Atividade da Fosfolipase A2 - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp076402.pdf · ii UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto para obtenção

do Título de Mestre em Ciências, área de

concentração em Bioquímica

Atividade da Fosfolipase A2

Secretada Humana do Grupo IID

(hsPLA2-IID) contra Membranas

Artificiais e Biológicas

Raquel Gomes Fonseca

Ribeirão Preto - 2008

Livros Grátis

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ii

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA

Atividade da Fosfolipase A2 Secretada Humana

do Grupo IID (hsPLA2-IID) contra Membranas




iii

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA

Atividade da Fosfolipase A2 Secretada Humana

do Grupo IID (hsPLA2-IID) contra Membranas



Orientador: Prof. Dr. Richard John Ward


Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto para obtenção

doTítulo de Mestre em Ciências, área de

concentração em Bioquímica

iv

A Deus.

“Mas Jesus foi, pegou-a pela mão e disse bem alto:

-Menina levante-se!

E ela tornou a viver.”

(Luc 8:54)

v

A minha família, Sandra (mamãe), Geraldo (papai) e Júlia (mana)

pelo apoio, confiança, dedicação e amor incondicional.

Não há palavras que expressem claramente toda

minha gratidão por ter vocês ao meu lado.

Ao meu querido Ivan, pelo amor, carinho e companheirismo,

compartilhando as alegrias e apoiando-me

nos momentos difíceis.

vi

.

As minhas amigas, Elisângela e Tatiana pela amizade, dedicação intensa junto a mim ao construir este trabalho, pelos ensinamentos

e consolo nos momentos de desespero. Valeu muito pela força, meninas.

Obrigada sempre.

As amigas, Leila, Renata e Vivian pelo carinho, companheirismo, diversão, alegrias e lembranças de momentos

maravilhosos que passamos juntas.

Aos “irmãos”, Gilvan, Lucas, Liliane e Cristiana por terem me direcionado na batalha pela fé e pela

assistência incondicional.

Ao Roberto, pelo apoio indispensável no desenvolvimento deste trabalho, pela direção e orientação constante.

A minha grande amiga Lucimara Benine, e aos amigos, o Prof. Dr. Ricardo Benine e Guilherme Lopes que acreditaram em minha

capacidade e sempre me incentivaram.

vii

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Richard John Ward do Depto. de Química da FFCLRP – USP,

pela oportunidade, dedicação e amizade no desenvolvimento deste trabalho, o meu

eterno muito obrigada.

À FAPESP, CAPES e FAEPA pelo apoio financeiro;

Aos Profs, Dr. Cláudio Miguel da Costa Neto do Depto. de Bioquímica da

FMRP - USP, e Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes do Depto. de Fisica e Biofísica

da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, pela participação na

avaliação de minha Dissertação.

Ao Prof. Dr. Pietro Ciancaglini do Depto. de Química da FFCLRP pela

utilização de seu laboratório, e por sua imensa simpatia e atenção.

Ao Prof. Dr. José Roberto Giglio do Depto de Bioquímica e Imunologia da

FMRP, Prof. Dr Fernando Luiz De Lucca do Depto. de Bioquímica e Imunologia da

FMRP, e Prof. Dr Renê de Oliveira Beleboni do Depto de Biotecnologia da UNAERP

pela atenção em meu exame de qualificação.

Ao Prof. Dr. Roy Eduard Larson do Depto. de Biologia Celular e Bioagentes

Patogênicos da FMRP - USP pela utilização de seu laboratório e em algumas atapas

do desenvolvimento do projeto e pela atenção durante a disciplina de Biologia

Celular.

Ao Prof. Dr. Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira do Depto. de Química da

FFCLRP pela participação crítica e conhecimentos no desenvolvimento do projeto.

A técnica Tânia Paula Aquino Defina do Depto. de Biologia Celular e

Molecular e Bioagentes Patogênicos da FMRP – USP, pela ajuda com o

seqüenciamento das amostras de DNA.

Aos técnicos Pita, Silvia, Ivana Aparecida Borin e Milton Rosa Alves pela

amizade e auxílio nos experimentos do projeto.

viii

Às secretárias Ivone e Lucia do Depto. de Bioquímica e Imunologia da FMRP

pela ajuda e eficiência em todos os momentos.

A todos os funcionários do Depto. de Química da FFCLRP-USP, e os

secretários Lâmia, Bel, Maria, André e Emerson pela atenção nos assuntos

burocráticos.

Aos amigos de laboratório Lica, Taty, Carlinha, Leiloca, Paty, Lelis, Plínio, Jú,

Gisele, João, dupla Lucas e Gilvan, obrigado pela companhia, diversão e

aprendizado. Obrigada Manu (da Taty) pela paciência ao me ajudar com a

formatação da Tese.

A todos os professores, funcionários e amigos do Depto. de Bioquímica e

Imunologia da FMRP.

A todos os professores, funcionários e amigos do Departamento de Química

da FFCLRP.

Finalmente, muito obrigada àqueles que possibilitaram o desenvolvimento

deste trabalho.

ix

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS..................................................................................................................... 14

3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................ 15

3.1. Subclonagem do Gene de hsPLA2-IID em vetor pET-3a......................................... 15

3.1.1. Vetores pET ....................................................................................................... 16

3.2. Mutagênese Sítio-Dirigida ....................................................................................... 16

3.2.1. Etapa I da reação de PCR: síntese do fragmento mutante.............................. 18

3.2.2. Etapa II da reação de PCR: extensão do fragmento mutado........................... 19

3.2.3. Etapa III da reação de PCR: amplificação do gene .......................................... 19

3.2.4. Oligonucleotídeos de subclonagem................................................................. 20

3.2.5. Oligonucleotídeos mutagênicos....................................................................... 20

3.3. Digestão Enzimática e Ligação do Gene de hsPLA2-IID Selvagem e mutantes ao

vetor pET-3a................................................................................................................... 21

3.4. Transdormação em Escherichia coli DH5 � Ca2+ Competente................................ 22

3.5. Extração e Purificação do DNA Plasmidial ............................................................. 24

3.6. Seqüenciamento Automático .................................................................................. 25

3.7. Expressão em Escherichia coli BL21[DE3]pLysS .................................................. 27

3.7.1. Preparação de E. coli BL21[DE3]pLysS competente....................................... 27

3.7.2. Transformação para expressão dos vetores em Escherichia coli

BL21[DE3]pLysS............................................................................................................. 28

3.7.3. Teste de expressão em pequena escala .......................................................... 28

3.7.4. Escalonamento da expressão do vetor recombinante em Escherichia coli

BL21[DE3]pLysS............................................................................................................. 29

3.8. Purificação de hsPLA2-IID Recombinante Tipo Selvagem e Mutantes .................. 29

3.8.1. Isolamento dos corpos de inclusão ................................................................. 30

3.8.2. Modificação química e enovelamento das proteínas recombinantes

expressas em E. coli BL21[DE3]pLysS .......................................................................... 31

3.8.3. Purificação das proteínas recombinantes tipo selvagem e mutantes de

hsPLA2-IID....................................................................................................................... 32

3.9. Dicroísmo Circular ................................................................................................... 33

3.10. Teste de Atividade Enzimática Através de Indicador de Ácido Graxo Livre ....... 34

3.11. Atividade de Liberação de Calceina Encapsulada Em Lipossomos.................... 37

3.11.1. Preparação de lipossomos ............................................................................. 37

3.11.2 Dosagem de fosfato dos fosfolipídios ............................................................ 38

3.11.3. Liberação de calceína encapsulada em lipossomos ..................................... 39

x

3.12. Efeito Bactericida................................................................................................... 40

4. RESULTADOS................................................................................................................. 43

4.1. Subclonagem de hsPLA2-IID Tipo Selvagem .......................................................... 43

4.2. Mutagênese Stio-Drigida de hsPLA2-IID Aravés da Ração em Cadeia de

Polimerase ...................................................................................................................... 44

4.3. Subclonagem dos Genes de hsPLA2-IID Mutantes................................................. 46

4.4. Expressão das Proteínas Recombinantes de hsPLA2-IID ...................................... 50

4.5. Enovelamento e Purificação das Proteínas Recombinantes de hsPLA2-IID ......... 51

4.6. Dicroísmo Circular ................................................................................................... 56

4.7. Teste de Atividade Hidrolítica.................................................................................. 58

4.8. Atividade de Permeabilização de membranas Artificiais ....................................... 60

4.9. Atividade Bactericida............................................................................................... 62

5. DISCUSSÃO.................................................................................................................... 65

6. CONCLUSÕES................................................................................................................ 81

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 83

xi

ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1: Hidrólise de fosfatidilcolina pela PLA1, PLA2, PLB, PLC e PLD, e os

respectivos produtos da reação.. ........................................................................................ 1

FIGURA 2: Representação em fita da estrutura tridimensional de uma Asp 49-PLA2 de

peçonha de serpente............................................................................................................ 6

FIGURA 3. Mecanismo de tríade catalítica de PLA2s. ......................................................... 8

FIGURA 4: Esquema ilustrativo de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia de

polimerase. ......................................................................................................................... 17

FIGURA 5: Esquema ilustrativo da modificação química de proteínas sob a forma de

corpos de inclusão............................................................................................................. 31

FIGURA 6. Titulação monitorada por fluorescência do ADIFAB com ácido oléico a 25°C.

............................................................................................................................................ 36

FIGURA 7: Diagrama de formação de lipossomos pelo método de evaporação de fase

reversa. ............................................................................................................................... 38

FIGURA 8: Esquema ilustrativo do teste de liberação de calceína encapsulada em

lipossomo. .......................................................................................................................... 40

FIGURA 9: Esquema ilustrativo do ensaio bactericida. Considere tampão como controle

negativo experimental (CFU = 100%)................................................................................. 42

FIGURA 10: Análise eletroforética em gel do gene da hsPLA2-IID................................... 43

FIGURA 11: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% da digestão NdeI/BamHI do

vetor pET-3a. ...................................................................................................................... 44

FIGURA 12: Análise eletroforética em gel de agarose a 2% das etapas I e III da reação

em cadeia de polimerase.. ................................................................................................. 46

FIGURA 13: Análise eletroforética em gel de agarose a 2% dos produtos da digestão

enzimática dos fragmentos originado na reação III da PCR............................................. 47

FIGURA 14: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% da subclonagem dos

fragmentos mutados no vetor pET-3a............................................................................... 47

FIGURA 15: Análise eletroforética de PCR de colônias obtidas após a transformação em

E. coli DH5αααα competente.................................................................................................... 48

FIGURA 16. Eletroferograma mostrando a seqüência de DNA da fita complementar do

gene de hsPLA2-IID............................................................................................................. 49

FIGURA 17: Expressão da hsPLA2 -IID recombinante em E. coli BL21. .......................... 50

FIGURA 18: Expressão das proteínas recombinantes mutantes de hsPLA2-IID em E. coli

BL21 após 5 horas de indução com IPTG. ........................................................................ 51

FIGURA 19: Cromatograma da purificação da hsPLA2 -IID renovelada segundo Ward e

colaboradores e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S............................ 52

xii

FIGURA 20: Cromatograma da purificação da hsPLA2 –IID renovelada com alteração do

estado de oxidação e redução do tampão de pré incubação e purificada em coluna de

troca catiônica Source 15S. ............................................................................................... 53

FIGURA 21: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA2-IID não

enovelada corretamente .................................................................................................... 54

FIGURA 22: Cromatograma da purificação da hsPLA2-IID renovelada por diluição

seguida de diálise e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S...................... 55

FIGURA 23: Cromatograma da purificação da hsPLA2 –IID renovelada segundo

protocolo estabelecido e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S. ............ 55

FIGURA 24: Cromatograma da purificação da hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes em

coluna de troca catiônica Source 15S............................................................................... 56

FIGURA 25: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA2-IID tipo

selvagem e mutantes. ........................................................................................................ 57

FIGURA 26: Hidrólise fosfolipídica da hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes no sítio

ativo na presença de CA2+ ou EGTA.................................................................................. 59

FIGURA 27: Cinética de liberação de calceína causada por hsPLA2-IID tipo selvagem e

mutantes sobre lipossomos compostos de DOPC e DOPG............................................. 61

FIGURA 28: Porcentagem da liberação de calceína encapsulada causada por hsPLA2-

IIDs em lipossomos compostos de DOPC e DOPG .......................................................... 61

FIGURA 29: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 5 e

10 � g.mL-1 de hsPLA2-IID sobre (A) Micrococcus luteus e (B) Escherichia coli (K12).. .. 63

FIGURA 30: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 10

� g.mL-1 de hsPLA2-IID mutantes sobre (A) Micrococcus luteus e (B) de Escherichia coli

(K12).................................................................................................................................... 65

FIGURA 31: Mecanismo catalítico de coordenação com Ca+2 proposto por Yu et al para

as sPLA2. ........................................................................................................................... 72

FIGURA 32: Porcentagem do número de UFC apresentado no efeito bactericida sobre

E.coli K12 e M.luteus por (A) hsPLA2-IIA e (B) BthTx-I. .................................................... 75

FIGURA 33: Estrutura simulada da proteína hsPLA2-IID(A) comparada a estrutura da

hsPLA2-IIA (B) e da BthTx-I (C). ........................................................................................ 77

FIGURA 34: Alinhamento das seqüências de aminoácidos das proteínas hsPLA2-IID,

hsPLA2-IIA e BthTx-I........................................................................................................... 78

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1: Resíduos de aminoácidos conservados entre hsPLA2-IID e BthTx-I e entre

hsPLA2-IID e hsPLA2-IIA na região do sítio de reconhecimento interfacial. .................... 79

xiii

ABREVIATURAS

ADIFAB: proteína de ligação de ácido

graxo intestinal marcada com Acrilodan.

ACS: acilceramida sintase

ATP: adenosina trifosfato

BthTX-I: bothropstoxina I

CD: dicroísmo circular

cDNA: DNA complementar

CFU: unidade formadora de colônias

Cho: colina

CI: corpos de inclusão

cPLA2: fosfolipase A2 citosólicas

DAG: diacilglicerol

DTT: ditiotreitol

dNTP:Desoxirribonucleotídeos fosfatados

DOPC: dioleoil fosfatidilcolina

DOPG: dioleoil fosfatidilglicerol

DMSO: dimetilsufóxido

DNA: ácido dioxiribonucleotídeo

E. coli: Escherichia coli

EDTA: ácido etilenodiamintetraacético

EGTA: ácido etitlenoglicoltetraacético

EXT1: oligonucleotídeo da extremidade 5´

EXT3: oligonucleotídeo seletivo

FA: ácido graxo

GdnHCl: hidrocloreto de guanidina

HDM: High density médium

HEPES: 4-(2-Hidroxiethil)1-ácido

piperazineethanesulfonico

HPLC: High-performance liquid

chromatography

I-FABP: proteína de ligação de ácido

graxo intestinal

iPLA2: fosfolipase A2 independente de

Ca2+

IPTG: isopropil- β-D-tiogalactopiranosídeo

IRS: sítio de reconhecimento interfacial

kDa: quilodalton

LB: Meio de cultura Luria-Bertan.

LysoPC: lisofosfolipídio

M. luteus: Micrococcus lysodeikticus MET: Mutagênese de Escaneamento do

Triptofano

MUT: oligonucleotídeo mutagênico

NBS: N-bromo-sucimanida

NMR: ressonância magnética nuclear

NTSB: 2-nitro-5-(sulphotio)-benzoato

OD: densidade ótica

ORF: janela de leitura aberta

PAF-AH: fator de agregação de plaquetas-

acetilhidrolase

P-Cho: fosfocolina

PCR: reação em cadeia de polimerase

PIPES:1,4-Piperazin-bisethansulfonado

PLA1: fosfolipase A1

PLA2: fosfolipase A2

PLA2-Asp49: fosfolipase A2 com resíduo

de ácido aspártico na posição 49

PLA2-Lys49: fosfolipase A2 com resíduo

de lisina na posição 49

sPLA2 : fosfolipase A2 secretada

hsPLA2-IIA: fosfolipase A2 secretada

humana do grupo IIA

hsPLA2-IID: fosfolipase A2 secretada

humana do grupo IID

PLB: fosfolipase B

PLC: fosfolipase C

PLD: fosfolipase D

PMSF: phenylmethanesulphonylfluoride

SMC: sítio múltiplo de clonagem

SDS: dodecilsulfato de sódio

UTR: regiões não traduzidas

UV: ultravioleta

xiv

Nomenclatura, classificação e estrutura dos 20 aminoácidos

encontrados em sistemas biológicos.

Não polares

Glicina Alanina Valina Leucina Metionina Isoleucina (Gly) (Ala) (Val) (Leu) (Met) (Ilo) (G) (A) (V) (L) (M) (I)

Aromáticos

Fenilalanina Tirosina Triptofano (Phe) (Tyr) (Trp) (F) (Y) (W)

Polares não carregados

Serina Treonina Cisteín Glutamina Prolina Asparagina (Ser) (Thr) (Cys) (Gln) (Pro) (Asn) (S) (T) (C) (Q) (P) (N)

xv

Positivamente carregados

Histidina Lisina Arginina (His) (Lys) (Arg) (H) (K) (R)

Negativamente carregados Aspartato Glutamato (Asp) (Glu) (D) (E)

xvi

ABSTRACT

Phospholipases A2 (PLA2s) are enzymes involved in a wide range of

physiological processes, including phospholipid hydrolysis, membrane

recycling and regulation of the immune system in pathological states. The

group II secreted PLA2s (sPLA2-II) are proteins of the immune system present

in the acute phase of the immune response and show bactericidal activity,

participating in the activation and release of cytokines and other inflammatory

mediators. Although the recent studies have focused on the pharmacological

effects and catalytic mechanism of group IIA human sPLA2 (hsPLA2-IIA), little

attention has been paid to group IID human sPLA2 (hsPLA2-IID), a protein

associated with the development of the inflammatory process. The present

work represents a study to evaluate a possible correlation between the

mechanism of permeabilization of models membranes and the bactericidal

activity of the hsPLA2-IID.

