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UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCOCURSO DE FARMÁCIACAMPUS CAMPINAS
UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE ESPECTROMETRIA DEINFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) PARA ANÁLISE QUANTITATIVA
Alessandra A. de S. Cirino
Vanessa C. de S. Ildefonso
Campinas
2011
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UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCOCURSO DE FARMÁCIACAMPUS CAMPINAS
GUIA DIDÁTICO PARA UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DEESPECTROMETRIA DE INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) PARA
ANÁLISE QUANTITATIVA
Alessandra A. de S. Cirino
Vanessa C. de S. Ildefonso
Monografia da disciplina de Trabalhode Conclusão de Curso deGraduação em Farmácia daUniversidade São Francisco, campusde Campinas
Orientação: Prof.ª Drª. Iara LúciaTescarollo Dias
Campinas
2011
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente à Deus por sua graça, sua misericórdia e pelas forças que tem renovado
a cada manhã.
A nossas famílias que contribuíram grandemente para que pudéssemos superar os
desafios.
A todos os profissionais que colaboraram com as experiências e ensinamentos, para a
conclusão deste trabalho.
Aos amigos e colegas pelo companheirismo em relação à conclusão desta jornada.
Aos professores que durante todo esse período nos capacitaram, dando condições para
juntos trilhamos uma etapa importante de nossas vidas.
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RESUMO
O presente trabalho tem como objetivo elucidar de forma didática a utilização da técnica
para fins quantitativos, assim como trazer exemplos práticos e as principais vantagens
e desvantagens da técnica de Quantificação de Compostos Químicos através de
Infravermelho Próximo (NIR). A técnica de espectrometria de infravermelho (IV) ou
infrared (IR) é a medição de comprimento de onda e intensidade da absorção de luz
infravermelha próxima realizada pela amostra. A luz infravermelha próxima se estende
em uma faixa de 800 nm - 2.500 nm (12,500 - 4000 cm-1) e tem energia suficiente para
excitar sobretons e combinações de vibrações moleculares a altos níveis de energia. Aespectrometria NIR é tipicamente usada na identificação de grupos funcionais
orgânicos, especialmente O-H, N-H, e C=O. Os limites de detecção são normalmente
0.1% e as aplicações mais comuns incluem análises farmacêuticas, agrícolas,
poliméricos e clínicos. Os componentes e o design do instrumental do NIR são similares
aos espectrômetros de absorção UV-Vis. A fonte de luz normalmente é uma lâmpada
de tungstênio e o detector é um detector de Sulfato de Chumbo estado sólido. Os
recipientes para a amostra podem ser de vidro ou quartzo e os solventes típicos são
Tetracloreto de Carbono e Dissulfeto de Carbono. O instrumental da espectroscopia de
infravermelho próximo (NIR) comparado com a espectroscopia de infravermelho
tradicional torna-o mais adequado para o monitoramento on line e o controle de
processos.
Palavras-chave: espectrometria, luz infravermelha próxima, radiação.
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ABSTRACT
This study aims to elucidate in a didactic manner using the technique for quantitative as
well as bring practical examples and the main advantages and disadvantages of the
quantification of chemical compounds using Near Infrared (NIR). The technique of
infrared spectroscopy (IR) or infrared (IR) is the measurement wavelength and intensity
of the absorption of near-infrared light held by the sample. Near-infrared light extends
over a range of 800 nm - 2,500 nm (12,500 - 4000 cm-1) and have enough energy to
excite overtones and combinations of molecular vibrations to higher energy levels. NIR
spectrometry is typically used to identify organic functional groups, especially OH, NHand C = O. The detection limits are typically 0.1% and the most common applications
include pharmaceutical, agricultural, polymer and biological. The components and
design of NIR instrumentation are similar to the absorption spectrometers UV-Vis. The
light source is usually a tungsten lamp and the detector is a detector of lead sulfate
solid. The sample containers can be glass or quartz and typical solvents are carbon
tetrachloride and carbon disulfide. The instruments of near-infrared spectroscopy (NIR)
compared to traditional infrared spectroscopy makes it more suitable for on-line
monitoring and process control.
Keywords: spectrophotometry, near-infrared light, radiation.
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LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASTM American Society for Testing and Material
CG Cromatografia Gasosa
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
FIR Infravermelho Longíquo
FTIV Transformada de Fourier
ICH International Conference on Harmonisation’s
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IR ou IV Infrared ou Infravermelho
MID Infravermelho Médio
MLR Regressão Linear Múltipla
NIR Near Infrared ou Infravermelho próximo
NIRR Reflexão no infravermelho próximo
PLS Regressão por quadrados mínimos parciais
PCR Regressão por Componentes PrincipaisUSP United States Pharmacopoeia
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparativo das características das técnicas analíticas
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Experimento de William HershellFigura 2: Modos de Vibrações Moleculares
Figura 3: Espectro de Etanol.
Figura 4: Tipos de radiação
Figura 5: Espectrômetros Dispersivos
Figura 6: Espectrômetros com Transformada de Fourier
Figura 7: Componentes básicos de um equipamento que opera na região do
infravermelho.
Figura 8: Construção da matriz X para calibração multivariada.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................01
2. JUSTIFICATIVA..........................................................................................................06
3. OBJETIVO...................................................................................................................06
4. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................08
5. RESULTADOS............................................................................................................09
5.1. Definição..............................................................................................................09
5.2. Princípio da espectroscopia no infravermelho.....................................................11
5.3. Tecnologias..........................................................................................................14
5.3.1. Tipos de radiação infravermelha................................................................145.3.2. Evolução Tecnológica................................................................................15
5.3.3. Espectrômetros dispersivos.......................................................................15
5.3.4. Instrumentos não dispersivos.....................................................................16
5.3.5. Espectrômetros com Transformada de Fourier.........................................17
5.4. Principais componentes de um equipamento de infravermelho...................18
5.5. Processamento de Dados.............................................................................20
5.5.1. Quimiometria..............................................................................................20
5.5.2. Análise Multivariada...................................................................................22
5.5.3. Calibração...................................................................................................23
5.5.4. Regressão Linear Múltipla – MIR...............................................................23
5.5.5. Regressão por Componentes Principais....................................................26
5.5.6. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais............................................26
5.5.7. Detecção de amostras anômalas – Outliers..............................................27
5.6. Aplicações da Espectroscopia e da Quimiometria na análise de medicamentos
.........................................................................................................................................28
6. DISCUSSÃO...........................................................................................................30
7. CONCLUSÃO.........................................................................................................35
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................36
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1
1. INTRODUÇÃO
Os medicamentos vêm sendo cada vez mais objetos de preocupação e de
inúmeras pesquisas realizadas mundialmente. Estas pesquisas dizem respeito à prática
médica, reações adversas, aumento e disseminação de resistência bacteriana à
antibióticos, padrão e influência da propaganda na prescrição de medicamentos na área
clínica, como também na área odontológica (CASTILHO, PAIXÃO, PERINI, 1999).
Por tais razões, é de enorme importância o desenvolvimento de métodos
eficazes e rápidos para maior controle de qualidade dos medicamentos
comercializados, tornando-se imprescindível o desenvolvimento de rotinas de análisesque, além de servirem para este propósito, favoreçam sua implantação em comparação
aos métodos usuais (PARISOTTO et al., 2005).
