Universidade Federal do ABC

Transformações Bioquímicas

RELATÓRIO 03

Desnaturação e Precipitação de Proteínas

Caroline Delcole Borsolari

Diego Rodrigo Massa Monteiro

Henrique de Abreu Piccolo

Jucilaine dos Santos Pereira

Lidia Furukawa

Profº Jiri Borecky

Santo André

2009

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SUMÁRIO

PÁGINA

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 3

2 OBJETIVO .............................................................................................................. 5

3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 6

3.1 Materiais ........................................................................................................... 6

3.2 Métodos ......................................................................................................... 6 3.2.1 Extração do suco de abacaxi ......................................................................... 6 3.2.2 Preparação da gelatina ................................................................................ 7 3.2.3 Ensaio 1 ........................................................................................................ 7 3.2.3 Ensaio 2 ......................................................................................................... 7

4 RESULTADOS ........................................................................................................ 84.1 Tabelas e fotos dos resultados ............................................................................. 84.2 O efeito do suco de abacaxi no colágeno ............................................................. 12 4.3 O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi ............................. 13 4.4 O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução ........... 13 4.5 Dificuldades técnicas ............................................................................................ 14

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 145.1 As proteoses do suco de abacaxi .......................................................................... 145.2 Purificação de proteínas ........................................................................................14 5.3 A otimização da atividade das proteases .............................................................. 14 5.4 O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de cozimentodos alimentos .............................................................................................................. 15 5.5 A utilização do abacaxi para amaciar carne ..........................................................15

6 CONCLUSÃO.............................................................................................................15

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................16

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1 INTRODUÇÃO

Proteases (ou enzimas proteolíticas) é um grupo de enzimas que catalisam a

quebra das ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.

A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, 1984)

sugeriram o uso do termo peptidase para um subconjunto de peptídeo-hidrolases

(subclasse E.C 3.4). O termo protease é usado como sinônimo de peptidase. As

peptidases compreendem dois grupos: endopeptidases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases

(EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia

peptídica e a eliminação do aminoácido seqüencial do terminal N ou C. A Figura 1

mostra o esquema de nomenclatura das proteases. O termo proteinase também pode ser

usado para endopeptidase [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

FIGURA 1: Esquema de nomenclatura moderna de proteases [SALLEH,

RAHMAN & BASRI, 2006].

Endopeptidases

Endopeptidases atuam preferencialmente nas regiões internas da cadeia

polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. A presença de grupos a-amino ou a-

carboxila tem um efeito negativo na atividade da enzima.

As endopeptidases podem ser subdivididas de acordo com o grupo reativo no

sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22),

aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou

metalloendopeptidases (EC 3.4.24).

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Exopeptidases

As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região

N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único

resíduo de aminoácido (aminopeptidases), um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um

tripeptídeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na região carboxi

terminal livre liberam um único aminoácido (carboxipeptidases) ou um dipeptídeo

(peptidil-dipeptidases). Algumas exopeptidases são específicas para dipeptídeos

(dipeptidases) ou removem resíduos terminais que são substituídos, ciclizados ou

ligados por ligações isopeptídicas. Ligações isopeptídicas são ligações peptídicas

diferentes daquelas entre uma a-carboxila e um a-amino grupo, e estes tipos de enzimas

são denominados omega peptidases.

Fontes

Proteases podem ser obtidas das plantas, animais e microorganismos. Proteases

produzidas das plantas incluem a papaína, bromelina, queratinase e ficina. A papaina é

extraída do mamão (Carica papaya). A bromelina é extraída do caule e frutos do

abacaxi e a ficina é obtida do látex da figueira (Ficus glabrata). Essas três proteases têm

especificidades similares, apesar de serem obtidas em diferentes fontes. Alguns grupos

de plantas botânicas produzem queratinase, que pode degradar o cabelo.

Alguns exemplos de proteases produzidas por animais são protaminase, tripsina,

quimotripsina, pepsina e renina. A protaminase é isolada de pâncreas bovino, leões

marinhos e porcos, enquanto a tripsina e a quimotripsina são sintetizadas no pâncreas e

secretadas na forma de zimogênio (tripsinogênio e quimotripsinogênio,

respectivamente). A pepsina pode ser obtida a partir de células da mucosa gástrica de

porcos, e a renina, do estomago de carneiros [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

Aplicação das Proteases

Proteases têm grandes aplicações industriais, principalmente nas indústrias de

comida, detergentes, medicina e biotecnologia. Muitas proteases bacterianas foram

purificadas, classificadas e comercializadas. Na indústria alimentícia, por exemplo, a

aplicação das proteases inclui a produção de queijos, solubilização de pasta de peixe e

amaciamento de carnes. Além disso, as proteases também são muito utilizadas no

tratamento do couro em substituição aos compostos tóxicos e poluentes até então

utilizados. Pelos aspectos econômicos e tecnológicos, as proteases bacterianas são as

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enzimas industriais mais utilizadas, com grandes aplicações em várias indústrias, como

detergente, couro, seda, pão, carnes e cervejarias. As proteases englobam 60% da venda

internacional de enzimas, sendo a enzima de detergente a maior usuária de proteases

[SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].

