INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM – ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA

CURSO DE ENGENHARIA DA PRODUÇÃO ANIMAL

BIOQUÍMICA

Doseamento das proteínas

pelo método do bioreto

(Relatório)

#2439 – David Quintino

#2466 – Filipe Sampaio

#2587 – André Chucha

Resumo Este trabalho teve como objectivo a determinação da quantidade de proteína

numa amostra. Para tal foi utilizada a espectroscopia de absorção molecular, mais

concretamente o método do Biureto. Esta reacção ocorre com todos os compostos que

contenham duas ou mais ligações peptídicas, formando-se um complexo azul púrpura.

A concentração da proteína na amostra foi calculada a partir de uma curva de

calibração feita usando uma solução proteica padrão, a solução de albumina de soro

bovino (BSA) 2mg/mL.

A equação da recta de calibração é y = 0,0371x + 0,0159 e através dela e dos

valores da absorvência para o tubo 6 e 7, podemos concluir que as suas concentrações

são: 21,17 mg/mL e 8,277 mg/mL, respectivamente.

Em relação à Lei de Lambert – Beer podemos concluir que existem desvios, pois

o coeficiente de correlação (r) = 0,9878, quando deveria ser 0,9999.

Introdução Teórica

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ ou emissão de

radiação electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se

movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da

radiação nos comprimentos de onda entre o ultra violeta e o infra vermelho.

A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de

onda que vai desde o ultra violeta ao infra vermelho no espectro da radiação

electromagnética.

O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 µm.

Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz

monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida

por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes

comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz

monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro

permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida em cada comprimento de onda.

O conjunto das absorvências dos vários comprimentos de onda para um

composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância, a

espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu

espectro como também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está

relacionada com a concentração da substância.

Existe então princípios de absorção da luz:

A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela

atravessada;

A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo

feixe luminoso através das amostras.

Juntando estes princípios temos a lei de Lambert – Beer: Abs = E. b. c

A absorvência da luz a cada comprimento de onda é directamente

proporcional à concentração da solução contida na couvette. Esta linearidade deixa de

ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nestes casos diluir

previamente a amostra a medir.

Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas

complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de

onda. Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos, o composto a

quantificar é posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver

uma cor cuja intensidade é directamente proporcional à concentração da substância

na mistura original. Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode

medir-se a absorvência a 280µm, sendo esta proporcional à concentração de proteína.

Mas se quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método

já não pode ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos

nucleícos, também absorvem a este comprimento de onda. Neste caso, podemos

utilizar, por exemplo, o reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as

proteínas, originando um complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a

540µm.

Para quantificar espectrofotométricamente uma substância é necessário saber

o valor de . Para isso é necessário preparar uma série de soluções do composto a

quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e medir as

absorvências ao comprimento de onda adequado.

Assim, podemos fazer corresponder uma absorvência medida, a uma concentração

de substância na solução a analisar, obtendo deste modo, uma curva de calibração.

Na determinação da concentração de proteínas, objectivo deste trabalho, há que

ter em conta que nem todas as proteínas exibem o mesmo comportamento perante os

ensaios espectrofotométricos de doseamento.

As características físico-químicas das proteínas exploradas em análises

quantitativas são:

1. As absorvências das cadeias laterais de resíduos aromáticos a 280µm;

2. Absorvências específicas de grupos prostéticos de proteínas, por exemplo do

grupo heme a 415µm;

3. A ligação peptídica que forma um complexo violeta com Cu 2+ na reacção do

Biureto;

4. As cadeias laterais de Tyr e Trp, que reagem com agentes oxidantes no método

de Lowry;

5. A ligação de corantes a regiões hidrofóbicas, como no método de Bradford;

6. As cadeias laterais de Lys e His e o terminal amina que reagem com a ninidrina.

Cada método é aplicável a gamas restritas de concentrações de proteínas e

apresentam sensibilidades e interferências a considerar, quando as amostras contém

outras moléculas para além das proteínas. Entre as vantagens da utilização destes

métodos, figuram a facilidade de execução e o facto de substâncias específicas

poderem ser doseadas em soluções que contenham misturas de várias biomoléculas

sem etapas prévias de purificação.

A reacção do Biureto (método utilizado nesta experiência) é um dos métodos mais

rápidos e mais utilizados no doseamento de proteínas. Foi um dos primeiros ensaios

colorimétricos a ser desenvolvido. A natureza do complexo colorido não é conhecida

em detalhe, no entanto pensa-se que está envolvida a formação de um complexo de

cobre em soluções muito alcalinas com uma ligação peptídica das proteínas e também

com alguns resíduos de tirosina, formando um complexo de cor violeta.