Havendo a necessidade de métodos rápidos, versáteis, confiáveis, capazes de
emitir resultados em tempo real, como alternativas eficazes aos métodos tradicionais.
O infravermelho e demais métodos espectroscópicos modernos como a
ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia na região do ultravioleta–visível
(UV-VIS) e espectrometria de massas (EM) constituem hoje os principais recursos para
a identificação e elucidação estrutural de substâncias orgânicas. São, também, de alta
relevância na determinação da pureza e quantificação de substâncias orgânicas, bem
como no controle e acompanhamento de reações e processos de separação. O uso dos
referidos métodos físicos de análise traz uma série de vantagens, destacando-se a
redução no tempo de análise, diminuição substancial nas quantidades de amostra,
ampliação da capacidade de identificar ou caracterizar estruturas complexas, não
destruição da amostra (exceto EM) e a possibilidade de acoplamento com métodos
modernos de separação, como a cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A espectroscopia na região do
infravermelho tem sido, também, amplamente utilizada em linhas de produção, no
controle de processos industriais (LOPES,FASCIO,2004).
A radiação na região do infravermelho foi descoberta por William Herschel, um
astrônomo inglês que, em 1800, estava investigando qual cor da radiação solar
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produzia calor. Ele empregou um prisma de vidro, transparente à radiação, para
decompor a luz branca do sol em seus comprimentos de onda visíveis e, com o auxílio
de um termômetro com um bulbo enegrecido, pôde verificar a temperatura produzida
por cada cor. Surpreendentemente, a mais intensa variação de temperatura foiobservada quando o termômetro foi colocado logo acima da região vermelha do
espectro. Herschel chamou esta radiação de “raios caloríficos”, que mais tarde foi
denominada Infravermelho (LIMA et al. 2009).
Atualmente, a espectroscopia na região do infravermelho tem se destacado
como técnica analítica, proporcionando métodos rápidos, robustos, não-destrutivos,
não-invasivos, possibilitando aplicações automáticas e em tempo real. Muitos dos
métodos baseados na espectroscopia na região do infravermelho médio (MID) ou naregião do infravermelho próximo (NIR) empregam um feixe de fibras ópticas para
efetuar medidas de reflectância ou transflectância diretamente na amostra, sem a
necessidade de pré-tratamento. Esta peculiaridade é facilmente explicada considerando
que as fibras ópticas conferem muitas vantagens para medidas em campo e na análise
de processos, uma vez que a sonda de fibra óptica “vai” até a amostra, mesmo em
locais de difícil acesso, mantendo o instrumento longe de ambientes hostis. Muitos dos
métodos analíticos no infravermelho são baseados nas propriedades intrínsecas dos
constituintes da amostra e o sinal analítico resulta da interação da radiação
eletromagnética com os níveis vibracionais das moléculas. Neste sentido, os métodos
no infravermelho baseados em fibras ópticas podem ser classificados no escopo de
sensores ópticos, uma vez que a fibra óptica atua passivamente como guia de luz. Este
tipo de sensor pertence à primeira geração, possibilitando o sensoriamento remoto
desde que uma propriedade óptica intrínseca da amostra possa ser distinguida. Em
outras palavras, o analito fornece a informação analítica diretamente, por meio de
absorção ou emissão de radiação (LIMA et al. 2009). A espectroscopia no infravermelho vem sendo amplamente estudada, como por
exemplo, a técnica de reflexão no infravermelho próximo (NIRR) que abrange a faixa
entre 1300 a 2500 nm, que vem sendo utilizada em análises farmacêuticas (BLANCO et
al., 1999a; HERKERT, PRINZ, KOVAR, 2001; PASQUINI, 2003).
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3
Até recentemente, a espectroscopia na região do infravermelho era pouco
utilizada em análises quantitativas em decorrência de algumas limitações inerentes à
técnica (DE SOUZA, FERRÃO, 2006). Porém, com a utilização da transformada de
Fourier, aliada à evolução de técnicas quimiométricas, ao advento dosmicroprocessadores digitais e de técnicas computacionais avançadas, permitiu-se a
análise de misturas complexas, como os medicamentos (DE SOUZA et al., 2004).
Associada ao crescente desenvolvimento do método de refletância difusa, este tipo de
análise garante a caracterização de fármacos com extrema rapidez (DE SOUZA,
FERRÃO, 2006). A identificação destas substâncias pode ser alcançada tanto
quantitativamente como qualitativamente através da espectroscopia por refletância
difusa no infravermelho com transformada de Fourier (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy - DRIFTS) (YANG, IRUDAYARAJ, 2002), aliada a
ferramentas quimiométricas de análise multivariada (NEUMANN et al., 2004;
PARISOTTO et al., 2005).
A espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier é uma técnica
instrumental que vem sendo amplamente utilizada no controle de qualidade de
fármacos, principalmente, pela rapidez e facilidade com que podem ser obtidos os
espectros. Deve-se destacar, também, que a combinação da espectroscopia de
infravermelho com as ferramentas quimiométricas (análise exploratória de dados e
calibração multivariada) vem colaborando para a disseminação do infravermelho como
ferramenta analítica na indústria, pois, além de quantificar o medicamento já acabado,
permite controlar o processo de fabricação do medicamento (monitoramento on-line) e
obtenção de informações que não poderiam ser alcançadas com as técnicas
convencionais de análise (GABRIELSSON; LINDBERG; LUNDSTEDT, 2002).
A interpretação de espectros de infravermelho de substâncias orgânicas é uma
tarefa que, devido ao grande número de informações que devem ou precisam ser manipuladas, geralmente apresenta dificuldades para os alunos e profissionais
iniciantes. Assim, é necessário um meio para, de modo sistemático, interpretar um
espectro na região do infravermelho e propor uma possível estrutura molecular. Os
livros textos geralmente apresentam tabelas de correlação entre as absorções de
estiramento e deformação, em número de onda (4000 - 400 cm-1) e/ou comprimento de
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onda (2,5 - 25 μm), e os respectivos grupos funcionais ou ligações químicas
correspondentes. Não há, contudo, uma preocupação com a sistematização de um
caminho que possibilite aos alunos, assim como demais profissionais analisar um
espectro infravermelho, obter informações sobre as principais ligações e gruposfuncionais de uma determinada substância orgânica e, finalmente, propor uma possível
estrutura (LOPES,FASCIO,2004).
Para facilitar a quantificação de compostos químicos através da técnica de IV
NIR, associa-se a calibração multivariada, possibilitando métodos seguros e práticos
para várias quantificações, como por exemplo: teor de proteínas, umidade, entre outros.
(LIMA et al., 2009).
Em métodos de Calibração Multivariada duas ou mais respostas instrumentaissão relacionadas com a propriedade de interesse. Esses métodos possibilitam análises
mesmo na presença de interferentes, desde que estejam presentes nas amostras de
calibração, determinações simultâneas, análises sem resolução etc. Isso faz com que,
modelos de Calibração Multivariada sejam uma alternativa quando métodos univariados
não podem ser aplicados. Diversos modelos de calibração multivariada vêm sendo
utilizados, tais como Regressão Linear Múltipla (MLR), Regressão por Componentes
Principais (PCR) e Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS). Esses modelos
têm apresentado ótimos resultados, com aplicações em diversas áreas. Contudo, sua
aceitação e implementação têm sofrido restrições em alguns setores, como as áreas
farmacêutica e médica, devido às exigências de validação. Essa validação é feita com
base no cálculo e análise das chamadas figuras de mérito, que certificam que o modelo
multivariado proposto é confiável e atende às especificações impostas pela indústria e
órgãos de fiscalização nacionais e internacionais como “United States Pharmacopoeia”
(USP), “International Conference on Harmonisation’s” (ICH), “American Society for
Testing and Materials” (ASTM), Instituto Nacional de Metrologia, Normalização eQualidade Industrial (INMETRO), Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
etc. (BRAGA, POPPI, 2004).
