BIOTECNOLOGIA_04

7/25/2019 BIOTECNOLOGIA_04

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Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores.

Curso de

Biotecnologia

MDULO IV

Ateno:O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos paraeste Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao domesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autoresdescritos nas Referncias Bibliogrficas.


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MDULO IV

Aplicaes da Biotecnologia

5. Introduo

A tecnologia do DNA recombinante forneceu as ferramentas que permitiram

desvendar a molcula de DNA. A principal aplicao desta descoberta foi o

sequenciamento de genomas. Com estas sequncias, o passo seguinte consiste emrevelar a funo de cada uma, o que tem aplicaes diretas em diversas reas do

conhecimento, como a de sade e a ambiental. Este mdulo tem por objetivo

fornecer uma viso geral a respeito dos diversos empregos que a biotecnologia pode

trazer em benefcio da sociedade.

5.1 Projeto Genoma

Biotecnologia e genoma so termos inter-relacionados. Enquanto o primeiro

significa a aplicao dos conhecimentos, o segundo representa a descoberta e o

entendimento necessrios para implantar os benefcios. A sequncia e a ordenao

dos nucleotdeos que compe o genoma contm a diversidade de informaes

necessrias para gerar todas as formas de vida existentes no planeta. Deste modo,

o sequenciamento dos genes permite a leitura, a compreenso e a utilizao destes

dados, caractersticas que impulsionam, ento, o desenvolvimento de projetos

genoma.

O primeiro genoma sequenciado de um organismo vivo diferente de vrus foi

o da bactria Hemophilus influenzae. Este tipo de projeto tambm prosseguiu para

outros organismos e espcies. Em 1990, uma associao internacional entre

pesquisadores de diferentes pases iniciou o projeto Genoma Humano. Em 2000, o

Brasil finalizou o sequenciamento do genoma da bactria Xylella fastidiosa, o que foi

realizado por pesquisadores do estado de So Paulo. Atualmente, diversos grupos


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de pesquisa investem esforos considerveis no sequenciamento de todo o material

gentico de diferentes micro-organismos, principalmente. S no Brasil, esto emandamento mais de 10 projetos para desvendar a sequncia de nucleotdeos de

bactrias e fungos. Estas tecnologias esto avanadas de tal maneira que este tipo

de estudo pode ser finalizado em apenas poucos dias.

O grande interesse manifestado por pesquisadores quanto ao

desenvolvimento de projetos genoma se deve s grandes aplicaes que suas

informaes podem proporcionar. O pleno conhecimento das informaes genticas

de diferentes organismos possibilitar um melhor entendimento da diversidadegentica, o que permitir desvendar muitas questes, como a relao parasita-

hospedeiro. O desenvolvimento de vacinas e de testes diagnsticos, finalmente,

guiar a produo de novas drogas e terapias efetivas para o tratamento de diversas

doenas.

Um equvoco das pessoas em relao aos projetos genoma se refere sua

associao de resoluo e cura de doenas. Na verdade, o que este tipo de projeto

fornece so informaes sobre as coordenadas iniciais de onde se localiza um

determinado defeito gentico. Por exemplo, atualmente j se tem conhecimento de

onde buscar a informao gentica que predispe para a Doena de Alzheimer e do

cncer de reto. Apesar disto, no h garantias de que a cura destas doenas ser

descoberta. Os projetos genoma constituem, portanto, o conhecimento bsico que

dar suporte, no futuro, a uma aplicabilidade das informaes por ele geradas.

As pesquisas sobre o genoma constituem o ponto de partida para a era ps-

genmica. Os cientistas acreditam que, por exemplo, compreendendo a fundo o que

acontece de errado quando uma doena aparece, a medicina entrar em uma nova

era, como o estabelecimento de terapias mais eficientes. Uma delas a terapia

gnica.

5.2 Terapia Gnica

Entende-se como terapia gnica a transferncia de material gentico para as


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clulas de um indivduo, resultando em substituio ou mesmo na complementao

dos genes defeituosos. Este conceito atualmente mais amplo e abrange otratamento de doenas degenerativas, infecciosas e do cncer. A terapia gnica

constitui uma esperana para o tratamento de diversas doenas que atualmente no

apresentam um tratamento adequado. Cerca de quatro mil doenas genticas so

conhecidas, sendo, portanto, alvos potenciais da terapia gnica.

