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Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia – Inmetro
Natália Cristina da Costa Andrade
ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA EM SISTEMAS
DE ÁGUA DE HEMODIÁLISE ATRAVÉS DE MÉTODOS
DEPENDENTES E INDEPENDENTES DE CULTIVO
Duque de Caxias - RJ
2016
Natália Cristina da Costa Andrade
ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA EM SISTEMAS
DE ÁGUA DE HEMODIÁLISE ATRAVÉS DE MÉTODOS
DEPENDENTES E INDEPENDENTES DE CULTIVO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia do Instituto Nacional de
Metrologia, Qualidade e Tecnologia,
como parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Juliana Lopes Martins
Orientadora
Janaina Japiassu de Vasconcelos Cavalcante
Coorientadora
Duque de Caxias - RJ
2016
Catalogação na fonte elaborada pelo serviço de documentação e informação do Inmetro
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
ANDRADE, Natália Cristina da Costa. Análise da comunidade bacteriana em sistemas de
água de hemodiálise através de métodos dependentes e independentes de cultivo. 2016.
103f. Trabalho de Conclusão do Curso do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia –
Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, Duque de Caxias, 2016.
CESSÃO DE DIREITOS
NOME DO AUTOR: Natália Cristina da Costa Andrade
TÍTULO DO TRABALHO: Análise da comunidade bacteriana em sistemas de água de
hemodiálise através de métodos dependentes e independentes de cultivo.
TIPO DO TRABALHO: Trabalho de conclusão do Curso do Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia / 2016
É concedida ao Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia a permissão para
reproduzir e emprestar cópias desta dissertação ou tese somente para propósitos acadêmicos e
científicos. O autor reserva outros direitos de publicação.
_____________________________________________
Natália Cristina da Costa Andrade
Av. Nossa Senhora das Graças, 50 – Xerém – Duque de Caxias – RJ
Laboratório de Microbiologia – Prédio 27
A553a Andrade, Natália Cristina da Costa
Análise da comunidade bacteriana em sistemas de água de
hemodiálise através de métodos dependentes e independentes de
cultivo / Natália Cristina da Costa Andrade. Duque de Caxias:
Inmetro,2016.
103f.
Orientadoras: Juliana Lopes Martins e Janaína Japiassu de
Vasconcelos Cavalcante.
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Instituto Nacional de
Metrologia, Qualidade e Tecnologia, 2016.
1.Hemodiálise. 2. Bactéria. 3. Metodologia de cultivo.I. Martins,
Juliana Lopes.II. Cavalcante, JanaínaJapiassu de Vasconcelos.
III. Instituto Nacional de Metrologia, Qualidadee Tecnologia.
IV. Título.
CDD: 617.461059
Natália Cristina da Costa Andrade
ANALYSIS OF THE BACTERIAL COMMUNITY IN
HEMODIALYSIS SYSTEMS THROUGH CULTURE –
DEPENDENT AND -INDEPENDENT METHODS
Master dissertation submitted in partial
fulfillment of the requirements for the
Degree of Master of Science in the
Graduate Program in Biotechnology of the
National Institute of Metrology, Quality
and Technology.
Juliana Lopes Martins
Advisor
Janaína Japiassu de Vasconcelos Cavalcante
Co-advisor
Duque de Caxias
2016
Natália Cristina da Costa Andrade
ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA EM SISTEMAS DE
ÁGUA DE HEMODIÁLISE ATRAVÉS DE MÉTODOS DEPENDENTES
E INDEPENDENTES DE CULTIVO
A presente Dissertação, apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia do Instituto Nacional
de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Ciências, foi aprovada pela seguinte Banca
Examinadora:
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Cristina e Carlos, pelo amor, carinho, educação, paciência e todo o suporte
que recebi durante a minha vida.
Ao meu noivo Felipe, pelo carinho, compreensão, ajuda, força e motivação nos momentos
mais difíceis.
Ao meu irmão Lipe, pelos conselhos, conversas e momentos de descontração.
À minha orientadora Juliana, pela amizade, oportunidade de aprendizado, pelos ensinamentos,
compreensão, paciência (muita!) e confiança.
À minha co-orientadora Janaina, pelo apoio, orientação e “caronas para a UERJ” sempre que
precisei.
Aos meus amigos da equipe da Micro: Vanessa, Raquel Soares, Renato (sim, você é da
Micro), Raquel Correia, pelos nossos almoços super felizes, pela ajuda em diversos
momentos e pela compreensão; Danic, pela amizade, apoio e também pela compreensão;
Mari, pela amizade e ajuda em vários momentos.
A todos os meus amigos do Labio, em especial: Júlio, pela amizade, ensinamentos e ajuda
sempre; Rafa, pelo apoio e momentos de descontração; Celso, pelos conselhos e apoio sempre
que precisei; Davi, pela ajuda em vários momentos e motivação; Luanda, pela amizade,
compreensão e apoio. Aos demais colegas do Labio, que de alguma forma também
contribuíram para que eu conseguisse terminar o trabalho.
Ao professor Rodolpho Albano da Uerj, pelos ensinamentos e enorme ajuda na parte
metagenômica do projeto.
Ao Fábio, da Vigilância Sanitária do Município do Rio de Janeiro, pelo suporte nas coletas de
amostras nas clínicas de hemodiálise.
Ao Ministério da Saúde pelo apoio financeiro.
RESUMO
No Brasil, mais de cem mil pessoas apresentam insuficiência renal crônica e são submetidas a
sessões de hemodiálise. Esse processo consiste na filtração do sangue para remoção de
substâncias tóxicas, água e sais minerais do organismo e ocorre através de uma membrana
semi-permeável, que constitui a única barreira entre o sangue do paciente e o grande volume
de líquido ao qual o paciente é exposto. A água utilizada no preparo do dialisato passa por
diferentes processos de filtração e desmineralização, mas continua susceptível à contaminação
por micro-organismos, o que constitui um grave problema para a terapia por hemodiálise.
Nesse estudo, foram avaliados parâmetros microbiológicos preconizados pela RDC ANVISA
Nº11/2014 em amostras de água potável, água tratada para hemodiálise e dialisato e as
comunidades bacterianas presentes nesses pontos foram analisadas através de uma abordagem
dependente e outra independente de cultivo, esta última baseada na análise metagenômica da
região V4 do rDNA 16S através da plataforma Miseq-Illumina. As coletas foram realizadas
em quatro unidades de diálise em parceria com a Vigilância Sanitária do Município do Rio de
Janeiro. As amostras de água foram analisadas quanto à presença de coliformes totais e
Escherichia coli através do método do substrato definido (Colilert®) e não foi detectado
nenhum desses bioindicadores nas amostras. As amostras foram submetidas à contagem de
bactérias heterotróficas e 91,7% mostraram resultados inferiores aos limites preconizados pela
legislação vigente. A maioria das bactérias encontradas pelas duas abordagens pertencia ao
filo Proteobacteria e Firmicutes. Foi observada uma diferença considerável entre as
comunidades bacterianas encontradas pelas metodologias dependente e independente de
cultivo, coincidindo apenas os gêneros Halomonas, Pseudomonas, Burkholderia e
Staphylococcus, que foram encontrados por ambas as metodologias nas mesmas amostras.
Alguns gêneros somente foram detectados em determinadas amostras através do cultivo,
como Micrococcus, Cupriavidus, Ralstonia, dentre outros. Entretanto, um número bastante
superior de bactérias foi identificado somente pelo método independente de cultivo, como
Sphingomonas, Paracoccus, Methylobacterium etc. Grande parte dos gêneros encontrados já
foram descritos como causadores de infecções em pacientes imunocomprometidos, como
Pseudomonas, Burkholderia e Ralstonia, servindo como alerta sobre a presença de micro-
organismos potencialmente patogênicos em amostras que apresentam conformidade com a
legislação brasileira.
Palavras-chave: hemodiálise; água; cultivo; metagenômica; bactérias.
ABSTRACT
In Brazil, more than a hundred thousand people have chronic kidney disease and are
submitted to dialysis sessions. This process involves blood filtration to remove toxic
substances, water and minerals from the body and occurs through a semi-permeable
membrane, which is the only barrier between the patient's blood and the large volume of
liquid to which the patient is exposed. The water used to prepare dialysate goes through
different filtration and demineralization processes, but remains susceptible to contamination
by microorganisms, which constitutes a serious problem for hemodialysis therapy. In this
study, the microbiological parameters established by RDC ANVISA 11/2014 were evaluated
in samples of potable water, treated water for hemodialysis and dialysate and the bacterial
communities present in those points were analyzed using a cultivation-dependent and a
cultivation-independent method, which were based on metagenomic analysis of the V4 region
of the 16S rRNA gene by Miseq-Illumina platform. Samples were collected in four dialysis
units in partnership with the Health Surveillance of the Municipality of Rio de Janeiro. Water
samples were analyzed for the presence of total coliforms and Escherichia coli by the
substrate-defined method (Colilert®) and none of these bioindicators were detected in the
samples. The samples were submitted to heterotrophic plate count and 91.7% showed results
below the limits prescribed by the current resolution. Most bacteria found by the two
approaches belonged to the phylum Proteobacteria and Firmicutes. There was a great
difference between the bacterial communities found by the cultivation-dependent and
cultivation-independent methodologies. Only the genera Halomonas, Pseudomonas,
Burkholderia and Staphylococcuswere found by both methods in the same samples. Some
genera were only detected in certain samples through cultivation, such as Micrococcus,
Cupriavidus andRalstonia. However, a much higher number of bacteria were identified only
by the cultivation-independent method, as Sphingomonas, Paracoccus, Methylobacterium etc.
Many genera found have been reported to cause infections in immunocompromised patients,
such as Pseudomonas, Burkholderia and Ralstonia, serving as a warning about the presence
of potentially pathogenic microorganisms in samples showing conformity with Brazilian law.
Keywords: hemodialysis; water; cultivation; metagenomics; bacteria.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAMI Association for the Advancement of Medical Instrumentation
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BLASTn Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool
[CG] Oligonucleotídeos não metilados citosina-guanina
CPHD Concentrado polieletrolítico para hemodiálise
DNA Ácido desoxirribonucléico
DP Diálise peritoneal
DRC Doença renal crônica
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EU Unidade de endotoxina
FFR Falência funcional renal
FG Filtração glomerular
HD Hemodiálise
IL Interleucina
Inmetro Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
Min Minuto
MS Ministério da Saúde
MUG Metilumbeliferil- -D-glicuronídeo
NCBI National Center for Biotechnology Information
nM Nanomolar
ONPG o-nitrofenil- -D-galactopiranosídeo
OTU Unidade Taxonômica Operacional
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial Hidrogeniônico
PVDF Fluoreto de polivinidileno
PTFE Politetrafluoroetileno
R2A Reasoner´s 2 Agar
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
rDNA 16S Gene codificador do RNA ribossomal 16S
RDP Ribossomal Database Project
rRNA Ácido ribonucléico ribossomal
rRNA 16S RNA ribossomal 16S
rpm Rotações por minuto
SBN Sociedade Brasileira de Nefrologia
SDS Dodecil sulfato de sódio
TAE Tampão tris/borato/EDTA
TLR Receptor Toll like
TNF- Fator de Necrose Tumoral– alfa
TSA Tryptic soy agar
TSB Tryptic soy broth
UE Unidades de endotoxina
UFC
Unidade formadora de colônia
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 13
1.1 A DOENÇA RENAL CRÔNICA (DRC) .................................................................. 13
1.2 O TRATAMENTO DA DRC .................................................................................... 15
1.3 UM BREVE HISTÓRICO DA HEMODIÁLISE ..................................................... 18
1.4 A IMPORTÂNCIA DO TRATAMENTO DA ÁGUA PARA HEMODIÁLISE ..... 20
1.5 SISTEMAS DE TRATAMENTO DA ÁGUA PARA HEMODIÁLISE .................. 23
1.6 PADRÕES DE QUALIDADE DA ÁGUA PARA HEMODIÁLISE ....................... 24
1.7 IMPORTÂNCIA DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA PARA
HEMODIÁLISE ................................................................................................................... 27
1.8 METODOLOGIAS PARA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS . 29
2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 36
3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 38
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 38
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 38
4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 39
4.1 COLETA DAS AMOSTRAS .................................................................................... 39
4.2 AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS PRECONIZADOS
PELA RDC ANVISA Nº 11/2014 ........................................................................................ 41
4.2.1 Verificação da presença/ausência de coliformes totais e Escherichia coli ........ 41
4.2.2 Contagem de bactérias heterotróficas ................................................................. 41
4.3 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA POR METODOLOGIA
DEPENDENTE DE CULTIVO ........................................................................................... 42
4.3.1 Filtração e concentração das amostras................................................................ 42
4.3.2 Plaqueamento e isolamento ................................................................................ 42
4.3.3 Extração de DNA................................................................................................ 43
4.3.4 Amplificação parcial do gene rRNA 16S ........................................................... 43
4.4 ANÁLISE METAGENÔMICA UTILIZANDO O GENE rDNA 16S ..................... 44
4.4.1 Filtração das amostras ........................................................................................ 44
4.4.2 Extração de DNA dos filtros .............................................................................. 45
4.4.3 Amplificação da região V4 do gene rDNA 16S ................................................. 45
4.4.4 Sequenciamento utilizando a plataforma MiSeq- Illumina ................................ 48
4.4.5 Análise das sequências geradas utilizando ferramentas de bioinformática ........ 48
4.4.6 Controle de qualidade das análises realizadas .................................................... 49
5. RESULTADOS ............................................................................................................... 51
5.1 AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS PRECONIZADOS
PELA RDC ANVISA Nº 11/2014 ........................................................................................ 51
5.1.1 Verificação da presença/ausência de coliformes totais e E. coli ........................ 51
5.1.2 Contagem de bactérias heterotróficas ................................................................. 52
5.2 ANÁLISE DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ATRAVÉS DE
METODOLOGIA DEPENDENTE DE CULTIVO ............................................................. 53
5.2.1 Identificação das bactérias isoladas das amostras de água e dialisato dos
sistemas de hemodiálise ................................................................................................... 53
5.3 ANÁLISE DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ATRAVÉS DE
METODOLOGIA INDEPENDENTE DE CULTIVO......................................................... 57
5.3.1 Extração de DNA................................................................................................ 57
5.3.2 Amplificação da região V4 do gene rDNA 16S ................................................. 57
5.3.3 Análises de diversidade, riqueza e rarefação baseadas em OTUs ...................... 59
5.3.4 Estrutura e composição taxonômica das comunidades bacterianas encontradas
nas amostras analisadas .................................................................................................... 63
5.3.5 Comparação entre as comunidades bacterianas encontradas pela metodologia
dependente de cultivo e independente de cultivo ............................................................. 69
6. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 73
7. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 89
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 A DOENÇA RENAL CRÔNICA (DRC)
A DRC é a perda progressiva e irreversível da função renal (TRETINI, 2004) e
constitui, atualmente, um importante problema médico e de saúde pública (JUNIOR, 2004).
No Brasil, de acordo com o Censo Brasileiro de Diálise 2013, estima-se que mais de 100.000
pacientes com insuficiência renal crônica realizem tratamento dialítico. Conforme pode ser
visto na figura 1, esse número vem crescendo a cada ano (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
NEFROLOGIA, 2013).No mundo, o número de pacientes com insuficiência renal crônica
terminal tratados com terapias renais substitutivas cresce a uma taxa aproximada de 7% ao
ano, a qual excede a taxa de crescimento da população (SZUSTER et al., 2012). Além disso, o
envelhecimento populacional e o aumento da prevalência de doenças que contribuem para a
incidência de DRC, como hipertensão e diabetes, sugerem que a DRC é um problema de
saúde pública que tende a crescer ainda mais no futuro (NATIONAL KIDNEY
FOUNDATION, 2002).
Figura 1. Total estimado de pacientes em tratamento dialítico por ano no Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA
DE NEFROLOGIA, 2013).
Os rins são os órgãos responsáveis pela manutenção do volume e da composição do
fluido extracelular do indivíduo dentro dos limites fisiológicos compatíveis com a vida. Cada
rim possui um córtex externo, uma medula interna e uma pelve renal, que desemboca no
ureter, conforme mostra a figura 2. A unidade funcional do rim é o néfron, do qual há
14
aproximadamente 1,4 x 106 em cada rim, variando consideravelmente entre indivíduos e com
um declínio relacionado à idade (RANG & DALE, 2007).
Figura 2. Anatomia renal (Modificado de A.D.A.M. consumer Health).
Na ausência de patologia, cada um dos quase 2 milhões de néfrons presentes nos rins
atuam na filtração, reabsorção e excreção de diversos solutos e água. O rim é o principal
regulador de sódio e água assim como da homeostase ácido-base do organismo. Além disso, é
responsável pela produção de hormônios que estimulam a síntese de hemácias e a homeostase
do cálcio. A falha na função renal é usualmente chamada de insuficiência renal, a qual é
dividida em duas categorias: aguda – perda temporária da função, podendo durar dias ou até
semanas; e crônica – definida como uma perda de função progressiva que ocorre ao longo de
meses ou anos e é caracterizada pela substituição gradual da arquitetura renal normal por
tecido fibroso(JOY et al., 2008).
A doença do parênquima renal é o resultado de diversas complicações agudas e
crônicas que podem levar à perda de néfrons e, em consequência disso, pode ocorrer uma
hiperfiltração adaptativa pelos néfrons remanescentes. Essa hiperfiltração pode gerar danos
glomerulares a longo prazo, o que leva à proteinúria e à perda progressiva da função renal.
Contudo, a diminuição inicial da função renal é assintomática, de forma que só ocorrem
manifestações clínicas tardiamente (HIMMELFARB & SAYEGH, 2010).
As complicações desencadeadas pela DRC podem ser consequências diretas da perda
da função renal, como: sobrecarga de volume, hipercalemia (níveis de potássio acima do
normal), hiperfosfatemia (níveis de fosfato acima do normal), acidose metabólica,
hiperparatireoidismo secundário, anemia e hipertensão. Outras complicações podem também
15
se dar como resultado do tratamento da causa da DRC, como é o caso da quimioterapia para
tratar a glomerulonefrite (HIMMELFARB & SAYEGH, 2010).A detecção precoce da DRC e
as condutas terapêuticas apropriadas para retardar a sua progressão são importantes para
reduzir o sofrimento dos pacientes e os custos associados à DRC (JUNIOR, 2004).
1.2 O TRATAMENTO DA DRC
Para o tratamento da doença renal crônica, existem três alternativas: o transplante
renal, a hemodiálise (HD) e a diálise peritoneal (DP).Esses tratamentos substituem
parcialmente a função renal, aliviam os sintomas da doença e preservam a vida do paciente
(THOMÉ et al., 1999).
Estudos mostram que o transplante renal apresenta vantagens em relação à
sobrevivência quando comparado com a diálise e preferencialmente deve ser feito
preventivamente, ou seja, antes que a diálise seja necessária (SAKHUJAet al., 2014).
Contudo, devido ao crescente aumento no tempo de espera para órgãos provenientes
de cadáveres e às baixas taxas de transplante para a população idosa com insuficiência renal
crônica, a diálise continua sendo o principal tratamento para doença renal terminal (THAMER
et al., 2000).
De acordo com o inquérito da Sociedade Brasileira de Nefrologia realizado em 2013,
no Brasil, 90,8% dos pacientes dialíticos utilizam o método da hemodiálise, enquanto 9,2%, o
método da diálise peritoneal (SESSO et al., 2014).
As duas modalidades de diálise diferem bastante no que se refere à autonomia e
independência do paciente, grau de interação com o sistema de saúde e estilo de vida
(THAMER et al., 2000). Dessa forma, vários fatores devem ser levados em consideração na
escolha da modalidade da diálise, como as características individuais e clínicas do paciente,
suas preferências assim como a dos médicos, a localização geográfica e fatores econômicos
(SZUSTER et al., 2012).
Existem diversos trabalhos que realizaram a comparação da taxa de mortalidade de
pacientes submetidos à hemodiálise versus à diálise peritoneal. Contudo, não existe um
consenso sobre os resultados encontrados (FOOTE & MANLEY, 2008). Alguns trabalhos
mostram que não há diferença na mortalidade nos primeiros anos de tratamento, mas que após
certo período, a taxa de mortalidade nos pacientes tratados por diálise peritoneal é maior que
nos tratados por hemodiálise (TERMORSHUIZEN et al., 2003; JAAR et al., 2005). O
principal problema dos estudos sobre mortalidade e morbidade destes pacientes é que eles não
16
são prospectivos e randomizados, o que faz com que os resultados possam se dar devido a
outros fatores, como por exemplo o estado de saúde dos pacientes antes de iniciar o
tratamento (FOOTE & MANLEY, 2008).
Na diálise peritoneal, realiza-se a infusão de um líquido contendo glicose e sais na
cavidade abdominal. Em seguida, o líquido é retirado dessa cavidade e descartado. Esta
modalidade de diálise pode ser realizada na própria residência ou local de trabalho do
paciente(figura 3) (FOOTE & MANLEY, 2008).
Figura 3. Cateter de diálise peritoneal.Colocaçãode um cateter de diálise peritoneal através da parede abdominal
dentro da cavidade peritoneal (Modificado de FOOTE & MANLEY, 2008).
A DP costuma ser indicada com maior frequência para pacientes que optam pela
independência do autocuidado, com bons hábitos de higiene, com acesso vascular complicado
ou pobremente tolerantes à hemodiálise (USRDS, 1991).
A hemodiálise é o tratamento mais comum para pacientes com insuficiência renal
crônica. Nesse processo, a depuração das substâncias tóxicas e a remoção de líquido são
realizadas por dois processos físicos: a difusão e a ultrafiltração. No transporte por difusão, é
estabelecido um gradiente de concentração de um soluto através de uma membrana
semipermeável; assim, o soluto se difunde pela membrana do lado mais concentrado para o
lado menos concentrado. Esse é o mecanismo primário para remoção de toxinas pela
hemodiálise. Na ultrafiltração, a remoção de fluidos é feita por meio da aplicação de um
gradiente de pressão hidrostática ou osmótica através da membrana; dessa forma, o fluido
atravessa a membrana do local de maior pressão para o de menor (SOARES, OCHIRO&
SANNOMYTA, 2001).
