Técnicas de análise de proteínas

Estrutura secundária da enzima COMT

Fundamento e aplicação das técnicas de análise de proteínas

• Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

• Hibridação Western

• Electroforese bidimensional (2D-PAGE)

• Imunoprecipitação

• Sistema de dois híbridos em levedura

• Sistema de phage display

• Espectrometria de massa

Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (1)

A velocidade de migração em campo eléctrico depende da dimensão, forma e carga das moléculas.

Para a desagregação e desnaturação das proteínas utiliza-se SDS, β-mercaptoetanol ou DTT (agentes redutores) e calor.

O SDS (detergente fortemente aniónico) confere às proteínas carga negativa.

SDS-PAGE (2)

Coloração do gel com azul de coomassie

Electrotransferência de proteínas

Hibridação Western (Imuno-hibridação) (1)

Em (A) e (B) foram utilizados anticorpos da distrofina diferentes.

A hibridação Western detecta proteínas que foram separadas por electroforese em gel de poliacrilamida e transferidas para uma membrana.

Hibridação Western (2)

Esta técnica permite detectar a presença ou ausência de uma proteína que reage com o anticorpo; determinar a sua dimensão e avaliar os níveis relativos de expressão em diferentes amostras. A dimensão da proteína na amostra 5 é diferente, talvez devido a modificação pós-traducional.

Electroforese bidimensional (2D-PAGE)

Gel de focagem isoeléctricaNa análise de proteomas a matriz é de poliacrilamidacom um gradiente de pH imobilizado (IPG) para haver maior reprodutibilidade nos resultados.

SDS-PAGE

Proteínasacídicas

Proteínas básicas

pI intermédio

O ponto isoeléctrico (pI) é a posicão em que a carga da proteína é neutra relativamente ao pH local.

A pH elevado as proteínas estão negativamente carregadas. A pH baixo as proteínas estão positivamente carregadas.

Poder de resolução do gel bidimensional

As imagens representam prroteínas do fígado de ratinho separadas por 2D-PAGE e coradas com nitrato de prata.No gel em que a gama de pH é mais larga (3-12) a maioria das proteínas estão concentradas no meio, reflectindo o facto de que a maioria das proteínas têm valores de pI na gama 4-7.Uma proteína pode ocorrer em diferentes posições num gel 2D, por exemplo como consequência de diferenças na modificação pós-traducional.

A gama de pH mais estreita aumenta o poder de resolução das proteínas.

Imunoprecipitação

Proteínas radioactivamente marcadas são incubadas com um anticorpo, que forma complexos com a proteína (o antigénio) contra a qual é dirigido. Estes complexos antigénio-anticorpo são colhidos em esferas que se ligam ao anticorpo e isolados por centrifugação. As esferas são fervidas para dissociar os complexos, e as proteínas recuperadas são analisadas por SDS-PAGE. A proteína radioactiva que foi imunoprecipitada é detectada por auto-radiografia.

Sistema de dois híbridos em levedura (1)

Figure 8-51. © 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter..

O sistema de dois híbridos em levedura permite detectar in vivo interacções proteína-proteína.

Fundamento

Fundamento:A proteína alvo é fundida com o domínio de ligação a DNA que a localiza na

região reguladora de um gene repórter, onde funciona como “isco” (bait). Quando esta proteína alvo se liga a uma outra proteína (“presa”, prey), no núcleo da célula, especificamente construída em fusão com o domínio de activação da transcrição, a sua interacção leva à aproximação dos dois módulos do activador transcricional, o que desencadeia a expressão do gene repórter.

O gene repórter, em geral, permite o crescimento em meio selectivo (Ex.: gene His3). Também se utiliza como gene repórter lacZ.

As proteínas de fusão bait e prey são obtidas por técnicas padrão de DNA recombinante.

Na maioria dos casos, uma única proteína bait é utilizada para pesquisar outras proteínas com as quais interage, partindo de um conjunto de proteínas preyproduzidas por ligação do DNA codificante do domínuio de activação de um activador transcricional a fragmentos de DNA de uma biblioteca de cDNA.

Sistema de dois híbridos em levedura (2)

Sistema de dois híbridos em levedura (3)

Procedimento

Sistema de dois híbridos em levedura (4)

Os domínios do factor de transcrição não têm de estar covalentemente ligados, mas devem formar uma proteína dimérica. Os factores de transcrição funcionais são detectados pela activação de um gene repórter.

Sistema de dois híbridos em levedura (5)

Os falsos positivos são devidos a:

• Autoactivação espontânea do gene repórter pelo bait ou pelo prey • Interacção não específica • Interacção irrelevante porque ocorre entre proteínas encontradas em compartimentos separados.

