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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Ariana Alves Rodrigues
Atividade antimicrobiana e produção de enzimas de interesse biotecnológico de
bactérias isoladas de diferentes habitats.
Orientador:
Profº. Dr. José Daniel Gonçalves Vieira
Dissertação de Mestrado
Goiânia – GO, 2009
1
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações
Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de
Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e
Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei
nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura,
impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir
desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a): Ariana Alves Rodrigues
CPF: 01116432102 E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não
Vínculo Empre-
gatício do autor
Não
Agência de fomento: Sigla:
País: UF: CNPJ:
Título: Atividade antimicrobiana e produção de enzimas de interesse biotecnológico de
bactérias isoladas de diferentes habitats.
Palavras-chave: Atividade antimicrobiana, microrganismos, enzimas, bioativas
Título em outra língua: Antimicrobial activity and production of enzymes with
biotechnological interest of bacteria isolated from different habitats.
Palavras-chave em outra língua: Antimicrobial activity, microorganisms, enzymes, bioactive
Área de concentração: Microbiologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 17/03/2009
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical
Orientador(a): José Daniel Gonçalves Vieira
CPF: E-mail: [email protected]
Co-orientador(a):
CPF: E-mail:
3. Informações de acesso ao documento:
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________________________________________ Data: 11/04/2011
Assinatura do(a) autor(a)
1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.
.
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
Ariana Alves Rodrigues
Atividade antimicrobiana e produção de enzimas de interesse biotecnológico de
bactérias isoladas de diferentes habitats.
Orientador:
Profº. Dr. José Daniel Gonçalves Vieira
Dissertação submetida ao CPGMT/IPTSP/UFG,
como requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre, na área de concentração de Microbiologia.
Goiânia – GO, 2009
.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)
GPT/BC/UFG
R696a
Rodrigues, Ariana Alves.
Atividade antimicrobiana e produção de enzimas de
interesse biotecnológico de bactérias isoladas de diversos
habitats [manuscrito] / Ariana Alves Rodrigues. - 2009.
xv, 68 f. : il., figs, tabs.
Orientador: Prof. Dr. José Daniel Gonçalves Vieira.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2009.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas.
Apêndices.
1. Atividade antimicrobiana 2. microrganismos 3.
enzimas I. Título.
CDU:579.222
Agradecimentos
Agradeço a Deus, por permitir esta conquista em minha vida;
Agradeço aos meus pais, Rui e Laide, e minhas tias Maria e Janayna pelo amor e incentivos
constantes;
Agradeço ao Profº José Daniel Gonçalves Vieira pelas oportunidades de aprendizado, pela
confiança, pelos seus conselhos e amizade;
Agradeço ao Profº Ruy de Souza Lino Junior pelo incentivo inicial;
Agradeço aos Professores André Kipnis, Maria Cláudia, Wilia Marta e Geraldo Sadoyama por
serem sempre prestativos e pela ajuda em diversos momentos;
Agradeço a Keili Souza pela ajuda inestimável e amizade;
Agradeço aos amigos Natalia Carvalhaes, Fernando Vaz e Petain Neto pela amizade, ajuda e
pelos momentos que jamais serão esquecidos;
Agradeço aos amigos da Microbiologia Ana Claúdia, Alessandra, Lorena e Camila pela
agradável companhia durante o curso;
Agradeço a amiga Denise pelo incentivo;
Agradeço a Lêda Maria A. Valadão pelo apoio técnico durante o desenvolvimento deste
trabalho;
Agradeço aos funcionários José Clementino e Kariny Soares pelo constante auxílio e apoio de
ordem administrativa;
Agradeço a Capes pela bolsa de mestrado concedida e ao IPTSP pelo apoio financeiro;
Agradeço todos que de alguma forma colaboraram para que este trabalho tivesse êxito e fosse
realizado.
Muito Obrigada!
i
ii
Sumário
Lista de tabelas iv
Lista de figuras v
Lista de Abreviaturas vi
Resumo vii
Abstract viii
1. Introdução 01
1.1. Diversidade microbiana em diferentes habitats e aplicações biotecnológicas 02
1.1.1. Diversidade microbiana em vegetais 03
1.1.1.1.Microrganismos endofíticos 03
1.1.1.2. Azadirachta indica A. JUSS (Nim) 05
1.1.2. Microrganismos de solo 06
1.1.2.1.Actinomicetos 07
1.1.3. Microrganismos de caverna 09
1.2. Produção de biomoléculas 11
1.2.1. Enzimas 12
1.2.1.1. Amilases 12
1.2.1.2. Celulases: endoglucanases e β-glucosidades 13
1.2.1.3. Esterases e lipases 14
1.2.1.4. Pectinases 14
1.2.1.5. Proteases 15
1.2.2. Produção de Substâncias Antimicrobianas 15
1.2.2.1.Bacteriocinas 17
1.2.2.2 Bacteriocinas de bactérias gram-positivas 17
1.2.2.3. Modo de ação das bacteriocinas de bactérias gram-positivas 18
1.3. Importância da bioprospecção de microrganismos produtores de
biomoléculas em diferentes habitats
19
2. Objetivos 22
3. Material e Métodos 23
3.1. Determinação da atividade antimicrobiana de endofíticos isolados de Nim e
do isolado de caverna.
24
3.1.1. Produção de extrato. 24
3.1.2. Determinação da atividade antimicrobiana dos isolados 25
3.2. Determinação da atividade enzimática de endofíticos isolados de Nim e do 25
iii
isolado de caverna.
3.2.1. Produção de Amilases. 25
3.2.2. Produção de celulases 26
3.2.3. Produção de endoglucanases 26
3.2.4. Produção de esterases e lipases 26
3.2.5. Produção de pectinases 26
3.2.6. Produção de proteases 27
3.2.7. Produção de ß- glucosidases 27
3.3. Determinação da atividade antimicrobiana de actinomicetos isolados de Nim
e de solos do cerrado e Mata Atlântica.
27
3.3.1. Determinação da atividade antimicrobiana dos actinomicetos - Técnica dos
“Plugs”.
27
3.3.2. Produção da substância com ação antimicrobiana e extração da substância
bioativa de actinomicetos.
28
3.3.3. Determinação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico final dos
isolados – Técnica de difusão em poço.
28
3.4. Atividade citotóxica frente à Artemia salina. 29
4. Resultados 30
4.1. Determinação da atividade antimicrobiana de endofíticos isolados de Nim e
do isolado de caverna.
31
4.2. Determinação da atividade antimicrobiana dos actinomicetos - Técnica dos
“Plugs”.
32
4.3. Determinação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico final dos
isolados actinomicetos – Técnica de difusão em poço.
33
4.4. Atividade citotóxica frente à Artemia salina. 33
4.5. Determinação da atividade enzimática de endofíticos isolados de Nim e do
isolado de caverna.
34
5. Discussão 37
6. Conclusões 43
8. Referências bibliográficas 45
9. Anexos 64
iv
Lista de tabelas
Tabela 1. Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos de endofíticos e
isolado de caverna frente às bactérias indicadoras.
31
Tabela 2. Avaliação da atividade antimicrobiana de actinomicetos frente às
bactérias indicadoras.
34
Tabela 3. Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico final dos
isolados actinomicetos frente às bactérias indicadoras.
35
Tabela 4. Dosagem letal média (DL50) dos diferentes extratos obtidos do
crescimento das bactérias analisadas.
36
Tabela 5. Índice Enzimático para as enzimas avaliadas. 36
v
Lista de figuras
Figura 1: Mecanismo de ação proposto para as bacteriocinas produzidas por
bactérias gram-positivas.
28
Figura 2. Atividade antimicrobiana dos extratos aquosos das bactérias endofíticas
de NIM e do isolado de caverna frente à S. aureus ATCC 25923.
32
Figura 3. Atividade antimicrobiana do crescimento em “plugs” de diferentes
actinomicetos frente à S. aureus ATCC 25923.
33
Figura 4. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólico final dos diferentes
isolados de actinomicetos frente à MRSA.
35
vi
Lista de Abreviaturas
AN Agar Nutriente
ATCC American Type Culture Collection (USA)
BHI Brain Heart Infusion
CTAB Brometo de cetiltrimetil amônio
DL50 Dosagem que mata 50 % dos animais experimentais
DNA Ácido Desoxirribonucléico
IE Índice enzimático
ISP-2 Ágar International Streptomyces Project
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
Kb Quilobase (10³ bases)
kDa Kilodalton
LAB Bactérias ácido láticas
MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistente
NIM Azadirachta indica A. JUSS
µL Microlitros
mL Mililitros
mm Milímetro
ppm Partes por milhão
rpm Rotação por minuto
TOC/L Carbono orgânico total por litro
vii
Resumo
Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente e contribuem para a estabilidade de
ecossistemas, participando de processos ecológicos básicos como os ciclos biogeoquímicos e
cadeias alimentares, muitas vezes mantendo relações ecológicas com outros organismos.
Desta forma há uma diversidade de microrganismos e conseqüentemente de moléculas
bioativas que eles produzem como resultado do metabolismo primário e secundário, que têm
sido amplamente utilizadas pelo homem em diversas atividades de importância sócio-
econômica, que incluem a busca por novos fármacos e por enzimas de interesse
biotecnológico. Este estudo analisou microrganismos isolados de diferentes habitats com o
objetivo de selecionar microrganismos com habilidade de inibir o crescimento de
microrganismos patogênicos e que sejam produtores de enzimas com importância
biotecnológica. Os isolados tiveram sua atividade antimicrobiana e enzimática avaliadas,
substâncias biotivas extraídas e a atividade citotóxica frente à Artemia salina determinada.
Dos isolados avaliados a maior parte demonstrou ser produtora de substâncias com atividade
antimicrobiana frente as bactérias gram-positivas avaliadas, sendo que nenhum isolado
demonstrou ser tóxico em baixas concentrações. Os isolados demonstraram predomínio na
produção de esterases e β-glucosidases. Embora os isolados descritos neste estudo pertençam
a quatro ambientes distintos: solo de Cerrado e Mata Atlântica, Azadirachta indica A. JUSS
(Nim) e ambiente cavernícola e estejam sujeitos a condições ambientais distintas, a maior
parte dos isolados obtidos mostrou-se capaz de produzir substâncias com aplicações
biotecnológicas, fato que sugere um grande potencial por parte dos microrganismos em
produzir moléculas bioativas que possam ser empregadas na indústria e medicina.
Palavras chave: Atividade antimicrobiana, microrganismos, enzimas, bioativas.
viii
Abstract
The microorganisms are essential for the environment and contribute to stabilize the
environments, playing a hole in the basic ecologic process such as biogeochemistry cycles
and food chains, and sometimes responsible for the maintenance of the ecologic relationship
between the organisms. So we have a diversity of microorganism and in consequence
bioactive molecules that they produce as a result of primary and secondary metabolism, and
are used by humans in many important social-economic activities, which includes the search
for new medicines and new enzymes with biotechnology interest. This study analyzed
different microorganisms isolated from different habitats, and the objective was select
microorganisms with the capacity of inhibit the growing of pathogenic microorganisms and
that produces enzymes with biotechnological applications. The isolates antimicrobial and
enzymatic activities were evaluated, bioactive substances extracted and the cytotoxic activity
with Artemia salina determined. The biggest part of the isolates produces substances with
antimicrobial activity for the evaluated gram-positives, and none are toxic in low levels. The
isolates are great producers of esterases and β-glucosidades. The isolates described in this
study are from four different environments: Cerrado soil, Mata Atlântica, Azadirachta indica
A. JUSS (Nim) e cave environment and are related to unique environmental conditions, the
majority part of the isolates are able to produce molecules with biotechnology activity, this
suggests a great microbial potential for the production of bioactive molecules that can be used
in industries and medicine.
Key Words: Antimicrobial activity, microorganisms, enzymes, bioactive.
1. Introdução
2
1. Introdução
1.1. Diversidade microbiana em diferentes habitats e aplicações biotecnológicas
O domínio Bacteria engloba uma grande diversidade de microrganismos que são
capazes de utilizar diversas fontes energéticas, apresentando inúmeras vias metabólicas e
habilidade em produzir e degradar diversos compostos orgânicos e inorgânicos. Esses
microrganismos, ao longo de sua evolução adaptaram-se aos mais diversos climas e
microambientes, colonizando de ambientes inóspitos a ambientes amplamente ricos em
nutrientes (Glazer & Nikaido 2007).
Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente e contribuem para a
estabilidade de ecossistemas, participando de processos ecológicos básicos como os ciclos
biogeoquímicos e cadeias alimentares, muitas vezes mantendo relações ecológicas com outros
organismos (Pace 2002). São vários os exemplos da utilização de recursos microbianos pelo
homem em diversas atividades de importância sócio-econômica:
. Na área médica, produção de diversos compostos bioativos incluindo antiparasitários,
antimicrobianos e antitumorais;
. Na área industrial, os microrganismos são empregados na produção de compostos
comerciais ou para transformação de substratos em produtos de maior valor agregado, ex:
etanol, acetona, propanol, plástico biodegradável;
. Na agricultura, destacam-se os microrganismos fixadores de nitrogênio e os
empregados no controle biológico de pragas e vetores;
. Na área de alimentos, são empregados na produção de bebidas, panificação, queijos,
ácidos orgânicos, enzimas, dentre outros;
. Na área ambiental, as perspectivas de recuperação do meio ambiente através da
biorremediação são bastante promissoras (Kurtböke et al. 2004).
A diversidade dos microrganismos e das moléculas que eles produzem como resultado
do metabolismo primário e secundário, bem como a conservação dos recursos genéticos que
eles fornecem são essenciais na sua utilização nos processos biotecnológicos (Hunter 1998).
Os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a diversidade
microbiana são extensos, incluindo, a melhor compreensão das funções exercidas pelas
comunidades microbianas nos ambientes e o conhecimento das suas interações com outros
componentes da biodiversidade. As aplicações biotecnológicas estão relacionadas com a
descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis em processos para a obtenção de
3
novos antibióticos, antitumorais e outros agentes terapêuticos, probióticos, produtos químicos,
enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, biorremediação de poluentes,
biolixiviação e recuperação de minérios. Outros benefícios incluem o prognóstico e prevenção
de doenças emergentes em seres humanos, animais e plantas, e a otimização da capacidade
microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das águas (Colwell 1997).
1.1.1. Diversidade microbiana em vegetais
Os vegetais constituem um verdadeiro ecossistema microbiano, formado por
diferentes nichos nas superfícies das raízes e folhas, ou então, colonizando o interior de
diversos tecidos vegetais, observa-se a presença de fungos, bactérias e vírus que mantém
relações ecológicas entre si e com o vegetal (Hallmann et al. 1997).
As bactérias que vivem no interior dos vegetais podem ser classificadas em dois
grupos, com base na sua relação com o hospedeiro. O primeiro grupo é o das bactérias
endofíticas que são geralmente definidas como aquelas que vivem no interior das plantas sem
causar danos visíveis (Hallmann et al. 1997). As bactérias fitopatogênicas habitam o interior
dos vegetais e podem causar doenças, trazendo prejuízo ao seu hospedeiro. Essa diferenciação
não é definitiva, uma vez que a relação benéfica ou patogênica depende de fatores como as
condições ambientais ou do equilíbrio com as outras populações bacterianas. Sendo assim,
uma bactéria endofítica pode, dependendo das condições, tornar-se um patógeno. Ou ainda,
uma epífita (que vivem na superfície do vegetal) pode entrar na planta, tornando-se endofítica
ou patogênica (Kloepper 1992; Andrews & Harris 2000; Sabaratnam & Beattie 2003).
1.1.1.1 Microrganismos endofíticos
Microrganismos endófitos são todos os microrganismos capazes de colonizar, em
alguma fase do seu ciclo de vida, tecidos vegetais das partes aéreas, sem causar danos à planta
hospedeira (Petrini 1991). De forma mais objetiva são microrganismos isolados de tecidos
vegetais desinfectados superficialmente ou isolados de partes internas das plantas (Hallmann
et al. 1997), e que não causam danos ao seu hospedeiro. Mais recentemente, endófitos foram
definidos como sendo todo microrganismo capaz de colonizar internamente os tecidos da
planta hospedeira, sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis (Azevedo et al.
2000).
4
Conceitualmente até o final da década de 70 do século passado, os microrganismos
endofíticos foram considerados assintomáticos, não produziriam efeitos benéficos ou
prejudiciais aos seus hospedeiros. Porém, estudos posteriores revelaram propriedades de
interesse, como proteção contra predadores e patógenos. Atualmente, atribuem-se outras
características importantes a estes organismos, como o aumento da resistência a condições de
estresse, alteração em propriedades fisiológicas, produção de fitormônios, toxinas, fármacos
(como antibióticos), imunossupressores, antitumorais, e compostos de interesse
biotecnológico, como enzimas (Azevedo 1998; Azevedo et al. 2000; Stamford et al. 2001;
Stamford et al. 2002; Suto et al. 2002; Strobel 2003; Carrim et al. 2006).
Espera-se que grande parte dos vegetais seja colonizada por endofíticos e que haja
diversas espécies coexistindo em um único hospedeiro. Microrganismos dominantes são
aqueles que aparecem mais freqüentemente em determinado tipo de vegetal, já espécies mais
raras são chamadas de secundárias. (Pereira et al. 1993; Glienke 1995; Azevedo 1998). A
ocorrência de endófitos varia bastante de acordo com o clima da região onde se encontra. A
maioria dos estudos descreve a microbiota de vegetais isolados de regiões de clima temperado,
que se revela bastante diversa das espécies encontradas em regiões tropicais, tanto em termos
quantitativos quanto qualitativos (Rodrigues & Petrini 1997).
Os microrganismos endofíticos entram na planta, primariamente através da raíz,
entretanto, partes aéreas, como as flores, caules e cotilédones podem também ser portas de
entrada usadas. Dentro da planta, essas bactérias podem se localizar no ponto de entrada ou se
dispersar de forma sistêmica (Hallmann et al. 1997; Zinniel et al. 2002). Sua penetração pode
ser de forma ativa nos tecidos de plantas pelo uso de enzimas hidrolíticas como celulases e
pectinases, aberturas naturais ou provocadas por injúrias (Quadt-Hallmann et al. 1997). O
modo de dispersão das bactérias endofíticas pode ser via: sementes, propagação vegetativa,
partes mortas do vegetal ou insetos (Baldani et al. 1997).
O fato dos endofíticos serem capazes de colonizar os tecidos internos das plantas,
confere vantagens sobre outros microrganismos por poderem sobreviver em um ambiente
mais uniforme onde são menos afetados pela temperatura, potencial osmótico e radiação ultra-
violeta (Lodewyckx et al. 2002). As interações endófitos/plantas ainda não são muito bem
compreendidas, mas podem ser simbióticas, neutras ou antagônicas. Nas interações
simbióticas, os microrganismos produzem ou induzem a produção de metabólitos primários e
secundários que podem conferir diversas vantagens às plantas tais como: a diminuição da
herbíviria e do ataque de insetos, o aumento da tolerância a estresses abióticos e o controle de
outros microrganismos (Pereira 1993; Rodrigues & Dias Filho 1996). Em alguns casos, eles
5
também podem acelerar o aparecimento da muda e promover o estabelecimento do vegetal
sobre diversas condições (Chanway 1997), além de aumentar seu crescimento e
desenvolvimento (Bent & Chanway 1998).
Por ocuparem um nicho ecológico semelhante àqueles ocupados por patógenos, as
bactérias endofíticas apresentam grande potencial para o controle biológico. Este controle
pode ser resultante de diversos mecanismos: competição por espaço e nutrientes na planta
hospedeira; produção de compostos antimicrobianos (Pleban et al. 1997; Bacon & Hilton
2002 e Taechowisan et al. 2003); indução de resistência sistêmica (M'Piga et al. 1997;
Benhamou et al. 1998; Lodewyckx et al. 2002) ou produzindo enzimas (quitinases ou
celulases) que degradam a parede celular de fungos patogênicos (Pleban et al. 1997; El-
Tarabily 2003).
A maioria dos estudos brasileiros sobre endofíticos está centrado em vegetais
aplicados na agricultura, visando o aumento da produtividade do vegetal (Azevedo 1998). Há
poucos estudos relacionando a atividade antimicrobiana de plantas e endofíticos. Em nosso
país há diversas plantas com atividade antimicrobiana comprovada, tais como o Nim indiano
e que não há estudos relacionando até que ponto essa atividade antimicrobiana está
relacionada aos microrganismos endofíticos.
1.1.1.2 Azadirachta indica A. JUSS (Nim)
Azadirachta indica A. JUSS conhecida popularmente como Nim, Neem ou margosa, é
originaria da Índia e tem diversas aplicações como planta na tradicional medicina indú (no
tratamento de inflamações, infecções virais, hipertensão e febre), planta sombreadora,
repelente, material para construção, combustível, lubrificante, adubo e mais recentemente
como praguicida (Schumutterer 1990; Locke 1995). Devido à baixa toxicidade e larga
distribuição na natureza, o Nim pode ser considerado como uma valiosa fonte para uso na
medicina tradicional e no desenvolvimento de drogas modernas. Em geral, os efeitos
benéficos de produtos naturais, como o Nim podem ser atribuídos a um ou mais compostos
fitoquímicos, incluindo antioxidantes, flavonóides e outras substâncias (Locke 1995). Apesar
da exata composição do extrato de Nim não ter sido determinada, os componentes da folha
solúveis em água têm provado ser eficazes no controle de várias doenças, incluindo câncer
(Balasenthil et al. 1999; Baral & Chattopadhyay 2004). Na literatura, têm sido descritas
atividades anti-sépticas, curativas, antiúlcera, antiinflamatória, antimicrobiana, anticonceptiva
hipolipidêmica e hepatoprotetora. Estudos envolvendo o uso de extrato de folhas de Nim em
6
formulações de gel dental mostram redução da placa bacteriana; folhas têm sido utilizadas no
tratamento de gengivites e periodontites (Chattopadhyay 1999).
O Nim é capaz de se proteger contra grande número de pragas por meio de uma
grande quantidade de compostos bioativos. Os compostos bioativos presentes no Nim são
encontrados em toda a planta, todavia aqueles presentes nas sementes e folhas são os que
estão mais concentrados e acessíveis, facilmente obtidos por meio de processos de extração
em água e solventes orgânicos como hidrocarbonetos, álcoois, cetonas ou éteres (Lee et al.
1988; Martinez 2002). Apesar de os efeitos de produtos à base de Nim serem bastante
conhecidos no controle de insetos, podem também atuar sobre outros organismos como os
nematóides (uma das pragas mais devastadoras na agricultura), caramujos (especialmente
Biomphalaria glabrata, auxiliando no controle da esquistossomose), crustáceos (que
prejudicam culturas de arroz por utilizarem as mesmas fontes de nitrogênio), viroses de
plantas e fungos (Locke 1995; Martinez 2002).
É utilizado na descoloração de corantes têxteis sintéticos: o resíduo da casca de Nim
(rico em lignina e outros compostos fenólicos) é empregado para produção de lignina
peroxidase por Phanerochaete chrysosporium sob fermentação sólida (Verma & Madamwar
2002). O pó de suas folhas tem sido utilizado com eficácia para remoção do corante verde
brilhante presente em soluções aquosas, como uma alternativa ao uso de carvão ativado
(Bhattacharyya & Sarma 2003).
Sua casca tem sido investigada como bioabsorvente na remediação ambiental dos
metais pesados tóxicos Cd2+
, Hg2+
, e Cr3+
, em pequenas concentrações, a partir de lixo aquoso
com resultados positivos. Produtos de Nim também têm sido utilizados na remoção de amônia
a partir de água salobra. A casca da árvore é também utilizada no preparo de corantes, usados
no tingimento de tecidos finos. O Nim se mostra resistente aos gases poluentes, tolerante à
seca e ao dióxido de enxofre e atua na redução da erosão do solo e purificando o ar (Tiwari et
al.1999; Amirthalingam 2001).
1.1.2. Microrganismos de solo
Os microrganismos do solo são essenciais no funcionamento de diversos ecossistemas
através dos vários processos de transformação de nutrientes e degradação da matéria orgânica.
Através da degradação de diferentes elementos ocorrem transformações em uma variedade de
biomoléculas e vários metabólitos secundários são liberados (Hackl et al. 2004; Dubey et al.