As proteases também estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como

a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas

proteolíticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no

ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Estes

fatos tornam as proteases um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de

novos compostos farmacêuticos. As enzimas proteolíticas também participam no

catabolismo de proteínas, tanto nas vias degradativas como nas biossintéticas, e na

liberação de hormônios peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de proteínas

precursoras. Certas modificações específicas e seletivas de proteínas durante a ativação

de enzimas ocorrem via proteólise, que também colabora no transporte de proteínas

secretórias na membrana.

Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas em pomadas cicatrizantes e

têm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as proteínas em

peptídeos e aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células; devido a seu papel

despolimerizante, as enzimas extracelulares têm um papel importante na nutrição.

2 OBJETIVO

Mostrar a atividade proteolítica presente no suco de abacaxi, o efeito da

desnaturação protéica por temperatura e o efeito da alteração de solubilidade protéica e

conseqüente precipitação provocados pela adição de álcool ou sal de amônio em solução

de gelatina (colágeno).

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

8 tubos de ensaio de 20 mL

1 tubo de ensaio de 30 mL

Pegador de tubo de ensaio

Estande para tubo de ensaio

Béquer de 100mL da Laborglás

Béquer de 400mL da Laborglás

Béquer de 20mL da Laborglás

Funil de vidro

Papel de filtro

Gelo

Almofariz e pistilo

2 pipetas graduadas de 5mL

Bastão de vidro

Pera

Balança

Estufa

H2O destilada

Solução de Sulfato de Amônio 3mol/L

Etanol

Abacaxi

Gelatina incolor sem sabor

3.2 Métodos

3.2.1 Parte 1 – Extração do suco de abacaxi

Macerou-se os pedaços de abacaxi com o auxílio do almofariz e do pistilo, até

que uma boa quantidade de suco fosse produzida. O suco foi filtrado em funil de vidro

com papel de filtro dentro de um tubo de ensaio de 20mL que se encontrava em um

béquer com gelo para que fosse mantida as propriedades do suco de abacaxi.

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3.2.2 Parte 2 – Preparação da gelatina

Pesou-se 2g de gelatina incolor sem sabor e dissolveu em 20mL de água

destilada em um béquer com a ajuda do bastão de vidro. Após total solubilização a

gelatina derretida foi transferida para um tubo de 20mL e levada à estufa de banho

maria à 60°C. A gelatina ficou na estufa até o momento da sua utilização.

3.2.3 Parte 3 – Ensaio 1

Com a pipeta colocou-se 2mL do suco de abacaxi obtido na parte 1 do

experimento em três tubos de ensaio de 20mL. Colocou-se 2mL de água em um tubo de

ensaio de 20mL. Um tubo com abacaxi e o de água foram mantidos à temperatura

ambiente, os outros dois foram aquecidos, ao mesmo tempo, um à 60ºC e o outro à

100°C durante 5 minutos. Após esse tempo os dois tubos foram resfriados

imediatamente no béquer com gelo. Retirou-se o tubo com a gelatina da estufa e

adicionou-se 2mL em cada um dos quatro tubos. Armazenou-se os 4 tubos à 37°C por

10 minutos. Após o tempo resfriou-se as amostras no béquer com gelo por 15 minutos.

As amostras foram observadas e os resultados anotados.

3.2.4 Parte 4 – Ensaio 2

Com a pipeta colocou-se 2mL de água, sulfato de amônio e etanol, um em cada

tubo de ensaio. Adicionou-se 2mL de gelatina em cada um dos três tubos. As amostras

foram observadas e os resultados anotados.

4 RESULTADOS

7

4.1 – Tabelas e fotos dos resultados

Os resultados obtidos na Parte 1 podem ser observados na Tabela 1:

TABELA 1: A ação das proteases do abacaxi sobre o colágeno

Branco Abacaxi Abacaxi 60º C Abacaxi fervido

Água 2 mL - - -

Amostra - 2 mL 2 mL 2 mL

Gelatina 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL

Resultado Sólido e sem

partículas.

