Anestesicos_Tese_UFMG

II

Janice Henriques da Silva

Efeito dos anestsicos inalatrios no transportador de dopamina em

fatias de crtex cerebral de ratos

Tese apresentada ao curso de Ps-graduao em Cincias Biolgicas: Farmacologia Bioqumica e Molecular da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas.

Orientadora: Profa. Cristina Guatimosim Fonseca

Co-Orientador: Prof. Renato Santiago Gomez

BELO HORIZONTE

2006

II

SUPORTE FINANCEIRO Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Neurofarmacologia do Departamento de Farmacologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais, com o auxlio das seguintes instituies: Agncia Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP). Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq). Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES). Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). Pr-Reitoria de Pesquisa da UFMG (PRPq-UFMG). Programa Avanado de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (PADCT). Programa de Ncleos de Excelncia (PRONEX).

III

Ao meu marido Pedro, pelo amor, compreenso e apoio.

Aos meus pais, Rosa de Maio e Jos Henriques, sempre presentes.

IV

AGRADECIMENTOS Deus, primeiramente, que sempre ilumina meus passos.

Ao professor Marcus Vincius Gomez que me acolheu no laboratrio de Neurofarmacologia, pela ateno, boa vontade, esclarecimentos de minhas dvidas e suporte cientfico que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por tudo. Aos meus orientadores, Cristina Guatimosim Fonseca e Renato Santiago Gomez, pela iniciao no campo da pesquisa, confiana, ensinamentos e orientao na realizao deste trabalho. Aos professores Antnio Mourth Filho e Edmundo Pereira que foram meus maiores incentivadores, pelos conselhos e amizade. professora Virgnia M. Vidigal Fernandes pela contribuio neste trabalho, conselhos e amizade. Muito obrigada. Aos professores Marco Antnio Mximo Prado e Helton Reis pelas sugestes para a finalizao deste trabalho. Aos alunos de iniciao cientfica Paulo Henrique Diniz e Juliara Mrcia Henriques da Silva pela ajuda na realizao dos experimentos e pelas sugestes cientficas.. A Adriane Aparecida pela amizade e ajuda no dia-a-dia do laboratrio. s minhas amigas especiais: Aninha, Mel e Lucimar pela sincera amizade, conselhos e sugestes que contriburam para este trabalho. s minhas novas amigas Luciene, Grace e Andria por estarem sempre disponveis para solucionar minhas dificuldades, pela ajuda nas diversas situaes e pela amizade. s minhas maravilhosas irms: Jnia e Juliara pelo carinho em todos os momentos importantes de minha vida. Aos meus amigos do laboratrio : Cristina Martins , Brulio, Clio, Daniela, Hernani, Bento, Dbora, Renan, Fabiana, Bruno Resende, Alan, Monaliza, Rodrigo, pela tima convivncia e amizade. Aos amigos e colegas da PUC MINAS, FUMEC e UNINCOR pelo apoio consistente e incentivo carinhoso.

V

Sumrio

Lista de Abreviaturas .................................................................................................... IX

Lista de Figuras.................................................................................................................X

Lista de Tabelas............................................................................................................XIII

Lista de Quadros .......................................................................................................... XIV

Resumo............................................................................................................................XV

Abstract ........................................................................................................................ XVI

1 Introduo

1.1 Anestsicos inalatrios .................................................................................02

1.1.1 Efeito dos anestsicos inalatrios no Sistema Nervoso Central ..........03

1.1.2 Mecanismo de ao dos anestsicos inalatrios ..................................05

1.1.3 Efeitos dos anestsicos inalatrios na liberao de dopamina.............08

1.2 Transmisso dopaminrgica..........................................................................10

1.2.1 Localizao dos neurnios dopaminrgicos ........................................10

1.2.2 Sntese e metabolismo da DA..............................................................11

1.2.3 Liberao de dopamina.................................................... ....................12

1.2.3.1 Liberao dependente de clcio ...............................................12

1.2.3.2 Liberao independente de Ca2+ ..............................................14

1.2.4 Receptores Dopaminrgicos......................................... .......................17

1.2.5 Relevncia Clnica............................................................................ ...18

VI

2 Objetivos

2.1- Objetivo Geral ................................................................................................21

2.2- Objetivos Especficos .....................................................................................21

3 Material e Mtodos

3.1 Drogas e Reagentes..........................................................................................24

3.2 Solues ...........................................................................................................25

3.3 Animais ............................................................................................................27

3.4 Determinao da liberao de DA em fatias de crtex cerebral de ratos ........28

3.4.1 Obteno das fatias de crtex cerebral de ratos ...................................28

3.4.2 Marcao das fatias com [3H]-DA.......................................................28

3.4.3 Lavagem das fatias com DA no radioativa .......................................28

3.4.4 Incubao das fatias ............................................................................29

3.4.5 Administrao e mensurao da concentrao do sevoflurano e

halotano..................................................................................................................29

3.4.6 Contagem da radioatividade do sobrenadante .....................................30

3.4.7 Anlise estatstica dos resultados.........................................................30

3.5 Mensurao de fosfato em fatias de crtex cerebral de ratos .......................30

3.5.1 Obteno das fatias de crtex cerebral de ratos.......................... .........31

3.5.2 Incubao das fatias e administrao das drogas..................... ............32

3.5.3 Mensurao de fosfato no meio de incubao .....................................32

3.5.4 Anlise estatstica dos resultados ........................................................33

VII

4 Resultados

4.1 Liberao de [3H]-DA em fatias de crtex cerebral de ratos na presena do

sevoflurano e halotano ...........................................................................................35

4.2 Efeito do tempo de incubao na liberao de [3H]-DA induzida pelo

sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos ................................39

4.3 Determinao do papel do on clcio na liberao de [3H]-DA induzida por

sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos ................................42

4.4 Participao dos canais de sdio sensveis TTX na liberao de [3H]-DA

induzida pelo sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos..........46

4.5 Liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano e halotano em fatias de crtex

cerebral de ratos na presena da reserpina.............................................................49


cerebral de ratos em baixa temperatura (12 C).....................................................52 4.7 Efeito do gradiente de Na+ na liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano

e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos ....................................................55


cerebral de ratos na presena de inibidores do DAT ................... .........................58

4.9 O papel do transportador de noradrenalina (NET) na liberao de dopamina

induzida pelo sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos..........61

4.10 Liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano e halotano em fatias de

crtex cerebral de ratos na presena da ouabana. .................................................64

4.11 A participao da bomba Na+/K+ ATPase na liberao de DA induzida pelo

sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos................ ................68

VIII

4.12 Efeito do sevoflurano, halotano e GBR12909 na captao da DA em fatias

de crtex cerebral de ratos .......................................................................... .........72

5 Discusso e Concluso .........................................................................................76

6 Referncias Bibliogrficas...................................................................................92

IX

LISTA DE ABREVIATURAS

Ci micro Curie M micro Molar [3H]dopamina dopamina triciada [Ca2+]i concentrao de clcio livre no citosol [Na+]i concentrao de sdio livre no citosol AMPc Monofosfato de adenosina cclico ANOVA Anlise de varincia ATP adenosina trifosfato BABTA-AM 1,2-bis (O-aminofenoxi) etano-N,N,N,,N, cido tetra

(acetoximetil) ster BIS ndice biespectral Ca2+ ons clcio

Cd2+ Cdmio

CCSV canais de clcio sensveis voltagem Cl - ons cloreto COMT enzima catecol-O -metiltransferase CSSV canais de sdio sensveis voltagem DA dopamina DAG diacilglicerol DAT transportador de dopamina Dpm desintegrao por minuto EC50 concentrao efetiva capaz de liberar 50% da liberao

mxima EGTA cido etileno glicol-bis (-amino ter) N,N,N,N,-tetraactico EEG Eletroencefalograma

EPM erro padro da mdia GABA cido -aminobutrico KCl cloreto de potssio MAO enzima monoaminoxidase NA noradrenalina Na+ ons sdio Na+/Ca2+ trocador sdio-clcio NMDA N,metil D-aspartato POPOP 1,4-bis 2 (5-feniloxazolil) benzeno PPO 2,5-difeniloxazol Rpm rotao por minuto SNC sistema nervoso central SRAA sistema reticular ativador ascendente TTX tetrodotoxina VMAT transportador vesicular das monoaminas

X

Lista de Figuras

Figura 1: Dose-resposta do sevoflurano na liberao de [3H]-DA em fatias de crtex

cerebral de ratos.. .............................................................................................................. 37

Figura 2: Dose-resposta do halotano na liberao de [3H]-DA em fatias de crtexcerebral

de ratos ...............................................................................................................................38

Figura 3: Curva de tempo de incubao do sevoflurano na liberao de [3H]-DA em fatias

de crtex cerebral de ratos .................................................................................................40

Figura 4: Curva de tempo de incubao do halotano na liberao de [3H]-DA em fatias de

crtex cerebral de rato........................................................................................................41

Figura 5: Efeito do EGTA, Cd+2 e BAPTA na liberao de [3H]-DA induzida por

sevoflurano em fatias de crtex cerebral de ratos..............................................................43


halotano em fatias de crtex cerebral de ratos ...................................................................44

Figura 7: Efeito do EGTA, Cd+2 e BAPTA na liberao de [3H]-DA induzida por KCl

em fatias de crtex cerebral de ratos..................................................................................45

Figura 8: Efeito da TTX na liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em fatias de

crtex cerebral de ratos .....................................................................................................47

Figura 9: Efeito da TTX na liberao de [3H]-DA induzida por halotano em fatias de

crtex cerebral de ratos ......................................................................................................48

XI

Figura 10: Efeito da reserpina na liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em

fatias de crtex cerebral de ratos........................................................................................50

Figura 11: Efeito da reserpina na liberao de [3H]-DA induzida por halotano em fatias


Figura 12: Liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em fatias de crtex cerebral

de ratos em baixa temperatura (12 C) ..............................................................................53

Figura 13: Liberao de [3H]-DA induzida por halotano em fatias de crtex cerebral de

ratos em baixa temperatura (12 C) ...................................................................................54

Figura 14: Efeito do gradiente de Na+ na liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano


Figura 15: Efeito do gradiente de Na+ na liberao de [3H]-DA induzida pelo halotano


Figura 16 : Efeito da nomifensina e do GBR12909 na liberao de [3H]-DA induzida por

sevoflurano em fatias de crtex cerebral de ratos..............................................................59

Figura 17 : Efeito da nomifensina e do GBR12909 na liberao de [3H]-DA induzida por

halotano em fatias de crtex cerebral de ratos ...................................................................60

Figura 18 : Efeito da nisoxetina na liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em

fatias de crtex cerebral de ratos........................................................................................62

Figura 19 : Efeito da nisoxetina na liberao de [3H]-DA induzida por halotano em fatias


XII

Figura 20: Liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em fatias de crtex cerebral

de ratos na presena de ouabana .......................................................................................66

Figura 21: Liberao de [3H]-DA induzida por halotano em fatias de crtex cerebral de

ratos na presena de ouabana ...........................................................................................67

Figura 22: Liberao de fosfato inorgnico em fatias de crtex cerebral de ratos na

presena de ouabana e/ou sevoflurano .............................................................................70

Figura 23: Liberao de fosfato inorgnico em fatias de crtex cerebral de ratos na

presena de ouabana e/ou halotano ..................................................................................71

XIII

Lista de Tabelas

TABELA 1 - Contagem da radioatividade das fatias de crtex cerebral de ratos na

presena do sevoflurano.....................................................................................................74

TABELA 2 Contagem da radioatividade das fatias de crtex cerebral de ratos na

presena do halotano..........................................................................................................75

XIV

Lista de Quadros

QUADRO 1 Vias dopaminrgicas do SNC........................................................................... 11

XV

Resumo

Os anestsicos inalatrios parecem afetar a transmisso sinptica, mas suas

aes no sistema nervoso central permanecem obscuras. A dopamina um

neurotransmissor catecolaminrgico que exerce importantes funes no sistema nervoso

central e, assim , possvel que a sua liberao possa ser modulada pelos anestsicos

inalatrios. Dessa forma, a investigao dos efeitos dos anestsicos na liberao deste

neurotransmissor pode fornecer informaes adicionais em relao aos mecanismos que

contribuem com as aes destes agentes durante a anestesia. No presente estudo, fatias de

crtex cerebral de ratos foram marcadas com [3H]dopamina objetivando-se estudar o

efeito dos anestsicos inalatrios, sevoflurano e halotano, na liberao deste

neurotransmissor. O sevoflurano (0,46 mM) e o halotano (0,048 mM) aumentaram

significativamente a liberao de [3H]dopamina em fatias de crtex cerebral de ratos.

Esse efeito foi independente do clcio extra e intracelular, alm de no ter sido afetado

pela presena da TTX (bloqueador dos canais de sdio sensveis a voltagem) e reserpina

(inibidor do transportador vesicular das monoaminas). Esses dados sugerem que a

liberao de dopamina induzida pelos anestsicos independente dos processo

exocittico e que, possivelmente, essa liberao pode ser via transportador de dopamina.

Experimentos realizados em baixa temperatura ou com diminuio do on sdio no meio

de incubao indicaram que a liberao de dopamina induzida pelos anestsicos foi

significativamente reduzida. Esse efeito tambm foi observado quando utilizou-se

inibidores do transportador de dopamina e noradrenalina (GBR12909 e nisoxetina,

respectivamente). A ouabana, um inibidor da bomba Na+/K+ ATPase, conhecida por

estimular a liberao de dopamina via transportador de membrana. Na presena desta

drogra a resposta evocada pelos anestsicos foi reduzida. No entanto, experimentos

adicionais mostraram que os anestsico halotano e sevoflurano no inibem a bomba de

Na+/K+ ATPase. Em concluso, este estudo indica que o sevoflurano e o halotano

aumentam a liberao de dopamina em fatias de crtex cerebral de ratos principalmente a

partir de transportadores de membrana desse neurotransmissor.

XVI

Abstract

Inhalatory anesthetics affect synaptic transmission, but little is known about

their actions in the central nervous system.

Dopamine is a catecholaminergic neurotransmitter that has important functions in the

central nervous system and it is possible that its release can be modulated by inhalatory

anesthetics. The study of inhalatory anesthetics effects in the neurotransmitter release

could provide further information about the mechanisms that contribute with the actions

of these agents during anesthesia. In this study, cortical slices of rat brain were labeled

with [3H] dopamine to observe the effects of sevoflurane and halothane in the release of

this neurotransmitter. Dopamine release was significantly increased in the presence of

sevoflurane (0,46 mM) and halothane (0,048 mM) were incubed. This effect was

independent of extracellular or intracellular calcium, and it was not affected by TTX

(blocker of voltage dependent sodium channels) or reserpine (an blocker of vesicular

monoamine transporter). These data suggest that dopamine release induced by anesthetics

is independent of the exocytotic process and that this release would be mediated by the

dopamine transporter. Experiments using low temperature or by decreasing sodium

concentration in the incubation media indicated that dopamine release induced by

anesthetics was considerably reduced. The same effect was also observed when dopamine

and noradrenaline transporter inhibitors were used (GBR12909 and nisoxetine,

respectively). Ouabain, Na+/K+ ATPase pump inhibitor, is known for stimulating

dopamine release through the membrane transporter. In its presence, the evoked response

by anesthetics was decreased. Nevertheless, further experiments demonstrated that

halothane and sevoflurane did not inhibit the Na+/K+ ATPase pump. In conclusion, our

study strongly suggests that halothane and sevoflurane increase dopamine release in

cortical slices of rat brain and that this release is mediated by the dopamine transporter

present in the plasma membrane.

1. Introduo

21.1 Anestsicos inalatrios

Os anestsicos inalatrios so utilizados como auxiliares em procedimentos

cirrgicos visando deixar o paciente inconsciente e insensvel aos estmulos dolorosos. Em

1846, o dentista William W. Morton introduziu a anestesia com ter em cirurgias. Assim, a

anestesia geral , por razes histricas, uma tcnica inalatria que, atravs do estudo dos

diversos anestsicos volteis que foram surgindo, possibilitou o desenvolvimento e o

aperfeioamento de muitas especialidades cirrgicas. No entanto, apesar de passado mais

de um sculo, o mecanismo de ao desses agentes volteis no est bem esclarecido e

permanece controverso (Antlkowiak, 2001).

Os anestsicos inalatrios constituem um grupo heterogneo de agentes, incluindo

o ter, o halotano, o sevoflurano, o isoflurano, dentre outros. O halotano, introduzido em

1956, foi o primeiro de uma srie de agentes anestsicos no inflamveis. Ele possui

propriedades que permitem uma perda de conscincia rpida, entretanto a sua margem de

segurana no ampla. Dentre as reaes adversas desse anestsico podemos citar a

depresso cardiovascular com queda da presso sangunea e frequncia cardaca (Saraiva e

cols., 2002). O sevoflurano um agente anestsico halogenado caracterizado por um baixo

coeficiente de partio sangue:gs, permitindo uma rpida induo e recuperao

anestsica. Esse anestsico foi sintetizado nos Estados Unidos em 1968 e, somente em

1990 foi liberado para uso clnico no Japo e se tornou disponvel na Inglaterra e Amrica

em 1995. Atualmente, esse anestsico inalatrio tem sido largamente utilizado na prtica

clnica, pois alm de possuir baixo coeficiente de solubilidade no sangue e no tecido

adiposo, proporciona pouca irritao respiratria durante a induo e o seu cheiro mais

aceitvel pelos pacientes. Alm disso, uma caracterstica clnica importante observada na

presena de sevoflurano que, ao contrrio de outros anestsicos volteis, como o halotano

e isoflurano, este no altera a freqncia cardaca (Patel e cols., 1996; revisto por Duffy &

Matta, 2000).

31.1.1 Efeito dos anestsicos inalatrios no Sistema Nervoso Central

Os anestsicos inalatrios so administrados sistemicamente e exercem seus

principais efeitos sobre o sistema nervoso central (SNC). Estabelecer como os anestsicos

inalatrios agem se torna difcil, principalmente pelo fato de que o SNC extremamente

complexo e, apesar dos progressos obtidos, temos apenas um conhecimento rudimentar

sobre a sua fisiologia. H relatos em diversos estudos de que os anestsicos volteis atuam

em diferentes locais do SNC (Collins e cols., 1995; Antognini e cols., 2000). No entanto,

ainda no foi possvel explicar de modo especfico onde se inicia a descontinuidade da

conduo do impulso nervoso para produzir amnsia, inconscincia e imobilidade.

Atualmente existem muitos estudos em animais demostrando que os anestsicos

inalatrios atuam na medula espinal dificultando a transmisso do impulso nervoso para o

tlamo e crtex cerebral (Antognini e cols., 2000). Sendo a medula uma regio que recebe

estmulos e envia respostas maior parte do corpo, possvel que a ao imobilizante

destes agentes se processe inicialmente nas estruturas medulares, mas a inconscincia e

amnsia ocorrem como resultado da ao dos anestsicos volteis em regies supraespinais

(Eger e cols., 1997).

Os anestsicos inalatrios diminuem de forma global o fluxo sanguneo e o

metabolismo de glicose e deprimem, seletivamente, vrias regies supraespinais. Por

exemplo, baixas concentraes de isoflurano reduzem a ativao cerebral em vrias

regies distintas do crtex. No entanto, a atividade no crtex motor, crtex visual e regies

subcorticais permanece inalterada (Heinke e cols., 2001). Um outro estudo demonstra que

os anestsicos inalatrios, como o enflurano, o isoflurano e o sevoflurano, diminuem o

metabolismo cortical e induzem a inconscincia em concentraes abaixo daquelas

necessrias para suprimir a resposta motora ao estmulo doloroso (Campagna e cols.,

2003).

4Apesar de no se saber quais as regies especficas do encfalo que so alvos dos

anestsicos inalatrios, uma ateno especial tem sido focalizada nas estruturas que

desempenham papel relevante na regulao da conscincia. Vrias hipteses sobre o estado

da conscincia tm sido postuladas nas ltimas dcadas, mas ainda no esto bem

estabelecidas as regies do SNC responsveis pela regulao desse estado (John, 2001).