7
2006). Durante o processo, normalmente ocorre a liberação de CO2 para atmosfera e
oscilações no balanço do nitrogênio do solo (Nuernberg et al. 1984).
A real dimensão da diversidade microbiana dos solos é ainda desconhecida. Estima-se
que o número global de células procarióticas no solo é de 4.5-6.6x1030
e que
aproximadamente 4,5-6,5% dos procariotos vivam nos solos (Whitmore et al. 1996).
Os microrganismos do solo são fontes de pesquisa para produção de produtos naturais
tais como antibióticos, antitumorais, componentes antifúngicos, antiparasitários, inseticidas e
promotores de crescimento. Os actinomicetos correspondem a um grupo de bactérias
filamentosas e estão associados a produção de diversas biomoléculas de interesse
biotecnológico (Xu 2006). Estima-se que cerca de 30% da população que habita os solos
corresponde aos actinomicetos (Kennedy 1999). Destes, 80% habitam a camada mais
superficial do solo (0-10 cm), diminuindo progressivamente com a profundidade (Iwai &
Takahashi 1992).
1.1.2.1. Actinomicetos
Actinomicetos compreendem um grupo heterogêneo de bactérias filamentosas
filogeneticamente classificadas como bactérias gram-positivas, que em seu crescimento,
formam redes de filamentos ramificados (Ensign 1978). São microrganismos aeróbios,
entretanto alguns gêneros são anaeróbios facultativos ou obrigatórios (Kennedy 1999). Estão
amplamente distribuídos na natureza, sendo encontrados em vários hábitats, como na água,
plantas em decomposição, nódulos de raízes das plantas, como endofíticos, sedimentos, lodo
ativado, fezes de animais e produtos alimentícios, porém seu hábitat principal é o solo
(McCarthy & Williams 1990). Sua ocorrência em ambientes aquáticos pode estar relacionado
a processos de lixiviação do solo (Iwai & Takahashi 1992).
A composição de bases nucléicas dos actinomicetos apresenta elevada proporção de
citosina e guanina, que varia de 63 a 78 % (Madigan et al. 2000). Seu genoma, de forma geral
é maior que o das demais bactérias não pertencentes ao grupo tendo cerca de 10,5.103 kb, que
é, aproximadamente, três vezes maior que de outras bactérias como Escherichia coli ou
Bacillus subtilis (Chater & Hopwood 1984). Os estreptomicetos, assim como outros
actinomicetos, apresentam uma forma característica de instabilidade genética. Várias
características, como formação de micélio aéreo e de esporos, produção de antibiótico e
resistência, são irreversivelmente perdidas em uma freqüência de 0,1 a 1 % na progênie de
8
colônias plaqueadas. Esta perda de função é resultado de deleção de grandes regiões do DNA
(Lancini & Lorenzetti 1993).
A diversidade morfológica dos actinomicetos está baseada primeiramente nas suas
estratégias reprodutivas as quais levam à formação de uma variedade de estruturas de esporos,
como artrósporos em Streptomyces, endósporos dos Thermoactinomyces, aleuriósporos
característicos do gênero Micromonospora e os zoósporos móveis como em Oerskovia,
Geodermatophilus e Kitasatoa (Ensign 1978).
A grande diversidade microbiana e em particular a população de actinomicetos que
ocorre em habitats naturais, pode muitas vezes ser alterada pela atividade do homem através
do uso de compostos químicos. Solos tratados com clordane levam à prevalência de
actinomicetos do gênero Nocardiopsis. Ambientes enriquecidos com lodo ativado levam a
predominância do gênero Micromonospora (Percich & Lockwood 1978; Orchard &
Goodfellow 1980). Os actinomicetos são essenciais na decomposição dos compostos
orgânicos e dos poluentes ativos na natureza, degradando materiais orgânicos no solo,
incluindo a lignina e outros polímeros (Groth et al. 1999). São importantes degradadores de
pesticidas tais como: organoclorados, triazinas simétricas, triazinonas, carbamatos e
acetanilidas podendo ocorrer à utilização destes compostos como única fonte de carbono e
energia para o seu metabolismo (Schrijver et al. 1999).
Os actinomicetos também produzem inúmeros compostos químicos como a tiamina, a
riboflavina, a vitamina B12 (cianocobalamina), as flavoproteínas, várias porfirinas, as quais
contêm compostos com ferro, e coenzimas que podem promover ou inibir o crescimento de
outros organismos (Kennedy 1999).
Os Streptomyces destacam-se entre os actinomicetos pela capacidade de produzir uma
grande variedade de enzimas com aplicação industrial como as oxidoredutases, transferases,
hidrolases, liases, isomerases e sintases. No meio ambiente eles desempenham uma função
importante na formação do húmus, pela produção de enzimas extracelulares usadas na
degradação de compostos celulolíticos (Padilha 1998). Além disto, produzem cerca de 75%
dos antibióticos comercialmente importantes (Miyadoh 1993). Esses microrganismos
apresentam um ciclo de vida complexo, que se inicia com a germinação do esporo, dando
origem a um micélio formado por hifas ramificadas que penetram no substrato, metabolizando
fontes orgânicas (polissacarídeos, proteínas, lipídeos e compostos aromáticos) pela ação de
enzimas extracelulares (Padilla 1998). Esse micélio vegetativo (hifas primárias) dá origem ao
micélio aéreo (hifas aéreas). As hifas aéreas passam por um processo de diferenciação
morfológica que pode incluir septação e formação de esporos (Chater 1989). Nessa fase,
9
ativa-se o metabolismo secundário, em que são produzidos principalmente antibióticos e
pigmentos (Chater 1989; Demain 1989; Bibb 1996).
Os gêneros Nocardia e Rhodococcus são componentes da microbiota do solo
decompondo compostos químicos prejudiciais ao meio ambiente. O gênero Rhodococcus
desempenha importante papel nos processos de biorremediação e biodegradação. Sendo
encontrado em ambientes contaminados com hidrocarbonetos ou outros compostos químicos.
Os membros deste gênero conseguem degradar poluentes hidrofóbicos porque as suas células
aderem às interfaces água/óleo. Este fato ocorre devido ao grupo possuir cadeias alifáticas de
ácidos micólicos na sua parede celular. Além disso, desempenham importante papel na
imobilização de metais pesados e na produção de surfactantes, amidos e polímeros (Bell et al.
1998).
Outro membro nocardioforme, Rhodococcus coprophilus, conhecido como coprofílico,
ocorre em esterco animal. A presença deste actinomiceto em rios e lagos é um indicador da
contaminação fecal por animais herbívoros. Os estudos ecológicos mostram que este
actinomiceto sobrevive à passagem através do rúmen e intestino dos animais poligástricos
atingindo as fezes onde ocorre o seu crescimento (Rowbotham & Cross 1977; Mara & Oragui
1981).
1.1.3. Microrganismos de caverna
As cavernas são consideradas ambientes pobres em nutrientes, nas quais a
concentração de carbono orgânico fica abaixo de 0.5 mg de TOC/L (carbono orgânico total
por litro), entretanto encontramos uma população de microrganismos de aproximadamente
106 celulas/grama de material rochoso, diversa e metabolicamente versátil, que obtêm energia
por diversos meios, incluindo a quebra de compostos aromáticos, fixação de gases e oxidando
metais presentes nas rochas (Barton & Jurado 2007; Porter 2007).
Nas cavernas diferentes microambientes podem ser habitados pelos microrganismos. A
comunidade pode assim diferir devidos as diferentes condições de umidade, temperatura
baixa e estável, a natureza dos recursos nutricionais e o pH (Mulec et al. 2002; Engel 2007).
As cavernas podem ser habitadas por microrganismos transitórios ou residentes. Os
microrganismos transitórios são aqueles que entram nas cavernas através das correntes de ar,
pelo fluxo de água, fluxo de sedimentos, em insetos, nos morcegos ou pelo homem. Qualquer
organismo ou objeto que entre em uma caverna carrega microrganismos (Barton e Northup
2007).
10
Os microrganismos residentes para sobreviverem dependem exclusivamente dos
nutrientes que estão distribuídos na caverna, diferente dos transitórios que desenvolvem-se
apenas enquanto houver disponibilidade de matéria orgânica (Barton e Northup 2007; Engel
2007).
Os microrganismos que utilizam carbono orgânico como fonte de energia são
chamados de quimioheterotróficos. Depósitos de guano, água corrente e madeira propiciam
um rico material orgânico para os microrganismos principalmente os fungos. A maioria dos
fungos achados em cavernas ajusta-se a este quadro e são provavelmente transitórios.
Bactérias também podem ser encontradas como transitórios. Porém, pesquisas atuais
demonstraram que a maioria dos microrganismos nativos em cavernas são bactérias (Barton e
Northup 2007).
Esporos de fungos e bactérias são normalmente encontrados no filme de água que se
forma na superfície da rocha calcária e de espeleotemas (estalactites, estalagmites, esnotites,
etc) de calcita e podem contribuir na sua formação e degradação. Esta formação pode ser
devida a precipitação extracelular do carbonato de cálcio mediada pelo metabolismo das
bactérias (Engel et al. 2004; Barton & Luiszer 2005; Baskar et al. 2005; Baskar et al. 2006).
Pouco se sabe sobre a distribuição, dinâmica populacional e biogeoquímica dos
microrganismos das cavernas e grutas (Northup & Welbourn 1997; Northup & Lavoie 2001;
Geric et al. 2004; Northup & Lavoie 2004). A presença de bactérias quimiolitotróficas em
cavernas é usualmente correlacionada com o aumento da diversidade de organismos nestes
ambientes (Geric et al. 2004; Engel 2007). Este conhecimento freqüentemente baseia-se em
estudos dependentes do cultivo microbiano, que subestimam a diversidade por incapacidade
de cultivar muitos dos microrganismos (Hugenholtz et al. 1998; Mulec et al. 2002, Engel
2007).
Estudos independentes do cultivo microbiano são necessários para compreender a sua
diversidade. Estudos preliminares efetuados em cavidades vulcânicas dos EUA demonstraram
grande diversidade microbiana, incluindo novos organismos. Os actinomicetos, uma das
principais fontes de antibióticos, são os microrganismos mais abundantes nestas grutas (Groth
et al. 1999).
Bactérias e fungos que habitam cavernas são importantes por várias razões. Devido ao
seu longo isolamento em relação à superfície e pelo seu crescimento em ambientes com baixa
concentração de nutrientes, alguns microrganismos presentes em caverna, parecem ter
evoluído para a produção de biomoléculas especializadas, ou toxinas, que são antagônicas a
11
outros. Estas biomoléculas microbianas podem ser úteis aos humanos no combate a doenças
e/ou poluição (Kambesis 2007; Portillo et al. 2008).
Nosso conhecimento do mundo microbiano em geral é limitado e nosso conhecimento
da diversidade microbiana de cavernas é ainda mais limitada. Assim, o potencial existente
para a descoberta de novos microrganismos e mesmo de microrganismos já conhecidos com
novas atividades e funções em cavernas é imenso. A investigação de tais organismos pode
prover novos detalhes sobre as relações evolutivas de bactérias e fungos (Barton e Northup
2007; Kambesis 2007).
O estudo de microrganismos em cavernas também é importante para a elucidação a
formação dos espeleotemas. Embora haja boas evidências que os microrganismos estejam
envolvidos na formação de ferro e óxidos de manganês, compostos de enxofre, depósitos de
salitre e carbonato de cálcio, elas ainda são limitadas (Barton e Northup 2007; Kambesis
2007).
1.2. Produção de biomoléculas
O metabolismo primário é composto pelas atividades metabólicas que visam o
crescimento celular. Os metabólicos produzidos, denominados metabólicos primários, têm por
objetivo principal a geração de energia para as células. O metabolismo secundário inclui a
síntese de compostos que não são essenciais ao crescimento celular, sendo denominados
metabólicos secundários e são sintetizados na fase final de crescimento ou durante a fase
estacionária. O metabolismo secundário pode ser observado em plantas, microrganismos,
tanto procariotos quanto eucariotos e, até mesmo, em alguns animais, como artrópodes e
insetos (Vining 1986).