Procedimento Experimental

Material e reagentes:

o Solução padrão de albumina de soro de bovino (BSA) 2 mg/mL

o Solução de proteína de concentração desconhecida

o Reagente do Biureto: dissolveu-se 6g de tartarato de sódio e potássio

tetrahidratado em 500mL de água destilada. Adicionou-se lentamente 1,5g de

sulfato de cobre pentahidratado e 300 mL de hidróxido de sódio10% (m/v).

diluiu-se para 1 L.

o Espectrofotómetro

o Cuvettes para medição no visível (plástico ou vidro)

o Tubos de ensaio

o Copo de precipitação

o Pipetas

o Balança analítica

Procedimento:

1. Preparou-se o branco e os tubos para a curva de calibração de acordo com o

quadro:

Tubo 1 2 3 4 5

mL BSA 0,3 0,5 0,7 1,0 1,2 mL H2O 1,2 1,0 0,8 0,5 0,3

Tubo branco: 1,5 mL de H2O

2. Diluiu-se o extracto proteico preparado na aula anterior 1/50 (0,1 mL de extracto

+ 4,9 mL de H2O) e prepararam-se os tubos com a amostra de proteína:

Tubo 6: 0,2 mL de amostra + 1,3 mL de H2O

Tubo 7: 1,0 mL de amostra + 0,5 mL de H2O

3. Adicionou-se 1,5 mL de reagente do Biureto a todos os tubos e agitou-se.

4. Deixou-se em banho-maria a 37ºC durante 15 minutos;

5. Leu-se a absorvência 540µm (calibrou-se o espectrofotómetro com o branco)

Apresentação e tratamento de resultados

Cálculos: o Tubo 1

2 mg ------------ 1 mL

x ------------ 0,3 mL x = 0,6 mg

o Tubo 2

2 mg ------------ 1 mL

x ------------ 0,5 mL x = 1,0 mg

o Tubo 3

2 mg ----------- 1mL

x ----------- 0,7 mL x = 1,4 mg

o Tubo 4

2 mg ------------ 1mL

x ------------ 1,0 mL x = 2,0 mg

o Tubo 5

2 mg ----------- 1mL

x ----------- 1,2 mL x = 2,4 mg

TUBOS Abs

540µm mL de BSA mg de proteína

1 0,051 0,3 0,6

2 0,097 0,5 1,0

3 0,118 0,7 1,4

4 0,170 1,0 2,0

5 0,200 1,2 2,4

Gráfico: Cálculos: (amostras)

A partir da equação da recta: y = 0,0371 x + 0,0159

o Tubo 6

0,173 = 0,0371 x + 0,0159

x = 4,234 mg

Concentração do tubo 6 = (4,234 x 1) / 0,2 = 21,17 mg/mL

o Tubo 7

0,323 = 0,0371 x + 0,0159

x = 8,277 mg

Concentração do tubo 7 = (8,277 x 1) / 1 = 8,277 mg/mL

TUBOS Amostra (mL) Abs. 540µm

Resultados do

cálculo da

massa (mg)

apartir da

equação da

recta

Concentrações

(mg/mL)

6 0,2 0,173 4,234

21,17

7 1,0 0,323 8,277

8,277

y = 0,0371x + 0,0159

R2 = 0,9878

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,6 1,0 1,4 2,0 2,4

mg de proteína

AB

S. 5

40

nm

Series1

Linear (Series1)

Discussão e conclusões

De acordo com os nossos princípios teóricos concluímos que existem desvios à

Lei de Lambert–Beer pois o coeficiente de correlação é igual a 0,9878, quando deveria

tomar valores próximos de 0,9999. Podemos também concluir que este é um método

muito sensível, daí a existência de desvios, que podem ter ocorrido devido a pouco

cuidado na execução e utilização da curva de calibração.

No entanto, todos os objectivos foram alcançados, dentro dos quais se destaca

a obtenção, através da recta de calibração y = 0,0371 x + 0,0159, do valor da

concentração da amostra contida no tubo 6 e no tubo 7.

Este trabalho permitiu também a familiarização com a técnica da

espectrofotometria e um dos métodos colorimétricos mais utilizados – o método do

Biureto.

Bibliografia

www.google.com

Protocolo experimental dado na aula

Sebenta teórica de Bioquímica