Cateter Músculo
abdominal Cuffs
Gordura
subcutânea Epiderme
Peritôneo parietal
Alças intestinais Omento
17
Conforme mostra a figura 4, durante uma sessão de hemodiálise, o sangue é bombeado
para fora do corpo do paciente, a uma taxa de 300 a 600mL/min, por um circuito vascular
externo através de uma bomba mecânica até o dialisador, que consiste em uma membrana
semipermeável em cujo lado oposto circula uma solução contendo água purificada e
eletrólitos, chamada de dialisato. Essa solução é preparada através da diluição de um
concentrado polieletrolítico para uso em hemodiálise (CPHD) em água. O dialisato é
bombeado através do dialisador em contracorrente com o fluxo de sangue no outro lado da
membrana semi-permeável. Após passagem pelo dialisador, o sangue retorna ao paciente.
Dessa forma, ocorre a passagem de diversas substâncias como água, uréia, creatinina, toxinas
urêmicas e fármacos do sangue para o dialisato. Na maioria das vezes, a hemodiálise é
prescrita três vezes por semana, em sessões que duram de 3 a 5 horas (FOOTE& MANLEY,
2008).
Figura 4. Representação esquemática do processo de hemodiálise(Modificado de FOOTE & MANLEY, 2008).
O início da diálise deve ocorrer com base em uma decisão conjunta do médico com o
paciente e deve levar em conta a indicação clínica. Além disso, existem recomendações que
se baseiam na taxa de filtração glomerular (FG) para início da diálise; as diretrizes publicadas
pela Kidney Disease Outcome Quality(KDOQI) em conjunto com a National Kidney
Foundation apontam que o início da diálise deve-se dar quando a taxa de FG se aproxima de
15mL/min/1,73m2 (NATIONAL KIDNEY FOUNDATION, 2002). Isso se baseia no
pressuposto de que a taxa de FG reflete adequadamente a função renal global e que os
Detector
de ar
Monitor de
pressão venosa
Dialisador
Ultrafiltrado e
dialisato
Bomba do
dialisato
Anticoagulante
Monitor de
pressão arterial Bomba de
sangue
Sangue
saindo do
paciente
Acesso vascular
Sangue retornando
do paciente
18
sintomas urêmicos geralmente se manifestam em uma taxa de FG menor que
15mL/min/1,73m2. Alguns especialistas afirmam que o início da diálise quando a taxa de FG
ainda é alta pode não ser benéfico aos pacientes, podendo estar associado a uma maior
morbidade e mortalidade devido ao processo de diálise (HIMMELFARB & SAYEGH, 2010).
1.3 UM BREVE HISTÓRICO DA HEMODIÁLISE
O termo “diálise” foi utilizado pela primeira vez pelo químico escocês Thomas
Graham (1805-1869) para descrever o fenômeno de separação de substâncias coloidais e
cristaloides através de uma membrana semipermeável constituída de material vegetal
(RIELLA, 2010).
O primeiro relato de hemodiálise encontrado na literatura é o de ABELet al.(1913),
que realizou o procedimento em animais. Nessa ocasião, foram utilizados tubos cilíndricos de
colódio como membrana e hirudina como anticoagulante.
Em humanos, a primeira hemodiálise foi realizada por George Haas, em 1924, que
também utilizou, inicialmente, tubos de colódio e hirudina. Em 1927, Haas substituiu a
hirudina pela heparina, a fim de evitar reações alérgicas à primeira (WIZEMANN et al., 1998;
EKNOYAN, 2009).
Somente 20 anos depois, em 1943, o holandês Willem Kolff, considerado por alguns o
“pai da hemodiálise”, desenvolveu um “rim artificial” e utilizou tubos de celofane como
membrana de diálise e heparina como anticoagulante e mostrou ser possível o tratamento de
pacientes com insuficiência renal aguda. O rim de Kolff removia eficazmente as toxinas do
sangue, mas como trabalhava com baixa pressão, não removia o líquido em excesso do
sangue do paciente(BLAGG et al., 2004).
Em 1960, SCRIBNERet al. começaram experimentos que tornaram possível o
tratamento da insuficiência renal crônica por hemodiálise, através do desenvolvimento de um
pequeno tubo de politetrafluoroetileno (PTFE ou Teflon) que conectava as cânulas venosas e
arteriais. A vantagem disso era a redução das inserções cirúrgicas de cânulas arteriais e
venosas. Esse aparato ficou conhecido com o shunt de Scribner. Devido às propriedades
antiaderentes do PTFE e sua relativa biocompatibilidade, houve redução dos eventos
trombóticos, possibilitando a realização de várias sessões de hemodiálise antes da falência do
shunt (QUINTON et al., 1960).
Inicialmente, eram realizadas sessões de diálise a cada 5-7 dias; com o tempo, foi visto
que os pacientes continuavam a desenvolver sintomas urêmicos, sendo necessário diminuir o
19
intervalo entre as sessões. Assim, estas passaram a ser realizadas duas vezes por semana.
Contudo, os problemas de hipertensão, neuropatia periférica e hipervolemia somente foram
sanados após ser instaurado o regime de três vezes por semana, utilizado até os dias de hoje
(BLAGG et al., 2004).
Em 1966, BRESCIA et al. (1966) desenvolveram a fístula arteriovenosa subcutânea,
que consiste em uma pequena comunicação entre uma veia e uma artéria, tornando possível a
realização de sessões de hemodiálise por períodos mais longos, sem que houvesse falência do
acesso vascular e com um menor número de complicações quando comparado com o shunt de
Scribner(KOLF et al., 1997).
Nos dias de hoje, a fístula arteriovenosa ainda é bastante utilizada, apresentando baixo
risco de complicações, como infecção e trombose e está relacionada com maiores taxas de
sobrevivência e menores taxas de hospitalização (figura 5).
Figura 5. Fístula arteriovenosa. O acesso vascular é criado pela anastomose cirúrgica da veia cefálica com a
arterial radial. O fluxo de sangue do sistema arterial de alta pressão resulta na hipertrofia da veia (Modificado de
FOOTE & MANLEY, 2008).
No Brasil, a primeira hemodiálise foi realizada em 1949 no hospital das Clínicas em
São Paulo, pelo Dr. Tito de Almeida (1913-1998), que utilizou um rim artificial totalmente
artesanal. Em 1972, a empresa multinacional norte-americana Baxter iniciou suas atividades
comerciais no Brasil, no setor de equipamentos de hemodiálise, favorecendo a difusão do
tratamento no país (FARIA, 2011).
A hemodiálise se tornou popular graças a avanços tecnológicos que incluem o
aprimoramento de máquinas e a fabricação de dialisadores mais eficientes e seguros, além do
Veia basílica
Veia cefálica
Veia da fossa antecubetal
Artéria braquial
Artéria ulnar Sítio geralmente
usado para instalação
da primeira fístula
Artéria radial
20
desenvolvimento de técnicas cirúrgicas de confecção de acessos vasculares permanentes
(LUGON, 2003).
1.4 A IMPORTÂNCIA DO TRATAMENTO DA ÁGUA PARA HEMODIÁLISE
Os pacientes que realizam tratamento por hemodiálise são expostos a volumes de
fluido de diálise que variam entre 18.000 a 36.000 litros por ano (SILVA et al., 1996). Ao
redor do mundo, a produção desse fluido gira em torno de 25.000.000.000 litros, o que torna
este um dos produtos de maior volume utilizados na medicina. Este fluido, chamado dialisato,
consiste em até 99% de água, que é misturada com ácidos, sais e bicarbonato (NYSTRAND,
2008).
O monitoramento da qualidade das águas é um dos instrumentos de verificação e
avaliação dos riscos que elas podem representar para a saúde humana. Os vários usos da água
possuem diferentes requisitos de qualidade. As águas com maior qualidade permitem usos
mais exigentes, como o consumo humano, enquanto águas com pior qualidade permitem usos
menos exigentes, por exemplo, navegação. No Brasil, adota-se o enquadramento por classes
de qualidade, que faz com que os padrões de qualidade estabelecidos para cada uma sejam
formados pelos critérios mais restritivos dentre todos os usos contemplados naquela classe
(CONAMA, 2005).
Os órgãos competentes para a definição dos parâmetros da qualidade das águas, pela
vigilância e fiscalização desses padrões estão bem determinados nas legislações e variam de
acordo com a utilização dessas águas. O Ministério da Saúde é o órgão com competência para
definir os padrões adotados para a qualidade de águas para consumo humano, enquanto a
ANVISA estabelece os requisitos da água para hemodiálise, conforme será explicitado na
página 25(BRASIL, 2011; ANVISA, 2014).
Até a década de 1970, acreditava-se que poderia ser utilizada a água potável para a
hemodiálise (SILVA et al., 1996). A hipótese se baseava na ideia de que se essa água poderia
ser usada para beber também seria segura para hemodiálise (TONG et al., 2001). Com o
tempo, o número de pacientes em tratamento foi crescendo e foi possível observar correlação
entre os contaminantes da água e os efeitos adversos observados nos pacientes (SILVA et al.,
1996).
A “síndrome da água dura” foi um dos primeiros eventos relacionados com a
qualidade da água. Durante as sessões de diálise, alguns pacientes apresentavam náuseas,
vômitos, letargia, fraqueza muscular intensa e hipertensão arterial. Descobriu-se que tais
21
sintomas estavam diretamente associados à presença de grandes quantidades de cálcio e
magnésio na água. Para remover estes minerais, começaram a ser utilizados equipamentos
chamados abrandadores, e os sintomas e sinais começaram a desaparecer (SILVA et al.,
1996).
Como os poros das membranas de diálise possibilitam a passagem de solutos de até
certo tamanho, todas as substâncias de pequeno peso molecular presentes no dialisato podem
ter acesso à corrente sanguínea do paciente, levando ao aparecimento de efeitos adversos, que
podem, muitas vezes, ser letais (RAMIREZ, 2009). Além disso, como o processo de diálise
utiliza grandes quantidades de água, até mesmo uma pequena quantidade de contaminantes
pode ser perigosa (TONG et al., 2001).
Nas águas de superfície, os contaminantes mais frequentemente encontrados são
materiais orgânicos, minerais e bactérias (SILVA et al., 1996).A presença de algumas
substâncias na água potável é normal, mas na água para hemodiálise, as mesmas podem
oferecersérios riscos à saúde do paciente,conforme pode ser observado natabela 1(TONG et
al., 2001).
Tabela 1. Efeitos de contaminantes químicos nos pacientes em diálise (Adaptado de TONG et al., 2001)
Sinais e sintomas Contaminantes possíveis
Anemia Alumínio, cloraminas, cobre, zinco, formaldeído,
nitratos
Doença óssea Alumínio, fluoreto
Hipertensão Cálcio, sódio
Hipotensão Bactérias, endotoxinas, nitratos
Acidose metabólica Baixo pH, sulfatos
Fraqueza muscular Cálcio, magnésio
Náuseas e vômitos Bactéria, cálcio, cobre, endotoxinas, baixo pH,
magnésio, nitratos, sulfatos, zinco
Deterioração neurológica e
encefalopatia Alumínio
Hemólise Cloraminas, cobre, nitratos, formaldeído
Outro fator que aumenta o risco de se usar a água potável na hemodiálise é que os
recursos utilizados pelos sistemas públicos de tratamento a fim de tornar a água própria para o
consumo humano são tóxicos para pacientes em tratamento por hemodiálise. Como exemplo,
tem-se a adição de sulfato de alumínio, cloro e flúor (RIELLA, 2010).
22
Diversos trabalhos já foram publicados relatando surtos em clínicas de hemodiálise
pelo mundo, devido tanto à presença de contaminantes químicos quanto microbiológicos em
águas para hemodiálise. BURWEN et al. (1995) relataram um caso de intoxicação de
pacientes pela presença de alumínio no dialisato que levou a episódios de convulsões nesses
pacientes. Outro caso de exposição a contaminantes químicos foi descrito por TIPPLE et al.
(1991): 41 pacientes foram expostos a dialisato contaminado com cloro e precisaram ser
submetidos a transfusões sanguíneas para tratar a anemia hemolítica que adquiriram. Também
foram relatados casos de anemia hemolítica por intoxicação por cobre (MANZLER &
SCHREINER, 1970). Casos de contaminação pela presença de fluoreto no dialisato também
já foram descritos por ARNOW et al. (1964), em que 12 pacientes ficaram doentes. Os casos
relatados constituem apenas uma parcela dos diversos surtos de intoxicação por contaminação
química do dialisato que podem ser encontrados na literatura (SELENIC et al., 2004;
ORRINGER & MATTERN, 1976; GORDON et al., 1990).
Vários casos de contaminação da água para diálise e dialisato por micro-organismos
também já foram reportados, a maioria associada com desinfecção inadequada dos sistemas
de água. Reações pirogênicas foram observadas por GORDON et al. (1988) em 16 pacientes,
sendo associadas com a presença de endotoxinas provenientes de dialisadores reutilizados.
Bacteremias também foram relatadas em seis pacientes renais crônicos por dialisato
contaminado por Klebsiella pneumoniae (WELBEL et al., 1995). BECK-SAGUE et al.
(1990) relataram nove reações pirogênicas e cinco bacteremias por bactérias gram-negativas
em pacientes em tratamento por hemodiálise. Além desses, outros trabalhos também mostram
a importância do controle microbiológico da água para hemodiálise (ARVANITIDOU et al.,
2003; BORGES et al., 2007; MONTANARI et al., 2009; OIE et al., 2003; BUGNO et al.,
2007).
No Brasil, o caso mais conhecido de contaminação em água para hemodiálise ocorreu
em fevereiro de 1996 no Instituto de Doenças Renais (IDR) em Caruaru, PE. Esse acidente
ocasionou a morte de 72 pessoas por intoxicação por microcistina, e motivou a publicação da
primeira normatização do Ministério da Saúde sobre o tema, transformando a história e a
prática clínica da hemodiálise no Brasil (COELHO, 1998).
23
1.5 SISTEMAS DE TRATAMENTO DA ÁGUA PARA HEMODIÁLISE
A eficiência de um sistema de tratamento de água para hemodiálise é influenciada por
alguns fatores, como a natureza da água a ser tratada, os componentes do equipamento e as
variações sazonais (SILVA et al., 1996). Um típico sistema de tratamento de água para
hemodiálise está representado na figura 6.
Figura 6. Esquema de um sistema de tratamento de água para hemodiálise (RIELLA, 2010). Os asteriscos
indicam os pontos de coleta de amostras utilizados neste trabalho, sendo: * Ponto 1: Água potável, proveniente
da rede de abastecimento; ** Ponto 2: Água potável após passar pelo sistema de tratamento, tornando-se água
tratada para diálise; *** Ponto 3: Dialisato, solução composta pela água para hemodiálise e CPHD.
Primeiramente, a água potável passa por um pré-tratamento, composto por filtros de
areia, carvão ativado e resina de troca iônica ou abrandador. O filtro de areia é importante
para a remoção das partículas em suspensão. Já os filtros de carvão ativado adsorvem
cloretos, cloraminas e substâncias orgânicas, além de eliminar odores presentes na água. Nos
abrandadores, ocorre a remoção de cálcio, magnésio e outros cátions polivalentes, o que é de
suma importância não só por controlar a dureza da água mas também por proteger as
membranas do sistema de osmose reversa (SILVA et al., 1996).
Após essa etapa inicial, a água pré-tratada atravessa as membranas do sistema de
osmose reversa. Esse tratamento apresenta índices de retenção de contaminantes químicos
Areia Carvão 1 Carvão 2 Resina de
troca
iônica
Osmose reversa
Rejeito
Produto
bomba Filtro de
membrana Máquina de
diálise
Estoque
de água
tratada
*
**
***
24
entre 95 e 99% e retém grande parte das bactérias, fungos, algas e vírus, além de reter
pirogênios e materiais proteicos de alto peso molecular (SILVA et al., 1996).No passado,
grande parte das clínicas utilizava deionizadores como sistema de purificação. Com o passar
do tempo, o uso da osmose reversa, que é comprovadamente mais eficiente, vem tomando o
lugar dos deionizadores, sendo encontrada em aproximadamente 95% das unidades de
hemodiálise brasileiras (SOCIEDADE BRASILEIRA DE NEFROLOGIA, 2008).
A água segue então para um tanque hermeticamente fechado que possui fundo cônico,
sendo posteriormente distribuída para as máquinas de hemodiálise. A água não utilizada
retorna para o tanque de armazenamento – isso somente é possível graças ao sistema de
canalização, que deve ser em circuito fechado (looping) sem zonas mortas. Recomenda-se que
a água não deixe de circular a fim de evitar a proliferação bacteriana e a possível formação de
biofilmes (SILVA et al., 1996).
1.6 PADRÕES DE QUALIDADE DA ÁGUA PARA HEMODIÁLISE
O reconhecimento do risco que a ausência de um tratamento específico da água
destinada para hemodiálise representava motivou a criação de diversos órgãos e comissões
pelo mundo, com o objetivo de estabelecer critérios para a composição adequada da água para
diálise. Mundialmente, as normas mais conhecidas são as sugeridas pela Association for the
Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) e as seguidas pela Comunidade Européia
(SILVA et al., 1996).
Em outubro de 1996, motivado pelo caso da contaminação por microcistina em
Caruaru,o Ministério da Saúde publicou a Portaria MS nº 2042/1996 (BRASIL, 1996) com o
objetivo de estabelecer os parâmetros da qualidade da água para hemodiálise. Essa portaria foi
substituída pela Portaria MS nº 82/2000 (BRASIL, 2000), posteriormente pela RDC ANVISA
nº 154/2004 (ANVISA, 2004) e atualmente se encontra em vigor a RDC 11/2014 (ANVISA,
2014), que estabelece os requisitos de boas práticas de funcionamento para os serviços de
diálise e dá outras providências(SIMÕES et al., 2005).
Outras normas compõem a legislação acerca da hemodiálise no Brasil. São elas: RDC
ANVISA nº 33/2008 (ANVISA, 2008), que dispõe sobre o Regulamento Técnico para
planejamento, programação, elaboração, avaliação e aprovação dos sistemas de tratamento e
distribuição de água para hemodiálise no Sistema Nacional de Vigilância Sanitária; RDC
ANVISA nº 8/2001 (ANVISA, 2001), instrumento normativo que aprova o regulamento
técnico que institui as boas práticas de fabricação do CPHDe, por último, a Portaria MS nº
25
2.914/2011 (BRASIL, 2011), que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância
da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.
Segundo a RDC ANVISA Nº 11/2014, aágua de abastecimento do serviço de diálise
deve ter o seu padrão de potabilidade em conformidade com o que estabelece aPortaria MS Nº
2.914/2011 (ANVISA, 2014; BRASIL, 2011). A qualidade da água de abastecimentoprecisa
ser monitorada e registrada diariamente pelo técnico responsável, e devem ser observadas as
condições presentes na tabela 2 (ANVISA, 2014).
Tabela 2. Características físicas e organolépticas da água potável(Adaptado de ANVISA, 2014)
Característica Parâmetro aceitável Frequência de
verificação
Cor aparente Incolor Diária
Turvação Ausente Diária
Sabor Insípido Diária
Odor Inodoro Diária
Cloro residual livre Água da rede pública: maior que 0,2 mg/L; água de
fonte alternativa: maior que 0,5 mg/L
Diária
pH 6,0 a 9,5 Diária
Com relação à água para hemodiálise, que é gerada após a água potável passar por um
sistema de tratamento conforme exemplificado na figura 6, as análises devem contemplar e
respeitar os componentes, o valor máximo e a frequência de análise dispostos na tabela 3.
Tabela 3. Padrão de qualidade da água para hemodiálise (ANVISA, 2014)
Componentes Valor máximo permitido Frequência
de análise
Coliforme total Ausência em 100mL Mensal
Contagem de bactérias heterotróficas 100 UFC/mL Mensal
Endotoxinas 0,25 EU/mL Mensal
Alumínio 0,01 mg/L Semestral
Antimônio 0,006 mg/L Semestral
Arsênico 0,005 mg/L Semestral
Bário 0,1 mg/L Semestral
26
Berílio 0,0004 mg/L Semestral
Cádmio 0,001 mg/L Semestral
Cálcio 2 mg/L Semestral
Chumbo 0,005 mg/L Semestral
Cloro total 0,1 mg/L Semestral
Cobre 0,1 mg/L Semestral
Cromo 0,014 mg/L Semestral
Fluoreto 0,2 mg/L Semestral
Magnésio 4 mg/L Semestral
Mercúrio 0,0002 mg/L Semestral
Nitrato (N) 2 mg/L Semestral
Potássio 8 mg/L Semestral
Prata 0,005 mg/L Semestral
Selênio 0,09 mg/L Semestral
Sódio 70 mg/L Semestral
Sulfato 100 mg/L Semestral
Tálio 0,002 mg/L Semestral
Zinco 0,1 mg/L Semestral
Conforme mostra a tabela acima, os parâmetros microbiológicos acessados na água
para hemodiálise são: avaliação de coliformes totais, contagem de bactérias heterotróficas e
dosagem de endotoxinas. Os dois primeiros parâmetros, acrescidos da avaliação da presença
de E. coli são também requisitos de potabilidade preconizados pela Portaria MS Nº
2.914/2011 (BRASIL, 2011).
A Resolução também determina que a qualidade bacteriológica da água para
hemodiálise deve ser verificada sempre que ocorrerem manifestações pirogênicas, bacteremia
ou suspeitas de septicemia nos pacientes (ANVISA, 2014).
Além das análises na água tratada para hemodiálise, deve-se executar análise
microbiológica mensal de uma amostra de dialisato, imediatamente antes do dialisador, no
final da sessão. Deve ser realizada contagem de bactérias heterotróficas e o valor máximo
permitido é de 200UFC/mL.