Os fabricantes de equipamentos disponibilizam diferentes softwares, que utilizam
métodos matemáticos e estatísticos para o máximo aproveitamento das informações
obtidas, têm sido desenvolvidos e aplicados para tratar estes tipos de dados, sendo o
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da regressão por quadrados mínimos parciais (PLS) um dos mais empregados. Embora
nem sempre ocorram relações lineares entre os sinais espectroscópicos e as medidas
da concentração total das espécies contidas na amostra, estes procedimentos já foram
aplicados com sucesso em análises de matrizes complexas, fornecendo resultadosrápidos, precisos e exatos (LIMA et al., 2009).
O presente trabalho tem como objetivo elucidar a utilização da técnica para fins
quantitativos, assim como trazer exemplos práticos e as principais vantagens e
desvantagens da técnica de Quantificação de Compostos Químicos através de
Infravermelho Próximo (NIR). Contribuir de forma a facilitar a tarefa de análise e
interpretação de espectros de infravermelho, estabelecendo um caminho bjetivo e
prático que permita a quantificação de compostos químicos. O trabalho foi desenvolvidoatravés de pesquisa bibliográfica de artigos publicados, literaturas auxiliares (manuais
de equipamentos) e livros e experiência prática de usuários da técnica.
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6
2. JUSTIFICATIVA
Apresentar uma nova alternativa para a quantificação de compostos químicos
através da técnica de Infravermelho Próximo (NIR), em substituição aos métodos
tradicionais (Cromatografia Líquida, Cromatografia Gasosa, UV/Vis).
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3. OBJETIVO
Elucidar a utilização da técnica para fins quantitativos, as principais vantagens e
desvantagens da técnica de Quantificação de Compostos Químicos através de
Infravermelho Próximo (NIR), de modo a facilitar a utilização da técnica por alunos e
também profissionais ingressantes na química analítica, de uma forma clara e objetiva,
estimulando ao uso de mais uma ferramenta na química analítica.
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
Foi realizada uma revisão bibliográfica sobre o tema escolhido, com coleta de
dados, utilizando as palavras-chave: Infravermelho, radiação, quimiometria e
multivariada. Através de pesquisa de artigos científicos e trabalhos acadêmicos,
utilizando as seguintes bases de dados digitais: Medline (www.medline.com/
nlm.nih.gov/PubMed); Lilacs (www.bireme.br) e SciELO (www.scielo.br ). A consulta em
literatura impressa também foi utilizada na elaboração do trabalho.
Os dados foram analisados, sendo adotado como critério para a seleção dos
trabalhos e artigos, aqueles que faziam menção a utilização da técnica de análise por
infravermelho, independente do tipo específico, como por exemplo, médio ou próximo,
sem limitação de data, nos idiomas inglês e português. Como não foram encontrados
muitos trabalhos publicados com as palavras-chave utilizadas, foi adotado como critério
para exclusão a avaliação dos trabalhos, sendo excluídos trabalhos que não
apresentaram informações relevantes para a elaboração dessa monografia.
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5. RESULTADOS
5.1. Definição
A espectrometria de infravermelho próximo (NIR) é a medição de comprimento
de onda e intensidade da absorção de luz infravermelha próxima realizada pela
amostra. A luz infravermelha próxima se estende em uma faixa de 800 nm - 2.500 nm
(12,500 - 4000 cm-1) e tem energia suficiente para excitar sobretons e combinações de
vibrações moleculares a altos níveis de energia. A espectroscopia NIR é tipicamente
usada na medição quantitativa de grupos funcionais orgânicos, especialmente O-H, N-
H, e C=O. Os limites de detecção são normalmente 0.1% e as aplicações mais comuns
incluem análises farmacêuticas, agrícolas, poliméricos e clínicos (LINDE, 2011).
A radiação infravermelha (IV) é uma radiação não ionizante na porção invisível
do espectro eletromagnético que está adjacente aos comprimentos de onda longos, ou
final vermelho do espectro da luz visível. Ainda que em vertebrados não seja percebida
na forma de luz, a radiação IV pode ser percebida como calor, por terminações
nervosas especializadas da pele, conhecidas como termorreceptores (WIKIPÉDIA,
2011). A radiação infravermelha foi descoberta em 1800 por William Herschel, um
astrônomo inglês de origem alemã. Hershell colocou um termômetro de mercúrio no
espectro obtido por um prisma de cristal com o a finalidade de medir o calor emitido por
cada cor (BURNS; CIURCZAC, 2001).
Descobriu que o calor era mais forte ao lado do vermelho do espectro,
observando que ali não havia luz. Esta foi a primeira experiência que demonstrou que o
calor pode ser captado em forma de imagem, como acontece com a luz visível. Em umaprimeira fase, as aplicações qualitativas concentraram-se principalmente na faixa
espectral do infravermelho médio, uma vez que nessa região é possível a observação
de bandas de absorção de grupos orgânicos específicos como N-H, C-H, O-H, C-C,
entre outros. Assim, esta técnica foi largamente empregada pelos químicos orgânicos
para auxiliar a caracterização de diversas substâncias químicas (BURNS; CIURCZAC,
2001).
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10
Fonte: < http://www.geocities.ws/saladefisica5/leituras/infravermelho.html>
Figura 1: Experimento de William Hershell.
A partir dos anos setenta uma nova fase de estudos espectroscópicos foi
iniciada, agora também no campo das análises quantitativas, promovido pelo
desenvolvimento dos espectrofotômetros com Transformada de Fourier, da informática,
do interfaceamento de instrumentos eletrônicos com computadores e a introdução de
recursos matemáticos mais sofisticados. Com essas inovações tecnológicas, os
estudos quantitativos expandiram suas fronteiras para as regiões espectrais no
infravermelho próximo e médio. Isso desencadeou um surpreendente interesse de
vários grupos acadêmicos de pesquisas, governamentais e industriais, na tentativa de
desenvolver metodologias de análise, trazendo como conseqüência o impacto direto no
crescimento da produção e produtividade industrial, redução de gastos e da quantidade
de resíduos industriais (BURNS; CIURZACK, 2001).
A primeira aplicação da espectroscopia no infravermelho foi para monitorar a
qualidade e controlar a produção na indústria petroquímica, por ocasião da segunda
guerra mundial. Os principais compostos monitorados foram combustíveis, lubrificantes
e polímeros e os equipamentos utilizados, projetados pelas maiores companhias
químicas da época como, Dow, Shell e Cyanamid, eram configurados somente paramedidas de absorção na região do infravermelho médio (COATES,1999).
A espectroscopia no infravermelho próximo não foi considerada inicialmente
como uma técnica analítica com algum valor prático, sendo originalmente, uma
extensão da região do visível que não foi explorada até por volta de 1970
(COATES,1999). Os primeiros trabalhos que proporcionaram interesse pelo estudo da
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espectroscopia no infravermelho próximo como ferramenta de análise industrial foram
desenvolvidos na década de setenta, pelo grupo de pesquisa do professor Karl Norris,
quando este era responsável por um grupo de pesquisa do Departamento de
Agricultura dos Estados Unidos. Entretanto, as limitações tecnológicas da época nãopermitiram o desenvolvimento vertiginoso do NIR como atualmente é observado em
diversos setores industriais como agrícola, petroquímico, alimentício e farmacêutico
(WILLIAMS, 1998).
