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 14
1.1 BIOCONVERSÃO ............................................................................................... 14
1.2 METABOLISMO DE FÁRMACOS ....................................................................... 16
1.2.1 Citocromo P450 (CYP450) .................................................................................. 17
1.2.2 Reações de Fase I .............................................................................................. 19
1.2.3 Reações de Fase II ............................................................................................. 21
1.2.4 Reações de biotransformação utilizando Cunninghamella elegans .................... 23
1.2.5 Fatores que influenciam no processo de bioconversão ....................................... 28
1.3 ESTUDO INDICATIVO DE ESTABILIDADE ....................................................... 30
1.3.1 Reações de Degradação forçada ........................................................................ 33
1.4 MÉTODOS APLICADOS ..................................................................................... 36
1.5 VENLAFAXINA E SEUS METABÓLITOS ......................................................... 443
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 46
3. PARTE EXPERIMENTAL - BIOTRANSFORMAÇÃO DA VENLAFAXINA EM O-
DESMETILVENLAFAXINA POR Cunningamella elegans ATCC 6169 .......................... 47
3.1 Equipamentos...................................................................................................... 47
3.2 Materiais e Reagentes ......................................................................................... 47
3.3 Microrganismos ................................................................................................... 47
3.4 Meio de cultura “Potato Dextrose Soy Medium” - PDSM ..................................... 47
3.5 Cultura e procedimento para a biotransformação................................................ 48
3.6 Método de Análise ............................................................................................... 49
6
3.7 Isolamento e identificação do metabólito principal ............................................... 49
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 50
4.1 Triagem preliminar da biotransformação .............................................................. 50
4.2 Identificação e caracterização dos metabólitos .................................................. 517
5. PARTE EXPERIMENTAL II - MANUSCRITO: IDENTIFICATION OF THE MAJOR
ACTIVE VETABOLITE, DESVENLAFAXINE IN EXTENDED-RELEASE CAPSULES OF
VENLAFAXINE ............................................................................................................... 55
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 56
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 57
8. ANEXO .................................................................................................................. 62
7
FIGURAS DA DISSERTAÇÃO
Figura 1
Biotransformação de amitriptilina por C. elegans (ZHANG et al., 1995).
20
Figura 2 Reações enzimáticas catalisadas por C. elegans (ZHANG et al., 1996).
22
Figura 3 Perfil metabólico de carbamazepina por C. elegans ATCC 9245. 2 hidroxicarbamazepina (CBZ-2OH), 3-hidroxicarbamazepina (CBZ-3OH) e 10,11-dihidro-10,11-epoxicarbamazepina (CBZ-EP), como demostra na figura 04 (Kang et al., 2008 (A)).
23
Figura 4 Perfil metabólico de mosaprida por C. elegans (SUN et al., 2009).
25
Figura 5 Proposta metabólica de GEN por C. elegans (KANG et al., 2009).
26
Figura 6 Perfil metabólico de venlafaxina por mamíferos (VIDYAVATHI et al., 2009).
27
Figura 7
Perfil de degradação da lamivudina formando os produtos I, II, III e IV ( BEDSE, KUMAR, SINGH, 2008).
35
Figura 8
Estrutura da venlafaxina (1), metabólito ativo O-desmetilvenlafaxina (2), e os outros metabólitos N, O-desmetilvenlafaxina (3) e N-desmetilvenlafaxina (4)
44
Figura 9 Estrutura da venlafaxina (1a), rac-sila-venlafaxina (rac -1b), e os derivados rac-2 e rac-3 (DAIB et al., 2006).
44
Figura 10
Espectro representativo “Full Scan” dos produtos (A) venlafaxina, (B) O-desmetilvenlafaxina [ODV+H]+ e (C) dehidroxi-venlafaxina
[VEN – H]+
52 Figura 11 “Product Ion”: (A) Dehidro-venlafaxina para [VEN – OH]+(B) O-
desmetilvenlafaxina [ODV+H]+
53
8
FIGURAS DO MANUSCRITO
Fig. 1 Structures of venlafaxine (1), its active metabolite desvenlafaxine (2), and its other metabolites N,O-didesmethyl (3) and N-desmethyl (4).
Fig. 2 HPLC chromatograms of VEN (A) extended-release capsules (0.75
mg/ml), (B) after 24 h exposure at acid and (C) after 50 h exposure at acid.
Fig. 3 ESI (+) full-scan ion spectra of: (A) venlafaxine (VEN); (B)
desvenlafaxine; (C) dehydration product of VEN.
Fig. 4 Collision-induced dissociation (CID) mass spectrum of the
electronspray generated [M+H]+ ions peaks from venlafaxine degradants. Product-ion spectrum for the [M+H]+ ions (A) m/z 260.1 of dehydration product of VEN and (B) m/z 264.2 for desvenlafaxine.
Fig. 5 Precursor-ion for m/z 58.1 resulting from three major pattern ions,
m/z 264.2 (dehydration product, A), 260.1 (desvenlafaxine, B) and 278.1 (venlafaxine, C).
9
TABELAS DA DISSERTAÇÃO
Tabela 1 Métodos cromatográficos utilizadas para análise de venlafaxina e de seus metabólitos.
39 Tabela 2
Detecção por cromatografia em camada delgada dos derivados da venlafaxina ao final da incubação da triagem e seus respectivos valores de Rf. 51
Tabela 3
Correlação entre os pesos molecular dos metabólitos encontrados na biotransformação de venlafaxina utilizando C. elegans (ATCC6169) com os mesmos produtos descritos na literatura em análise de plasma humano.
53
TABELAS DO MANUSCRITO
Table 1 Inter-day and between-analysts precision data of the method
Table 2
Accuracy data of the method
Table 3
Evaluation of robustness for the venlafaxine HPLC assay (n = 6)
10
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
C.C.D – Cromatografia em camada delgada
CBZ-2OH - 2 hidroxicarbamazepina
CBZ-3OH - 3-hidroxicarbamazepina
CBZ-EP - 10,11-dihidro-10,11-epoxicarbamazepina
C. elegans – Cunninghamella elegans
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
CYP450 – Citocromo P450
D.P.R – Desvio padrão relativo
EM – Espectro de massa
GEN – Genfibrozila
ICH – International Conference of Harmonization
K – Fator de capacidade
LC – Cromatografia líquida
LOD – Limit of detection
LOQ – Limit of quatification
EM – Espectrometria de massa
N – número de pratos teóricos
NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
ODV – O-desmetilvenlafaxina (desvenlafaxina)
PDA – Photo diode Array detector
PDSM – Potato dextrose soy medium
r – coeficiente de correlação linear
REF – Revista Eletrônica de Farmácia
R.S.D. – Relative standard deviation
REA – Relação estrutura atividade
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
RT – Tempo de retenção
S.Q.R. – Substância química de referência
11
Tf – Fator de simetria
UV – Ultra violeta
VEN – Venlafaxina
12
RESUMO
A venlafaxina, (1-[2-dimetilamino)-1-(4-metoxifenil)etil]ciclohexanol), é um fármaco antidepressivo de segunda geração. É um dos mais potentes inibidores da recaptação de serotonina e noradrenalina, e o seu efeito terapêutico é atribuído a esta atividade. A venlafaxina é biotransformada no fígado pelas enzimas CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9 em O-desmetilvenlafaxina ou também chamado de desvenlafaxina (metabólito majoritário), N,O-desmetilvenlafaxina, N-desmetilvenlafaxina. O O-desmetilvenlafaxina é farmacologicamente ativo e contribui significativamente para o efeito farmacológico da venlafaxina, uma vez que é encontrado no plasma em altas concentrações. A investigação da formação de produtos de degradação é de grande importância, pois os produtos formados podem ser menos ativos, mais ativos ou tóxicos. Bioconversão ou a aplicação de modelos microbianos é uma estratégia para mimetizar o metabolismo dos mamíferos produzindo quantidades consideráveis de metabólitos para estudos de atividade farmacológica e toxicológica. Neste trabalho foi realizado um estudo de degradação forçada de venlafaxina em cápsulas de liberação prolongada em diferentes condições de estresse (hidrólise ácida e alcalina, oxidativa e térmica) e foram selecionadas cepas de fungos filamentosos com a finalidade de identificar aquelas capazes de metabolizar a venlafaxina e produzir em escala semi-preparativa os principais metabólitos. Os fungos filamentosos utilizados foram: Aspergillus candidus ATCC 2023, Beauveria bassiana ATCC 7159, Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunningamella elegans ATCC 6169, Mortierella isabelina ATCC 1757 e Rhizopus arrhizus ATCC 11145. Foi desenvolvido e validado um método indicativo de estabilidade por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando fase reversa para a análise de venlafaxina na formulação farmacêutica. Os metabólitos preparados por bioconversão foram utilizados para elucidação estrutural e posteriormente serão utilizados como substância química de referência em análises de estudos de estabilidade e futuros estudos de atividade biológica. A cepa Cunninghamella elegans ATCC 6169 foi selecionada e produziu O-desmetilvenlafaxina (desvenlafaxina) e dehidroxi-venlafaxina, similares aos encontrados em mamíferos, reforçando a aplicação dos modelos microbianos para o estudo do metabolismo animal. O estudo indicativo de estabilidade da condição ácida de venlafaxina, formou dois produtos de degradação similares aos obtidos por bioconversão. A O-desmetilvenlafaxina foi recentemente aprovado para o tratamento do transtorno depressivo maior. Como resultado do presente trabalho, foi possível obter a O-desmetilvenlafaxina nas reações de bioconversão por Cunninghamella elegans ATCC 6169 e em estudos de degradação forçada de venlafaxina. O método desenvolvido e validado por CLAE foi considerado método indicativo de estabilidade para análise de venlafaxina em cápsulas de libertação prolongada, pois é sensível/ específico (seletividade < 2%), preciso (D.P.R < 2%), linear (r > 0,99), exato (98,0 - 102,0%) e reprodutível (D.P.R < 2%). Palavras-chave: Bioconversão, estudo de degradação forçada, venlafaxina, produtos
funcionalizados, produtos de degradação.
