Ap4 - Anticorpos Monoclonais

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Aula prática: Anticorpos Monoclonais

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  • 1. Anticorposmonoclonais Aula 4 Maio de 2003

2. Osanticorposquesurgemnumanimalemrespostaa umnico antgeno complexosoheterogneos. Soformados vrios clones diferentes de clulas B quediferenciam-se em plasmcitos, cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo,capazdereagircomumdiferenteeptopo no antgeno complexo.Estes anticorpos so denominados policlonais .linfcitos/plasmcitos ... anticorpos antgeno 3. Osanticorposquesurgemapartirdeumnico clone declulas,como,por exemplo, numtumordeplasmcitos(mieloma) so homogneos,isto ,soiguais entre si. So ditos anticorpos monoclonais. Esse histograma mostra uma distribuio tpica de afinidadesdeanticorposemumantissoro paraumdeterminanteantignicocomparando-ascomaafinidadenicacom que um anticorpomonoclonalseligaao seu determinanteantignico. Anticorpo monoclonal Plasmcitos derivados de um nico linfcito B pro- duzem anticorpos monoclonais, portanto idnticos entre si.Afinidade de anticorpo (K) Frao de anticorpo total (%)(escala log) 4. Omtodoenvolvefusocelular(ou hibridizao de clulas somticas), entre um linfcito Bnormalprodutor de anticorpo e uma linhagem demieloma , seguindo-se subsequentementeaseleodeclulasfusionadasquesecretem anticorpo daespecificidade desejada , derivada do linfcito B normal. Tais linhagenscelulares imortalizadas, produtorasdeanticorpose derivados de fuses, so chamadas hibridomas. Os anticorpos queelasproduzemsoanticorposmonoclonais Mtodo de produo de anticorpo monoclonal(tecnologia dos hibridomas) Antgeno X Os monoclo- nais tm sidoproduzidos prin- cipalmente em camundongos. Veja a seguir Clulas do bao isoladas de camundongo imunizado com antgeno X. 5. Mistura de clulas do bao incluindo algumas produtoras de anticorposanti -X Linhagem tumoral de mieloma mutante,imortalizadaenocresceemmeio seletivo(HAT). incapazdeproduziranticorpos. Fusoin vitro Mistura de clulas fusionadas e no fusionadas. Seleoin vitroem meio de cultivo - HAT 6. Pesquisa de anticorpo anti- X nos sobrenadantes para posterior expanso dos clones positivos. Hibridomas produzindo anti corpo anti- X (Ac monoclonal anti-X). . Somente clulas fusionadas hbridas (hibridomas) crescem. Preparada a diluio no cultivo de modo que em cada poo fique s uma clula me /clone. 7. O sucesso dessa tcnica depende do desenvolvimento das linhagens de mieloma que cresam em meio normal de cultura mas no cresam em um meio seletivo (HAT - hipoxantina, aminopterina e timidina), porque lhes faltamgenes funcionais, necessrios para a sntese de DNA pela via de salvao (genes que codificam as enzimas TK e HGPRT). Esses genes esto presentes nas clulas normais, de modo que somente os hbridos e os linfcitos B continuam a crescer no meio seletivo. Aps a fuso, a aminopterina presente no meio bloqueia a sntese de DNA pela via de novo. As clulas podem ento utilizar a via de salvao, j que o meio suplementado com timidina e hipoxantina.Como aslinhagensmutantes, no expressam as enzimas necessrias para a referida via de salvao,no vo conseguir sobreviver nesse meio. Como os linfcitos normais possuem vida curta em cultura, somente os clones hbridos sobrevivero e proliferaro secretando anticorpos com a especificidade da clula me que cresceu sozinha e foi selecionada no poo no incio do procedimento. 8. Via de novo Nucleotdeos Via de salvao Timidina Hipoxantina timidina cinase (TK) hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT) Veja umresumo dos dois caminhos possveispara a sntesede nucleotdeos pela clula. Sea viadenovoestiver bloqueada (como abaixo), s resta a via de salvao : Fosforribosilpirofosfato + Uridilato bloqueio com aminopterina 9. Ahibridizaode linfcitosomelhormtodoparaproduzirumanticorpomonoclonalcontraumdeterminanteantignicoconhecido.Este anticorpo podeserusado para identificar antgenos desconhecidos presentes numa mistura,porquecadaanticorpoespecficoparaapenasumdeterminanteantignico .Algumasdasaplicaesmaiscomuns dos anticorpos monoclonais incluem as que se seguem. 10. 1. Identificaodemarcadoresfenotpicosnicosparaostiposcelularesindividuais. Abaseparaaclassificaomodernade linfcitos e fagcitos mononucleares a ligao de anticorpos monoclonais populao especficos . Estes tm sidousadosparadefinirmolculas tpicas de cada clula. CD3 TCR CD2 CD28 CD5 CD7 CD4 CD8 Th Tc MFR CD64 CD32 CD16 HLA-D CD35 CD11b LFA-1 Macrfago 11. 2. Imunodiagnstico: odiagnsticodemuitasdoenasinfecciosas e degenerativas, depende da deteco de ant- genos e/ouanticorpos especficosna circulao ounos tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios. anticorpos monoclonais aglutinao Exemplo: reao de aglutinao em latex Para a imunodosagem de hormnios, marcadores tumorais e de outras protenas sricas, sempre se usaanticorpos monoclonais soro do pacientecontendo antgeno com vrios epitopos idnticos partculas de latex adsorvidas com os monoclonais 12. 3.Diagnstico e terapia de tumores: anticorpos monoclonais especficosparatumoressousadosparaadetecodetumoresportcnicasdeimagensepara a imunoterapia. 13. 4. Anlisefuncionaldemolculasdasuperfcie celular e secretadas:napesquisaimunolgica,osanticorposmonoclonais que seligam a molculas da superfcie celular e estimulam ouinibemfunes celulares, so instrumentos inestimveisparadefinirafunodasmolculasdesuperfcie,incluindoosreceptoresparaantgenos .Anticorposqueneutralizamcitocinassousadosparadetectar a presena e os papis funcionais destes compostos proteicosin vitroein vivo. 14. A Biologia Molecular tem traado o caminho paraaproduodeanticorposmonoclonais(mAc)deespecificidade, afinidade eisotipos definidos. Istopermiteaosimunologistas o desenvolvi-mento de anticorpos de determinadaespecificidadenocamundongo, utilizando-se ento os genes que expressamesta especificidade (genes que codificam VH e VL), para a construo de vetores de clona- gem e expresso, associando-os aos genes paraos domnios constantes de anticorposhumanos. OmAcresultante (humanizado) de muito baixaimunogenicidadeparaa nossa espcie, podendo serutilizado em tratamentos especficos. FIM