Epigenética. Fenómeno Epigenético Qualquer actividade reguladora de genes que não envolve...

Epigenética

Fenómeno Epigenético

• Qualquer actividade reguladora de genes que não envolve mudanças na sequência do DNA (código genético) e que pode persistir por uma ou mais gerações

Territórios cromossómicos

Espaços intercromáticos

Territórios cromossómicos eEspaços intercromáticos

O início da epigenética

• 1990’s– Descobertas metilases de DNA em C – Metilação representada na maioria dos animais, vegetais e

fungos

• 1993– Stephen Baylin et al

• Metilação do Gene de Supressão Tumoral p16 numa variedade de tumores humanos

• Tratamento destas células com agentes desmetilantes repõe a actividade do gene

– Extensa metilação em promotores de outros genes de supressão tumoral

Mecanismos conhecidos de regulação epigenética

• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

Metilação

• A 5ª base 5-metil citosina

A metilação inactiva os genes

Papel da Metilação/desacetilação na repressão do genoma

Mecanismos conhecidos de regulação epigenética• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

Código das histonas (I)

• 1993 Alan Wolffe– Acetilação das histonas altera o acesso de outras

proteínas ao DNA (abre o cromossoma)• Acetilases/Desacetilases formam complexos com factores de

transcrição que ligam/desligam os genes

• 1998 Adrian Bird et al.– Mostrou que as desacetilases podem funcionar em

conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inactiva os genes

Código das histonas (II)

• 2000 Thomas Jenuwein– Identificou uma metilase de histonas, mostrando que

actuam sobre o mesmo local das histonas que as acetilases

• 2001 Tony Kouzarias– Metilação de histonas desliga os genes

Metilação da H3

permite a ligação

da HP1, o que

silencia os genes

Modelos de modificação eu/heterocromática por alteração de histonas

Formation of heterochromatin silences gene expression at telomeres and other regions

Silent genes in mating-type control in yeast

Several genes encode proteins that bind specifically to silent loci at yeast telomeres

Schematic model of silencing at yeast telomeres

Repressors and activators can direct histone deactylation at specific genes

Mecanismos conhecidos de regulação epigenética• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

Silenciamento do RNA

-RdDM = RNA directed DNA methylation

-PTGS = Post translational gene silencing

-RNAi = RNA interference

siRNA= small interfering RNA

RISC = RNA induced silencing complex

CMT = chromomethylase

DNMT= DNA methyltransferase

IR = inverted DNA repeats

SC = single copy genes

cRdRP= cellular RNA dependent RNA pol

DICER/CAF = RNAse III type enzimes

Epigenética

• Metilação do DNA• Modificação das Histonas

– Metilação– Acetilação– Fosforilação

• Silenciamento do RNA– RNA directed DNA methylation– Postranscriptional gene silencing– RNA interference (RNAi)

• Imprinting• A Epigenética em Análises Clínicas

Imprinting (I)

• Marcação permanente dos genes passados por cada um dos progenitores

• Fenómeno conhecido há pelo menos 3,000 anos– Égua+Burro Mula– Cavalo+Burra Machohá efeitos específicos do genero nos cruzamentos

Imprinting (II)

• 1991– Igf2r– H19– Igf2 (activo só se herdado do pai)

• 2001– Mais de 40 genes com efeito de imprinting

• mecdin• UBE3A• p53 (gene de supressão tumoral envolvido no neuroblastoma)

• peg3• igf2• ... ...