13
ABSTRACT
The venlafaxine, 1-[2-dimethylamino-1-(4-methoxyphenyl)-ethyl] cyclohexanol, is a antidepressant drug of second generation. This is one of the most potent reuptake inhibitor of serotonin and noradrenaline, and its therapeutic effect is attributed to this activity. Venlafaxine is biotransformed in the liver to O-desmethylvenlafaxine (desvenlafaxine), N, O-desmethylvenlafaxine, N-desmethylvenlafaxine. Enzymes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 metabolize venlafaxine and major metabolite is the O-desmethylvenlafaxine. This is pharmacologically active and contributes significantly to the pharmacological effect of venlafaxine, as is found in plasma at high concentrations. The investigation of the formation of degradation products is of great importance, because the products formed may be less active, more active or toxic. Bioconversion or the application of microbial models is a strategy to mimic the mammalian metabolism produces significant quantities of metabolites for studies of pharmacological activity and toxicological. This work represents a forced degradation study of venlafaxine extended-release capsules in different stress conditions (acid and alkaline hydrolysis, oxidative and thermal) and select strains of filamentous fungi, to identify those able to metabolize venlafaxine and produce in a semi-preparative major metabolites. The filamentous fungi used were: Aspergillus candidus ATCC 2023, Beauveria bassiana ATCC 7159, Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunningamella elegans ATCC 6169, Mortierella isabelina ATCC 1757 and Rhizopus arrhizus ATCC 11145. Was developed and validated method stability indicating HPLC using reverse phase for the analysis of venlafaxine in pharmaceutical formulation. The metabolites prepared by bioconversion were used for structural elucidation and later as a reference chemical in the analysis of stability studies and future studies of pharmacological and toxicological activity. The fungus Cunninghamella elegans ATCC 6169 was selected and produced O-desmethylvenlafaxine (desvenlafaxine) and dihydroxy-venlafaxine, similar to those found in mammals, reinforcing the application of microbial models for the study of animal metabolism. The study indicated the stability of the acid condition of venlafaxine, formed two degradation products, the products found were similar to those obtained by bioconversion. The O-desmethylvenlafaxine, corresponds to the active metabolite of venlafaxine in humans and was recently approved for the treatment of major depressive disorder. Those studies, one can get the O-desmethylvenlafaxine in bioconversion reactions by Cunninghamella elegans ATCC 6169 and forced degradation studies of venlafaxine. The method developed and validated HPLC method was considered indicative of stability analysis of venlafaxine extended-release capsules, it is sensitive, specific (interference < 2%), precise (RSD < 2%), linear (r > 0.99), accurate (98.0 to 102.0%) and reproducible (RSD < 2%).
Keywords: Bioconversion, forced degradation study, venlafaxine, functionalized
products, degradation products.
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 BIOCONVERSÃO
Nos últimos anos, a biotransformação tornou-se uma ferramenta importante na
modificação estrutural e no estudo do metabolismo de compostos orgânicos de origem
natural ou sintéticos. A aplicação da transformação microbiana como modelo
complementar in vitro para o metabolismo dos fármacos tem desempenhado atenção
considerável (SUN et al., 2009).
A biotransformação é importante para a avaliação do fármaco porque é
considerada uma reação de detoxificação, fazendo com que o fármaco fique mais polar
para ser eliminado do organismo. Em muitos casos este metabolismo pode levar a uma
ativação, produzindo outras substâncias farmacologicamente mais ativas ou metabólitos
tóxicos reativos (AZERAD, 1999; SUN et al., 2009).
Modelos microbianos podem constituir uma alternativa, ou no mínimo, um
complemento para o uso de sistemas animais, pois eles podem mimetizar o
metabolismo dos mamíferos, dando informações pertinentes sobre o metabolismo e o
destino do fármaco (AZERAD, 1999).
Os fungos filamentosos, por serem organismos eucariotos, são comumente
utilizados nos estudos de bioconversão, porque apresentam um sistema enzimático
semelhante ao dos mamíferos. O uso de bactérias (organismos procariotos) tem sido
limitado, pois geralmente elas utilizam as substâncias xenobióticas como fonte de
carbono e nitrogênio para a sua manutenção. Porém, o uso das bactérias limita-se as
cepas Actinomicetos (Streptomyces, Nocardia, Actinoplanes e Mico ou Corynebacteria),
pois, apresentam um sistema enzimático similar aos dos fungos filamentosos (AZERAD,
1999).
O estudo do metabolismo in vivo de fármacos tem contado com a utilização de
sistemas para produzir os metabólitos humanos. Nestes modelos in vivo, utilizam-se
pequenos animais de laboratórios como, por exemplo: rato, cão, gato, coelhos, etc.
Nestes animais são coletados e examinados o plasma e a urina para verificar a
presença de possíveis metabólitos formados e compará-los com os metabólitos
humanos (ASHA e VIDYAVATHI, 2009).
15
Os estudos in vivo tradicionais sofrem uma série de limitações, tais como, custo
dos animais, manutenção, preocupações éticas e as variações das espécies. Além
disso, a quantidade de fármaco a ser administrado no animal deve ser em pequenas
dosagens, devido à toxicidade do fármaco. Com isso, a quantidade de metabólitos
formados é pequena, dificultando o isolamento, purificação e identificação (ASHA e
VIDYAVATHI , 2009).
A utilização do modelo microbiano oferece uma série de vantagens sobre o
estudo do metabolismo em animais. Dentre as vantagens, pode-se destacar por ser
uma técnica simples, de fácil preparação e apresenta baixo custo de manutenção e
preparação do meio de cultura, a triagem para várias cepas de fungos filamentosos é
um processo simples e repetitivo, a formação de metabólitos permite mais fácil
detecção, isolamento e identificação estrutural, novos metabólitos podem ser
produzidos e isolados, é um método utilizado para síntese de compostos que envolvem
várias etapas, a manutenção das culturas das cepas é simples, é de custo menor do
que manter células ou culturas de tecidos ou animais em laboratórios, fácil
manipulação, mais viável e reprodutível. (ABOURASHED, CLARK e HUFFORD, 1999;
AZERAD, 1999; SRISILAM e VEERESHAN, 2003; SMITH e ROSAZZA, 2004; LIN et
al., 2007 (A); ASHA e VIDYAVATHI, 2009; VIDYAVATHI et al., 2009).
As biotransformações microbianas têm a seu favor a natureza régio, quimio e
estereosseletiva das reações enzimáticas, permitindo o direcionamento do sistema de
reação para obtenção de um produto definido. Isto pode ser importante na produção de
compostos farmacêuticos que possuem centros quirais, porque nestes compostos não é
fácil a preparação produtos através da síntese química convencional (YOSHIDA et al.,
2001).
Nas reações quimiosseletivas, as enzimas agem em grupos funcionais
específicos, assim, outros sítios funcionais da molécula ficam inalterados. Observa-se a
formação de produtos puros quando comparados com as reações químicas
convencionais (FABER, 2000).
Nas reações regiosseletivas, devido à estrutura tridimensional complexa das
enzimas, elas podem diferenciar grupos funcionais idênticos localizados em regiões
diferentes do substrato reagindo com um grupo específico (FABER, 2000).
16
Nas reações estereosseletivas, as enzimas fúngicas irão reagir com isômeros
específicos do substrato (R,S) e não irão produzir mistura racêmica (FABER, 2000).
1.2 METABOLISMO DE FÁRMACOS
O metabolismo de fármacos compreende o conjunto de reações enzimáticas que
biotransformam fármacos e outros compostos exógenos (xenobióticos) em metabólitos
de polaridade crescente, para que sejam excretados. O metabolismo desempenha,
assim, um importante papel na eliminação dos fármacos, e impede que estes
compostos permaneçam por tempo indeterminado no organismo (BARREIRO e
FRAGA, 2001).
Os fármacos apresentam estruturas químicas diversas, diferenciando em
tamanhos e formas, que vão desde cadeias alifáticas até cadeias cíclicas. As enzimas
responsáveis pelo metabolismo destes fármacos também são diferentes, embora
muitas executem transformações químicas semelhantes. A maioria dos tecidos (como
por exemplo: intestino, pulmões e rins) apresentam capacidade de metabolizar os
fármacos para que eles sejam excretados, porém, o fígado é o órgão que apresenta
maior acúmulo de enzimas responsáveis pelo processo de metabolização (TREDGER,
2004).
O fígado contém uma variedade de enzimas responsáveis pelo metabolismo das
substâncias. As enzimas mais importantes são as do citocromo P450 (CYP 450), que
catalisam as reações de primeira passagem, estas também conhecidas reações de fase
I, são denominadas de reações de funcionalização, que são: oxidação, redução e
hidrólise. Posteriormente, catalisam reações de conjugação (ex. glucuronidação,
sulfatação, acetilação) que são as reações de fase II e resultam na formação de
compostos solúveis que são facilmente excretados na urina (LEE e DORKICL, 2006).
Os metabólitos ativos podem agir por mecanismos de ação similares ou diferentes ou
até mesmo por antagonismo. O conhecimento da cinética da formação dos metabólitos
ativos é importante não apenas para previsão do resultado terapêutico, mas também
para explicar a toxicidade de um fármaco (PEREIRA, 2007).
17
Bactérias e fungos filamentosos são usados como modelos in vitro para simular o
metabolismo dos fármacos que ocorre nos mamíferos. O uso dos microrganismos como
modelo do metabolismo tem sido bem registrado para obter novos metabólitos, novos
protótipos de fármacos e também por produzir metabólitos em grande quantidade
(VIDYAVATHI et al., 2009).
1.2.1 Citocromo P450 (CYP450)
Citocromo P450 é o componente primordial do sistema enzimático oxidativo,
porque o complexo formado com o monóxido de carbono apresentava um pico de
absorção espectrofotométrica no comprimento de onda 450 nm (nanômetros). Essa
enzima apresenta um núcleo pirrólico com o átomo de ferro à semelhança da
hemoglobina, sendo considerada uma hemoproteína (BERNHARDT, 2006)..
O sistema citocromo P450 faz parte da fração microssômica e é responsável
pelas reações de oxidação de inúmeras drogas, desempenhando papel fundamental na
biotransformação (BERNHARDT, 2006).