A qualidade microbiológica do dialisato não depende apenas do controle da água, mas
também do controle da qualidade do CPHD, cuja fabricação deve seguir a RDC ANVISA Nº
08/2001 (ANVISA, 2001), que impõe padrões estritos de qualidade. Segundo essa resolução,
27
as matérias-primas empregadas na sua fabricação devem ser especificadas quanto à pureza
física e química, teor do princípio ativo e pureza microbiológica que garanta no máximo 100
UFC/mL ou gno produto final.Ao término da produção, o CPHD diluído com a água
purificada empregada na preparação deve ser submetido a determinados controles, como: (i)
teste de condutividade, devendo estar entre 11 mS.cm-1 e 15 mS.cm-1, (ii) medição de pH,
que deve estar entre 6,8 e 7,5, (iii) contagem de bactérias heterotróficas (até 100 UFC/mL),
(iv) endotoxinas, com valor máximo de 0,5 EU/mL e (v) medição dos teores dos
componentes, que precisam estar entre +2,5% para o sódio e + 5% para os demais sais em
relação ao declarado no rótulo do produto (ANVISA, 2001). Dessa forma, nota-se que, por ser
um produto farmacêutico, sua fabricação ocorre de acordo com elevados padrões de controle
de qualidade química e microbiológica.
1.7 IMPORTÂNCIA DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA PARA
HEMODIÁLISE
No processo de hemodiálise, como o sangue do paciente e o dialisato são separados
apenas por uma membrana semipermeável, a qualidade microbiológica deste fluido é
extremamente importante. A presença de micro-organismos na água pode liberar endotoxinas,
fragmentos de endotoxinas, exotoxinas, fragmentos de DNA e polissacarídeos que podem
passar através da membrana de diálise, devido ao seu tamanho (0,5-200kDa). Os efeitos dessa
passagem podem se dar na forma de reações pirogênicas imediatas ou através da indução de
produção de citocinas pelos monócitos devido a ativação dos receptores Toll-like pelos
fragmentos bacterianos, levando a uma resposta inflamatória. A exposição por longos
períodos está relacionada com a desnutrição, amiloidose e aterosclerose e é importante
também na resposta do paciente à eritropoetina (HOENICH et al., 2006).
Os pacientes urêmicos apresentam um estado microinflamatório crônico caracterizado
por níveis elevados de proteínas reativas de fase aguda, como a proteína-C-reativa, e elevação
de citocinas pró-inflamatórias, como por exemplo, as interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) e o
fator de necrose tumoral- (TNF- ).A proteína-C-reativa tem sido constantemente associada
à mortalidade cardiovascular em pacientes submetidos à hemodiálise e é considerada um
marcador de inflamação em casos de uremia (THOMÉ et al., 2005).
Em 1983, HENDERSON et al.propuseram que nos pacientes em hemodiálise, os
monócitos eram ativados pelo contato com a membrana celulósica do dialisador e produziam
IL-1, o que levava à febre e redução da pressão arterial. Mais tarde, foi visto que outras
28
citocinas, além da IL-1, também eram produzidas pelos monócitos e isso ocorria não só pelo
contato do sangue com a membrana de diálise, mas também devido à presença de
contaminantes no dialisato (HENDERSON et al., 1983; TAKEMOTO, NAGANUMA &
YOSHIMURA, 2011).
Mais tarde, SCHIFFLet al. (2001) mostraram que trocando-se o dialisato convencional
pelo ultrapuro, os níveis de IL-6 e proteína-C-reativa foram reduzidos significativamente e
resultaram em aumento na massa corpórea seca estimada do paciente e concentração de
albumina sérica, após um período de doze meses. Enquanto isso, os pacientes que mantiveram
o uso do dialisato convencional não apresentaram alterações significativas nesses marcadores.
Assim, como a presença de endotoxinas no dialisato pode estimular a liberação de
citocinas, a pureza do mesmo se tornou tão importante quanto o material da membrana em se
tratando de biocompatibilidade na hemodiálise (TAKEMOTO, NAGANUMA &
YOSHIMURA, 2011).
No entanto, de acordo com MERINOet al. (2008), mesmo quando se utiliza um
dialisato ultrapuro, ocorre ativação de monócitos, e com isso, uma resposta inflamatória. Isso
provavelmente se deve à presença de fragmentos de DNA bacterianos, que continuam
presentes no dialisato até mesmo se a contaminação bacteriológica já tiver sido eliminada.
O DNA bacteriano contém sequências oligonucleotídicas imunoestimulatórias de 15 a
20 pares de bases com dinucleotídeos citosina-guanina não metilados (CpG). Esses
dinucleotídeos CpG podem atravessar as membranas de diálise por retrofiltração e podem se
ligar ao receptor toll-like 9 (TLR-9) de células imunocompetentes, disparando uma cascata de
ativação de proteínas cinases (MERINO et al., 2008).
Além das reações inflamatórias geradas pela presença dos produtos bacterianos, existe
também a possibilidade de bacteremia, que é uma das principais causas de morbidade e
mortalidade em pacientes de hemodiálise. Teoricamente, uma membrana de diálise intacta
deve impedir a passagem de bactérias a partir do fluido de diálise para a corrente sanguínea
do paciente. Contudo, pode ocorrer bacteremia se houver defeitos na integridade da
membrana, se o nível de contaminação no dialisato for alto o suficiente a ponto de permitir
que os micro-organismos cresçam através da membrana ou caso haja contaminação extrínseca
durante o reprocessamento do dialisador (ROTH & JARVIS, 2000).
Diversos surtos de contaminação bacteriana em unidades de hemodiálise já foram
descritos. Dentre as bactérias encontradas com frequência nas amostras de água e dialisato
contaminados, se encontram espécies dos gêneros Pseudomonas, Moraxella, Klebsiella,
Xanthomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Burkholderia, Alcaligenes, Achromobacter,
29
Serratia e Stenotrophomonas (BUGNO et al., 2007; SILVA et al., 1996; ROTH & JARVIS,
2000).
1.8 METODOLOGIAS PARA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
Métodos baseados no cultivo de amostras em meios de cultura específicos são simples,
convenientes e permitem comparações rápidas de múltiplas amostras empregando poucos
equipamentos laboratoriais simples. Contudo, é um equívoco comum pensar que os micro-
organismos isolados em cultura pura de determinado meio representam as espécies
numericamente dominantes deste ambiente. Na realidade, micro-organismos isolados a partir
de métodos de cultivo padrão raramente se encontram em maioria nas comunidades de onde
foram retirados: em vez disso, eles são isolados graças à sua capacidade de crescer
rapidamente em meios de cultivo ricos em nutrientes, normalmente sob condições aeróbicas, a
temperaturas moderadas (HUGENHOLTZ, 2002). De fato, estima-se que, em muitos
ambientes, somente 1% dos micro-organismos podem ser detectados em placas com meios de
cultura tradicionais. Isso pode ser explicado pela necessidade de condições de crescimento
mais específicas, pela interdependência de diferentes organismos com outros ou por estarem
em um estado viável, mas não cultivável (GOMILA et al., 2005; SCHMIDT, 2006).
A caracterização de comunidades bacterianas na água de hemodiálise é geralmente
limitada à contagem ou à detecção de micro-organismos indicadores ou grupos específicos de
bactérias utilizando abordagens dependentes de cultivo. Devido às limitações dos métodos
que se baseiam em cultivo, para acessar a complexidade das comunidades microbianas de um
ambiente, esses métodos podem ser complementados com as informações obtidas por análises
independentes de cultivo (GOMILA et al., 2005).
O emprego de técnicas moleculares baseadas na análise do DNA de micro-organismos
retirado diretamente dos ambientes naturais sem a necessidade de multiplicação prévia das
células, conhecidas como técnicas metagenômicas, tornou-se possível graças aos estudos de
pioneiros em amostras de água e sedimentos de lagoas costeiras com o objetivo de analisar
comunidades microbianas utilizando as informações da sequência de nucleotídeos do DNA
ribossômico (BENLLOCH, RODRÍGUEZ-VALERA & MARTÍNEZ-MURCIA, 1995).
O termo “metagenômica” foi publicado pela primeira vez em 1998 em um estudo de
clonagem de DNA ambiental de micro-organismos do solo (HANDELSMAN, 1998). A
metagenômica é um tipo de abordagem independente de cultivo que analisa DNA genômico
de uma mistura de populações microbianas diretamente na amostra, enquanto a genômica se
30
trata da análise da mesma molécula, com a diferença de esta ser proveniente de uma célula ou
organismo isolado (GILBERT & DUPONT, 2011).
Atualmente, as aplicações dos estudos de metagenômica são bastante vastas, variando
desde estudos básicos em diversidade e ecologia até a obtenção de produtos de interesse
biotecnológico. Nesse contexto, diversos trabalhos já a utilizaram para caracterizar a
diversidade biológica em diversos ambientes (BEARDSLEY, 2006; PIGANEAU &
MOREAU, 2007; HUGENHOLTZ & TYSON, 2008). Outros utilizaram a técnica para
encontrar genes envolvidos em reações de interesse biotecnológico, como degradação de
biomassa (HESS, 2011), xilanases (HU, 2008) assim como outras enzimas e biosurfactantes
(KENNEDY et al., 2011).
Dentre as diversas aplicações da metagenômica, as que utilizam o gene que codifica o
RNA ribossomal 16S para análise da diversidade bacteriana em diferentes ambientes vem
ganhando bastante importância.
Os RNAs ribossomais estão entre as macromoléculas mais conservadas em todos os
seres vivos. Nas bactérias, os genes de RNA ribossomal são transcritos a partir de uma única
unidade de transcrição ou operon, que contém os genes de rRNA 5S,16S e 23S. O tamanho do
operon, as sequências nucleotídicas e as estruturas secundárias dos três genes de rRNAsão
conservados dentro de uma espécie bacteriana (RAJENDHRAN & GUNASEKARAN, 2011).
No final dos anos 1960, o rRNA 5S foi largamente empregado para análise de
sequências, por ser relativamente pequeno (~120 nucleotídeos) e consequentemente, mais
fácil de sequenciar utilizando a tecnologia disponível na época. Contudo, a escassez de
regiões variáveis limitou seu uso (OLSEN, 1986; PACE, 2012). Tanto o gene que codifica o
rRNA 23S quanto o que codifica o 16S possuem um número suficiente de regiões
informativas filogeneticamente para caracterizar muitos procariotos. No entanto, poucos
estudos taxonômicos utilizam o 23S, já que o rRNA 16S é o mais conservado dentro de uma
espécie bacteriana (KOLBERT & PERSING, 1999; WOESE, 1987).
Tradicionalmente, os organismos eram classificados em procariotos e eucariotos e,
dentro desses grupos, encaixados dentro de reinos, filos, classes, ordens, famílias, gêneros e
espécies de acordo com as suas características fenotípicas. Entretanto, a classificação
taxonômica através desses métodos pode ser difícil devido a variações nessas características.
Há aproximadamente três décadas, WOESE et al. (1990) começaram a analisar sequências de
rDNA 16S de várias bactérias.Com base nessas análises, foi sugerida uma nova classificação
para os seres vivos, não mais baseada na morfologia, mas na sequência estrutural do rDNA.
Assim,a vida na Terra foi dividida em 3 domínios: Bacteria, Archaea e Eucarya. Cada
31
domínio foi subdividido em no mínimo dois reinos através de análises genotípicas e
fenotípicas (WOO et al., 2008; WOESE et al., 1990).
Com o passar dos anos, observou-se que árvores filogenéticas construídas a partir de
sequências de RNA ribossomal procarióticas não coincidem necessariamente com a
caracterização baseada em métodos taxonômicos clássicos, como morfologia e utilização de
fonte de carbono. Enquanto as classificações genotípicas são baseadas em alvos moleculares
uniformes e relativamente estáveis, sabe-se que classificações fenotípicas podem estar sujeitas
a variações na morfologia, status metabólico e interpretações individuais (KOLBERT &
PERSING, 1999).
A sequência nucleotídica do rDNA 16S possui aproximadamente 1550 pares de bases
e é composta por regiões conservadas e hipervariáveis intercaladas (figura 7). Esse gene, que
ocorre em pelo menos uma cópia em cada genoma de procarioto, pode ser comparado não só
entre as bactérias, mas também com o gene que codifica o rRNA 16S das arquéias assim
como com o 18S de eucariotos (CLARRIDGE, 2004). Assim, podem ser utilizados
iniciadores universais complementares às regiões conservadas para que as regiões
hipervariáveis sejam usadas para distinguir as espécies ou gêneros (MIZRAHI-MAN,
DAVENPORT & GILAD, 2013). Após o sequenciamento, alvos homólogos são alinhados
para análise taxonômica e filogenética (KOLBERT & PERSING, 1999).
Figura 7. Representação do gene que codifica o rRNA 16S com base na sequência de E. coli (BROSIUS et
al.,1981). Em azul: regiões variáveis entre gêneros ou espécies bacterianas. Em branco: sequência conservada no
Domínio Bacteria.
Embora a taxa absoluta de alterações na sequência do gene rRNA 16S não seja
conhecida, as diferenças marcam a distância evolutiva e a relação entre os organismos
(CLARRIDGE, 2004).
A abordagem metagenômica utilizando o rDNA 16S para analisar diversidade
bacteriana geralmente envolve a extração do DNA total da amostra, amplificação pela reação
em cadeia da polimerase (PCR) seguidos do sequenciamento de nova geração e análise das
sequências geradas.
O primeiro passo no isolamento de ácidos nucléicos de amostras de água é a
concentração das mesmas, que pode ser realizada por centrifugação, filtração ou combinação
32
de ambas a fim de se obter quantidade de biomassa suficiente para análise metagenômica
(FELCZYKOWSKA et al., 2015). O segundo passo é o isolamento do DNA, cuja eficácia
depende do método de extração empregado visto que existem grandes diferenças na parede e
estruturas das membranas bacterianas. Muitos protocolos de extração de DNA já se
mostraram eficientes em amostras de água (FUHRMA et al., 1988; SOMERVILLE et al.,
1989; SCHMIDT et al., 1991; BOCCUZZI et al., 1998), assim como kits comerciais
específicos, como PowerWater® SterivexTM
DNA Isolation kit(MOBIO, USA)ou kits
inicialmente empregados para outras matrizes mas que foram adaptados para amostras de
água, como o PowerSoil® DNA Isolation kit (MOBIO, USA) (BAI et al., 2013).
A reação em cadeia da polimerase é frequentemente usada na análise filogenética de
comunidades microbianas e para várias outras abordagens moleculares de estudos ecológicos.
Ela permite amplificar regiões do DNA de forma seletiva através do emprego de primers
específicos a partir de pequenas quantidades de material genético extraído das amostras de
interesse (ROLING & HEAD, 2005).
Os estudos iniciais de análise da diversidade bacteriana usualmente empregavam
amplificação e sequenciamento do gene que codifica o rRNA 16S por completo, mas havia
certa dificuldade em se conseguir explorar toda a diversidade da amostra pois havia uma
limitação na profundidade do sequenciamento.Com o advento das novas tecnologias de
sequenciamento que geram sequências mais curtas, o conceito passou a ser amplificar e
sequenciar uma das regiões hipervariáveis do rDNA 16S, mas obtendo-se uma profundidade
maior (MIZRAHI-MAN, DAVENPORT & GILAD, 2013).
A análise metagenômica ganhou bastante força com o advento das tecnologias de
sequenciamento de nova geração, que geram milhões de fragmentos de DNA de uma única
amostra de uma só vez (GRADA & WEINBRECHY, 2013).
O sequenciamento de ácidos nucleicos é um método que tem como objetivo
determinar a ordem exata dos nucleotídeos presentes em uma molécula de DNA ou RNA. O
sequenciamento de primeira geração foi desenvolvido por Edward Sanger, em 1975
(SANGER et al., 1977; GRADA & WEINBRECHY, 2013). O método de Sanger, como ficou
conhecido, foi a técnica “padrão-ouro” durante aproximadamente 30 anos após sua
publicação, em 1977.
O conceito químico do método permanece basicamente o mesmo até os dias de hoje,
com a vantagem de ter sido adaptado para sistemas automatizados de sequenciamento,
simplificando o processo de separação dos fragmentos e permitindo o aumento do tamanho
das leituras (MADABHUSHI, 1998). Os sequenciadores passaram a processar um número
33
maior de amostras, aumentando, assim, o rendimento e diminuindo os custos associados.
Atualmente, dispõe-se de equipamentos capazes de 96 a 384 sequenciamentos paralelos que
podem produzir leituras da ordem de 1000 bases (PETERSON et al., 2009).
O método de Sanger, apesar de sua robustez, possui algumas desvantagens, como a
necessidade da preparação de bibliotecas de clones, que é um processo caro e demorado.
Após o término do primeiro sequenciamento do genoma humano, que foi realizado através do
método em questão, foi crescendo cada vez mais a demanda por técnicas de sequenciamento
mais baratas e rápidas. Isso impulsionou o desenvolvimento de novas tecnologias de
sequenciamento, conhecidas como de “nova geração”, “próxima geração” ou “segunda
geração”, que realizam sequenciamento paralelo em massa (GRADA & WEINBRECHY,
2013).
Cada tecnologia de sequenciamento de nova geração utiliza uma estratégia diferente,
mas as etapas que constituem o processo são comuns a todos os sequenciadores, como o
preparo da amostra, a amplificação da biblioteca e o sequenciamento em si. A etapa inicial, de
preparação das amostras, consiste na geração de bibliotecas de fragmentos formadas pela
ligação de pequenas moléculas de DNA sintéticas, também chamadas de adaptadores, às
extremidades de cada fragmento de DNA da amostra a ser sequenciada. A amplificação das
bibliotecas geradas ocorre em suportes sólidos, como uma placa de vidro ou uma nanoesfera,
através de uma reação que envolve a atividade da enzima polimerase, gerando diversas cópias
das bibliotecas formadas. A fixação das moléculas de DNA a estes suportes ocorre graças aos
adaptadores. As reações de sequenciamento ocorrem como uma série de ciclos repetidos, de
nucleotídeo em nucleotídeo, e não através da separação e detecção distintas dos produtos já
sequenciados, como acontece no método de Sanger (RIBEIRO, 2012).
Os representantes dessas novas tecnologias que mais se sobressaíram foram a empresa
454 Life Sciences, e um pouco mais tarde, as empresas Solexa e Agencourt. Todas as
tecnologias das três empresas fundadoras foram, mais tarde, adquiridas por outras
corporações: a Agencourt passou a fazer parte da Applied Biosystems/Life Technologies; a 454
foi comprada pela Roche Applied Science e a Illumina adquiriu a Solexa (RIBEIRO, 2012).
A plataforma 454, primeira tecnologia de segunda geração a ser comercializada, utiliza
como método de amplificação a PCR em emulsão, em que os fragmentos de DNA são
imobilizados em beads e multiplicados por PCR.A técnica de sequenciamento empregada é o
pirosequenciamento, que se baseia na detecção da liberação de um grupamento pirofosfato a
cada incorporação de nucleotídeo (RONAGHI, 2001). Das tecnologias de sequenciamento de
segunda geração existentes, o pirosequenciamento em larga escala foi, por um bom tempo, a
34
plataforma de primeira escolha de grande parte dos pesquisadores, visto que gera sequências
longasquando comparadas com as demais plataformas.
Recentemente, as plataformasIlluminaMiSeq e HiSeqtêm se tornado mais atrativas
para estudos microbianos devido ao menor custo e a maior geração de sequências (MIZRAHI-
MAN, DAVENPORT & GILAD, 2013).
O sequenciamento na plataforma Illumina é realizado por síntese e utiliza DNA
polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. O preparo da
biblioteca envolve a ligação das moléculas de DNA a adaptadores em ambas as extremidades,
seguida de ligação a um suporte sólido, chamado flow cell, onde estão aderidos
oligonucleotídeos complementares aos adaptadores. A partir de então, realiza-se uma
amplificação em ponte que gera clusters de moléculas idênticas usadas como molde. Para
obter as sequências de ácidos nucléicos a partir das bibliotecas amplificadas, nucleotídeos
marcados com fluorescência são disponibilizados em ciclos, competindo entre si para se
ligarem ao alvo. Após cada ciclo de síntese, os fluorocromos são excitados por um laser, o
que permite a identificação da base adicionada. Em seguida, ocorre uma etapa de lavagem
para remoção dos reagentes excedentes, do grupo terminal bloqueador 3´ e do fluoróforo do
nucleotídeo incorporado no ciclo anterior para que a reação de sequenciamento prossiga. A
leitura das bases é feita através da análise em sequência das imagens capturadas em cada ciclo
de sequenciamento (GRADA & WEINBRECHT, 2013; CARVALHO & SILVA, 2010).
Váriosaspectos devem ser levados em consideração ao selecionar uma plataforma para
sequenciar ogene rDNA 16S. Em primeiro lugar, a qualidade das sequências, visto que
estudos baseados em dados não confiáveis são suspeitos (SCHLOSS, GEVERS,
WESTCOTT, 2011). Um segundo aspecto importante é o número de sequências geradas que
podem ser obtidas por corrida e o custo de cada uma. O terceiro aspecto é o tamanho das
sequências geradas, já que sequências mais longas são mais fáceis de serem classificadas
dentro de um grupo taxonômico (WANG et al., 2007, KOZICH et al., 2013).
Atualmente, a tecnologia Illumina é a que apresenta o melhor custo benefício, pois
gera uma maior quantidade de dados a um custo menor. O Hiseq é mais empregado em
análises metagenômicas do tipo shotgun, enquanto o Miseq possui maior potencial para
análises de sequências do gene rRNA 16S, pelo menor custo por corrida e por gerar
sequências maiores. O número de ciclos alcançados no Hiseq pode ser de até 300 e no MiSeq
até 500. Com relação ao throughput, com o Miseq é possível se obter 17 milhões de pares de
bases (KOZICH et al., 2013).
35
Até pouco tempo atrás, o problema mais significativo com as plataformas Illumina era
a habilidade em sequenciar amostras com baixa diversidade genética, o que é encontrado
comumente nos amplicons do gene rDNA 16S. Contudo, esse problema pode ser facilmente
solucionado aumentando artificialmente a diversidade genética através da mistura do DNA
com uma biblioteca do fago PhiX (KOZICH et al., 2013).