Activos só se herdados da mãe

Prader-willi e Angelman syndromes

Afectam o desenvolvimento embrionário

Imprinting (III)

• Metilação está habitualmente envolvida quer activando quer

inactivando os genes

• Genes imprinted estão presentes em clusters

– Ex:• H19/Igf2 (11p15.5)

• DKK1/GTL2 (14q32)

• Um dos genes origina 1 proteína o outro RNA não traduzido (cerca de 25% dos

genes imprinted não originam proteínas)

• Os genes são separados por ilhas CpG as quais são locais de ligação de CTCF,

formando uma fronteira cromossómica

Imprinting (IV)

Implicações do imprintig

• Necessidade de:– Remover as marcas de imprinting cedo na

gametogénese– Criar novas marcas de imprinting durante a

gametogénese

A epigenética em análises clínicas(I)• Bibliografia crescente implicando epigenética em patologias (ex: tumores)

– Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation Eric Lander, Rudolf Jaenisch Nature Genetics, vol 27, January 2001

– Cancer epigenetics comes of age. Jones PA, Laird PW. Nat Genet. 1999 Feb;21(2):163-7.PMID: 9988266; UI: 99140765

– DNA methylation in health and disease.Robertson KD, Wolffe AP Nature Reviews Genetics. 2000 October, Vol.1:11-19

– DNA methylation. Singal R, Ginder GD. Blood. 1999 Jun 15;93(12):4059-70. PMID: 10361102; UI: 99290759

– DNA methylation: past, present and future directions. Robertson KD, Jones PA. Carcinogenesis. 2000 Mar;21(3):461-7. PMID: 10688866; UI: 20156136

– Current Topics in Microbiology and Immunology. Vol. 249: DNA Methylation and Cancer edited P. A. Jones, P. K. Vogt Springer-Verlag (2000) pp. 170.

– Behind the Scenes of Gene Expression Elizabeth Pennisi, Science Aug 10 2001: 1064-1067

A epigenética em análises clínicas(II)

• Patologias com envolvimento da Epigenética– Sindroma do X frágil– Sindroma de Rett– Sindroma ICF (Imunodeficiencias,Instabilidade centromérica

e Anomalias Faciais) (Mutações na DNA metiltransferase 3B (DNMT3B))

– Genes de supressão tumoral em tumores– Deficiencias de imprinting genético– Envelhecimento– Doenças cardiacas

Métodos para o Estudo Epigenético

1 -Alteração de Histonas

Analysis of the acetylation state of histones in chromatin associated with a specific region of the genome

Métodos para o Estudo Epigenético

2 –Metilação do DNA

Diagrama geral dos Métodos para estudo de mCpG

Determinação de conteudo global de mCpG

• Hidrólise– Química

– Enzimática

• Marcação fluorescente c/ cloroacetaldeído

• Metilação in vitro com SssI e Leitura por southern Blot

Leitura por HPLC / HPCE

*=ethenocytosine / ethenoadenine (Fluorescentes)

In Situ DNA methylation

• Metilação in vitro seguida de imunoprecipitação• Utilização de anticorpos anti-mCpG

Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos

Métodos enzimáticos

Southern Blot and PCR

• Utilizar uma enzima de restrição que distingue a sequencia metilada da não metilada

Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos

Tratamento com bissulfito

• C U• mC mC

Methylation specific PCR

• Tratamento com bissulfito

• Duas reacções de PCR– 1 primer terminando na sequencia complementar de C– 1 primer terminando na sequencia complementar de U

Sequenciação / Pyrosequenciação

• Tratamento com bissulfito Sequenciação

• Tratamento sem bissulfito Sequenciação

• As diferenças (CT) correspondem a C

• As semelhanças (CC) correspondem a mC

pirosequenciação

• Razão entre altura dos picos C/T é proporcional á metilação

Detecção de mudança na Tm

• Tratamento com Bissulfito

• Leitura por:– DGGE– TTGE

Detecção de Alterações de conformação

• Tratamento com bissulfito

• Desnaturação

• Leitura por:– HA– DGGE– SSCP– DHPLC

Primer extension (PE)

Real-Time-PCR followed By Tm analysis

Methylight

• Tratamento com bissulfito– Ex: CpG genome DNA modification kit (QBiogene)

• Real-Time-PCR

• Uso de sondas FRET ou Taqman:– 1 específica para a sequencia terminada em C

• Se produz sinal há metilação

– 1 específica para a sequência terminada em U• Se produz sinal não há metilação

PE-DHPLC ou PE-CE (Electroforese Capilar)