Um sistema de nomenclatura foi desenvolvido para o citocromo P450, sendo que
suas isoenzimas são reunidas em subgrupos tendo em vista as semelhanças nas
sequências de aminoácidos. O prefixo CYP é usado para designar o sistema citocromo
P450. As isoenzimas são classificadas dentro de famílias e subfamílias. Um numeral
arábico depois do prefixo CYP indica a família (por exemplo, CYP2). Depois do numeral
arábico, há uma letra que representa uma subfamília (por exemplo, CYP2D). O último
dígito do sistema de nomenclatura do citocromo P450 é um numeral arábico que
designa a isoenzima específica (por exemplo, CYP2D6) (BERNHARDT, 2006).
Uma família é constituída por enzimas que compartilham pelo menos 36% da
sequencia de aminoácidos. As subfamílias são formadas por enzimas com mais de 70%
de similaridade na sequência de aminoácidos (BERNHARDT, 2006).
Até o momento são conhecidas 11 famílias do citocromo P450 humano, que
incluem 30 enzimas ou citocromos diferentes. Apenas as famílias CYP1, CYP2 e CYP3
são importantes na biotransformação de drogas. Dentro dessas famílias, as isoenzimas
18
1A1, 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, e 3A3/4 são reconhecidamente as mais importantes para o
metabolismo de drogas (BERNHARDT, 2006)..
A reação básica catalisada pelo sistema do citocromo P450 é a
monooxigenação, onde o oxigênio molecular é decomposto e um de seus átomos é
adicionado a um substrato (um xenobiótico ou uma substância endógena) e o outro
reduzido na formação de água, à custa da oxidação do NADPH (BERNHARDT, 2006).
O Citocromo P450 catalisa as reações da seguinte forma:
SUBSTRATO-H + O2(g) +NAD(P)H + H+ → METABÓLITO-OH + H2O + NAD(P)+
Nesse ciclo, as reações catalisadas pelo citocromo P450 envolvem a
hemoproteína do citocromo P450, a NADPH citocromo P450 redutase, o NADPH e o
oxigênio molecular, mas devido a rearranjos ocorridos durante as reações, os produtos
do sistema do citocromo P450 não se resumem aos álcoois e fenóis e envolvem
reações de hidroxilação, N-, O- e S- desalquilações, N-oxidação, sulfoxidação, N-
hidroxilação, desaminação, deshalogenação e dessulfuração (BERNHARDT, 2006).
O mecanismo da reação envolve a formação do complexo substrato-citocromo
oxidado (Fe+3), que é reduzido (Fe+2) pelo citocromo P450 redutase com o elétron
transferido do NADPH. O complexo reduzido reage com o oxigênio molecular e
novamente é reduzido pelo mesmo citocromo P450 Redutase com outro elétron doado
por outro NADPH e reage também com um próton, passando de Fe+2O2 para Fe+2OOH.
A adição de um segundo próton cliva o complexo, originando uma molécula de água e o
complexo (FeO)+3 transfere seu oxigênio para o substrato. O substrato oxidado é
liberado, reconstituindo o citocromo P450. A interrupção desse ciclo (desacoplamento)
após a adição do primeiro elétron origina um ânion superóxido (O 2-) e, se desacoplado
após a adição do segundo elétron, origina peróxido de hidrogênio (BERNHARDT,
2006).
Muitas substâncias exógenas ou endógenas podem ser substratos de
isoenzimas P450, ou seja, ser metabolizada por elas. Em geral, um fármaco pode ser
substrato de uma única isoenzima CYP450 ou de mais de uma, seja em dado momento
19
ou simutaneamente . Além disso, pode ser substrato de uma isoenzima CYP450 e atuar
como inibidor da mesma. Atuando como inibidor da atividade das isoenzimas, pode
provocar interações potenciais com outros fármacos. Um fármaco pode ainda, inibir
uma isoenzima CYP450 que não esteja relacionada com o seu processo de
biotransformação. Finalmente, uma substância pode induzir um aumento na atividadede
certa isoenzima, sendo ou não substrato da mesma (BERNHARDT, 2006).
1.2.2 Reações de Fase I
As reações de fase I são mediadas por enzimas do citocromo P450, contendo
flavinas monoxigenases, esterases e amidases. Os metabólitos das reações de fase I
são produzidos por reações de oxidação, hidroxilação de aromáticos e alifáticos, N, O,
desmetilação e redução (IYER e SINZ, 1999).
Os fungos do gênero Cunninghamella ssp., simulam o metabolismo dos
xenobióticos semelhante ao que ocorre nos mamíferos (ZHANG et al., 1996). As
enzimas responsáveis pelas reações de fase I realizam a funcionalização dos
xenobióticos, ou seja, introdução ao substrato de grupos funcionais com a função de
aumentar a polaridade do metabólito podendo formar compostos farmacologicamente
mais ativos (IYER e SINZ, 1999, FURA, 2006). A formação de nortriptilina pela
biotransformação da amitriptilina utilizando Cunninghamella elegans (C. elegans), está
ilustrada na Figura 1. Esta reação é um exemplo de biotransformação para a obtenção
de produtos que podem apresentar atividade farmacológica (ZHANG et al., 1995;
FURA, 2006).
20
Figura 1- Biotransformação de amitriptilina por C. elegans (ZHANG et al., 1995).
21
1.2.3 Reações de Fase II
As enzimas que catalisam as reações de fase II são geralmente transferases e
são responsáveis pela conjugação com os xenobióticos ou metabólitos destes,
resultando assim em produtos mais polares (IYER e SINZ, 1999).
Nas reações de fase II (Figura 2), pequenas moléculas polares (ex. ácido
glicurônico e sulfatos), se conjugam com grupos funcionais formados durante as
reações da fase I, formando produtos com uma polaridade maior. A conjugação direta
com as moléculas endógenas pode também ocorrer se o composto já contém grupos
funcionais apropriados. Estas reações de conjugação são mediadas por enzimas que
são as glicuroniltransferases, sulfotransferases e N-acetiltransferases (FURA, 2006).
22
Figura 2- Reações enzimáticas catalisadas por C. elegans (ZHANG et al., 1996).
23
1.2.4 Reações de biotransformação utilizando C. elegans
Muitos estudos utilizando C. elegans estão descritos na literatura e estes
simulam o metabolismo humano e ainda demonstram outros caminhos ou vias
sintéticas para a produção de novos protótipos com possível atividade farmacológica. A
C. elegans é utilizada como modelo microbiano para estudar o metabolismo dos
mamíferos de muitos fármacos, em particular os antidepressivos tricíclicos como, por
exemplo, a amitriptilina, a ciclobenzapina, a imipramina, a protriptilina e os anti-
histaminicos (incluindo doxepina e azatadina) (KANG et al., 2009 (A)).
A cepa C. elegans (ATCC 9245) foi utilizada para produzir três metabólitos de
carbamazepina. Os metabólitos formados foram mais hidrofílicos que o substrato e eles
foram caracterizados por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
(LC/MS). Os produtos formados foram 2-hidroxicarbamazepina (CBZ-2OH), 3-
hidroxicarbamazepina (CBZ-3OH) e 10,11-dehidro-10,11-epoxicarbamazepina (CBZ-
EP), como apresentado na Figura 3 (KANG et. al., 2009 (A)).
Figura 3- Perfil metabólico de carbamazepina por C. elegans ATCC 9245. 2-hidroxicarbamazepina (CBZ-2OH), 3-hidroxicarbamazepina (CBZ-3OH) e 10,11-dehidro-10,11-epoxicarbamazepina (CBZ-EP) (KANG et al., 2009 (A)).
24
Estudo de mosaprida em humanos têm mostrado um metabolismo extensivo
catalizado pelas enzimas do citocromo CYP3A4 produzindo o composto, des-p-
fluorobenzil mosaprida (M6), que tem sido relatado como o metabólito majoritário. A
biotransformação da mosaprida utilizando a C. elegans AS 3.156 indicou que o fármaco
foi metabolizado (90,35% de biotransformação) e formaram uma quantidade de 13
produtos. Dentre os metabólitos, sete (7) metabólitos foram originados das reações de
fase I e seis (6) originados das reações de fase II, conforme Figura 4. O emprego da
biotransformação microbiana utilizando este fungo filamentoso, houve a formação do
metabólito majoritário produzido pelos mamíferos (M6), além de produzir novos
compostos. Embora a produção dos metabólitos não tenha sido elevada, os resultados
descritos indicaram que a transformação microbiana poderia produzir padrões de
referência para análises biológicas e também novos derivados do fármaco (SUN et al.,
2009).
NHO
N
O
ONH2
CH3
F
Cl
NHO
N
O
ONH2
CH3
F
Cl
NHO
N
O
ONH
CH3
F
Cl
Glucoside
o
NHOH
O
ONH2
CH3
Cl
NH
F
NHOH
CH2OH
O
ONH2
CH3
Cl
NHOH
O
ONH2
CH3
Cl
N
F
CHO
NHO
NH
O
ONH2
CH3
Cl
NHO
N
O
ONH2
CH3
Cl
CHONHO
N
O
ONH2
CH3
Cl
COCH3
Mosaprida
M9
M8
M7
M6
M13
M10
M5
M4
M3M2
NHO
N
O
ONH
CH3
F
Cl
HO3SM12
NH2
O
ONH2
CH3
Cl
M11
M1
O
CH3
NHO
N
O
NH2
F
Cl
O
CH3
NHO
N
O
NH2
F
Cl
O
CH3
NHO
N
O
NH2
F
Cl
o
o
o
Figura 4- Perfil metabólico de mosaprida por C. elegans AS 3.156 (SUN et al., 2009).
O metabolismo primário de genfibrozila (GEN) por C. elegans também foi
investigado com a finalidade de elucidar os metabólitos produzidos e comparar com
aqueles produzidos em cães, ratos e no homem. A biotransformação de GEN utilizando
C. elegans originou 10 metabólitos, conforme mostrado na Figura 5. Baseados em
dados obtidos por CLAE, CLAE/Espectrometria de massa (EM) e análise de
CLAE/EM/EM, os autores propuseram uma via metabólica de GEN por C. elegans,
conforme demonstrado na Figura 5. Esta via mostra a formação dos metabólitos 2-
hidroximetilgenfibrozila (FM7) e 2,5 hidroximetilgenfibrozila (FM1), que tiveram suas
estruturas confirmadas por ressonância magnética nuclear (RMN). O metabólito FM1 e
o seu produto de oxidação, FM2, são encontrados no metabolismo de ratos. A C.
elegans formou mais produtos por oxidação (KANG et al., 2009 (B)).