Líquido e sem

partículas.

Líquido e com

pequenas partículas.

Sólido e com

muitas partículas.

As respectivas fotos dos resultados da Tabela 1 estão nas Figuras 2, 3, 4 e 5:

FIGURA 2: Resultado Branco Parte 1

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FIGURA 3: Resultado Abacaxi

FIGURA 4: Resultado Abacaxi 60ºC

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FIGURA 5: Resultado Abacaxi Fervido

Os resultados obtidos na Parte 2 podem ser observados na Tabela 2:

TABELA 1: A ação do etanol e do sulfato de amônio sobre o colágeno

Branco Ensaio 1 Ensaio 2

Água2 mL -

Gelatina2 mL 2 mL 2 mL

Sulfato de

Amônio- 2 mL -

Etanol

Absoluto- - 2 mL

Resultado

Solubilizou, a

solução adquiriu

coloração

amarelada.

Solubilizou

parcialmente, com

formação de placas

sólidas.

Solubilizou

parcialmente, com

formação de

precipitado gelatinoso.

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As respectivas fotos dos resultados da Tabela 2 estão nas Figuras 6, 7 e 8:

FIGURA 6: Resultado Branco Parte 2

FIGURA 7: Resultado Ensaio 1

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FIGURA 8: Resultado Ensaio 2

4.2 – O efeito do suco de abacaxi no colágeno

A desnaturação de proteínas acarreta perda de sua estrutura original (Figura 9).

A proteína assume sua conformação nativa, ocorrendo alteração na conformação

tridimensional das proteínas (estrutura secundária, terciária e quaternária) sem romper

as ligações peptídicas (estrutura primária).

A proteína é dita desnaturada quando sua conformação nativa é destruída devido

a quebra de ligações não-covalentes e o resultado é uma cadeia polipeptídica distendida.

FIGURA 9: Desnaturação de Proteínas

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Um dos agentes de desnaturação de proteínas é ação de ácidos ou base fortes.

Quando adicionamos o suco de abacaxi ao colágeno ocorrem modificações no

pH que resultam em alterações no estado iônico de cadeias laterais das proteínas,

modificando as pontes de hidrogênio e as pontes salinas (associação de grupos iônicos

de proteínas de carga oposta). Como afeta a ionização da proteína, conferem a molécula

uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulsão intramolecular, com

exposição do núcleo hidrofóbico.

4.3 – O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi

Quando elevamos a temperatura do suco de abacaxi, as enzimas presentes no

suco de abacaxi são também desnaturadas, e a capacidade de quebra do colágeno é

corrompida.

Como a estrutura tridimensional específica das proteínas é fundamental para o

exercício de suas funções, alterações estruturais provocadas pela desnaturação

ocasionam a perda parcial ou completa das suas funções. Com o aumento da

temperatura, a velocidade de vibração molecular aumenta. Eventualmente, interações

fracas como as pontes de hidrogênio são rompidas promovendo alterações na

conformação das enzimas presentes no abacaxi.

4.4 – O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução

A adição de solvente orgânicos solúveis em água, como o etanol, ao colágeno

presente na gelatina diminuem a constante dielétrica do meio, interferem com as

interações hidrofóbicas por sua interação com os grupos R não−polares e forma pontes

de hidrogênio com a água e grupos protéicos polares. Os solventes não-polares também

rompem interações hidrofóbicas.

A adição de sais, como o sulfato de amônio a grupos ionizáveis do colágeno,

enfraquecem as interações entre grupos de cargas opostas da molécula protéica. As

moléculas de água solvatam os grupos protéicos, havendo a formação de um precipitado

gelatinoso. As moléculas de água competem pelo sal adicionado tornando a quantidade

de solvente muito pequena e, com isso, promovendo a agregação de moléculas protéicas

e a sua precipitação. Esse efeito é chamado salting out.

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4.5 – Dificuldades técnicas

O suco de abacaxi poderia ter sido coado em antes de ser filtrado, para que os

maiores pedaços fossem tirados primeiro e não interferissem na filtragem de caráter tão

delicado.

5 DISCUSSÃO

5.1 – As proteases do suco de abacaxi

O abacaxi possui uma potente enzima, a bromelina, que leva esse nome pelo fato

de o abacaxi pertencer à família das bromeliáceas. A bromelina foi detectada pela

primeira vez em 1892 por Chittenden. Ela está presente em todas as partes do abacaxi,

porém é no caule que se encontra maiores quantidades, por isso que se diz que a

bromelina não é fornecida em grandes quantidades se apenas for degustado o abacaxi.