Acredita-se que a conscincia seja uma funo integrativa de muitas reas do crebro,

incluindo o crtex pr-frontal, frontal, pr-central e para-central, alm do tlamo, sistema

lmbico e gnglios da base segundo a teoria integrativa (theorethical framework)

(Edelman, 2003). De acordo com essa teoria, a conscincia resulta da integrao de muitos

inputs oriundos de diferentes reas cerebrais e esta integrao ocorreria em um perodo

de tempo menor que 500 ms. Assim, os anestsicos inalatrios podem induzir a perda da

conscincia pela inibio de uma rea especfica ou pela depresso de vrias reas

integradas conscincia.

Os estudos tm focalizado os ncleos intralaminares do tlamo como centro de

integrao da conscincia atravs das diversas conexes com o crtex e o sistema reticular

ativador ascendente (SRAA) (revisto por Perry e cols., 1999). importante ressaltar

tambm que o tlamo, h muito tempo, considerado como rgo integrante das vias

ascendentes, sendo admitido que o centro da percepo da dor parte de sua estrutura que

tem conexes com o crtex cerebral onde a sensibilidade dolorosa conscientizada e

classificada. Alm disso, a avaliao tomogrfica das regies de consumo de glicose em

voluntrios com anestesia profunda indica que o tlamo e o SRAA do tronco enceflico

tm metabolismo de glicose mais alterado que outras regies (Campagna e cols, 2003).

Assim, possvel que a ao dos anestsicos gerais se relacione com a inibio da

sensibilidade dolorosa no tlamo.

O SRAA, o tlamo,a ponte,a amgdala e o hipocampo esto envolvidos na

cognio, memria, aprendizagem, sono e viglia. H evidncias da ao dos anestsicos

5inalatrios sobre o SRAA. Sendo esta estrutura muito importante no estado de viglia,

possvel que os frmacos que induzem o sono e a inconscincia possam ter ao sobre a

mesma. Dados experimentais demonstraram inibio reversa do SRAA do tronco

enceflico pelos anestsicos gerais (Clark & Rosner, 1973). Entretanto, foi demonstrado

que leses extensas no SRAA suprimem a resposta eletroencefalogrfica estimulao,

porm os animais continuam completamente despertos (Feldman & Waller, 1962).

Portanto no h evidncias experimentais de que o SRAA seja o nico ou mesmo o local

principal de ao dos anestsicos inalatrios.

Estudos realizados com eletroneuromonitorao proporcionaram novas evidncias

para o local e o mecanismo de ao dos anestsicos gerais. Esses agentes alteram a

amplitude e a latncia das ondas do eletroencefalograma (EEG), indicando que h ao

desses frmacos principalmente sobre o crtex cerebral. A anlise biespectral do EEG

expressa pelo ndice biespectral (BIS) que tem valores de 0 a 100, sendo que 100

corresponde ao mximo de viglia e 0 ao mximo de inconscincia. Durante o estado

anestsico o BIS est sempre abaixo de 50, geralmente em torno de 40. Ao despertar est

prximo de 90 (Sebel e cols., 1997).

Contudo, embora existam muitos dados sobre os efeitos anestsicos nas vrias

regies do encfalo, nenhum conjunto de dados suficientemente completo ou consistente

a ponto de permitir a concluso de que os anestsicos produzem suas aes atravs de um

efeito especfico em determinada regio do SNC.

1.1.2 Mecanismo de ao dos anestsicos inalatrios

Os anestsicos inalatrios como ter, xido nitroso, xennio, halotano, sevoflurano,

entre outros, constituem um grupo heterogneo de substncias que, juntas, no pertencem a

6nenhuma classe qumica reconhecvel. As teorias sobre a anestesia geral surgiram na

tentativa de explicar como compostos to diversos podem produzir o mesmo efeito global.

As hipteses sobre as bases moleculares da anestesia geral, no decorrer da sua

histria, mudaram consideravelmente. Meyer e Overton foram os primeiros a propor um

mecanismo molecular da ao anestsica, a hiptese lipdica. De acordo com a mesma, o

mecanismo da anestesia relaciona-se intimamente com a propriedade destes agentes de se

dissolverem na bicamada lipdica, causando, assim, mudanas crticas nas propriedades

fsico-qumicas da membrana celular (Miller e cols., 1961).

A hiptese lipdica foi universalmente aceita por mais de 60 anos. Entretanto,

Franks e Lieb (1981, 1978) propuseram que os anestsicos gerais atuariam diretamente em

protenas da membrana celular ao invs de interagirem com a bicamada lipdica. A

hiptese protica surgiu a partir da observao do fenmeno da interrupo, em que ocorre

uma perda da atividade anestsica alm de um determinado limite de aumento no

comprimento da cadeia de hidrocarboneto, muito embora a solubilidade lipdica continue a

aumentar. Essa hiptese foi reforada atravs da observao de que vrios anestsicos

modulavam a atividade de uma protena, a luciferase do pirilampo (vaga-lume). Os

anestsicos se ligariam a um domnio hidrofbico desta protena inibindo sua funo de

emisso de luz (Franks & Lieb, 1984). Alm disso, a descoberta de que estereoismeros de

anestsicos, igualmente solveis em lipdios, podem ser diferentemente efetivos em causar

anestesia tambm corroborou com a hiptese protica (Franks & Lieb, 1991; Harris e cols.,

1992; revisto por Franks, 2006). Assim, a partir da correlao da potncia anestsica com

solubilidade lipdica e da capacidade de ligao protica dos anestsicos inalatrios,

acredita-se que, provavelmente, ocorra uma ligao destes agentes a domnios hidrofbicos

especficos das protenas, especialmente canais proticos (Franks & Lieb, 1994).

Nos ltimos 40 anos os canais inicos tm sido considerados os principais alvos de

ao dos anestsicos no SNC de mamferos, uma vez que estes desempenham um

7importante papel na transmisso neuronal. Os canais inicos diferem tanto na sua

seletividade para ons como no seu mecanismo de abertura. Tem se tornado cada vez mais

evidente que a maioria dos anestsicos gerais afetam um grande nmero de diferentes

canais inicos (Franks & Lieb, 1994; Antkowiak, 2001; Hemmings e cols., 2005; revisto

por Franks, 2006). Os canais inicos podem ser subdivididos em canais operados por

voltagem, em que o mecanismo de abertura do canal controlado pela variao da

voltagem na membrana plasmtica, e nos canais operados por ligante, onde uma molcula

se ligaria a um receptor associado a um canal inico.

Segundo Franks & Lieb (1994), grande parte dos canais inicos operados por

voltagem so relativamente insensveis a concentraes clinicamente relevantes de

anestsicos gerais. No entanto, foi demonstrado que os anestsicos volteis podem

deprimir as correntes dos canais de clcio voltagem dependente e, conseqentemente,

inibir a transmisso sinptica (Yamakage e cols, 1995).

Quando um potencial de ao se propaga at o terminal nervoso, a membrana

despolariza-se e canais de clcio sensveis voltagem (CCSV) se abrem. O influxo de

clcio atravs destes canais dispara a exocitose de vesculas sinpticas com conseqente

liberao do neurotransmissor (Katz & Miledi, 1967; revisto por Neher, 1998). Assim,

posssvel que os CCSV possam ser um alvo pr-sinptico dos anestsicos inalatrios,

interferindo, assim, na transmisso sinptica.

Baseado em critrios farmacolgicos e eletrofisiolgicos, seis tipos de correntes de

CCSV so identificados: L, N, P, Q, R e T. Os CCSV so divididos em canais ativados

por baixa voltagem e inativados rapidamente (tipo T), e canais ativados por alta voltagem,

no qual necessitam de grande voltagem para serem ativados e so inativados lentamente

(L, N ,P ,Q e R) (revisto por Meir e cols.,1999). Dados da literatura sugerem que os canais

de clcio do tipo N, P, e Q esto envolvidos na regulao da excitabilidade e so essenciais

na transmisso sinptica e, conseqentemente, na liberao de neurotransmissores (Dunlap

8e cols, 1995). Portanto, alguns estudos investigaram se esses canais so alvos dos

anestsicos inalatrios no SNC, porm, resultados contraditrios foram observados. Study

(1994) investigou o efeito do isoflurano nas correntes de clcio em neurnios de

hipocampo. Esse autor demonstrou que o isoflurano, em concentraes clinicamente

relevantes, inibiu as correntes de clcio ativadas por baixa e alta voltagem. No entanto,

Hall e cols (1994) observaram que os CCSV do tipo P so insensveis a uma variedade de

anestsicos gerais (halotano, isoflurano, tiopental, pentobarbital e propofol).

Os canais inicos operados por ligantes tambm parecem desempenhar um papel

importante na anestesia. Os receptores ionotrpicos como o para GABA (cido -

aminobutrico) do tipo A, para acetilcolina do tipo nicotnico e para glutamato so

considerados stios de ao dos anestsicos gerais (Campagna e cols, 2003).

1.1.3 Efeito dos anestsicos inalatrios na liberao de dopamina

A ao farmacolgica dos anestsicos inalatrios descrita com base nos seus

efeitos clnicos. Como j mencionado anteriormente, at hoje o mecanismo de ao dessas

drogas permanece ainda bastante desconhecido. Estudos clnicos e experimentais foram

realizados com o objetivo de identificar os locais de atuao dos anestsicos e quais as

alteraes funcionais que esses frmacos produzem nas estruturas do SNC que seriam

determinantes do estado de anestesia observado clinicamente. Um possvel stio de ao

para os anestsicos o terminal neuronal pr-sinptico, como sugerido por dados

experimentais que mostram que a transmisso sinptica mais sensvel aos efeitos dos

anestsicos inalatrios que a conduo axonal (Eger e cols., 1997; revisto por Franks,

2006). Alteraes na liberao de neurotransmissores podem estar diretamente

relacionadas com a interao dos anestsicos com canais inicos ou com qualquer outra

protena de membrana. Dessa forma, a investigao dos efeitos dos anestsicos na

9liberao de neurotransmissores pode contribuir para a elucidao do mecanismo de ao

dos anestsicos.

