Novas tecnologias para o diagnóstico da TB
&
Ensaio da carga bacteriana molecular para o controlo do tratamento da TB
Khalide Azam
Maputo, 08 de Novembro de 2017
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Conteúdo da apresentação
Há mais de 1 século ...
Novas tecnologias para o diagnóstico laboratorial da TB
Ensaio da carga bacteriana molecular
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Há mais de 1 século ...
1882: Robert Koch 1882: Franz Ziehl & Friedrich Neelsen
Descrição do M. tuberculosis Invenção da coloração Ziehl-Neelsen
1931 Lowestein & 1932 Jensen
Cultura sólida (padrão-ouro)
1938: Hagemann
Uso da Auramina O na microscopia de
fluorescencia
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Novas tecnologias para o diagnóstico da TB endossadas pela
OMS nos últimos 10 anos
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2007: Cultura liquida BD MGIT 960
• Multiplica e isola as micobactérias
• Tempo de resposta longo
• Susceptível a contaminação
• Requer especiação
• Amostras pulmonares e extrapulmonares
• Permite a realização dos TSA
• Laboratórios de contenção de risco
• Padrão-ouro !!!
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2008: Line Probe Assay (LPA)- Genotype MTBDRplus -
• PCR baseado no ADN da bactéria
• Complexo MTB + Rifampicina e Isoniazida
• Resultado em 2-7 dias
• Amostras de expectoração positivas
• Requer salas específicas
• Pessoal altamente treinado
• Custo elevado (baixo que Xpert)
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2010: GeneXpert® MTB/RIF
• PCR baseado no ADN da bactéria
• Complexo MTB e Rifampicina
• Resultados em 1-2 dias
• Laboratórios de baixo risco
• Exigências operacionais (AC, UPS, calibração)
• Não recomendado para controlo de tratamento
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2011: Interferon-gamma release assay (IGRAs)- QuantiFERON-TB Gold-in Tube & T-SPOT.TB -
• ELISA baseado em sangue total
• Resultado em 24 horas
• Não distingue TB latente e TB activa
• Sensibilidade(~80%), especificidade(~70%)
• Custo elevado e complexo
• Não recomendado a substituir o PPD em países com baixosrecursos (alto peso TB e/ou HIV)
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2015: Lateral Flow – Urine Lipoarabinomanan Assay (LF-LAM)
• Teste rápido (25 minutos)
• Amostra de urina (60μL)
• Diagnóstico de TB activa em 2 grupos:
✓ PVHIV com sinais e sintomas de TB e CD4 ≤100 cells/μL
✓ PVHIV gravemente doente* independente de CD4 ouCD4 desconhecido
* frequência respiratória >30/min; 39°C, frequência cardíaca > 120/min; incapaz de andar sem ajuda
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2016: Loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP)
• PCR, menos 2 horas
• Laboratório de baixo risco - POC
• Diagnóstico da TB activa
• Amostra de expectoração
• Usado para adultos e crianças
• Valor desconhecido em PVHIV com sinais e sintomas de TB
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2016: Line Probe Assay (LPA)- Genotype MTBDRsl -
• Teste inicial em pacientes TB RIFresistente ou TB MR para detectarresistência a fluoroquinolonas e drogasinjectáveis de 2a linha, em vez de TSAfenotípico baseado em cultura
• Necessidade de TSA fenotípico paraconfirmar resistências a outras drogase monitorar a emergência de drogasresistentes durante o tratamento.
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Ensaio da carga bacteriana molecular para o controlo do
tratamento da TB
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Ensaio da carga bacteriana molecular (MBLA)
• Detecção de MTB 16S rRNA por qPCR
• Específico de MTB, não susceptível a contaminação
• Curvas padrão para quantificar a carga bacteriana
• Mede a mudança na carga bacteriana à medida que o paciente responde à terapia anti-TB
• A queda na carga bacteriana corresponde ao aumento do tempo para a positividade da cultura MGIT (TTP)
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Como o MBLA funciona?