Outras aplicaes sugeridas para esta tecnologia tambm incluem a

liberao de protenas que permitam controlar os nveis hormonais ou estimular o

sistema imunolgico. O primeiro exemplo de aplicao da terapia gnica foirealizado em uma criana de quatro anos que sofria de uma desordem no sistema

imunolgico, nos Estados Unidos. Desde ento, aproximadamente dez anos de

pesquisa tm sido conduzidos na rea. Um deles apresentou um resultado

significativo que foi a reverso dos efeitos da doena hereditria da imunodeficincia

ligada ao cromossomo X. Apesar deste resultado promissor, a maioria deste tipo de

terapia no tem apresentado tanto sucesso. Novas pesquisas devem ser concludas

de forma a aperfeioar este tipo de tratamento.

A terapia gnica constitui uma estratgia promissora para o tratamento de

diversas doenas infecciosas. Entretanto, frente a tratamentos ainda ineficazes, a

biotecnologia tambm revolucionou a rea da medicina preventiva, como o

desenvolvimento de novas vacinas.

5.3 Novas Vacinas

Diversos tipos de vacinas esto disponveis ou em desenvolvimento, cada

qual apresentando diferentes vantagens e desvantagens. As que utilizam micro-

organismos vivos atenuados ou mortos tm a vantagem de apresentarem mltiplos

epitopos para reconhecimento pelo sistema imunolgico, sendo que seu custo e

produo dependem basicamente do fornecimento de material contendo os micro-

organismos em questo. Contudo, sua segurana questionvel. A instabilidade da

vacina atenuada torna difcil a sua distribuio, particularmente em pases em


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desenvolvimento. Alm disso, as vacinas que utilizam todo o micro-organismo

podem apresentar reaes cruzadas com outros antgenos, o que interfere com ostestes sorolgicos. No caso de vacinas mortas, apesar de serem mais seguras,

frequentemente necessitam de mltiplas inoculaes associadas a adjuvantes, o

que pode induzir efeitos colaterais indesejados. Dentro destes aspectos, percebe-se

a necessidade do desenvolvimento de vacinas mais seguras e eficazes.

A tecnologia do DNA recombinante tem sido utilizada no aprimoramento de

vacinas. Na era dos omas, as anlises de genomas, transcriptomas e proteomas

permitem um melhor atendimento das vias moleculares relacionadas biologia dopatgeno e das interaes parasita-hospedeiro. A partir destas informaes,

protenas alvos tm sido obtidas a partir da expresso em vetores de expresso

procariotos e eucariotos, constituindo as vacinas de subunidades proteicas.

As vacinas de subunidade tm sido muito utilizadas para a preveno de

doenas. Mesmo que sejam necessrios vrios antgenos para a estimulao da

resposta imunolgica adequada, ela ainda possui vantagens sobre a utilizao de

drogas como tratamento ou como mtodo preventivo de doenas. Por exemplo, o

controle de parasitas geralmente utiliza drogas em um sistema de rotao, o que

pode induzir a resistncia aos medicamentos utilizados. Alm disso, outro ponto

atualmente muito discutido se refere contaminao ambiental pelo uso excessivo e

descontrolado destas drogas.

Outras apresentaes vacinais esto sob contnuo aprimoramento. Uma das

mais recentes a vacina de DNA. O antgeno destas vacinas expresso pela

prpria clula do hospedeiro, sendo capazes de induzir uma potente resposta

imunolgica, principalmente em nvel de linfcitos citotxicos. Esta caracterstica a

torna uma estratgia promissora no combate de parasitas intracelulares.

A tecnologia do DNA recombinante ainda auxilia no desenvolvimento de

novas formas para a apresentao de antgenos, como o uso de lipossomas,

nanopartculas, ou mesmo o uso de vrus e bactrias carreadoras. Esta ltima opo

tem grande interesse, principalmente no desenvolvimento de vacinas veterinrias,

pois apresenta a oportunidade de induzir a imunidade de mucosa. A maioria das


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doenas infecciosas de animais adquirida por via oral ou por inalao, o que

facilitado pelas condies de criao a que os animais esto submetidos. Assim,vias que gerem a imunidade de mucosa poderiam ser a via de imunizao mais

eficaz para determinadas doenas de animais.

A biotecnologia ainda pode ser utilizada para resolver um problema

decorrente da vacinao: a distino entre indivduos vacinados e infectados. Para

que isto seja possvel, uma estratgia a identificao de antgenos que induzam

uma intensa resposta humoral (por anticorpos) durante a infeco e que no sejam

essenciais para a imunidade induzida ou para a sobrevivncia da bactria. Estainformao pode ser utilizada na construo de uma linhagem mutante para o gene

em questo.