As aplicações do sequenciamento de nova geração parecem ser infinitas, permitindo
rápidos avanços em muitos campos do conhecimento. Contudo, diversas etapas de análise dos
dados gerados pelos sequenciadores são necessárias a fim de se concluir algo a partir do
estudo realizado.
Várias ferramentas podem ser utilizadas para a análise das sequências hipervariáveis
do rDNA 16S, como QIIME (CAPORASO et al., 2010), mothur (SCHLOSS et al., 2009),
SILVA ngs (QUAST et al., 2013), MEGAN (HUSON et al., 2007), dentre outras. Omothur
(criado a partir da combinação de softwares já existentes, como DOTUR, SONS e
TREECLIMBER) e o QIIME se destacam por funcionarem em múltiplos sistemas
operacionais (Mac OSX, Windows e Linux), por oferecerem tutoriais online que tornam seu
uso possível até mesmo por usuários sem expertise em bioinformática e por serem capazes de
realizar diversas etapas do processamento das sequências através da incorporação de outros
programas, como alinhamento, remoção de quimeras, classificação em OTUs, realização de
análises de diversidade alfa e beta, confecção de gráficos, muitas vezes eliminando a
necessidade de realizar buscas em bases externas ou empregar ferramentas adicionais
(OULAS et al., 2015). A escolha do algoritmo a ser empregado vai depender da preferência
do usuário.
36
2. JUSTIFICATIVA
Pacientes portadores de doença renal crônica em tratamento por hemodiálise são de
alto risco para o desenvolvimento de infecções por várias razões, que incluem o estado de
imunocomprometimento intrínseco à fase final da DRC, a alta prevalência de diabetes, a
hospitalização frequente e a exposição a outros pacientes durante as sessões de HD,
possibilitando a transmissão cruzada de agentes infecciosos. Além disso, a invasividade
requerida pelo processo de diálise, utilizando-se o acesso vascular por período prolongado e
expondo o sangue do paciente a grandes volumes de dialisato em um circuito extra-corpóreo
três vezes por semana aumenta ainda mais a vulnerabilidade em adquirir infecções.
Com o intuito de garantir a qualidade em relação ao aspecto microbiológico da água
para hemodiálise e dialisato, a RDC ANVISA nº 11 de 2014 utiliza os parâmetros contagem
de bactérias heterotróficas inferior a 100 UFC/mL, ausência de coliformes totais em 100 mL
de água e dosagem de endotoxinas inferior a 0,25 EU/mL como indicadores (ANVISA,
2014). Contudo, o atendimento a esses requisitos não garante a ausência de possíveis
patógenos ou micro-organismos originalmente sem importância médico-sanitária, mas que
podem ser patógenos oportunistas e letais a pacientes imunocomprometidos. Além disso,
reações imunes podem ser disparadas nos pacientes em resposta a outros componentes
bacterianos além das endotoxinas, como peptidoglicanos, glicoesfingolipídeos e fragmentos
de DNA, que podem elicitar reações imunes mais fortes ou mais fracas dependendo do gênero
ou espécie bacteriana de que se originam.
Dessa forma, considerando a relevância da água e do dialisato para pacientes em
tratamento dialítico, a análise das comunidades bacterianas de sistemas de água de
hemodiálise desde a água potável proveniente da rede de abastecimento, passando pela água
tratada até o dialisato se mostra importante para elucidar fontes de contaminação e os riscos
associados com a exposição dos pacientes. Diversos estudos já foram realizados com esse
objetivo em diferentes países (ARVANITIDOU et al., 2003; MONTANARI et al., 2009; OIE
et al., 2003; BORGES et al., 2007; GOMILA et al., 2006), mas a maioria empregou
metodologias baseadas em cultivo, que possuem algumas limitações, comotempo de
incubação,interferência de organismos antagonistas e baixa sensibilidade. Ademais, após
exposição prolongada à água, as bactérias podem entrar em um estágio viável, mas não
cultivável embora mantenham seu potencial infeccioso. Nesse contexto, os métodos
37
independentes de cultivo se destacam por ter um maior potencial em estimar a diversidade das
comunidades microbianas.
Nesse trabalho, amostras de água e dialisato provenientes de sistemas de água de
hemodiálise foram analisadas através de abordagem dependente e independente de cultivo e
examinadas com relação a parâmetros microbiológicos preconizados pela legislação vigente.
Os dados obtidos podem gerar conhecimento sobre micro-organismos presentes que não são
comumente encontrados pelos métodos dependentes de cultivo e trazer melhorias ao controle
de qualidade da água e dialisato, por exemplo através da sugestão de outros potenciais
bioindicadores.
38
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Verificar a presença e analisar as comunidades bacterianas nas águas e fluido de
hemodiálise em clínicas pertencentes ao Município do Rio de Janeiro conveniadas ao SUS,
utilizando uma metodologia dependente e outra independente de cultivo, a fim de avaliar a
eficácia dos tratamentos aos quais estas águas são submetidas e de obter conhecimento sobre
micro-organismos não previstos nas normas regulamentadoras vigentes.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar se as amostras coletadas atendem aos parâmetros microbiológicos de
verificação de presença/ausência de coliformes e Escherichia coli e contagem de bactérias
heterotróficaspreconizados pela RDC ANVISA Nº 11/2014;
Promover o isolamento e identificação das bactérias presentes nas amostras coletadas
através de metodologia dependente de cultivo;
Determinar a composição da comunidade bacteriana presente nas amostras coletadas
através de análise metagenômica utilizando a região V4 do rDNA 16S;
Analisar e comparar os resultados obtidos com as duas metodologias;
Avaliar os parâmetros atualmente utilizados para o controle microbiológico da água de
hemodiálise.
39
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos descritos neste trabalho foram realizados no Laboratório de
Biotecnologia – Diretoria de Metrologia Aplicada às Ciências da Vida (Dimav) – Instituto
Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Inmetro) e no Laboratório de Genoma do
Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomesna Universidade Estadual do Rio de Janeiro
(UERJ) em colaboração com o Professor Rodolpho Albano.
4.1 COLETA DAS AMOSTRAS
Para acessar as clínicas de hemodiálise, foi estabelecido um convênio com a
Vigilância Sanitária do Município do Rio de Janeiro, que realiza inspeções semanais nas
clínicas de hemodiálise vinculadas ao SUS,pertencentes ao município. Dessa forma, foi
possível acompanhar as inspeções e executar as coletas de amostras para o presente estudo.
As amostras foram coletadasem três pontos (denominados ponto 1, 2 e 3) dos sistemas
de purificação de água existentesnas quatroclínicas visitadas, denominadas A, B, C e D, por
questões de sigilo. O ponto 1 corresponde à água potável, fornecida pela rede pública de
abastecimento, antes de passar pelo sistema de tratamento da unidade. O ponto 2 corresponde
à água tratada para diálise, que é a água potável após passar pelos processos de filtração e
osmose reversa. O ponto 3 é o dialisato, coletado na máquina de hemodiálise, que consiste na
água tratada acrescida do CPHD (tabela 4 e figura 6).
Tabela 4. Pontos de coleta e identificação das amostras coletadas nas clínicas de hemodiálise visitadas.
Locais de coleta Clínica A Clínica B Clínica C Clínica D
Ponto 1 – Água potável
Torneira comum A1 B1 C1 D1
Ponto 2 – Água tratada para diálise
Torneira após osmose
reversa A2 B2 C2 D2
Ponto 3 – Dialisato
Máquina de hemodiálise A3 B3 C3 D3
Número total de amostras = 12
40
Foram coletados 10 litros de amostra nos pontos 1 e 2, em frascos de polipropileno
estéreis (Nalgene), sendo que para o ponto 1 o frasco continha 10 mL de solução de
tiossulfato de sódio (CinéticaProdutos Químicos) a 10%, a fim de neutralizar qualquer resíduo
de cloro existente. Os frascos utilizados para os pontos 2 e 3 não foram acrescidos de
tiossulfato de sódio pois o cloro é removido da água ao passar pelos filtros de carvão. Para o
ponto 3, foram coletados 500 mL em frascos de borosilicato previamente esterilizados. As
amostras de dialisato foram coletadas diretamente das máquinas durante a hemodiálise de um
paciente, interrompendo momentaneamente seu tratamento. Dessa forma, para que os
pacientes não tivessem seus tratamentos interrompidos por um período demasiadamente
longo, somente foi possível coletar amostras de 500 mL.
Todas as coletas foram realizadas após desinfecção das torneiras utilizando etanol
70% e depois de a água escorrer por 3 a 5 minutos, posicionando o frasco de forma que não
entrasse em contato com a torneira para evitar possíveis contaminações. Os frascos foram
imediatamente fechados e mantidos refrigerados a uma temperatura entre 2 e 8ºC em
recipiente térmico até o momento do processamento no laboratório, que ocorreu em até 8
horas após todas as coletas.A execução de todas as coletas foi supervisionada por um técnico
da Vigilância Sanitária do Município do Rio de Janeiro.
O processamento das amostras se deu de acordo com o fluxograma apresentado a
seguir (figura 8):
Figura 8. Fluxograma das análises realizadas com as amostras de água e dialisato coletadas.
Amostras de água e dialisato coletadas nas clínicas
Presença/ausência de
coliformes (item 4.2.1) e
contagem de bactérias
heterotróficas (item
4.2.2)
Extração de
DNA (item 4.3.3)
Identificação por
PCR 16S e
sequenciamento
(item 4.3.4)
PCR V4 rDNA 16S
(item 4.4.3)
Sequenciamento de
nova geração e análise
das sequências
geradas (itens 4.4.4 e
4.4.5)
Incubação e
isolamento em meios
de cultura (itens 4.3.1
e 4.3.2)
Filtração das amostras e
extração de DNA
genômico (itens 4.4.1 e
4.4.2)
41
4.2 AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS PRECONIZADOS
PELA RDC ANVISA Nº 11/2014
4.2.1 Verificação da presença/ausência de coliformes totais e Escherichia coli
A detecção de coliformes e E. coli se deu através do método normalizado do substrato
definido(Colilert®, IDEXX), publicado na seção 9223 doStandard Methods for Examination
of Water and Wastewater(APHA, 2012), seguindo as orientações do fabricante. Nesse
método, as bactérias coliformes produzem coloração amarela por meio da ação da sua
enzima -galactosidase sobre osubstrato ortonitrofenil- -D-galactopiranosídeo (ONPG),
enquanto a E. coli é definida como uma bactéria coliforme que apresenta fluorescência azul
sob luz ultravioleta (UV) devido à ação da sua enzima -glicuronidase sobre o substrato 4-
metilumbeliferil- -D-glicuronídeo (MUG) (IDEXX, 2008).
Para esse ensaio, foram utilizados 100 mL de cada amostra de água para cada ampola
do kit utilizada. O ensaio também foi realizado com suspensões de Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacter cloacea e Escherichia coli, que foram utilizadas como controle negativo,
controle positivo para coliformes totais e controle positivo para E. coli, respectivamente.
4.2.2 Contagem de bactérias heterotróficas
O procedimento foi realizado através do método do plaqueamento em superfície ou
spread plate utilizando dois meios diferentes, um rico em nutrientes, agar triptona de soja
(tsa) (himedia) e outro oligotrófico, reasoner´s 2a (r2a) (sigma-aldrich®). Um volume de 0,1
ml de cada amostra, em duplicata, foi semeado nos meios descritos acima. As amostras
plaqueadas no meio tsa foram incubadas a uma temperatura de35ºc por 48 horas enquanto as
que foram plaqueadas no meio r2a foram incubadas a 20ºc por 7 dias. Após esses períodos,
foi realizada a contagem das unidades formadoras de colônia (ufcs) em todas as placas e foi
calculada a média e o desvio padrão das duplicatas. O método spread plate, o uso do meio de
cultivo r2a e as respectivas condições de incubação para a contagem de bactérias
heterotróficas estão descritos no standard methods for the examination of water and
wastewater (apha, 2012). Já o uso do meio tsa e a incubação a 35ºc foram realizados de
acordo com os procedimentos descritos pela farmacopeia americana (usp 38- nf 33, 2016).
42
4.3 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA POR METODOLOGIA
DEPENDENTE DE CULTIVO
4.3.1 Filtração e concentração das amostras
Com o intuito de concentrar os micro-organismos cultiváveis presentes nas amostras,
2L de cada amostra coletada (no caso do ponto 3, 200mL) foram filtrados através de um filtro
de fluoreto de polivinidileno (PVDF) de 0,22 m (Millipore®SterivexTM
GV), utilizando um
sistema com uma bomba peristáltica (Millipore® - easy load)com fluxo de 100mL por
minuto, como pode ser visualizado na figura 9. Posteriormente, os cartuchos das unidades
filtrantes foram quebrados para que fosse possível o acesso à membrana. Em seguida, as
membranas foram retiradas com o auxílio de pinça previamente flambada e resfriadae
divididas em duas partes: uma parte foi inoculada em 100 mL de caldo TSB (Himedia) e a
outra metade, em 100 mL de caldo R2A (0,25 g/L de caseína ácida hidrolisada, 0,5 g/L de
glicose, 0,3 g/L de fosfato de dipotássio, 0,024 g/L de sulfato de magnésio, 0,5 g/L de
peptona, 0,3 g/L de piruvato de sódio, 0,5 g/L de amido solúvel, 0,5 g/L de extrato de
levedura e água q.s.p 1L). As membranas inoculadas no TSB foram incubadas a35ºC
enquanto as inoculadas em R2A, a 20ºC, ambas por 24 horas sob agitação a 150 rpm.
Figura 9. Filtração das amostras coletadas em frascos de polipropileno de 10 L através de filtro de PVDF de
0,22 m (Millipore®SterivexTM
GV) utilizando bomba peristáltica (Millipore®easy load).
4.3.2 Plaqueamento e isolamento
Após o período de incubação, foram realizadas diluições seriadas das culturas em água
destilada estéril até 10-3
e 0,1 mL de cada uma das diluições foram plaqueados em duplicata,
através da técnica spread plate. No caso das culturas que cresceram no caldo TSB, o
43
plaqueamento foi realizado no ágar TSA (Himedia), enquanto as que cresceram no caldo
R2A, no agar R2A (Sigma-Aldrich®).As placas de TSA foram incubadas a 35ºC por 24 - 48
horas e as de R2A a 20ºC por 5 - 7 dias. Após os respectivos períodos de incubação, as
colônias que cresceram foram diferenciadas morfologicamente, com base nos aspectos
visuais, como cor da colônia, diâmetro, borda, superfície (rugosa ou brilhosa) e outras
características especiais, como tendência a espalhar. Os morfotipos representantes foram
plaqueados nos mesmos meios em que foi observado seu crescimento, a fim de se obter uma
cultura pura.
Os isolados foram criopreservados em TSB com glicerol (Merck) a 20% e estocados à
-80ºC.
4.3.3 Extração de DNA
Os micro-organismos criopreservados foram crescidos em TSB ou caldo R2A,
dependendo do meio em que foram isolados, por 24 horas sob agitação e submetidos à
extração de DNA genômico através do kit comercial GenElute Bacterial Genomic DNA
(Sigma-Aldrich®),seguindo as recomendações do fabricante. Foi realizada eletroforese em
gel de agarose (Uniscience) 0,8% em TAE 1X (Tris Acetato EDTA) para observação do DNA
extraído.Foram aplicados 5 L de amostra, adicionados de 1 L de tampão de corrida (0,25%
de azul de bromofenol,0,25% de xileno cianol e 50% de glicerol) e 1 L do corante
GelRedTM
(Biotium). A corrida foi realizada a 80V por 30 minutos e as bandas foram
visualizadas em luz ultravioleta.Os DNAs obtidos foram analisados quanto à pureza e tiveram
suas concentrações determinadas pelo NanoDropTM
2000 (Thermo ScientificTM
).
4.3.4 Amplificação parcial do gene rRNA 16S
Os DNAs extraídos foram amplificados através de reação de PCR com os
oligonucleotídeos iniciadores para o gene rRNA 16S 27F e 907R descritos na tabela 5:
Tabela 5. Sequências dos primers utilizados para amplificação do gene rRNA 16S
Primers Sequência (5´> 3´) Referência
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG LANE et al., 1991
907R CCGTCAATTCMTTTRAGTTT WEISBURG et al., 1991
44
As amplificações foram realizadas no termocicladorThermal Cycler C1000 (Bio-Rad).
As reações foram feitas nas seguintescondições: aproximadamente 40ngDNA extraído, 1U de
Taq PCRx DNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific), 0,1 M dos primers 27F e
907R,2mM de MgCl2 (Thermo Fisher Scientific),0,1mM de cada DNTP (ThermoFisher
Scientific)e água Milli-Q autoclavada(q.s.p.25 L). O programa de PCR foi iniciado com
desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguidos de 34 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1
minuto a 55ºC e 1 minuto e 30 segundos a 72ºC. Após os ciclos, foi realizada uma extensão
final a 72ºC por 10 minutos. A fim de verificar se a reação ocorreu de forma eficiente, foi
realizada eletroforese em gel de agarose 2% em TAE 1X a 60V por 90 minutos. Foram
aplicados 5 L de amostra, adicionados de 1 L de tampão de corrida (0,25% de azul de
bromofenol,0,25% de xileno cianol e 50% de glicerol) e 1 L do corante
GelRedTM
(Biotium).Em seguida, o gel foi exposto à luz ultravioleta e fotodocumentado.
Os produtos de PCR foram encaminhados para a plataforma de sequenciamento do
Inmetro para serem sequenciados utilizando os mesmos primers.
As sequências Forward e Reverse obtidas de cada amostra foram alinhadas utilizando
a ferramentaClustalWno programa BioEdit v7.2.5(HALL, 1999)e as bases divergentes foram
corrigidas manualmente através de observação dos eletroferogramas no mesmo programa. Em
seguida, foram geradas as sequências consenso, que, após serem convertidas para o formato
FASTA, foram comparadas com as sequências depositadas no GenBank - National Center for
Biotechnology Information(NCBI), utilizando o algoritmo Nucleotide Basic Local Alignment
Search Tool(BLASTn), com o objetivo de identificar os micro-organismos isolados.
4.4 ANÁLISE METAGENÔMICA UTILIZANDO O GENE rDNA 16S
4.4.1 Filtração das amostras
Para as análises independentes de cultivo, foi realizada a filtração de 8L das amostras
coletadas (exceto no caso das amostras de dialisato, quando foramfiltrados aproximadamente
200mL)utilizando filtro de PVDF de 0,22 m (Sterivex GV Millipore®), através de um
sistema com bomba peristáltica conforme descrito no item 4.3.1. Os filtros foram mantidos a -
20ºC até o momento da extração.
45
4.4.2 Extração de DNA dos filtros
A lise celular foi realizada através de adição de 50 L de lisozima (10mg/mL) (Sigma-
Aldrich®, nº de catálogo 62970) ao filtro contendo 1,8 mL de SET Buffer (Sacarose, 50mM
ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), 50 mM Tris-HCl (pH 7,6). Os filtros foram
incubados a 37ºC (sob agitação) por 45 minutos. Em seguida, foram adicionados 50 L de
proteinase K (0,2 mg/mL) (Sigma-Aldrich®, nº de catálogo P2308) e 200 L de dodecil
sulfato de sódio (SDS) (Sigma-Aldrich®) a 10% e os filtros foram incubados a 55ºC por 1
hora. Os lisados foram retirados e os filtros foram rinsados com 1 mL de SET Buffer.
O DNA do lisado foi extraído duas vezes com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico
(25:24:1) e outra vez com clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Os ácidos nucleicos da fase
aquosa foram precipitados com 2 volumes de etanol absoluto e 3M de acetato de sódio, em
seguida centrifugados, lavados com 70% de etanol, secos e então ressuspensos em 50 L de
água Milli-Q estéril (SOMERVILLE et al., 1989).
O DNA extraído das amostras foi quantificado através do kit comercial Quant-iTTM
dsDNA HS Assay (ThermoFisher Scientific) no fluorímetroQubit® (ThermoFisher
Scientific)seguindo as recomendações do fabricante. O DNA foi mantido a -20ºC até a etapa
de amplificação.
4.4.3 Amplificação da região V4 do gene rDNA 16S
Para realizar o sequenciamento na plataforma MiSeq - Illumina, algumas abordagens
podem ser utilizadas. Nesse trabalho, foi utilizada a abordagem descrita por KOZICH et al.
(2013), em que são utilizados primers específicos para a região V4 do gene rDNA16S
(Integrated DNA Technologies - IDT) que consistem de uma sequência adaptadora para anelar
os amplicons à flowcell, uma sequência indexadora de 8 nucleotídeos, uma sequência
espaçadorade 10 nucleotídeos, uma sequência de ligação de 2 nucleotídeos e a sequência do
iniciador específico para a região do gene em questão, conforme pode ser visto na tabela 6.
46
Tabela 6. Estrutura dos primers utilizados para amplificar a região V4 do gene rDNA 16S (KOZICH et al.,
2013)
Sequência adaptadora –
forward
Index i5* Espaçador Ligação Sequência específica -
V4 FW
AATGATACGGCGACCAC
CGAGATCTACAC
XXXXX
XXX
TATGGTA
ATT
GT GTGCCAGCMGCCGC
GGTAA
Sequência adaptadora –
reverse
Index i7* Espaçador Ligação Sequência específica -
V4 RV
CAAGCAGAAGACGGCAT
ACGAGAT
XXXXX
XXX
AGTCAGT
CAG
CC GGACTACHVGGGT
WTCTAAT
* As sequências indexadoras, formadas por oito nucleotídeos que estão representados pela letra X, foram
combinadas de tal forma que cada amostra recebeu uma combinação de i5 + i7 diferente, para que as sequências
geradas para cada amostra pudessem ser rastreadas posteriormente. Os oito nucleotídeos que constituem as
sequências indexadoras para cada amostra estão descritos na tabela 7.