The coding sequence of hsPLA2-IID was inserted in the expression

vector pET3a, and the recombinant protein was produced in the form of

inclusion bodies in Escherichia coli BL21(DE3). A protocol for the refolding of

the recombinant protein was developed that allowed the production of hsPLA2-

IID in the native conformation. To evaluate the role of catalytic activity in the

membranes permeabilization effect and in the bactericidal activity, mutants

H48Q, D49K and G30S in catalytic site were produced with the intention of

reducing or eliminating the catalytic activity of the enzyme.

The protein wild type hsPLA2-IID and the H48Q mutant had presented

hydrolytic activity of 58,45 and 7,7 � M.min-1.mg-1 respectively, and

xvii

demonstrated a membrane damages against liposomes. In contrast, mutants

G30S and D49K lost the catalytic activity completely, but retained the capacity

to damage artificial membranes, demonstrating that the hydrolytic activity and

the artificial membrane activity are not correlated. The wild type hsPLA2-IID

demonstrated bactericidal effect against Gram-negative (E. coli K12) and

Gram-positive (Micrococcus luteus) bacterias. The H48Q and D49K mutants

showed, the bactericidal activity against the E. coli, demonstrating that the

catalytically independent activity contributes to the killing effect against this

strain. The same mutants also cause significant reduction in the activity

against M. luteus, showing that the mechanisms of the bactericidal effect are

different between Gram-negative and Gram-positive bacteria. The effect of the

hsPLA2-IID mutations have been compared with the effect of the same

mutations in hsPLA2-IIA and with botropstoxina-I, a PLA2-Lys49 isolated from

the venon of Bothrops jararacussu, indicating that in addition its catalytic and

catalyzes independent activity, access to the internal membrane of the

bacterium may be a important factor in the determination of the bactericidal

activity of group II phospholipases A2.

xviii

RESUMO

As fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) são enzimas envolvidas em uma

ampla variedade de processos fisiológicos que compreendem digestão

fosfolipídica, remodelagem de membranas, regulação do sistema imunológico

e processos patofisiológicos. As PLA2s secretadas do grupo II (sPLA2-II) são

proteínas do sistema imune presentes na resposta de fase aguda e na

atividade bactericida, participando na ativação e liberação de citosinas e de

outros mediadores pré-inflamatórios. Apesar dos estudos recentes sobre os

efeitos farmacológicos e mecanismo catalítico da sPLA2 do grupo IIA humana

(hsPLA2-IIA), pouca atenção tem sido dada à sPLA2 do grupo IID humana

(hsPLA2-IID), uma proteína associada ao progresso do processo inflamatório.

O presente trabalho representa um estudo para avaliar uma eventual

correlação entre o mecanismo de permeabilização de membranas modelos e

a atividade bactericida de hsPLA2-IID.

A seqüência codificadora da hsPLA2-IID foi inserida no vetor de

expressão pET3a, e a proteína heteróloga foi produzida na forma de corpos

de inclusão em Escherichia coli BL21(DE3). Um protocolo de enovelamento

da proteína recombinante foi desenvolvido que permitiu a produção de

hsPLA2-IID na conformação nativa. Para avaliar o papel de atividade catalítica

no efeito de permeabilização de membranas modelos e na atividade

bactericida, as mutantes H48Q, D49K e G30S na região de sitio ativo foram

produzidos com o intuito de reduz ou eliminar a atividade catalítica da enzima.

A proteína hsPLA2-IID tipo selvagem e a mutante H48Q apresentaram

atividade hidrolítica de 58,45 e 7,7 � M.min-1.mg-1 respectivamente, e

demonstraram uma atividade de danificação de membranas artificiais. Em

xix

contraste, as mutantes G30S e D49K perderam completamente a atividade

catalítica, mas mantiveram a capacidade de danificar membranas artificiais,

demonstrando que a atividade hidrolítica e a danificação de membranas

modelos não estão correlacionadas. A proteína hsPLA2-IID tipo selvagem

demonstrou um efeito bactericida contra bactérias Gram-negativa (E. coli K12)

e Gram-positiva (Micrococcus luteus). As mutantes H48Q e D49K reduziram,

mas não aboliram a atividade bactericida contra a E. coli, demonstrando que a

atividade independente da atividade catalítica contribui para o efeito contra

este linhagem. As mesmas mutantes causam uma redução maior na atividade

contra M. luteus, mostrando que os mecanismos do efeito bactericida são

diferentes entre bactérias Gram negativas e positivas. Os efeitos das

mutações da hsPLA2-IID foram comparados com os efeitos das mesmas

mutações na hsPLA2-IIA e com botropstoxina-I, uma Lys49-PLA2 isolado do

veneno da serpente Bothrops jararacussu, indicando que além da atividade

catalítica e a atividade independente de catalise, acesso a membrana interna

da bactéria pode ser um fator na determinação da atividade bactericida das

fosfolipases A2 de classe II.

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

1

1. INTRODUÇÃO

As fosfolipases são enzimas lipolíticas que estão agrupadas nas

famílias A1 (PLA1), A2 (PLA2), B (PLB), C (PLC) e D (PLD) de acordo com a

ligação hidrolisada no fosfolipídio (FIGURA 1). As fosfolipases A2 (PLA2) ou

fosfatidil-acil hidrolases (EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das

ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como

produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios (VAN DEENEN E DE

HAAS, 1963), sendo a hidrólise realçada sobre substratos agregados

micelares e lamelares, em membranas ou ainda, na interface água-lipídio

(RAMIREZ E JAIN, 1991).

FIGURA 1: Hidrólise de fosfatidilcolina pela PLA1, PLA2, PLB, PLC e PLD, e os

respectivos produtos da reação. As fosfolipases A2 hidrolisam especificamente a ligação

éster sn-2 de fosfolipídios e liberam, como produto da catálise, ácido graxo e lisofosfolipídio.

Cho, colina; DAG, diacilglicerol; P-Cho, fosfocolina, FA, ácido graxo.

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

2

As PLA2s estão envolvidas em uma ampla variedade de processos

fisiológicos incluindo digestão fosfolipídica, remodelagem de membranas

biológicas e defesa do hospedeiro. Essas proteínas também participam de

processos patofisiológicos através da produção de mediadores lipídicos tais

como prostaglandinas e leucotrienos. O fato de exibirem uma função central

em diversos processos celulares faz com que as PLA2s sejam alvos de muitos

estudos, com o objetivo de correlacionar estrutura com função da enzima.

As fosfolipases A2 constituem uma classe diversificada de enzimas com

relação à localização, regulação, mecanismo, seqüência de aminoácidos e

estrutura tridimensional. A superfamília de fosfolipases A2 consiste em 15

grupos (SCHALOSKE E DENNIS, 2006), subdivididas em cinco principais

subfamílias: PLA2s secretadas (sPLA2), PLA2s citosólicas (cPLA2), PLA2s

independente de Ca2+ (iPLA2), as PAF-AH (fator de agregação de plaquetas -

acetilhidrolases) e as PLA2s lisosomais.

As PLA2 secretadas compreendem os grupos I, II, III, V, IX, X, XI, XII,

XIII e VIX. São enzimas interfaciais, de baixo peso molecular, dependentes de

Ca2+, encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais

vertebrados e invertebrados e estão implicadas na digestão fosfolipídica,

geração de mediadores lipídicos, proliferação celular, exocitose, atividade

bactericida, câncer e doenças inflamatórias. As sPLA2s do grupo I são

enzimas encontradas tanto no suco pancreático de mamíferos como no

veneno de serpentes das famílias Elapidae e Hidrophidae. Apresentam peso

molecular de 13 a 15 kDa e 14 resíduos de cisteínas que formam 7 pontes

dissulfeto. Ao grupo II pertencem as sPLA2s do veneno de serpentes das

famílias Viperidae e Crotalidae, do fluido sinovial de mamíferos (grupo IIA), do

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

3

veneno da víbora Gaboon (grupo IIB), do testículo de camundongos (grupo

IIC), do baço e pâncreas de camundongos/humanos (grupo IID), do útero,

coração e cérebro de camundongo/humano (grupo IIE) e do embrião e

testículo de camundongos (grupo IIF). Além desses cinco grupos, as sPLA2s

do grupo IIC, encontradas em roedores, foram identificadas em um

pseudogene em humanos (TISCHFIELD, 1997). São enzimas que

apresentam peso molecular de 13-17 kDa e contém de 6 a 8 pontes

dissulfeto. As proteínas dos grupos I e II apresentam alta similaridade em

suas seqüências de aminoácidos e alto grau de homologia estrutural. As

sPLA2s do grupo III incluem enzimas dos venenos de abelhas, lagartos e

também são encontradas nos exudados inflamatórios e grânulos de plaquetas

e mastócitos. O grupo V é composto de sPLA2s encontradas em macrófagos,

coração e pulmão de mamíferos e são expressas principalmente em resposta

a estímulos inflamatórios. Ao grupo IX pertencem as sPLA2s isoladas do

veneno de um gastrópodo marinho. O grupo X compreende sPLA2s isoladas

do timo, baço e leucócito humano. O grupo XI representa sPLA2s isoladas de

plantas e a descoberta de uma nova fosfolipase A2 isolada de células T-helper

(HO, et al., 2001) levou ao estabelecimento do 12o grupo. O grupo XIII

compreende as sPLA2s encontradas em parvovírus (CANAAN, et al., 2002) e

o grupo XIV compreende as sPLA2s de fungos simbiontes e bactérias e estão

envolvidas na invasão celular durante rompimento da membrana celular do

hospedeiro (ISTIVAN E COLOE, 2006).

As PLA2s citosólicas compreendem o grupo IV composto de enzimas

que apresentam de 61 a 114 kDa e são encontradas tanto no músculo

esquelético e cardíaco de humanos (grupo IVC), no cérebro, coração e fígado

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

4

de humanos (grupo IVB) quanto no fígado de rato e plaquetas de humanos

(grupo IVA). Ambas cPLA2 dos grupos IVB e IVC mostram uma pequena

especificidade para ácidos graxos sn-2 (SONG, et al., 1999, STEWART, et al.,

2002). O grupo IVD mostrou certa especificidade para acido linoléico (CHIBA,

et al., 2004). O grupo IVE não mostrou ter prioridade por substratos contendo

fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, no entanto o grupo IVF parece preferir

fosfatidiletanolamina como substrato (OTHO, et al., 2005).As PLA2s citosólicas

têm recebido mais atenção como reguladoras da biossíntese do fator de

agregação de plaqueta (PAF) e eicosanóides, devido à liberação seletiva de

ácido araquidônico. Estas enzimas sofrem translocações dependentes de Ca2+

do citosol para as membranas do retículo endoplasmático e perinuclear, onde

estão localizadas várias enzimas associadas com a síntese de eicosanoídes,

como ciclooxigenases e lipoxigenases.

As PLA2s citosólicas de peso molecular entre 84-90 kDa,

independentes de Ca2+ (iPLA2) exibem função central na remodelagem de

fosfolipídios (BALSINDE, et al., 1999). São encontradas no músculo

esquelético/cardíaco, testículo, linfócito e macrófago de humanos e

compreendem o grupo VI com subgrupos A-1, A-2, B, C, D, E e F. As iPLA2s

dos grupos VIA exibem função central na liberação de ácido aracdônico que

resulta na formação de ecosanoide (RICKARD, et al., 2005), na secreção

(SONG, et al., 1999), além de apresentar um papel na apoptose (ATSUMI, et

al., 2000). O grupo VIB também está envolvido na liberação de ácido

aracdônico para formação de eicosanóides, e estudos com enentiômeros de

lactona bromoenol tem ajudado a diferenciar as funções celulares entre os

grupos VIA e VIB (JENKINS, et al., 2002).

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

5

PAF-AHs (grupos VII e VIII) pertencem a um subtipo de fosfolipase A2

que degrada especificamente PAF e lipídios oxidados relacionados. Os

grupos VII e VIII compreendem enzimas com atividade de PAF

acetilhidrolases sendo pertencentes ao grupo VII àquelas que apresentam de

40 a 45 kDa e são encontradas tanto no plasma quanto intracelularmente no

fígado e rim de humano/bovino e ao grupo grupo VIII aquelas com 26 kDa

encontradas no cérebro humano.

As PLA2 lisossomais foram primeiramente purificadas do cérebro

bovino e denominadas como 1-O-acilceramida sintase (ACS) (ABE E

SHAYMAN, 1998). Entretanto, o grupo acil hidrolisado é transferido através de

uma enzima acil para ceramida ou água resultando ou na produção de 1-O-

acil-ceramida (ACS atividade) ou na liberação de ácidos graxos livres (PLA2

atividade) dessa forma nome ACS foi modificado por PLA2 lisossomal (LPLA2)

(HIRAOKA, et al., 2002) e de acordo com a nomenclatura de superfamília de

fosfolipases, esta enzima foi nomeada agora pelo grupo XV PLA2.

Estrutura de PLA2s dos grupos I e II

Estudos cristalográficos e espectroscópicos contribuíram

significativamente para a elucidação de um modelo para a catálise das PLA2s

(SCOTT, et al., 1992, SCOTT, et al., 1990, VERHEIJ, et al., 1981). As

enzimas que incluem um par aspartato-histidina no sítio ativo são tipicamente

extracelulares de baixo peso molecular e requerem concentrações milimolares

de Ca2+ para exercerem sua atividade catalítica. Por outro lado, os grupos que

utilizam uma serina no sítio catalítico são tipicamente enzimas maiores,

intracelulares que utilizam uma serina nucleofílica para a clivagem hidrolítica e

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

6

que não apresentam nenhuma ligação dissulfeto e nenhum requerimento de

Ca2+ para a catálise.

As estruturas tridimensionais das proteínas dos grupos I, II e III na

presença e ausência do cofator Ca2+ e também de inibidores específicos para

a atividade catalítica foram resolvidas por cristalografia de raio-X (SCOTT, et

al., 1990). Como apresentado na FIGURA 2 das PLA2s apresentam duas � -

hélices anti-paralelas conservadas (onde se localizam os resíduos do sítio

ativo), associadas com uma alça rica em resíduos de glicina, que está

envolvida na ligação do Ca2+ (ARNI, et al., 1999, ARNI E WARD, 1996,

SCOTT E SIGLER, 1994).

FIGURA 2: Representação em fita da estrutura tridimensional de uma Asp 49-PLA2 de

peçonha de serpente (MARCUSSI et al., 2007). Estrutura tridimensional típica das classes I

e II de sPLA2. As principais hélices e alças estão indicadas.

“asa” �

Hélice 3 Hélice 2

Hélice 1

Alça C-terminal

Alça de ligação do

Ca+2

Sítio Ativo

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

7

Utilizando a numeração de homologia dos grupos I e II, (DIJKISTRA, et

al., 1981) foi constatado que as posições dos resíduos His48, Asp49, Tyr52 e

Asp99 são altamente conservadas no sítio ativo dos dois grupos

(RENETSEDER, et al., 1985), sendo que, resíduos análogos são encontrados

no grupo III. O grupo carboxila do resíduo de aspartato presente na posição

49, juntamente com três oxigênios carbonil da cadeia principal dos resíduos

Tyr28, Gly30 e Gly32, estão envolvidos na ligação do Ca2+ (THUNNISSEN, et

al., 1990), que funciona como um cofator no mecanismo de hidrólise (SCOTT,

et al., 1992, VERHEIJ, et al., 1980) Este cofator orienta tanto o substrato

fosfolipídico, como estabiliza o intermediário catalítico tetraédrico (SCOTT, et

al., 1990, SCOTT, et al., 1990, THUNNISSEN, et al., 1990) e, na sua

ausência, as PLA2s são inativas.

O mecanismo proposto por VERHEIJ e colaboradores (1981) e

revisado (BERG, et al., 2001) sugere que os resíduos Asp99, His48 e uma

molécula de água formam uma tríade catalítica . A seqüência do mecanismo

catalítico proposto ocorre em 3 etapas (FIGURA 3): (1) desprotonação da

molécula de água pela díade catalítica His48/Asp99; (2) ataque nucleofílico na

ligação ester sn-2 do glicerofosfolipídio pela água desprotonada; e a formação

do intermediário tetraédrico, que é estabilizado pelo cofator Ca2+; (3) e

finalmente, colapso do intermediário da reação, com a liberação dos produtos

da catálise, ácido graxo e lisofosfolipídio. O passo limitante da reação seria a

formação do intermediário tetraédrico quando o grupo δN do H48 é protonado.

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

8

FIGURA 3. Mecanismo de tríade catalítica de PLA2s. Representação esquemática do

mecanismo catalítico proposto para PLA2s. Asp 99, His48 e uma molécula de água formam

uma tríade catalítica, na qual a desprotonação da molécula de água pelo resíduo de His48

gera o ataque nucleofílico.