Atualmente, o valor, a funcionalidade e os benefícios oferecidos pela
espectroscopia no infravermelho, principalmente a espectroscopia no infravermelho
próximo, são incontestáveis (COATES,1999).
5.2. Princípio da espectroscopia no infravermelho
A radiação infravermelha não é suficientemente energética para causar
transições eletrônicas e a absorção desta radiação está muito restrita a espécies
moleculares que possuem diferenças de energia pequenas entre vários estados
vibracionais e rotacionais. Para absorver radiação infravermelha a molécula precisasofrer uma variação no momento de dipolo como conseqüência do movimento
vibracional ou rotacional. Apenas nessas circunstâncias o campo elétrico alternado da
radiação pode interagir com a molécula e causar variações na amplitude de um de seus
movimentos. O momento dipolar é determinado pela magnitude da diferença de carga e
a distância entre os dois centros de carga. Quando uma molécula que possui essa
variação do momento dipolar vibra, uma variação regular do momento dipolar ocorre e
surge um campo que pode interagir com o campo elétrico associado à radiação. Se a
freqüência da radiação coincidir exatamente com a freqüência vibracional natural da
molécula, ocorre uma transferência de energia efetiva e resulta em uma variação da
amplitude da vibração molecular e a conseqüência é a absorção de radiação. Do
mesmo modo, a rotação de moléculas assimétricas em torno dos seus centros de
massa resulta em uma variação periódica do dipolo que pode interagir com a radiação.
Nenhuma variação efetiva no momento de dipolo ocorre durante a vibração ou rotação
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de uma molécula homonuclear, como O2, N2 ou Cl2 e, conseqüentemente, essas
substâncias não podem absorver no infravermelho (COATES, 1999;SKOOG, 2002).
A energia necessária para causar uma mudança de nível rotacional é pequena,
da ordem de 100 cm-1 ou menor que 100.000 nm. O espectro infravermelho de um gásconsiste normalmente de uma série de linhas aproximadamente espaçadas, isso
porque há vários estados rotacionais de energia para cada estado vibracional. Por outro
lado, a rotação está rigorosamente restrita em líquidos e sólidos e nestas condições as
linhas discretas vibracionais/rotacionais desaparecem deixando picos vibracionais
alargados (SKOOG, 2002).
Em uma molécula, as posições relativas dos átomos não estão fixas variando
continuamente em conseqüência dos tipos de vibrações e rotações em torno dasligações da molécula. Para uma molécula diatômica ou triatômica simples é possível
definir com certa facilidade o número e a natureza de tais vibrações e relacioná-las às
energias de absorção. Entretanto, para moléculas constituídas de muitos átomos
possuindo um grande número de centros de vibração, como também para moléculas
apresentando interações entre vários centros, é muito difícil definir o número e a
natureza das vibrações envolvidas e relacioná-las à suas respectivas energias de
absorção (SKOOG, 2002).
As vibrações são divididas em duas categorias: estiramentos (deformação axial)
e deformações angulares. Uma vibração de estiramento envolve uma variação contínua
na distância interatômica ao longo do eixo da ligação entre dois átomos podendo
acontecer de forma simétrica ou assimétrica, enquanto que as deformações angulares
são caracterizadas pela variação do ângulo entre duas ligações e podem acontecer no
plano ou fora do plano da molécula. Além desses tipos de vibração, interações ou
acoplamentos de vibrações podem ocorrer se as vibrações envolverem ligações de um
mesmo átomo central e o resultado disso é uma variação nas características dasvibrações envolvidas (SKOOG, 2002).
Considerando que as vibrações acontecem de forma isolada em uma molécula,
estas podem ser representadas por um modelo mecânico simples e conhecido como
oscilador harmônico. As características da vibração de estiramento pode se aproximar
às de um modelo mecânico consistindo de duas massas ligadas por uma mola e as
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freqüências fundamentais de quaisquer dois átomos ligados podem ser calculadas
assumindo que a energia segue o comportamento de um oscilador harmônico que
obedece a Lei de Hooke. Assim as massas representam os átomos e a mola representa
a ligação química entre eles. Uma perturbação de uma das massas ao longo do eixo damola resulta em uma vibração denominada de movimento harmônico simples e a força
restauradora é proporcional ao deslocamento (lei de Hooke) e tende a restaurar as
massas para sua posição original (BURNS; CIURZACK, 2001).
Fonte: < http://www.sorocaba.unesp.br/gpm/ftir.htm >
Figura 2: Modos de vibração molecular. Os sinais X e • indicam movimentos
para dentro e para fora do plano do desenho, respectivamente.
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Fonte: < http://www.webbook.nist.gov/chemistry>
Figura 3: Espectro do Ethanol.
5.3. Tecnologias
5.3.1. Tipos de radiação
200-400nm – U.V.
400 – 1000nm – U.V. Visível
1000 – 2500nm – Infravermelho
Infravermelho próximo (NIR)
Infravermelho médio (MID)
Infravermelho longínquo (FIR)
Microondas
Rádio
Fonte:<http://estadoquantico.blogspot.com/2011/04/25-anos-do-desastre-de-
chernobyl.html>
Figura 4: Tipos de radiação.
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5.3.2. Evolução tecnológica
O início da utilização da técnica de infravermelho para análises de compostos
químicos teve início nos anos 70, sendo inicialmente utilizada apenas para análises
qualitativas, devido a necessidade de ferramentas algébricas de difícil processamento,
o que impossibilitava o uso para análises quantitativas, no decorrer dos anos a técnica
foi aprimorada, passando por diversas tecnologias.
1970: Filtros - Técnica mais antiga, uso de Filtros Coloridos.
1980: Dispersivos - Luz de uma fonte decomposta através de um prisma (ouuma grade).
1980: Arranjo de fotodiodos
1990: Transformada de fourier
5.3.3. Espectrofotômetros dispersivos
Os espectrofotômetros dispersivos no infravermelho são instrumentosregistradores de feixe duplo, que usam redes de difração para dispersar a radiação.
Essa é uma característica importante devido à baixa intensidade das fontes de
infravermelho, à baixa sensibilidade dos transdutores para infravermelho e à
conseqüente necessidade de grandes amplificações de sinal (COATES, 1999; SKOOG,
2002).
Geralmente, este tipo de equipamento incorpora um modulador de baixa
freqüência que permitirá ao detector distinguir entre o sinal da fonte e sinais de radiação
espúria, tal como emissão infravermelha ao redor do transdutor. Baixas velocidades de
modulação são requeridas devido ao tempo de resposta lento dos transdutores para
infravermelho usados na maioria dos instrumentos dispersivos. Em geral, a óptica dos
instrumentos dispersivos é muito parecida com a de equipamentos no UV/VIS, exceto
que os compartimentos de amostra e referência estão sempre localizados entre a fonte
e o monocromador nos instrumentos no infravermelho. Essa disposição é possível
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porque a radiação infravermelha, em contraste com a UV/VIS, não é energética o
suficiente para causar decomposição fotoquímica da amostra. Colocando a amostra e a
referência antes do monocromador, tem-se a vantagem de que a maior parte da
radiação espalhada, gerada no compartimento da célula, é efetivamente removida pelomonocromador e não atinge o transdutor (SKOOG, 2002).