Figura 05- Proposta metabólica de GEN por C. elegans (KANG et al., 2009 (B)).
27
A biotransformação da venlafaxina (Figura 6), foi realizada a fim de analisar qual
microrganismo (fungo filamentoso ou bactéria) era responsável por produzir metabólitos
em quantidades suficientes para a detecção por CLAE. Os autores desenvolveram um
método simples, rápido e específico por CLAE para a detecção de venlafaxina e de
seus prováveis metabólitos em estudos de biotransformação. O método desenvolvido
foi especifico, preciso, linear e exato nas condições analisadas. Na análise realizada
por CLAE, obteve-se um pico adicional nos extratos de culturas da cepa
Saccharomyces cerevesiae, quando comparada com as amostras de controle, “branco”.
Isto indicou que houve a formação de um metabólito derivado da biotransformação da
venlafaxina por Saccharomyces cerevesiae (VIDYAVATHI et al., 2009).
Figura 6- Perfil metabólico de venlafaxina por mamíferos (VIDYAVATHI et al., 2009).
28
1.2.5 Fatores que influenciam no processo de bioconversão
Os processos de bioconversão, assim como qualquer processo reacional, estão
sujeitos às várias influências, que devem ser controlados com a finalidade de se obter
um maior rendimento. Dentre os fatores que influenciam no processo de síntese dos
metabólitos pelos fungos filamentosos, podem-se relatar os parâmetros de pH, a
composição do meio reacional, a velocidade de agitação, a aeração, a temperatura e a
morfologia (AZERAD, 1999).
Diferentes valores de pH do meio de cultura, podem ser medidos durante a
incubação e estar relacionados ao transporte e a solubilização de nutrientes, às
reações enzimáticas e/ou a fenômenos de superfície. Meios fracamente tamponados
contendo sais de amônio, provavelmente se tornarão mais ácidos durante o
crescimento, enquanto meios contendo nitratos se tornarão mais alcalinos. Altas
concentrações de íons, tais como fosfatos, são requeridos para se alcançar valores de
pH estáveis, sobretudo quando se deseja medir a atividade biológica e a atividade
enzimática (PAZINI, 2006).
O meio de cultura é responsável pelo crescimento fúngico e por maiores
rendimentos na produção dos possíveis metabólitos. Neste tipo de experimento, pode-
se utilizar variados tipos de meio de cultura desde que atendam uma quantidade
mínima de nutrientes para a sobrevivência e manutenção das cepas. O meio reacional
é composto por água, oxigênio, carbono como fonte de energia, nitrogênio, podendo
conter, se necessário, fósforo, potássio, cloreto de sódio, peptona, açucares (D-frutose,
sacarose e D-glucose), lipídios e aminoácidos (ALEXANDRE et al., 2004; SUN et al.,
2009).
Estudos relatam que a velocidade de agitação, pode alterar a viscosidade do
meio reacional para alguns microorganismos. O aumento da rotação reduz o
comprimento das hifas e leva ao aumento de ramificações tornando o meio de cultura
mais viscoso (GIBBS, SEVIOUR e SCHMID, 2000; PAPAGIANNI, 2004). A agitação é
um dos processos mais importantes e necessários para as reações de
biotransformação, a fim de se obter concentrações e temperaturas uniformes nos
processos de fermentação. A agitação influencia no crescimento e na concentração da
29
biomassa formada, e ainda na produção dos metabólitos formados por alguns fungos
filamentosos (ZNIDARSIC e PAVKO, 2001).
A oxigenação é um fator importante nas reações de biotransformação utilizando
fungos filamentosos, pois a redução na aeração influencia na formação dos metabólitos
produzidos (PAPAGIANNI, 2004). O nível de oxigênio altera o crescimento e a
morfologia da massa fúngica durante a incubação no meio reacional. A taxa de
crescimento, as propriedades da parede celular e o comprimento das hifas é fortemente
dependente da concentração de oxigênio presente no meio reacional (ZNIDARSIC e
PAVKO, 2001).
A morfologia dos fungos filamentosos altera a viscosidade do meio reacional, a
transferência de calor entre a biomassa e ainda afeta o transporte de nutrientes e
metabólitos de dentro para fora das hifas. Considerando o aspecto morfológico como
produtor de metabólitos pelos fungos, então o tipo morfológico irá alterar a produção de
metabóitos pelas cepas. Estudos afirmam que para a formação de alguns metabólitos é
necessário uma morfologia específica. Algumas morfologias específicas são
preferenciais para a produção de ácido itacônico por Aspergillus terreus, enquanto o
crescimento filamentoso é melhor para a síntese de ácido fumárico por Rhizopus
arrhizus. Os fatores aeração e agitação afetam a morfologia microbiana e
consequentemente a formação de produtos (ZNIDARSIC e PAVKO, 2001).
A produção de metabólitos por alguns fungos é reduzida com o crescimento na
forma de “pellets”, estes são grupamento de colônias com formas arredondadas,
semelhante a uma esfera. Uma possível razão para redução da produção de
metabólitos, quando houver formação de “pellets”, é o estabelecimento de um gradiente
de nutrientes, pois, enquanto o fluido de fermentação está bem aerado e rico em
nutrientes, as células do interior dos “pellets” poderão estar estressadas devido à
limitação de transporte nutricional. Esta deficiência nutricional é especialmente
detectada em “pellets” compactos, onde a difusão molecular não ocorre livremente e
seus centros são ocos devido à autólise hifal. Informações sobre a morfologia dos
“pellets” produzidos são importantes para se ter uma estimativa dos rendimentos.
Maiores rendimentos são esperados com a formação de pequenos “pellets”, já que
30
oferecem uma menor barreira para difusão de oxigênio e outros nutrientes em relação a
“pellets” compactos (PAZINI, 2006).
A vantagem de se obter “pellets” é a de possuir uma maior superfície de contato
externa facilitando com isso as reações. No caso da produção de massa amorfa, melhor
rendimento é encontrado em modificações de compostos por reação de redução ou
outras mais demoradas (PAZINI, 2006).
1.3 ESTUDO INDICATIVO DE ESTABILIDADE
A estabilidade de fármacos e medicamentos pode ser definida como a extensão
em que estes retém, dentro dos limites especificados e dentro de seu prazo de
validade, as mesmas propriedades e características que possuíam na ocasião em que
foram fabricados (KOMMANABOYINA e RHODES, 1999).
A estabilidade dos produtos farmacêuticos precisa ser avaliada para fornecer
informações sobre a variação da qualidade de um produto ao longo do tempo, sob a
influência de fatores ambientais como temperatura, umidade, luz e ar atmosférico (ICH,
2003).
Teste de estabilidade e teste de estresse (estudo de degradação forçada) são
componentes críticos para o desenvolvimento de fármacos. Os estudos ajudam a
entender os mecanismos de decomposição dos fármacos além de obter informações
sobre os fatores físicos e químicos que resultam em instabilidade (SINHA et al., 2007).
Para estabelecer o prazo de validade a partir dos testes de estabilidade,
considera-se o período de tempo compreendido entre a fabricação do produto
farmacêutico até o momento em que sua potência não seja inferior a 90%, desde que
os produtos de degradação estejam todos seguramente identificados e seus efeitos
previamente reconhecidos e que a qualidade do produto esteja dentro do especificado
(PRISTA, ALVES e MORGADO, 1995; BRASIL, 2005).
O controle da pureza de uma formulação é fundamental para garantir a qualidade
dos ingredientes de uma forma farmacêutica e do produto final. As impurezas podem
ser sintetizadas durante as etapas da síntese do fármaco ou podem ser formadas
durante as etapas de produção do medicamento. Portanto, é necessário ter um método
31
analítico que separe o fármaco de todos os possíveis produtos de degradação e/ou
impurezas, e que também separe todos os produtos de degradação uns dos outros
(XIÃO et al., 2007; XIONG, XIÃO e RUSTUM, 2009).
Além da diminuição da potência do medicamento, que é o efeito mais óbvio da
instabilidade farmacêutica, também é importante investigar se os produtos de
degradação formados são tóxicos, já que seu acúmulo é tão importante quanto, ou mais
que, a diminuição da potência (KOMMANABOYINA e RHODES, 1999).
Vários são os fatores que podem afetar a estabilidade de formas farmacêuticas.
Existem, por um lado, fatores relacionados ao produto, como características físicas e
químicas do fármaco e excipientes, dosagem e composição da fórmula, processo de
fabricação e propriedades dos materiais de embalagem e, por outro lado, deve-se
considerar os fatores ambientais, tais como temperatura, umidade e luz (WHO, 1996).
A legislação Brasileira, por meio da Resolução RE nº. 1, de 29 de julho de 2005,
da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), define três tipos de estudo de
estabilidade: acelerado, de longa duração e de acompanhamento. No primeiro, a
degradação química é acelerada por condições extremas de armazenamento durante
um curto período de tempo (6 meses). Neste estudo, o medicamento sólido é submetido
a uma condição de temperatura de 40°C ± 2°C e umidade relativa (UR) de 75% UR ±
5% UR. O medicamento é analisado após 3 e 6 meses da sua produção e sob estas
condições de armazenamento (BRASIL, 2005).
O estudo de estabilidade de longa duração visa verificar por quanto tempo o
medicamento mantem suas características nas condições normais de armazenamento
durante um período de 24 meses. Por ocasião de registro poderá ser concedido um
prazo de validade provisório de 24 meses se aprovado o relatório de estudo de
estabilidade de longa duração de 12 meses ou relatório de estudo de estabilidade
acelerado de 6 meses acompanhado dos resultados preliminares do estudo de longa
duração. No estudo de estabilidade de longa duração, o medicamento sólido é
submetido a uma condição de temperatura de 30ºC ± 2ºC e umidade relativa (UR) de
75% UR ± 5% UR. O medicamento é analisado após 3, 6, 9, 12, 18 e 24 meses da sua
produção sob estas condições de armazenamento (BRASIL, 2005).