Fosfolipases Humanas e Suas Funções Independentes de Catálise

Cinco grupos de sPLA2s (IB, IIA, IID, V e X), identificados em humanos,

(TISCHFIELD, 1997) aumentam sinergicamente no plasma de pacientes com

inflamações sistêmicas, como choque séptico e queimaduras graves (NAKAE,

ET AL., 1995, SORENSEN E MARTINOFF, 1984) ou com sistema

imunológico inato comprometido (HAAPAMAKI, et al., 1999, HUHTINEN, et

al., 1999, LIN, et al., 1996)

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

9

Inicialmente, as sPLA2s humanas (hsPLA2s) eram consideradas

importantes no processo inflamatório devido á liberação de ácido aracdônico,

precursor de mediadores pré-inflamatórios, com prostaglandinas e

leucotrienos. Entretanto, estudos recentes têm sugerido que o efeito pré-

inflamatório das hsPLA2s não é limitado ao metabolismo do ácido

araquidônico. Muitas doenças associadas com alto nível de sPLA2 extracelular

são caracterizadas por um aumento significativo das concentrações de

citocinas como TNF- � e interleucina 1 � (GRANATA, et al., 2003,

HAAPAMAKI, et al., 1999). Além disso, hsPLA2s são relatadas por induzir

desgranulação e produção de citocinas de uma variedade de células

autócrinas envolvidas em respostas inflamatórias (GRANATA, et al., 2003,

TOUQUI E ALAOUI-EL-AZHER, 2001). Este efeito ocorre por um mecanismo

independente da atividade enzimática o qual é mediado por interação das

hsPLA2s com receptores específicos de membrana (GRANATA, et al., 2003).

A descoberta da hsPLA2-IIA em plaquetas e fluido sinovial

(NEVALAINEN, et al., 1993), bem como sua associação com desordens

inflamatórias, direcionaram os esforços para determinação da função

fisiológica desta enzima (TOUQUI E ALAOUI-EL-AZHER, 2001). A localização

da sPLA2-IIA em macrófagos (INADA, et al., 1991), células Paneth do

intestino 1993 (HIETARANTA, et al., 1993, QU, et al., 1996), células da

glândula lacrimal (AHO, et al., 1996, NEVALAINEN, et al., 1994) , plaquetas

(KRAMER, et al., 1989), neutrófilos (WRIGHT, et al., 1990) e mastócitos

(MURAKAMI, et al., 1992) evidenciou uma possível função no sistema

imunológico inato do corpo (TOUQUI E ALAOUI-EL-AZHER, 2001).

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

10

As fosfolipases A2 do grupo IIA e grupo V e de várias serpentes contém

vários resíduos básicos na superfície da enzima, entre os resíduos 54 e 77,

que estão envolvidos na ligação ao fator Xa e assim impedindo a formação do

complexo protrombinase durante a coagulação sanguínea (MOUNIER, et al.,

2001) O efeito anticoagulante dessas PLA2 é independente da hidrólise de

fosfolipídios (KINI, 2005).

A hsPLA2-IIA apresenta um efeito bactericida evidente contra a

Micrococcus luteus, e a retirada de cargas positivas da enzima feita por

mutagênese sítio dirigida diminuíram o efeito bactericida em relação à nativa

(BEERS, et al., 2002). Foi sugerido que este resultado é devido à redução na

afinidade da proteína pela membrana bacteriana e à eliminação na hidrolise

dos fosfolipídeos (BEERS, et al., 2002). Entretanto, mutações no sítio ativo

(H48Q e D49K), reduziram, mas não eliminaram a atividade bactericida de

hsPLA2-IIA (CHIOATO, 2004). Com estes resultados pode-se inferir que a

função bactericida conferida por esta proteína é apenas parcialmente

dependente da atividade catalítica.

As propriedades enzimáticas da hsPLA2-IID e da hsPLA2-IIA são

similares em termos de requerimento de Ca+2, pH ótimo e substrato específico

(ISHIZAKI, et al., 1999). Entretanto o efeito bactericida de sPLA-IID tem sido

pouco avaliado e embora relatos com a proteína de camundongos mostrem

uma atividade bactericida evidente (KODURI, et al., 2002) até o presente,

nada foi relatado sobre a contribuição da sPLA2-IID humana nesta atividade.

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

11

Comparação das Funções de sPLA2-IID e sPLA2s-IIA com as sPLA-Lys49

do Veneno de Serpentes

Algumas variantes das sPLA2s, como a subfamília de sPLA2s miotóxica

do grupo II isolada do veneno de serpentes do gênero Bothrops,

Bothropstoxina-I (BthTx-I) , apresentam uma substituição do aminoácido ácido

aspártico (Asp) por lisina (Lys) na posição 49 do sítio ativo. Esta substituição

impede a ligação do cofator Ca2+, com a conseqüente perda do ciclo catalítico

produtivo, pois o grupo � -amino do Lys49 está localizado na posição

normalmente ocupada pelo cofator Ca2+ nas PLA2s-Asp49 (HOLLAND, et al.,

1990, SCOTT, et al., 1992). Embora sem atividade catalítica fosfolipásica, a

interação da sPLA2-Lys49 com membranas artificiais de lipossomos provoca

uma rápida liberação do conteúdo aquoso dos mesmos (PEDERSEN, et al.,

1995, RUFINI, et al., 1992). Em adição, as sPLA2s-Lys49 apresentam efeito

bactericida e atividade citotóxica, sugerindo que essas proteínas exibem

atividade de danificação de membranas em uma ampla variedade de alvos

biológicos (LOMONTE, et al., 1994) independente da ação catalítica (WARD,

et al., 2002)

A região C-terminal da sPLA2s-Lys49 e da hsPLA-IID é rica em

aminoácidos aromáticos e positivamente carregados (FRANCIS, et al., 1991,

WARD, et al., 1998). Motivos com resíduos catiônicos/hidrofóbicos são

observados em várias proteínas e peptídeos que interagem com membranas,

indicando que esta combinação de aminoácidos forma estruturas com

capacidade para penetrar na bicamada lipídica (SEGREST, et al., 1990).

Mutagênese sítio dirigida na região C-terminal de sPLA2s-Lys49 foi utilizada

para investigar o papel desta região nas atividades contra membranas

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

12

artificiais e biológicas (CHIOATO, et al., 2002). Os resultados demonstraram

que resíduos catiônicos e aromáticos localizados entre os resíduos 117 e 122

são determinantes estruturais das atividades miotóxica, danificadora de

membranas artificiais e efeito bactericida (CHIOATO, et al., 2007).

Recentemente, foi demonstrado que as substituições na região C-terminal de

sPLA2-Lys49, causa redução na atividade danificadora de membranas

artificiais, e também reduz o efeito bactericida, sugerindo que estes dois

efeitos estão correlacionados (ARAGÃO, 2005). O papel da hidrólise dos

fosfolipídios na atividade bactericida também é questionado pela atividade

bactericida apresentada pelas PLA2s-Lys49, que sugere que o mecanismo

bactericida pode ser causado na ausência de catálise. Tanto BthTX-I quanto

hsPLA2 -IIA são proteínas básicas e apresentam alto número de aminoácidos

positivamente carregados em suas seqüências. Dessa forma, BEERS,

colaboradores (2002), sugerem que esta natureza fortemente catiônica

permite a penetração na parede celular durante o efeito bactericida. Dentro

deste parâmetro de investigação da base estrutural de atividades

farmacológicas de PLA2s de veneno de serpentes, a observação de que as

PLA2s-Lys49 apresentam efeito bactericida contra bactérias gram-negativas e

gram-positivas apesar de não apresentarem hidrólise de fosfolipídios de

membranas e uma vez que, a hsPLA2-IIA apresenta um efeito bactericida

parcialmente dependente da atividade catalítica, e também uma atividade

danificadora de membranas artificiais Ca2+ independente (CHIOATO, et al.,

2007) e como há poucos estudos sobre a hsPLA2-IID, uma das metas deste

trabalho é identificar e avaliar o papel da atividade catalítica desta enzima

nestes efeitos.

_______________________________________________________________________INTRODUÇÃO

13

A sPLA2-IID representa a isoenzima mais próxima a sPLA2-IIA e

segundo Ishizaki e colaboradores (1999), estaria substituindo sPLA2-IIA em

algumas condições da resposta inflamatória, pois em camundonfgos

deficientes de sPLA2-IIA há um aumento da expressão de PLA2-IID durante

infecções. Entretanto a expressão de sPLA2-IID, detectada em diferentes

mamíferos, ocorre principalmente no baço e no timo o que é contrastante com

a expressão da sPLA2-IIA, enfatizando que essas duas enzimas teriam

funçãos diferentes no organismo.

Apesar das evidências de que alguns efeitos celulares são provocados

por sPLA2 do grupo IID, não é conhecido se a atividade catalítica dessa

enzima está envolvida na atividade danificadora de membranas biológicas

e/ou artificiais. Portanto, o papel da atividade catalítica da hsPLA2-IID nos

efeitos biológicos ainda está por ser esclarecido e diante das evidências que

mostram sua participação em processos inflamatórios o estudo das atividades

dependentes e independentes da atividade catalítica nesses processos torna-

se relevante.

_________________________________________________________________________OBJETIVOS

14

2. OBJETIVOS

O objetivo geral do atual trabalho é avaliar a contribuição da atividade

catalítica da fosfolipase humana do grupo IID (hsPLA2-IID) no efeito

bactericida e na danificação de membranas artificiais. Portanto, os três

objetivos específicos consistiram em:

2.1) Expressão de hsPLA2-IID em E. coli, e estabelecimento de um

protocolo de purificação e enovelamento da enzima recombinante.

2.2) Avaliar o papel da atividade hidrolítica na atividade de danificação

de membranas artificiais, através de mutagênese sítio dirigida de resíduos no

sítio ativo da hsPLA2-IID.

2.3) Avaliar o papel da atividade hidrolítica da hsPLA2-IID tipo selvagem

e mutantes no efeito bactericida sobre linhagens Gram-negativa e Gram-

positiva.

_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS

15

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Subclonagem do Gene de hsPLA2-IID em vetor pET-3a

O cDNA da hsPLA2-IID inserido em vetor de clonagem pCMV-SPORT6

foi obtido do IMAGE Consortium/MGC (IMAGE ID 5223912, Geneservice Ltd,

Cambridge, RU). Para a expressão o gene da hsPLA2-IID foi subclonado em

um vetor de expressão pET3a. O vetor pET-3a foi inicialmente escolhido pois

já possui um sistema de expressão bem padronizado em nosso laboratório e

uma análise do mapa de restrição do pCMV-SPORT6+hsPLA2-IID e do vetor

pET-3a foi realizada, e foram identificadas posições para inserir os sítios de

restrição únicos para NdeI e BamHI.

Oligonucleotídeos complementares às extremidades 5` (PLAG2DN) e

3` (PLAG2DC) do gene humano foram construídos introduzindo os sítios de

restrição nas extremidades da região codificadora. A partir de uma reação de

PCR, um fragmento foi amplificado e seqüenciado confirmando que a região

codificadora da hsPLA2-IID está flanqueada por sítios das enzimas de

restrição BamHI e NdeI.

NdeI

PLAG2DN (5`-3`): CCAATC CATATG GCGATCCTG

BamHI

PLAG2DC (5`-3`): AGGTGG GGATCC CAGAGCTCC


16

3.1.1. Vetores pET

Os vetores da série pET - Plasmídeos para a Expressão pela T7 RNA

polimerase - Novagen - (ROSENBERG, et al., 1987, STUDIER E MOFFATT,

1986, STUDIER, et al., 1990) apresentam uma seqüência promotora T7 N-

terminal, que controla a expressão de genes inseridos dentro do sítio múltiplo

de clonagem (SMC), além de apresentarem marcadores seletivos para a

resistência à ampicilina. Uma característica do sistema pET de vetores é a

capacidade de clonagem de genes sob condições de atividade transcricional

extremamente baixa. O nível de expressão basal é mínimo na ausência de T7

RNA polimerase porque o sítio de clonagem múltiplo (SMC) se localiza em

uma região fracamente transcrita pela atividade de leitura da RNA polimerase

bacteriana. Apenas após a indução com IPTG (isopropil -β-D-

tiogalactopiranosídeo), ocorre a transcrição e a tradução da enzima T7 RNA

polimerase do bacteriófago T7, que reconhece o promotor T7 N-terminal

presente no vetor, e transcreve o RNA mensageiro dos genes localizados

abaixo (downstream) do promotor T7. A T7 RNA polimerase elonga cadeias 5

vezes mais rapidamente do que a RNA polimerase de Escherichia coli,

fazendo transcritos completos de qualquer DNA sob controle deste promotor

(STUDIER E MOFFATT, 1986).

3.2. Mutagênese Sítio-Dirigida

O protocolo utilizado para a obtenção das proteínas recombinantes

mutantes da hsPLA2-IID foi o de mutagênese sítio-dirigida através de uma

modificação na reação em cadeia da polimerase (NELSON E LONG, 1989).


17

Esta técnica é muito utilizada em estudos de correlação entre estrutura e

função de proteínas, pois permite a introdução de uma mutação em qualquer

posição de uma seqüência de DNA de fita dupla.

O processo de mutagênese sítio-dirigida através da reação em cadeia

de polimerase é realizado em três etapas ilustradas na FIGURA 4. A primeira

é responsável pela inserção da mutação na região alvo. Na segunda etapa,

ocorre a extensão do fragmento mutado originado na primeira etapa, e na

terceira etapa é selecionada e amplificada somente a fita de DNA que

contenha a mutação.

FIGURA 4: Esquema ilustrativo de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia de

polimerase. EXT1, PLAG2DC, EXT3 E MUT: oligonucleotídeos complementares a seqüência

molde; NdeI e BamHI representam as posições dos sítios de restrição enzimáticos; ORF:

“Open Reading Frame” (fase de leitura aberta); UTR: regiões não traduzidas


18

Para a mutagênese sítio-dirigida por PCR, além dos dois

oligonucleotídeos complementares às extremidades da seqüência de DNA

alvo (EXT1 e PLAG2DC), um terceiro oligonucleotídeo é necessário, chamado

oligonucleotídeo mutagênico (MUT). O oligonucleotídeo mutagênico (5’ para

3’) é complementar à fita codificadora da seqüência de DNA de interesse e

apresenta um ou mais nucleotídeos de determinada trinca alterados para a

determinação de um novo aminoácido.

3.2.1. Etapa I da reação de PCR: síntese do fragmento mutante

O primeiro passo da PCR para mutagênese sítio-dirigida foi realizado

com 100 pMols do oligonucleotídeo mutagênico (MUT), 100 pMols do

oligonucleotídeo externo (EXT1), 1mM do cofator MgCl2, 2,5 mM dNTP, 1 fMol

do DNA molde, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) em tampão de

PCR 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl) e água estéril para um volume

final de 50 � l. A reação foi realizada em termociclador, programado para 30

repetições do seguinte ciclo: 1) 2 minutos a 96°C, para desnaturação da fita

dupla 2) 1 minuto à 55°C para hibridação das fitas complementares; e 3) 2

minutos à 72°C para amplificação do fragmento. O fragmento de fita dupla

(EXT1-MUT) gerado após 25 ciclos da PCR foi analisado em gel de agarose

2%, purificado e quantificado em absorbância 260nm em espectrofotômetro

Hitach U-2000. O cDNA da hsPLA2-IID e subclonado em vetor pET-3a foi

usado como DNA molde.


19

3.2.2. Etapa II da reação de PCR: extensão do fragmento mutado

Na reação de extensão foi utilizado 1 pmol do fragmento gerado na

etapa I como iniciador em tampão de PCR 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50

mM KCl), contendo MgCl2 (1mM), dNTP (2.5mM), seqüência molde (1fMol),

2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e água estéril para um volume final

de 50 µL. A reação foi incubada em miniciclador por 2 minutos a 96°C, e

sofreu 5 repetições do seguinte ciclo: 1) 1 minuto a 96°C; 2) 30 segundos a

55°C e 3) 1 minuto a 72°C.

3.2.3. Etapa III da reação de PCR: amplificação do gene

Nesta última etapa, os ciclos da PCR são os mesmos que os da

primeira etapa, mas são utilizados dois outros oligonucleotídeos que delimitam

a amplificação da seqüência alvo inteira, PLAG2DC (3’ para 5’) e EXT3 (5’

para 3’). EXT3 é complementar a uma porção única de EXT1, portanto a

amplificação final só ocorrerá na etapa III se o oligonucleotídeo EXT1 tiver

sido incorporado durante a primeira etapa, ou seja, é um oligonucleotídeo

responsável pela amplificação seletiva do fragmento mutado.

Após a reação de extensão, o oligonucleotídeo PLAG2DC (100 pMol) e

o oligonucleotídeo EXT3 (100 pMol), que delimitam o gene, foram adicionados

à mistura, e a reação foi imediatamente incubada em miniciclador. O produto

da reação foi analisado em gel de agarose 2%, purificado e digerido para

posterior subclonagem em vetor de expressão.


20

3.2.4. Oligonucleotídeos de subclonagem

EXT1 (5’- 3’)

5’ GGA AAG CAG AGA AAA GAT GCC TAA TAC GAC TAC CTA TAG 3’

EXT3 (5’-3’): é o oligonucleotídeo responsável pela amplificação seletiva do

primeiro fragmento.

5’ GGA AAG CAG AGA AAA GAT GCC 3’

PLAG2DC (5`- 3`):

5’ AGG TGG GGA TCC CAG AGC TCC 3’

3.2.5. Oligonucleotídeos mutagênicos

As mutações G30S H48Q e D49K foram realizadas no sítio ativo da

enzima humana com o objetivo de eliminar a atividade catalítica da hsPLA2-

IID. Os mutantes G30S e D49K eliminam a atividade catalítica, pois impedem

a ligação do cofator, o íon Ca+2. A histidina na posição 48 está diretamente

envolvida no mecanismo catalítico, logo sua substituição dificulta o ataque

nucleofílico e o rompimento da ligação ester.