Assim, animais infectados podem ser identificados pela resposta humoral

contra o antgeno que foi deletado da linhagem vacinal; por outro lado, os animais

vacinados e no infectados no reagiram no mesmo teste. Estudos nessa rea

esto recebendo intensos investimentos e os resultados experimentais j obtidos

demonstram-se promissores. A biotecnologia tem um profundo aproveitamento na

rea da sade. Alm do desenvolvimento de terapias e de vacinas, ela ainda pode

ser utilizada na gerao de novos produtos e kits de diagnstico.

5.4 Novos Produtos

Muitos produtos de interesse comercial e de sade pblica j so obtidos

atualmente por meio de tcnicas biotecnolgicas. Exemplos como a insulina

humana, o hormnio de crescimento bovino, suno e equino e substncias beta-

agonistas, foram conseguidos com sucesso. Frequentemente, a tecnologia envolvida

em sua gerao a expresso em sistemas procariotos e eucariotos. Contudo, o

mesmo objetivo pode ser alcanado utilizando animais transgnicos como

biofbricas.


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5.5 Novos Kits de Diagnst ico

O mtodo de diagnstico mais utilizado na clnica mdica e veterinria o

microbiolgico. Contudo, o isolamento e a caracterizao dos diversos micro-

organismos possuem limitaes, principalmente no caso de linhagens em que o

cultivo in vitrono to eficiente. A necessidade de meios de cultura especficos

para cada patgeno, o tempo de crescimento in vitro, que pode variar de semanas a

meses, e a presena de contaminantes so fatores limitantes quanto utilizao do

mtodo em questo. Portanto, h a necessidade de mtodos diagnsticos capazesde obter um resultado de alta sensibilidade e especificidade em menor tempo, sendo

o diagnstico molecular uma alternativa promissora.

O diagnstico molecular utiliza como base a identificao de sequncias de

DNA especficas e caractersticas de cada patgeno. A tcnica de eleio para este

fim a reao em cadeia da amplificao de cidos nucleicos (PCR). Vrios grupos

de pesquisa desenvolvem este tipo de teste, comparando a sua vantagem frente a

mtodos de diagnstico tradicionais. Dentro deste contexto, um trabalho comparou a

sensibilidade entre a microscopia ptica, a imunofluorescncia indireta e o PCR para

a deteco de Brucella equiem equinos cronicamente infectados.

O ensaio mostrou que 38,8%, 50% e 78% dos animais formam positivos

utilizando as tcnicas anteriormente citadas, respectivamente. Ainda foi relatado o

fato de o PCR ter detectado o agente etiolgico at mesmo em baixos nveis de

parasitemia. Estes resultados demonstram que o PCR uma tcnica bastante

eficiente quanto ao diagnstico de doenas infecciosas.

As provas de diagnstico molecular so amplamente trabalhadas, o que se

deve a sua alta sensibilidade e especificidade. O PCR uma tcnica capaz de

amplificar uma sequncia de interesse a partir de picogramas do DNA da amostra, o

que caracteriza sua alta sensibilidade. A alta especificidade das tcnicas

moleculares est relacionada com a amplificao de somente uma sequncia de

DNA especfica de cada patgeno, evitando respostas cruzadas com outros agentes

que possuam caractersticas similares. Isto constitui uma vantagem em relao ao


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diagnstico por testes sorolgicos, uma vez que o mesmo pode identificar

caractersticas compartilhadas por outros agentes etiolgicos.A escolha por um mtodo de diagnstico molecular baseado no PCR deve

ser analisada com cautela. Apesar da alta sensibilidade e especificidade, os testes

moleculares tambm apresentam limitaes e problemas frequentes. A reao pode

gerar desde um falso-positivo, devido presena de contaminantes, ou mesmo um

falso negativo, pela presena de inibidores da reao na amostra clnica.

Alm destes problemas, outra questo se refere falta de controles internos

na reao, dificultando diferenciar entre um diagnstico negativo verdadeiro e umafalha da tcnica. Portanto, o aprimoramento da tcnica e dos mtodos de anlise

padro constitui passo fundamental para a implantao do diagnstico molecular.

Uma opo ao diagnstico por PCR a utilizao de uma de suas variantes,

o PCR multiplex. Esta tcnica se baseia na incluso, em uma mesma reao de

PCR, de pares de iniciadores capazes de amplificar diferentes sequncias de um

determinado agente etiolgico, incluindo uma que ser amplificada com certeza em

qualquer amostra clnica. Este tipo de controle interno diferenciar se o resultado

realmente negativo ou se decorre de um problema que tenha inibido a reao.