Além de cada amostra ter recebido uma combinação única de i5+i7, as sequências
indexadoras quando combinadas, deveriam excitar ambos os canais de laser a cada ciclo
(quando uma base A ou C é sequenciada, o canal de laser vermelho é excitado; quando uma
base G ou T é identificada, o canal de laser verde é excitado). Como as amostras desse
trabalho foram sequenciadas junto com mais 40 amostras provenientes de outros estudos, não
foi difícil combinar as sequências indexadoras de forma a excitar ambos os canais a cada
ciclo. As sequências indexadoras(index) utilizadas para as amostras coletadas para realização
desse trabalho estão esquematizadas na tabela 7 a seguir.
Tabela 7. Combinações das sequências indexadoras utilizadas para as amostras analisadas
Amostras Index i5 Index i7
Controle negativo (1) SA701 AACTCTCG SB501 CTACTATA
Controle negativo (2) SA701 AACTCTCG SB502 CGTTACTA
Controle negativo (3) SA701 AACTCTCG SB503 AGAGTCAC
Clínica A – ponto 1 (A1) SA701 AACTCTCG SB504 TACGAGAC
Clínica A – ponto 2 (A2) SA701 AACTCTCG SB505 ACGTCTCG
Clínica A – ponto 3 (A3) SA701 AACTCTCG SB506 TCGACGAG
Clínica B – ponto 1 (B1) SA701 AACTCTCG SB507 GATCGTGT
Clínica B – ponto 2 (B2) SA702 ACTATGTC SB501 CTACTATA
Clínica B – ponto 3 (B3) SA702 ACTATGTC SB502 CGTTACTA
Clínica C – ponto 1 (C1) SA702 ACTATGTC SB503 AGAGTCAC
47
Clínica C – ponto 2 (C2) SA702 ACTATGTC SB504 TACGAGAC
Clínica C – ponto 3 (C3) SA702 ACTATGTC SB505 ACGTCTCG
Clínica D – ponto 1 (D1) SA702 ACTATGTC SB506 TCGACGAG
Clínica D – ponto 2 (D2) SA702 ACTATGTC SB507 GATCGTGT
Clínica D – ponto 3 (D3) SA703 AGTAGCGT SB501 CTACTATA
Dessa forma, o tamanho total dos primers ficou entre 63 e 68 pb. A amplificação das
amostras foi realizada no equipamento termociclador Thermal Cycler 1000 (Biorad), nas
seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, 40 ciclos de 45 segundos a
94ºC, 1 minuto a 50ºC e 1 minuto e 90 segundos a 72ºC. Após os ciclos, foi realizada uma
extensão final a 72ºC por 10 minutos. A mistura reacional com volume final de 25 L
continha 200 nM de cada primer, 18 L de AccuPrime Pfx Supermix(ThermoFisher
Scientific) e um volume de 6 L de cada amostra.
Para visualização dos produtos amplificados, alíquotas de 3 L dos produtos da reação
somados com 1 L de tampão de corrida (mesmo descrito no item 4.3.3) e 1 L do GelRedTM
(Biotium) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose (Uniscience) a 2% em TAE 1X
a 60V por 90 minutos.Foi adicionado à corrida eletroforética o padrão de peso molecular
100bp molecular ruler (Bio-Rad). Controles negativos também foram aplicados no gel a fim
de confirmar ausência de contaminação proveniente do protocolo de extração ou dos
reagentes empregados.
Foram realizadas três reações de amplificação semelhantes e os seus produtos foram
agrupados em pools para cada amostra.
Os pools dos produtos amplificados foram purificados pelo kit comercial de
purificação de amplicons Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter®) conforme as
recomendações do fabricante. Com o intuito de verificar a eficiência da purificação e se houve
perda de amostra, os amplicons purificados foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose (Uniscience) a 2% nas mesmas condições da anterior.
As amostras foram quantificadas através do kit comercial Quant-iTTM
dsDNA HS Assay
Kit (ThermoFisher Scientific)no Qubit®(ThermoFisher Scientific)seguindo as recomendações
do fabricante. Algumas amostras foram diluídas de modo que todas atingissem concentrações
equimolares de 2nM. A seguir, os pools de amplicons com concentrações equimolares foram
unificados e o DNA contido no pool resultante foi quantificado pelo mesmo método
fluorimétrico descrito acima.
48
4.4.4 Sequenciamento utilizando a plataforma MiSeq- Illumina
O preparo da amostra para a reação de sequenciamento, assim como a reação em si, foi
realizado no Laboratório de Genoma do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes –
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), com a colaboração do professor Rodolpho
Albano.
Antes das bibliotecas serem encaminhadas aoMiSeq, elas passaram por uma etapa de
desnaturação com NaOH e foram combinadas com 5% de uma biblioteca genômica do fago
PhiX 174. A biblioteca do vírus PhiX é sempre utilizada nos seqüenciamentos realizados nos
equipamentos da Illumina como um padrão interno de qualidade e para aumentar a
diversidade genética de amostras pouco diversas como, por exemplo, amplicons gerados a
partir de genes marcadores como o rDNA 16S. Assim, foram transferidos 5 L da biblioteca a
2 nM para um microtubo de 1,5 mL e adicionados 5 L de 0,2 N NaOH. A outro microtubo
semelhante, foram adicionados 2 L da biblioteca de DNA genômico do fago PhiX a 20 nM,
3 mL de água Milli-Q e 5 mL de 0,2N NaOH. Os tubos foram vortexados, centrifugados por 1
minuto a 400 x g e incubados por 5 minutos a temperatura ambiente.
Tanto a biblioteca quanto o PhiX foram diluídos com HT1 (tampão de hibridização)
de modo que a biblioteca chegasse à concentração final de 10 pM e o PhiX à concentração de
12 pM. Foram então combinados570 L da solução de 10 pM da biblioteca e 30 L do PhiX
em um novo tubo e vortexados. Estes 600 L foram utilizados para o sequenciamento no
MiSeq(KOZICH et al., 2013).
4.4.5 Análise das sequências geradas utilizando ferramentas de bioinformática
As sequências geradas pelo Illumina foram analisadas utilizando o software mothur
v.1.36.1 seguindo as etapas descritas no MiSeqSOP
(http://www.mothur.org/wiki/Miseq_SOP) (KOZICH et al., 2013) com algumas
modificações.
O primeiro passo foi a montagem dos contigs a partir das sequências forward e
reverseem formato FastQgeradas pelo Illumina. Os contigs maiores que 275 pb e/ou que
continham bases ambíguas (ex. “N”) foram removidos. Em seguida, as sequências idênticas
foram agrupadas e posteriormente alinhadas contra o banco de dados de genes rDNA 16S
SILVA (QUAST et al., 2013). Os artefatos quiméricos, produtos de PCR originados durante a
49
amplificação por mais de uma fita de DNA molde, foram detectados e removidos através da
ferramenta UCHIME (EDGAR et al., 2011) ainda dentro do software mothur. As sequências
foram classificadas em diferentes níveis taxonômicos através do método Baiesiano utilizado
pelo mothur contra o RDP 16S rRNAgene Training set (version 9) (COLE et al., 2007;
WANG et al., 2007).
Tanto as sequências que não puderam ser classificadas a nível de reino quanto as
classificadas como Archaea, Eukaryota, cloroplastos ou mitocôndrias foram removidas. As
sequências foram agrupadas em OTUs, considerando uma dissimilaridade de 3%, que
corresponde ao nível taxonômico de espécie. Posteriormente, o número de sequências foi
normalizado para 6.855, que foi o menor número de sequências encontrado dentro das
amostras que apresentaram amplificação, através do comando sub.sample no mothur, para
realizar as análises de diversidade alfa e beta.
Foram construídas curvas de rarefação para as amostras considerando a distância
genética de 3 e 5%. A análise da diversidade das amostras foi calculada pelos índices de
Shannon e invSimpson (recíproca de Simpson). Foram também calculados os índices de Ace
e Chao1, que estimam a riqueza das amostras. Também foram construídos diagramas de Venn
que permitiram melhor visualização da quantidade de OTUs exclusivas e compartilhadas
entre os pontos das clínicas analisadas.
Para que os dados taxonômicos das amostras gerados pelo programa mothur pudessem
ser visualizados em outros programas, os dados foram convertidos para o formato Biological
Observation Matrix (Biom). Este arquivo foi aberto no programa MEGAN 5 (HUSON et al.,
2007), onde foram construídos gráficos de distribuição taxonômica aos níveis de filo e gênero.
4.4.6 Controle de qualidade das análises realizadas
4.4.6.1 Análise das comunidades bacterianas por metodologia dependente de cultivo
A fim de assegurar a confiabilidade das análises microbiológicas, todos os meios de
culturarecém preparados foram submetidos à incubação a 37+/- 1°C e a 26 +/- 1°C por sete
dias. Somente foram utilizados os meios que não apresentaram crescimento microbiano após
o período de incubação.
Ademais, como controle de que as cabines de segurança biológica forneciam um
ambiente livre de contaminação bacteriana durante a manipulação das amostras, uma placa de
petri contendo meio de cultivo TSA foi mantida aberta em todos os procedimentos realizados
50
dentro das cabines. Não foi observado crescimento bacteriano em nenhuma das placas
analisadas.
4.4.6.2 Análise das comunidades bacterianas por abordagem metagenômica utilizando
o gene rDNA 16S
Para essa análise, foram utilizados 3 controles negativos: (i) da reação de PCR; (ii) do
processo de extração de DNAe (iii) do processo de concentração das amostras no Vacufuge. O
primeiro controle foi obtido a partir da reação de PCR de uma amostra contendo apenas a
mistura de reagentes da reação, sem nenhuma amostra. O segundo controle foi obtido através
da filtração de uma amostra de água Milli-Q previamente autoclavada através de um filtro de
fluoreto de PVDF de 0,22 m (Millipore®SterivexTM
GV), seguida da extração de DNA
diretamente do filtro, conforme procedimento descrito nos itens 4.4.1 e 4.4.2. O terceiro
controle foi realizado submetendo-se microtubos contendo apenas água Milli-Q previamente
autoclavada ao processo de concentração no Vacufuge, com o objetivo de assegurar que essa
etapa não introduziu contaminação bacteriana. Todos os controles foram amplificados e
sequenciados conforme os procedimentos descritos nos itens 4.4.3 e 4.4.4 seguidos da análise
das sequências no mothur, conforme item 4.4.5.
51
5. RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS PRECONIZADOS
PELA RDC ANVISA Nº 11/2014
5.1.1 Verificação da presença/ausência de coliformes totais e E. coli
A análise de presença/ausência de coliformes e E. coli em 100 mL de amostra é
preconizada pela Portaria MS Nº 2914 de 2011 para a água potável, assim como pela RDC
ANVISA Nº 11 de 2014 para água tratada para hemodiálise (BRASIL, 2011; ANVISA,
2014). Decorridas 24 horas de incubação, nenhuma das amostras analisadas pelo método do
substrato definido apresentou coloração amarela ou fluorescência, quando observadas sob luz
ultravioleta. Isso indica ausência tanto de bactérias pertencentes ao grupo dos coliformes
totais quanto de bactérias da espécie E. coli.
A figura 10 mostra o resultado da ausência de coliformes na clínica A. Acoloração
amarela só foi observada nas amostras incubadas com suspensões de Enterobacter cloacea e
Escherichia coli, usadas como controles positivos de coliformes totais e E. coli,
respectivamente (figura 10 – A). A observação de fluorescência somente foi possível no
frasco que continha suspensão de E. coli (figura 10-B). Esse resultado também foi observado
nas demais clínicas visitadas.
Figura 10. Verificação da presença/ausência de coliformes totais e E. colinas amostras da clínica A. No método
do substrato definido empregado, a presença de coliformes totais torna a solução amarela (A)enquanto a
presença de E. coli é evidenciada pelo aparecimento de fluorescência quando é incidida luz ultravioleta (B). Em
(A): (1) Ponto 1; (2) Ponto 2; (3) Pseudomonas aeruginosa(controle negativo para ambos os parâmetros); (4)
Enterobacter cloacea(controle positivo para coliformes totais); (5) Escherichia coli(controle positivo para E.
coli). Em (B): (1) Ponto I; (2) Ponto II; (3) Escherichia coli.
1 2 3
1 2 3 4 5
(B)
(A)
52
5.1.2 Contagem de bactérias heterotróficas
A RDC ANVISA Nº11/2014 preconiza que as amostras de água potável devem
atender o disposto na Portaria MS Nº 2914/2011, que limita a contagem de bactérias
heterotróficas em 500 UFC/mL (BRASIL, 2011). Jáas amostras de água tratada para diálise
devem apresentar contagem de bactérias heterotróficas inferior a 100 UFC/mL e as de
dialisato, inferior a 200 UFC/mL (ANVISA, 2014). Para avaliar esse parâmetro, as amostras
foram semeadas através da técnica de spread plate nos meios de cultura TSA e R2A,
conforme os procedimentos descritos pela farmacopéia americana (USP 38 – NF 33, 2016) e
pelo Standard Methods for the examination of water and wastewater (APHA, 2012).
Nas amostras provenientes do ponto 1 de todas as clínicas analisadas, que corresponde
à água potável proveniente da rede de abastecimento, não foi observado crescimento de
nenhuma UFC em nenhum dos dois meios de cultura empregados. Portanto, todas as amostras
de água potável (100%) mostraram conformidadecom relação à legislação vigente,
apresentando contagem inferior a 500 UFC/mL.
No ponto 2, a clínica A apresentou contagem média de 80 UFC/mL no meio de cultura
R2A e não foi observado crescimento quando essa mesma amostra foi plaqueada no meio
TSA. Ainda a respeito desse ponto de coleta, foi observada uma contagem média de 90
UFC/mL quando a amostra coletada na Clínica C foi incubada no meio TSA e, da mesma
forma, não foi observado crescimento no meio R2A. As amostras das clínicas B e D
correspondentes ao ponto 2 (C2 e D2) não apresentaram crescimento em nenhum dos meios
de cultivo empregados. Dessa forma, todas as amostras (100%) foram consideradas
satisfatórias, atendendo às exigências da RDC ANVISA Nº 11 DE 2014 (ANVISA, 2014).
Nas amostras de dialisato (ponto 3), foi observado crescimento de 10 UFC/mL na
clínica A, quando foi utilizado o meio TSA e nenhum crescimento quando foi empregado o
meio R2A. Na clínica D, as médias dos valores encontrados, 1840 e 2480, observados nos
meios TSA e R2A, respectivamente, foram bastante elevadas, ultrapassando o limite de 200
UFC/mL, preconizado pela legislação vigente para o dialisato.Dessa forma, verificou-se que
75% (3/4) do total das amostras de dialisato das quatro clínicas atenderam aos limites
determinados pela legislação brasileira. Considerando o total de amostras analisadas, o
percentual foi de 91,7% de conformidade com a legislação (tabela 8).
53
Tabela 8. Contagem de bactérias heterotróficas (UFC/mL) nas amostras coletadas dos pontos 1, 2 e 3 das
clínicas A, B, C e D
Pontos Ponto 1
(UFC/mL ± DP)
Ponto 2
(UFC/mL ± DP)
Ponto 3
(UFC/mL ± DP)
Clínicas
TSA
48h/30-
35ºC
R2A
7 dias/20ºC
TSA
48h/30-
35ºC
R2A
7 dias/20ºC
TSA
48h/30-35ºC
R2A
7 dias/20ºC
A <10 <10 <10 80± 14 10± 0 <10
B <10 <10 <10 <10 <10 <10
C <10 <10 90± 0 <10 <10 <10
D <10 <10 <10 <10 1840± 127 2480± 162
* DP – Desvio padrão das duplicatas.
** <10 – Placas em que não foi observado crescimento de colônias (APHA, 2012).
Além dos valores de bactérias heterotróficas máximos de 100 UFC/mL e 200 UFC/mL
para a água tratada para diálise e o dialisato, respectivamente, a RDC ANVISA nº 11/2014
também determina um nível de ação de 50 UFC/mL. Dessa forma, as amostras A2 e C2
atingiram o nível de ação, pelo menos em um dos meios de cultura empregados. Quando isso
ocorre, se faz necessária a adoção de providências para identificação do foco de contaminação
e intervenção preventiva a fim de eliminá-lo e impedir que haja aumento da contaminação e
posterior não conformidade com a legislação, apresentando maiores riscos à saúde dos
pacientes.
5.2 ANÁLISE DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ATRAVÉS DE
METODOLOGIA DEPENDENTE DE CULTIVO
5.2.1 Identificação das bactérias isoladas das amostras de água e dialisato dos sistemas
de hemodiálise
A partir das amostras de água e dialisato concentradas por filtração, inoculadas nos
caldos R2A e TSB e posteriormente semeadas em placas de petri contendo a versão sólida dos
mesmos meios, as colônias obtidas foram analisadas morfologicamente e os morfotipos
representantes resultaram em 32 isolados nos pontos de coleta analisados, sendo 9
provenientes da clínica A (ponto 1=1, ponto 2=7 e ponto 3=1), 2 da clínica B (ponto 1=1 e
54
ponto 2=1), 8 da clínica C (ponto 1=1, ponto 2=4 e ponto 3=3) e 12 da clínica D (ponto 1=1,
ponto 1=2 e ponto 3=9). Dos 32 isolados, 28 (87,5%) puderam ser identificados até o nível de
gênero e 12 (37,5%) até o nível de espécie, através do sequenciamento parcial do gene que
codifica o rRNA 16S. A figura 11 mostra alguns isolados da Clínica D.
Figura 11. Aspectos de diferentes isolados provenientes da Clínica D nos meios de cultivo TSA e R2A.
Na Clínica A, foram encontrados diferentes micro-organismos ao longo do sistema de
água de hemodiálise. No ponto 1, o único isolado obtido foi classificado como Bacillus sp. No
segundo ponto, foram isolados Herbaspirillum frisingense, Cupriavidus sp e Micrococcussp
e, por último, na amostra de dialisato somente foi possível o isolamento da espécie
Staphylococcus epidermidis, não havendo isolados compartilhados entre os diferentes pontos
de coleta.
Na Clínica B, bactérias foram isoladas somente nos pontos 1 e 2. No ponto 1, foi
encontrado o gênero Pseudomonas e no ponto 2, um isolado pertencente à família
Burkholderiaceae, que não pôde ser identificado a nível de gênero ou espécie.
A clínica C apresentou a espécie Streptococcus salivarius no ponto 1. No ponto 2,
Bacillus sp e Ralstonia sp enquanto no ponto 3, foram identificados isolados pertencentes à
espécie Halomonasmeridiana, Halomonas sp e Burkholderia sp.
Na Clínica D, o ponto 1 apresentou a espécie Bacillus subtilis, cujo gênero também foi
observado no ponto 1 da Clínica A. No ponto 2, os gêneros Rhizobium e Burkholderia foram
encontrados, mostrando mais uma semelhança com outra clínica, a B, na qual também foi
encontrado um membro da família Burkholderiaceae nas amostras de água tratada. No
dialisato da Clínica D foram observados Pseudomonas stutzeri, Microbacterium sp e
55
Rhizobiumsp, este último também presente na água para diálise desta mesma clínica (tabela
9).
Tabela 9. Identificação por sequenciamento parcial do gene rDNA 16S das bactérias isoladas por metodologia
de cultivo
Isolados Clínica
Ponto
de
coleta
Meio de
cultura de
isolamento
Sequenciamento rDNA 16S (%identidade)
A1-1 A 1 TSA Bacillus sp (99%)
A2-1 A 2 TSA Herbaspirillum frisingense (98%)
A2-2 A 2 TSA Cupriavidus sp (99%)
A2-3 A 2 R2A *
A2-4 A 2 R2A Micrococcus(98%)
A2-5 A 2 R2A Herbaspirillum frisingense (99%)
A2-6 A 2 R2A Herbaspirillum frisingense (99%)
A2-7 A 2 R2A Herbaspirillum frisingense (99%)
A3-1 A 3 TSA Staphylococcus epidermidis (99%)
B1-1 B 1 TSA Pseudomonas sp (96%)
B2-1 B 2 TSA ** Família Burkholderiaceae
C1-1 C 1 TSA Streptococcus salivarius (96%)
C1-2 C 1 R2A Caulobacter vibrioides (90%)
C2-1 C 2 R2A Bacillus sp (86%)
C2-2 C 2 R2A Ralstonia sp (97%)
C2-3 C 2 R2A Ralstonia sp (96%)
C2-4 C 2 R2A Ralstonia sp (91%)
C3-1 C 3 TSA Halomonas meridiana (97%)
C3-2 C 3 TSA Halomonas sp (97%)
C3-3 C 3 R2A Burkholderia sp (96%)
D1-1 D 1 R2A Bacillus subtilis (97%)
D2-1 D 2 TSA Burkholderia sp (93%)
D2-2 D 2 R2A Rhizobium sp (95%)
D3-1 D 3 TSA Pseudomonas stutzeri (96%)
D3-2 D 3 TSA Pseudomonas stutzeri (96%)
D3-3 D 3 TSA Microbacterium sp (97%)
D3-4 D 3 TSA *
56
D3-5 D 3 TSA Microbacterium sp (99%)
D3-6 D 3 R2A Pseudomonas stutzeri (97%)
D3-7 D 3 R2A Microbacterium sp (94%)
D3-8 D 3 R2A Rhizobium sp (96%)
D3-9 D 3 R2A Microbacterium sp (97%)
* Organismo não identificado
** Organismo identificado até o nível taxonômico de família
Assim, os gêneros mais encontrados pelos diferentes pontos de coleta foram: Bacillus
(A1, C2 e D1), Pseudomonas (B1 e D3), Burkholderia (C3 e D2) e Rhizobium (D2 e D3).
Dois isolados, A2-3 e D3-4, não puderam ser identificados pelo sequenciamento
parcial do rDNA 16S, pois não foram encontrados micro-organismos com alto percentual de
identidade quando suas sequências foram comparadas com as contidas no GenBank (figura
12). O isolado B2-1 também não pôde ser identificado a nível de gênero, mas foi possível
atribuí-lo à família Burkholderiaceae.
Figura 12. Comparação das sequências FASTA de parte do gene rDNA 16S amplificada pelos primers 27F e
907R (A) do isolado A2-3 e (B) D3-4 com as sequências depositadas no GenBank.