Os falsos negativos são devidos a:

• Erros de PCR na produção de cDNA• Condições não fisiológicas, uma vez que o teste ocorre no núcleo e as proteínas de outros compartimentos podem não adquirir a conformação ou a agregação correcta.

Vectores de clonagem utilizados no sistema de dois híbridos em levedura

Sistema de phage display (1)

O gene III codifica uma proteína secundária da cápside do fago f1.O local de clonagem está situado na região que corresponde à extremidade N-terminal da proteína codificada pelo gene III.Uma biblioteca fágica de expressão é produzida a seguir à transfecção de E. coli.

O phage display é uma forma de clonagem de expressão de genes estranhos em fagos. Os cDNAs são clonados de modo a expressar proteínas estranhas na superfície dos fagos, o que permite o estudo de interacções proteína-proteína in vitro.

Sistema de phage display (2)

Os recombinantes com insertos na mesma fase de leitura do gene III originam proteínas de fusão em que o componente N-terminal consiste na sequência da proteína estranha.

Sistema de phage display (3)

A purificação de afinidade utilizando um anticorpo específico de uma das proteínas estranhas permite a identificação de sequências de cDNA que codificam a proteína não caracterizada.

Sistema de phage display (4)

As bibliotecas de phage display são utilizadas na triagem de proteínas ou péptidos com propriedades farmacológicas, enzimáticas ou antigénicas.

A identificação de um péptido que se liga a um ligando pode ter utilização directa na investigação de um agente terapêutico ou fornecer informação acerca da sequência parcial de uma proteína maior de ligação ao ligando.

Genómica é o estudo de genomas completos. Genoma é a informação genética total numa célula particular ou organismo.

Transcritómica é o estudo do transcritoma. Transcritoma é a população de mRNAs expressos numa única célula ou tipo de célula.

Proteómica é o estudo do proteoma. Proteoma é o conjunto completo de proteínas codificadas pelo genoma.

A era pós-genómica

Limitações da genómica

• O número de genes (ORFs) encontrados no genoma humano é muito menor do que o número de proteínas expressas (splicing alternativo, modificações pós-traducionais, clivagem proteolítica) e por isso, é necessária mais informação acerca das “unidades funcionais” da célula.

• O genoma é na sua maioria estático (numa geração) enquanto o proteoma é mais dinâmico – ciclo celular, desenvolvimento, resposta ao ambiente.

• Os níveis de mRNA, em geral, não têm correlação com os níveis de expressão proteica (diferente estabilidade dos mRNAs e diferentes eficiências de tradução).

• A maioria das modificações pós-traducionais vulgarmente observadas nas proteínas não podem ser estudadas ou previstas com rigor a partir do genoma.

Espectrometria de massa

• A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que permite determinar a massa molecular de proteínas/péptidos e a sequência de aminoácidos.

• Esta informação é utilizada para identificar a proteína, pesquisando bases de dados de sequências de nucleótidos e de proteínas.

• Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas.

Espectrómetro de massa

A maioria dos espectrómetros de massa possuem:

• Uma fonte de ionização (produz iões – moléculas carregadas)

• Um ou mais analisadores de massa (separa os iões)

• Um detector (conta iões)

AmostrasAmostras22--DEDE

Analisador deAnalisador demassamassa

FonteFonte de de ionizaçãoionização DetectorDetector

Sistema de Sistema de recolha de recolha de

dados dados

Sistema de vácuoSistema de vácuo

Minimiza colisões, interferências

Espectrometria de massa em tandem

Genetics – From Genes to Genomes

Análise da expressão génica

Os parâmetros importantes na expressão génica são o material de estudo, a resolução da expressão e a eficiência (o número de genes/proteínas que podem ser analisados de uma só vez).

O conhecimento da biologia molecular das células torna experimentalmente possível partir do estudo do gene para a proteína e da proteína para o gene.Uma pequena quantidade de proteína purificada é utilizada para se obter uma sequência parcial de aminoácidos. Esta informação permite identificar o gene correspondente numa biblioteca de DNA. Uma vez clonado o gene, a sequência codificante da proteína pode ser inserida num vector de expressão de modo a produzir grandes quantidades da proteína a partir de células obtidas por engenharia genética.

Da proteína ao gene e do gene à proteína (1)

Da proteína ao gene e do gene à proteína (2)

Engenharia de proteínas

• Alteração da composição de bases e/ou dos codões do gene para melhorar a sua expressão.

• Introdução de alterações específicas na sequência de DNA para melhorar as características da enzima (aumentar a especificidade pelo substrato).

• Produção de proteínas totalmente novas.