32
O estudo de acompanhamento, que ocorre após o início da comercialização do
produto, tem a função de determinar se o produto mantém as características previstas
no estudo de estabilidade de longa duração. O prazo de validade de 24 meses será
concedido mediante relatório de estudo de estabilidade de longa duração de 12 meses,
ou de estudo de estabilidade acelerada de 6 meses. Posteriormente, para renovação do
registro do medicamento, será necessária a apresentação dos resultados do estudo de
longa duração de 24 meses (BRASIL, 2005).
O teste de estresse é definido como o teste de estabilidade do fármaco ou
produto farmacêutico em que as condições excedem as usadas no teste de estabilidade
acelerada. Estes estudos são realizados para elucidar a estabilidade intrínsica dos
fármacos. De acordo com o guia da Conferência Internacional de Harmonização (ICH)
os testes de estabilidade de novos fármacos e produtos devem ser realizados em
diferentes condições de estresse e deve-se validar o método indicativo de estabilidade
para ser utilizado nas análises de estabilidade das amostras. As condições de estresse
devem exceder valores de pH, oxidação, hidrólise (ácida e básica), fotólise e
temperatura (SINHA et al., 2007).
Algumas condições analíticas estão descritas na literatura contribuindo para a
realização dos testes de degradação forçada de fármacos. Para realizar o estudo
indicativo de estabilidade de venlafaxina, pode-se submeter o fármaco à degradação
forçada em meio ácido, básico, condição oxidativa e aquecimento (MAKHIJA e VAVIA
2002; ADJAYE et al. 2007).
Um método indicativo de estabilidade precisa ser capaz de dosar o fármaco
seletivamente, diferenciando-o de suas impurezas e de seus produtos de degradação.
Desta forma, deve-se realizar estudos de degradação forçada quando se pretende
desenvolver uma metodologia indicativa de estabilidade, com o intuito de garantir a
especificidade do método (ICH, 2003; RAMAN et al., 2009).
Nas condições de degradação forçada, o agente de estresse deve ser capaz de
degradar a amostra a um valor preferencial de 10-20% em relação ao teor da
substância na formulação farmacêutica. A descoberta de tais condições é baseada em
tentativas e erros (RAMAN et al., 2009).
33
O estudo de degradação forçada também permite elucidar a estabilidade
intrínseca do fármaco, contribuindo para o entendimento do mecanismo de degradação
da substância, o que, posteriormente, ajuda a compreender quais fatores físicos e
químicos devem ser controlados para manutenção da estabilidade (SINHA et al., 2007).
Tendo em vista a necessidade de garantir a confiabilidade, comparabilidade e
rastreabilidade dos resultados analíticos, é imprescindível a validação dos métodos. O
processo de validação assegura a credibilidade do método no uso rotineiro, fornecendo
evidências documentadas de que o método realiza o que é esperado, através da
avaliação sistemática do procedimento analítico (RIBANI et al., 2004).
Desta forma, a validação do método é um requisito importante para a prática da
análise química e deve ser uma parte integrante das boas praticas para as análises
(ZAN et al., 2009).
No Brasil, a validação de procedimentos analíticos é regulamentada pela
Resolução – RE nº 899, de 29 de maio de 2003, em que está definido: “a validação
deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências
das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados”. Para métodos
analíticos quantitativos, os parâmetros utilizados na validação são:
especificidade/seletividade, linearidade, intervalo, precisão, exatidão e robustez
(BRASIL, 2003).
1.3.1 Reações de degradação forçada
O estudo de degradação forçada de aciclovir foi realizado de acordo com as
condições recomendadas pelo ICH, utilizando hidrólise ácida (0,1mol/L, 1,0 mol/L e 2,0
mol/L de HCl com e sem temperatura de 80°C por 2 horas), hidrólise alcalina (1N de Na
OH com e sem temperatura de 80°C por 2 horas), condição oxidativa (1% H2O2 por 30
minutos e subsequentemente por 3horas; 10% H2O2 e 30% H2O2 por 24 horas) e
fotoestabilidade por 14 dias. O estudo realizado apresentou diferentes condições de
estresse nas condições descritas. O aciclovir degradou e formou produtos em todas as
condições de estresse, detectadas por CLAE, porém a extensão de degradação foi
diferente em cada condição analisada (SINHA et al., 2007).
34
O estudo indicativo de estabilidade de rizatriptam, usado no tratamento de
enxaquecas, foi desenvolvido e validado por CLAE para detectar as substâncias
relacionadas nas amostras. Estudos de degradação forçada foram realizados em
amostras de benzoato de rizatriptam usando hidrólise ácida (HCl 0,5 mol/L), hidrólise
básica (NaOH 0,1 mol/L) e condição oxidativa (3% H2O2), aquecimento a 60°C e
condição fotolítica. Uma degradação leve do fármaco foi observada na hidrólise básica
e uma degradação considerável foi observada durante o estresse oxidativo (RAO et al.,
2006).
Um método indicativo de estabilidade foi desenvolvido e validado por CLAE para
determinar a pureza de fanciclovir na presença de impurezas e de produtos de
degradação. O fármaco foi submetido às condições de estresse oxidativo, hidrólise
ácida e básica, hidrólise térmica e degradação fotolítica. No estudo realizado,
encontraram-se produtos de degradação nas condições oxidativa, ácida e básica. Nas
condições de estresse em hidrólise térmica e fotolítica não houve a degradação do
fármaco, considerando assim estável nestas condições. Os produtos de degradação
tiveram uma boa resolução em relação ao pico principal, indicando que o método é
considerado indicativo de estabilidade (RAMAN et al., 2009).
A lamivudina foi submetida ao estresse de degradação forçada por condição
hidrolítica (neutra, ácida e alcalina), oxidativa, fotolítica e estresse térmico, conforme
sugerido pelo guia de recomendações do ICH. O fármaco demonstrou ser instável em
meio ácido, alcalino e oxidativo, e permaneceu estável na condição neutra e de
estresse térmico. No total, cinco produtos de degradação foram formados, conforme
Figura 7. Para caracterizar os produtos formados, em primeiro lugar uma fragmentação
completa do fármaco foi realizada através da espectrometria de massa. O mesmo foi
comparado com os fragmentos do produto de degradação da substância química de
referência. Os valores exatos das massas obtidos foram usados e as informações totais
ajudaram na identificação dos produtos de degradação (BEDSE, KUMAR e SINGH,
2009).
35
Figura 07- Perfil de degradação da lamivudina formando os produtos I, II, III e IV
(BEDSE, KUMAR e SINGH, 2009).
Um método rápido, simples e indicativo de estabilidade foi desenvolvido por
CLAE para avaliar a estabilidade das formas farmacêuticas de venlafaxina. O uso de
hidrólise ácída (1 mol/L HCl) e básica (1 mol/L NaOH), condição oxidativa (3% H2O2)
com e sem temperatura na degradação forçada de comprimidos de venlafaxina, foi
capaz de produzir um produto de degradação na condição ácida detectado por CLAE e
N
N
S
O
O
NH2
OH
N
N
O
O
NH2
OH
SO
N
N
S
O
O
NH2
OH
N
NH
NH2
N
NH
O
O
N
N
S
O
O
O
OH
[O]
H+/OH-,H2O
-NH3
-Oxatiol
-NH3
-Oxatiol
-NH3
H+,OH-,H2O H+,OH-,H
2O
III IV
36
com característica mais polar que o próprio fármaco. A venlafaxina foi estável em
hidrólise básica e na condição oxidativa (MAKHIJA e VAVIA, 2002).
A estabilidade gastrointestinal da venlafaxina foi avaliada in vitro simulando os
fluidos gástrico e intestinal usando um método por CLAE para detectar e indicar a
estabilidade. O estudo de degradação forçada do fármaco em meio básico (1 mol/L
NaOH) a 70°C, assim como em condição oxidativa (15% H2O2) por 1 hora e em estudo
de fotoestabilidade no ultravioleta a 255 e 365nm por 24 horas, não produziu nenhum
produto de degradação detectável. O estudo de degradação forçada em meio ácido (1
mol/L HCl) a 70°C por uma hora formou o produto dehidro-venlafaxina (ADJAYE et al.,
2007).
1.4 MÉTODOS APLICADOS
Fungos filamentosos apresentam uma enorme capacidade de promover reações
simples capazes de produzir modificações estruturais em xenobióticos gerando uma
quimiodiversidade de compostos. Dessa forma, a metodologia analítica empregada em
estudos de bioconversão deve ser capaz de distinguir estes compostos, separá-los,
quantificá-los e identificá-los adequadamente (GOMES, 2007).
No estudo do metabolismo dos fármacos é necessário detectar, identificar e
caracterizar os metabólitos formados para permitir uma melhor compreensão do seu
papel na avaliação da segurança dos medicamentos (SUN et al., 2009).
Os microrganismos têm sido usados como alternativa ou complemento ao
emprego de sistemas animais, pela sua capacidade de imitar o metabolismo que ocorre
em mamíferos. As concentrações usadas (que geralmente variam de 0,2 a 0,5 g/l) são
muito maiores que as empregadas em outros modelos de células ou tecidos; como a
capacidade metabólica dos microrganismos pode ser alta, a soma dos metabólitos
formados encontra-se na escala de 20 a 200 mg/L, permitindo fácil detecção,
isolamento e identificação estrutural (AZERAD, 1999).
O uso de fungos filamentosos tais como Beauveria bassiana ATCC 7159, C.
echinulata ATCC 9244 e Mortierella isabelina NRRL 1757 na realização de reações de
oxidação, redução e glicosilação, entre outras, têm se mostrado úteis na bioconversão
37
de uma grande variedade de compostos orgânicos (GROGAN e HOLLAND, 2000). A
aplicação dessa metodologia possibilita a obtenção de quantidades suficientes para
identificação estrutural, prepararação de padrões autênticos para as análises de
metabólitos animais e se necessário produção dos mesmos em escala preparativa
(CIRILO, 2006).