Fonte: FELLI,2011.
Figura 5: Espectrofotômetros Dispersivos.
5.3.4. Instrumentos não-dispersivos
Estes instrumentos são simples e robustos e foram projetados para análise quantitativa.
Alguns são fotômetros de filtro único ou não-dispersivo, outros usam filtros no lugar de
um elemento dispersivo para a obtenção de um espectro completo, outros ainda, não
fazem uso de qualquer dispositivo para seleção de comprimento de onda. Em geral,
este tipo de instrumento é menos complexo, mais robusto, fácil de manter e menos caroque os instrumentos descritos anteriormente. Os fotômetros de filtro podem utilizar
filtros de interferência e são normalmente designados para análises quantitativas. Uma
variedade de filtros é disponível atualmente, cada um indicado para uma aplicação
específica (SKOOG, 2002).
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5.3.5. Espectrofotômetro com Transformada de Fourier
Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIV) é uma
técnica de análise para colher o espectro infravermelho mais rapidamente. Em vez de
se coletar os dados variando-se a freqüência da luz infravermelha monocromática, a luz
IV (com todos os comprimentos de onda da faixa usada) é guiada através de um
interferômetro. Depois de passar pela amostra o sinal medido é o interferograma.
Realizando-se uma transformada de Fourier no sinal resulta-se em um espectro
idêntico ao da espectroscopia IV convencional (dispersiva) (WIKIPÉDIA, 2010).
Esse tipo de equipamento utiliza um interferômetro ao invés de redes dedifração. Sua popularização ocorreu com o surgimento de microcomputadores, com o
seu interfaceamento e com a utilização da transformada de Fourier para o tratamento
de dados. Espectrofotômetros com Transformada de Fourier apresentam algumas
vantagens, como a grande eficiência no transporte da radiação até o detector, o que
melhora a relação sinal/ruído, apresenta um alto poder de resolução e reprodutibilidade
do comprimento de onda, todos os elementos de resolução para um espectro são
medidos simultaneamente o que possibilita a aquisição de dados de um espectro inteiroem cerca de um segundo ou menos (COATES, 1999; SKOOG, 2002).
A maioria dos equipamentos utilizados atualmente, utilizam o princípio
interferométrico, sendo que diante de tantas vantagens, a existência e utilização de
equipamentos dispersivos para a região NIR é justificada pelo fator custo e por se tratar
de uma região onde os sinais observados são em sua maioria bandas relativamente
largas, em que uma grande resolução não é requerida na maioria das vezes, uma vez
que as aplicações geralmente são quantitativas (BURNS; CIURCZAK, 2001, dentre
outros).
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Fonte: FELLI,2011.
Figura 6: Espectrofotômetros com Transformada de Fourier.
5.4. Principais compontes de um equipamento de infravermelho
A Figura 1 mostra um esquema básico dos componentes principais de um
equipamento de infravermelho:
→ → →↓
FONTE SELETOR DECOMPRIMENTODE ONDA
RECIPIENTE
DEAMOSTRA TRANSDUTOR
PROCESSADORDISPOSITIVO D
SAÍDA
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Figura 7. Componentes básicos de um equipamento que opera na região do
infravermelho.
As fontes de infravermelho consistem em um sólido inerte como a fonte deNernst que é composta de óxido de terras raras, a fonte Globar que consiste em uma
barra de carbeto de silício, a fonte de filamento incandescente que é representada
através de um espiral de níquel-cromo, o arco de mercúrio, a lâmpada de filamento de
tungstênio, o laser de dióxido de carbono, são exemplos de fontes para a região do
infravermelho que encontram aplicações de acordo com o interesse específico ou a
região NIR/MID/FAR (COATES, 1999; SKOOG, 2002).
A princípio, os equipamentos de infravermelho não diferem muito dosequipamentos utilizados nas regiões do ultravioleta e do visível no que diz respeito
aos componentes básicos. Contudo, diferenças notórias são encontradas
principalmente na fase de seleção de comprimento de onda, que originam
espectrofotômetros dispersivos ou interferométricos ou, ainda, fotômetros que são
equipados com filtros (COATES, 1999; SKOOG, 2002).
Os recipientes para a amostra variam de acordo com a região NIR/MID/FAR e
com o estado físico da amostra.
Os transdutores para o infravermelho são de três tipos gerais:
1. Transdutores térmicos: a resposta depende do efeito de aquecimento da
radiação sendo comumente encontrados em fotômetros e espectrofotômetros
dispersivos.
2. Transdutores piroelétricos: consiste em um transdutor térmico muito
especializado com propriedades térmicas e elétricas especiais e são
encontrados em fotômetros e espectrofotômetros dispersivos.3. Transdutor fotocondutor: consiste na absorção da radiação pelos materiais
componentes do transdutor, essa absorção promove elétrons não-condutores de
valência a um estado condutor, de energia mais elevada, decrescendo a
resistência elétrica do semicondutor. A composição dos materiais componente
do transdutor varia de acordo com a região NIR/MID/FAR. Esse tipo de
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transdutor é encontrado em instrumentos multiplexados com transformada de
Fourier (SKOOG, 2002).
Os instrumentos para a região do infravermelho próximo são semelhantes aosutilizados para a espectroscopia de absorção no UV/VIS. Lâmpadas de
tungstênio/halogênio com janelas de quartzo servem como fontes, as células para
medidas de absorção são normalmente de quartzo ou sílica fundida, transparentes até
3.000 nm. O caminho óptico varia de 0,1 a 10 cm. Os detectores são, em geral,
fotocondutores de sulfeto de chumbo (SKOOG, 2002).
Estão disponíveis uma série de fotômetros e espectrofotômetros projetados
especificamente para a região do infravermelho próximo. A variedade de instrumentos émuito grande, indo dos mais sofisticados com Transformada de Fourier, aos de feixe
duplo com redes de difração ou arranjo de diodos, até os instrumentos mais simples
baseados em filtros (BURNS, 2001; MCCLURE, 1994, dentre outros).
5.5. Processamento dos dados
5.5.1. Quimiometria
A quimiometria pode ser definida como a pesquisa e utilização de métodos
matemáticos e estatísticos para o tratamento de dados químicos de forma a extrair uma
maior quantidade de informações e melhores resultados analíticos. Os métodos
utilizados na quimiometria, a princípio, foram desenvolvidos em outras disciplinas que
com a aplicação e pesquisas voltadas para o tratamento de dados químicos acabou
dando origem a uma nova área dentro da química analítica. Isso se deu após a
segunda metade dos anos 60, com o surgimento de métodos instrumentais
computadorizados para a análise química que promoveu a geração de uma grande
quantidade de dados. Até este período, os químicos baseavam suas decisões em uma
pequena quantidade de dados que, na maioria das vezes, eram obtidos de forma lenta
e dispendiosa. A partir dos anos 60, com a grande quantidade de dados de obtenção
rápida e com menor esforço, foi preciso analisar todos esses dados e extrair maior
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quantidade de informações relevantes. Foi então, que teve início a pesquisa e utilização
dos métodos matemáticos e estatísticos que acabaram resultando nessa nova área
conhecida como quimiometria (OTTO, 1999).
