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Anticorpos Monoclonais Diagnóstico e Fármacos
inovadores
Fernando Thomé Kreutz, M.D./Ph.D.
FK-Biotec – PUCRS – CNPq 1B
Estrutura do anticorpo Cadeia dividida em Domínios:
Leve – 2 (VL e CL)
Pesada – 4 (VH, CH1, CH2, CH3)
Pontas do Y representam o Paratopo (VH + VL) amino terminal;
Características de reconhecimento e afinidade são determinados pelo Paratopo;
Uma célula B produz um único tipo de anticorpo!
Kreutz, FT 1997
Estrutura do Anticorpo
Ligação Paratopo-Epítopo
Antígeno e Anticorpo Complexo Ag-Ac
Estrutura do Paratopo (VH e VL) Frame work - Região de Borda
CDR -Região Determinante de Complementaridade;
<---------L1---------> <--L2-> <----L3--->
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Anticorpos Monoclonais (1976)
Célula B Mieloma
• Produz um anticorpo
específico
• Morre em cultura
• Não Produz anticorpo
• Imortal em cultura
Hibridoma
FUSÃO
• Produz um anticorpo
específico
• Imortal em cultura
Etapas para Produzir umAcM - HIBRIDOMA
Imunização - CFA e IFA – Intra-esplênica (18 a 30 dias).
Isolar linfócitos – Baço
Cultivo de SP2-0
FUSÃO celular – ARTE E TÉCNICA!
Seleção Metabólica –MEIO HAT – AMINOPTERINA
SP2-0 – sensível ao meio HAT – bloqueio da via de novo –mutação na via de salvagem.
Linfócito célula Terminal – morre em cultura, possui a via de novo e de salvagem.
Anticorpos Monoclonais Seleção
Célula B Mieloma
• Sintese de nucleotídios
•De novo
•Salvagem - Reciclagem
• Sintese de nucleotídeios
•De novo
•Mutação na via de salvagem
Hibridoma
FUSÃO
MEIO HAT – Bloqueia
a via de novo.
Sobrevive utilizando a
via de salvagem da célula B
Etapas para Produzir umAcM - HIBRIDOMA
Seleção dos clones – positivos – definir ensaios
Expansão e criopreservação
Retestagem
Reclone
Produção - Ascite ou cultura de células.
Banco de Hibridomas.
Produção de Anticorpos Monoclonais (FK)
ELISA - Imunométrico
Y YY Substrato
Anti-IgG ou IgM
humano - conjugado
Soro do paciente
Antígeno (Insulina)
ELISA - Sanduíche
Substrato
Anti-Albumina -
conjugado
Amostra paciente
Anti-Albumina
ELISA - Captura
Substrato
Antígeno -
conjugado
Soro do paciente
Anti-IgG ou IgM
humano
Vantágens dos AcM
Sem variação de lote a lote.
Alta capacidade produtiva.
Baixo custo para produção.
Capacidade de selecionar Ac com características imunoquímicas desejáveis.
Excelentes para diagnóstico.
Imunoensaios – Ag-Ac-Marca!
Problemas com AcM convencionais para uso in vivo
Os anticorpos monoclonais MURINOS
Não próprios
Alto peso molecular (160 KDa)
Proteíco
Altamente Imunogênico
HAMA (“Human Anti-Mouse Antibody”)
Tipos de Anticorpos Monoclonais
Anticorpo Murino Anticorpo Humanizado
Anticorpo Quimérico
Sequência Humana
Sequência Murina
Anti-TNFalfa Infliximab (Remicade®) Aprovado FDA 1998;
Anti-Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF );
Anticorpo Monoclonal Quimérico (IgG1-Kappa);
P.M.149 KDa;
Afinidade: Kd 1, 8 x 109 M-1
Frascos contendo 100 mg de anticorpo liofilizado;
Dose 3 a 5 mg/Kg com intervalos de 2 a 8 semanas;
~ 4 a 5 g/paciente.ano (40-50 frascos)
Expresso em SP2/0 – perfusão – Proteína A
Anti-Her2 Trastuzumab (Herceptin®)
Aprovado FDA 1998;
Anti-domínio extra celular do receptor ErbB-2/Her2/neu (oncogene).
Anticorpo Monoclonal Humanizado (IgG1-Kappa);
P.M. 149 KDa;
Afinidade: Kd 4,7 x 109 M-1
Frascos contendo 440 mg de anticorpo liofilizado;
Dose inicial 4 mg/Kg + semanal de 2 mg/Kg
8 g/paciente.ano.
Expresso em CHO (aderente) Roller – Proteína A
Anti-CD20 Rituximab (Mabthera®) Aprovado FDA 1997;
Anti-CD20
Anticorpo Monoclonal Quimérico (IgG1-Kappa);
P.M. 145 KDa;
Afinidade: Kd 7,4 x 109 M-1
Frascos contendo 100 mg de anticorpo líquido (10 mg/ml);
Dose inicial 375 mg/m2 / semana 4 a 8 doses.
~2.5 a 5 g/paciente
Expresso em CHO ou SP2/0 Suspensão – Proteína A
MAb hV12.22 – Novo alvo;
Antígeno solúvel e ligado a membrana.
Tumores do TGI.
Desenvolvimento pré-clinico.
5 novos Biosimilares (pipeline).
Sistemas de Produção em alta densidade – redução de volume.
Escalonamento de produção.
Anticorpos Monoclonais Terapêuticos Humanizados
Pesquisa Faz [email protected]