As quantidades de metabólitos obtidos nas reações de bioconversões dependem
do desenvolvimento de uma metodologia apropriada que consiste na utilização de
técnicas tradicionais como cromatografia de camada delgada (C.C.D.), CLAE, sendo
esta acoplada ou não a espectrometria de massa (EM) (GOMES, 2007). A C.C.D. é
uma técnica muito utilizada no monitoramento dos produtos formados durante a triagem
e na escala semi-preparativa, pois, esta técnica possibilita a seleção do microrganismo
de interesse de acordo com a produção de cada cepa, assim como no monitoramento
dos diversos derivados produzidos por uma única cepa (GOMES, 2007).
Dentro dos métodos cromatográficos, a CLAE é a mais utilizada devido à sua
alta capacidade de resolução, sensibilidade e especificidade, e porque há uma grande
quantidade de compostos que podem ser analisados usando esta técnica (MARIN e
BARBAS, 2004). Algumas vezes as informações que a CLAE fornece não são
suficientes para a confirmação da identidade. Para este efeito, a LC/MS é uma técnica
em que o peso molecular sugere informações de fragmentação e é uma ferramenta
indispensável de análise (MARIN e BARBAS, 2004).
Vários métodos foram desenvolvidos para a determinação de antidepressivos por
CLAE/EM, a maioria deles para a determinação de um composto e de seus principais
metabólitos, ou de alguns compostos pertencentes ao mesmo grupo de antidepressivos
(CASTRO et al., 2008). Muitos destes métodos são encontrados na literatura para a
determinação quantitativa de níveis terapêuticos de venlafaxina e O-
desmetilvenlafaxina em amostras de plasma humano e fluidos biológicos. Muitos deles
usam a CLAE com detecção ultravioleta (UV), fluorescência, eletroquímico ou
espectrômetro de massa. Eletroforese capilar com detecção UV também tem sido
utilizada (MADRIOLI e VAVIA, 2007).
Um método ideal, que seja indicativo de estabilidade, deve separar o fármaco e
também ser capaz de separá-lo de seus produtos de degradação. Assim, uma tentativa
38
foi feita para desenvolver um método por CLAE que fosse preciso, rápido, específico e
reprodutível para a determinação de venlafaxina, na presença de produtos de
degradação durante o estudo de estabilidade de formas farmacêuticas. (ADJAYE et al.,
2007).
Na literatura se encontram muitos estudos para a detecção e a separação de
venlafaxina e de seus metabólitos. Na Tabela se observam os mais variados métodos
para análise de venlafaxina e de seus metabólitos na forma farmacêutica cápsula,
fluidos biológicos, estudos indicativos de estabilidade e meios reacionais para estudos
de biotransformação.
Tabela 1. Métodos cromatográficos utilizados para análise de venlafaxina e de seus metabólitos.
Tipo de estudo Compostos analisados Condições cromatográficas Referência
Estudos de biotransformação de
venlafaxina VEN e metabólito
Técnica analítica: CLAE
(VIDYAVATHI et al., 2009)
Detector: U.V.
Comprimento de onda: 200 nm
Coluna: C8, 4,6x250 mm
Fase móvel: Acetonitrila:Tampão fosfato de sodio monobásico 0,05 mol/L pH: 3,8 (25:75)
Fluxo: 1,0 mL/min
Tempos de retenção:
VEN: 9.8 min.
Metabólito: 6.2 min.
Estudo indicativo de estabilidade de venlafaxina
em formulações farmacêuticas
VEN e degradante ácido
Técnica analítica: CLAE
(MAKHIJA e VAVIA, 2002)
Detector: U.V.
Comprimento de onda: 224 nm
Coluna: C8_4,6x250 mm
Fase móvel: Acetonitrila:Tampão fosfato de sódio monobásico 0,04 mol/L pH: 6.8 (25:75)
Fluxo: 1,5 mL/min.
Volume de injeção: 20 uL
Tempos de retenção:
VEN: 5.3 min.
Degradante ácido: 4.32 min.
Tabela 1. Métodos cromatográficos utilizados para análise de venlafaxina e de seu metabólito.
Tipo de estudo Compostos analisados Condições cromatográficas Referência
VEN e desvenlafaxina
Técnica analítica: CLAE
(MADRIOLI e VAVIA, 2007) Análise de venlafaxina e de seu metabólito em plasma
humano
Detector: Fluorescência
Comprimento de onda:
excitação: 238 nm
emisssão: 300 nm
Coluna: C8_4,6x150 mm
Fase móvel: Acetonitrila:Tampão fosfato de sodio monobásico 0,04 mol/L pH: 6.8 com trietilamina(v/v)
Fluxo:
0,0 - 3,5 min: 1,0 mL/min.
3,5 - 4,0 min.: 1,0 - 2,0 mL/min
4.0 - 15,0 min: 2,0 mL/min.
15,0 - 15,5 min: 2,0 - 1,0 mL/min.
Volume de injeção: 20 uL
Tempos de retenção:
VEN: 9.8 min.
Metabólito: 6.2 min.
1.5 VENLAFAXINA E SEUS METABÓLITOS
A venlafaxina (1-[2-dimetilamino)-1-(4-metoxifenil)etil]ciclohexanol), é um
fármaco antidepressivo de segunda geração. Este é um dos mais potentes inibidores
da recaptação de serotonina e noroadrenalina, e o seu efeito terapêutico é atribuído
a esta atividade. Acredita-se, que o mecanismo de ação antidepressiva da
venlafaxina em seres humanos é associado com a potenciação da atividade
neurotransmissora no sistema nervoso central (PATEL et al., 2008; FONSECA e
BONATO, 2010). A venlafaxina tem demonstrado ação mais rápida e melhor
resposta quando comparada com outros antidepressivos, como, por exemplo, a
fluoxetina (inibidora seletiva da recaptação de serotonina) (LIN et al., 2007).
Venlafaxina está sendo usada em pacientes que não respondem aos inibidores
seletivos da recaptação de serotonina ou naqueles pacientes em que esta resposta
diminui com o tempo (PATEL et al., 2008). A dose diária deste fármaco está entre 75
a 225 mg (MADRIOLI e VAVIA, 2007).
A venlafaxina não mostrou in vitro, afinidade significativa por receptores
muscarínicos, histamínicos ou 1-adrenérgicos. A venlafaxina é biotransformada no
fígado em O-desmetilvenlafaxina (desvenlafaxina), N, O-desmetilvenlafaxina, N-
desmetilvenlafaxina, (Figura 8). As enzimas do CYP2D6, CYP2C19 E CYP2C9
metabolizam a venlafaxina e seu metabólito majoritário é a O-desmetilvenlafaxina
(PATEL et al., 2008; FONSECA e BONATO, 2010), que é farmacologicamente ativo
e contribui significativamente para o efeito farmacológico da venlafaxina, uma vez
que é encontrado no plasma em altas concentrações. Enquanto a venlafaxina é
certamente muito mais benéfica do que os tradicionais antidepressivos tricíclicos, o
tratamento com este fármaco ainda pode causar vários efeitos colaterais sobre o
sistema nervoso central (vertigem, boca seca, insônia, nervosismo, sonolência), o
sistema gastrointestinal (constipação, anorexia, náuseas), o sistema cardiovascular
(hipertenção, vasodilatação e palpitações) e no sistema geniturinário (impotência,
anorgasmia). Portanto, a grande importância do monitoramento terapêutico em
pacientes submetidos ao tratamento com este fármaco pode ser facilmente
compreendido (MADRIOLI e VAVIA, 2007).
44
Figura 8. Estrutura da venlafaxina (1), metabólito ativo O-desmetilvenlafaxina (2), e os outros metabólitos N-desmetilvenlafaxina (3), N, O-desmetilvenlafaxina (4)(VU et al., 1997).
Estudos relatam a síntese e a caracterização farmacológica de rac-sila-
venlafaxina (rac -1b), um produto sililado análogo da inibição da recaptação da
serotonina e noradrenalina (rac -1a). No contexto de relação estrutura-atividade
(REA), os derivados rac - 2 e rac - 3 também foram investigados. Neste estudo,
foram testados a eficácia na inibição de serotonina, noradrenalina e dopamina e as
alterações nas propriedades farmacológicas de rac -1a, rac -1b, rac -2 e rac -3.
Estas estruturas químicas estão ilustradas na Figura 9 (DAIB et al., 2006).
Figura 9. Estrutura da venlafaxina (1a), rac-sila-venlafaxina (rac - 1b), e os derivados rac - 2 e rac - 3 (DAIB et al., 2006).
O composto sililado rac-sila-venlafaxina (rac - 1b), apresenta uma inibição no
perfil de recaptação da monoamina substancialmente alterada quando comparado
com o seu análogo rac-carbono-venlafaxina (rac - 1a). A inibição na atividade de
45
recaptação de noradrenalina e transportadores de dopamina é essencialmente
afetada pela sila-substituição (dentro das variações biológicas esperimental in vitro).
Alterações como estas afetam as propriedades químicas, físico-químicas e a
estrutura da venlafaxina e, portanto, alteram suas propriedades biológicas. Em
contrapartida, a rac-sila-venlafaxina-2 (rac - 2) (houve a troca de um ciclo contendo 5
carbonos) reduziu a recaptação de serotonina quando comparado com rac-
venlafaxina (rac - 1a), enquanto que houve um aumento na recaptação do
transportador seletivo de dopamina. O composto rac-metoxilados-sila-venlafaxina
(rac - 3) apresentou uma redução significativa na inibição da atividade de recaptação
de serotonina e noroadrenalina, resultando em um fraco perfil inibidor da atividade
de recaptação de monoaminas. Estes dados demonstram a importância da fração p-
metoxi na manutenção da inibição da recaptação de serotonina e noradrenalina,
enquanto que as mudanças sila alteram as atividades e os efeitos na recaptação de
serotonina e dopamina. Observa-se que a inibição refinada da recaptação de
serotonina e noroadrenalina foi seletiva em rac-sila-venlafaxina (rac-1b) podendo
este, fornecer benefícios na terapêutica no tratamento de várias desordens do
sistema nervoso central (DAIB et al., 2006).