A quimiometria pode ser considerada uma das áreas mais recentes da químicaanalítica. Desde o seu surgimento no final dos anos 60 até os dias de hoje, foram
desenvolvidos muitos métodos que tem tornado possível o processamento e
interpretação de dados que antes seriam impossíveis de serem analisados. Um
exemplo importante do sucesso da utilização da quimiometria são as análises
realizadas na região do infravermelho próximo, as quais, sem a utilização de modelos
de calibração multivariada não apresentam possibilidades para determinações
quantitativas (OTTO, 1999).Com o crescimento da quimiometria foram desenvolvidas novas ferramentas
para tratamento de dados encontrando aplicações distintas conforme o objetivo do
estudo como, por exemplo, a otimização de processos, a classificação de dados,
as determinações quantitativas, entre outros. Assim, a quimiometria foi dividida em
diversas frentes de pesquisa e aplicação:
- Processamento de sinais analíticos;
- Planejamento e otimização de experimentos;
- Reconhecimento de padrões e classificação de dados;
- Calibração multivariada;
- Métodos de inteligência artificial (OTTO, 1999).
Dentro dessa divisão, a principal linha de pesquisa da quimiometria aplicada à
química analítica tem sido a construção de modelos de regressão a partir de dados de
primeira ordem, ou seja, dados que podem ser representados através de um vetor para
cada amostra, sendo a construção desses modelos denominada de calibração
multivariada (BRERETON, 2000).
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5.5.2. Análise multivariada
Métodos de Análise Multivariada têm sido cada vez mais utilizados em química
analítica, principalmente quando os componentes presentes em uma mistura precisam
ser determinados, mas a informação analítica disponível não apresenta seletividade, ou
seja, em uma mistura não é possível se identificar os componentes individuais de cada
espécie a partir da resposta instrumental. A calibração multivariada baseia-se em
estabelecer uma relação entre duas matrizes (ou blocos) de dados químicos, quando
ocorrer uma dependência entre as propriedades que descrevem cada uma delas (DE
SOUZA et al., 2004).
Nos métodos de análise univariáveis, somente a absorbância de uma freqüênciaé associada à concentração, enquanto que métodos multivariados usam,
simultaneamente, duas ou mais freqüências. A precisão dos métodos univariáveis é
dependente da capacidade para identificar uma única banda isolada para cada
componente. Os métodos multivariáveis,entretanto, podem ser utilizados igualmente
quando estão sobrepostas informações espectrais selecionadas (DE SOUZA et al.,
2004).
Os métodos de análise multivariada aplicados na modelagem de informações
químicas fazem parte da área da quimiometria, e são assim denominados pois no caso
da espectroscopia permitem manipular dados de absorbância espectrais associadas a
uma ou mais freqüências ao mesmo tempo. Estes métodos têm recentemente tornado
possível modelar propriedades químicas e físicas de dados simples e complexos, a
partir de dados espectroscópicos (Zamora et al., 1997).
Pode-se citar a regressão por quadrados mínimos parciais (PLS) como um dos
tratamentos de dados matemáticos mais utilizados em análises de multicomponentes
na calibração de sistemas complexos e verificação da precisão e exatidão da exatidão
da sua calibração, bem como previsão sem experiência espectroscópica extensiva (DE
SOUZA et al., 2004).
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5.5.3. Calibração
A calibração pode ser definida como uma série de operações que estabelecem,
sob condições específicas, uma relação entre medidas instrumentais e valores para
uma propriedade de interesse correspondente (EURACHEM/CITAC, 1998).
O conjunto de dados empregado para essa finalidade é chamado de conjunto de
calibração. Os parâmetros do modelo são denominados de coeficientes de regressão
(b) determinados matematicamente a partir dos dados experimentais (HELLAND, 1998;
MARTENS, 1996).
O passo seguinte à calibração é a validação. Nesta etapa, as variáveis
independentes obtidas, para um outro conjunto de amostras, são utilizadas em conjuntocom o coeficiente de regressão, para calcular os valores previstos para a variável
dependente. No conjunto de validação utilizam-se amostras cujas variáveis
dependentes sejam conhecidas para que seja possível estabelecer uma comparação
entre os valores previstos pelo modelo e os valores conhecidos previamente através de
uma metodologia padrão, o que permitirá a avaliação sobre o desempenho do modelo
de calibração proposto (MARTENS, 1996).
Existem diversos métodos para a construção de modelos de calibração, sendoque a função que ajusta as variáveis dependentes e independentes pode ser linear ou
não, dependendo da complexidade do sistema em estudo (SEKULIC, 1993).
Dentre os métodos de calibração existentes, sem dúvida, os mais difundidos são
ainda os métodos de calibração univariada que também são conhecidos como
calibração de ordem zero, ou seja, tem-se apenas uma medida instrumental para cada
uma das amostras de calibração, isto é, para cada amostra tem-se apenas um escalar.
Esses métodos são descritos na literatura em vários trabalhos sua aplicação e
validação são relativamente fáceis. No entanto, a aplicação da calibração univariada é
restrita, visto que, quando a amostra não é livre de interferentes e a medida é realizada
diretamente na metodologia instrumental, isso provavelmente provocará desvios na
determinação da propriedade de interesse e a aplicação deste método de calibração
torna-se inviável (CHARNE, 1999;MILLER, 2000, dentre outros).
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Em calibração multivariada, mais de uma resposta instrumental é relacionada
com a propriedade de interesse. Esses métodos de calibração possibilitam a análise
mesmo na presença de interferentes, desde que esses interferentes estejam presentes
nas amostras utilizadas para a construção do modelo de calibração. Outraspossibilidades apresentadas por este tipo de calibração são determinações simultâneas
e análises mesmo sem resolução. Isso faz com que os modelos de calibração
multivariada sejam uma alternativa quando os métodos univariados não encontram
aplicação. Neste tipo de calibração a resposta instrumental é representada na forma de
matriz, enquanto a propriedade de interesse, determinada por uma metodologia padrão,
é representada por um vetor (VALDERRAMA, 2005).
Uma diversidade de métodos de regressão vem sendo utilizado em químicaanalítica para a construção de modelos de calibração multivariada, dentre esses os
mais empregados tem sido a regressão linear múltipla (MLR), regressão por
componentes principais (PCR) e regressão por mínimos quadrados parciais (PLS), que
são métodos para ajuste linear entre as variáveis. Tem-se verificado que a maioria dos
métodos de calibração multivariada empregados em espectroscopia utiliza ajuste linear
entre as variáveis, uma vez que este representa o modelo de mais fácil elaboração e
interpretação (VALDERRAMA, 2005).
5.5.4. Regressão Linear Múltipla – MLR
O modelo mais simples em calibração multivariada consiste na resolução de um
sistema de equações lineares em uma regressão linear múltipla (MLR – do inglês,
Multiple Linear Regression) (OTTO, 1999). Este modelo de calibração inversa, para a
determinação de um analito, pode ser obtido a partir de uma matriz X de respostas
instrumentais. com dimensão (i x j), arranjada de acordo com a Figura 2, onde i
representa o número de amostras a ser utilizada na construção do modelo (conjunto de
calibração) e j representa o número de variáveis, e um vetor y de dimensão (i x 1), que
contém as concentrações de referência das amostras de calibração. A partir daí cada
variável dependente de y é expressa como uma combinação linear das variáveis
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independentes da matriz X e um vetor que contém os coeficientes de regressão, bMLR,
relaciona X e y por meio da expressão (BRERETON, 2000):
y = XbMLR (1)
em que bMLR é um vetor de dimensão (j x 1).