O interesse pelos metabólitos secundários justifica-se pela grande variedade de
atividade biológica destes compostos, podendo ser empregados como antimicrobianos,
antitumorais, antiparasitários, inibidores de enzimas e pigmentos, entre outras aplicações
(Vining 1986). A maioria dos metabólitos secundários são moléculas orgânicas complexas
que requerem um grande número de reações enzimáticas para a sua síntese, reações estas que
não fazem parte do metabolismo primário. Entretanto, as vias metabólicas do metabolismo
secundário requerem precursores gerados pelo metabolismo primário, por exemplo, alguns
aminoácidos são precursores para a biossíntese de antibióticos β-lactâmicos, como a
penicilina (O‟Sullivan & Sykes 1986).
12
1.2.1. Enzimas
Enzimas são catalisadores de reações químicas, envolvendo reações com substratos
orgânicos e inorgânicos. As enzimas geralmente são de natureza protéica, altamente
específicas e apresentam grande poder catalítico. São bastante ativas, versáteis e executam
uma variedade de transformações de modo seletivo e rápido, em condições brandas de reação.
As enzimas não requerem altas temperaturas e valores extremos de pH. Além disso, a
atividade enzimática pode ser regulada com relativa facilidade, bastando modificar a natureza
do meio de reação, como, por exemplo, a alteração do pH ou a adição de algum efetor. Toda
enzima, em razão da sua grande especificidade, catalisa as transformações moleculares sem
ocorrência de reações paralelas indesejáveis que são comuns em sínteses químicas.
Consequentemente, os processos industriais que empregam enzimas são, em geral,
relativamente simples, fáceis de controlar, energeticamente eficientes e de baixo custo (Wong
& Whitesides 1994).
As enzimas são amplamente utilizadas nas indústrias de alimentos, farmacêuticas, de
detergentes, têxteis e cosméticas. As propriedades hidrolíticas de enzimas como proteases,
amilases e lipases podem favorecer o desenvolvimento das tecnologias de produção de
combustíveis líquidos (álcool, biodiesel), solventes, plásticos biodegradáveis, bem como
produtos de química fina como corantes, defensivos agrícolas, sabores, fragrâncias e produtos
farmacêuticos para uso humano e veterinário, a partir de matérias primas renováveis,
processos menos agressivos, economicamente viáveis e ecologicamente aceitáveis (Barreto
1997; Lima 1997).
1.2.1.1. Amilases
As amilases são responsáveis pela degradação da molécula de amido e estão
amplamente distribuídas na natureza. O amido é encontrado principalmente em sementes de
cereais como milho, cevada, trigo e arroz e em tubérculos ou raízes como batata e mandioca.
O tamanho e forma dos grãos de amido são específicos para cada vegetal (Moraes 2004). O
amido é o mais importante polissacarídeo de reserva do reino vegetal possuindo em sua
constituição amilose (25%) e amilopectina (75%), que são polímeros constituídos de glucose
(Buléon et al. 1998).
As amilases apresentam grande importância biotecnológica, como aplicações nas
indústrias têxteis, papel e celulose, de couro, detergentes, cervejas, bebidas destiladas,
13
panificação, cereais para alimentação infantil, liquefação e sacarificação do amido, ração
animal, indústria química e farmacêutica. Apesar de derivarem de diversas fontes, incluindo
plantas, animais e microrganismos, as enzimas microbianas geralmente encontram grande
demanda industrial, por serem de fácil extração e manejo. Atualmente, grandes quantidades
de amilases microbianas estão disponíveis comercialmente e têm aplicação quase completa na
hidrólise do amido em indústrias de processamento do amido (Gupta et al. 2003; Pandey et al.
2005).
1.2.1.2. Celulases: endoglucanases e β-glucosidades
A celulose é um dos biopolímeros mais abundantes e pode ser hidrolisada, através do
rompimento das ligações glicosídicas de suas microfibrilas, tendo como produto final a
glucose (Bayer & Lamed 1992; Dillon 2004). Na natureza a degradação da celulose por
microrganismos representa a maior fonte de carbono para o solo (Lynch et al. 1981). Existe
uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, entretanto, apenas alguns
são conhecidos como verdadeiros celulolíticos, por serem capazes de degradar a celulose
natural. (Robson & Chambliss 1989).
Na indústria alimentícia, as celulases são utilizadas em vários processos,
principalmente, na extração de componentes do chá verde, proteína de soja, óleos essenciais,
aromatizantes e amido da batata doce. Essas enzimas participam, ainda, dos processos de
produção do vinagre de laranja e do ágar e na extração e clarificação de sucos de frutas
cítricas (Orberg 1981).
Existem basicamente três classes de celulases, que são denominadas de acordo com
sua funcionalidade, as endoglucanases, as exo-celobiohidrolases e as -glucosidases. As
endoglucanases e as exo-celobiohidrolases atuam sobre a celulose produzindo celobiose como
produto final (Coughlan 1985). A principal função da -glucosidase, comumente chamada de
celobiase, é a hidrólise da celobiose e outras celodextrinas, resultando em glucose (Nadalini
1997). A -glucosidase também é responsável pelo controle da velocidade global da reação
de hidrólise celulósica, desempenhando assim, um efeito crucial na degradação enzimática da
celulose (Sengupta et al. 1991).
14
1.2.1.3. Esterases e lipases
As lipases e as esterases constituem um importante grupo de enzimas que estão
associadas ao metabolismo e à hidrólise dos lipídios. São amplamente distribuídas na natureza,
sendo encontradas em organismos animais e vegetais e, também em células de
microrganismos (Reed 1975; Oliveira 2000). As enzimas lipolíticas, juntamente com as
celulases constituem, atualmente importantes grupos de enzimas com enorme potencial para
aplicações biotecnológicas (Jaeger & Eggert 2002).
Essas enzimas têm grande importância fisiológica, uma vez que hidrolisam óleos e
gorduras em ácidos graxos livres, monoglicerídeos e diglicerídeos, essenciais aos processos
metabólicos, como o transporte dos ácidos graxos, e oxidação e síntese de glicerídeos e
fosfolipídios (Reed 1975).
As esterases representam um grupo diversificado de hidrolases que catalisam a quebra
e a formação da ligação éster, com potencial aplicação, nas áreas da agricultura, de alimentos
e da indústria farmacêutica (Panda & Gowrishankar 2005). Estão amplamente distribuídas na
natureza podendo ser encontradas nos animais, nas plantas e nos microrganismos. Apresentam
alta especificidade espacial e regional, propriedade que as tornam atrativas como
biocatalizadores para a obtenção de compostos oticamente puros em reações de síntese da
química fina (Jaeger & Reetz 1998). As lipases são capazes de catalisar reações de hidrólise,
esterificação, transesterificação e lactonização (esterificação intramolecular), além de agirem
sobre compostos que causam ranços. Essa flexibilidade aliada às diferentes lipases confere a
essas enzimas um potencial enorme de aplicações (Levy et al. 2003; Pastore et al. 2003).
1.2.1.4. Pectinases
Pectinases, ou enzimas pectinolíticas, são produzidas por um grande número de
bactérias, leveduras e fungos, insetos, nematódeos e plantas, a fim de degradar (para obter
fonte de carbono) ou modificar (fruto em amadurecimento) o heteropolissacarídeo pectina. A
biodegradação eficiente da pectina requer uma larga diversidade de enzimas pectinolíticas,
incluindo tanto as que agem na cadeia principal como as que agem nas cadeias laterais.
Possuem importância industrial, principalmente para aumentar a eficiência de filtração e
clarificação de sucos de frutos, na maceração, liquefação e extração de tecidos vegetais
(industria têxtil), podendo em alguns casos ser responsáveis pela patogênese em plantas
(Whitaker 1991).
15
1.2.1.5. Proteases
Proteases são enzimas capazes de quebrar ligações peptídicas de cadeias protéicas.
Estão amplamente distribuídas na natureza e estão associadas a importantes processos
biológicos tais como: a digestão protéica, coagulação sangüínea e morte celular. As enzimas
proteolíticas possuem também uma vasta aplicação comercial e industrial, estando entre os
três maiores grupos de enzimas industriais (Romero et al. 2001). Na indústria alimentícia, as
enzimas proteolíticas são largamente utilizadas para o amaciamento de carne, clarificação da
cerveja, panificação, hidrólise de soja, produção de aspartame, alimentos dietéticos, queijo e
em alguns alimentos para melhorar seu sabor, textura, funcionalidade e qualidade nutricional.
Nos curtumes são utilizados no amaciamento do couro e na degradação de resíduos. Já na
indústria farmacêutica, essas enzimas proteolíticas são empregadas em medicamentos para
distúrbios de digestibilidade, tendo também ação antiinflamatória, antimucolítica e
cicatrizante (Rao et al. 1998; Birschbach et al. 2004).
1.2.2. Produção de Substâncias Antimicrobianas
Antibióticos podem ser definidos como substâncias produzidas por um organismo que
apresenta efeitos adversos em outros organismos (Davies 1990). Embora o papel dos
antibióticos nos ambiente naturais não seja totalmente conhecido, sabe-se que algumas dessas
substâncias conferem vantagem competitiva para o microrganismo produtor (Martin &
Demain 1980).
Entre os maiores produtores de antibióticos estão os fungos e os actinomicetos. Os
actinomicetos constituem a maior fonte de antibióticos, sendo que cerca de dois terços dos
antibióticos são sintetizados por estes microrganismos (Okami & Hotta, 1988). Entre os
actinomicetos, o gênero Streptomyces responde por cerca de 93% dos metabólitos secundários
conhecidos. Algumas cepas produzem mais de um antibiótico e, freqüentemente, os diferentes
antibióticos produzidos não são quimicamente relacionados. Um mesmo antibiótico pode
também ser sintetizado por diferentes espécies. Os antibióticos produzidos por actinomicetos
apresentam grande variedade de estruturas químicas, incluindo aminoglicosídeos,
antraciclinas, glicopeptídeos, β-lactâmicos, macrolídeos, nucleosídeos, peptídeos, polienos,
poliéteres e tetraciclinas (Okami & Hotta 1988), dentre os quais podemos destacar
cloranfenicol, eritromicina, neomicina, novobiocina, estreptomicina, tetraciclina, e
16
gentamicina. Os actinomicetos têm ainda importância na produção de antimicrobianos aos
quais são adicionados grupamentos químicos, tais como a clindamicina (Hopwood & Merrick
1977).Outros grupos bacterianos produtores de antibióticos são as bactérias dos gêneros
Bacillus e Pseudomonas. Como exemplos de metabólitos produzidos temos a bacitracina, as
polimixinas e a colistina (Hopwood & Merrick 1977). Também as bactérias ácido-láticas
(LAB), que são amplamente aplicadas em indústria de alimentos. A nisina é uma das
substancias mais estudadas, com atividade antimicrobiana produzida por LAB e sua eficácia
tem sido estudadas principalmente para conservação de carnes, peixes e produtos lácteos
(Devlieghere et al.2004).
Muitos dos compostos classificados como antibióticos são peptídeos ou pequenas
proteínas (Kolter & Moreno 1992). Estes freqüentemente contem resíduos de aminoácidos
não comumente encontrados em proteínas, levantando a questão de como estes peptídeos
podem ser elaborados. Muitos estudos mostram que essas biomoléculas de estrutura peptídica
podem ser sintetizadas pela via não ribossomal através de reações catalizadas por enzimas
(Marahiel 1992; Stachelhauss & Marahiel 1995; Kleinkauf & Von Döhren 1996). Essas
enzimas sintetizam moléculas lineares e circulares, tais como gramicidina, polimixina e
bacitracina (Kleinkauf & Von Döhren 1987). Nisina (Buchman et al. 1988), subtilina
(Banerjee & Hansen 1988) e microcina B17 (Davagnino et al. 1986) são exemplos de
peptídeos antibióticos, os quais são sintetizados pela via ribossomal.
A literatura descreve o solo como um ambiente rico em microrganismos capazes de
sintetizarem antibióticos, mas a freqüência com que à síntese ocorre em níveis
ecologicamente significativos na natureza não é muito explorada e elucidada (Fedrizzi 2006).
Alguns microrganismos que vivem em associação com vegetais também demonstraram ser
bons produtores de antibióticos. Estes antibióticos podem contribuir para a competitividade
microbiana e à supressão dos patógenos da raiz da planta. Assim, as bactérias que os
produzem são de interesse para o controle de doenças nas plantas (Thomashow et al. 1990).