Car
gab
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og1
0 C
FU/m
l)
TTP
MG
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x 1
00
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ras)
Tempo (semanas)
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Métodos
• 4 Locais: Maputo (Moçambique), Blantyre (Malawi), Mbeyae Moshi (Tanzania)
• 178 pacientes - baciloscopia ou Xpert MTB / RIF positivo
• Cultura (MGIT, LJ) tempo de positividade (TTP) vs (MBLA) -12 semanas (3 meses) acompanhamento
• Regime de tratamento (% dos pacientes):
• RHZE (68%), HRZQ (9%), HR20ZQ (9%), HR35ZE (10%), HR20ZM (10%)
• 1768 amostras analisadas em série
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Definições
• Resposta ao tratamento: mudança na carga bacteriana outempo de positividade da cultura
• Carga bacteriana: Taxa de alteração na carga bacterianadurante o período de tratamento
• Conversão: carga bacteriana zero ou cultura negativa semreversão para positivo durante o tratamento
• Falência: positividade da cultura no 5 ou 6 mês
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Resultados
• Gênero : 128 (72%) masculinos, 50 (28%) femininos
• HIV: 47 (26.4%) positivos
• TB Sensível: 164 (92%)
• TB Resistente
• 7 (4%) Z monoresistente
• 3 (1.7%) HZ poliresistente
• 4 (2.5%) MDR
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Reproducibilidade do MBLA nos laboratórios
Car
gab
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0 C
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l)
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MBLA vs TTP Cultura líquidaC
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Visita de tratamento (semanas) Visita de tratamento (semanas)
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Inconsistência: MBLA vs Cultura líquidaC
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l)
Visita de tratamento (semanas) Visita de tratamento (semanas)
MBLA MGIT
Tem
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Cultura líquida perdido por contaminação
Time on treatment (weeks)
Pro
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de
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(%)
Visita de tratamento (semanas)
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Resposta ao tratamento
• A carga bacteriana (CB) diminuiu de 5,6 ± 1,3 na linha de base para 0,7 ± 0,4 log10CFU/ml na semana 12 do tratamento
• O TTP MGIT aumentou de 5 dias na linha de base para 25 dias na semana 12
• O declínio da CB foi correlacionada ao aumento do TTP Cultura líquida, p <0,001 (correlação de Spearmans)
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Resposta ao tratamento
• A carga bacteriana perdida foi de 0,7 ± 0,4 log10CFU/ml /semana
• 46% resposta rápida: 1,4 ± 0,4log10CFU/ml/semana
• 54% resposta lenta: 0,4 ± 0,4 log10CFU/ml/semana
• Resposta por perfil de resistência:
✓ TB susceptível: 0,6 ± 0,2 log10CFU / ml / semana
✓ Monoresistente (Z) TB: 0,7 ± 0,4log10CFU / ml / semana
✓ Poliresistente (HZ): 0,7 ± 0,3 log10CFU/ml/semana
✓MDR (RHZE): TB: 0,5 ± 0,1log10CFU/ml/semana
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Desfecho do tratamento
• 63% Curados (cultura negativa aos 5 e 6 meses)
• 27% Contaminados - Situação da TB desconhecida aos 5 e 6 meses
• 10% (17) Falência de tratamento (cultura positiva aos 5 e 6 meses)
Destes, os resultados na semana 8 foram:
✓ MBLA: 53% (9/17) como TB positivo
✓ MGIT: 12% (2/17) como TB positivo
✓ LJ: 0% (0/17) como TB positivo
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Conclusões
• Métodos rápidos para o diagnóstico e controlo detratamento da tuberculose são uma necessidade
•O MBLA:
✓ Determina a carga bacteriana e resposta ao tratamentoem tempo real
✓ Reproduzível em diferentes configurações laboratoriais
✓ Não necessita de testes extras para confirmar oresultado
✓ Baixa necessidade de biossegurança, poderia serrealizada em laboratórios de baciloscopia.
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Agradecimentos
• University of St. Andrews, UK
• University College London, UK
• University of Liverpool, UK
• University of Leicester, UK
• University of Munich, Germany
• Radboud University, Netherlands
• Instituto Nacional de Saúde, Mozambique
• Kilimanjaro Clinical Research Institute, TZ
• Mbeya Medical Research Institute, TZ
• College of Medicine, Malawi
PANBIOME consórcio
• Prof. Stephen H Gillespie, Dr. Wilber Sabiiti & Dr. Gerry Davies, United Kingdom
• Dr. Ilesh Jani, Dr. Nilesh Bhatt, Dr CelsoKhosa, Mr. Khalide Azam & Dr. Sofia Viegas, Mozambique
• Prof. Gibson Kibiki, Dr. Nyanda Elias Ntinginya, Mr. Davis Kuchaka & Mr. BarikiMtafya, Tanzania
• Dr. Margaret Khonga, Dr. Elizabeth Kampira, Mr. Aaron Mdolo & Ms. Mercy Kamdolozi, Malawi
Equipa de pesquisa
• Pacientes
Obrigado pela atenção