A enzima não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto,

porém, seu nível aumenta rapidamente, mantendo-se elevado até o amadurecimento,

onde tem um pequeno decréscimo. Essa é uma das vantagens da utilização das proteases

do abacaxi em comparação com outras proteases vegetais. Apesar da diminuição da

atividade proteolítica durante a maturação, o abacaxi é o único fruto que possui

concentrações relativamente altas de proteases no estado maduro.

5.2 – Purificação de proteínas

A purificação da bromelina pode ser realizada através de um método conhecido

por ALE (Adsorção em Leito Expandido). Esta é uma técnica cromatográfica para

separação e purificação de produtos biológicos diretamente de seu extrato bruto, sem o

uso de centrifugação, microfiltração e outros passos primários de clarificação. Esta

técnica permite que o extrato bruto seja alimentado na coluna cromatográfica sem

tratamento inicial, e enquanto o leito expande, a superfície de contato do adsorvente

aumenta, fazendo que a interação com a molécula alvo seja mais efetiva.

5.3 – A otimização da atividade das proteases

A atividade das proteases pode ser otimizada com o aumento da temperatura e

com a proximidade do pH neutro. Esta temperatura não pode ser muito elevada, senão

irá ocorrer a desnaturação da protease.

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5.4 – O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de

cozimento dos alimentos

A desnaturação de proteínas não tem grande influência na utilidade nutricional

dos alimentos, mas tem grande efeito em outras propriedades como sabor, cor,

estabilidade e solubilidade, ou seja, a desnaturação de proteínas pelo fornecimento de

calor é útil, pois facilita a digestão dos alimentos. Por exemplo, quando cozinhamos um

ovo, as proteínas desnaturadas tornam-se insolúveis e se solidificam, separando-se da

água, o que torna-se melhor para o consumo.

5.5 – A utilização do abacaxi para amaciar carne

Esta propriedade deve-se à bromelina, que é capaz de desdobrar proteínas em

substâncias mais simples como proteoses e peptonas. Ela quebra as proteínas das fibras

musculares e do tecido conjuntivo, que dá liga ao músculo e é um dos principais

responsáveis pela eventual dureza da carne. A relação do suco de abacaxi e os

amaciantes de carne comerciais são de que a bromelina pode ser utilizada na fórmula do

amaciante. Os amaciantes comerciais juntam temperos, fazendo com que não fique

gosto de abacaxi na carne. Um exemplo que temos, é um amaciante de carne da Nestlé,

que utiliza a protease do mamão, a chamada papaína.

6 CONCLUSÃO

Durante o experimento, verificamos que as proteases (enzimas catalíticas

biológicas) atuam nas ligações peptídicas, neste caso, foram às ligações do colágeno e

as quebram. A prova disso é que quando a protease envolvida (bromelina) foi

desnaturada, portanto perdendo sua função, o colágeno reagiu naturalmente, ou seja,

enrijeceu a solução, como mostrado nos experimentos.

Observamos também que uma das vias para o desnaturamento é o aumento da

temperatura, pois a 100 °C a bromelina perdeu totalmente seu poder de reação com o

colágeno. Isto pode ser visto com as fases presentes nos tubos de ensaio. Além da

temperatura, têm-se também a solvatação que foi realizada na segunda parte do

experimento e que demonstrou mesmo com a temperatura sendo ambiente como as

forças nas ligações peptídicas podem modificar-se de acordo com o reagente colocado

para atuar na proteína.

Dessa maneira, acrescentamos mais um grau de complexidade aos organismos

vivos, pois para eles existirem, para que suas proteínas exerçam suas devidas funções e

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não saiam de controle, deve haver intrincados sistemas de controle de temperatura e de

reações bioquímicas.

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- SALLEH, Abuh B., RAHMAN, Rajah A., BASRI, Mahiran: New Lipases and

Proteases. 1ª Ed. Nova Science Publishers: New York, 2006, p. 23-34.

- URL 01: Proteases de Microorganismos. Disponível em:

http://acd.ufrj.br/proteases/ProteaseApres.htm. Acesso em 08/11/2009.

- URL 02: Bromelina. Disponível em:

http://www.todafruta.com.br/todafruta/mostra_conteudo.asp?conteudo=19499. Acesso

em 08/11/2009.

-URL 03: Bromelina como amaciante natural de carnes.

http://www.sbpcnet.org.br/livro/57ra/programas/senior/RESUMOS/resumo_1398.html.

Acesso em 08/11/2009.

- URL 04: Abacaxi. http://supermundo.abril.com.br/busca/?qu=abacaxi. Acesso em

08/11/2009.

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