Tomando como base os estudos descritos anteriormente, foi realizado uma
triagem ou “screening” com várias cepas de fungos filamentosos, para identificar
aquelas capazes de metabolizar a venlafaxina e produzir em escala semi-preparativa
os produtos funcionalizados. Também, foi avaliado o padrão de degradação da
venlafaxina em cápsulas de liberação prolongada. A caracterização dos metabólitos
formados na biotransformação e dos produtos de degradação será realizada por
ESI-EM/EM. Além disso, foi desenvolvido e validado um método por CLAE para
estudo indicativo de estabilidade.
Embora a literatura descreva estudos de biotransformação microbiana de
venlafaxina usando a detecção por CLAE dos produtos encontrados, nenhum
metabólito descrito foi caracterizado, o que justifica a realização deste trabalho, uma
vez que os metabólitos produzidos na bioconversão podem ser utilizados como
padrão de referência em analises de estudos de estabilidade ou para futuros
estudos do metabolismo animal.
46
2. OBJETIVOS
- Aplicar o modelo microbiano para obter metabólitos de venlafaxina semelhantes
aos do metabolismo animal;
- Desenvolver e validar um metodo analítico que seja indicativo de estabilidade para
venlafaxina em cápsulas de liberação prolongada;
- Caracterizar os produtos formados pela bioconversão e pelo estudo indicativo de
estabilidade;
- Correlacionar os produtos formados na bioconversão com os formados pelo estudo
indicativo de estabilidade.
47
3. PARTE EXPERIMENTAL - BIOTRANSFORMAÇÃO DA VENLAFAXINA EM O-
DESMETILVENLAFAXINA POR Cunningamella elegans ATCC 6169
3.1. Equipamentos
Os equipamentos para análise foram: espectrômetro Micromass/Waters
Quattro Micro (ZSpray®) e MDS/SCIEX API5000 (Turbo V - Turbo Ion Spray®),
sistema de purificação de água Milli-Q-plus (Millipore), aparelho de ultra-som,
agitador magnético (Unique), incubadora com agitação, câmara climática (Tecnal),
autoclave (Alpha), câmara climática, evaporador rotatório (Eletro lab).
3.2. Materiais e Reagentes
Matéria prima de cloridrato de venlafaxina, lote: VF001/7007. Acetato de etila
grau UV/HPLC, álcool etílico grau UV/HPLC, fosfato de potássio monobásico
(J.T.Baker, USA); acetato de etila, ácido fórmico, celite, cloreto de sódio, D-glicose
anidra (Dextrose), extrato de levedura, iodo, sílica gel 60 (230-400 mesh), sulfato de
magnésio anidro, vanilina sulfúrica (Vetec, BR); ágar batata, celite, glicerol, papel de
filtro, sílica gel FG254 e tubo de ensaio (Merck, GER); lecitina de soja (INLAB, BR);
metanol grau HPLC (TEDIA, USA); peptona bacteriológica (Synth, FR), Erlenmeyer,
eppendorf, funil de Buchner, funil de vidro sinterizado (Pyrex) e água destilada.
3.3. Microrganismos
As cepas de fungos filamentosos utilizadas foram Aspergillus candidus
(ATCC2023), Beauveria bassiana (ATCC7159), Cunninghamella echinulata
(ATCC9244), Cunningamella elegans (ATCC6169), Mortierella isabelina
(ATCC1757) e Rhizopus arrhizus (ATCC11145). Os microrganismos estavam
estocados em meio sólido inclinado de ágar batata a 4°C.
3.4. Meio de cultura “Potato Dextrose Soy Medium”- PDSM
A biotransformação microbiana foi realizada em meio líquido. Este foi
preparado pesando-se separadamente 5 g de peptona bacteriológica, 20 g de D-
glicose anidra (dextrose), 5 g de cloreto de sódio, 5 g de fosfato de potássio
48
monobásico, 3 g de extrato de levedura, 5 g de lecitina de soja. Após a pesagem, os
reagentes foram solubilizados em 1000 mL de água destilada, homogeneizados e
transferiu-se 100 mL deste meio para frascos de Erlenmeyer de 250 mL. Após
transferência os frascos foram autoclavados por 15 minutos a 121°C (SUN et al.,
2009).
3.5. Cultura e procedimentos para a biotransformação
A biotransformação da venlafaxina foi realizada de acordo com duas fases de
fermentação: triagem e escala semi-preparativa (SUN et al., 2009). Para o
procedimento de triagem ou “screening”, foram utilizadas as seis cepas de fungos
filamentosos, já descritas. Estas cepas estavam armazenadas em câmara climáticas
e estocadas em tubos de vidros contendo ágar-batata inclinado. Duas gostas da
suspensão em glicerol dos esporos das cepas foram inoculadas em frascos
Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio de cultura Potato Dextrose Soy
Medium (PDSM). Após à inoculação, os frascos de Erlenmeyer foram incubados sob
agitação de 200 rpm a 28 ± 2°C em agitador rotativo por 65h. Após esse período,
adicionou-se a cada Erlenmeyer 1,0 mL de uma solução do substrato solubilizado
em álcool etílico na concentração de 50 mg/mL, obtendo-se uma concentração final
de 0,5 mg/mL. Os Erlenmeyer foram novamente incubados no agitador à 200 rpm,
28 ± 2 °C por um período de 144 h. O monitoramento da reação foi realizada em 24,
48, 72, 96 e 144 h após a adição do substrato ao meio de cultura líquido. Foram
retiradas em duplicata com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, 1,5 mL do
sobrenadante de cada frasco Erlenmeyer e transferidos para tubos eppendorfs (SUN
et al., 2009).
Frasco de cultura controle, contendo microrganismos, foram cultivadas em
condições idênticas, mas sem substrato ou seja, venlafaxina. Experimentos de
controle contendo o substrato foram preparados nas mesmas condições descritas,
mas sem os microrganismos (SUN et al., 2009).
Para o procedimento de fermentação em escala semi-preparativa, o fungo
selecionado na etapa de triagem, Cunninghamella elegans (C. elegans)
(ATCC6169), foi incubado utilizando os mesmos procedimentos e as mesmas
condições do método de triagem. A solução de venlafaxina foi adicionada em cada
frasco Erlenmeyer para dar uma concentração final de 0,5 mg/mL. Após 144 h de
49
incubação, o conteúdo dos frascos foram filtrados originando uma fração aquosa e
uma massa fúngica, ou micélio (SUN et al., 2009).
3.6. Método de análise
As reações de biotransformação do experimento de triagem e da escala semi-
preparativa foram monitoradas durante cada tempo de coleta. Após a coleta, as
alíquotas foram centrifugadas por 5 min. a 3000 rpm. Em seguida, transferiu-se o
sobrenadante para um tubo de vidro e saturou-se o líquido com cloreto de sódio.
Após a saturação, adicionou-se acetato de etila, centrifugou e deixou o tubo em
repouso. O extrato orgânico obtido foi analisado utilizando cromatoplacas de
alumínio com sílica gel FG254 e fase móvel metanol : acetato de etila (1:1). Os
metabólitos eluidos nas cromatoplacas foram detectados utilizando luz UV (254 e
365 nm), e revelados com iodo e vanilina sulfúrica.
3.7. Isolamento e identificação do metabólito principal
No experimento em escala semi-preparativa, após o período de incubação
(144 h) a biomassa, contida nos fracos Erlenmeyer, foi separada utilizando funil de
Buchner com gaze. A solução filtrada foi saturada com cloreto de sódio e novamente
filtrada em funil de Buchner contendo celite sob vácuo. Após a filltração, a solução
denominada fração aquosa foi extraída com três partes de acetato de etila (sendo
cada extração com 300 mL), formando a fração acetato de etila. Adicionou-se a esta
fração orgânica, sulfato de magnésio anidro, para eliminar alguma quantidade de
água existente. Filtrou-se em funil de vidro sinterizado e o solvente foi rotaevaporado
sob vácuo, resultando em um material oleoso, que foi seco a temperatura ambiente,
para posterior separação e purificação dos produtos formados.
A massa fúngica, ou micélio, separada durante a filtração foi extraída com
acetona (300 mL) sob agitação constante em agitador magnético por um período de
3 h, sendo posteriormente filtrada em papel de filtro. A fração orgânica obtida foi
rotaevaporada sob vácuo, resultando em uma fração cetônica. As frações acetato de
etila e cetônica, foram analisadas por cromatografia em camada delgada e os
metabólitos foram detectados e revelados.
50
A cromatografia em coluna foi utilizada para o procedimento de separação
dos metabólitos formados. Utilizou-se uma coluna com 30 cm de comprimento e 2
cm de diâmetro empacotada com sílica gel 60 (230-400 mesh). A fase móvel para
eluição dos metabólitos foi em gradiente com acetato de etila: metanol (100:0),
alterando 5% a preparação da fase móvel até se chegar em acetato de etila: metanol
(0:100).
As frações acetato de etila e cetônica, foram solubilizadas em metanol:acetato
de etila (1:1), misturadas e aplicadas na coluna. Com a eluição da fase móvel de
maneira contínua, foram coletados 5 mL em tubos de ensaio e aplicados em
cromatoplacas para acompanhamento. O monitoramento foi igual ao utilizado para a
fração acetato de etila e cetônica da escala semi-preparativa. Os tubos contendo as
frações com o mesmo Rf foram agrupados e evaporados.
As frações obtidas na separação pela cromatografia em coluna e contendo o
mesmo Rf, foram enviadas para caracterização em espectrometria de massa. As
amostras preparadas na concentração de 50 ng/mL com 2mM de acetato de amônio
e 0,1% de ácido fórmico foram envuadas para análise em espectrômetro de massa.