Para a obtenção do vetor dos coeficientes de regressão, esta equação pode
ser resolvida por mínimos quadrados (BRERETON, 2000):
b̂ MLR (XTX) -1XTy (2)
em que, os índices sobrescritos –1 e T representam a inversão e transposição de
uma matriz ou vetor, respectivamente. Uma estimativa para a concentração da espécie
de interesse ( yˆ ) pode ser obtida por (BRERETON, 2000):
yˆ = XbMLR (3)
A regressão linear múltipla apresenta dois problemas que limitam sua aplicação. O
primeiro deles é que o número de amostras deve ser igual ou superior ao número de
variáveis, uma vez que o modelo consiste na resolução de um sistema de equações
lineares simultâneas quando o número de variáveis é superior ao número de amostras,
ou vice-versa, o sistema de equações a ser resolvido torna-se indeterminado. O
segundo problema constatado para a MLR é que a matriz (XTX) pode não apresentar
inversa devido a alta correlação entre as variáveis (BRERETON, 2000):
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26
Fonte: VALDERRAMA, 2005.Figura 8. Construção da matriz X para calibração multivariada.
5.5.5.Regressão por Componentes Principais
A regressão por componentes principais (PCR- do inglês, Principal Components
Regression) surge como uma alternativa no intuito de contornar os problemas
apresentados pela MLR. Neste método de regressão utiliza-se a análise decomponentes principais (PCA – do inglês, Principal Component Analysis) como a
técnica de ortogonalização baseada em mudança de base vetorial. Este procedimento
resolve os dois principais problemas da MLR, uma vez que a PCA pode ser utilizada
para a redução do número original de variáveis sem acarretar na perda significativa de
informação resolvendo, assim, o problema de existência de alta colinearidade entre as
colunas de X e a necessidade de um número excessivo de amostras para a construção
do modelo por MLR (OTTO, 1999; BEEBE, 1987, dentre outros).
5.5.6. Regressão por mínimos quadrados parciais
Este método foi desenvolvido nos anos 70 por Herman Wold, e um excelente
guia prático foi escrito por Geladi e Kowalski (1986). Como usual em procedimentos
analíticos primeiro desenvolve-se um modelo de calibração (Pimentel, Barros Neto,
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1996). Uma matriz X com m colunas, correspondendo ao sinal espectral (p. e.
absorbância) para cada número de onda, e n linhas, representando cada amostra
(padrão). Uma segunda matriz Y, é definida com k colunas, com as informações
químicas (p. e. concentrações) e com n linhas, correspondendo a cada amostra.Utilizado técnicas de análise fatorial a matriz X é decomposta numa soma de matrizes
menores (equação 1).
X = M1 + M2 + ... + Ma + E (4)
Sendo Mi os componentes principais ou variáveis latentes, com dimensão 1, 2 ...
a, onde a corresponde ao número de fatores (componentes principais ou variáveislatentes) selecionado para truncar a igualdade. E corresponde a matriz de resíduos,
relacionada ao número de fatores.
A matriz Y é decomposta de maneira análoga. Finalmente, determina-se a
correlação entre as variáveis latentes usando os componentes das matrizes menores.
No modelo PLS as decomposições das matrizes X e Y são feitas
simultaneamente por meio interativo e se acredita que a informação contida em Y é
transferida para X.
Após a calibração é possível prever as propriedades de novas amostras a partir
de medidas espectrais. Os sinais espectrais são definidos numa nova matriz Xp, que
contém m colunas mas t linhas, correspondendo as t novas amostras. Usando a
correlação construída na fase de calibração as propriedades desconhecidas são
coletadas numa nova matriz Yp (DE SOUZA, FERRÃO, 2006).
5.5.7. Detecção de amostras anômalas – Outliers
Outliers é o termo utilizado para designar amostras anômalas que podem estar
presentes nos conjuntos de calibração e de validação, que serão empregados na
construção e validação de um modelo de calibração multivariada, respectivamente.
Normalmente, essas amostras anômalas possuem um comportamento diferente das
demais amostras do conjunto de dados (VANDEGINSTE, 1998).
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A presença desse tipo de amostra no conjunto de calibração pode conduzir a modelos
com baixa capacidade de previsão, ou seja, que produzem altos valores de erro.
Quando presentes no conjunto de validação, podem influenciar os resultados,
geralmente, levando a resultados que indicam que o modelo não é adequado ou que asua capacidade é inferior à que poderia ser apresentada na ausência destas amostras
anômalas. Assim, a identificação de anomalias é um passo importante para a
otimização dos conjuntos de calibração e validação, sendo que, a exclusão destes
permite a construção de modelos mais eficientes e precisos e com melhor capacidade
de previsão (MARTENS; NAES, 1996).
Existem diversas técnicas para a identificação de amostras anômalas, como por
exemplo: a distância de Mahalanobis, método da incerteza (HOY, 1998;FERNÁNDEZPIERNA, 2002, dentre outros), uma metodologia conhecida como “convex hull” funções
potenciais, (FERNÁNDEZ PIERNA, 2002;JOUAN-RIMBAUD, 1999), RHM (do inglês,
Resampling by the Half-Means) (FERNÁNDEZ PIERNA, 2002;EGAN, 1998, dentre
outros), SHV (do inglês, Smallest Half- Volume), (FERNÁNDEZ PIERNA, 2002;EGAN,
1998), entre outros, sendo que esta área constitui uma linha de pesquisa recente e em
andamento que, no entanto, é de grande importância tendo em vista a variedade de
tipos de equipamentos e a grande quantidade de amostras que geram dados de
primeira ordem.
5.6. Aplicações da espectroscopia e da quimiometria na análise de
medicamentos
A técnica de análise de reflexão no infravermelho próximo (NIR) pode ser
aplicada nas análises farmacêuticas, sua aplicação ainda é um desafio, pois a técnica
ainda não é descrita em farmacopéias para fins quantitativos, porém é amplamente
utilizada em outros segmentos, como por exemplo, polímeros, agroquímicos,
agrotóxicos, entre outros. O desenvolvimento da técnica se deve a adequada
determinação qualitativa e quantitativa de parâmetros físicos e químicos, habilidade no
processo, além de ser compatível com a fibra ótica, fator este que acaba por facilitar as
análises. O método de análise por NIR geralmente é utilizado como uma alternativa
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para os métodos de referência, como por exemplo, Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE), Cromatografia Gasosa (CG), Espectrofotômetria de UV/Vis, visando
a diminuição nos custos analíticos, otimização dos processos e diminuição no tempo de
análise.
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6. DISCUSSÃO
Os resultados apresentados, demonstram que a técnica de quantificação de
compostos químicos por Infravermelho Próximo (NIR) é de grande relevância, ainda em
expansão, principalmente quando se fala na aplicação em química analítica
quantitativa.
A técnica representa hoje uma alternativa eficaz, que depende de alguns fatores
importantes, para que sejam obtidos resultados confiáveis e precisos.