As técnicas usadas para compreender o papel dos antibióticos nos solos e nos vegetais
são aplicáveis a outros ambientes (Fedrizzi 2006). Acredita-se que novos antibióticos e outros
metabólitos secundários bioativos podem ainda ser descobertos de fontes microbianas. A
probabilidade de se encontrar novos compostos bioativos depende de alguns fatores críticos.
Por um lado, existe o número de linhagens selecionadas e seus níveis de diversidade; do outro,
essas linhagens são únicas e seu potencial para produzir metabólitos secundários é grande
(Donadio et al. 2002).
17
1.2.2.1.Bacteriocinas
As bacteriocinas são proteínas ou complexos de proteínas excretados por bactérias
metabolicamente ativas, que possuem modo de ação bactericida (James et al. 1991) e
geralmente são ativas contra membros de uma mesma espécie ou de espécies relacionadas
com a cepa produtora (Klaenhammer 1988). Representam um grupo de substâncias
antimicrobianas bastante heterogêneo, que variam consideravelmente quanto ao
microrganismo produtor, ao espectro bacteriano, ao seu modo de ação, a massa molar e às
suas propriedades bioquímicas. (Tag et al. 1976).
Sendo que uma mesma espécie pode produzir diferentes tipos de bacteriocinas. É
estimado que aproximadamente 99% de todas as bactérias possam produzir pelo menos uma
bacteriocina (Carolissen et al. 1997). As halobacterias, membros do domínio Archeae,
produzem um tipo próprio de bacterocina, as halocinas (Torreblanca et al. 1994).
A elaboração e produção de compostos antimicrobianos e bacteriocinas é
metabolicamente dispendioso. Um organismo que produz um peptídeo antibiótico precisa ser
capaz de: a) sintetizar o antibiótico; b) exportar o antibiótico extracelularmente; c) proteger-se
da ação do antibiótico. A síntese do antibiótico envolve vários passos: transcrição, tradução,
modificação pós-tradução de resíduos de aminoácidos e processamento pela clivagem da
seqüência principal do N-terminal (Kolter & Moreno 1992).
1.2.2.2 Bacteriocinas de bactérias gram-positivas
As bacteriocinas produzidas por bactérias gram-positivas são mais abundantes e
diversas que as produzidas por bactérias gram-negativas (Tagg et al. 1976; Jack et al.1995).
Elas diferem das bacteriocinas produzidas por gram-negativas em alguns aspectos
fundamentais. Primeiro, a produção de bacteriocinas não é um evento letal como ocorre nas
gram-negativas, quando a liberação da bacteriocina ocorre juntamente com a lise celular. Tal
diferença é explicada pelo fato de que as bactérias gram-positivas possuem mecanismos de
transporte específico de bacteriocinas. Outro fator que as difere é a complexidade na
regulação da produção de bacteriocinas que é maior nas gram-positivas (Jack et al.1995).
Klaenhammer (1993) dividiu as bacteriocinas de bactérias do ácido lático (LAB) em
quatro classes, de acordo com sua estrutura e características bioquímicas. Contudo, esta
definição pode ser aplicada a outras bactérias gram-positivas (Hu 2003). Assim, as
bacteriocinas de bactérias gram-positivas podem ser divididas em classes I, II, III e IV. As
18
bacteriocinas da classe I são pequenos peptídeos (<5 kDa) que agem na membrana e contem
aminoácidos incomuns como dehidroalanina, dehidro-butirina, lantionina e b-metillantionina.
As bacteriocinas da classe I podem ainda ser subdivididas em A, B e C, de acordo com o seu
modo de ação (Brotz et al. 1995). Dentro desta classe se destaca a bacteriocina nisina,
descoberta em 1928 (Roger 1928). A nisina vem sendo, desde então, o modelo para as
bacteriocinas de bactérias gram-positivas (Brotz et al. 1995).
As bacteriocinas da classe II são pequenos peptídeos (<10 kDa) hidrofóbicos,
termoestáveis e que não contêm lantionina (Dirix et al. 2004). A bacteriocinas maduras dessa
classe formam hélices anfifílicas com hidrofobicidade variável, estrutura de β-folha e
estabilidade térmica moderada (100ºC) a alta (121ºC). Dentro dessa classe podem ser
definidas três subclasses: IIa, IIb e IIc (Héchard & Sahl 2002). A classe III é composta por
bacteriocinas de maior peso molecular (>30 kDa), sensíveis ao calor e, das quais, se tem
pouca ou nenhuma informação sobre seu modo de ação (Héchard & Sahl 2002). Na classe IV
estão inseridos peptídeos complexos, que possuem motivos contendo lipídios ou carboidratos
(Hu 2003).
As bacteriocinas produzidas por gram-positivas requerem muito mais genes para sua
produção do que as produzidas por gram-negativas. Estes grupos de genes geralmente se
localizam nos plasmídeos, mas ocasionalmente são encontrados no cromossomo. Já na
maioria das gram-negativas os genes de produção se localizam nos transposons (Dodd et al.
1990). O espectro de ação inibitória das bacteriocinas gram-positivas se restringe a bactérias
gram-positivas e podem variar de um menor espectro a um amplo espectro (Roos et al. 1999).
1.2.2.3. Modo de ação das bacteriocinas de bactérias gram-positivas
As bacteriocinas de bactérias gram-positivas são peptídeos que exibem uma grande
variedade de estruturas químicas. Por isso, estas bacteriocinas afetam diferentes funções
essenciais da célula bacteriana, como a transcrição, tradução, duplicação de DNA e
biossíntese da parede celular (Oscáriz & Pisabarro 2001) ou causam estresse oxidativo nas
células sensíveis (Eraso & Inés 2004). Contudo, a grande maioria age formando canais ou
poros na membrana, o que afeta o equilíbrio osmótico e o potencial energético das células
sensíveis (Oscáriz & Pisabarro 2001). A ação das bacteriocinas é bactericida e em alguns
casos concentrações mínimas promovem a inibição do crescimento (Diep & Nes 2002).
A formação de poro na membrana celular não é mediada pelo reconhecimento de um
receptor na célula. Há uma interação eletrostática inespecífica entre a porção N-terminal da
19
bacteriocina, carregada positivamente, e os fosfolipídeos de membrana, carregados
negativamente. A porção C-terminal, por sua vez, participa da formação do poro
transmembrânico por ser altamente hidrofóbica, Figura 1 (Oscáriz & Pisabarro 2001).
Figura 1: Mecanismo de ação proposto para as bacteriocinas produzidas por bactérias
gram-positivas. A porção N-terminal da molécula de bacteriocina se liga aos fosfolípideos
de membrana carregados negativamente. A região hidrofóbica da molécula se a região
hidrofóbica da membrana, abrindo um canal (Adaptado de Oscáriz & Pisabarro 2001).
1.3. Importância da bioprospecção de microrganismos produtores de biomoléculas em
diferentes habitats
Desde o período mais remoto a melhoria tecnológica tem sido importante para o
desenvolvimento e instalação da espécie humana neste planeta. Atualmente, a biotecnologia,
além do melhoramento da biodiversidade, pode fazer modificações genéticas e criação,
inclusive mudando geneticamente as formas de vida existentes.
20
Enfrentamos uma situação delicada, temos um contingente populacional amplo e por
isso é necessária a otimização de processos, sem deixar de lado uma coexistência sustentável
entre biodiversidade, biotecnologia e saúde. Nas indústrias observamos a demanda por
tecnologias baratas, de alta rentabilidade e facilmente obtidas, que por sua vez visam
simplificar os processos industriais, aumentando sua produtividade ou até mesmo tratando os
resíduos industriais. Já nas áreas da saúde observamos uma constante demanda por novas
drogas, seja pela diminuição da eficácia ou pela busca de drogas com menos efeitos colaterais.
Um caminho viável para a obtenção de novos recursos é a exploração da
biodiversidade, especialmente os microrganismos, que são conhecidos como produtores de
metabolitos secundários biologicamente ativos. Como exemplo, podemos citar que grande
parte dos antibióticos descobertos nos últimos 50 anos foram provenientes de bactérias. Das
bactérias são obtidas, por exemplo, enzimas que podem ser amplamente empregadas na
indústria. Os microorganismos contribuem para o equilíbrio de ecossistemas atuando
intermediariamente entre a biogeosfera e os constituintes atmosféricos gasosos. Podem-se
encontrar bactérias capazes de degradarem herbicidas, pesticidas, inseticidas, óleos e esgotos
poluidores. Assim, as bactérias participam da reciclagem de compostos químicos na biosfera,
incluindo a degradação de poluentes industriais (Vining 1986; Colwell 1997; Hunter 1998;
Azevedo 1998; Glazer & Nikaido 2007).
21
2. Objetivos
22
2. Objetivos
Objetivo Geral
Determinar a atividade antimicrobiana e citotoxicidade de extratos obtidos do
crescimento de bactérias isoladas de diferentes habitats, e potencial de produção enzimática
destes mesmos isolados.
Objetivos Específicos
Recuperar actinomicetos isolados de solos de cerrado e Mata Atlântica, bactérias
endofíticas de Nim e de caverna conservados em glicerol 20 % (v/v) pertencentes à
bacterioteca do Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás;
Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro dos isolados de NIM, caverna e
actinomicetos.
Comparar métodos de obtenção de extratos produzidos pelos microrganismos. Técnica
de “plugs” e extrato etanóico.
Avaliar a atividade citotóxica in vitro dos extratos produzidos pelos isolados frente à
Artemia salina.
Avaliar a atividade enzimática in vitro dos isolados de NIM e caverna.
23
3. Material e Métodos
24
3. Material e Métodos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia Ambiental e
Biotecnologia (LAMAB) do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da
Universidade Federal de Goiás (UFG). Os microrganismos utilizados fazem parte da
bacterioteca pertencente ao LAMAB, estando preservados em glicerol 20 % (v/v) a
temperatura de -20C.
As bactérias utilizadas neste estudo foram isoladas de três ambientes distintos, de
caverna (Rodrigues et al. 2008a), do vegetal Azadirachta indica A. JUSS (NIM) (Rodrigues et
al. 2008b) e de solo de cerrado e mata Atlântica (actinomicetos) (Vieira 1999). O
microrganismo isolado de caverna foi denominado CAV1. Os isolados de Nim, NIM1, NIM2,
NIM4, NIM5, NIM6 e NIM7, sendo que NIM1 e NIM2 são actinomicetos. Dos isolados de
solo actinomicetos, os provenientes do cerrados foram denominados ADU1.3, ADU2.2 E
ADU2.5, já os oriundos de mata Atlântica, PEG23,TIJA2,TIJA5,TILA3 e TILA4.
3.1. Determinação da atividade antimicrobiana de endofíticos isolados de Nim e do
isolado de caverna.
Foram avaliados os seguintes isolados: CAV1, NIM4, NIM5, NIM6 E NIM7.
3.1.1. Produção de extrato.
A produção de substâncias com atividade antimicrobiana seguiu a metodologia
descrita por Romeiro (1989), modificado. Uma alíquota de 50µL dos isolados preservados em
glicerol, foram inoculados em 5mL de caldo BHI e incubados por 24 horas a 30ºC. Após este
período uma alíquota de 100 µL do caldo, foram transferidas para placas contendo meio
sólido de Kado, de forma a ocupar toda a superfície do meio, formando um “tapete” e
incubadas por 48 horas a 30°C.
As placas que apresentaram crescimento foram expostas por 30 minutos à luz
ultravioleta. O ágar foi cortado e tratado com 30mL água destilada esterilizada para a extração
das substâncias com possível atividade antimicrobiana, a solução foi homogeneizada em
vórtex por 5 minutos. A fase líquida foi separada da fase sólida, por centrifugação a 4ºC,
13.000 rpm por 10 minutos e os extratos resultantes foram esterilizados por filtração em
filtros Millipore (0.25 m) e mantidos a -20°C até a utilização.