As análises foram realizadas através dos espectros obtidos quando estas amostras
foram analisadas por infusão direta com fluxo de 10μL/min nos espectrômetros
Micromass/Waters Quattro Micro (ZSpray®) e MDS/SCIEX API5000 (Turbo V -
Turbo Ion Spray®), nos modos “fullscan”, “precursor íon scan” e “product ion scan”.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Triagem preliminar da biotransformação
Em uma seleção de 6 cepas de fungos filamentosos foram realizados os
experimentos de triagem com a finalidade de verificar qual mirorganismo
desmetilava o fármaco (ASHA e VIDYAVATHI, 2008). Na triagem, todos os fungos
foram capazes de metabolizar a venlafaxina após o período de incubação de 144 h,
produzindo quantidades variáveis de até seis metabólitos. Os metabólitos eluidos
nas cromatoplacas foram detectadas utilizando luz UV (254 e 365 nm), e reveladas
com iodo e vanilina sulfúrica. A Tabela 1, demonstra a quantidade de metabólitos
produzidos pelas cepas no procedimento de triagem e seus respectivos valores de
Rf. Nas análises realizadas dos controles, não houve nenhuma decomposição
51
química ou qualquer outra transformação do meio de cultura e da venlafaxina nas
condições de fermentação. As manchas obtidas nas cromatoplacas para o
monitoramento da escala semi-preparativa, para a fração acetato de etila, fração
cetônica e separação por coluna cromatográfica apresentaram o mesmo R f dos
obtidos no procedimento de triagem utilizando C. elegans (ATCC6169).
Tabela 2. Detecção por cromatografia em camada delgada dos derivados da venlafaxina ao final da incubação da triagem e seus respectivos valores de Rf.
Microrganismos Metabólitos (Rf)
VEN (0,50)
I (0,07)
II (0,30)
III (0,60)
IV (0,80)
V (0,90)
VI (0,95)
Aspergillus candidus (ATCC2023)
+ - + + - + +
Beauveria bassiana (ATCC7159)
+ - - + - + +
Cunninghamella echinulata
(ATCC9244) + - - + + + +
Cunningamella elegans (ATCC26169)
+ - + + - - -
Mortierella isabelina (ATCC1757)
+ + + + + + +
Rhizopus arrhizus (ATCC11145)
+ - - + + + +
VEN: Venlafaxina; ( - ): Ausência de metabólito; ( + ): Presença de metabólito
4.2. Identificação e caracterização dos metabólitos da venlafaxina
A cepa de escolha na escala semi-preparativa foi selecionada por produzir um
único ou um pequeno número de metabólitos (ALEXANDRE et al., 2004). As
frações orgânicas obtidas após a eluição em coluna cromatográfica foram
monitoradas por cromatoplacas e aquelas que continham metabólitos com o mesmo
Rf foram analisadas no espectrômetro no modo FullScan (ALEXANDRE et al., 2004).
Os compostos foram facilmente caracterizados por espectrometria de massa e este
mostrou um íon molecular [VEN+H]+ em m/z 278,9439 correspondente a venlafaxina,
[ODV+H]+ em m/z 264,2024 para O-desmetilvenlafaxina e [VEN – OH]+ em m/z
260,9133 para dehidroxi-venlafaxina (Fig. 2). O composto com íon molecular
[ODV+H]+ em m/z 264,2024 para O-desmetilvenlafaxina demonstra a desmetilação
da venlafaxina pela C. elegans (ATCC6169) (ASHA e VIDYAVATHI, 2008).
52
Fig. 10. Espectro representativo “Full Scan” dos produtos (A) venlafaxina, (B) O-
desmetilvenlafaxina [ODV+H]+ e (C) dehidroxi-venlafaxina [VEN – H]+
Analisando os resultados da decomposição iônica ativada por colisão (CID),
para os fragmentos de O-desmetilvenlafaxina [ODV+H]+ obteve-se m/z 58.0904,
120.9395, 220.4722, 264.2498 e para a dehidroxi-venlafaxina [VEN – OH]+ obteve-
se m/z 58.0665, 81.0531, 107.0537, 121.0878, 158.1757, 177.1509, 215.1037
sendo então possível propor as estruturas correspondentes (Fig. 3) (ADJAYE et al.
2007 e PATEL et al., 2008).
53
Fig. 11. “Product Ion”: (A) Dehidro-venlafaxina para [VEN – OH]+(B) O-
desmetilvenlafaxina [ODV+H]+
Pela comparação dos pesos moleculares de dehidroxi-venlafaxina, O-
desmetilvenlafaxina e venlafaxina em análise por espectro de massa de plasma
humano descritos na literatura (ADJAYE et al. 2007 e PATEL et al., 2008), com os
metabólitos obtidos na biotransformação de venlafaxina por C. elegans (ATCC6169),
observa-se neste estudo a formação dos mesmos produtos pelo modelo microbiano
utilizando C. elegans (ATCC6169) (Tabela 2).
Tabela 3. Correlação entre os pesos molecular dos metabólitos encontrados na biotransformação de venlafaxina utilizando C. elegans (ATCC6169) com os mesmos produtos descritos na literatura em análise de plasma humano (ADJAYE et al. 2007 e PATEL et al., 2008).
Metabólito/Ven Rf MS [M +H]+ Encontrado [M
+H]+
Dehidroxi-venlafaxina 0,6 260,0 260,39
O-desmetilvenlafaxina 0,3 264,0 264,38
Venlafaxina 0,5 278,3 278,41
Ven.: venlafaxina
Para a diferenciação dos enantiômeros formados por biotransformação, deve-
se utilizar métodos analíticos enantioseletivos para a separação dos enantiômeros
de (R),(S) ODV e (R),(S) NDV. Para estas separações utiliza-se uma coluna quiral
com fase móvel normal para a diferenciação dos metabólitos enantioseletivos
54
formados da venlafaxina em estudo de biotransformação in vitro (FONSECA e
BONATO, 2010).
Mesmo não tendo isolado os metabólitos, nossos resultados indicaram que a
via de transformação microbiana produz derivados de venlafaxina e os produtos
obtidos foram similares aos encontrados em mamíferos, salientando a aplicação do
modelo microbiano para o estudo do metabolismo animal. Os nossos estudos
confirmaram ainda que a C. elegans (ATCC6169), é capaz de metabolizar fármacos,
especialmente por desmetilação conforme descrito na literatura (AZERAD, 1999;
ASHA e VIDYAVATHI, 2008 e SUN et al. 2009).
55
5. PARTE EXPERIMENTAL II - MANUSCRITO : IDENTIFICATION OF THE
MAJOR ACTIVE VETABOLITE, DESVENLAFAXINE IN EXTENDED-RELEASE
CAPSULES OF VENLAFAXINE; Revista Eletrônica de Farmácia (REF) - ISSN
1808-0804 Vol. VI (1), 39-53, 2010. (Vide anexo).
56
6. CONCLUSÕES
- As cepas Aspergillus candidus (ATCC2023), Beauveria bassiana (ATCC7159),
Cunninghamella echinulata (ATCC9244), Cunningamella elegans (ATCC6169),
Mortierella isabelina (ATCC1757) e Rhizopus arrhizus (ATCC11145)
biotransformaram a venlafaxina;
- O fungo Cunninghamella elegans ATCC 6169 foi capaz de produzir os
metabólitos em quantidades suficientes para análises estruturais em espectrometria
de massa;
- Os metabólitos obtidos neste estudo foram similares aos encontrados em
mamíferos, salientando a aplicação dos modelos microbianos para o estudo do
metabolismo animal;
- A biotransformação de venlafaxina por Cunninghamella elegans ATCC 6169,
produziu metabólitos similares aos dos mamíferos e que podem ser utilizados como
padrões de referências em análises;
- O estudo indicativo de estabilidade da condição ácida de venlafaxina, formou
dois produtos de degradação que foram caracterizados por ESI-MS/MS, os produtos
foram desvenlafaxina e a dehidroxi-venlafaxina;
- Um dos produtos de degradação corresponde ao metabólito ativo da
venlafaxina, encontrado nos mamíferos e nas reações de bioconversão por
Cunninghamella elegans ATCC 6169;
- O método de venlafaxina desenvolvido e validado por CLAE é considerado
método indicativo de estabilidade para análise de venlafaxina em cápsulas de
liberação prolongada, pois é sensível, específico, preciso, linear, exato e
reprodutível.
57
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABOURASHED, E. A.; CLARK, A. M.; HUFFORD, C. D. Microbial models of mammalian metabolism of xenobiotics: An Updated Review. Current Medicinal Chemistry, v. 6, p. 359 - 374, 1999.
ADJAYE, E. B. A. A. FAUSTINO, P. J. TAWAKUL, M. A. VOLPE, D. A. KWON, H. Validation and application of a stability-indicating HPLC method for the in vitro determination of gastric and intestinal stability of venlafaxine. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 43, p. 1854 – 1859, 2007. ALEXANDRE, V. LADRIL, S. MAURS, M. AZERAD, R. Microbial models of animal drug metabolism Part 5: Microbial preparation of human hydroxylated metabolites of irbesartan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, v. 29, p. 173 - 179, 2004. ASHA, S. VIDYAVATHI, M. Cunninghamella – A microbial model for drug metabolism studies – a review. Biotechnology Advances, v. 27, p.16 - 29, 2008.
AZERAD, R. Microbial models for drug metabolism. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, ed. K. Faber, T. Scheper, p. 169-218. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1999. BARREIRO, E. J.; FRAGA, C. A. M. Química Medicinal – As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos . 2° Ed. Porto Alegre: Ed. Artmed. 2001. cap. 1. BEDSE, G.; KUMAR, V.; SINGH, S. Stud of forced decomposition behavior of lamivudine using LC, LC-MS/TOF and MSn . Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 49, p. 55 - 63, 2009.
BERNHARDT, R. Cytochromes P450 as versatile biocatalysts. Journal of Biotechnology, v. 124, p. 128 – 145, 2006. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução nº 899, de 29 de maio de 2003. Anexo I: Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. 2003. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Resolução RE nº 1, de 29 de Julho de 2005, que apresenta um guia para a Realização de Estudos de Estabilidade, 2005. CASTRO, A, C. CONCHEIRO, M. QUINTELA, O. CRUZ, A. LOPEZ, R. M. LC–MS/MS method for the determination of nine antidepressants and some of their main metabolites in oral fluid and plasma Study of correlation between venlafaxine concentrations in both matrices. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 48, p. 183 – 193, 2008. CHATTERJEE, T.; BHATTACHARYYA, D. K. Biotransformation of limonene by Pseudomonas putida. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 55, p. 541 -
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8. ANEXO I - MANUSCRITO : IDENTIFICATION OF THE MAJOR ACTIVE VETABOLITE, DESVENLAFAXINE IN EXTENDED-RELEASE CAPSULES OF VENLAFAXINE; REF - ISSN 1808-0804 Vol. VI (1), 39-53, 2010.
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