G30S (5’-3’) 5´GCC ACC TAG TGA GCA GTG ACA GCC 3´

H48Q (5’-3’) 5Á GCA GCA GTC TTG GGT CTG GC 3´

D49K (5’-3’) 5’ A GCA GCA TTT ATG GGT CTG GC 3’


21

3.3. Digestão Enzimática e Ligação do Gene de hsPLA2-IID ao Vetor

pET-3a

Para que haja a ligação unidirecional de um inserto de DNA em um

plasmídeo, os dois devem apresentar extremidades coesivas formadas

através da clivagem pelas mesmas enzimas de restrição. Por isso, tanto o

inserto contendo o gene selvagem e/ou mutante de hsPLA2-IID quanto o vetor

pET-3a foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e Ndel para

posterior subclonagem. A reação de digestão do gene foi realizada em volume

final de 100 � L, na presença de tampão 1X (10 mM Tris-acetato, 10 mM

acetato de magnésio e 50 mM de acetato de potássio, pH 7,5), 1 mM de

albumina sérica bovina e 2.5 U de cada uma das enzimas de restrição (BamHI

e NdeI - Promega). A mistura foi incubada por 90 minutos a 37°C, seguida da

inativação enzimática por 15 minutos a 65°C.

A digestão foi aplicada em gel de agarose 2% e a banda

correspondente ao gene da hsPLA2-IID selvagem ou mutante foi isolada e

submetida à purificação do gel através do kit de extração de banda de gel

“Clean-up” (Eppendorf). O vetor de expressão pET-3a foi digerido com BamHI

e NdeI em uma reação de volume final de 200 � L, na presença de tampão 1X

(10 mM Tris-acetato, 10 mM acetato de magnésio e 50 mM de acetato de

potássio, pH 7.5), 1 mM de albumina sérica bovina e 2,5 U de cada uma das

enzimas de restrição por 90 minutos a 37°C.

A reação de ligação foi feita na proporção molar de 10:1

fragmento/vetor respectivamente, anteriormente digeridos, na presença de 0,5

U de T4 DNA ligase e 1X do tampão apropriado (Tris-HCl 250 mM, MgCl2 50

mM, ATP 5 mM, DTT (ditiotreitol) 5 mM e 25% peso/volume de


22

polietilenoglicol-8000) em um volume final de 10 � L. A reação foi incubada por

1 hora a 23°C e o DNA plasmidial ligado foi transformado em E.coli DH5 � .

3.4. Transformação em Escherichia coli DH5 � Ca2+ Competente

A transformação bacteriana é o processo de introduzir um vetor,

recombinante ou não, em uma bactéria. No entanto, para permitir a entrada

de DNA plasmidial nas células bacterianas, a bactéria deve apresentar

condições fisiológicas especiais, ou seja, estar competente. A técnica para

torná-las competentes quimicamente envolvem tratamento com soluções

como cloreto de cálcio e mudanças bruscas de temperatura, que alteram a

permeabilidade da parede celular. A preparação de células DH5α

competentes foi feita através do inóculo de algumas células DH5α em meio

LB sólido (10g.L-1, 5g.L-1, 10g.L-1, 1,5% de ágar), para posteriormente serem

incubadas por 12 horas a 37oC. Algumas colônias foram inoculadas em 5 mL

de meio LB liquído (10g.L-1, 5g.L-1, 10g.L-1) a 180rpm, 37oC por 12 horas.

Todo conteúdo foi transferido para 500mL de meio e incubado a 37oC entre 2

a 3 horas, sob agitação de 180 rpm, até atingir a densidade óptica de 0,3 em

600 nm. Em seguida, a cultura foi incubada por 5 minutos no gelo e

centrifugada a 1200 x g, em 4oC, por 10 minutos. Após centrifugação, o

sobrenadante foi descartado e o precipitado celular, por leve agitação, foi

ressuspendido em 100 mL do tampão de competência (CaCl2 60 mM, PIPES

- 1,4-Piperazin-bis-(ethansulfonsado) - 10 mM e glicerol 15%) gelado. A

centrifugação foi repetida e o precipitado celular ressuspendido foi mantido

em gelo por 30 minutos. Após centrifugação a 4°C, 1200 x g por 10 minutos,

o precipitado celular foi ressuspendido em um volume final de 12 mL de


23

tampão e as células, agora competentes, distribuídas em alíquotas de 50 µL.

As mesmas foram estocadas a -70ºC até o uso.

Para o processo de transformação bacteriana, em cada tubo de 50 µL

de células DH5 � competentes, foram adicionados 20 µL da reação de

ligação, 1,0 µL de 1M MgCl2, 0,5 µL de 1M CaCl2 e 28,5 µL de água estéril. A

mistura final de 100 µL foi mantida em gelo por 20 minutos, e em seguida,

mantida a temperatura ambiente durante 10 minutos. Os íons cálcio

presentes na mistura têm a função de neutralizar as cargas negativas do DNA

e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela mesma

quando as células são transferidas do gelo para a temperatura ambiente. Em

seguida, 900 µL de meio LB líquido foram adicionados em cada tubo, e as

células mantidas a 37°C, sob a agitação de 180 rpm durante 1 hora para

regeneração. Durante o processo de transformação, apenas os plasmídeos,

que se recircularizaram por meio da ligação com o inserto, serão inseridos na

bactéria. Logo, a seleção da bactéria que apresenta o vetor, daquela que não

foi transformada, foi feita pelo plaqueamento de 50 µL da suspensão celular

em meio LB sólido contendo 100 µg.mL-1 de ampicilina, pois o vetor pET-3a

apresenta resistência a este antibiótico. As bactérias cresceram por 12 horas

a 37°C.

Como alguns vetores nativos podem ter sido transformados, foi

necessária uma seleção das colônias crescidas em meio seletivo. Esta

seleção foi feita através da análise das colônias por PCR utilizando

oligonucleotídeos complementares as extremidades 5’ e 3’ do gene alvo. Em

uma reação composta de tampão de PCR 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM

KCl), oligonucleotídeo de extremidade 5’ PLAG2DN (50 pMol),


24

oligonucleotídeo de extremidade 3’ PLAG2DC (50 pMol), MgCl2 (1mM), dNTP

(2,5 mM), 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e água estéril para um

volume final de 50 µl, foi adicionada 5ul de uma colônia diluída em 25ul de

tampão salino. A reação foi incubada em miniciclador nas mesmas condições

descritas para a etapa I da PCR. Apenas as colônias de bactérias que

apresentam vetor recombinante, ou seja, com o gene alvos inseridos

apresentarão uma banda correspondente ao gene de interesse no gel,

enquanto que aquelas colônias com vetores nativos não serão amplificados

por não apresentarem o DNA molde inseridos.

Após a seleção, as colônias identificadas foram inoculadas em 5 mL de

meio LB líquido contendo 100 µg.mL-1 de ampicilina e mantido a 37°C,

durante 12 horas, sob agitação de 180 rpm, para a propagação e posterior

purificação do DNA plasmidial recombinante

3.5. Extração e Purificação do DNA Plasmidial

O DNA plasmidial das colônias selecionadas foi isolado de acordo com

o protocolo de lise alcalina. De 5 mL de LB líquido inoculados com as colônias

selecionadas, dois foram transferidos para tubos de 1,5 mL e centrifugados a

5000 rpm, 25oC por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado

ressuspendido até completa homogeneização em 100 µL de solução GET (50

mM de glicose, 10 mM de EDTA pH 8,0; 25 mM Tris-HCl). A lise celular foi

obtida em 200 µL de NaOH 0,2 M e 0,01 M de SDS por 5 minutos seguida da

precipitação do DNA genômico pela adição de 150 µL de acetato de potássio

3M. A amostra foi centrifugada a 16000 x g, em temperatura ambiente, por 5


25

minutos e 400 � L do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo de

1,5 mL. A adição de 1 mL de etanol 100% e a incubação em gelo seco por 5

minutos permitiu a precipitação da amostra, subseqüentemente centrifugada a

16000 x g, 4oC, por 5 minutos. O precipitado foi lavado pela adição de 1mL de

etanol 70%, e o sobrenadante descartado. O excesso de RNA bacteriano foi

eliminado pela incubação do DNA plasmidial em 100 � L de RNAse A (200

� g.mL-1) durante 3 horas, seguida de uma extração com 50 � L de fenol

equilibrado (Tris -HCl, pH 8,0) que foi agitada em vortex e subseqüentemente

centrifugada a 16000 x g, 25oC por 5 minutos. A fase aquosa contendo o DNA

plasmidial foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, e o DNA foi

precipitado pela adição de 10% de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e 2X o

volume de etanol 100% gelado. A amostra foi incubada por 5 minutos em gelo

seco e centrifugada a 16000 x g, por 5 minutos a 4oC. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado lavado com 1mL de etanol 70%. Após completa

secagem, o DNA plasmidial purificado foi ressuspendido em 30 µL de TE (10

mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, pH 8) e armazenado a -20oC.

3.6. Seqüenciamento Automático

Após a purificação do DNA plasmidial recombinante selvagem e/ou

mutante da hsPLA2-IID, realizou-se o seqüenciamento para confirmação do

sucesso do processo de subclonagem. As reações de seqüenciamento foram

feitas de acordo com o kit ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing

Ready Reaction. Para cada gene mutante selecionado, foi preparada uma

reação com 300 ng de DNA, 4 pMol de oligonucleotídeo de seqüenciamento,

2,5X de tampão de seqüenciamento (Tris 200 mM, MgCl2 5mM, pH 9,0) e 1 � L


26

da solução Mix Big Die (deoxinucleosídeos trifosfatos: dATP, dCTP, dITP e

dUTP), terminador A-Dye marcado com dicloro[R6G], terminador C-Dye

marcado com dicloro[ROX], terminador G-Dye marcado com dicloro[R110],

terminador T-Dye marcado com dicloro [TAMRA], AmpliTaq DNA polimerase

com pirofosfatase termoestável), em um volume final de 20 � L. O

oligonucleotídeo de seqüenciamento escolhido foi complementar a

extremidade 3’ de cada dos genes seqüenciados.

A reação foi incubada em termociclador nas seguintes condições: 1) 2

minutos a 96ºC; 2) 30 segundos a 96ºC; 3) 15 segundos a 50ºC; 4) 4 minutos

a 60ºC. A partir do ciclo 2, os passos foram repetidos 40 vezes. Em seguida,

as amostras foram transferidas para tubos de 1,5 mL e precipitadas pela

adição de 80 � L de isopropanol 75%. A mistura foi incubada por 15 minutos a

temperatura ambiente. Subseqüentemente, as amostras foram centrifugadas

a 16000 x g por 20 minutos a temperatura ambiente e o sobrenadante

descartado. Após a adição de 1 mL de etanol 70%, a amostra foi novamente

centrifugada e o sobrenadante descartado. As amostras foram armazenadas a

-20ºC após completa secagem. No momento da aplicação em gel, as

amostras foram ressuspendidas em 20 � L de tampão Loading 2x formamida

(10X TBE, 90% formamida e 0,5% azul de bromofenol) e aquecidas por 2

minutos a 96ºC. As amostras foram aplicadas em gel de seqüenciamento

padrão 4,25% (18 g uréia, 5,3 mL acrilamida 40%, 0,5 g de resina, 5 mL TBE

10X (10,8 g de trisma base, 35 g de ácido bórico, 9,3 g de EDTA), 250 � L de

APS 10% e 35 � L de TEMED), monitorizado em aparelho seqüenciador

automático (ABI 377-18, Applied Biosystems) programado para 12 horas de

corrida. As seqüências obtidas foram alinhadas com sua respectiva seqüência


27

de DNA nativa no banco de dados e o resultado final apresentado sob a forma

de eletroferograma.

3.7. Expressão em Escherichia coli BL21[DE3]pLysS .

3.7.1. Preparação de E. coli BL21[DE3]pLysS competente

Células de E. coli BL21 foram plaqueadas em meio HDM sólido (15 g.L-

1 triptona, 25 g.L-1 extrato de levedura, 1,5% de ágar, pH 7,5) contendo 34

µg.mL-1 de cloranfenicol e incubadas a 37ºC durante a noite. No dia seguinte,

em torno de 3-5 colônias foram inoculadas em 5 mL de HDM líquido (15 g.L-1

triptona, 25 g.L-1 extrato de levedura, pH 7,5) e incubadas sob agitação a 180

rpm, 37ºC por 12 horas. Todo o conteúdo foi transferido para 500 mL de HDM

na manhã seguinte (diluição 1:100), ficando sob agitação a 180 rpm, 37ºC até

atingir a densidade óptica de 0,3 em 600 nm. A cultura foi transferida para 2

tubos de 250 mL e incubada por 5 minutos no gelo. Após centrifugação a 4°C,

16000 x g por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado de

cada tubo ressuspendido em 100 mL de tampão (CaCl2 60 mM, PIPES 10 mM

e glicerol 15%). O homogeneizado foi novamente centrifugado por 10 minutos

a 3000 rpm, 4°C e o precipitado ressuspendido em 100 mL de tampão. O

homogeneizado foi incubado em gelo por 30 minutos e a centrifugação

descrita acima repetida. Juntou-se o precipitado originado em cada um dos

tubos e ressuspendeu-se em 12 mL de tampão final. As células competentes

foram distribuídas em alíquotas de 50 µL e estocadas a -70°C.


28

3.7.2. Transformação para expressão dos vetores recombinantes em

Escherichia coli BL21[DE3]pLysS

Na transformação, em cada tubo de 50 µL de células competentes foram

adicionados 2 µL de DNA plasmidial recombinante (0,1µg.mL-1), 1,0 µL de 1M

MgCl2, 0,5 µL de 1M CaCl2 e 46,5 µL de água estéril. A mistura foi mantida no

gelo por 20 minutos e em seguida a temperatura ambiente durante 10

minutos. A cada tubo foram adicionados 900 µL de meio HDM (15 g.L-1

triptona, 25 g.L-1 extrato de levedura, pH 7,5) contendo 10 mM de sulfato de

magnésio e 20 mM de glicose para a regeneração celular por 1 hora a 37°C

sob a agitação de 180 rpm. Cerca de 50-100 � L das células regeneradas

foram plaqueados em HDM sólido contendo 100 µg.mL-1 de ampicilina, 34

µg.mL-1 de cloranfenicol e 10 mM de sulfato de magnésio. A presença de

ampicilina no meio é fundamental, pois seleciona as bactérias que

incorporaram o plasmídeo pET-3a recombinante que apresenta resistência a

este antibiótico. As placas foram mantidas a 37°C durante 12 horas.

3.7.3. Teste de expressão em pequena escala

Para o teste de expressão em pequena escala de hsPLA2-IID tipo

selvagem e mutantes, 3 colônias de cada placa de Escherichia coli

BL21[DE3]pLysS transformada com os vetores pET-3a recombinantes foram

inoculadas em 400 mL de meio HDM contendo 100 � g.mL-1 de ampicilina, 34

µg.mL-1 de cloranfenicol e 10 mM de sulfato de magnésio sob agitação a 180

rpm e 37°C. Após atingirem a fase logarítmica de crescimento (densidade

óptica de 0,6-0,7 em 600nm) a expressão protéica foi induzida com 600 � M

de IPTG. Durante aproximadamente 5 horas de indução, 1 mL a cada hora foi


29

coletado e centrifugado a 16000 x g por 2 minutos para a análise da

expressão em gel de poliacrilamida. O sobrenadante foi descartado e o

precipitado ressuspendido em 200 � L de tampão de amostra (0,025 mM Tris,

0,192 M Glicina e 0,1% de SDS). As amostras foram aquecidas por 2 minutos

para aumentar o nível de desnaturação e imediatamente aplicadas em SDS-

PAGE a 16%.

3.7.4. Escalonamento da expressão dos vetores recombinantes em

Escherichia coli BL21[DE3]pLysS

Para expressão em grande escala da hsPLA2-IID tipo selvagem e

mutantes 4-5 colônias foram inoculadas em 5 mL de meio HDM contendo

ampicilina (100 � g.mL-1), cloranfenicol (34 � g.mL-1) e sulfato de magnésio (10

mM) e incubadas durante 12 horas a 37ºC sob agitação de 180 rpm. Na

manhã seguinte, esta cultura foi transferida para tubos de 400 mL de meio

HDM complementado com os mesmos antibióticos e mantida sob agitação a

180 rpm, 37ºC até atingir a densidade óptica de 0,7 em 600 nm (cerca de 3

horas). A cultura foi induzida com 1 mM de IPTG e incubada por 5 horas a

37ºC sob agitação de 200 rpm. Posteriormente, a cultura foi centrifugada a

6000 x g por 10 minutos, o sobrenadante descartado e o precipitado

armazenado a -20ºC até o isolamento dos corpos de inclusão.

3.8. Purificação de hsPLA2-IID Recombinante Selvagem e Mutantes

Após a expressão das proteínas recombinantes de hsPLA2-IID, as

etapas de isolamento dos corpos de inclusão, enovelamento e purificação


30

foram feitas de acordo com protocolo de filtação em gel (WARD, et al., 2001)

modificado.