25
3.1.2. Determinação da atividade antimicrobiana dos isolados
Placas contendo ágar Müeller-Hinton foram previamente inoculadas com as bactérias
indicadoras padronizadas para a turbidez do tubo Nº 0,5 da escala de MacFarland. Após a
inoculação, poços de 5,0 mm de diâmetro foram feitos e inoculados com 30 μL dos extratos
(item 3.1.1) e incubados por 24 horas a 30°C. Após este tempo os halos de inibição de
crescimento foram determinados. Como controle negativo, utilizou-se a mesma alíquota (30
μL) de extrato obtido a partir de uma placa contendo meio sólido de Kado isento de
crescimento (Santos 1993).
O critério utilizado para a escolha dos microrganismos indicadores foi a de sua
importância como causadores de doenças a nível comunitário e hospitalar. Foram avaliadas as
seguintes bactérias indicadoras:
A) gram-positivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus meticilina
resistente (MRSA), Micrococcus luteus ATCC 9341, Bacillus subtilis ATCC 6633,
Enterococcus faecalis ATCC 29212 e Bacillus cereus ATCC 14579.
B) gram-negativas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterobacter aerogenes ATCC
13048, Salmonella choleraesuis ATCC 10708, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella
typhimurium ATCC 14028 e Serratia marcecens ATCC 14756.
3.2. Determinação da atividade enzimática de endofíticos isolados de Nim e do isolado de
caverna.
Para a determinação da atividade enzimática, os isolados foram inoculados em caldo
BHI e incubados por 24 horas a 30 ºC. Após esse tempo, alíquotas de 100 µL foram
inoculadas na superfície dos meios de cultura específicos para cada enzima a ser avaliada com
o auxílio de uma multi-alça (inoculador de Stiers). As placas foram incubadas a 30ºC por 48
horas. Após a incubação, foi determinado o índice enzimático que corresponde ao diâmetro
dos halos de atividade enzimática em mm dividido pelo diâmetro da colônia em mm. Se o
índice enzimático for maior do que 1, sugere-se a produção da enzima de interesse. Foram
avaliadas a produção de amilase, esterase, lípase, celulase, protease, pectinase, -glucosidase
e endoglucanase.
3.2.1. Produção de Amilases.
26
Para determinação de atividade amilolítica foi utilizado meio Agar nutriente (AN)
acrescido de 0,2% de amido solúvel (Hankin & Anagnostakis 1975). A leitura foi realizada
após a exposição da placa a vapor de iodo metálico, sendo a presença de halo claro ao redor
da colônia indicativo positivo para produção da enzima.
3.2.2. Produção de celulases
Para verificação de atividade celulolítica as amostras foram incubadas em meio
mínimo a base de KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 7.H2O, (NH4)2SO4, extrato de levedura,
(celulose microcristalina) e ágar, sendo a formação de halo claro ao redor da colônia indicador
positivo (Stamford et al. 1998).
3.2.3. Produção de endoglucanases
Para teste de atividade de endoglucanase, as amostras foram incubadas em meio
mínimo acrescido de 0,1% de extrato de levedura e 0,1% de carboximetilcelulose (Melo
2000). A leitura foi feita com a observação de halos claros ao redor da colônia, após
tratamento com solução 1% de brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB) e incubação com esta
por 4 horas a 4ºC.
3.2.4. Produção de esterases e lipases
O teste de atividade esterásica foi feito a partir da metodologia descrita por Sierra
(1975), incubando as amostras em meio com bacto peptona, NaCl, CaCl2 H2O e ágar,
suplementado com 1mL de Tween 20 a concentração de 1% (v/v).
A atividade lipolítica segue o mesmo protocolo da atividade esterásica (Sierra 1975),
mas a suplementação foi feita com Tween 80. Para ambas as enzimas a leitura positiva é
indicada pela presença de halos claros ao redor das colônias.
3.2.5. Produção de pectinases
A atividade pectinolítica foi medida após incubação em meio à base de KH2PO4 ,
K2HPO4, pectina, (NH 4)2SO4 , FeSO4 7.H2O, CaCl2 , extrato de levedura e H 2O.
27
Para a leitura as placas foram recobertas por uma solução de CTAB a 1% (v/v) e incubadas
por uma hora a temperatura ambiente, e depois serem lavadas com água destilada esterelizada
(Hankin et al. 1971). A presença de halo claro ao redor da colônia indica resultado positivo.
3.2.6. Produção de proteases
A atividade proteolítica foi feita a partir de incubação em meio Caldo Nutriente,
glucose, leite desnatado e ágar (Vieira 1999), sendo a leitura realizada após exposição à
solução de ácido acético 5%, verificando-se a presença de halos claros ao redor das colônias
como resultado positivo.
3.2.7. Produção de ß- glucosidases
Para teste de atividade de β-glucosidase as amostras foram incubadas em placas
contendo meio mínimo acrescido de 0,1% de extrato de levedura, 0,2% de esculina e 0,05%
de citrato férrico de amônia (Melo 2000). A leitura positiva foi realizada observando a
formação de halos escuros ao redor das colônias.
3.3. Determinação da atividade antimicrobiana de actinomicetos isolados de Nim e de
solos do cerrado e Mata Atlântica.
Foram avaliados os seguintes isolados actinomicetos: ADU 1.3, ADU 2.2, ADU 2.5,
NIM1, NIM2, PEG 23, TIJA2, TIJA5, TILA3 e TILA4.
3.3.1. Determinação da atividade antimicrobiana dos actinomicetos - Técnica dos
“Plugs”.
Os actinomicetos, previamente isolados, foram cultivados em ágar ISP-2 por 14 dias a
30°C. Após este tempo cilindros de 7,0 mm de diâmetro (plugs) foram cortados e inoculados
sobre placas de Petri contendo o ágar Müeller-Hinton previamente inoculadas com as
bactérias indicadoras (item 3.1.2.) padronizadas para a turbidez do tubo Nº 0,5 da escala de
MacFarland. As placas foram incubadas por 24 horas a 30ºC. Após este tempo os halos de
28
inibição de crescimento foram determinados (Vieira 1999). Como controle negativo, utilizou-
se um cilindro de 7,0 mm de ágar ISP-2 isento de crescimento.
3.3.2. Produção da substância com ação antimicrobiana e extração da substância
bioativa de actinomicetos.
Os isolados que apresentaram atividade antimicrobiana frente ao MRSA avaliado,
foram inoculados em 15 mL de caldo ISP-2 e incubados sob agitação constante em “shaker” a
180 rpm, 30ºC por 48 horas. Decorrido este período, foram adicionados mais 50 mL de caldo
ISP-2 ao Erlenmeyer contendo os isolados e novamente incubados em “shaker” a 180 rpm,
30ºC por 14 dias. Após o termino da fermentação, o conteúdo do Erlenmeyer (65 mL), foi
filtrado para a separação micélio e sobrenadante (extrato aquoso). O micélio foi macerado em
gral e tratado com etanol absoluto na proporção de 2 mL do solvente para cada grama de
micélio bruto, a solução foi filtrada e a porção filtrada reservada. Este procedimento foi
repetido por três vezes, e as porções de filtrado foram reunidas (extrato 1), que resultou em
um volume final de 30 mL.
O extrato aquoso foi tratado por três vezes com acetato de etila. Foi obtida uma
bicamada na qual a fase orgânica (extrato de acetato de etila) foi separada. No Laboratório de
Farmacognosia da Faculdade de Farmácia – UFG, o extrato de acetato de etila foi concentrado
sob baixa temperatura (45ºC) em um rotavapor. Ao resíduo obtido após a evaporação, foi
adicionado aos 30mL do extrato 1, sendo novamente concentrado em rotavapor nas mesmas
condições descritas anteriormente. O precipitado final obtido (5,0 gramas) foi resuspenso em
1mL de etanol absoluto (extrato etanólico final) e armazenados em freezer a -20ºC (Azevedo
et al. 2004).
3.3.3. Determinação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico final dos isolados –
Técnica de difusão em poço.
A atividade antimicrobiana dos extratos, foi realizada pela técnica de difusão em poço.
Placas contendo ágar Müeller-Hinton foram previamente inoculadas com as cepas indicadoras
padronizadas para a turbidez do tubo Nº 0,5 da escala de MacFarland. As bactérias
indicadoras utilizadas foram Sthapylococcus aureus ATCC 25923 e MRSA. Após a
inoculação, poços de 5,0mm de diâmetro foram feitos e inoculados com 30 μL dos extratos e
incubados por 24 horas a 30°C. Como controle negativo, utilizou-se a mesma alíquota (30 μL)
29
de etanol absoluto puro. Após este tempo os halos de inibição de crescimento foram
determinados (Azevedo et al. 2004).
3.4. Atividade citotóxica frente à Artemia salina.
Os isolados que apresentaram atividade frente ao MRSA avaliado, tiveram suas
atividades citotoxicas determinadas, a fim de verificar uma possível letalidade dos extratos
frente à Artemia salina. Para a determinação da atividade citotóxica dos endofíticos de Nim e
do isolado de caverna, foram utilizados os extratos aquosos (item 3.1.1). Já na determinação
da atividade citotóxica dos actinomicetos isolados de solo e de Nim, foram utilizados os
extratos etanólicos bruto (item 3.3.2.).
Ovos de Artemia salina foram eclodidos em solução salina contendo 3,5 % de sal
marinho. Os ovos foram incubados, sob iluminação e aeração constante, a 30ºC por 48 horas.
Os extratos obtidos dos endofíticos, bactéria de caverna e actinomicetos, foram adicionados a
10 mL de solução salina previamente preparada. As diluições inicialmente empregadas foram
20.000 ppm (200µL do extrato em 10 mL de solução salina), 10.000 ppm (100µL do extrato
em 10 mL de solução salina), 5.000 ppm (50µL do extrato em 10 mL de solução salina),
2.500 ppm (25 µL do extrato em 10 mL de solução salina) e 1.250 ppm (12,5µL do extrato
em 10 mL de solução salina). Diluições posteriores foram preparadas de acordo com a
necessidade de menores diluições, para o cálculo da DL50 (Lima 2007).
Em tubos contendo 1 mL das diluições foram adicionados 10 náuplios de Artemia
salina, o teste foi realizado em triplicata para cada diluição. O controle negativo do teste
consistiu em etanol absoluto diluído nas mesmas concentrações dos extratos, para a
verificação de uma possível ação tóxica dessa substância sobre os náuplios. Os tubos foram
incubados sob iluminação a 30ºC por 24 horas. Após este período, o número de náuplios
mortos ou com perda de movimento foram contados para a determinação da porcentagem de
mortalidade em cada concentração analisada.
% Mortalidade = nº total de mortos ou imóveis x 100
nº total de Artemia salina
Os resultados obtidos foram utilizados para o cálculo da DL50, que é a dosagem que
mata 50 % dos animais experimentais. Essa dosagem foi calculada pela análise de regressão
linear dos resultados obtidos (Meyer et al. 1982).
30
4. Resultados
31
4. Resultados
4.1. Determinação da atividade antimicrobiana de endofíticos isolados de Nim e do
isolado de caverna.
Analisando os resultados da atividade antimicrobiana, observou-se que os isolados
NIM5, NIM7 (isolados de Nim) e CAV1 apresentam atividade frente à Staphylococcus aureus
ATCC 25923 (Figura 2) e Micrococcus luteus ATCC 9341.
NIM5 e CAV1 apresentam atividade frente à MRSA, Bacillus cereus ATCC 14579 e
Bacillus subtilis ATCC 6633. Nenhum dos isolados testados apresentou atividade frente à
Enterococcus faecalis ATCC 29212 e as bactérias gram-negativas avaliadas (Tabela 1).
Observou-se que NIM4 e NIM6 não possuem atividade frente às bactérias indicadoras
avaliadas. Todos os isolados avaliados foram classificados como gram-positivos.
Tabela 1. Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos de endofíticos e isolado de
caverna frente às bactérias indicadoras.