A dopamina (DA) est presente em regies restritas do SNC, mas exerce

importantes funes tais como atividade motora, conscincia e processos cognitivos.

Estudos indicaram que a anestesia geral est frequentemente associada a mudanas

significativas na concentrao extracelular desse neurotransmissor (Segal e cols., 1990;

Irifune e cols., 1997; Becker e cols., 2003).

Embora existam alguns trabalhos a respeito da ao dos anestsicos volteis na

liberao de DA, os resultados so bastante contraditrios. Estudos in vivo demonstraram

que um aumento na concentrao de DA no SNC observado aps anestesia induzida pelo

halotano e isoflurano (Miyano e cols., 1993). Alm disso, Stahle e cols., (1990),

observaram que no s a concentrao de DA extracelular foi significativamente

aumentada por concentraes clnicas de halotano e isoflurano no corpo estriado de ratos,

como tambm os metablitos da DA. No entanto, Adachi e cols. (2000), utilizando tcnica

de microdilise in vivo, demonstraram que o halotano diminui os nveis extracelulares de

DA no corpo estriado de ratos.

Grande parte dos estudos in vitro sobre a ao dos anestsicos inalatrios na

transmisso dopaminrgica utilizam preparaes semi-intactas, como preparaes de fatias

e sinaptosomas. Keita e cols. (1999) mostraram que o halotano e isoflurano aumentam a

liberao espontnea de DA em fatias de neoestriado de ratos. A partir de um estudo em

sinaptosomas de crtex cerebral de ratos foi demonstrado que o halotano, mas no o

isoflurano, inibiu a captao de [3H]-DA (EL-Maghrabi e cols., 1993). No entanto, Shahani

e cols. (2002) observaram que a captao de DA foi inibida pelo halotano e isoflurano em

clulas LLC-PK1 transfectadas com transportador de dopamina (DAT) humano.

101.2 Transmisso dopaminrgica

As catecolaminas (DA, noradrenalina, adrenalina) so compostos formados por

um ncleo catecol (um anel de benzeno com duas hidroxilas) associado a uma cadeia de

etilamina ou a alguns de seus derivados. As catecolaminas atuam como mensageiros

qumicos no SNC (Vallone e cols., 2000). A DA a principal catecolamina no SNC e est

envolvida em uma variedade de funes, tais como atividade motora, humor, emoo,

afetividade e comunicao neuroendcrina. No sistema nervoso perifrico, a DA um

modulador das funes cardaca e renal, do tnus vascular e da motilidade gastrointestinal

(Jackson & Westlind-Danielsson, 1994).

Estudos sobre a transmisso dopaminrgica surgiram na dcada de 50, quando

a DA foi reconhecida como um neurotransmissor independente (Carlsson e cols.,1958). A

partir da tcnica de microscopia de fluorescncia, Carlsson e Waldeck (1958) observaram

populaes de neurnios contendo DA. Posteriormente, Dahlstrom e Fuxe (1964)

descreveram mais detalhes sobre o sistema dopaminrgico no sistema nervoso de ratos.

11..22..11 LLooccaalliizzaaoo ddooss nneeuurrnniiooss ddooppaammiinnrrggiiccooss

No SNC de ratos existe um nmero importante de clulas dopaminrgicas,

cerca de 15.000 a 20.000 para cada uma das metades do mesencflo (Hokfelt e cols.,

1976). O sistema dopaminrgico tem sido amplamente estudado com o auxlio das tcnicas

de microscopia de fluorescncia e imunocitoqumica. Diferentemente de outros

neurotransmissores, como a noradrenalina, que encontrada de forma difusa no SNC, a

DA se distribui de maneira circunscrita. As projees dopaminrgicas do SNC esto

presentes no corpo estriado, crtex frontal, substncia negra, sistema lmbico, corpo

11amigdalide e hipotlamo (Hokfelt e cols., 1976; Fallon e cols., 1978; Fallon & Moore,

1978). As principais projees dopaminrgicas do SNC so representadas no QUADRO 1.

QUADRO 1 Vias dopaminrgicas do SNC

Origem Projees e funes Vias dopaminrgicas

Substncia negra e formao

reticular.

Corpo estriado. Controle da

atividade motora somtica.

Via nigro-estrial.

rea tegmental ventral.

Crtex frontal, corpo estriado

ventral, sistema lmbico e corpo

amigdalide. Regulao do

comportamento emocional.

Via mesolmbica.

Ncleo arqueado do

hipotlamo hipfise.

Eminncia mdia do hipotlamo.

Controle hormonal

Via tubero-infundibular.

11..22..22 SSnntteessee ee mmeettaabboolliissmmoo ddaa DDAA

A sntese de DA tem lugar nas terminaes nervosas dopaminrgicas, onde so

encontradas altas concentraes de enzimas como a tirosina hidroxilase (TH) e a

descarboxilase de aminocidos aromticos, a L-DOPA descarboxilase (Freund e cols.,

121984). Os trabalhos de Nagatsu e cols., (1964) e Leviit e cols., (1965) demostraram que a

hidroxilao do aminocido L-tirosina o ponto de regulao da sntese de catecolaminas

no SNC e, consequentemente, a enzima TH a enzima limitante da sntese de DA,

noradrenalina e adrenalina. A TH uma protena de 498 aminocidos (56 KDa) presente

predominantemente no citosol das terminaes catecolaminrgicas. A enzima uma

oxidase que utiliza L-tirosina e oxignio como substratos e tetrahidrobioterina (BH4) como

co-fator para adicionar um grupo hidroxila ao aminocido e assim formar a L-DOPA. Na

presena da descarboxilase de aminocidos aromticos a L-DOPA convertida em DA.

Esse neurotransmissor metabolizado por dois tipos de enzimas: a monoaminoxidase

(MAO) e a catecol-O-metiltransferase (COMT). No crebro existem dois tipos de MAO,

designadas do tipo A e B. Os principais produtos de metabolizao da DA so o cido

diidroxifenilactico (DOPAC) e o cido homovanlico (HVA) (Thorpe e cols., 1997).

1.2.3 Liberao de dopamina

1.2.3.1 Liberao dependente de clcio

Nesse processo, a DA contida nas vesculas liberada quando ocorre a fuso

da membrana vesicular com a membrana do terminal pr-sinptico (Katz & Miledi, 1967).

Primeiramente, o neurotransmissor transportado para o interior das vesculas sinpticas

com o auxlio de uma protena com 12 domnios transmembrana, o transportador vesicular

das monoaminas (VMAT2 ), que utiliza um gradiente eletroqumico gerado por uma bomba

(ATPase) de prtons (Henry e cols., 1998a; Henry e cols., 1998b; Schuldiner, 1994). Esse

transportador tambm responsvel pelo transporte vesicular da noradrenalina, serotonina

e histamina. O VMAT2 inibido pela reserpina e tetrazenazina e sensvel variao de pH

(Howell e cols., 1994). O VMAT2 tem um papel importante na liberao de DA

13dependente do on clcio (Ca2+) (Kanner & Schuldiner, 1987). Nas clulas cromafins da

adrenal existe um outro transportador vesicular das monoaminas: o VMAT1 (Erickson e

cols., 1992).

A maior parte das vesculas sinpticas (90%) que contm o transmissor no esto

livres no citoplasma. Elas encontram-se unidas ao citoesqueleto da terminao pr-

sinptica mediante a interao de protenas fosforiladas por quinases presentes na

membrana da vescula (sinapsina I e II) com protenas do citoesqueleto. Quando um

potencial de ao alcana o terminal nervoso, a mudana de potencial de membrana ativa

os canais de Ca2+ sensveis voltagem (CCSV). Devido ao gradiente eletroqumico, gera-

se um influxo de ons Ca2+, que em conjunto com a calmodulina ativam quinases que

fosforilam a sinapsina I e II. A adio de um grupo fosfato s sinapsinas enfraquece a

unio das vesculas sinpticas ao citoesqueleto, facilitando, assim, o seu transporte zona

ativa (revisto por Sudhof, 2004).

Uma vez transportadas zona ativa, as vesculas ancoram-se e sofrem maturao

(priming) tornando-se prontas para sofrerem exocitose. Como mencionado

anteriormente, um potencial de ao despolariza o terminal alterando o potencial de

aproximadamente -70 mV a +20mV, permitindo, assim, a abertura de CCSV. Essa abertura

dos canais altera a concentrao de ons Ca2+ no interior das clulas. O influxo de Ca2+

atravs desses canais dispara a exocitose com conseqente liberao do neurotransmissor

(Katz & Miledi, 1967; revisto por Neher, 1998).

Existem evidncias de que o processo de exocitose pode ser desencadeado pelo

clcio proveniente dos estoques intracelulares (Tse e cols., 1997; Berridge, 1998; Raiteri,

2000). Dados obtidos pelo nosso grupo de pesquisa demonstraram que os anestsicos

sevoflurano, halotano e isoflurano aumentam a liberao exocittica de [3H]-acetilcolina

em fatias de crtex cerebral de ratos, principalmente a partir de clcio proveniente de

14estoques intracelulares (Gomez e cols., 1999; Gomez e cols., 2000; Silva e cols., 2005).

Fernandes e cols. (2004) observaram que a ttiittyyuussttooxxiinnaa,, uummaa ttooxxiinnaa ddee eessccoorrppiioo Tityus

serrulatus,, iinndduuzz liberao exocittica de [3H]-DA dependente do clcio intracelular.

1.2.3.2 Liberao independente de Ca2+

J est bem estabelecido o processo de liberao de DA atravs da exocitose de

vesculas, envolvendo o clcio proveniente do meio extra ou intracelular. No entanto, foi

proposto um outro mecanismo de liberao, que pode co-existir com o clssico modelo

exocittico, denominado transporte reverso (TR) atravs do transportador de DA (DAT)

(Leviel, 2001).

O DAT uma glicoprotena de membrana plasmtica que pertence a uma

superfamlia de transportadores de membrana dependentes de Na+/Cl- (Amara & Kuhar,

1993a; Amara & Kuhar, 1993b). Os membros dessa superfamlia possuem mltiplas

caractersticas estruturais em comum, incluindo 12 domnios transmembrana, mltiplos

stios de glicosilao e stios de fosforilao (Amara e Kuhar, 1993; Giros e cols., 1996). A

estequiometria do transportador indica que a DA co-transportada para o interior do

terminal (recaptao) ou para o meio externo (TR) com dois ons Na+ e um on Cl-

(Krueger, 1990; Nelson, 1998).