3.8.1. Isolamento dos corpos de inclusão

Um dos principais problemas da expressão de proteínas heterólogas

em bactérias é o enovelamento incorreto das cadeias polipeptídicas recém

sintetizadas, com a formação de agregados insolúveis ou corpos de inclusão

que são biologicamente inativos. Devido ao alto conteúdo de pontes

dissulfeto, as hsPLA2-IID recombinante expressas são insolúveis, levando à

formação desses agregados, cujo isolamento representou o primeiro passo

da purificação das proteínas. O isolamento é necessário, pois as etapas

subseqüentes de enovelamento são fortemente influenciadas pela presença

de lipídios e ácidos nucléicos.

A purificação dos corpos de inclusão da hsPLA2-IID seguiu-se de

acordo com protocolo já estabelecido (OTHMAN, et al., 1996). As células

derivadas de 400 mL de cultura foram ressuspendidas em Tris-Cl 50 mM pH

8.0, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e 0,5 mM de PMSF, num volume final de

40 mL. Triton X-100 e deoxicolato foram adicionados a 0,4% na concentração

final e a mistura agitada por 20 minutos a 4ºC. As células foram sonicadas em

aparelho Sonic dismembrator (Fisher scientific). Depois da centrifugação a

13000 x g por 10 minutos, o processo foi repetido aumentando a

concentração final de TRITON X-100 e deoxicolato para 0,8%. O sedimento

obtido depois da centrifugação foi lavado e sonicado com 20mL de tampão

contendo 1% de TRITON-X100 e sem a adição de detergentes. Em seguida


31

fez-se a centrifugação do conteúdo em microtubos de 2mL resultando nos

corpos de inclusão para o início do enovelamento.

3.8.2. Modificação química e enovelamento das proteínas recombinantes

expressas em E. coli BL21[DE3]pLysS

A dissolução dos agregados protéicos formados durante a expressão

de hsPLA2-IID em E.coli BL21[DE3]pLysS é feita através do uso de agentes

químicos, e este passo é extremamente essencial para a obtenção dessas

proteínas.

Cada corpo de inclusão foi incubado por cerca de 1 hora em 500 � L de

uma solução contendo 4,8 M de tiocianato de guanidina e NTSB (disódio 2-

nitro-5-(tiosulfo)-benzoato). O tiocianato de guanidina é um agente

desnaturante que rompe a camada de solvatação existente entre a solução e

a proteína, desestabilizando as interações hidrofóbicas e conseqüentemente

expondo as pontes dissulfeto. Uma vez expostas, as pontes de dissulfeto

sofrem redução através dos grupos sulfito do NTSB. A adição de um grupo

SO3- as cisteínas aumenta a solubilidade das mesmas. O esquema é ilustrado

na FIGURA 5.

FIGURA 5: Esquema ilustrativo da modificação química de proteínas sob a forma de

corpos de inclusão

S-S

S-S

S-S

TIOCIANATO DE GUANIDINA

S-SO3 -

NO2

COO-

NTSBS-

NO2

COO-

NTB

S-SO3 -

S-SO3 -

(NH2)2C=H.HNCS

S-S

S-S

S-S

S-S

S-S

S-S

TIOCIANATO DE GUANIDINA

S-SO3 -

NO2

COO-

S-SO3 -

NO2

COO-

NTSBS-

NO2

COO-

NTB

S-

NO2

COO-

S-

NO2

COO-

NTB

S-SO3 -

S-SO3 -

(NH2)2C=H.HNCS


32

Após a modificação química, a amostra foi submetida a uma coluna de

filtração em gel (2 x 5 cm) contendo resina Bio-Gel P-6, 200-400 mesh,

equilibrada com 2,5 M de hidrocloreto de guanidina, 20 mM de Tris e 2 mM de

EDTA, pH 8,0. Esta etapa separa a proteína modificada, retirando o excesso

de NTSB, e reduz a quantidade de agente desnaturante de 4,8 M para 2,5 M.

A proteína eluída em cerca de 1,5 mL, serviu como material inicial para o

processo de enovelamento.

A cada eluído foram adicionados 150ul do tampão 20 mM de Tris pH

8,0, 10 mM de cistína, 80 mM de cisteína, e mantidos durante 24 horas a

temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, as amostras foram

diluídas com o tampão de enovelamento (20mM de Tris pH 7,0 1mM cistina e

8mM de cisteína) até atingirem uma concentração de 1,5M de hidrocloreto de

guanidina e deixadas sob repouso 24 horas. Outra diluição foi realizada com o

tampão de enovelamento (20mM de Tris pH 7,0 1mM cistina e 8mM de

cisteína) até atingirem uma concentração de 1,0M de hidrocloreto de

guanidina e deixadas sob agitação suave por 24 horas Ao fim do processo

foram feitas duas diálises seguidas por 24 horas contra tampão de

enovelamento para retirada de todo agente desnaturante.

3.8.3. Purificação das proteínas recombinantes selvagem e mutantes de

hsPLA2-IID

As proteínas hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes são proteínas

básicas e portanto foram purificadas por cromatografia de troca catiônica.

Utilizou-se uma coluna de dimensões 2X10cm previamente empacotada com


33

resina SOURCE 15S (Amersham-pharmacia). Essa resina é fortemente

catiônica e sua matriz apresenta grupos metil-sulfonato. O mecanismo de

separação por cromatografia de troca catiônica é baseado no grau de

afinidade que substâncias básicas diferentes apresentam pela matriz, devido

a diferenças na carga, densidade e distribuição das mesmas sobre a

superfície molecular. A coluna foi equilibrada com 20 mM de Tris-Cl pH 7,5 e a

proteína eluída em um gradiente linear de NaCl 1M, com fluxo de 1 mL.min-1.

A cromatografia foi realizada em HPLC (Shimadzu) previamente programado

para um gradiente de 0 a 100% do tampão salino em 20 minutos.

3.9. Dicroísmo Circular

Dicroísmo circular (CD) é a técnica ideal para o estudo de moléculas

quirais em solução, pois é muito sensível à assimetria do sistema. O CD é por

definição a diferença em absorção, A, da luz polarizada circularmente (CPL) à

direita e à esquerda:

CD = A � - Ar

O sinal de CD é observado em comprimentos de onda onde a amostra

absorve fótons, podendo ser positivo ou negativo dependendo da molécula e

da transição eletrônica que está sendo estudada.

As aplicações mais comuns da técnica em bioquímica incluem a

determinação da estrutura de macromoléculas biológicas. A avaliação da

estrutura secundária das proteínas recombinantes tipo selvagem e mutantes

foi realizada em espectropolarímetro Jasco 810, em comprimento de onda de

200 a 250 nm. Como cada proteína apresenta um padrão característico de

sinal de CD (HOLZWARTH E DOTY, 1965), foram retirados espectros de


34

proteína nativa da mesma família e comparados aos espectros das proteínas

recombinantes de hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes para avaliar se

estrutura secundária das proteínas está mantida. Para cada medida, utilizou-

se 100 � L de proteína de concentração desconhecida em tampão Hepes 20

mM, pH 7,0. Foi utilizada cubeta de quartzo 3mm e o sinal de CD obtido foi

resultado de uma média de três medidas de cada amostra. O sinal obtido da

análise apenas do tampão foi subtraído de todas as amostras. O valor de

elipticidade ( ) em 222 nm foi anotado e a concentração foi calculada de

acordo com uma curva padrão de espectros de CD com concentrações

crescentes de um padrão de hsPLA2. A amplitude do sinal de absorção em

222 nm é diretamente proporcional a quantidade de proteína utilizada. Os

valores de elipticidade em 222 nm foram plotados contra cada concentração

da curva padrão e o seguinte cálculo foi utilizado para determinar a

concentração de cada amostra, de acordo com os parâmetros obtidos de um

fit linear da curva padrão:

3.10. Teste de Atividade Enzimática Através de Indicador de Ácido Graxo

Livre

ADIFAB (proteína de ligação de ácido graxo intestinal marcado com

Acrilodan) é um indicador fluorescente para a medida da concentração de

ácidos graxos livres. Como já sugerido pelo nome, o indicador é um

conjugado composto por uma sonda fluorescente sensível a polaridade

(acrilodan) e pela proteína de ligação de ácido graxo intestinal (I-FABP), uma

proteína de baixo peso molecular (15 kDa) com alta afinidade para o ácido

[proteína] = (θθθθ222 – 0,70119)/ -0,0857 x fator de diluição


35

graxo (RICHIERI, et al., 1992, RICHIERI, et al., 1999). A detecção do ácido

graxo pelo ADIFAB é baseada na mudança de posição do fluoróforo acrilodan

em relação à bolsa de ligação apolar da proteína I-FABP quando ela torna-se

ocupada pelo ácido graxo. Quanto maior a concentração de ácido graxo,

menor a intensidade de fluorescência em 425 nm e maior em 505 nm

(FIGURA 6), devido a um deslocamento do espectro para maiores

comprimentos de onda. A mudança espectral do ADIFAB permite a

determinação da concentração de ácidos graxos através da razão da

intensidade de fluorescência do indicador ligado e desligado medido em 505 e

425 nm, respectivamente.

A solução estoque de ADIFAB foi preparada pela dissolução de uma

unidade de 200 µg de ADIFAB (Sigma) em 1,0 mL de tampão 50 mM de Tris,

1 mM de EGTA, 0,05% de azida, pH 8.0 (solução estoque de 13 µM). Para o

ensaio de volume final de 1 mL foram utilizados 15 µL de ADIFAB (estoque

200 µg.mL-1), 6 µL (estoque 5 mg.mL-1) de vesículas unilamelares grandes de

90% de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC – Sigma PM:786,1) e 10% de dioleoil

fosfatidilglicerol (DOPG – Sigma PM: 797) 1 µL de CaCl2 , proteína e tampão

Hepes 20 mM, NaCl 20 mM para completar o volume. As medidas foram feitas

em espectrofluorímetro Spectronic SLM 8100C a 25ºC, utilizando cubeta de

quartzo de caminho óptico de 1 cm sob agitação magnética. O aparelho foi

programado para medir a razão entre as intensidades de fluorescência em

505 e 425 nm com excitação de ADIFAB em 385 nm. As amostras contendo

tampão, ADIFAB, vesículas lipídicas e 1mM Ca2+ foram pré-incubada por 15

minutos e em seguida, a razão entre as intensidades de fluorescência em 505

e 425 nm foi monitorada por 2000 segundos. Após 500 segundos de ensaio,


36

foram adicionados 0,2 µg.mL-1 da hsPLA2-IID tipo selvagem na presença de 1

mM de CaCl2 ou 1 mM de EGTA. As proteínas mutadas no sítio ativo, H48Q,

D49K e G30S foram ensaiadas na concentração de 0,5 µg.mL-1 com 1mM

CaCl2 ou 1 mM de EGTA.

FIGURA 6. Titulação monitorada por fluorescência do ADIFAB com ácido oléico a 25°C.

A concentração de indicador é 0,2 µM em 10 mM Tris-Cl, 0, 15 M NaCl, 1 mM de EGTA, pH

8.0. O espectro representante da maior concentração de ácido oléico titulada está

representado por uma linha pontilhada

A atividade específica enzimática é diretamente proporcional à

quantidade de ácido graxo liberada pela hidrólise dos fosfolipídios

DOPC:DOPG, na razão molar de 9:1 respectivamente. A concentração de

ácidos graxos liberados foi calculada de acordo com RICHIERI et al, 1999.

[ácido graxo]= Kd x 19,5 x (R – Ro)/(11,5 – R)

onde, Kd para os ácidos graxos liberados é de 0,28 (RICHIERI, et al., 1995)),

Ro é a razão 505/425nm da intensidade de fluorescência sem ácido graxo, R

é a razão quando o ADIFAB está ligado ao ácido graxo.

Comprimento de onda (nm)

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

rela

tiva

Comprimento de onda (nm)

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

rela

tiva


37

3.11. Atividade de Liberação de Calceina Encapsulada em Lipossomos

3.11.1. Preparação de lipossomos

Os lipossomos foram preparados pela técnica de evaporação de

reverso de fase (SZOKA E PAPAHADJOPOULOS, 1978). Esta técnica produz

vesículas com capacidade de encapsular altas porcentagens de solução

aquosa, além de permitir a variação da composição fosfolipídica da bicamada

artificial e da razão entre eles. O princípio do método (FIGURA 7) é baseado

na encapsulação do material aquoso em micelas invertidas na presença de

solvente orgânico. A remoção subseqüente do solvente orgânico resulta na

encapsulação da solução de interesse. Neste estudo, foi utilizado lipossomos

90% de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC – Sigma PM:786,1) e 10% de dioleoil

fosfatidilglicerol (DOPG – Sigma PM: 797). Uma mistura de 5 mg.mL-1 dos

dois lipídios nas devidas proporções foi solubilizada em éter e

subseqüentemente colocada em um evaporador rotativo para secagem.

Posteriormente os lipídios foram resolubilizados em 1 mL de éter mais 1 mL

de tampão de encapsulação (tampão 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH

7,0, calceína 20 mM). Sonicou-se (Sonicator XL- Misonix) no gelo por 2

minutos na presença de tampão para formar uma emulsão de fase reversa, na

qual o tampão foi encapsulado dentro de micelas reversas numa suspensão

em éter. A fusão dessas micelas foi induzida pela evaporação lenta do éter

em evaporador rotativo (Tecnal, mínimo duas horas) produzindo lipossomos

unilamelares de diâmetro 1→100 µm.


38

Após a passagem dos lipossomos por membranas de policarbonato

(400 nm), produzindo uma população de lipossomos homogênia e de diâmetro

definido, uma coluna de filtração em gel (Sephadex G-25, 1 x 10cm) foi usada

para separar os lipossomos intactos contendo solução encapsulada, da

calceína livre. Como a filtração em gel dilui a solução de lipossomos, a

dosagem do fosfato das amostras de lipossomos é necessária.

FIGURA 7: Diagrama de formação de lipossomos pelo método de evaporação de fase

reversa. Os lipídios são dissolvidos em solventes apropriados e ficam solúveis (1), após a

fixação na superfície (2) eles formam as micelas em fase reversa (3). Com a sonicação, elas

formam os lipossomos pela fusão entre as micelas (4, 5 e 6).

3.11.2 Dosagem de fosfato dos fosfolipídios

A dosagem de fosfato e permite a avaliação na faixa de 0,1 a 10 µg.ml-1

de PO4. A amostra de lipossomo (100 µL) foi mantida a 300oC (banho de

areia) em ácido perclórico 70% por 5 minutos. Após o resfriamento, foram

adicionados 4,2 mL de água, 200 µL de molibidato de amônio (Merck) 5%


39

(Sigma) e 200 µL de diaminofenol (Sigma) 1% em bissulfito de sódio 20%

(Sigma). A solução foi agitada e deixada em banho de água fervente por 7

minutos. Leu-se a absorbância em 830 nm em cubeta de quartzo de 1cm de

caminho óptico em espectrofotômetro Hitach U-2000. A curva padrão foi feita

com amostras contendo 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µg de Na2HPO4.

3.11.3. Liberação de calceína encapsulada em lipossomos

A calceína (PM = 622,5 - Sigma) é um fluoróforo auto-supressor, com

comprimentos de excitação (λex= 490 nm) e emissão (λem = 520 nm) muito

próximos, permitindo que a emissão de uma molécula possa ser usada para a

excitação de outra. Em concentrações altas (≥ 25mM), a luz fluorescente

emitida por uma amostra de calceína é baixa, porém em soluções diluídas a

intensidade da luz aumenta, pois não ocorre auto-supressão. Dentro do

lipossomo, a calceína encontra-se em alta concentração (25 mM), por isso a

intensidade de emissão de fluorescência é baixa. Quando ocorre a

danificação da membrana lipossomal, a calceína encapsulada é liberada,

diluindo-se na cubeta, aumentando em cerca de 10 vezes a intensidade de

fuorescência emitida.

Os experimentos foram realizados em tampão 20 mM HEPES (Sigma)

com 150 mM de NaCl (Merck) em pH 7,0 com concentração fixa de 1 µg.ml-1

de hsPLA2-IID tipo selvegem e mutantes. A quantidade de proteína e

lipossomo corresponde à proporção de uma molécula de hsPLA2-IID para 200

moléculas de lipídio. O lipossomo usado foi de 400 nm de diâmetro e as

medidas feitas em espectrofluorímetro Spectronic SLM 8100C a 25oC,

utilizando-se cubeta de quartzo de caminho óptico de 1cm, sob agitação. A


40

excitação foi em 480 nm e a emissão em 520 nm, sendo a abertura de

excitação e emissão de 4 nm e a voltagem fotomultiplicadora de 600V. O

detergente Triton X-100 foi adicionado (0,1%) no final do processo de

liberação para se obter a intensidade de fluorescência máxima de liberação

da calceína encapsulada. A FIGURA 8 mostra um esquema ilustrativo do

ensaio de liberação de calceína encapsulada em lipossomos.

.

FIGURA 8: Esquema ilustrativo do teste de liberação de calceína encapsulada em

lipossomo. (A) Os comprimentos de onda de excitação e emissão da molécula de calceína

são muito próximos, por isso ocorre auto-supressão; (B) Perfil da liberação de calceína

provocada pela adição da proteína em 20 segundos e da liberação máxima de calceína

provocada pela adição de TRITON X-100 em 150 segundos em um total de 170 segundos

3.12. Efeito Bactericida

O efeito bactericida de hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes foi

avaliado em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. O teste realizado

com bactérias Gram negativas, Escherichia coli (K12) foi realizado segundo

A B % LIBERAÇÃO: (B-A)/(C-A)* 100


41

protocolo já estabelecido (PÁRAMO, et al., 1998). Em torno de 3-4 colônias de

uma placa fresca foram inoculadas em 5 mL de meio LB líquido e cresceram

por 12 horas sob agitação. Um millilitro dessa cultura foi inoculado em 50 mL

de LB líquido e a cultura agitada a 180 rpm, 37°C até atingir densidade óptica

de 0,7 em 660 nm. As bactérias foram diluídas em tampão fosfato de sódio

0,01 M pH 7.4 contendo 1% de triptona e ajustadas para 4X106 unidades

formadoras de colônias (CFU).mL-1, para determinação da atividade

bactericida. As proteínas foram incubadas com 4X105 células por 120 minutos

a 37ºC. Em seguida foi realizada uma diluição serial, e as bactérias dispersas

em LB sólido.