BACTÉRIAS INDICADORAS HALOS DE INIBIÇÃO (Ø mm)
C1 CAV1 NIM 4 NIM 5 NIM6 NIM7
S. aureus ATCC 25923 -2 11³ - 10 - 10
MRSA - 11 - 9 - -
M. luteus ATCC 9341 - 15 - 12 - 10
B. subtilis ATCC 6633 - 12 - 12 - -
E. faecalis ATCC 29212 - - - - - -
B. cereus ATCC 14579 - 11 - 11 - -
P. aeruginosa ATCC 27853 - - - - - -
E. aerogenes ATCC 13048 - - - - - -
S. choleraesuis ATCC 10708 - - - - - -
E. coli ATCC 25922 - - - - - -
S. typhimurium ATCC 14028 - - - - - -
S. marcecens ATCC 14756 - - - - - -
1. (C) - Controle negativo
2. (-) indica ausência de halo
3. Os valores dos halos indicados na tabela correspondem à média de três repetições.
32
4.2. Determinação da atividade antimicrobiana dos actinomicetos - Técnica dos “Plugs”.
Todos os actinomicetos avaliados apresentaram atividade frente à S. aureus ATCC
25923 (Figura 3), MRSA, B. subtilis ATCC 6633, M. luteus ATCC 9341 e B. cereus ATCC
14579. Somente os isolados ADU 2.5 e ADU 2.2 não apresentaram atividade frente à E.
faecalis ATCC 29212. Não foi observada atividade frente às bactérias gram-negativas
avaliadas (Tabela 2).
Figura 2. Atividade antimicrobiana dos extratos aquosos das bactérias endofíticas de
NIM e do isolado de caverna frente à S. aureus ATCC 25923.
33
Figura 3. Atividade antimicrobiana do crescimento em “plugs” de diferentes
actinomicetos frente à S. aureus ATCC 25923
4.3. Determinação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico final dos isolados
actinomicetos – Técnica de difusão em poço.
Todos os extratos etanólicos avaliados apresentaram atividade frente à S. aureus
ATCC 25923 e MRSA (Figura 4, tabela 3).
4.4. Atividade citotóxica frente à Artemia salina.
Os valores de dosagem letal média (DL50) foram obtidos por análise de regressão dos
resultados de porcentagem de mortalidade dos náuplios (Tabela 4).
Nenhum dos extratos avaliados apresentou citotoxicidade em baixa concentração
(DL50 < 1.000 ppm) por este método, apresentando valores de DL50 superiores a 1.000 ppm.
34
4.5. Determinação da atividade enzimática de endofíticos isolados de Nim e do isolado de
caverna.
Os isolados NIM5, NIM7 e CAV1 demonstraram ser produtores de amilases, esterases,
proteases e -glucosidases. O isolado NIM 4 demonstrou ser produtor de esterases e -
glucosidases, o isolado NIM6 não demonstrou ser produtor de nenhuma das enzimas
avaliadas (Tabela 5).
Tabela 2. Avaliação da atividade antimicrobiana de actinomicetos frente às bactérias
indicadoras.
BACTÉRIAS
INDICADORAS HALOS DE INIBIÇÃO (Ø mm)
C1
ADU
1.3
ADU
2.2
ADU
2.5
PEG23 NIM
1
NIM
2
TIJA
2
TIJA
5
TILA
3
TILA
4
S. aureus ATCC 25923 -2 19³ 9 8 18 12 13 17 17 15 18
MRSA - 19 9 8 15 12 13 14 17 15 16 M.luteus ATCC 9341 - 23 12 15 19 15 13 22 23 21 22
B. subtilis ATCC 6633 - 16 11 8 14 11 10 14 16 13 16 E. faecalis ATCC
29212 - 16 - - 12 12 11 15 16 12 14
B. cereus ATCC 14579 - 16 13 20 13 14 13 15 15 16 15 P. aeruginosa ATCC
27853 - - - - - - - - - - -
E. aerogenes ATCC
13048 - - - - - - - - - - -
S. choleraesuis ATCC
10708 - - - - - - - - - - -
E. coli ATCC 25922 - - - - - - - - - - - S. typhimurium ATCC
14028 - - - - - - - - - - -
S. marcecens ATCC
14756 - - - - - - - - - - -
1. (C) - Controle negativo
2. (-) indica ausência de halo
3. Os valores dos halos indicados na tabela correspondem à média de três repetições.
35
Tabela 3. Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico final dos isolados
actinomicetos frente às bactérias indicadoras. Os valores dos halos indicados na tabela
correspondem à média de três repetições.
BACTÉRIAS
INDICADORAS HALOS DE INIBIÇÃO (Ø mm)
C1
ADU
1.3
ADU
2.2
ADU
2.5
PEG
23
NIM
1
NIM
2
TIJA
2
TIJA
5
TILA
3
TILA
4
S. aureus ATCC
25923
-2 32 23 25 23 30 32 34 30 35 36
MRSA - 30 22 20 20 30 30 31 27 30 19
1. Controle negativo
2. (-) indica ausência de halo.
Figura 4. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólico final dos
diferentes isolados de actinomicetos frente à MRSA.
36
Tabela 4. Dosagem letal média (DL50) dos diferentes extratos obtidos do crescimento das
bactérias analisadas.
ISOLADOS Dosagem Letal Média (DL50) em ppm1
ADU1.3
ADU2.2
ADU2.5
CAV1
NIM1
NIM2
NIM5
NIM7
PEG23
TIJA2
TIJA5
TILA3
TILA4
1.730
18.900
1.120
>20.000
11.800
9.120
>20.000
>20.000
10.300
>20.000
>20.000
9.200
14.900
1. Partes por milhão dos extratos brutos.
Tabela 5. Índice Enzimático.
ISOLADO ATIVIDADE ENZIMÁTICA1
____________________________________________
Amilolítica Esterásica Proteolítica β- glucosidase
CAV1
NIM4
NIM5
NIM6
NIM7
1,2
-
2,0
-
1,6
1,8
1,5
1,6
-
1,3
1,6
-
1,3
-
1,5
1,2
3,3
1,2
-
1,2
Índice Enzimático (diâmetro dos halos de atividade enzimática em mm/ diâmetro da colônia em mm), a
marcação (-) indica que não houve atividade.
37
5. Discussão
38
5. Discussão
Observou-se que dois isolados de Nim (NIM5 e NIM7) e o isolado de caverna
apresentaram a capacidade de inibir o crescimento da cepa-padrão S. aureus ATCC 25923,
MRSA e a maioria dos indicadores gram-positivos avaliados.
Comparando os resultados encontrados entre os diferentes isolados de Nim, sugere-se
que todos apresentem potencial para serem utilizados como antimicrobianos, entretanto,
nenhum dos isolados se destacou na inibição de um microrganismo indicador. A produção de
substâncias com ação antimicrobiana por endofíticos facilita sua adaptação ao vegetal,
inibindo outros microrganismos que seriam patogênicos para o vegetal, o que poderia
prejudicá-los indiretamente ou que competiriam pelos mesmos nutrientes (Pleban et al. 1997;
Bacon & Hilton 2002 e Taechowisan et al. 2003).
A produção de substancias com atividade antimicrobiana pelo isolado de caverna,
pode ser explicada pela complexidade do ambiente cavernícola. Dessa forma acredita-se que
haja uma cooperação entre os microrganismos de caverna, visto que poucas espécies são
capazes de sintetizar todas as substâncias necessárias ao seu crescimento, sendo
freqüentemente encontrados associados à biofilmes. Independentemente de estarem em
associação com outros microrganismos ou não, ocorre competição para a aquisição dos
escassos nutrientes na caverna, podendo levar a produção de substâncias que inibam o
crescimento de outros microrganismos (Barton e Northup 2007; Kambesis 2007).
O espectro de ação das substâncias com atividade antimicrobiana mostrou-se restrito a
gram-positivas. Microrganismos gram-positivos geralmente produzem substâncias com
espectro restrito a gram-positivas, enquanto as gram-negativas podem inibir o crescimento de
ambas (Klaenhammer 1988; James et al. 1991), tal fato foi demonstrado por Carrim (2005),
que ao analisar o espectro de ação de dez endofíticos gram-positivos isolados de Jacaranda
decurrens CHAM. (Carobinha do Campo) verificou que nenhum dos isolados apresentou
atividade antimicrobiana frente aos gram-negativos avaliados no estudo. Este padrão de
atividade era esperado uma vez que os microrganismos isolados de Nim e caverna foram
classificados segundo a metodologia de Gram como gram-positivos.
Sabe-se que as condições de crescimento microbiano in vitro não reproduzem
totalmente as reais condições aos quais os microrganismos estão adaptados. Este fato interfere
no espectro biocida observado quando há variação meio de cultivo utilizado para a produção
de moléculas bioativas inibidoras de crescimento de outros microrganismos (Romeiro 1989).
Carrim (2005) testando vários meios de cultivo para a avaliação da atividade antimicrobiana
39
de endofíticos isolados de Carobinha do campo, observou que somente o meio sólido de Kado
mostrou-se adequado para a produção de substâncias com atividade antimicrobiana. A
inibição de produção de moléculas bioativas, como os antibióticos, quando diferentes meios
são comparados tem sido relatados com freqüência na literatura Diferentes autores relatam
que a produção de antibióticos está relacionada não só a presença de diferentes constituintes
nos meios de cultura, como também o pH, a temperatura e o estado físico (sólido ou líquido)
do meio de cultivo e/ou produção (Omoto et al. 1979, Shomura et al. 1979; Furlan 1997,
Gonella 2003, Azevedo et al. 2004).
Vários estudos avaliam a ação antimicrobiana de extratos de plantas medicinais, mas
poucos tentam estabelecer uma ligação entre endofíticos e a atividade antimicrobiana
observada nos extratos obtidos a partir de partes do vegetal. Carrim (2005) e Barbosa (2005)
realizaram a determinação da atividade antimicrobiana de microrganismos isolados de plantas
medicinais do cerrado e verificaram que a maior parte dos microrganismos endofíticos
isolados possuíam atividade antimicrobiana frente aos indicadores gram-positivos avaliados.
Dos dez actinomicetos avaliados (2 endofíticos e 8 isolados de solos de diferentes
biomas brasileiros) todos apresentaram a capacidade de inibir a maioria dos indicadores gram-
positivos avaliados. Tais resultados sugerem a produção de moléculas bioativas com potencial
antimicrobiano, seja de novos antimicrobianos ou de antimicrobianos já descobertos. É
importante salientar a ausência de positividade do controle negativo, sugerindo que o meio de
cultura e o etanol não interferiram no teste.
Dos isolados, ADU1.3 apresentou os maiores halos de inibição quando comparado aos
demais isolados de solo de cerrado. As diferenças entre as atividades antimicrobianas dos
microrganismos isolados de solo e de endofíticos de Nim não foram muitos diferentes.
Verificou-se que tantos os actinomicetos provenientes de cerrado, como os
provenientes de Mata Atlântica apresentaram bons resultados, sugerindo que mesmo com
características de solos diferentes, os microrganismos isolados de ambas as regiões
demonstram ser capazes de produzir biomoléculas com atividade antimicrobiana,
caracterizando assim os solos dessas regiões como promissoras fontes para a pesquisa de
novas e variadas moléculas, especialmente com características farmacológicas.
A atividade antimicrobiana demonstrada pelos actinomicetos endofíticos isolados de
NIM sugere que a atividade antimicrobiana ou parte dela, comprovadamente associada ao
extrato de partes de NIM seja associada aos microrganismos endofíticos que habitam o
vegetal.
40
Embora os isolados actinomicetos tenham apresentado atividade antimicrobiana
somente frente a gram-positivas, tal fator não pode ser considerado padrão. Quando
comparamos os actinomicetos às demais bactérias gram-positivas, verifica-se que em muitos
casos o espectro de ação dos actinomicetos não se restringe apenas as gram-positivas,
apresentando atividade frente a várias gram-negativas e a fungos (Miyadoh 1993; Padilla
1998).
Várias pesquisas têm sido realizadas para avaliar a ação antimicrobiana de
actinomicetos frente aos mais variados patógenos, uma vez que grande parte dos
antimicrobianos comercialmente disponíveis são isolados de actinomicetos (Hopwood &
Merrick 1977; Okami & Hotta 1988). Dos 15 isolados avaliados no presente estudo, 12
demonstraram atividade frente ao MRSA avaliado. Lima (2007) realizando análises de
microrganismos de solo de cerrado e Mata Atlântica frente à cepas de MRSA obteve
resultados promissores, nos quais dos 50 isolados obtidos no estudo, 7 demonstraram alguma
atividade frente aos MRSA avaliados.