57
5.3 ANÁLISE DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ATRAVÉS DE
METODOLOGIA INDEPENDENTE DE CULTIVO
5.3.1 Extração de DNA
Os DNAs extraídos diretamente dos filtros de PVDF de 0,22 m se mostraram
límpidos.Foi feita a quantificação de DNA nessas amostras com o objetivo de verificar a
eficiência da extração. Foi observada uma baixa concentração de DNA em todas as amostras,
sendo a D3 a que apresentou a maior concentração (4,17 ng/ L) (tabela 10).
Tabela 10. Quantificação do DNA extraído das amostras coletadas nas clínicas A, B, C e D e concentradas em
filtro de 0,22 m (Sterivex GV Millipore®) utilizando o kit Quant-iTTM
dsDNA HS Assay Kit no fluorímetro
Qubit®
Amostras Concentração de DNA
Controle negativo (Água Milli-Q estéril) < 0,5ng/mL**
A1 0,148 ng/ L (2,80 x 10-3
)*
A2 < 0,5ng/mL**
A3 < 0,5ng/mL**
B1 0,319 ng/ L (4,20 x 10-3
)*
B2 < 0,5ng/mL**
B3 < 0,5ng/mL**
C1 0,243 ng/ L (1,40 x 10-3
)*
C2 0,285 ng/ L (0)
C3 0,154 ng/ L (2,80 x 10-3
)*
D1 0,258 ng/ L (1,10 x 10-3
)*
D2 < 0,5ng/mL**
D3 4,17 ng/ L (0)
* Os valores apresentados constituem a média de 2 medições e o valor entre parênteses o desvio padrão.
** A quantificação do DNA presente em concentrações muito baixas (inferiores a 0,5 ng/mL) não foi possível
devido ao limite de quantificação do método utilizado, não sendo possível, dessa forma, o cálculo da média e
desvio padrão entre as medições.
5.3.2 Amplificação da região V4 do gene rDNA 16S
Os DNAs extraídos foram submetidos à reação de PCR com osprimers específicos
descritos no item 4.4.3visando à obtenção de fragmentos já contendo as sequências
58
adaptadoras, para o sequenciamento no Illumina. Como as concentrações de DNA obtidas
foram baixas, três estratégias foram utilizadas com o intuito de aumentar as chances de
amplificação pela reação de PCR: (i) as amostras foram concentradas através do Vacufuge
(Eppendorf) por 30 minutos, (ii) o número de ciclos da reação de PCR foi alterado de 35
(CAPORASO et al., 2011) para 40 e (iii) o volume de DNA moldeutilizado na reaçãofoi
alterado de 2 L para 6 L. Com essas alterações, algumas amostras que não haviam
mostrado amplificação, foram amplificadas, gerando um fragmento de aproximadamente
400pb. Entretanto, mesmo após as modificações descritas, as amostras A1, A3, B1, B2, C1,
C2 e D1não puderam ser amplificadas por não terem quantidade de DNA suficiente. A figura
13 mostra os produtos das três reações de PCR que foram agrupados em pools, antes (13-A) e
depois do processo de purificação (13-B), respectivamente. Conforme pode ser observado,
todas as bandas de restos e dímeros de primersforam removidas após o processo de
purificação.
Figura 13. Géis de agarose a 2% em TAE após eletroforese (60V/90min) dos pools dos produtos de 3 reações de
PCR, antes da purificação (A) e após (B). A numeração das amostras corresponde a: 1= controle negativo da
reação de PCR; 2= controle negativo da extração de DNA; 3= controle negativo do processo de concentração das
amostras no Vacufuge; 4= A1; 5= A2; 6= A3; 7= B1; 8= B2; 9= B3; 10= C1; 11= C2; 12= C3; 13= D1; 14= D2;
15= D3.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
400 pb
100 pb
400 pb
100 pb
(A
)
(B
)
59
5.3.3 Análises de diversidade, riqueza e rarefação baseadas em OTUs
Após corrida no MiSeq - Illumina,filtração por tamanho (até 275 pb) e qualidade dos
contigsforam geradas 136.052 sequências válidas, sendo observada bastante variação no
número de sequências obtidas em cada amostra (A1=38, A2=17.879, A3=6.855, B1=26,
B2=41, B3=18.550, C1=25, C2=12, C3=38.027, D1=21, D2=22.295, D3=26.995). Devido a
essa grande oscilação no número de sequências obtidas, as amostras A1, B1, B2, C1, C2 e D1
foram excluídas das análises subsequentes, por terem gerado um número muito baixo de
sequências, que foram interpretadas como ruído.
As sequências foram agrupadas em 1.161 OTUs, considerando uma similaridade de
97%,sendo: A2 (n=337), A3 (n=257), B3 (n=224), C3 (n=152), D2 (n=286) e D3 (n=134).
Previamente à construção das curvas de rarefação, recorreu-se ao comando sub.sample
no mothur, que selecionou de forma randomizada 6.855sequências (menor número de
sequências encontrado dentro das amostras que permaneceram sendo estudadas). As curvas de
rarefação (figura 14-A e B) obtidas plotando-se o número de OTUs observadas em relação ao
número de sequências mostraram perfis parecidos nas amostras agrupadas a 97% (espécie) e
95% (gênero) de similaridade, sendo observada uma maior tendência de estabilidade nesta
última. O perfil das curvas de rarefação sugere que a diversidade foi amostrada de modo
satisfatório como um todo. As curvas de rarefação indicam que as amostras C3 e D3, ambas
provenientes de dialisato apresentaram menor diversidade que as outras, mostrando maior
tendência a atingir um platô. Por outro lado, as amostras A2 e A3, ambas provenientes da
mesma clínica, apresentaram uma maior diversidade quando comparadas com as demais
amostras analisadas.
60
Figura 14. Curvas de rarefação indicando o número estimado de OTUs em relação ao número de sequências
analisadas construídas no mothur(A) considerando uma distância genética de 3% e (B) uma distância genética de
5%.
Foram calculados os índices estimadores de riqueza ACE e Chao1 e de diversidade
Shannon e Inverse Simpson (Recíproca de Simpson) assim como os valores de cobertura
alcançados para cada amostra. Os resultados mostram que o número de sequências analisadas
permitiu atingir uma cobertura satisfatória das OTUs presentes em todas amostras, visto que
os valores de cobertura observados foram superiores a 98% para todas.
(A)
(B)
61
Analisando as estimativas de riqueza calculadas pelos índices ACE e Chao1,
considerando o intervalo de confiança a 95% de probabilidade, observou-se pouca diferença
entre as amostras analisadas. Os valores obtidos por ambos os métodos não paramétricos
sugerem uma maior riqueza nas amostras coletadas na clínica A (A2 e A3), não sendo
observada diferença significativa entre os dois pontos. Os valores obtidos revelaram ainda
que, de um modo geral, as amostras C3 e D3 apresentaram uma riqueza inferior ao restante
das amostras.
Os resultados demonstraram que para as amostras A3 e B3 a diversidade foi maior que
a observada nas demais amostras, de acordo com os índices de Shannon e recíproca de
Simpson, que apresentaram a mesma tendência. Além disso, os valores obtidos com esses
estimadores também revelaram menor diversidade de OTUs nas amostras C3 e D3, assim
como havia sido observado em relação à riqueza, conforme pode ser verificado na tabela 11 a
seguir.
62
Tabela 11. Número de OTUs, cobertura, índices de riqueza (Ace e Chao1) e diversidade (Shannon e Recíproca de Simpson) calculados pelo software mothur v. 1.36.1 das
amostras que apresentaram número de sequências igual ousuperior a 6.855 utilizando um cutoff de 97%.
Amostras Nº de OTUs
observadas
Cobertura Riqueza Diversidade
ACE Chao1 Recíproca de Simpson Shannon
A2 207,461±7,414 0,985±0,001 564,975 ±79,460
(487,067-664,731)
429,329 ± 62,071
(334,682-594,566)
6,076 ± 0,102 (5,829-
6,343)
2,657 ± 0,018
(2,614-2,700)
A3 257 ± 0 0,985 ± 0 469,868 ± 0 (418,318-
537,893)
396,216 ± 0 (339,721-
491,295)
8,653 ± 0 (8,252-
9,095)
3,181 ± 0
(3,136-3,226)
B3 152,141± 5,493 0,992 ± 0,001 294,677±45,199
(252,227-355,441)
263,028 ± 43,868
(204,192-388,686)
17,444 ± 0,220
(16,918-18,003)
3,381 ±0,014
(3,349-3,414)
C3 70,133 ± 4,574 0,996 ± 0,001 216,555 ± 71,652
(166,940-292,717)
131,124 ± 35,336
(93,431-230,423)
4,810 ± 0,072 (4,663-
4,966)
2,109 ±0,016
(2,076-2,143)
D2 163,847 ± 6,492 0,988 ± 0,001 399,071 ± 71,221
(338,254-481,583)
303,324 ± 43,216
(239,330-421,713)
6,958 ± 0,098 (6,739-
7,192)
2,576 ± 0,017
(2,538-2,615)
D3 67,192 ± 4,565 0,995 ± 0,001 193,029 ± 57,612
(149,110-261,713)
134,567 ± 35,992
(93,519-240,128)
1,767 ± 0,019 (1,724-
1,812)
1,113 ± 0,017
(1,075-1,150)
Valores entre parênteses representam o intervalo com 95% de confiança.
63
5.3.4 Estrutura e composição taxonômica das comunidades bacterianas encontradas nas
amostras analisadas
As interseções das OTUs agrupadas a 97% de similaridadeobservadas entre as
amostras de dialisato das quatro clínicas analisadas (amostras A3, B3, C3 e D3) assim como
as OTUs compartilhadas entre as amostras de água tratada e dialisato das clínicas A e D –
únicas que apresentaram mais de um ponto passível de estudo – foram verificadas por meio
dos diagramas de Venn gerados pelo mothur (figura 15).A partir desses dados, observou-se
que mais de 70% das OTUs observadas na amostra A3 não foram compartilhadas com as
outras clínicas, assim como aproximadamente 56% das OTUs da amostra B3, 45% da amostra
C3 e em torno de 65% das OTUs encontradas na amostra D3 não foram comuns a outras
clínicas, mostrando uma grande variedade bacteriana entre diferentes clínicas. Foram
compartilhadas 9 OTUs entre as 4 amostras de dialisato comparadas, que representam 1,98%
do número total de OTUs que foram obtidas. As OTUs compartilhadas correspondem aos
seguintes gêneros: Pseudomonas (2 OTUs), Sphingomonas (1 OTU), Paracoccus (1 OTU) e
Burkholderia (1 OTU). As outras 4 OTUs foram identificadas como unclassified, sendo
possível apenas chegar à conclusão de que 3 correspondiam ao filo Proteobacteria e 1, ao
Firmicutes. Dos gêneros observados, Burkholderia e Pseudomonas também haviam sido
identificados pela abordagem dependente de cultivo nas amostras de dialisato das clínicas C e
D, respectivamente. No diagrama de Venn entre as duas amostras da clínica A, foi observado
compartilhamento de 68 OTUso que representa 17% do total de OTUs observadas nos dois
pontos examinados. A outra análise comparativa entre água tratada para diálise e dialisato, na
clínica D, resultou no compartilhamento de 21 OTUs (8,5%). Através dessa análise foi
possível observar também uma diferença considerável entre as comunidades bacterianas
presentes na água tratada para hemodiálise e no dialisato de uma mesma clínica, corroborando
os resultados obtidos nos ensaios dependentes de cultivo.
64
Figura 15. Diagramas de Venn gerados pelo mothur com OTUs agrupadas a 97% de similaridade mostrando o
compartilhamento destas para as comunidades bacterianas entre as amostras (A) A3, B3, C3 e D3, (B) A2 e A3 e
(C) D2 e D3.
A distribuição taxonômica das sequências provenientes da região V4 do gene rDNA
16S que foram geradas pela plataforma MiSeq-Illumina foi determinada por meio do
programa MEGAN 5.0, no qual foi aberto o arquivo no formato Biom gerado pelo mothur.
Foram identificados 10 filos distintos no grupo de amostras analisado, sendo que os micro-
organismos pertencentes a cinco delesrepresentam 99,6% do total encontrado. São eles:
Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes e Fusobacteria. Proteobacteria foi o
filo mais abundante em todas as amostras analisadas, com 82% das sequências analisadas
atribuídas a ele, mesma tendência observada através da metodologia dependente de cultivo.
Para as amostras A2, A3 e B3, o filo Firmicutes foi o segundo mais frequente, enquanto que
para as amostras C3 e D3 Actinobacteria foi mais abundante e para D2, o filo Bacteroidetes
apareceu na segunda posição. Os cinco filos predominantes estão representados na figura 16.
A2 A3 D2 D3
150 68 189 162 21 63
D3
B3
C3
A3
93
4
12
44
2
9
2
1
3
4
55
8
34
3
180
(A)
(B) (C)
A2 D2
186 32 151
(D)
65
Figura 16. Distribuição taxonômica dos filos bacterianos que compreendem 99,6% das bactérias encontradas.
Sequências obtidas através do sequenciamento da região V4 do rDNA 16S na plataforma MiSeq -Illuminanas
amostras A2, A3, B3, C3, D2 e D3.
Na figura 17, é possível analisar mais detalhadamente a composição de cada amostra.
De um modo geral, o perfil das comunidades bacterianasnas amostras em relação ao filo não
variou muito. Na amostra A2, observou-se uma predominância do filo Proteobacteria
(93,4%), seguido dos filos Firmicutes (3,29%), Bacteroidetes (1,65%) e Actinobacteria
(1,15%). Na amostra A3, os filos Proteobacteria (74,3%), e Firmicutes (16,7%) também
foram os mais abundantes, mas Actinobacteria (6,53%) foi encontrado com maior frequência
do que Bacteroidetes (1,27%). Na amostra B3, um padrão um pouco diferente foi observado.
Os filos Proteobacteria e Firmicutes foram encontrados em uma proporção parecida, 48% e
40,8%, respectivamente. Esses filos foram seguidos por Bacteroidetes (5,76%),
Actinobacteria (2,86%) e Fusobacteria (1,86%). As amostras de dialisato C3 e D3
apresentaram uma distribuição de filos muito similar, predominando o filo Proteobacteria
(92,2% e 91,3%), seguido de Firmicutes (0,5% e 0,73%), Bacteroidetes (0,4% e 0,4%) e
Actinobacteria (6,84% e 7,60%). Na amostra D2, o filo Proteobacteria também predominou
(93,7%), mas a ocorrência do filo Bacteroidetes (4,64%) foi consideravelmente maior que
Actinobacteria, que representou menos de 1% das sequências analisadas. Os filos
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Bacteroidetes Fusobacteria
Seq
uên
cias
an
alis
adas
(%
)
A2 A3 B3 C3 D2 D3
66
quesomados, totalizam 0,38% do total estão agrupados como “raros” e compreendem
Acidobacteria, Planctomycetes, Chlamydiae,Tenericutes e Deinococcus-Thermus.
Figura 17. Diferenças na composição das comunidades bacterianas a nível de filo nas amostras A2, A3, B3, C3,
D2 e D3.
A nível de gênero, os 10 mais abundantes foram: Halomonas, Pseudomonas,
Sphingomonas, Paracoccus, Methylobacterium, Bradyrhizobium, Streptococcus,
Caulobacter, Burkholderia e gêneros pertencentes ao filo Actinobacteria, que não puderam
ser classificados a esse nível taxonômico. Esses gêneros compreendem 80% do total de OTUs
encontradas. Destes, os gêneros Pseudomonas, Caulobacter, Burkholderia, Halomonas e
Streptococcus também foram observados pela metodologia dependente de cultivo.
Halomonas se mostrou o gênero mais frequente (24%) - quando se considera o
número total de gêneros encontrados em todas as amostras analisadas, seguido de
Pseudomonas(21,5%), que esteve presente em todos os pontos avaliados. Outro gênero que
também foi encontrado em todas as amostras foi Sphingomonas, em geral menos abundante
67
que Pseudomonas, com exceção da amostra D2, em que o primeiro foi mais abundante (figura
18).
Figura 18. Distribuição taxonômica dos 10 gêneros bacterianos mais frequentes, que correspondem a
aproximadamente 80% do total dos gêneros encontrados. Sequências obtidas através do sequenciamento da
região V4 do rDNA 16S na plataforma MiSeq - Illumina nas amostras A2, A3, B3, C3, D2 e D3. As bactérias
pertencentes ao filo Actinobacteria não puderam ser classificadas a nível de gênero, por isso são representadas
pelo filo.
Na amostra A2, 3 gêneros predominaram: Bradyrhizobium (27,8%), Pseudomonas
(27,4%) e Sphingomonas (22,4%). Já a amostra A3 teve o gênero Pseudomonas como
predominante (58,8%), Methylobacterium como segundo gênero mais abundante (10,5%),
seguidos de outros gêneros menos frequentemente encontrados. Os gêneros compartilhados
entre esses dois pontos analisadosna Clínica A foram: Pseudomonas, Sphingomonase
Yersinia, o qual foi identificado apenas nessas duas amostras.
A amostra B3 apresentou uma comunidade bacteriana distribuída em uma quantidade
maior de gêneros que as demais amostras, considerando os gêneros que apresentaram
frequência acima de 1%, corroborando o que haviam apontado os índices de diversidade
Shannon e recíproca de Simpson. Os gêneros mais abundantes foram Pseudomonas (29,9%),
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Seq
uên
cias
an
alis
adas
(%
)
A2 A3 B3 C3 D2 D3
68
Streptococcus (16,9%), Halomonas (13,1%), Veillonella (10,1%) seguidos de outros com
distribuição parecida.
O gênero Halomonas apareceu como mais frequente na amostra C3 (35,6%), seguido
de Sphingomonas (16,5%), Paracoccus (11,9%), gêneros pertencentes ao filo Actinobacteria
(11,65%), Idiomarina (8,55%) e Pseudomonas (6,56%). Outros gêneros como Burkholderia,
Caulobacter, Phenylobacter e Methylobacter também foram observados.
Em relação aos pontos 2 e 3 coletados na Clínica D, houve uma grande diferença entre
as comunidades bacterianas, sendo compartilhados por ambos os pontos apenas os gêneros
Pseudomonas e Sphingomonas, também presentes nas demais amostras. Na amostra D2, o
gênero Sphingomonas foi o mais frequentemente observado (45,5%), seguido de Caulobacter
(13,8%), Pseudomonas (12,7%), Burkholderia (9,8%) e outros menos abundantes. A amostra
D3 apresentou uma baixa diversidade ao nível de gênero quando comparada às demais
amostras, sendo observados apenas Halomonas (70%), Paracoccus (12,6%), gêneros
pertencentes ao filo Actinobacteria (7,9%) Pseudomonas (5,1%) e Sphingomonas (2,6%),
além dos gêneros considerados como raros por estarem presentes em uma frequência inferior
a 1%.
Dessa forma, foi visto que o gênero Bradyrhizobium foi observado somente em
amostras de água para hemodiálise, não sendo detectado em nenhum dos dialisatos
investigados. Já os gêneros Paracoccus e Staphylococcus foram detectados apenas nas
amostras de dialisato, estando presentes em 3/4 (75%) e 2/4 (50%) amostras, respectivamente.
O total dos gêneros reportados para cada amostra, desconsiderando os que foram
encontrados com frequência inferior a 1% em cada uma, são apresentados na figura 19.
69
Figura 19. Diferenças na composição das comunidades bacterianas a nível de gênero das amostras A2, A3, B3,
C3, D2 e D3. O grupo Raros é representado pelos gêneros que correspondem a menos de 1% do total de OTUs
encontradas e classificadas a nível de gênero.
5.3.5 Comparação entre as comunidades bacterianas encontradas pela metodologia
dependente de cultivo e independente de cultivo
Conforme resultados expostos acima, Proteobacteria foi o filo mais acessado, tanto de
forma dependente, em que 61% dos isolados pertenciam a esse filo, quanto independente de
cultivo, em que representou 82% das sequências analisadas.
70
Os gêneros Halomonas, Pseudomonas, Streptococcus, Caulobacter, Burkholderia,
Staphylococcus e os pertencentes ao filo Actinobacteria foram obtidos por ambas as
metodologias, mas nem todos nas mesmas amostras. Os gêneros que puderam ser
identificados por ambos os métodos nas mesmas amostras foram: Halomonas (C3),
Pseudomonas (D3), Burkholderia (C3 e D2) e Staphylococcus (A3).
Todas as amostras que puderam ser analisadas tanto pela metodologia dependente de
cultivo quanto pela independente apresentaram uma comunidade bacteriana mais rica através
do último método (tabela 12). Diversos gêneros puderam ser acessados apenas pela análise
independente de cultivo: Sphingomonas, Paracoccus, Methylobacterium, Bradyrhizobium,
Yersinia, Novosphingobium, Weissella, Phenylobacterium, Idiomarina, Pasteurellaceae,
Prevotella, Veillonella, Acidominococcus, Sporolactobacillus, Telmatospirilum,
Hyphomicrobium,Acinetobacter, além dos filos encontrados com uma frequência de até 1%
em cada amostra, que foram desconsiderados dessas análises.
Entretanto, as amostras A1, B1, B2, C1, C2 e D1 somente foram analisadas pela
metodologia dependente de cultivo, o que pode ter sido causado pela pouca quantidade de
DNA obtida para amplificação da região V4 do gene que codifica o rRNA 16S.Desse grupo
de amostras, 67% corresponde a amostras de água potável, antes de passar pelos sistemas de
tratamento. Assim, nenhuma amostra de água potável foi analisada pela metodologia
independente de cultivo. Além disso, alguns gêneros somente foram detectados através do
método de cultivo, como Micrococcus, Microbacterium, Rhizobium e Cupriavidus.