H quatro dcadas, Julius Axelrod introduziu o conceito de recaptao na tentativa

de explicar como a noradrenalina era transportada de volta para terminal nervoso (Hertting

& Axelrod, 1961). Assim, ele props que o processo de recaptao era um mecanismo

importante para a inativao de neurotransmissores. Mais tarde, similaridades e algumas

diferenas entre os mecanismos de captao para DA, noradrenalina e serotonina foram

demonstradas. Com os avanos nas tcnicas de biologia molecular, os genes que codificam

15protenas responsveis pela recaptao das monoaminas foram identificados nos anos 90

(Inazu e cols., 1999). Vale a pena ressaltar que, a partir dessa dcada, estudos

evidenciaram que a DA pode ser recaptada pelo transportador de noradrenalina (NET) em

diversas regies cerebrais, principalmente no crtex pr-frontal (Morn e cols., 2002;

revisto por Torres e cols., 2003).

As tcnicas de imunocitoqumica e hibridizao in situ possibilitaram a localizao

dos transportadores de monoaminas. Pode-se encontrar o DAT expresso nos corpos

celulares da substncia negra, rea tegmental ventral do crebro e crtex cerebral,

(principalmente frontal e temporal), o transportador de serotonina (SERT) expresso nos

ncleos da rafe central e medial e o NET expresso no crtex pr-frontal e parietal e nos

ncleos da base (Hoffman e cols., 1999; Torres e cols., 2003). Outras metodologias

relevantes so o uso de sistemas de expresso heterloga e a mutagnese, que contribuem

para a identificao dos domnios estruturais e funcionais dos transportadores. Atualmente

surgem os modelos animais que possuem alteraes genticas no transporte de

monoaminas e que tm ajudado a esclarecer o papel dessas protenas na funo cerebral

(Torres e cols., 2003).

O DAT , portanto, um carreador de membrana cuja principal funo terminar a

ao do neurotransmissor, atravs da recaptao, alm de ser responsvel tambm pela

liberao da DA citoslica para a fenda sinptica, denominado TR, mecanismo ainda

bastante desconhecido (Leviel, 2001).

O transporte reverso de DA observado na presena de anfetamina, sendo que

vrios estudos demonstraram que a liberao de DA induzida pela anfetamina no inibida

pela reserpina (um inibidor do transportador vesicular de DA) (revisto por Leviel, 2001).

Alm disso, estudos sugerem que a DA endgena, localizada principalmente em

compartimento vesicular parece ser menos sensvel anfetamina do que a DA livre no

citosol. Assim, o conceito de TR foi utilizado, inicialmente, a partir de estudos sobre a

16liberao de DA na presena de algumas drogas como a anfetamina e a tiramina. Somente

mais tarde, o TR foi ento considerado um possvel modo fisiolgico de liberao

responsvel por parte da DA presente na fenda sinptica. A funo do TR na atividade

neuronal basal ainda no est bem esclarecida, mas o mecanismo de ao e o processo

regulatrio desse modelo atpico de liberao tm sido intensamente estudados (Chen &

Reith, 2000; Leviel, 2001; Torres e cols, 2003).

O DAT sensvel a drogas como GBR 12909, que inibe esse transportador

competitivamente e com grande seletividade (Anderesen, 1989) e nomifensina, inibidor

de alta afinidade do DAT (Herdon & Nahorshi, 1987; Raiteri,1979). Sua funo pode ser

modulada por segundos mensageiros como o diacilglicerol (via ativao da PKC) e o cido

araquidnico (Chen & Reith, 2000). O DAT pode ser regulado diretamente atravs de

mltiplos fatores endgenos envolvendo alteraes no gradiente de sdio e na temperatura.

Em baixas temperaturas (12 a 17 C) ocorre inibio do DAT, afetando suas funes nos neurnios dopaminrgicos, principalmente o TR (revisto por Gerevich e cols., 2001).

Recentemente, Khoshbouei e cols. (2003) relataram que o TR mediado pelo DAT

pode ser iniciado por um aumento da concentrao do sdio intracelular ([Na+]i ). A [Na+]i

desempenha um papel importante na regulao da liberao de neurotransmissores a partir

do terminal axnico ( via despolarizao ou inverso do trocador Na+ / Ca2+ ). A elevao

da [Na+]i tambm pode causar liberao de neurotransmissor independente de clcio, onde

o aumento da [Na+]i pode reverter o processo de recaptao de transmissores, ocasionando

o efluxo de neurotransmissores livres no citoplasma, denominado TR, como j citado

anteriormente (Adam-Vizi, 1992). Assim, o funcionamento do DAT est diretamente

relacionado com o gradiente de Na+ extra e/ou intracelular, visto que o DAT uma

glicoprotena de membrana plasmtica dependente de Na+/Cl- .

171.2.4 Receptores Dopaminrgicos

Com base nas caractersticas moleculares, foram descritos 5 subtipos de receptores

para DA , os quais so agrupados em 2 famlias farmacolgicas denominados D1 e D2. A

famlia D1 composta pelos receptores D1 e D5. Esses receptores possuem uma regio

carboxila terminal que aproximadamente 7 vezes mais longa que a correspondente aos

receptores D2. O subtipo D1 o receptor dopaminrgico mais abundante no SNC (Missale

e cols., 1998). Nveis altos desses receptores so encontrados no tubrculo olfatrio,

estriato, substncia negra e crtex cerebral (frontal e cngulo) (Missale e cols., 1998). J o

subtipo D5 se distribui pelo hipocampo, tlamo e hipotlamo e nas regies frontal e

temporal do crtex cerebral (Jaber e cols., 1996). A ativao da famlia D1 estimula a

enzima adenil ciclase levando formao do AMPc (Zhou e cols., 1990). Tambm tem

sido reportado que a ativao dos receptores D1 do crtex frontal induz a produo de

outros segundos mensageiros, como o diacilglicerol e o IP3, atravs da estimulao de

fosfolipase C (Friedman, 1990)

A famlia D2 formada por 3 subtipos: D2, D3 e D4. Essa famlia possui como

caracterstica uma regio (i3), composta por 101 a 166 aminocidos, dependendo do

subtipo e da espcie. Os subtipos da famlia D2 so considerados autoreceptores das

terminaes dopaminrgicas cuja ativao reduz a liberao de DA (Dwoskin e cols.,

1986). O efeito se deve principalmente inibio da sntese de AMPc e modulao das

correntes inicas, em particular as ativadas por voltagem. A reduo da formao de

AMPc diminui a atividade da PKA que fosforila as sinapsinas I e II. A inibio dos canais

de Ca2+ sensveis voltagem reduzem a entrada do on Ca2+, diminuindo a probabilidade

de fuso das vesculas (Jaber e cols., 1996).

181.2.5 Relevncia clnica

J est bem estabelecido que a dopamina (DA) um neurotransmissor

catecolaminrgico que est presente no crebro (crtex frontal, temporal e parietal, ncleo

arqueado do hipotlamo hipfise) e principalmente na substncia negra do mesencfalo.

O sistema dopaminrgico tem sido foco de grande interesse, principalmente devido a

associao de alguns transtornos do SNC com alteraes nesse sistema. Alteraes da via

dopaminrgica nigrostriatal so responsveis pelo desenvolvimento do Mal de Parkinson,

ao passo que disfunes dos neurnios dopaminrgicos da via mesocorticolmbica esto

relacionadas com o aparecimento de alguns estados psicticos, como a esquizofrenia.

(Weinberger e cols., 1988; Goldstein & Deuthch, 1992; Lang & Lozano, 1998). Diferentes

estudos indicaram que sinais positivos da esquizofrenia, como euforia, alucinaes

auditivas e delrio, se devem, pelo menos em parte, a uma hiperatividade da transmisso

dopaminrgica. De fato, algumas drogas psicoestimulantes, como a anfetamina aumentam

a transmisso dopaminrgica, mimetizando alteraes do comportamento presentes em

pacientes esquizofrnicos (Goldstein e cols., 1997).

Apesar da existncia de alguns estudos relacionados com a transmisso

dopaminrgica e anestsicos inalatrios, temos pouco ou quase nenhum conhecimento

sobre o papel funcional da DA no estado de anestesia (Becker e cols., 2003). No entanto,

sabe-se que durante a induo da anestesia observam-se estgios de euforia, alm de

hiperlocomoo durante a recuperao anestsica. A DA um neurotransmissor que

exerce importantes funes no SNC tais como atividade motora, conscincia e processos

cognitivos, logo, a modulao da transmisso dopaminrgica pode ser um alvo de ao dos

anestsicos inalatrios.

Embora existam trabalhos a respeito da ao dos anestsicos volteis na

transmisso dopaminrgica, no est claro se essas drogas alteram a liberao desse

neurotransmissor (Toner e cols., 2001; Adachi e cols., 2003). Assim, ao estudar o efeito do

19halotano e do sevoflurano na liberao de DA no SNC estaremos contribuindo para um

maior entendimento sobre o mecanismo de ao de dois anestsicos muito utilizados na

clnica, alm de tornar o procedimento da anestesia cada vez mais seguro, principalmente

para pacientes que possuem distrbios no sistema dopaminrgico.

20

2. Objetivos

21Objetivo Geral

- Estudar a transmisso dopaminrgica em fatias crtex cerebral de ratos na presena

dos anestsicos inalatrios sevoflurano e halotano.

Objetivos especficos

- Avaliar se diferentes concentraes do sevoflurano e halotano interferem na liberao de

dopamina em fatias de crtex cerebral de ratos.

- Investigar se o efeito do sevoflurano e halotano na liberao de dopamina em fatias de

crtex cerebral de ratos dependente do tempo de incubao.

- Investigar a participao do on clcio extra e intracelular na liberao de dopamina

induzida pelo sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos.

- Investigar a participao dos canais de sdio sensveis TTX na liberao de dopamina


- Investigar o papel do transportador de dopamina na liberao de dopamina induzida pelo

sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos.