A atividade antimicrobiana demonstrada pelos extratos etanólicos finais foi superior
quando comparada à obtida pela técnica de “plugs”. Os halos obtidos a partir dos extratos
foram maiores, fenômeno que pode ser explicado levando em consideração alguns fatores: a)
O crescimento dos microrganismos ocorreu em meio líquido, em “shaker” e em condição de
aeração constante. Fato que pode ter potencializado a produção de biomoléculas bioativas.
Alguns autores consideram que o estado físico da cultura (sólido, semi-sólido ou líquido),
bem como os constituintes, pH, temperatura e o teor de oxigênio são fatores que influenciam
o crescimento e a produção de metabólitos pelos microrganismos; b) o acetato de etila (30 mL)
e o álcool (30 mL) utilizados durante a extração da substância bioativa foram eficientes na
extração das moléculas bioativas; c) a concentração dos volumes de extração, acetato de etila
e etanol para um volume final de 1mL de etanol absoluto fez com que a concentração das
biomoléculas fosse 50 vezes mais concentrado (Omoto et al. 1979; Shomura et al. 1979;
Orduña & Theobald 2000).
Diversos trabalhos empregam Artemia salina como um teste de triagem, in vivo,
indicador de potencial citotoxicidade de diferentes moleculas. Grande parte destes refere-se à
avaliação de citotoxicidade de extratos de plantas com algum potencial para produção de
biomoléculas, geralmente fármacos (Callow 1993). Após uma triagem in vitro para a
determinação da eficácia farmacológica de biomoléculas, é necessário a verificação de sua
toxicidade em organismos alvo. A utilização da Artemia salina como um teste de triagem é
importante devido ao seu baixo custo, simplicidade de realização e tempo reduzido (72 horas),
41
permitindo a avaliação de grande número de amostras. Considera-se que ocorre potencial
citotóxico quando a DL50 é < 1.000 ppm da substância analisada (Meyer et al. 1982). Esta
metodologia, entretanto, não permite avaliar quais estruturas são afetadas pela biomolécula,
sendo necessários outros testes tais como: inibição de crescimento de células tumorais,
inibição de indução de tumorogênese em células de batata, inibição de motilidade em
planárias para tal comprovação (Calow, 1993; Krishnaraju et al. 2005).
Dos isolados analisados nenhum apresentou citoxicidade em baixas concentrações
(DL50 < 1.000 ppm) sugerindo que os compostos presentes no extrato podem ser utilizados
como antimicrobianos. Tais dados são bastante promissores nesta etapa preliminar na busca
de substâncias com atividade antimicrobiana, tendo em vista que o antimicrobiano deve ser
seletivo, causando dados ao patógeno e não a célula hospedeira (Amato Neto et al. 2000).
Vários subprodutos de NIM (pesticidas, insumos agrícolas, extrato) tem sido
avaliados em relação à citoxicidade, usando mamíferos como indicadores. Os resultados
obtidos indicam que a toxicidade depende da quantidade administrada, enquanto baixas doses
não são tóxicas, altas doses exibem disfunção tireoidiana e efeitos hepatotóxicos (Panda &
Kar 2000; Kasturi et al. 2002; Khan & Awasthy 2003).
Os resultados obtidos neste trabalho, demonstram que os extratos obtidos de
endofíticos e actinomicetos endofíticos de NIM não são tóxicos em baixas concentrações.
Entretanto a substância bioativa extraída dos isolados não foi identificada ou purificada, sendo
necessária análises posteriores.
O Índice Enzimático é uma ferramenta prática que viabiliza a seleção e a comparação
da produção enzimática de diferentes isolados microbianos, uma vez que este índice leva em
consideração a correlação direta entre o tamanho do halo e a capacidade degradativa dos
microrganismos (Lin et al. 1991; Fungaro e Maccheroni 2002). Índices enzimáticos maiores
que 1,0 são indicativos de excreção de enzimas (Fungaro e Maccheroni 2002).
Dos isolados avaliados quatro demonstraram ser produtores de enzimas de interesse
biotecnológico. Observa-se que os isolados NIM5 e NIM7 são produtores das mesmas
enzimas (amilases, esterases, proteases e -glucosidases) com índice enzimático com valores
próximos. O isolado NIM4 apresenta uma produção de amilase maior quando comparada aos
outros endofíticos de Nim. Tais dados sugerem que para adaptar-se as condições do vegetal,
microrganismos diferentes podem apresentar padrões semelhantes de produção de enzimas ou
padrões completamente diferentes caso seja necessário. É importante ressaltar que os
experimentos in vitro reproduzem parcialmente as condições naturais e que este padrão no
vegetal pode alterar-se.
42
Barbosa (2005), Carrim (2005) e Carrim et al (2006) realizando estudos com
endofíticos isolados de plantas nativas do cerrado concluíram que todos os microrganismos
por eles isolados produziram pelo menos uma das enzimas avaliadas. As plantas avaliadas
pelos autores, assim como o Nim, são plantas utilizadas em medicina popular, sugerindo um
potencial que extrapola o farmacêutico para os microrganismos endofíticos.
Pela determinação da atividade enzimática podemos traçar um perfil das enzimas de interesse
biotecnológico produzidas pelo isolado de caverna. O isolado CAV1 é produtor de diferentes
enzimas (amilolítica, esterase, proteolítica e de β- glucosidase) estas, permitem possivelmente
uma melhor utilização dos nutrientes e uma melhor adaptação às condições diferenciadas do
ambiente cavernícola. Esta diversidade de atividade enzimática e as diversas bactérias
produtoras, sugerem um potencial das mesmas para serem empregadas na produção xaropes
de glucose e maltose (amilases), biodiesel (liases e esterases), indústria de alimentos
(pectinases, proteases, celulases e oxidoredutases), indústria farmacêutica e de couro.
Tendo em vista o número restrito de produtos disponíveis no mercado e de pesquisa
desenvolvidas, resistência as drogas disponíveis apresentadas por diversas cepas e grande
demanda industrial para a optimização de processos faz-se necessário a bioprospecção de
novos microrganismos produtores de biomoléculas. Ao analisarmos e compararmos
ambientes totalmente diferentes estamos abrindo novas possibilidades para novas
biomoléculas.
Quando comparamos o ambiente cavernícola, solo e partes internas de vegetais,
verificamos que esses ambientes são regidos por condições próprias e diferentes uma das
outras, sendo necessário o desenvolvimento pelos microrganismos de mecanismos que
garantam sua sobrevivência. Em três habitats tão distintos, encontramos microrganismos
capazes de produzir biomoléculas, fato que deve considerado com otimismo, uma vez que
amplia os habitats onde podem ser extraídas biomoléculas de interesse biotecnológico.
43
6. Conclusões
44
6. Conclusões
Neste estudo isolados de diversos habitats demonstraram ser produtores de
biomoléculas de interesse biotecnológico como antimicrobianos e enzimas.
Os valores obtidos nas analises de atividade antimicrobiana e produção enzimática
mostraram-se semelhantes para todos os habitats avaliados.
A metodologia de avaliação da atividade antimicrobiana com a produção de extrato
etanóico mostrou-se mais eficiente que a técnica de “plugs”
Nenhum extrato obtido a partir dos isolados apresentou citotoxicidade em baixa
concentração, tornando-os viáveis como antimicrobianos.
45
8. Referências bibliográficas
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9. Anexos
65
9. Anexos
9.1. Composição química dos meios de cultura e reagentes
9.1.1. Detecção de Atividade Aminolítica (Hankin & Anagnostakis 1975)
Meio Agar nutriente é acrescido com 0,2% de amido solúvel, com ajuste de pH para
6,0. Após 96 h de incubação a 30ºC as placas devem ser reveladas com vapores de Iodo
Metálico. A atividade aminolítica é revelada pela presença de halo claro ao redor da colônia.
9.1.2 Detecção da Atividade Celulolítica (Stamford et al. 1998)
KH2PO4 ........................................................................................................ 7,0 g
K2HPO4 ........................................................................................................ 2,0 g
MgSO4 7H2O ................................................................................................ 0,1 g
(NH4)2SO4 .................................................................................................... 1,0 g
Extrato de Levedura ......................................................................................0,6 g
Avicel .............................................................................................................10 g
Ágar .............................................................................................................. 15 g
H2O destilada q.s.p ................................................................................ 1000 mL
Ajustar pH para 7,0 – 7,2. Após 48h de incubação a 30ºC as placas devem ser
incubadas por mais 12 h a 50ºC. A visualização de halo claro ao redor da colônia é indicativo
positivo
9.1.3. Meio mínimo para testes de atividade enzimática
NaCl ............................................................................................................. 0,5%
K2HPO4 ........................................................................................................ 0,1%
MgSO4.7H2O .............................................................................................. 0,05%
NaNO3 ....................................................................................................... 0,05%
FeSO4.7H2O .............................................................................................. 0,01%
Ágar ................................................................................................................ 2%
Extrato de Levedura .................................................................................... 0,1%
66
9.1.4. Detecção da Atividade de Endoglucanases (Melo 2000)
Meio mínimo acrescido com 0,1% de extrato de levedura e 0,1% de
caboximetilcelulose. A leitura é realizada após a exposição da placa a uma solução 1% de
brometo de cetiltrimetil amônio por uma hora a 4°C. A presença de halos claros ao redor das
colônias é indicativo positivo.
9.1.5. Detecção da Atividade Lipolítica e Esterásica (Sierra 1975)
Meio Bacto Peptona .......................................................................................10 g
NaCl ............................................................................................................. 5,0 g
CaCl2H2O ..................................................................................................... 0,1 g
Agar .............................................................................................................. 18 g
H2O destilada q.s.p ................................................................................ 1000 mL
Ajustar pH para 7,4. Após esterilizarão o meio deve ser suplementado com 1mL de
Tween 80 a concentração de 1% (v/v) para teste de atividade lipolítica; suplementação com
Tween 20 nas mesmas condições para atividade esterásica. As placas devem ser incubadas
por 48 h a 30ºC e a presença de halo opaco ao redor da colônia é indicativo positivo.
9.1.6. Detecção de Atividade Pectinolítica (Hankin et al. 1971)
Solução I
KH2PO4 ........................................................................................................ 0,2 g
K2HPO4 ...................................................................................................... 0,36 g
H2O destilada q.s.p .................................................................................. 200 mL
Solução II
Pectina ..........................................................................................................5,0 g
H2O destilada q.s.p .................................................................................. 200 mL
Solução III
(NH4)2SO4 .....................................................................................................2,0 g
FeSO4.7H2O ..............................................................................................0,001 g
67
CaCl2 ........................................................................................................ 0,001 g
Extrato de Levedura ......................................................................................1,0 g
H2O destilada q.s.p ................................................................................ ..600 mL
As soluções devem ser esterilizadas separadamente e reunidas no momento da
utilização, com proporção de 200 mL solução I + 200 mL solução II + 600 mL solução III.
Após 48h de incubação a 30ºC, as placas devem ser recobertas com solução de Brometo de
Hexadeciltrimetil Amônio (CTAB) a 1% (p/v) e incubadas por 1h a temperatura ambiente.
Lavar as placas com água destilada esterilizada. A presença de halo claro ao redor da colônia
é indicativo positivo.
9.1.7. Detecção de Atividade Proteolítica (Vieira 1999)
Caldo Nutriente ............................................................................................ 8,0 g
Glucose ........................................................................................................ 1,0 g
Leite Desnatado ..........................................................................................15 mL
Ágar .............................................................................................................. 18 g
Após 48h de incubação a 30ºC as placas devem ser reveladas em solução de ácido
acético 5%. A presença de halo claro ao redor da colônia é indicativo positivo.
9.1.8. Meio sólido de Kado (Romeiro 1989)
Sacarose......................................................................................................10,0 g
Extrato de levedura........................................................................................4,0 g
Caseína hidrolisada...................................................................................... 8,0 g
MgSO4 ..........................................................................................................0,3 g
H2HPO4 ........................................................................................................ 2,0 g
Ágar.............................................................................................................15,0 g
H2O destilada q.s.p .................................................................................1000 mL
9.1.9. Ágar ISP-2
Sacarose.......................................................................................................4,0 g
Extrato de Levedura......................................................................................4,0 g
68
Extrato de Malte..........................................................................................10,0 g
Ágar.............................................................................................................20,0 g
H2O destilada q.s.p .................................................................................1000 mL
pH= 7,0