O teste realizado com bactérias Gram-positivas, Micrococcus luteus (M.

lysodeikticus - ATCC 9341), foi feito segundo o protocolo descrito por BEERS

e colaboradores (2002). Em torno de 3-4 colônias de uma placa fresca

cresceram por 12 horas a 37°C em 5 mL de meio LB líquido. Um mL dessa

cultura foi inoculado em 50 mL de LB líquido e a cultura agitada a 180 rpm,

37°C até atingir densidade óptica de 0,45 em 600 nm. A cultura foi

centrifugada a 3500 x g por 10 minutos e o sedimento ressuspendido em 10

mL de tampão fosfato de sódio 0,01 M pH 7,4 contendo 1% de triptona, sendo

ajustado para 2X107 unidades formadoras de colônias (CFU).mL-1 para

determinação da atividade bactericida. As proteínas foram incubadas com

2X106 células por 3 horas a 37°C. Em seguida, foi feita uma diluição serial e

as bactérias foram dispersas em LB sólido. A sobrevida das células foi

analisada após 18 horas de incubação, através da contagem do número de

unidades formadores de colônia (UFC) por placa de cultura.


42

FIGURA 9: Esquema ilustrativo do ensaio bactericida. Considere tampão como controle

negativo experimental (CFU = 100%). (1) Linhagem Gram-positiva, (2) Linhagem Gram-

negativa.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

43

4. RESULTADOS

4.1. Subclonagem de hsPLA2-IID Selvagem

Um fragmento de 443pb foi obtido após uma reação de PCR

contendo 2 sítios de restrição delimitando a região codificadora de hsPLA2-IID,

NdeI na extremidade 5é BamHI na extremidade 3´. A digestão do fragmento

com estas enzimas para posterior subclonagem em vetor pET-3a resultou em

uma banda de aproximadamente 431 pares de bases como mostra a FIGURA

10

Apesar de o gene ter cerca de 370 pares de bases, o fragmento isolado

foi de 431pb, porque o sítio de restrição de ambas enzimas utilizadas na

digestão contém alguns pares de bases da seqüência do vetor tanto na

extremidade 3’, quanto na extremidade 5’. O vetor pET-3a utilizado para a

subclonagem também foi digerido com as enzimas de restrição NdeI/BamHI

(FIGURA 11).

FIGURA 10: Análise eletroforética do gene da hsPLA2-IID. (M) marcador de peso

molecular de DNA de 1 kb (Invitrogen). (1) produto de 431pb da digestão enzimática NdeI

/BamHI do fragmento originado na reação da PCR. (2) fragmento amplificado de 443pb obtido

após uma reação de PCR contendo 2 sítios de restrição delimitando a região gênica de

hsPLA2-IID.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

44

FIGURA 11: Análise eletroforética da digestão NdeI/BamHI do vetor pET-3a. (M)

marcador de peso molecular de 1 kb; (1) pET-3a sem digestão; (2) pET-3a + NdeI; (3) pET-

3a + NdeI /BamHI.

O vetor pET-3a contendo o inserto foi transformado em bactérias

DH5α, selecionadas pela presença de ampicilina no meio de cultura. Foi feita

uma seleção das colônias obtidas através da digestão NdeI/BamHI para

confirmação da presença do gene no vetor. A região codificadora de hsPLA2-

IID foi seqüenciada com oligonucleotídeos complementares ao vetor.

4.2. Mutagênese Sítio-Dirigida de hsPLA2-IID Através da Reação em

Cadeia de Polimerase

Todas as proteínas recombinantes mutantes propostas para hsPLA2-IID

foram obtidas pelo método de mutagênese sítio-dirigida através da reação em

cadeia de polimerase (PCR). A FIGURA 12.A mostra o fragmento obtido na

_______________________________________________________________________RESULTADOS

45

etapa I da reação de PCR. O fragmento I é originado da extensão do

oligonucleotídeo mutagênico e o oligonucleotídeo EXT1 (que delimita a

extremidade 5´ do fragmento de interesse), tendo como molde o gene de

hsPLA2-IID, subclonado em pet-3a. A diferença de tamanho observada entre

os fragmentos amplificados na reação I corresponde ao tamanho baseado na

posição de inserção do oligonucleotídeo mutagênico, ou seja quanto mais

próxima a inserção estiver da extremidade do gene, menor o tamanho do

fragmento sintetizado. Os fragmentos mutados apresentaram o tamanho

esperado após a etapa I da reação de PCR. Após a purificação e

quantificação do fragmento I, 1pmol foi utilizado na reação II, de extensão. Na

terceira etapa, o fragmento II final foi amplificado, utilizando-se os

oligonucleotídeos EXT3, que delimita a extremidade 5’, e PLAG2DC a

extremidade 3’. Como o oligonucleotídeo EXT3 é complementar a uma

pequena seqüência de EXT1, o anelamento só ocorre se EXT1 tiver sido

incorporado na etapa I, selecionando-se desta maneira a fita de DNA mutada.

A FIGURA 12.B mostra o resultado da terceira etapa da reação de PCR. O

fragmento, depois de estendido e amplificado, apresenta em torno de 535

pares de bases, o que corresponde ao número de pares de bases delimitados

pelos oligonucleotídeos EXT1 e PLAG2DC.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

46

FIGURA 12: Análise eletroforética das etapas I e III da reação em cadeia de polimerase.

(A) Etapa I da reação de PCR, representada pelos fragmentos H48Q (254 pb), D49K (254 pb)

3 G30S (202pb) do numero 1 ao 3 respectivamente. (B) Etapa III da reação, representada

pelos mesmos fragmentos citados acima. (M) Marcador de peso molecular de DNA de 1kb

plus (Invitrogen).

4.3. Subclonagem dos Genes de hsPLA2-IID Mutantes

O fragmento de 535 pares de bases, obtido após as três etapas da

reação de PCR apresenta 2 sítios de restrição delimitando a região

codificadora de hsPLA2-IID, NdeI na extremidade 5é BamHI na extremidade

3´. A digestão do fragmento com estas enzimas para posterior subclonagem

em vetor pET-3a, resultou em uma banda de aproximadamente 431 pares de

bases como mostrado na FIGURA 13. Apesar do gene ter cerca de 378 pares

de bases, o fragmento isolado foi de 431 pb, porque o sítio de restrição de

ambas enzimas utilizadas na digestão contém alguns pares de bases da

seqüência do vetor tanto na extremidade 3’, quanto na extremidade 5’.

M 1 2 3 M 1 2 3 B A

_______________________________________________________________________RESULTADOS

47

O vetor pET-3a utilizado para a subclonagem também foi digerido com

as enzimas de restrição NdeI/BamHI para a inserção dos fragmentos

mutantes como mostrado na FIGURA 14.

.

FIGURA 13: Análise eletroforética dos produtos da digestão enzimática NdeI/BamHI dos

fragmentos originado na reação III da PCR. (M) marcador de peso molecular de DNA de 1

kb (Invitrogen) e (1-3) fragmentos H48Q, D49K e G30S respectivamente, após a digestão

com as enzimas de restrição, contendo cerca de 431 pares de bases.

FIGURA 14: Análise eletroforética da subclonagem dos fragmentos mutados no vetor

pET-3a (M) marcador de peso molecular de 1 kb (Invitrogen); (1) pET-3a sem digestão; (2)

pET-3a + NdeI+BamHI; (3) pET-3a + fragmento H48Q (4) pET-3a + fragmento D49K (5) pET-

3a + fragmento G30S.

M 1 2 3

M 1 2 3 4 5

_______________________________________________________________________RESULTADOS

48

O vetor pET-3a contendo o inserto foi transformado em bactérias

DH5α, selecionadas pela presença de ampicilina no meio de cultura. Foi feita

uma seleção das colônias obtidas através de um PCR de colônias para

confirmação da presença do gene no vetor como mostrado na FIGURA 15.

FIGURA 15: Análise eletroforética de PCR de colônias obtidas após a transformação em

E. coli DH5αααα competente. (1) (M) marcador de peso molecular de 1OO pb (Fermentas) (1-

12) DNA plasmidial selecionado do total de transformantes. Os vetores 1, 4, 6, 7 e 12 não

apresentaram o gene, pois não possuem a banda correspondente ao DNA amplificado

O gene de hsPLA2-IID foi seqüenciado com um oligonucleotídeo

complementar a extremidade 3’ do gene. Todas as seqüências obtidas foram

alinhadas com a seqüência gênica de hsPLA2-IID tipo selvagem presente no

Geneban. O resultado do alinhamento mostrou que nenhuma das mutações

obtidas tinha substituições indesejáveis em outras regiões da seqüência de

hsPLA2-IID. A FIGURA 16 mostra a seqüência da fita codificadora de DNA

dos fragmentos mutados obtidos.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1000pb 500pb 100pb

_______________________________________________________________________RESULTADOS

49

FIGURA 16. Eletroferograma mostrando a seqüência de DNA da fita complementar do

gene de hsPLA2-IID. (A) seqüência de DNA da região da proteína tipo selvagem e a mesma

região contendo a mutação G30S. (B) seqüência de DNA da região da proteína tipo selvagem

e a mesma região contendo a mutação D49K. (C) seqüência de DNA da região da proteína

tipo selvagem e a mesma região contendo a mutação H48Q. A seqüência nucleotídica

sublinhada representa a trinca nucleotídica mutada que corresponde ao novo aminoácido.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

50

4.4. Expressão das Proteínas Recombinantes de hsPLA2-IID

O plasmídio pET-3a contendo o gene da hsPLA2-IID tipo selvagem ou

mutantes foi transformado em células de E. coli da linhagem BL21, bactérias

capazes de expressar a proteína recombinante quando induzidas com IPTG.

A FIGURA 17 mostra um gel de poliacrilamida da expressão da hsPLA2-IID

tipo selvagem em função do tempo. A análise foi feita através da coleta de

alíquotas com intervalos de uma hora durante 5 horas. Após 5 horas de

indução, uma banda intensa em torno de 14 kDa, correspondente à proteína,

foi visualizada, a qual não estava presente no controle não induzido. A

FIGURA 18 mostra o resultado da expressão após 5 horas de indução das

três hsPLA2-IID mutantes.

FIGURA 17: Expressão da hsPLA2 -IID recombinante em E. coli BL21. (M) marcador de

peso molecular (Benchmark protein ladder LMW- Amersham Pharmacia – fosforilase b:

97000, albumina: 66000, ovoalbumina: 45000, Anidrase Carbônica: 30000, α-Lactalbumina:

14300); (N) controle negativo e (1-5) hsPLA2-IID no intervalo de 1 a 5 horas, respectivamente.

As demais bandas correspondem às proteínas expressas pela E.coli.

�14,3kDa

�30kDa

�45kDa

�66kDa

�97kDa

MN 1 2 3 4 5

_______________________________________________________________________RESULTADOS

51

.

FIGURA 18: Expressão das proteínas recombinantes mutantes de hsPLA2-IID em E. coli

BL21 após 5 horas de indução com IPTG. (M): marcador de peso molecular (Benchmark

protein ladder LMW- Amersham Pharmacia – fosforilase b: 97000, albumina: 66000,

ovoalbumina: 45000, anidrase carbônica: 30000, α-Lactalbumina: 14300 (N) controle

negativo realizado com vetor pET-3a induzido. (2-4) hsPLA2-IID mutante G30S, D49K e

H48Q, respectivamente

4.5. Enovelamento e Purificação das Proteínas Recombinantes de

hsPLA2-IID

Um dos principais problemas da expressão de proteínas heterólogas

em bactérias é o enovelamento incorreto das cadeias polipeptídicas recém

sintetizadas, com a formação de agregados insolúveis ou corpos de inclusão

O protocolo de isolamento dos corpos de inclusão para a hsPLA2-IID

recombinante foi realizado com sucesso, uma vez que esta técnica se

encontra estabelecida em nosso laboratório para o tratamento da hsPLA2-IIA.

Após o isolamento seguiu-se com as etapas de enovelamento, e purificação

por troca catiônica que foram primeiramente executadas de acordo com o

protocolo de WARD e colaboradores (2001)

FIGURA 19 mostra que o perfil de eluição da hsPLA2-IID apresentou

baixa resolução e um baixo rendimento.

N 2 3 4 M

� 97

�

66 �

45 �

30 �

14,3

_______________________________________________________________________RESULTADOS

52

0 5 10 15 20 25-0 ,000

0 ,000

0 ,000

0 ,001

0 ,001

0 ,002

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)

T em po (m in )

FIGURA 19: Cromatograma da purificação da hsPLA2 -IID renovelada segundo Ward e

colaboradores e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S. Os picos mal

definidos correspondem às formas mal enoveladas da hsPLA2 gIID durante o processo de

enovelamento e a fraca interação da proteína na resina da coluna de purificação.

Diante da dificuldade em obter um rendimento razoável, devido à

grande quantidade de precipitado ao longo do enovelamento e ao baixo

rendimento do HPLC algumas modificações tornaram-se necessárias.

A primeira modificação a ser feita teve o intuito de aumentar o

rendimento de proteína nativa minimizando a precipitação durante a primeira

etapa do enovelamento (pré-incubação com tampão de oxidação/redução).

Para isso as concentrações de cisteína e cistina foram alteradas de 0,8mM e

0,1mM para 8 e 1 mM respectivamente e o tempo de reação para 24 horas.

Entretanto diante da dificuldade em um espectro de dicroísmo circular com os

decaimentos bem definidos fez-se necessário investigar se durante o

_______________________________________________________________________RESULTADOS

53

0 2 4 6 8 10 12 14

0 ,000

0 ,004

0 ,008

0 ,012

0 ,016

0 ,020

0 ,024

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)

T em po (m inu to )

enovelamento e a purificação por troca catiônica estava ocorrendo seleção de

alguma isoforma mal enovelada. Inicialmente, no protocolo de purificação

o gradiente linear de 0 a 100% de tampão salino 2,5M foi substituído por um

gradiente suave e com tampão salino 1,5 M.

A FIGURA 20 mostra que o perfil de eluição da hsPLA2-IID apresentou

início de separação das isoformas não enoveladas. A FIGURA 21 mostra o

espectro de dicroísmo circular da proteína quando não enovelada

corretamente.

FIGURA 20: Cromatograma da purificação da hsPLA2 –IID renovelada com alteração do

estado de oxidação e redução do tampão de pré incubação e purificada em coluna de

troca catiônica Source 15S.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

54

200 210 220 230 240 250-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

(θ)

mde

g.cm

2 .dm

ol-1

com prim ento de onda (nm )

FIGURA 21: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA2-IID não

enovelada corretamente

Diante deste resultado modificações constantes foram feitas no

protocolo de enovelamento a fim de selecionar somente formas enoveladas

corretamente e permitindo que formas mal enoveladas sejam eliminadas

durante o processo.

Após várias tentativas de pouca melhora, o enovelamento feito em

coluna de filtração em gel foi substituído por enovelamento em diluição

seguido de diálise para evitar que o gel permita que proteína não nativa

permaneça solúvel e comprometa o rendimento final de proteína nativa. A

partir disso obteve-se o perfil de eluição mostrado na FIGURA 22 com melhor

separação de isoformas não enoveladas corretamente.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

55

-2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4

0 ,0 0 0

0 ,0 0 4

0 ,0 0 8

0 ,0 1 2

0 ,0 1 6

0 ,0 2 0

0 ,0 2 4

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)

T e m p o (m in u to )

FIGURA 22: Cromatograma da purificação da hsPLA2-IID renovelada por diluição

seguida de diálise e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S

Modificações continuaram a ser feitas com intuito de aperfeiçoar ainda

mais o enovelamento e chegar ao protocolo estabelecido e referido na

metodologia. A FIGURA 23 representa o resultado das modificações no

protocolo.

FIGURA 23: Cromatograma da purificação da hsPLA2 –IID renovelada segundo

protocolo estabelecido e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S. Os

eluídos 1 e 3 correspondem às formas mal enoveladas da hsPLA2-IID durante o processo de

enovelamento e o eluído 2 corresponde à forma nativa da proteína

1

2

3

-2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4

0 ,00 0

0 ,00 5

0 ,01 0

0 ,01 5

0 ,02 0

0 ,02 5

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)


_______________________________________________________________________RESULTADOS

56

-2 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4

0 ,0 0 0

0 ,0 0 5

0 ,0 1 0

0 ,0 1 5

0 ,0 2 0

0 ,0 2 5

0 ,0 3 0

0 ,0 3 5

0 ,0 4 0

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)


h s P L A2- I ID S e lv a g e m

h s P L A2- I ID H 4 8 Q

h s P L A2- I ID G 3 0 S

h s P L A2- I ID D 4 9 K

O mesmo protocolo de enovelamento e purificação em HPLC da

proteína tipo selvagem foi usado para as proteínas mutantes. O perfil de

eluição é mostrado na FIGURA 24. As proteínas obtidas em purificação de

acordo com FIGURA 24 foram usadas em testes de atividade catalítica e

danificação de membranas artificiais e biológicas.