A calibração é um dos fatores de grande importância, os melhores equipamentos
disponíveis no mercado atual, devem conter em seu sistema operacional a calibração
multivariada, que faz o uso de um simples ponto espectral, mas leva em consideração
as características espectrais de uma larga faixa. Por essa razão, as análises de bandas
espectrais com picos largos tornam-se possíveis. A informação contida no espectro de
amostras de calibração serão comparadas com a informação de valores usando a
regressão, que pose ser a PLS. O método assume que as variações observadas no
espectro são em conseqüência da mudança na concentração dos componentes.
Contudo, a correlação entre a mudança de concentração dos componentes e amudança de sinal do infravermelho não é necessariamente linear.
As principais desvantagens da Calibração Multivariada são:
A calibração Multivariada requer um grande número de amostras de calibração
contendo grande quantidade de informações (vários espectros com centenas ou
milhares de pontos com informações relevantes).
Para manipular as informações de forma conveniente, os dados espectrais e os
dados de concentração são escritos na forma de matrizes, onde cada linha na
matriz de dados espectrais representa os espectros das amostras.
A matriz de dados de concentração contem os correspondentes valores de
concentração das amostras.
As matrizes serão quebradas em vetores que serão chamados de fatores ou
componentes principais.
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As principais vantagens da Calibração Multivariada são:
A principal vantagem dessa abordagem, é que nem todos os componentes
principais são necessários para descrever uma relevante característica espectral,
por exemplo, alguns desses vetores representam simplesmente o ruído espectral
da análise. Somente relevantes componentes principais serão então usados ao
invés de todos os dados espectrais originais, reduzindo consideravelmente a
quantidade de informações.
O Algoritmo PLS entrará em ação para encontrar a melhor função de correlação
entre a matriz dos dados espectrais e matriz da concentração.
A utilização do algoritmo PLS permite quantificar mais de um componente em umaamostra.
Para a utilização da técnica, além de um equipamento que tenha disponível a
calibração multivariada, com um logaritmo tipo PLS, é necessário que seja
desenvolvido um método quimiométrico, usando um número representativo de
amostras de calibração de composição conhecida, que tenha como referência um
método analítico confiável, validado. Os espectros IR destas amostras serão usados
para calcular uma função de calibração, que é um elemento indispensável no modelo
quimiométrico que será usado posteriormente para analisar as amostras
desconhecidas.
Para se desenvolver um método quimiométrico é necessário:
O primeiro passo para se construir um modelo quimiométrico é selecionar um
número suficientemente de amostras para representar o sistema.
Essas amostras precisam ter seus componentes analisados quantitativamente
em métodos confiáveis (métodos de referência) e seus espectros coletados no
infravermelho.
Dependendo do tipo de método de validação usado, um set de calibração e um
set de teste são formados com esses espectros.
Número mínimo de amostras recomendados:
Estudo de viabilidade: ~ no mínimo 20 amostras
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Aplicações comuns: ~ 50-100 amostras
Aplicações complexas: > 150 amostras
Alguns fatores que podem interferir na modelagem e na precisão do método
quimiométrico:
Qualidade do instrumento (Resolução, estabilidade, relação sinal/ruído, precisão,
robustez);
Preparação da amostra e representatividade da amostra;
Precisão do método referência (por exemplo, via úmida) (em muitos casos, a
precisão do método IR ou NIR depende unicamente da precisão do método
referência).
Alguns fatores que podem interferir na qualidade da predição:
Seleção da faixa espectral:
Regiões com ruídos espectrais incluídos na calibração;
Regiões com absorção total incluídos na calibração.
Seleção correta do experimento para medição; Ferramentas para o processamento de dados;
Valores das amostras de calibração bem distribuídas na faixa selecionada.
Evitar o ruído espectral, como por exemplo a borda direita ou esquerda
(extremos) onde o detector tem menor sensibilidade.
Evitar faixas espectrais com absorção total (absorção > 2,0 AU).
Outro cuidado à ser tomado no desenvolvimento de um método quimiométrico, sãoos outliers, que são erros de calibração devido a valores de referência ruins.
As possíveis causas para os outliers são:
A amostra não homogeneizada corretamente;
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Variação de temperatura de amostras líquidas;
Utilização incorreta de probe;
Presença de bolhas no “gap” óptico;
Seleção errada do método ou do experimento (parâmetros de medição);
Os porta amostras utilizados na calibração e na medição não são idênticos.;
Mesmas condições de análise. (exemplo: ângulo da probe, etc.).
As soluções para os outiliers são:
Revisão do método de análise referência;
Revisão de precisão, limite de erros e reprodutibilidade das análises referência;
Repetição e/ou determinação múltipla de valores referência de algumas
amostras.
A tabela 1 abaixo, mostra as características da técnica de análise por Infravermelho
Próximo quando comparado aos métodos tradicionais:
Tabela 1: Comparativo das características das técnicas analíticasParâmetros NIR CLAE UV/VIS
Custo Equipamento Relativamente
Elevado
Relativamente
Elevado
Médio
Tempo de Análise Rápido (cerca de
5 segundos)
Considerado
Demorado
Rápido
Forma de Medição Automático Automático Semi-AutomáticoPreparo na amostra Não necessário Necessário NecessárioUso de reagentes Não necessário Necessário Necessário
Uso de Consumíveis Não necessário Necessário NecessárioCusto Manutenção Médio Alto MédioMetodologia pode ser
validada
Sim, mas
depende de outro
método como
referência
Sim,
independente
Sim, independente
Analisa mais de um Sim Sim Não
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composto de uma vezEmite Resultados
Precisos
Sim Sim Sim
7. CONCLUSÃO
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Através do presente trabalho foi possível esclarecer e elucidar a técnica de
analítica de quantificação de compostos químicos através da espectrometria de IV NIR.
Conclui-se que a técnica analítica é uma alternativa eficaz, rápida e robusta e
representa uma alternativa para a substituição dos métodos analíticos tradicionais,
como por exemplo, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), Cromatografia
Gasosa (CG), Espectrofotômetria de UV/Vis desde que observados as condições para
a aplicação da técnica, que exige o avanço dos sistemas informatizados, assim como
também um investimento considerado elevado, porém esse investimento deve ser
avaliado com cautela, levando-se em consideração o custo benefício que a técnica traz,principalmente pela rapidez nos resultados e por não exigir pré-tratamento de amostras,
além disso o método não substitui totalmente os métodos tracionais, já que necessita
de um método de referência validado para a sua utilização, sendo assim se torna muito
útil a utilização dessa técnica na rotina laboratorial de controle de qualidade de
medicamentos, pois com a implantação da técnica de Infravermelho Próximo (NIR) em
um laboratório, pode-se poupar os equipamentos tradicionais ou utilizá-los para
análises mais complexas ou outras atividades laboratoriais. As principais vantagens da aplicação da técnica são: rapidez, método não
invasivo, não necessidade de reagentes e possibilidade monitoramento on-line.
As principais desvantagens da aplicação da técnica são: Custo elevado,
necessidade de software avançado, necessidade de um método de referência validado,
e aceitabilidade os órgãos de fiscalização.
Avaliando-se cuidadosamente as vantagens e desvantagens da técnica e a
aplicação desejada, é possível implantar em um laboratório analítico a técnica de
quantificação de compostos químicos através da espectrometria de IV NIR e obter
ótimos resultados, que associada as demais técnicas analíticas pode contribuir
positivamente na rapidez, otimização dos processos, diminuição dos custos a longo
prazo, geração de processos automatizados, diminuição de gastos de reagentes, e
melhor utilização e aproveitamento dos equipamentos analíticos tradicionais.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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