71
Tabela 12. Comparação entre os gêneros bacterianos isolados através de cultivo e os gêneros acessados de forma independente de cultivo
Gêneros Amostras
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3
D I D I D I D I D I D I D I D I D I D I D I D I
Halomonas - - - + - - - - - - - + - - - - + + - - - - - +
Pseudomonas - - - + - + + - - - - + - - - - - + - - - + + +
Sphingomonas - - - + - + - - - - - - - - - - - + - - - + - +
Actinobacteria* - - - + - + - - - - - + - - - - - + - - - - - +
Micrococcus** - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Paracoccus - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - +
Methylobacterium - - - - - + - - - - - + - - - - - + - - - + - -
Bradyrhizobium - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - + - -
Streptococcus - - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - -
Caulobacter - - - + - - - - - - - - + - - - - + - - - + - -
Burkholderiacaea*** - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - -
Burkholderia - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - + + - -
Bacillus + - - - - - - - - - - - - - + - - - + - - - - -
Herbaspirilum - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Cupriavidus - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Ralstonia - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - -
Staphylococcus - - - - + + - - - - - + - - - - - - - - - - - -
Rhizobium - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - + -
72
Microbacterium - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + -
Yersinia - - - + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Novosphingobium - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - + - -
Weissella - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Phenylobacterium - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - + - -
Idiomarina - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - -
Pasteurellaceae - - - + - - - - - - - + - - - - - - - - - - - -
Prevotella - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - -
Veillonella - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - -
Acidominococcus - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - -
Sporolactobacillus - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Telmatospirilum - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - -
Hyphomicrobium - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Acinetobacter - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Fusobacteria**** - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - -
D – Metodologia dependente de cultivo; I – Metodologia independente de cultivo; “ +”: gênero acessado pela metodologia em questão; “-“ gênero não acessado pela
metodologia em questão.
* Organismos pertencentes ao Filo Actinobacteria não puderam ser classificados até o nível de gênero pela metodologia independente de cultivo.
** Micrococcus pertence ao Filo Actinobacteria mas foi isolado e identificado pela metodologia dependente de cultivo.
*** Organismo identificado até o nível taxonômico de família.
**** Organismos pertencentes ao Filo Fusobacteria não puderam ser classificados até o nível de gênero pela metodologia independente de cultivo.
73
6. DISCUSSÃO
A água potável, para ser utilizada na hemodiálise, passa por um processo de
tratamento que inclui filtros de carvão e areia, abrandadores e osmose reversa. Esse processo
soluciona diversos problemas gerados pela contaminação química da água, como a hemólise,
que pode ser causada pela presença de cloro e cloraminas. Contudo, a passagem da água pelo
sistema de tratamento pode introduzir complicações relacionadas à contaminação
microbiológica, devido à remoção do cloro, que pode fazer com que micro-organismos
voltem a ser detectados assim como pela presença dos filtros, resinas dos abrandadores e
carvão ativado, que oferecem grandes superfícies nas quais bactérias e outros micro-
organismos poderiam crescer (FARIA, 2011). Além disso, após o tratamento, a água passa
por diversas tubulações para ser distribuída para as máquinas. O diâmetro e comprimento
dessas tubulações, que costumam ser grandes, podem reduzir a velocidade do fluxo de água, o
que permite a multiplicação de bactérias, que podem aderir às superfícies dessas tubulações e
formar biofilmes, que constituem uma fonte de contaminação bacteriana constante e de difícil
remoção (ROTH & JARVIS, 2000).
Para evitar a formação de biofilmes, as concentrações bacterianas e de seus produtos
devem ser mantidas baixas. A exposição de pacientes a elevadas concentrações microbianas
está associada tanto com complicações de curto-prazo como febre, desconforto e náuseas
quanto com consequências de longo-prazo, como amiloidose e desnutrição. Além disso, a
possibilidade de infecção existe, caso a membrana do dialisador não esteja íntegra, podendo
permitir a passagem de micro-organismos (ALMODOVAR, PEREIRA & BUGNO, 2009).
Dessa forma, como os micro-organismos encontrados na água para hemodiálise
podem representar um risco à saúde dos pacientes, por serem produtores de doenças invasivas
ou atuarem como indutores de respostas imunológicas nesses pacientes, nesse
trabalhoinvestigamos a comunidade bacteriana em amostras provenientes de unidades de
hemodiálise vinculadas ao SUS, localizadas no município do Rio de Janeiro. As coletas foram
realizadas em quatro clínicas visitadas, ao longo dos sistemas de tratamento de água para
hemodiálise nos seguintes pontos: água potável proveniente da rede de abastecimento antes de
passar pelo processo de tratamento da clínica, água tratada para hemodiálise e dialisato.
Foram realizadas contagens de bactérias heterotróficas, ensaios para detecção de coliformes
totais e E. coli e identificação das comunidades bacterianas presentes por metodologia
dependente e independente de cultivo.
74
A detecção de coliformes totais e E. colié extensivamente utilizada no monitoramento
da qualidade de águas (ALM et al., 2013; NOGUEIRA et al., 2003; LEBARON et al., 2005).
Os coliformes totais são bastonetes gram-negativos, compostos por bactérias da família
Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de ácido e gás, quando
incubados a 35-37ºC por 48 horas. As bactérias pertencentes a esse grupo,
predominantemente formado pelos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e
Klebsiella, são abundantes nas fezes de animais de sangue quente, mas também podem ser
encontradas no solo e vegetais. Destes, apenas a espécie Escherichia colié de origem quase
que exclusivamente fecal, sendo por isso considerada um indicador mais específico de
contaminação fecal (HACHICH et al., 2012).
Para esse parâmetro, uma amostra é considerada satisfatória quando há ausência de
coliformes totais e E. coli em 100 mL de água potável e de coliformes totais em 100 mL de
água tratada para hemodiálise (BRASIL, 2011; ANVISA, 2014).Tanto bactérias pertencentes
ao grupo dos coliformes totais quanto à espécie E. coli estiveram ausentes em 100% das
amostras através do método empregado.BORGES et al. (2007) encontraramresultados
similares quando analisaram 72 amostras de águas e dialisato em uma clínica de hemodiálise
localizada no Estado do Paraná. Assim como FIGEL, DALZOTO & PIMENTEL (2015)
quando avaliaram amostras de água em seis clínicas de hemodiálise em Curitiba-PR.
Contudo, outros grupos já encontraram coliformes em amostras de água para hemodiálise,
como ARVANITIDOU et al. (1998), que examinaram 85 centros de hemodiálise na Grécia e
encontraram coliformes em 12,3% das amostras de água e EL-KORAIE et al. (2007), que
observaram bactérias do grupo coliforme em 4% das amostras de água analisadas em duas
unidades de diálise na cidade de Alexandria, no Egito.
Apesar de a espécie E. coli não ter sido detectada em nenhuma das clínicas, sabe-se
que é um indicador mais específico do que o grupo dos coliformes totais para detectar
contaminação fecal. Conforme já mencionado, enquanto a Portaria MS Nº 2.914/2011 usa
tanto o grupo dos coliformes quanto a E. coli como indicadores, a RDC ANVISA Nº 11/2014
somente preconiza a detecção do grupo dos coliformes totais. A legislação Europeia que trata
dos parâmetros para avaliação da qualidade de águas próprias para banho substituiu a
avaliação da presença de coliformes pela E. coli e, segundo FIGUERAS & BORRECO
(2010), a tendência é que o grupo dos coliformes também seja substituído nas próximas
revisões da legislação Europeia que trata da água considerada própria para beber. Isso mostra
que a RDC ANVISA Nº 11/2014, apesar de ter sido revisada recentemente, parece caminhar
na contramão de outras legislações existentes.
75
A contagem de bactérias heterotróficas também é um parâmetro empregado com
frequência em análises de amostras de água. Seu resultado gera informações a respeito do
número total de bactérias aeróbias organotróficas e uma indicação da composição orgânica
total do meio analisado (APHA, 2012). Apesar de não estar diretamente relacionada à
presença de patógenos, pode ser utilizada como indicativo de deficiências na sanitização ou
falha nos processos de tratamento. Para análise desse parâmetro, foi empregada a técnica de
espalhamento em superfície nos meios TSA e R2A, sob condições diferentes de incubação.
No presente estudo, verificou-se que 100% das amostras de água potável (4/4) e tratada para
diálise (4/4) e 75% das amostras de dialisato (3/4) estiveram de acordo com os limites
preconizados pela legislação brasileira, que é de 500 UFC/mL para a água potável (BRASIL,
2011), 100 UFC/mL para a água tratada para diálise e 200 UFC/mL para o dialisato
(ANVISA, 2014). Entretanto, foram observadas algumas divergências entre as contagens
realizadas nos dois meios de cultivo empregados em quatro amostras analisadas (A2, A3, C2
e D3).
A legislação brasileira, através da Portaria e RDC supracitadas, estabelece o número
máximo de UFCs que a água potável, água tratada para diálise e dialisato devem conter, mas
não normatiza as técnicas de cultivo a serem utilizadas. Diferentes métodos para contagem de
bactérias heterotróficas em amostras de água são recomendados por diversos órgãos e
associações, como a American Public Health Association (APHA), a AAMI e a farmacopéia
americana (USP), que podem variar na técnica de semeadura (membrana filtrante, spread
plate ou pour plate), nos meios de cultura (pobres ou ricos nutricionalmente) e nas condições
de incubação (temperaturas baixas ou elevadas por um período de incubação curto ou longo)
(APHA, 2012; ANSI/AAMI, 2014; USP 38 – NF33, 2016).
Existem duas abordagens principais utilizadas para essas análises microbiológicas em
amostras de água: uma delas emprega meios de cultura com alto conteúdo nutricional, como
TSA e Agar padrão para contagem (PCA), tendo sido vastamente utilizada no passado; a outra
utiliza meios pouco nutritivos, como o R2A, que são importantes na detecção de bactérias
oligotróficas de crescimento lento e/ou que tenham o metabolismo adaptado a ambientes
aquáticos, que são pouco nutritivos na maior parte das vezes (ALMODOVAR, PEREIRA &
BUGNO, 2009).
GOMILA et al. (2005) analisaram amostras de água de hemodiálise e dialisato e
utilizaram os meios Agar sangue, Mueller Hinton e R2A para a contagem de bactérias
heterotróficas. As contagens nos dois primeiros meios foram entre 3 e 10 vezes inferior à
contagem obtida no meio R2A. LINDE et al. (1999) compararam os resultados de contagens
76
de bactérias hetetrotróficas, também em amostras de água de hemodiálise e dialisato, nos
meios TSA e R2A e concluíram que o meio R2A recuperou um maior número de UFCs que o
TSA. ALMODOVAR, PEREIRA & BUGNO (2009) encontraram contagens
significativamente maiores no agar R2A em relação ao PCA.
Dessa forma, nesse trabalho foram utilizadas as duas abordagens: foi empregado o
meio TSA, a uma temperatura de 35ºC através da técnica de spread plate(USP 38-NF33,
2016), a qual possui algumas vantagens em relação aos demais métodos, como por exemplo
ausência de choque térmico para os micro-organismos – que pode ocorrer natécnica de pour
plate – e melhor definição das colônias por estarem na superfície, sendo facilmente
distinguidas de bolhas do meio e partículas; e o meio R2A, a uma temperatura mais baixa,
20ºC por um período de incubação de 7 dias (APHA, 2012), também por spread plate, usando
como base os trabalhos descritos anteriormente.
Como resultado, foi verificada uma variação na contagem de algumas amostras em
cada uma das condições de cultivo empregadas, sem haver uma tendência em relação a qual
técnica recuperou uma maior quantidade de bactérias, visto que na amostra A2 o meio R2A
apresentou maior contagem, na A3 e C2 o TSA recuperou maior quantidade de micro-
organismos e na D3, foi o R2A que mostrou maior crescimento de bactérias.
Nesse estudo, as diferenças nas contagens não resultaram em divergência na
aceitabilidade das amostras em relação aos limites máximos previstos na legislação, mas no
tocante ao nível de ação, que é de 50 UFC/mL houve diferença no enquadramento das
amostras A2 e C2, que atingiram o nível somente quando foi empregado um dos meios de
cultivo. Assim, nota-se que o uso de diferentes técnicas de cultivo pode influenciar na
enumeração dos micro-organismos, podendo levar a resultados diferentes quanto à
conformidade ou não de amostras em alguns casos. Não existindo uma padronização, os
laboratórios podem empregar protocolos variados, o que torna difícil a comparação entre os
resultados gerados por cada laboratório para esse parâmetro. Isso mostra a necessidade de
estudos específicos que tenham como objetivo gerar uma normatização a respeito desse tema.
BORGES et al. (2007) isolaram 160 bactérias gram-negativas de amostras coletadas
em uma unidade de hemodiálise, sendo que apenas um desses isolados foi detectado na água
potável, sendo 79 provenientes dos diferentes pontos de água tratada selecionados e 80 das
amostras de dialisato coletadas. No presente estudo, as análises das amostras de água potável
através das contagens de bactérias heterotróficas e da abordagem independente de cultivo
também sugerem que esse ponto de coleta apresentou uma concentração microbiana muito
baixa, visto que nenhuma bactéria viável foi recuperada através da metodologia de contagem
77
empregada e que não foi obtida quantidade de DNA suficiente para a análise independente de
cultivo em nenhuma das clínicas examinadas.
Esses resultados podem ser explicados pela presença de cloro na água potável, que de
acordo com a Portaria MS Nº 2914/2011, pode conter até 2 mg/L de cloro residual livre
(BRASIL, 2011). Para inativar esse cloro residual e permitir o crescimento das bactérias
eventualmente presentes, recomenda-se a adição de tiossulfato de sódio, que foi adicionado
aos frascos empregados nessas coletas. Entretanto, somente foi observado crescimento
bacteriano quando 2L dessas amostras foram submetidos à filtração para concentração dos
micro-organismos em membranas e incubação das mesmas sob agitação em meio de cultivo
líquido, estratégia que melhora as condições para o crescimento de micro-organismos,
corroborando a hipótese de que a concentração de bactérias aparentementeera muito baixa
nessas amostras.
Conforme já mencionado, algumas características dos sistemas de tratamento de água
para hemodiálise podem favorecer o crescimento de bactérias, como os filtros, resinas, carvão
ativado e tubulações. Esse crescimento tende a ser maior no dialisato, que por ser uma solução
balanceada de sais, poderia ser comparado a um meio de crescimento quase tão fértil quanto
um caldo nutriente (ARVANITIDOU et al., 1998). Essa pode ser uma das explicações para o
fato deque, em contraste com as amostras de água potável, 2/4 amostras de água tratada e
todas as de dialisato analisadas (4/4) apresentaram quantidade suficiente de DNA bacteriano,
possibilitando sua análise pela metagenômica empregando o gene rDNA 16S.
A identificação das bactérias através de uma metodologia dependente e outra
independente de cultivo revelou uma diversa comunidade bacteriana. A maior parte das
bactérias encontradas pelas duas abordagens pertenciam ao filo Proteobacteria, seguido de
Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes e Fusobacteria. O filo Proteobacteria compreende a
maioria das bactérias gram-negativas conhecidas até o momento e consiste em uma das
maiores divisões dentro dos procariotos, englobando mais de 200 gêneros. Esse grupo possui
grande importância biológica por incluir um grande número de patógenos de plantas, animais
e humanos (GUPTA, 2000).As sequências correspondendo ao filo Proteobacteria foram
assinaladas a diversos gêneros, como Pseudomonas, Halomonas, Sphingomonas, Paracoccus,
Burkholderia, Cupriavidus, Methylobacterium, dentre outros. As bactérias classificadas como
Firmicutes, segundo filo mais abundante, incluíram os gêneros Streptococcus, Bacillus,
Staphylococcus e outros menos frequentemente encontrados.
Apesar de os filos bacterianos predominantemente encontrados através das duas
abordagens terem apresentado pouca variação, ao nível de gênero houve uma
78
diferençaconsiderável entre as comunidades bacterianas observadas atravésdas metodologias
dependente e independente de cultivo, coincidindo apenas Halomonas, Pseudomonas,
Burkholderia eStaphylococcus, que foram encontrados por ambas as abordagens nas mesmas
amostras. Alguns gêneros foram detectados por ambas as metodologias, mas em amostras
diferentes, como Caulobacter e três dos gêneros citados acima, que foram encontrados tanto
nas mesmas amostras por ambas as metodologias quanto em amostras diferentes por uma das
abordagens apenas, sendo elesHalomonas, Pseudomonas e Staphylococcus. Alguns gêneros
bacterianosforam detectados em determinadas amostras apenas através do cultivo, como
Micrococcus, Cupriavidus, Ralstonia, Rhizobium, dentre outros. Entretanto, um número
bastante superior de procariotos foi identificado somente pelo método independente de
cultivo, como Sphingomonas, Paracoccus, Methylobacterium, Yersinia, Novosphingobium,
Weissella, Prevotella, Hyphomicrobium etc.
As análises dos diagramas de Venn demonstraram grande variação das OTUs
identificadas entre as amostras de dialisato das diferentes clínicas assim como entre as
amostras de água tratada e dialisato de uma mesma clínica, visto que um baixo percentual de
OTUs foram compartilhadas entre os diferentes pontos. Dos gêneros compartilhados entre os
dialisatos das quatro clínicas visitadas, que foram Pseudomonas, Burkholderia,
Sphingomonas e Paracoccus, somente os dois primeiros haviam sido detectados pela
metodologia dependente de cultivo e apenas em 1 de 4 amostras em que foram identificados
pela abordagem molecular. Nesse estudo não foi possível observar gêneros compartilhados
entre as amostras de dialisato estudadas através do cultivo. Esses resultados sugerem que
diferentes comunidades são recuperadas por cada metodologia, e que a abordagem molecular
utilizada foi capaz de recuperar uma maior diversidade bacteriana nas amostras de dialisato.
Das amostras de água potável, analisadas apenas pela metodologia dependente de
cultivo, foram isolados Bacillus sp (A1), Pseudomonas sp (B1), Streptococcus salivarius
(C1), Caulobacter vibrioides (C1) e Bacillus subtilis (D1). Os gêneros Pseudomonas e
Bacillus, inclusive a espécie B. subtilis também foram isolados por MONTANARI et al.
(2009) em amostras de água potável coletadas de um centro de hemodiálise localizado em São
Paulo.
A espécie B. subtilis é conhecida por seus esporos altamente resistentes a biocidas, o
que pode ter permitido resistir ao cloro presente na água e quando este foi inativado com
tiossulfato, pode ter ocorrido a desesporulação e o crescimento desses micro-organismos.
Além disso, sabe-se que os esporos são comumente resistentes a agentes líticos, ou seja, que
promovem a lise celular, o que também poderia explicar o fato de não terem sido detectados
79
pela abordagem independente de cultivo (RUSSEL, 1999; FELCZYKOWSKA et al., 2015).
Já a espécie S. salivarius trata-se de um membro da flora microbiana da cavidade oral
(BURTON et al., 2006), podendo ter sido fruto de contaminação em alguma etapa da coleta
ou manipulação da amostra.
O gênero Caulobactercompreende espécies gram-negativas aeróbias que crescem a
uma temperatura ótima de 25 a 30ºC e pode requerer nutrientes específicos para seu
crescimento. Sua presença já foi observada em diferentes tipos de água: potável, destilada,
envasada e tratada para hemodiálise e já esteve envolvido em um caso de peritonite em um
paciente que realizava diálise peritoneal, que resultou em bacteremia (JUSTESEN et al.,
2007; GOMILA et al., 2005).Nesse trabalho, a espécie C. vibrioides foi identificada na
amostra C1 pela metodologia dependente de cultivo e o respectivo gênero na amostra de água
tratada da clínica D e no dialisato da clínica C, através do método independente de cultivo,
reforçando a ideia de que é capaz de crescer em diferentes tipos de amostras de água.
O gênero Pseudomonas, além da amostra B1, também foi encontrado no dialisato da
Clínica D pela metodologia dependente de cultivo. Nessa amostra de dialisato, foi possível a
identificação através de comparação com as sequências presentes no GenBank até o nível de
espécie, sendo classificada como Pseudomonas stutzeri. O gênero Pseudomonas também foi
detectado nas amostras A2, A3, B3, C3 e D2 pela metodologia independente de cultivo,
estando presente, portanto, em todas as amostras que puderam ser analisadas por esse método.
GOETZ et al. (1983) reportaram 6 casos de bacteremia por P. stutzeri envolvendo
pacientes em tratamento por hemodiálise, causando febre, calafrios, náuseas e vômitos. A
origem da contaminação foi investigada e bactérias dessa espécie foram encontradas no
sistema de tratamento da água para hemodiálise e no dialisato, eliminando outras
possibilidades de contaminação frequentes em pacientes, como através do cateter ou
provenientes de infecções já existentes.
Algumas espécies de Pseudomonas sintetizam uma cápsula de exopolissacarídeos que
pode ajudar na adesão celular, podendo culminar na formação de biofilmes, que as protege da
ação de agentes desinfetantes e biocidas (GONZÁLEZ, MELIÁN & ALONSO, 2014).
Dentro desse gênero, a espécie mais conhecida por produzir infecções em humanos,
especialmente imunocomprometidos, é a P. aeruginosa. Apesar de não ter sido identificada
nesse estudo, é possível que ela seja uma das espécies do gênero Pseudomonas detectado em
várias amostras pela metodologia independente de cultivo, visto que P. aeruginosaé uma das
espécies mais observadas em sistemas de água de diálise, tendo sido encontrada por PISANI
80
et al. (2000), OIE et al. (2003), ARVANITIDOU et al.(2003), FERREIRA(2009), dentre
outros.
Dentre o total de bactérias encontradas, a maior parte são gram-negativas, que são
descritas como as principais causadoras de infecções nos pacientes em terapia por
hemodiálise (ARVANITIDOU et al., 2003). Além disso, sua parede celular é rica em LPS,
conhecido por atravessar as membranas de diálise e estimular o sistema imune inato dos
pacientes, através de reconhecimento por receptores Toll like(TLR)e liberação de citocinas,
gerando uma reação pirogênica. Entretanto, outras moléculas derivadas de bactérias também
podem induzir resposta imune nos pacientes, como peptidoglicano, exotoxinas, fragmentos de
DNA e glicoesfingolipídeos.