- Investigar o papel do transportador de noradrenalina na liberao de dopamina induzida

pelo sevoflurano e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos.

22- Investigar a participao da bomba de Na+/K+ ATPase na liberao de dopamina


- Investigar o efeito do sevoflurano e halotano na captao da dopamina em fatias de

crtex cerebral de ratos

23

3. Material e Mtodos

243.1 Drogas e reagentes

Reagentes e toxinas obtidos da Sigma Chemical Co.,St Louis, MO, USA:

- EGTA, C14H24N2O10.

- Dopamina no radioativa, C8H11NO3 . HBr.

- Pargilina, C11H13N HCl.

- Nomifensina, C16H18N2- + C4H4O4.

- GBR12909, C28H32F2N2O . 2HCL

- Ouabana, C29H44O12.

- Reserpina, C33H40N2O9.

- BAPTA-AM, C34H40N2O18.

- POPOP, C24H16N2O2.

- PPO, C15H11NO.

- cloreto de cdmio.

- cloreto de colina

- Nisoxetina

- Malachite Green Base (Verde de Malaquita)

- Coomassie Brilliant Blue G

O Sevoflurano foi gentilmente fornecido por Cristlia Produtos Qumicos Farmacuticos

LTD.

O Halotano foi gentilmente cedido por Halocarbon, River Edge, New Jersey, USA.

Reagentes obtidos da Reagen-Quimiobras Indstrias Qumicas do Brasil:

- cido tricloroactico, CCl3COOH.

- Cloreto de potssio, KCl.

- Molibdato de amnio

- Alcool polivinlico

25Reagentes obtidos da Merk S.A Indstrias Qumicas:

- Cloreto de sdio, NaCl.

- Sulfato de magnsio, MgSO4.(7H2O).

- Glicose, C6H12O6.

- Tolueno, C6H5CH3.

- Cloreto de clcio dihidratado, CalCl2.2H2O.

- cido clordrico, HCl.

- lcool etlico, CH3CH2OH.

- Fosfato dicido de potssio, KH2PO4

- Hidrxido de sdio, NaOH.

- HEPES, C8H18N2O4S.

- Tritom, C34H62O11.

Os reagentes obtidos do Grupo Qumica Indstria Ltda, Brasil.

- Naftaleno, C10H8.

- Dioxana, C4H8O2.

Substncia obtida da Amersham Pharmacia Bioetech UK Limited, England:

- [2,5,6-3H]dopamina, atividade especfica 49.0 (lote-TRK284).

3.2 Solues

Meio de incubao 1

NaCl 136 mM

KCl 2,7 mM

CaCl2 , 2H2O 1,35 mM

MgSO4 (7H2O). 1,2 mM

26 Glicose 5,5 mM

KH2PO4 1,2 mM

Pargilina 10 M

HEPES 12,5 mM

pH 7.4 ajustado com Na0H 0,1 N

Obs: Pargilina: droga inibidora da degradao da DA.

Soluo de [3H]-DA, contendo aproximadamente 0,20 Ci de [3H]-DA em 2000 mL do

meio de incubao

Soluo de dopamina no radioativa 1,0 M

Lquido de cintilao (soluo de Bray modificado)

- lcool etlico 30% v/v

- Dioxana 30% v/v

- Tolueno 30% v/v

- Naftaleno 7% p/v

- POPOP 0,02% p/v

- PPO 0,5% p/v

- Triton 10% v/v

Soluo de cido tricloroactico a 10%

27Meio de incubao 2

NaCl 115 mM

KCl 3 mM

CaCl2 , 2H2O 2 mM

MgSO4 (7H2O). 1,2 mM

Glicose 10 mM

NaHCO3 25 mM

pH 7.4 ajustado com NaOH

Solues estoque para o Mtodo Chan

Verde de Malaquita - 0,08 % p/v

Alcool polivinlico - 2,32% p/v

Molibdato de amnio 5,7% p/v em HCl 6 N

Soluo para o Mtodo Chan

- H20 % 33 v/v

- Molibdato de amnio 16 % v/v

- Alcool polivinlico 16 % v/v

- Verde Malaquita 33 % v/v

3.3 Animais

Foram utilizados ratos adultos da raa Wistar (180-200 gramas), de ambos os

sexos, fornecidos e criados no CEBIO, Centro de Bioterismo do Instituto de Cincias

Biolgicas da UFMG.

283.4 Determinao da liberao de DA em fatias de crtex crebral de ratos

33..44..11 OObbtteennoo ddaass ffaattiiaass ddee ccrrtteexx cceerreebbrraall ddee rraattooss

Ratos adultos Wistar foram decapitados e o encfalo removido. Os dois hemisfrios

do crebro eram separados e o crtex dissecado sobre uma placa Petri em cima de um

papel de filtro umedecido com soluo (meio de incubao 1) em gelo. Em seguida, o

crtex foi fatiado em fatias de 0,5 mm em um fatiador de tecido.

O tecido foi pesado em balana de toro na quantidade de 40 mg e colocado em

frascos de incubao que se encontravam no gelo. Esses frascos continham 2,0 mL da

soluo, contendo aproximadamente 0,20 Ci de [3H]-DA.

33..44..22 MMaarrccaaoo ddaass ffaattiiaass ccoomm [[33HH]]--DDAA

Em seguida, as fatias foram colocadas em banho com agitao (120 rpm), pr-

incubadas a 37C durante cinco minutos e posteriormente incubadas por 30 minutos com

[3H]-DA (atividade especfica 49,0 Ci/mmol). Aps a marcao, as fatias foram

transferidas para tubos de centrfuga que j se encontravam no gelo e, logo aps,

centrifugadas a 6000 rpm, 3300 g por cinco minutos, a 4C.

33..44..33 LLaavvaaggeemm ddaass ffaattiiaass ccoomm DDAA nnoo rraaddiiooaattiivvaa

Os tubos foram retirados da centrfuga, o sobrenadante desprezado e o

precipitado contendo os pellets com as fatias foram lavados com 2,0 mL de soluo

contendo DA no radioativa (1,0 M). Esse procedimento foi repetido trs vezes, para

29retirar a [3H]-DA inespecificamente ligada ao tecido.

33..44..44 IInnccuubbaaoo ddaass ffaattiiaass

Aps a ltima centrifugao, o sobrenadante foi desprezado e as fatias foram

colocadas em 1,5 mL de meio de incubao e transferidas novamente para frascos de vidro

que foram incubados em banho com agitao (120 rpm) temperatura de 37C e pr-

incubadas durante 5 minutos .

33..44..55 AAddmmiinniissttrraaoo ee mmeennssuurraaoo ddaa ccoonncceennttrraaoo ddoo sseevvoofflluurraannoo ee hhaalloottaannoo

Solues estoques saturadas com sevoflurano ou halotano foram preparadas a cada

experimento e obtidas da seguinte maneira: 10 ml do meio de incubao foram

equilibradas com os anestsicos estudados na forma lquida (100, 200, 400, 600, 800, ou

1600l) a 37C em frascos de vidro, hermeticamente fechados por 30 minutos. Em

seguida, utilizando-se uma seringa de vidro, 500l da soluo estoque saturada com

sevoflurano ou halotano foram adicionadas aos frascos de vidro contendo 1,5 mL de meio

de incubao a 37C aps 5 minutos de pr-incubao. Aps a administrao do anestsico

especfico, os frascos foram, ento hermeticamente fechados, agitados e incubados por at

30 minutos. A saturao da soluo estoque e a concentrao aquosa do sevoflurano e

halotano no meio de incubao aps 30 minutos foram confirmadas aps a extrao com n-

heptano utilizando-se o princpio da cromatografia gasosa (Ruteldge e cols, 1963). Com

esse objetivo, utilizamos um cromatgrafo a gs Hewlett Packard Series II-Modelo 5890

equipado com uma coluna capilar (HP1:SE-30;35 metros de comprimento; dimetro

interno 20 mm; espessura de filme de 0,33 m; temperatura mxima: 325C), onde um

microlitro da soluo estoque ou do meio de incubao era introduzido diretamente atravs

30de um septo (elastmero). As condies de separao incluam uma anlise cromatogrfica

temperatura constante da coluna (30C) e uma mistura de hidrognio (fluxo:35, 350 e 30

ml /min, respectivamente) como gs carreador.

33..44..66 CCoonnttaaggeemm ddaa rraaddiiooaattiivviiddaaddee ddoo ssoobbrreennaaddaannttee

Ao terminar o tempo de incubao, os frascos eram retirados do banho e o material

transferido em seguida para um tubo de centrfuga. Aps a centrifugao (3300g por 7

minutos, a 4C), o sobrenadante era colocado em tubo de ensaio e 100L desta soluo era

transferido para um microtubo (eppendorf) contendo 1000L de soluo de Bray. A

radioatividade era contada no espectrofotmetro de cintilao lquida durante 10 minutos.

Em estudos prvios, foi realizado uma cromatografia da frao do sobrenadante que

mostrou que aproximadamente 90% da radioatividade presente [3H]-DA (Fernandes e

cols., 2004). O termo liberao de DA usado para indicar a liberao de [3H]-DA no

captada pelo sistema de captao aps a sua liberao.

3.4.7 Anlise estatstica dos resultados

Os resultados foram obtidos, analisados e expressos de duas formas: a primeira pela

contagem da radioatividade do sobrenadante em que se utilizou a liberao de [3H]-DA em

dpm/mg de tecido. Representa a mdia das amostras, feitas em duplicata, repetidas no

mnimo trs vezes (em dias diferentes), o erro padro da mdia (EPM) subtrado o valor da [3H]-DA liberada nos frascos mantidos em gelo.

Na segunda forma, expressamos a radioatividade do sobrenadante pelo delta ( ) de liberao de [3H]-DA. Representa a liberao de [3H]-DA em dpm/mg de tecido (conforme

31citado anteriormente) na presena de drogas (anestsicos ou outros agentes) subtrada da

liberao de [3H]-DA em dpm/mg de tecido obtida nas condies controle definidas em

cada experimento.