FIGURA 24: Cromatograma da purificação da hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes em

coluna de troca catiônica Source 15S. O mesmo perfil de eluição é apresentado tanto para

hsPLA2-IID recombinante tipo selvagem quanto para as proteínas recombinantes mutantes.

4.6. Dicroísmo Circular

Para avaliar a estrutura secundária mediu-se o espectro de CD da

proteína heteróloga na região UV-distante (200-250nm). Proteínas ricas em α-

hélices apresentam espectro de CD característico com valores mínimos em

208 e 222nm e máximo em 194nm. Esse padrão de espectro foi encontrado

tanto na BthTX-I quanto na hsPLA2-IIA, que sabidamente são proteínas ricas

_______________________________________________________________________RESULTADOS

57

190 200 210 220 230 240 250-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

comprimento de onda (nm)

(θ)

mde

g.cm

2 .dm

ol-1

hsPLA2-IID G30S

hsPLA2-IID H48Q

hsPLA2-IID Selvagem

hsPLA2-IID D49KK

em α-hélices e estudadas em nosso laboratório. As proteínas recombinantes

mutantes de hsPLA2-IID apresentou espectro de CD indistinguível daquele

apresentado por hsPLA2-IID selvagem, ou seja, as mutações inseridas não

causaram nenhuma mudança significativa na conformação secundária da

cadeia polipeptídica dessas proteínas. A FIGURA 25 mostra o espectro de CD

das hsPLA2-IID mutantes e tipo.

FIGURA 25: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA2-IID tipo

selvagem e mutantes. As mutações sítio-dirigidas apresentadas não perturbaram a estrutura

secundária das proteínas recombinantes.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

58

4.7. Teste de Atividade Hidrolítica

Os ensaios de atividade hidrolítica das proteínas hsPLA2-IIDs

recombinantes tipo selvagem e mutantes foram realizados através da técnica

do ADIFAB, um indicador de ácido graxo livre. Para tal, foi utilizada a

composição fosfolipídica de DOPC e DOPG na razão molar de 9:1,

respectivamente. A FIGURA 26 mostra a atividade hidrolítica das hsPLA2-IIDs

recombinantes tipo selvagem e mutantes.

Através da metodologia utilizada, tanto a hsPLA2-IID nativa quanto a

proteína recombinante mutante H48Q apresentaram atividade hidrolítica que

foi quantificada através do aumento da razão da intensidade de fluorescência

(I505/I425 nm).

A adição de 0,2µg.mL-1 da enzima tipo selvagem apresentou uma

atividade específica de 58,45 � M.min-1.mg-1, na presença de Ca2+. Foi

observado que a atividade hidrolítica da hsPLA2-IID é dose dependente, pois

a adição de 0,1µg.mL-1 resultou em atividade total menor que quando

adicionado 0,2ug.mL-1 da hsPLA2-IID. A mutante H48Q apresentou uma

atividade específica de 7,7 � M.min-1.mg-1 e as mutantes D49K e G30S

apresentaram atividade zero. Nenhuma das proteínas avaliadas apresentou

atividade hidrolítica na presença de EGTA, um quelante de Ca2+,

evidenciando que a atividade catalítica é dependente do íon Ca+2.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

59

A B

C D

0 500 1000 1500 2000

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

R 5

05/4

25nm

- F

luor

escê

ncia

Tempo (segundos)

hsPLA2-IID selvagem (0,2ug.mL-1)+ Ca2+


hsPLA2-IID selvagem (0,2ug.mL-1)+ EGTA

0 500 1000 1500 2000

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

R 5

05/4

25nm

- F

luor

escê

ncia

Tempo (segundos)


hsPLA2-IID H48Q (0,5ug.mL-1)+ Ca2+

hsPLA2-IID H48Q (0,5ug.mL-1)+ EGTA

0 500 1000 1500 2000

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

R 5

05/4

25nm

- F

luor

escê

ncia

Tempo (segundos)


hsPLA2-IID D49K (0,5ug.mL-1)+ Ca2+


0 500 1000 1500 2000

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

R 5

05/4

25nm

- F

luor

escê

ncia

Tempo (segundos)


hsPLA2-IID G30S (0,5ug.mL-1)+ Ca2+


FIGURA 26: Hidrólise fosfolipídica da hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes no sítio

ativo na presença de CA2+ ou EGTA. (A) Razão da intensidade de fluorescência (I) em 505

e 425 nm após a adição de 0,2 g.mL-1 comparada a 0,1 g.mL-1 da hsPLA2-IID tipo

selvagem; (B) Razão da intensidade de fluorescência (I) em 505 e 425 nm após a adição de

0,5 g.mL-1 da mutante H48Q; (C) Razão da intensidade de fluorescência (I) em 505 e 425

nm após a adição de 0,5 g.mL-1 da mutante D49K; (D) Razão da intensidade de

fluorescência (I) em 505 e 425 nm após a adição de 0,5 g.mL-1 da mutante G30S.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

60

4.8. Atividade de Permeabilização de Membranas Artificiais A liberação de marcadores fluorescentes encapsulados dentro de

lipossomos é uma técnica utilizada para o estudo da interação de PLA2s com

membranas. Foram realizados testes de liberação de calceína encapsulada

em lipossomos cujas membranas foram compostas de uma mistura DOPC e

DOPG na razão molar de 9:1, respectivamente. Nestes experimentos, a perda

da integridade da membrana lipossomal resulta na diluição do fluoróforo, com

conseqüente aumento do sinal de fluorescência (DE OLIVEIRA, et al., 2001,

RUFINI, et al., 1992). A liberação total do fluoróforo encapsulado ocorre após

a adição de 0,1% do detergente TRITON X-100.

A FIGURA 27 e a FIGURA 28 mostram os resultados de liberação de

marcador fluorescente das proteínas hsPLA2-IID recombinantes tipo selvagem

e mutantes. A adição de 1µg.mL-1 hsPLA2-IID recombinate tipo selvagem,

sobre lipossomos compostos de DOPC e DOPG resultou em perda da

integridade da membrana lipossomal com conseqüente liberação da calceína

encapsulada. A porcentagem de liberação apresentada por hsPLA2-IID

recombinante tipo selvagem, nesta composição fosfolipídica, foi de

aproximadamente 10,5% da liberação total causada por TRITON-X100. As

proteínas recombinantes D49K e G30S, perderam parcialmente atividade de

danificação de membranas em relação à proteína tipo selvagem com

porcentagem de liberação de 4,2% e 4,1% respectivamente. Entretanto a

proteína recombinante H48Q manteve capacidade de danificar a membrana

de lipossomos DOPC e DOPG com porcentagem de liberação de

aproximadamente 11%.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

61

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

0

5 0 0

1 0 0 0

5 0 0 0

7 5 0 0

1 0 0 0 0

Flu

ores

cênc

ia

T e m p o (s e g u n d o s )

B ra n c o ( ta m p ã o ) h s P L A

2 s e lv a g e m (1 u g .m L -1 )

h s P L A2 H 4 8 Q (1 u g .m L -1 )

h s P L A2 G 3 0 S (1 u g .m L -1 )

h s P L A2 D 4 9 K (1 u g .m L -1 )

FIGURA 27: Cinética de liberação de calceína causada por hsPLA2-IID tipo selvagem e

mutantes sobre lipossomos compostos de DOPC e DOPG. Fluorescência de liberação de

calceína encapsulada após 20 segundos da adição das proteínas na concentração de

1ug.mL-1. A liberação máxima de calceína ocorreu após a adição de 0,1% de TRITON X-100

FIGURA 28: Porcentagem da liberação de calceína encapsulada causada por hsPLA2-

IIDs tipo selvagem e mutantes em lipossomos compostos de DOPC e DOPG

0

2

4

6

8

10

12

90

100

Dan

ific

ação

de

mem

bra

nas

art

ific

iais

(%

)

Branco hsPLA2-IID Selvagem

hsPLA2-IID H48Q

hsPLA2-IID D49K

hsPLA2-IID G30S

_______________________________________________________________________RESULTADOS

62

4.9. Atividade Bactericida

O efeito bactericida apresentado por hsPLA2-IID tipo selvagem foi

avaliado contra duas linhagens de bactérias, linhagem de bactéria Gram-

negativa Escherichia coli K12, e a linhagem Gram-positiva Micrococcus

luteus (ATCC 9341). A atividade bactericida observada para a proteína

hsPLA2-IID tipo selvagem sobre 4x106 células.mL-1 de E.coli K12 e sobre

2x107 células.mL-1 de Micrococcus luteus após 120 minutos da adição da

proteína está apresentada na FIGURA 29. A atividade bactericida foi

determinada com concentração de 5 e 10ug.mL-1. Nas duas linhagens

analisadas nota-se que o número de unidades formadoras de colônias (UFC)

é menor quanto maior a concentração de proteína utilizada.

O efeito bactericida sob concentração de 10ug.ml-1 de proteína

selvagem foi de 74% sobre a linhagem Gram-positiva de Micrococcus luteus e

de aproximadamente 54% sobre a linhagem Gram-negativa de Escherichia

coli (K12) em relação ao controle experimental realizado apenas na presença

de tampão fosfato 0,01 M.

A partir do teste dose-resposta apresentada na FIGURA 29 a

concentração fixa de 10 � g.mL-1 foi escolhida para a avaliação do efeito

bactericida das hsPLA2-IID mutantes sobre as linhagens de Escherichia coli

K12 e Micrococcus luteus.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

63

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(%)

UF

C

Controle hsPLA2-IID 5ug.ml-1

hsPLA2-IID 10ug.ml-1

B

Controle

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(%)

CF

U

hsPLA2-IID 5ug.ml-1

hsPLA2-IID 10ug.ml-1

A

FIGURA 29: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 5 e

10 � g.mL-1 de hsPLA2-IID sobre (A) Micrococcus luteus e (B) Escherichia coli (K12). O

controle experimental foi realizado apenas na presença de tampão fosfato de sódio 0,01M. Os

valores estão apresentados como a média da porcentagem ± SD de pelo menos 3

experimentos.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

64

Como há relatos que algumas PLA2s apresentam atividade bactericida

independente da atividade hidrolítica, as duas mutantes do sítio ativo da

hsPLA2-IID, H48Q e D49K, foram utilizadas para avaliar se a propriedade de

hidrolisar fosfolipídios de membranas, era na sua integridade, responsável

pelo efeito bactericida observado contra as bactérias Gram-positivas e Gram-

negativas. A FIGURA 30 mostra os resultados obtidos. As mutações dos

resíduos no sítio catalítico (H48) e no sítio de ligação ao íon Ca+2 (D49) teve

forte influência no o efeito bactericida de hsPLA2-IID sobre a linhagem Gram-

positiva de Micrococcus luteus. Essas substituições diminuíram drasticamente

o efeito bactericida total apresentado pela proteína selvagem. A mutante

H48Q teve atividade bactericide reduzida para 14% e a mutante D49K teve

atividade reduzida para 8% comparada à proteína selvagem que apresentou

atividade de 74% contra essa linhagem.

Entretanto, as mutações D49K e H48Q da hsPLA2-IID reduziram

levemente a atividade bactericida exercida pela proteína selvagem sobre a

linhagem Gram-negativa Escherichia coli (K12), um efeito bactericida

significativo ainda é apresentado por estes mutantes, como verificado na

FIGURA 30B. Sobre a linhagem Gram-negativa a mutante H48Q conservou o

efeito bactericida em 47% e a mutante D49K apresentou efeito de 33%

comparado ao efeito de 54% da proteína selvagem.

_______________________________________________________________________RESULTADOS

65

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(%)

do n

úmer

o de

UF

C

Controle hsPLA2-IID selvagem 10ug.mL-1

hsPLA2-IID H48Q

10ug.mL-1

hsPLA2-IID D49K

10ug.mL-1

A

B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(%)

do n

úmer

o de

UF

C

Controle hsPLA2-IID selvagem 10ug.mL-1

hsPLA2-IID H48Q

10ug.mL-1

hsPLA2-IID D49K

10ug.mL-1

FIGURA 30: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 10

� g.mL-1 de hsPLA2-IID mutantes sobre (A) Micrococcus luteus e (B) de Escherichia coli

(K12). O controle experimental foi realizado apenas na presença de tampão fosfato de sódio

0,01M. Os valores estão apresentados como a média da porcentagem ± SD de pelo menos 3

experimentos.

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

66

5. DISCUSSÃO

Para o estudo das atividades catalítica, danificadora de membranas

artificiais e bactericida de hsPLA2-IID, alem da proteína tipo selvagem, foram

produzidas as mutantes G30S, H48Q e D49K através da técnica de

mutagênese sítio-dirigida. Todos os fragmentos de DNA contendo a

seqüência codificadora mutante de hsPLA2-IID foram subclonados no vetor de

expressão pET-3a. Apesar de apresentam aproximadamente 4640 pares de

bases, tamanho que dificulta tanto a ligação de fragmentos quanto a

transformação bacteriana (HANAHAN, 1983, INOUE, et al., 1990), não houve

problemas relacionadas as etapas de mutagênese e clonagem e este

constructo expressou eficientemente as proteínas heterólogas. Os vetores da

série pET (ROSENBERG, et al., 1987, STUDIER E MOFFATT, 1986,

STUDIER, et al., 1990) apresentam uma seqüência promotora T7 N-terminal,

que controla a expressão de genes inseridos dentro do sítio múltiplo de

clonagem (SMC), além de apresentarem marcadores seletivos para a

resistência à ampicilina. Uma característica do sistema pET de vetores é a

capacidade de clonagem de genes sob condições de atividade transcricional

extremamente baixa. (HANAHAN, 1983, INOUE, et al., 1990).

Idealmente, a estratégia de mutagênese sítio-dirigida deve ser utilizada

juntamente com um sistema eficiente de expressão de proteínas heterólogas,

e um protocolo de purificação que renda níveis satisfatórios da proteína

funcionalmente ativa. As PLA2s freqüentemente são bem expressas por E.

coli, mas a principal desvantagem é que as PLA2s dos grupos I e II não são

expressas na forma nativa e sim como agregados protéicos insolúveis

denominados corpos de inclusão (KELLEY, et al., 1992, KUO, et al., 1995,

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

67

LIU, et al., 1990, WARD, et al., 2001). O primeiro passo no processo de

purificação das proteínas foi o isolamento destes agregados protéicos. As

etapas de purificação dos corpos de inclusão são fundamentais antes do

enovelamento protéico, pois a presença de contaminantes incluindo DNA,

RNA, fosfolipídios e outras proteínas, é o fator que mais interfere no

rendimento protéico final, influenciando fortemente o processo de

enovelamento (BATAS E CHAUDHURI, 1998). Embora facilmente purificados

por centrifugação, os corpos de inclusão devem posteriormente ser

solubilizados com desnaturantes químicos e a proteína reenovelada na sua

conformação nativa.

O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de

fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Protocolos de

enovelamento protéico usando uma resina de filtração em gel têm sido

utilizados com sucesso para enovelamento hsPLA2-IIA expressada na forma

de corpos de inclusão, pois a difusão reduzida das proteínas em coluna de

filtração em gel suprime as interações não específicas de moléculas

parcialmente renoveladas, reduzindo assim a agregação (BATAS, et al.,

1999). Entretanto para hsPLA2-IID este método não ajudou a reduzir a

agregação de proteína nativa, mas permitiu que formas não corretamente

enoveladas permanecessem em solução prejudicando o rendimento

qualitativo de proteína realmente ativa. Outra etapa importante do processo de

enovelamento é a redução lenta da concentração do agente desnaturante,

hidrocloreto de guanidina (GdnHCl), que interage com o solvente, causando

destruição do arranjo estrutural existente entre as moléculas de água e a

proteína. Além disso, como as PLA2s dos grupos I e II apresentam de 6 a 8

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

68

pontes dissulfeto, o enovelamento protéico deve ser realizado na presença de

tampão de oxidação/redução.

O enovelamento protéico da hsPLA2-IID foi alternativamente conduzido

através de repetidos ciclos de diluição e diálise contra um tampão que

apresentava o par redox cisteína-cistina, e concentrações decrescentes de

GdnHCl e na presença de 1 mM do cofator Ca2+ que aumentou

significativamente o rendimento final de hsPLA2-IID funcionalmente ativa. O

processo de enovelamento foi monitorado através de medidas de dicroísmo

circular, sobre espectro de comprimento de onda de 190-250 nm,

cromatografia de troca catiônica e ensaios de atividade hidrolítica, que

confirmaram a produção da proteína recombinante sob uma forma solúvel e

biologicamente ativa. O mesmo protocolo de enovelamento foi utilizado para

as proteínas mutantes.

A análise da estrutura secundária das proteínas recombinantes é

fundamental para eliminar as proteínas recombinantes mutadas com

conformação estrutural não nativa. A ligação peptídica é rígida e planar, e a

rotação em volta do Cα é limitada por impedimento estérico das cadeias

laterais dos aminoácidos vizinhos. Isso faz com que certas conformações da

cadeia principal sejam energicamente favorecidas. O conjunto limitado de

arranjos das ligações peptídicas tem sinais bem definidos de CD, e a soma

das contribuições resulta num espectro que é característico de cada proteína

(GORE, 1998). O espectro de CD de proteínas é geralmente medido dentro

das regiões entre 250 e 300 nm (denominada região UV-próxima) e em

comprimentos de onda menores do que 250 nm (UV-distante). O espectro de

CD na região próxima é dominado por sinais das cadeias laterais aromáticas,

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

69

embora transições de ligações dissulfeto também contribuam para a

intensidade de absorção total. A absorção na região do UV-distante é

dominada por transições eletrônicas da cadeia peptídica da proteína, mas

algumas cadeias laterais também contribuem nesta região, especialmente se

o conteúdo de α-hélices da proteína é baixo. Uma das utilizações da técnica

de CD no estudo de proteínas é a avaliação da conformação e estrutura

protéica. As α-hélices (direita) são as estruturas secundárias dominantes em

muitas proteínas, mas o espectro de CD da proteína nativa é a soma das

porcentagens apropriadas de cada componente do espectro. Os resultados de

CD na região UV-distante (190-250nm) mostraram que as proteínas

enoveladas hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes apresentaram estrutura

secundária semelhante à outras hsPLA2s nativas da mesma família. Este

resultado era esperado, pois as mutações envolvem resíduos voltados para o

solvente e, portanto não foram previstas alterações significativas nas

estruturas e estabilidade das proteínas mutantes.