Foi demonstrado que o potencial imunoestimulatório do DNA varia de acordo com a
abundância dos oligonucleotídeos não metilados citosina-guanina (CG) e os DNAs
dosvariados gêneros bacterianos existentes possuem diferenças na sua frequência. Os gêneros
Pseudomonas e Burkholderia são conhecidos por terem um alto conteúdoCG e por isso têm
um alto potencial imunoestimulatório, disparando uma resposta imune agressiva nos pacientes
que entram em contato com seus fragmentos de DNA, o que contribui para o estado
microinflamatório crônico desses pacientes (DAPKE et al., 2006).
OgêneroBurkholderia, também observado nesse estudo, compreende mais de 40
espécies, as quais já foram classificadas como pertencentes ao gênero Pseudomonas (DINIZ
et al., 2008; GONZÁLEZ, MELIÁN & ALONSO, 2014).Bactérias desse gênero foram
encontradas tanto pela metodologia dependente quanto pela independente de cultivo em uma
amostra de água tratada (D2) e em uma amostra de dialisato (C3), em clínicas diferentes.
Através da primeira abordagem, foi possível chegar à espécie B. contaminans, pertencente ao
complexo Burkholderia cepacia, que abrange espécies gram-negativas e inclui patógenos de
plantas, animais e humanos. As bactérias contidas nesse complexo exibem grande
versatilidade metabólica, o que as permite adaptação a diferentes ambientes, incluindo
desinfetantes e antissépticos (SOUSA, RAMOS & LEITÃO, 2011;BORGES et al., 2007). Em
humanos, os membros desse complexosão conhecidos por causar infecções pulmonares em
pacientes com fibrose cística, que constitui a causa mais comum de óbito nesses pacientes.
Em hospitais, esses micro-organismos já foram detectados em amostras de água da torneira e
destilada, máquinas de hemodiálise, cateteres, soluções, fluidos intravenosos, dentre outros
(MARIONI et al., 2006). Bactérias desse complexo também já estiveram envolvidas em
surtos de bacteremia em pacientes dialíticos devido à contaminação da água para diálise
(SOUZA et al., 2004).
81
A abordagem metagenômica empregada também permitiu a detecção do gênero
Methylobacterium em 3/4 amostras de dialisato (A3, B3 e C3) e em uma amostra de água para
hemodiálise (D2). As bactérias desse gênero não foram observadas através da metodologia
dependente de cultivo utilizada em nenhuma amostra, o que poderia ser explicado pelo fato de
as espécies desse gênero serem fastidiosas e de crescimento lento. Sãogram-negativas e
podem ser encontradas no solo, folhas e esgoto (SANDERS et al., 2000). Mais de vinte
espécies são conhecidas, sendo que algumas delas já foram isoladas de sítios estéreis, como
sangue, medula óssea, líquido peritoneal, dentre outros, causando infecções em pacientes
imunocomprometidos. As espécies mais comumente reportadas em amostras clínicas são M.
mesophilicum e M. zatmanii(LAI et al., 2011; FERNANDEZ et al., 1997; HORNEI et al.,
1999; KAYE, MACONE & KAZANJIAN, 1992; KORVICK et al., 1989). Outra
característica desse gênero é a resistência ao cloro, já tendo sido encontrado em amostras de
água potável (REASONER et al., 1989) e água de hemodiálise (GOMILA et al., 2005;
GOMILA et al., 2006).
Nesse trabalho, o gênero Sphingomonas foi encontrado em quase todas as amostras
analisadas pela metodologia independente de cultivo, estando presente nas amostras A2, A3,
C3, D2 e D3, não sendo observado apenas na amostra B3. Esse gênero compreende mais de
30 espécies de bactérias aeróbias gram-negativas, que já foram reportadas em amostras de
água do mar, de rio, mineral, sistemas de distribuição de água, nebulizadores em hospitais,
água destilada, dialisato etc (RYAN& ADLEY, 2010; LIN et al., 2010). Até o momento, 3
espécies já foram descritas como importantes clinicamente: S. paucimobilis, S. mucosíssima e
S. adesiva, sendo a primeira considerada a principal espécie patogênica desse gênero (ROH et
al., 2009), já tendo sido associada com uma variedade de infecções em humanos, como
bacteremia, pneumonia, infecções relacionadas a cateter, meningite, peritonite, osteomielite,
artrite séptica, enfisema pulmonar, infecções do trato urinário e outras (LIN et al., 2010). As
espécies pertencentes a esse gênero, apesar de definidas como gram-negativas, não possuem
lipopolissacarídeo (LPS) em sua parede celular, e sim glicoesfingolipídeos, que possuem
composição química um pouco diferente do LPS. Contudo, em contato com o sangue do
paciente, os glicoesfingolipídeos também podem ativar o sistema imune, mas através de um
mecanismo diferente do observado na presença de LPS, envolvendo as células T Natural
Killer (NKT) e rápida produção de citocinas pró-inflamatórias, como TNF- , IL-6 e IL-1.
Um outro gênero encontrado nesse trabalho foiStaphylococcus, observado em duas
amostras de dialisato, A3 e B3, não tendo sido observado nas amostras de água potável
tampouco nas de água tratada para diálise. Na amostra A3, por sua vez, os dados das duas
82
metodologias empregadas coincidiram, sendo que pelo método dependente de cultivo foi
possível identificar a espécie S. epidermidis. Esse micro-organismo é um membro conhecido
da microflora da pele humana e pode ser transmitido para a superfície de dispositivos médicos
quando estes são manipulados (KAPLAN et al., 2004), constituindo um dos principais micro-
organismos envolvidos em infecções relacionadas a cateteres intravasculares, cateteres usados
na diálise peritoneal, lentes intraoculares, marcapassos cardíacos etc (HUEBNER&
GOLDMAN, 1999). S. epidermidis é capaz de formar biofilmes, o que o torna menos
susceptível a antibióticos e defesas do hospedeiro, podendo levar à sepse aguda, osteomielite
ou até mesmo à morte, particularmente em pacientes imunocomprometidos (VUONG &
OTTO, 2002).Não é comum encontrar essa espécie em águas naturais ou puras, devido às
suas características ecológicas (GOMILA et al., 2006). Além disso, ela não foi observada em
nenhuma das amostras de água, somente nas de dialisato. Desse modo, a presença dessa
espéciepode ser devida à manipulação no preparo do dialisato ou no reprocessamento dos
dialisadores em caso de reuso dos mesmos. Além disso, esse achado pode sugerir também a
presença de biofilmes, visto que esses organismos são conhecidos produtores dessas
estruturas.
O gênero Yersinia somente foi encontrado nas amostras de água tratada e dialisato da
Clínica A, pelo método independente de cultivo. Não é frequente encontrar na literatura
registros de contaminação de água para hemodiálise ou dialisato por Yersinia, contudo, já
foram reportados casos de pacientes em tratamento por hemodiálise que foram acometidos
por infecção sistêmica pela espécie Yersinia enterocolitica, sem que tenha sido investigada a
origem da infecção (FAKIR et al., 1992; MERGENHAGEN & TELESZ, 2011). A presença
desse gênero é um achado crítico, visto que os casos de septicemia que envolvem a espécie Y.
enterocolitica podem resultar em taxas de mortalidade de até 50% dos casos e o tratamento
com antibióticos é complicado devido a vários fatores de resistência (MERGENHAGEN &
TELESZ, 2011). Além disso, pacientes em hemodiálise recebem suplementação com ferro,
tanto devido à anemia que ocorre graças à deficiência de eritropoietina, que é produzida pelos
rins quanto pela perda de sangue que ocorre com as sessões de diálise e já foi visto que a
sobrecarga de ferro é um fator de risco para a infecção de Yersinia, pois elevadas
concentrações desse metal dificultam a atividade fagocítica dos neutrófilos e aumentam,
portanto, a virulência das espécies de Yersinia(IOANNIDIS et al., 2014).
É possível que a pouca quantidade de relatos da presença de Yersinia em sistemas de
hemodiálise na literatura se deva à escassez de estudos que empregaram ferramentas
moleculares além dos métodos tradicionais de cultivo para analisar esses sistemas. Espécies
83
pertencentes a esse gênero, especialmente a Y. enterocolitica, apresentam crescimento lento
em meios de cultivo tradicionais, assim, em amostras contendo outras bactérias de
crescimento mais rápido, a detecção é difícil (HUSSEIN, FENWICK & LUMSDEN, 2001).
O gênero Halomonas compreende 77 espécies, que foram descritas como gram-
negativas, aeróbias, quimio-organotróficas e halofílicas (POLI et al., 2013). Estudos
mostraram que algumas espécies são capazes de produzir exopolissacarídeos, que poderiam
levar à formação de biofilmes. STEVENSet al. (2009) isolaram três espécies de Halomonas
em dois pacientes com bacteremia em um centro de diálise nos Estados Unidos.Nesse estudo,
os autores sugerem que a contaminação tenha sido originada no bicarbonato utilizado para
preparar a solução de diálise. No presente trabalho, esse gênero foi encontrado em uma
amostra de água tratada para hemodiálise (A2) pela metodologia independente de cultivo e em
três amostras de dialisato: C3 (por ambos os métodos), B3 e D3 (somente pela metodologia
independente de cultivo).Na amostra D3, existe grande possibilidade de a origem da
contaminação ser também o bicarbonato, visto que Halomonas é um gênero que geralmente
compreende espécies isoladas de ambientes com elevadas concentrações salinas (STEVENS
et al., 2013),não foi encontrado na amostra D2, que foi analisada por ambas as metodologias e
apareceu como gênero predominante no dialisato dessa clínica, correspondendo a 70%. Não
se deve descartar essa possível origem de contaminação nas outras amostras em que esse
gênero foi encontrado (B3 e C3), porém torna-se um pouco mais complicado de inferir isso, já
que as amostras de água tratada provenientes dessas clínicas(B2 e C2)apenas foram analisadas
pela metodologia dependente de cultivo, que somente foi capaz de detectar esse gênero em
1/3 amostras nas quais a abordagem independente de cultivo identificou Halomonas.Apesar
de a origem da contaminação ser difícil de precisar, a presença deHalomonas nas amostras de
dialisato é um achado importante dado que esse gênero já esteve envolvido em surtos de
bacteremia em unidades de diálise.
A água de hemodiálise é um habitat altamente oligotrófico e as bactérias ali presentes
adaptaram suas propriedades metabólicas a esse meio pouco nutritivo. O uso de uma
variedade de meios e condições de cultivo é importante para o isolamento de uma faixa maior
de micro-organismos. Nesse trabalho, a escolha dos meios e condições de incubação foi
baseada em resultados publicados na literatura, que apontam o meio R2A como o mais
indicado para recuperar bactérias viáveis desse ambiente oligotrófico (GOMILA et al., 2005).
Como estratégia adicional, o meio TSA foi empregado por promover um ambiente rico em
nutrientes, favorecendo a detecção de um outro grupo de bactérias.Contudo, é possível que o
emprego de meios de cultura adicionais e diferentes condições de incubação resultassem no
84
isolamento de um número maior de gêneros ou espécies, visto que alguns dos micro-
organismos encontrados nesse trabalho somente através da abordagem metagenômica já
haviam sido isolados por outros autores através de metodologias dependentes de cultivo,
como por exemplo os gêneros Methylobacterium, Paracoccus, Novosphingobium,
Sphingomonas e Acinetobacter (GOMILA et al., 2005; BORGES et al., 2007).
Entretanto, mesmo utilizando estratégias de cultivo adicionais, é bastante provável que
nem toda a comunidade bacteriana presente fosse acessada, pois existem diversos micro-
organismos que exigem condições de cultivo muito específicas para crescimento em meios de
cultura, assim como outros poderiam estar em um estado viável, porém não cultivável.
Como mais de 90% das bactérias podem estar nesse estado viável mas não cultivável,
as abordagens independentes de cultivo empregando o gene rDNA 16S têm contribuído
enormemente para a ciência, garantindo o acesso a uma vasta gama de micro-organismos.
Entretanto, o uso dessa metodologia inclui diversas etapas até a obtenção das sequências,
quepodem introduzir erros que eventualmente acarretam em resultados imprecisos. São elas:
(i) concentração dos micro-organismos, lise celular e extração de ácidos nucleicos das
bactérias presentes na amostra em análise, (ii) reação de amplificação por PCR e (iii)
sequenciamento de nova geração.
A composição do DNA total obtido depende da técnica usada para lise celular, visto
que existem células mais difíceis de serem rompidas do que outras, como as bactérias gram-
positivas e as formadoras de esporos. Dessa forma, dependendo da metodologia empregada,
pode haver lise somente das bactérias gram-negativas ou o método pode ser capaz de lisar
todas as bactérias gram-positivas mas gerar degradação no material genético de alguns
organismos. Deve haver, portanto, um balanceamento entre a necessidade da lise completa
das células e a qualidade do DNA (TRINGE & RUBIN, 2005). Nesse trabalho, foi realizada
concentração das amostras através da filtração em SterivexTM
e lise celular no interior do
mesmo seguido por extração de DNA empregando fenol-clorofórmio. Esse método foi
originalmente proposto por SOMERVILLE et al. (1989) e já foi usado em diversos trabalhos
com algumas modificações (BRUCE et al., 2012; SALLOTO et al., 2012). Apesar de alguns
estudosterem mostrado a superioridade do método fenol-clorofórmio para extração de DNA
em amostras de água, (URAKAWA, MARTENS-HABBENA & STAHL, 2010; HWANG et
al., 2012) o uso de apenas uma metodologia de lise e extraçãopode ter favorecido alguns
micro-organismos em detrimento de outros, pois o métodoescolhido pode ser mais eficiente
para extração de DNA de determinadas bactérias e menos para outras.
85
A reação de PCR também introduz algumas fontes de erros. A contaminação dos
reagentes usados na reação, como a própria enzima Taq polimerase, com DNA bacteriano
poderia levar a resultados falso positivos, devido à amplificação de moléculas de DNA não
correspondentes à sequência alvo. Outro problema em potencial é a amplificação de DNA
proveniente de templates bacterianos misturados, podendo resultar na formação de artefatos
moleculares que não representam verdadeiramente nenhum organismo. Além disso, existem
substâncias possivelmente presentes na amostra que podem inibir a reação de PCR, como o
EDTA e ácidos húmicos (KOLBERT & PERSING, 1999). A amplificação preferencial de
sequências dominantes numericamente também pode ser observada durante a reação de PCR
(KOZDRÓJ & VAN ELSAS, 2001).
Além disso, apesar de a análise da sequência do rDNA 16S ser vantajosa para a
identificação de muitos micro-organismos, alguns estudos mostraram que a resolução
taxonômica desse alvo molecular pode ser limitada quando se trata de agentes muito
similares, particularmente aqueles com homologia de sequências em torno de 97% ou mais
(KOLBERT & PERSING, 1999). Nesse contexto, uma questão importante é a definição da
região hipervariável do rDNA 16S a ser sequenciada. Existem diferenças no poder de
discriminação filogenética entre as diferentes regiões e nenhuma região sozinha é capaz de
distinguir todas as bactérias.NELSON et al. (2014) realizaram uma comparação entre os
resultados de diversidade alfa e beta provenientes do sequenciamento de bibliotecas das
regiões hipervariáveis V4 e V4-V5 realizado pelo Roche 454 Life Sciences e pelo Illumina -
MiSeq e uma das conclusões a que chegaram foi que a escolha da região hipervariável teve
um efeito maior na variação da diversidade beta do que a escolha da tecnologia de
sequenciamento. MIZRAHI-MAN, DAVENPORT & GILAD (2013) realizaram comparações
entre as diferentes regiões V1, V3, V4, V5, V6, V7 e V9 e chegaram à conclusão de que tanto
a região V3 quanto a V4 foram as melhores para a pesquisa das comunidades bacterianas.
GHYSELINCK et al. (2013) compararam a cobertura de cinco primers universais que tinham
como alvo diferentes regiões conservadas entre as regiões hipervariáveis V1 e V9 e os
resultados mostraram que as sequências geradas pelos iniciadores que flanqueavam a região
V4 foram mais informativas, quando comparadas com as sequências geradas pelos demais
primers. Outro estudo que reforça a região V4 como promissora foi o realizado por KOZICH
et al. (2013), em que as análises com as sequências geradas com os amplicons da porção V4
apresentaram melhores resultados do que com os amplicons das regiões V3-V4 e V4-V5.
Portanto, nota-se que a região V4 do rDNA 16S, utilizada nesse trabalho, é bastante
empregada em estudos de diversidade, especialmente os que utilizam a plataforma Illumina-
86
Miseq, que atualmente gera sequências de aproximadamente 2 x 300 pb (no caso de
sequenciamento do tipo paired-end), enquanto a região V4 contém aproximadamente 250 pb,
o que permite um overlap completo das sequências Forward e Reverse, aumentando
consideravelmente a qualidade das sequências consenso geradas.Contudo, para se distinguir
as bactérias a nível de espécie, seria necessário analisar uma região maior do rDNA 16S, visto
que a estratégia utilizada foi capaz de distinguir as bactérias até o nível de gênero apenas.
Assim, os resultados obtidos com esse trabalho reforçam a ideia de que cada uma das
metodologias empregadas favorece a detecção de determinados grupos de bactérias. Desse
modo, para acessar a complexidade das comunidades bacterianas presentes em determinado
ambiente, as abordagens dependentes e independentes de cultivo devem ser utilizadas em
conjunto, já que seus resultados se complementam (McLELLAN et al., 2010; GOMILA et al.,
2006).
Apesar de a legislação vigente utilizar apenas o grupo dos coliformes,a contagem de
bactérias heterotróficas e a dosagem de endotoxinas como indicadores da qualidade
microbiológica da água de hemodiálise e do dialisato, sem exigir a identificação dos micro-
organismos ali presentes, a identificação dos mesmos nos diferentes pontos de purificação da
água possui grande relevância por alguns motivos: (i) auxiliar no estabelecimento da origem
da contaminação, (ii) avaliar os efeitos dos desinfetantes no tratamento da água e(iii) acessar o
risco associado com a presença de determinadas bactérias. Foi visto que a liberação de
citocinas e outros mediadores inflamatórios no sangue dos pacientes pode ser estimulada por
diversas moléculas além das endotoxinas, que podem estar presentes em determinados
gêneros ou espécies, como é o caso dos glicoesfingolipídeos, presentes nos gêneros
Sphingomonas e Novosphingobium, observados nesse estudo. Outra característica que varia
entre os micro-organismos é o conteúdo CG do DNA, que quanto mais elevado, mais ativa a
resposta imunológica do paciente.
Nesse trabalho, foi visto que, apesar das análises microbiológicas da maior parte das
amostras (91,7%) estarem dentro dos limites preconizados pela legislação brasileira no que
diz respeito à presença/ausência de coliformes e contagem de bactérias heterotróficas, foram
identificados micro-organismos potencialmente patogênicos em várias amostras. Isso mostra a
limitação dos indicadores adotados pela legislação vigente para avaliar a qualidade
microbiológica da solução empregada na hemodiálise, que é separada do sangue dos pacientes
apenas por uma membrana semi-permeável.
Através desse estudo, foi possível observar a presença de uma comunidade bacteriana
diversa, englobando muitas bactérias gram-negativas que já estiveram envolvidas em surtos
87
de bacteremias e endotoxemias em clínicas de hemodiálise. Dos gêneros encontrados,
Pseudomonas foi o que esteve presente em um maior número de amostras, sendo detectado
por ambas as metodologias em alguns casos.Dentre as espécies conhecidas pertencentes a esse
gênero, Pseudomonas aeruginosa possui uma importância médica notável por estar
frequentemente associada a infecções em pacientes hospitalizados e/ou imunodeprimidos. Por
esse motivo, associado ao fato de ser uma das espécies mais frequentemente isoladas em
unidades de hemodiálise, alguns países, como Estados Unidos – cuja farmacopéia constitui
um dos compêndios mais reconhecidos mundialmente – e Cuba, adotaram a ausência de P.
aeruginosacomo um dos parâmetros de qualidade para a água de hemodiálise (USP 38-NF 33,
2016; GONZÁLEZ et al., 2014). Além disso,o reconhecimento do risco para os pacientes
também levou à exigência da sua ausência em medicamentos não estéreis dispostos em
preparações de uso tópico (oromucosa, nasal, gengival, cutâneo, auricular), inalatório,
preparação vaginal e dispositivos transdérmicos (ANVISA, 2010).
Portanto, os resultados obtidos nesse trabalhomostram a necessidade de que
osparâmetros microbiológicos adotados pela legislação brasileira vigente para água de
hemodiálise e dialisato sejam revistos. A adoção da espécie P. aeruginosa como parâmetro
adicional poderia agregar maior qualidade e confiabilidade a essas águas.
88
7. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nesse trabalho demonstraram que 100% das amostras coletadas
em diferentes pontos de sistemas de hemodiálise pertencentes à 4 clínicas vinculadas ao
SUSapresentaram conformidade com a legislação vigente em relação à ausência de coliformes
totais e 91,7% em relação aos valores limites de bactérias heterotróficas. As análises
dependentes e independentes de cultivo proporcionaram a identificação de uma diversa
comunidade bacteriana nos diferentes pontos analisados e mostraram ser complementares,
visto que alguns micro-organismos isolados e identificados pelo cultivo não puderam ser
identificados pela abordagem molecular e um número expressivo de bactérias foi identificado
pela abordagem independente de cultivo sem que estas tenham sido apontadas pela
metodologia de cultivo. A identificação de diversas bactérias gram-negativas, especialmente
os gêneros Pseudomonas, Burkholderia e Yersinia, serve como alerta sobre a presença de
micro-organismos potencialmente patogênicos em amostras que apresentam conformidade
com a legislação brasileira.
Dessa forma, para que haja melhoria na qualidade microbiológica da água para
hemodiálise e do dialisato, além do papel das unidades de diálise em realizar um
monitoramento microbiológico frequente e uma desinfecção eficiente dos equipamentos de
diálise, é importante que seja realizada uma revisão da legislação vigente por parte dos órgãos
reguladores e fiscalizadores visando à padronização de metodologias para os ensaios, à
definição de um método mais específico para investigar a existência de contaminação de
origem fecal nessas águas, e à inclusão de parâmetros bioindicadores adicionais, como a
Pseudomonas aeruginosa, que oferece risco aos pacientes renais crônicos e é altamente
prevalente nesses sistemas.
89
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