Para analisar o contedo de [3H]-DA captada pelo tecido, fizemos extraes com

TCA, que causou a liberao de [3H]-DA das fatias do crtex cerebral. Expressamos os

resultados em dpm/mg de tecido, que representa a mdia das amostras, feitas em duplicata,

repetidas no mnimo cinco vezes (em dias diferentes) o erro padro da mdia (EPM).

Os resultados foram analisados por anlise de varincia ANOVA ou pelo teste

t-student, quando indicado. O valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

O programa de computador utilizado na elaborao dos grficos, anlise

estatstica e clculo para o EC50 foi o Sigma-plot (Scientific Graphing Software), verso

8.0.

3.5 Mensurao de fosfato em fatias de crtex cerebral de ratos

Esta metodologia foi desenvolvida por Chan e cols. (1986), adaptada por

Bruno e cols. (2002) e associada com a tcnica de fatia em crtex cerebral de ratos

utilizada no Laboratrio de Neurofarmacologia do Departamento de Farmacologia do

Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais.

3233..55..11 OObbtteennoo ddaass ffaattiiaass ddee ccrrtteexx cceerreebbrraall ddee rraattooss ee aaddmmiinniissttrraaoo ddaass ddrrooggaass

Aps obteno das fatias (tem 3.4.1) em meio de incubao 2, as mesmas

foram colocadas em banho com agitao (120 rpm), pr-incubadas a 37C durante 20

minutos na presena ou ausncia de ouabana e subseqentemente, administrado os

anestsicos sevoflurano ou halotano (conforme tem 3.4.5). Aps o perodo de 10 minutos

de incubao era acrescentado cido tricloroactico a 10% para lisar as fatias e interromper

as reaes. Em seguida as fatias foram transferidas para tubos de centrfuga que j se

encontravam em gelo e, logo aps, centrifugadas a 6000 rpm, 3300 g por cinco minutos, a

4C.

3.5.3 Mensurao de fosfato no meio de incubao

O fosfato presente no sobrenadante (meio de incubao 2) aps a centrifugao foi

mensurado a partir do mtodo Chan e cols. (1986). A liberao de fosfato foi expressado

em nmol de fosfato por minuto por miligrama de protena.

Para a dosagem de protena das fatias de crtex cerebral de ratos foi utilizado o

mtodo Bradford (1976).

3.5.4 Anlise estatstica dos resultados

Representa a mdia das amostras, feitas em duplicata, repetidas no mnimo quatro

vezes (em dias diferentes), o erro padro da mdia (EPM). A liberao de fosfato foi expressa em nmol de fosfato por minuto por miligrama

de protena.

Os resultados foram analisados por anlise de varincia ANOVA ou pelo teste

33t-student, quando indicado. O valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo.

34

4. Resultados

35

4.1 Liberao de [3H]-DA em fatias de crtex cerebral de ratos na presena do

sevoflurano e halotano

Nosso objetivo inicial foi investigar a ao do sevoflurano e do halotano na

liberao de [3H]-DA em fatias de crtex cerebral de ratos. Assim, para testar se o

sevoflurano ou halotano seriam capazes de alterar a liberao deste neurotransmissor, as

fatias de crtex cerebral de rato foram incubadas em concentraes crescentes desses dois

anestsicos.

As fatias de crtex cerebral de ratos foram pr-incubadas por 5 minutos em meio de

incubao a 37C e, subseqentemente, estimuladas com concentraes crescentes de sevoflurano (0,058, 0,11, 0,23, 0,46 e 0,93 mM) durante 20 minutos. Os resultados

apresentados na figura 1 mostram que o sevoflurano foi capaz de induzir um aumento na

liberao de [3H]-DA de uma maneira dependente da concentrao do anestsico. Nota-se

que o sevoflurano aumentou significativamente a liberao de [3H]-DA (p< 0,05) em todas

as concentraes utilizadas. O EC50 (calculado da concentrao efetiva capaz de liberar

50% da liberao mxima) foi de 0,29 mM. A liberao de [3H]-DA induzida pelo

sevoflurano nas concentraes de 0,46 e 0,93 mM se diferem estatisticamente (p< 0.05),

porm pode-se observar que a curva tende a se estabilizar aps a concentrao 0,46mM

(1617 38 dpm/mg de tecido). Logo, a concentrao que passamos a utilizar em nossos experimentos foi de 0,46mM que levou a um aumento de 3,24 vezes em relao ao

controle (498.6 37dpm/mg de tecido).

Experimento semelhante ao descrito anteriormente foi realizado com o anestsico

halotano. As fatias de crtex cerebral de rato foram incubadas com o anestsico em

concentraes crescentes (0,012, 0,024, 0,048, 0,072 e 0,096mM) durante 20 minutos. Os

36resultados apresentados na Figura 2 mostram que o halotano tambm foi capaz de induzir

um aumento na liberao de [3H]-DA de uma maneira dependente da concentrao do

anestsico, de forma que todas as concentraes do halotano utilizadas aumentaram

significativamente a liberao basal de [3H]-DA (p< 0,05). A liberao de [3H]-DA

induzida pelo halotano nas concentraes de 0,024 e 0,048mM se diferem estatisticamente

(p< 0.05). Assim, pode-se observar que a liberao foi crescente at a concentrao de

0,048mM. Logo, a concentrao que passamos a utilizar em nossos experimentos foi de

0,048mM de halotano que liberou 2744,6 86 dpm/mg de tecido de [3H]-DA e provocou um aumento de 7,43 vezes em relao ao controle (369,6 25 dpm/mg de tecido). O EC50 calculado para o halotano foi de 0,025mM.

37

Concentrao (mM)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Li

bera

o

de [3

H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

sevoflurano controle

Figura 1: Dose-resposta do sevoflurano na liberao de [3H]-DA em fatias de

crtex cerebral de ratos.

Fatias de crtex cerebral de ratos (40 mg) marcadas com [3H]- DA foram pr-

incubadas por 5 minutos em meio de incubao a 37C e, subseqentemente, estimuladas com sevoflurano nas concentraes de 0,058, 0,11, 0,23, 0,46, 0,93

mM , durante 20 minutos. Os resultados expressam a mdia EPM de pelo menos

trs experimentos independentes realizados em duplicatas.

38

Concentrao (mM)

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12Lib

era

o d

e [3

H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

halotanocontrole

Figura 2: Dose-resposta do halotano na liberao de [3H]-DA em fatias de

crtex cerebral de ratos.


incubadas por 5 minutos em meio de incubao a 37C e, subseqentemente, estimuladas com halotano nas concentraes de 0,012, 0,024, 0,048, 0,072 e

0,096mM durante 20 minutos. Os resultados expressam a mdia EPM de pelo

menos trs experimentos independentes realizados em duplicatas.

39

4.2 Efeito do tempo de incubao na liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano

e halotano em fatias de crtex cerebral de ratos

Para determinar se a liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano e halotano era

dependente do tempo de incubao, as fatias foram estimuladas com sevoflurano ou

halotano por diferentes tempos. As fatias de crtex cerebral de ratos foram pr-incubadas

por 5 minutos em meio de incubao e, subseqentemente, estimuladas com sevoflurano

(0,46mM) durante 5, 10, 20, 30 e 45 minutos a 37C. A Figura 3 mostra que a liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano foi dependente do tempo de incubao.

O mesmo procedimento experimental foi realizado utilizando-se o halotano. As

fatias foram pr-incubadas por 5 minutos a 37C e, posteriormente, estimuladas com halotano (0,048mM) por 2,5, 5, 10, 20, e 30 minutos de incubao a 37C. A Figura 4 mostra que a liberao de [3H]-DA induzida pelo halotano tambm foi dependente do

tempo de incubao.

Pode-se observar que a curva de liberao foi crescente at o tempo de 30 minutos

de incubao com sevoflurano (Fig. 3) e 20 minutos de incubao com o halotano (Fig. 4).

Verifica-se ainda, que a liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano nos tempos de 30

e 45 minutos e pelo halotano nos tempos 20 e 30 minutos de incubao no se diferem

estatisticamente (p> 0,05), ou seja, a resposta do sevoflurano e halotano tende a se

estabilizar aps 30 e 20 minutos de incubao, respectivamente.

Assim, o tempo que escolhemos para estudar o mecanismo envolvido na liberao

de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano foi de 20 minutos (173046,5 dpm/mg de tecido) e pelo halotano foi de 10 minutos de incubao (2680125 dpm/mg de tecido), onde o sevoflurano induziu um aumento na liberao de [3H]-DA de 3,47 e o halotano de 7,29

vezes quando comparado ao controle.

40

Tempo (min)0 10 20 30 40 5L

iber

ao

de

[

0

3 H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

sevofluranocontrole

Figura 3: Curva de tempo de incubao do sevoflurano na liberao de [3H]-DA em


Fatias de crtex cerebral de ratos (40mg) marcadas com [3H]-DA foram pr-

incubadas por 5 minutos em meio de incubao a 37C e, subseqentemente, estimuladas ou no com sevoflurano (0,46 mM) durante 5, 10, 20, 30 e 45 minutos. Os resultados

expressam a mdia EPM de pelo menos trs experimentos independentes realizados em

duplicatas.

41

0 10 20 30Lib

era

o d

e [3

H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

HalotanoControle

Tempo (min)

Figura 4: Curva de tempo de incubao do halotano na liberao de [3H]-DA em


Fatias de crtex cerebral de ratos (40mg) marcadas com [3H]- DA foram pr-

incubadas por 5 minutos em meio de incubao a 37C e, subseqentemente, estimuladas ou no com halotano (0,048 mM) durante 2,5, 5, 10, 20, e 10 minutos. Os resultados

expressam a mdia EPM de pelo menos trs experimentos independentes realizados em

duplicatas.

424.3 O papel do on clcio na liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano e

halotano em fatias de crtex cerebral de ratos

O influxo de clcio atravs de CCSV dispara a exocitose com conseqente

liberao do neurotransmissor (Katz & Miledi, 1967; revito por Neher, 1998). Desse

modo, para testar a participao do clcio extracelular na liberao de [3H]-DA induzida

pelo sevoflurano (0,46 mM) e halotano (0,048 mM), as fatias de crtex cerebral de ratos

foram incubadas em meio contendo Cd+2, um bloqueador inespecfico dos CCSV (Fox e

cols, 1987) ou EGTA, um quelante de clcio extracelular.