As PLA2s atuam sobre fosfolipídios em membranas ou formas

agregadas e o ciclo catalítico é iniciado através da ligação interfacial, que é

distinta da ligação da molécula do fosfolipídio no sítio ativo (GELB, et al., 1995

). A composição lipídica de DOPC e DOPG em membranas sintéticas tem sido

utilizada na literatura para o entendimento do mecanismo de ação da hsPLA2

(BAKER, et al., 1998, BEERS, et al., 2003). Sabe-se que a hsPLA2 são

proteínas básicas, e que devido ao alto número de aminoácidos carregados

positivamente localizados na superfície da proteína, elas apresentam uma

marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol

(PG) encontrados em membranas bacterianas (SNITKO, et al., 1997). Por

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

70

outro lado, a hsPLA2 liga-se fracamente a interfaces zwiteriônicas presente

em membranas celulares de eucariotos (BAYBURT, et al., 1993).

Um ensaio com o conjugado ADIFAB foi realizado para avaliar a

capacidade das proteínas recombinantes tipo selvagem e mutantes de

hidrolisar fosfolipídios. A enzima humana tipo selvagem apresentou atividade

hidrolítica específica contra vesículas unilamelares compostas de

DOPC:DOPG de 58,45 � M.min-1.mg-1. A mutante H48Q apresentou uma

atividade de 7,7 � M.min-1.mg-1. Os resultados apresentados mostraram que a

atividade enzimática da proteína hsPLA2-IID tipo selvagem e da mutante

H48Q é dependente de Ca2+, pois na presença de EGTA a atividade

hidrolítica foi abolida. Além disso, foi verificado que a atividade catalítica é

dose dependente, pois o ensaio com concentração menor de proteína

detectou atividade específica menor. Cristalização de raio-X da mutante H48Q

da hsPLA2-IIA mantém algumas características da maquinaria catalítica

comparada à nativa (EDWARDS, et al., 2002). O íon Ca+2 ocupa uma posição

idêntica no sitio ativo nas duas proteínas permitindo que a mutante H48Q

apresente atividade catalítica residual sobre vesículas unilamelares de DOPG

(dioleoil fosfatidilglicerol). A partir disso propuseram um mecanismo catalítico

para a mutante H48Q (FIGURA 31) o qual está baseado no mecanismo de

catálise para as PLA2s de Yu e colaboradores (1993). Entretanto, devido à

estrutura do anel imidazol que sofre deslocamento de elétrons e estabilização

por ressonância, a histidina é mais acida, desprotonando mais facilmente, e

dessa forma é favorecida no mecanismo catalítico em relação à ressonância

do grupo amida da glutamina. No mecanismo proposto há duas moléculas de

égua e não uma única como proposto por Verheij em 1981, e revisado em

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

71

2001 (BERG, et al., 2001), envolvidas na catalise e uma delas faz

coordenação com o íon Ca+2.

Por outro lado, a mutante D49K da hsPLA2-IID, uma fosfolipase A2-

Lys49 (PLA2-Lys49), não apresentou atividade catalítica da mesma forma que

duas PLA2s-Lys49 cataliticamente inativas isoladas em 1984 dos venenos de

Agkistrodon p. piscivorus e Bothrops atrox (MARAGANORE E HEINRIKSON,

1986). Portanto, a ausência de atividade hidrolítica residual da mutante D49K

observada neste estudo já era esperada. A mutante G30S elimina a

capacidade da enzima de hidrolisar fosfolipídios por impedir a ligação do

cofator Ca2+ (THUNNISSEN, et al., 1990, VERHEIJ, et al., 1981).

A

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

72

FIGURA 31: Mecanismo catalítico de coordenação do Ca+2 com um oxiânion para as

sPLA2 (YU, et al., 1993). (A) A molécula de água (w5) que gera o ataque nucleofílico é

coordenada com Ca+2 enquanto a molécula de água (w6) está diretamente ligada a His-48.

Pontes de hidrogênio facilitam o fluxo de elétrons e transferência de prótons. (B) Mecanismo

proposto por Edwards para a mutante H48Q na qual a desprotonação da molécula de água

(w5) resulta na protonação da molécula de água (w6). A molécula H3O+ é estabilizada por

ressonância com Gln-48 que por sua vez é estabilizada por pontes de hidrogênio com Asp-99.

R2 é o ácido graxo liberado e PL representa o lisofosfolípidio.

B

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

73

A atividade de danificação de membranas artificiais da hsPLA2-IID,

contra lipossomos compostos de fosfolipídios de 90% de DOPC e 10% de

DOPG com conseqüente liberação da calceína encapsulada também foi

avaliada no presente trabalho. Esta composição lipídica foi escolhida, pois

ISHIZAKI e colaboradoes (1999) usando hsPLA2-IID purificada por

cromatografia de afinidade determinou, dentre 13 tipos de fosfolipídios

comerciais, quais substratos são hidrolizados por esta proteína. Foi observada

uma ausência e especificidade, também encontrada na hsPLA2-IIA (ONO, et

al., 1988). Dentre os substratos mais hidrolizados estava fosfosfolipidios com

cabeça polar composta por fosfatidilglicerol e fosfatidiletanolamina contendo

acido oléico como acido graxo na posição sn-2.

O resultado encontrado mostrou que a atividade de danificação de

membranas observada para a proteína tipo selvagem foi de aproximadamente

10,5%, semelhante à mutante H48Q de 11% da liberação total causada por

TRITON-X100. As mutantes D49K e G30S apresentaram atividade de

aproximadamente 4%. Este resultado mostra que a hsPLA2-IID tem uma

atividade de danificação de membranas não relacionada a atividade catalítica

pois mesmo a mutante H48Q possuindo uma atividade catalítica residual

pequena apresentou uma atividade de danificação de membrana semelhante

a proteína tipo selvagem e as mutantes D49K e G30S que tiveram atividade

catalítica abolida apresentaram mesmo que reduzida uma atividade de

danificação de membranas artificiais. Uma vez que a hsPLA2-IID tipo

selvagem apresenta atividade hidrolítica dependente de Ca2+, esperava-se

que a porcentagem de liberação de calceína apresentada por esta enzima

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

74

fosse realçada na presença do cofator pois, além do mecanismo danificador

de membranas, esta fosfolipase apresentaria também hidrólise dos

fosfolipídios. Entretanto, no intervalo de tempo (80 segundos) em que a

liberação de calceína é monitorada, uma fração muito pequena dos

fosfolipídios é hidrolisada de acordo com a FIGURA 26.

A proteína hsPLA2-IID tipo selvagem e mutantes também foram

avaliadas quando a capacidade de causar efeito bactericida. A atividade

bactericida foi avaliada contra as linhagens Gram-positiva, Micrococcus luteus

e Gram-negativa, Escherichia coli (K12). A contagem do número de unidades

formadoras de colônia (UFC) foi realizada em função das concentrações de

5ug.ml-1 e 10ug.ml-1 para a proteína selvagem (FIGURA 29), mostrando que o

efeito bactericida é dependente da concentração de proteína, independente

da linhagem. Este resultado está em concordância com a atividade bactericida

demonstrada por hsPLA2-IIA e BthTx-I descritos por CHIOATO, 2004. Os

resultados demonstraram que a hsPLA2-IID selvagem possui atividade contra

as duas linhagens. Como mostrado na FIGURA 32 este efeito bactericida é

diferenciado de outras sPLA2, pois a humana sPLA2-IIA tem somente atividade

contra a linhagem Gram positiva e a BthTx-I, uma Lys 49, é capaz de

permeabilizar somente a linhagem Gram negativa .

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

75

FIGURA 32: Porcentagem do número de UFC apresentado no efeito bactericida sobre

E.coli K12 e M.luteus por (A) hsPLA2-IIA e (B) BthTx-I.

(Chioato et al, 2004)

(Chioato et al, 2004)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

UF

C(%

)

Escherichia coli (K12) M icrococcus luteus

Controle hsPLA2-IIA selvagem 5ug.mL-1

hsPLA2-IIA selvagem 10ug.mL-1

A

B

Controle BthTX-I selvagem 5ug.mL-1

BthTX-I selvagem 10ug.mL-1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

UF

C (

%)

Escherichia co li (K12) M icrococcus lu teus

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

76

Diante de tal resultado e sabendo que a região C-terminal de PLA2s-Lys49

está envolvida no efeito bactericida (PÁRAMO, et al., 1998) e um cluster de

resíduos básicos na região N-terminal tem importância crucial no efeito

bactericida da proteína humana sPLA2-IIA (WEISS, et al., 1994) foi feita um

análise das seqüências de aminoácidos presentes na cadeia polipeptídica de

hsPLA2-IID e hsPLA2-IIA e BthTx-I com o intuito de identificar possíveis

resíduos que estariam envolvidos com o efeito bactericida contra as linhagens

E. coli K12 e M. luteus. Um modelo tridimensional de hsPLA2-IID foi calculado

através do programa “Modeller” (MARTI-RENOM, et al., 2000) usando As

coordenados de hsPLA2-IIA (WERY, et al., 1991) como um molde. Usando o

modelo e alinhamento das seqüências de aminoácidos da hsPLA2-IID, as

posições dos resíduos com cargas positivas e negativas foram comparadas

com hsPLA2-IIA e BthTx-I (FIGURA 33). Através do alinhamento de

seqüência de aminoácidos (FIGURA 34) foi possível identificar resíduos

comuns entra as sPLA2s humana do grupo IID e IIA e a Lys-49, BthTx-I.

A proteína hsPLA2-IIA apresenta um cluster de aminoácidos básicos

na região N-terminal, em particular a Arg7 e Lys 15 que segundo Weis, 1994

são determinantes estruturais na atividade bactericida da hsPLA2-IIA. Dessa

forma a conservação de resíduos básicos nessa região na hsPLA2-IID (Lys7,

Lys 10 e Lys15) pode está envolvida em sua atividade bactericida. Há também

uma região de resíduos polares e básicos conservados entre os resíduos 65 a

80, sendo a Lys 67 e Arg 100 unicamente presente nas proteínas hsPLA2-IID

e hsPLA2-IIA

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

77

FIGURA 33: Estrutura simulada da proteína hsPLA2-IID(A) comparada a estrutura da

hsPLA2-IIA (B) e da BthTx-I (C).

A

B

C

hsPLA2-IID

hsPLA2-IIA

BthTx-I

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

78

FIGURA 34: Alinhamento das seqüências de aminoácidos das proteínas hsPLA2-IID,

hsPLA2-IIA e BthTx-I

Entretanto, há regiões que são conservadas entre hsPLA2-IID e BthTx-I

que não estão presentes em hsPLA2-IIA. Um exemplo são os resíduos Asp64

e Lys63 que estão ausentes na hsPLA2-IIA.

Estudos cristalográficos e de RMN mostram uma superfície protéica de

ligação interfacial comum para as PLA2s dos grupos II. Esta superfície

denominada de sítio de reconhecimento interfacial, SRI (PIETERSON, et al.,

1974) ou “i-face” (RAMIREZ E JAIN, 1991) é composta por uma fenda

hidrofóbica altamente conservada que se liga a cadeia de ácido graxo do

substrato fosfolipídico, e um anel de resíduos carregados e polares. Sabendo

que em Lys-49-PLA2 os resíduos da alça C-terminal contribuem para

formação do anel do SRI e que estes resíduos interagem eletrostaticamente

com as cargas negativas nos fosfolipídios da membrana permitindo um

deslocamento da região C-terminal, facilitando assim seu contato com a

membrana (CHIOATO, et al., 2002) foi verificado uma semelhança

significativa entre as regiões C-terminais das proteínas hsPLA2-IID e BthTx-I

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

79

com aproximadamente 50% de identidade quanto a composição dos

aminoácidos e um total de 8 resíduos conservados na região do IRS

(TABELA 1) que estão presentes em hsPLA2-IID e BthTx-I e ausentes em

hsPLA2-IIA. Dessa forma é possível sugerir que a atividade bactericida contra

a linhagem Gram-neativa apresentada por essas duas proteinas tem seus

determinates estruruturiais em regiões de contato com o substrato. Enquanto

isso além dos aminoácidos da região N-terminal, já citados, a Arg 100 só

aparece em hsPLA2-IIA e hsPLA2-IID, estes são aminoácidos que ficam

opostos ao local do IRS, pondendo inferir que os determinantes estruturais de

permeabilização de membranas bacterianas da linhagem Gram-positiva não

dependem somente da região de contato com o substrato, mas que regiões

envolvidas no acesso a membrana estão contribuindo com a permeabilização

bacteriana.

hsPLA2-IID vs BthTx-I hsPLA2-IID vs hsPLA2-IIA

Resíduos Conservados no IRS

Pro 18, Lys 70, Asp 71, Glu 87, Arg 107, Leu 110, Arg 118, Lys 122

Thr 46, Lys 77

TABELA 1: Resíduos de aminoácidos conservados entre hsPLA2-IID e BthTx-I e entre

hsPLA2-IID e hsPLA2-IIA na região do sítio de reconhecimento interfacial.

O fato de BthTx-I não apresentar atividade hidrolítica e mesmo assim

provocar danificação de membranas bacterianas, mostra que esta toxina

apresenta atividade bactericida independente de catálise (CHIOATO, et al.,

2002). Mutantes da hsPLA2-IID no resíduo do sítio catalítico H48 e no resíduo

de ligação ao íon Ca+2 D49 também foram testados contra as linhagens

propostas. Contra a linhagem Gram-negativa, os mutantes apresentaram um

_________________________________________________________________________DISCUSSÃO

80

efeito bactericida independente de catálise, pois mantiveram um efeito

bactericida de 47% para a mutante H48Q e 33% para a mutante D49K, contra

um efeito de 54% da hsPLA2-IID tipo selvagem. Mas contra a linhagem Gram-

positiva este efeito foi bem sutil, pois os mutantes apresentaram um efeito de

aproximadamente 10%, enquanto a proteína selvagem teve 77% de efeito

bactericida. Estes dados sugerem uma dissociação da atividade hidrolítica em

relação ao efeito bactericida.

O efeito das mutações no resíduo do sítio catalítico e no sítio de ligação

ao íon Ca+2 sobre a atividade de danificação de membranas artificiais não foi

o mesmo apresentado sobre o efeito bactericida das duas linhagens, uma vez

que os mutantes mesmo possuindo atividade de danificação de membranas

artificiais não tiveram efeito bactericida sobre a linhagem Gram-positiva. Este

resultado pode ser devido às diferenças na composição e estrutura da parede

celular das linhagens bacterianas que dificultam ou impedem o acesso das

enzimas ou ainda devido às diferenças na membrana interna que não é

susceptível ao ataque independente de hidrólise no caso da linhagem de

Micrococcus luteus.

_______________________________________________________________________CONCLUSÕES

81

6. CONCLUSÕES

1) A proteína recombinante hsPLA2-IID é expressa em E. coli sob a forma de

corpos de inclusão e pode ser renovelada para sua forma nativa através de

um protocolo estabelecido em nosso laboratório.

2) A hsPLA2-IID tipo selvagem apresentou atividade catalítica de 58,45

� M.min-1.mg-1 e a mutante H48Q uma atividade de 7,7 � M.min-1.mg-1,

enquanto as mutantes G30S e D49K não apresentam atividades detectáveis

usando a metodologia de ligação de acido graxo em ADIFAB.

3) A hsPLA2-IID apresenta atividade danificadora de membranas artificiais por

um mecanismo que não envolve hidrolise dos fosfolipídios. Esta conclusão é

reforçada pela observação de atividade danificadora de membranas não

correlacionada com a hidrolise, como no caso da mutante H48Q que

apresentou atividade de danificação de membranas artificiais semelhante a

proteína selvagem e os mutantes G30S e D49K, que tiveram atividade

hidrolítica abolida no entanto apresentaram atividade de danificações de

membranas.

4) Além da atividade contra substrato artificial, a hsPLA2-IID apresenta

atividade bactericida contra linhagens Gram-positiva e Gram-negativa.

5) Mutantes que reduziram a atividade hidrolítica continuaram apresentando

atividade bactericida contra linhagem Gram-negativa, entretanto os mesmos

_______________________________________________________________________CONCLUSÕES

82

mutantes reduziram significativamente a atividade bactericida contra a

linhagem Gram-positiva. Assim a atividade hidrolitica não está correlaciona

com o efeito bactericida.

6) Comparação da seqüência e da distribuição dos aminoácidos carregados

mostram diferenças entre hsPLA2-IID, hsPLA2-IIA e BthTx-I, que podem

indicar os fatores estruturais que determinam a especificidade de efeito

bactericida entre bactérias Gram-positiva e Gram-negativa.

______________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Atividade da Fosfolipase A2 - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp076402.pdf · ii UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA