Aula Bibliotecas

5/13/2018 Aula Bibliotecas - slidepdf.com

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Amplificação (clonagem) dos

genes e seu armazenamento

Sistemas celulares-> bactérias, vírus, células

eucarióticas;

Sistemas acelulares-> Reação em cadeia da

polimerase (PCR)



Reação em cadeia da polimerase

(PCR) 1985- Kary Mullis inventou a reação em cadeia

da polimerase (PCR) durante uma viagem decarro ao longo da costa da Califórnia. Sua ideia

foi a concepção de uma técnica genial,relativamente simples, que funciona comocomplemento perfeito para a clonagem

gênica. Novas disciplinas surgiram comoconsequência direta da invenção da PCR-ecologia molecular, arqueologia biomolecular,

ciência forense.




(PCR

)




(PCR

)



Bibliotecas Genômicas

e de cDNA

Departamento de Biologia Celular e Molecular



Bibliotecas

São coleções de sequencias de DNA usadas

para armazenar informação-> coleção de

genes recombinantes.

Ex. de usos:

isolamento de um gene específico;

sequenciamento;

clonagem; identificação de genes em diferentes

especies;

análise de proteínas relacionadas;

Etc...



Tipos de Bibliotecas:

Biblioteca Genômica : uma coleção de clones

de DNA representando o genoma de um

organismo

Biblioteca de cDNA : coleção de clones com

insertos de DNA complementar (cDNA)

sintetizada a partir de moleculas de mRNA de

uma célula



Fontes de DNA para a Biblioteca

DNA Genomico : o DNA genômico é cortado e pequenos pedaços são clonados.

Vantagem : todo o genoma é cortado e clonado em pequenos pedaços - pega toda asequencia.

Desvantagem : vem um monte de lixo.

Dois métodos: 1. fragmentação randômica do DNA em pequenos pedaços que sãoligados a oligonucleotídeos, as pontas contêm sítios de restrição.

2. Fragmentos parcialmente digeridos com enzima de restrição. Podevariar o tempo de digestão ou quantidade de enzima.

cDNA : DNA sintetizado a partir do mRNA com a transcriptase reversa.

Vantagem : somente os genes expressos são selecionados.Desvantagem : não é possivel selecionar sequencias de controle ou íntrons e

frequentemente dependem do nível de expressão gênica.





Biblioteca genômica como fazer ?



Acompanhamento da Reação: visualização em

eletroforese em gel de agarose

Variando o tempo de digestão

ou quantidade de enzima



Biblioteca genômica



Biblioteca genômica



Biblioteca de cDNA



Síntese decDNA

oligo-dT anela na caudapoly-A.

Síntese da primeira fitade DNA a partir do mRNAem presença datranscriptase reversa

Biblioteca de cDNA



Sí ntese de cDNA

Remoção da fita original de RNAcom: Calor, alcali ou RNAse H.

Formação de grampo naextremidade 3 e extensão dogrampo com DNA polimerase

S1 nuclease (que corta bases nãopareadas)

Ligação de linkers com DNA ligase eclonagem em um vetor.



Vetores de

clonagem



Vetores

São usados para amplificar uma molécula de DNA . ODNA tem que ser inserido em um vetor de clonagem.

Um plasmídio tem uma origem de replicação e é capazde replicar em bactérias.

Os vetores são geneticamente modificados gerando:

- Plasmídeos;

- Fagos;

- Cosmídeos- BACs e

- YACs



Vetores para bibliotecas de

DNA



Plasmideos

Plasmideos são circulares,

dupla fita e encontrados em

bactérias.

Podem replicar idependentemente podendo terde poucas bases a 100 Kb.

Pode carrear fragmentos de até 10 kb

Plasmideos tem uma origem de replicação,marcador de seleção e sitios de restrição.

Após cultivo o clone pode ser recuperadofacilmente após a lise das celulas e o

fragmento de DNA ou mantido indefinitamente

em glicerol a 700

C.



Biblioteca genômica: Bacteriofago

(Lambda) Para clonar insertos de 10 a 20 Kb

Bibiotecas em plasmídeos

comportam insertos de até 10 Kb



O genoma do Bacteriofago



Biblioteca Genômica: Bacteriofago





Biblioteca de Cosmideo

Permite a clonagem defragmentos de até 45 kb



BACs: Bacterial Artificial Chromosomes

Baseado no

bacteriofago P1, o

Plasmideo F e a região lacZ

do plasmideo pUC

É um plasmideo com

baixo número de cópias

Permite fragmentos

de 50-300kb



YACs:Yeast Artificial Chromosomes

Permite insertos de até 500 kbs

YACs replicam como plasmideos embacterias quando sem inserto de DNA.

Assim que os fragmentos são inseridos,

YACs são transferidos para células, e

replicam como cromossomos eucarióticos



Triagem dos clones

de interesse



Triagem do Clone Recombinante

Biblioteca de Bacteriofagos ou plasmideos

Plaqueamento da Biblioteca

Triagem por:

Sondagem por Hibridização

Sondagem Imunológica



Hibridização

O DNA em fita simples pode parear com outro DNAou RNA desde que este possua região complementar.

Técnicas que aplicam a hibridização:

± Southern blot: DNA digerido por enzima de restrição éseparado em um e de eletroforese

± Northern blot: usa RNA no gel ao invés do DNA

± Hibridização in situ : usando um tecido ± Hibridização de colonias : detecção de clones



Processo de hibridização

O

D

NA é aquecido a alta temperatura ou empresença de NaOH e desnatura. As fitascomplementares a sonda anelam. Apóslavagem somente as sondas ligadas ficam.

Estringência: Q ual a necessidade dehomologia perfeita para que as fitas se

mantenham ligadas?DEPENDE DA ESTRINGENCIA

Em BAIXA concentração de salALTA temperatura (Depende da quantidade de

GC)MAIOR a necessidade de complementariedade.

Autorradiografia. Sonda marcadaimpressiona o filme de raioX.









Hibridização com sonda radioativa



Hibridização com sonda não

radioativa



Hibridização com sonda não

radioativa





Sondagem imunológica



Sondagem imunológica



Southern hybridization (DNA)







Triando uma Biblioteca: Hibridização de colônias





Hibridização de Colônias



A sonda pode ser sintetizada?



Triagem de biblioteca Genômica:

II.Colônia ImunoensaioA sonda é um anticorpo, as colônias são crescidas e a proteínarecombinante é expressa



Triando uma Biblioteca Genômica:

II.Colônia Imunoensaio

A quimioluminescencia também irá impressionar o filme de raio-X



Biblioteca Genomica: Bacteriofago



Plaques - Bacteriofago



Triando uma biblioteca de fago

Fagos recombinantes inseridos em

bactérias são plaqueados resultando

na formação de plaques;

As partículas de fagos e o genoma

do fago são transferidos para umfiltro de nitrocelulose;

O filtro é incubado com uma sonda

radioativa para um determinado gene;

Fago com o gene de interesse é

identificado por autoradiografia e este

clone pode ser isolado e inoculado em

um novo hospedeiro para mais uma amplificação

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