Nesses experimentos, as fatias de crtex cerebral foram pr-incubadas em meio de

incubao por 15 minutos na presena ou ausncia de Cd+2 (100 M) ou EGTA (2,0 mM),

em experimentos independentes e, subseqentemente, estimuladas com sevoflurano

(0,46mM) durante 20 minutos ou halotano (0,048mM) durante 10 minutos. As Figuras 5 e

6 mostram que a liberao de [3H]-DA induzida pelos anestsicos sevoflurano e halotano

no foi alterada pela presena do Cd+2 e EGTA (p>0,05) .

Existem evidncias de que a exocitose pode ser desencadeada pelo clcio

proveniente dos estoques intracelulares (Tse e cols., 1997; Berridge, 1998). Assim, para

avaliarmos a participao do clcio intracelular na liberao de [3H]-DA induzida pelos

anestsicos, utilizou-se o BAPTA-AM (50M), um quelante de clcio intracelular (Adler e

cols, 1991). Nesses experimentos as fatias foram pr-incubadasde crtex cerebral em meio

de incubao por 30 minutos na presena ou ausncia de BAPTA-AM (50 M) e,

subseqentemente, estimulamos com sevoflurano (0,46 mM) durante 20 minutos ou

halotano (0,048 mM) durante 10 minutos. Observou-se (Fig. 5 e 6) que essa droga tambm

no interferiu na resposta dos anestsicos (p>0,05). Por outro lado, a presena do EGTA,

Cd+2 e BAPTA-AM inibiu significativamente a liberao de [3H]-DA induzida por altas

concentraes de potssio (50 mM) (Fig. 7).

43

Li

bera

o

de [3

H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500Sem SevofluranoCom Sevoflurano

controle EGTA Cd2+ BAPTA-AM

* **

*


sevoflurano em fatias de crtex cerebral de ratos


incubadas por 15 minutos na presena ou ausncia de EGTA (2,0mM) ou Cd+2 (100M)

ou por 30 minutos na presena ou ausncia de BAPTA-AM (50M) e, subseqentemente,

estimuladas com sevoflurano (0,46mM) durante 20 minutos. Os resultados expressam a

mdia EPM de pelo menos trs experimentos individuais realizados em duplicatas.

* estatisticamente diferente do controle.

Os experimentos com EGTA e BAPTA-AM foram realizados na ausncia de clcio no

meio de incubao.

44

Libe

ra

o de

3[H

]-DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Sem Halotano Com Halotano

Controle EGTA Cd2+ BAPTA-AM

**

**


halotano em fatias de crtex cerebral de ratos




estimuladas com halotano (0,048mM) durante 10 minutos. Os resultados expressam a


* estatisticamente diferente do controle.

Os experimentos com EGTA e BAPTA-AM foram realizados na ausncia de clcio no

meio de incubao.

45

Li

bera

o

de [3

H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000sem KClcom KCl

controle EGTA Cd+2 BAPTA-AM

* * *

Figura 7: Efeito do EGTA, Cd+2 e BAPTA na liberao de [3H]-DA induzida por KCl

em fatias de crtex cerebral de ratos

Fatias de crtex cerebral de ratos (40 mg) marcadas com [3H]-DA foram pr-



estimuladas KCl (50 mM) durante 15 minutos. Os resultados expressam a mdia EPM de

pelo menos trs experimentos individuais realizados em duplicatas.

* estatisticamente diferente do controle, p

464.4 Participao dos canais de sdio sensveis TTX na liberao de [3H]-DA


O influxo de Na+ atravs da membrana um elemento fundamental no processo de

despolarizao e consequente liberao de neurotransmissores. Assim, a liberao de DA

induzida pelo anestsicos poderia estar relacionada com alteraes na entrada desse on

atravs de canais sensveis voltagem. Para investigar esta hiptese, utilizou-se a

tetrodotoxina (TTX), potente inibidor de canais de sdio sensveis voltagem que bloqueia

a gerao e a propagao do potencial de ao em tecidos excitveis (Moore & Narahashi,

1967).

As fatias de crtex cerebral foram pr-incubadas em meio de incubao por 15

minutos na presena ou ausncia de TTX (1 M) e, subseqentemente, estimuladas com

sevoflurano (0,46 mM) durante 20 minutos ou halotano (0,048 mM) durante 10 minutos.

As Figuras 8 e 9 mostram que a liberao de [3H]-DA induzida pelos anestsicos

sevoflurano e halotano no foi afetada pela presena TTX (p>0,05), sugerindo que a

respostas dos anestsicos independente da despolarizao de membrana.

.

47

Libe

ra

o de

[3H

] - D

A (d

pm/m

g de

teci

do)

0

500

1000

1500

2000

2500

controle TTX sevoflurano sevoflurano +TTX

* *

Figura 8: Efeito da TTX na liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em fatias

de crtex cerebral de ratos


incubadas por 15 minutos na presena ou ausncia de TTX (1 M) e, subseqentemente,

estimuladas com sevoflurano (0,46 mM) durante 20 minutos. Os resultados expressam a



48

Li

bera

o

de [3

H] -

DA

(dpm

/mg

de te

cido

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

controle TTX Halotano Halotano +TTX

* *

Figura 9: Efeito da TTX na liberao de [3H]-DA induzida por halotano em fatias de

crtex cerebral de ratos


incubadas por 15 minutos na presena ou ausncia de TTX (1 M) e, subseqentemente,

estimuladas com halotano (0,048mM) durante 20 minutos. Os resultados expressam a



49J est bem estabelecida a liberao de dopamina atravs de um processo

exocittico, envolvendo alteraes no influxo de Ca2+ e Na+ atravs de canais sensveis

voltagem ou clcio proveniente do meio intracelular. Uma vez que observamos que a

liberao de [3H]-DA induzida pelo sevoflurano e halotano independente do on clcio e

da despolarizao de membrana, investigou-se atravs da reserpina (inibidor do

transportador vesicular das monoaminas) se esta DA liberada independente do processo

exocittico.

Nesses experimentos, as fatias de crtex cerebral foram pr-incubadas por 15

minutos em meio de incubao na presena ou ausncia da reserpina (0,03 M),

posteriormente marcadas com [3H]-DA e, subseqentemente, incubadas novamente por 15

minutos em meio de incubao na presena ou ausncia da reserpina (0,03 M) e

estimuladas com sevoflurano (0,46 mM) durante 20 minutos ou halotano (0,048 mM)

durante 10 minutos. As figura 10 e 11 mostram que a reserpina no afetou a liberao de

[3H]-DA induzida pelos anestsicos (p>0,05). A reserpina inibiu significativamente a

liberao de [3H]-DA induzida por altas concentraes de potssio (50 mM) (dados no

mostrados).

Esses dados sugerem que o mecanismo de exocitose no est envolvido na ao

desses anestsicos, ou seja, a liberao de DA induzida pelo sevoflurano e halotano em

fatias de crtex cerebral de ratos , possivelmente, de origem no vesicular.

50

Lib

era

o d

e [3

H]-D

A (d

pm/m

g de

teci

do)

0

500

1000

1500

2000

Sevoflurano Sevoflurano +reserpina

Figura 10: Efeito da reserpina na liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em


Fatias de crtex cerebral de ratos (40 mg) foram pr-incubadas por 15 minutos em

meio de incubao na presena ou ausncia da reserpina (0,03 M), posteriormente

marcadas com [3H]-DA e, subseqentemente, incubadas novamente por 15 minutos em

meio de incubao na presena ou ausncia da reserpina (0,03M) e estimuladas com

sevoflurano (0,46 mM) durante 20 minutos.Os resultados foram obtidos pelo da liberao de [3H]dopamina que corresponde seguinte relao:

sevoflurano - controle

(sevoflurano + reserpina)- reserpina.

Os resultados expressam a mdia EPM de pelo menos trs experimentos

individuais realizados em duplicatas

51

Lib

era

o d

e [3

H]-D

A (d

pm/m

g de

teci

do)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Halotano Halotano +reserpina

Figura 11: Efeito da reserpina na liberao de [3H]-DA induzida por halotano em


Fatias de crtex cerebral de ratos (40 mg) foram pr-incubadas por 15 minutos em

meio de incubao na presena ou ausncia da reserpina (0,03M), posteriormente

marcadas com [3H]-DA e, subseqentemente, incubadas novamente por 15 minutos em

meio de incubao na presena ou ausncia da reserpina (0,03M) e estimuladas com

halotano (0,048mM) durante 10 minutos. Os resultados foram obtidos pelo da liberao de [3H]DA que corresponde seguinte relao:

halotano - controle

(halotano + reserpina) - reserpina.

Os resultados expressam a mdia EPM de pelo menos trs experimentos

individuais realizados em duplicatas


cerebral de ratos em baixa temperatura (12 C)

O principal papel do DAT terminar a ao da DA, atravs da sua recaptao.

Assim, uma inibio do DAT causa aumento da concentrao da DA na fenda sinptica,

prolongando sua ao (Engberg e cols., 1997). Alm disso, o DAT tambm responsvel

por um aumento da concentrao de DA extracelular atravs de uma liberao

extravesicular desse neurotransmissor, denominada TR (como j citado anteriormente).

Logo, estudamos a participao do DAT na liberao de DA induzida por sevoflurano e

halotano.

Estudos j mostraram que em baixas temperaturas (12 a 17 C) ocorre uma inibio do DAT, afetando suas funes nos neurnios dopaminrgicos (Gerevich e cols., 2001).

Assim, avaliamos se a liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano e halotano em fatias

de crtex cerebral de ratos alterada em baixa temperatura.

Nestes experimentos, as fatias de crtex cerebral foram pr-incubadas por 5

minutos em meio de incubao a 37C ou 12 C, e subseqentemente, estimuladas com sevoflurano (0,46mM) durante 20 minutos ou halotano (0,048 mM) durante 10 minutos.

A Figura 12 mostra que a liberao de [3H]-DA induzida por sevoflurano em fatias

de crtex cerebral de ratos em meio de incubao a 12

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