O PCR multiplex, apesar de ser uma variante com vantagens considerveis

sobre o PCR convencional, tambm possui suas limitaes. Dependendo dos

agentes que se queira identificar, o nmero de pares de iniciadores a serem

adicionados em uma mesma reao tambm um fator limitante para uma

amplificao adequada. Quando muitos so adicionados, observa-se uma

diminuio, at mesmo expressiva, da sensibilidade do teste. Mesmo sendo possvel

a manipulao em alguns casos, a soluo para este problema pode exigir o uso de

outra tcnica, como a hibridizao reversa.

A hibridizao reversa consiste de uma reao de PCR que utiliza um primer

universal capaz de amplificar sequncias conservadas entre os agentes etiolgicos a

serem diagnosticados. Apesar de a regio de anelamento dos iniciadores ser

conservada, a poro interna da mesma deve conter sequncias variveis e

singulares a cada patgeno. A diferenciao entre eles feita com o auxlio da


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hibridizao. Para isso, utiliza-se um aparato especial que permite que vrias

amostras de PCR sejam analisadas ao mesmo tempo, em relao a diferentesagentes. Alm disso, essa tcnica a de eleio em casos em que o objetivo seja o

de diagnosticar infeces mltiplas, sendo ainda uma tcnica de maior sensibilidade

que o PCR.

Diante do exposto, a escolha do teste de diagnstico a ser utilizado depende

dos objetivos do pesquisador e das condies limitantes. Para diferentes situaes

so exigidas adaptaes distintas. Por isso, novas tcnicas esto sendo

desenvolvidas, como:I. O PCR em tempo real, que permite a quantificao do material

referente aos possveis alvos. Sua vantagem est na possibilidade de diferenciar

entre a presena de uma sequncia de DNA e a sua expresso ativa;

II. A tecnologia do microarray, o qual pode ser utilizado na identificao

de espcies, sorotipos, marcadores de virulncia e resistncia a antibiticos;

III. O sequenciamento de genes derivados dos micro-organismos.

A biotecnologia tem mltiplas aplicaes em diversas reas do

conhecimento. Alm da rea da sade, como o desenvolvimento da medicina

teraputica e preventiva, as tcnicas derivadas da engenharia gentica podem trazer

benefcios para a agropecuria. Exemplos so a seleo assistida por testes de

DNA e a clonagem.

5.6 Seleo Assistida com Testes de DNA e Clonagem

A tecnologia do DNA recombinante permite ainda fornecer instrumentos para

o melhoramento animal. A produo agropecuria exerce um importante patamar na

economia e comrcio internacional brasileiro. Assim, a pesquisa busca mtodos

eficientes para aperfeioar o potencial gentico dos animais, resultando em uma

produo mais rentvel, com elevada produtividade e/ou agregao ao valor do

produto.


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Uma alternativa utilizada no melhoramento de animais utiliza a gentica

clssica de Mendel. Durante sculos este modelo tem sido empregado com sucessopara a seleo artificial de caractersticas benficas. Contudo, esta metodologia

apresenta desvantagens relevantes. Vrios cruzamentos so necessrios, tendo

ainda que levar em considerao o tempo de amadurecimento sexual e do intervalo

entre partos dos animais. Estas afirmaes demonstram que se leva muito tempo

at alcanar a caracterstica desejada.

Alm disso, os resultados obtidos podem ser insatisfatrios, pois pode

ocorrer de outros genes ligados ao de interesse, que codificam caractersticasindesejadas, sejam repassados tambm. Diante destes fatos, percebe-se a

necessidade de implantar estratgias que permitam trabalhar o melhoramento

gentico em um menor tempo de geraes para o surgimento da caracterstica

desejada. Uma destas estratgias por meio das tcnicas derivadas da

biotecnologia molecular.

O melhoramento gentico tem sido beneficiado por estudos com a

genmica. Esta cincia envolve uma verdadeira anatomia molecular, como o

mapeamento de cromossomos, iniciativas de estudos de transcriptomas em tecidos

e rgos, ou mesmo em fases da evoluo embrionria. Contudo, estas informaes

so muito amplas e ainda restritas sobre a sua funcionalidade, dificultando a sua

aplicao no melhoramento de animais. Um dos mtodos mais promissores para a

produo animal o estudo de polimorfismos genticos.

Os polimorfismos genticos so variaes nos alelos de um gene, o que

resulta em diferentes gentipos. Esses marcadores moleculares podem estar ligados

s caractersticas de interesse, como a taxa de ovulao, de crescimento e de

composio corporal, da qualidade e funo do sistema imunolgico e, at mesmo,

com a eficincia reprodutiva. Nestes casos, eles so pontos de partida para avaliar e

escolher gentipos que devam ser propagados at alcanar a caracterstica de

interesse.

Os polimorfismos se aplicam, inicialmente, em estudos populacionais. As

variaes em alelos podem ser documentadas em estudos genealgicos, permitindo


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a montagem da estrutura da populao. As vantagens da genmica para a anlise

de pedigrees na gentica quantitativa se traduzem em uma maior acurcia, tendo-seque inferir menos a respeito das observaes feitas a partir da prole obtida.

Estudos de pedigrees foram realizados na identificao de caractersticas de

interesse e, consequentemente, para a seleo animal. Um exemplo foi o estudo

sobre a deficincia do fator XI em gado, patologia que pode ser assintomtica.

Contudo, esta anomalia pleiotrpica, afetando outras caractersticas de interesse

econmico, como a reproduo e o estado imunolgico dos animais. Sugere-se que

o gado deficiente no fator XI, incluindo tanto os homozigotos quanto osheterozigotos, d menor nmero de bezerros, alm de serem mais susceptveis s

doenas infecciosas.

Diante do impacto econmico que a deficincia do fator XI tem sobre a

produo animal, foram realizados estudos sobre a sua transmisso. Para isso,

utilizou-se a anlise de pedigree, que mostrou tratar-se de uma deficincia

autossmica recessiva. Perante este fato, um trabalho de genotipagem de gado foi

desenvolvido com o objetivo de avaliar a frequncia da mutao gnica na

populao.

A deficincia se deve insero que acrescenta aproximadamente 76b de

uma espcie de cauda poliA. A diferenciao entre homozigotos e heterozigotos

pode ser feita aps a amplificao das sequncias allicas p PCR, sendo que o

resultado pode ser visualizado aps a eletroforese dos amplicons. Os animais

homozigotos apresentam uma nica banda, sendo que a de maior peso molecular

indica que os animais so homozigotos recessivos.

Diferentemente, os indivduos heterozigotos so distinguidos dos demais

pela visualizao de duas bandas distintas no gel aps a eletroforese da amostra.

Testes de genotipagem j vm sendo realizados nos programas de melhoramento

gentico e nas centrais de inseminao artificial, permitindo o descarte de

caractersticas indesejadas e as de baixa herdabilidade. Um exemplo o teste para

a susceptibilidade sndrome do estresse suno, o qual j se encontra disponvel

comercialmente. Outros testes disponveis incluem os que permitem a anlise de


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crescimento, reproduo e outros que afetam a qualidade dos produtos animais.

O estudo de pedigree vem sendo tambm utilizado na reproduo animalpara a seleo de reprodutores. A anlise preliminar de alguns grupos ancestrais

visa utilizar, de maneira mais racional, a variabilidade gentica existente nos

plantis, ordenando quais seriam os melhores pares para o acasalamento. Esse tipo

de anlise vem sendo feito na Amaznia para a seleo de avestruzes. O mesmo

estudo de polimorfismo utilizado para este fim.

O potencial da biotecnologia para a reproduo tambm tem sido aplicado

em processos de sexagem de espermatozoides e de embries. Estas tcnicas sode grande interesse, principalmente para gado de leite, podendo selecionar somente

os espermatozoides ou embries que deem origem a fmeas. Isto evitaria o

descarte de bezerros machos.

Outra tecnologia que foi testada ainda dentro do tema reproduo a

clonagem de animais. O primeiro animal clonado foi a ovelha Dolly, sendo que no

Brasil foi a bezerra Vitria. Um dos ideais da clonagem consiste em aumentar a

produo animal. Contudo, o custo envolvido com esta tecnologia a torna

inacessvel para esta finalidade. Outros aspectos so: a falta de conhecimento a

respeito do funcionamento do genoma, alm das questes ticas. Por isso, centros

de pesquisas que trabalham na rea esto investigando o comportamento fisiolgico

dos clones, para averiguar a viabilidade do processo.

O melhoramento gentico de animais, com a introduo de uma

caracterstica de interesse em menor tempo, tem um grande interesse comercial.

Alm de inferir com mais acurcia os animais a serem cruzados, a biotecnologia

ainda vem testando uma maneira mais rpida para obter a qualidade almejada,

como o uso de animais transgnicos. Alm desta aplicao, estes animais

geneticamente modificados apresentam ainda outras aplicaes extremamente

interessantes.


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5.7 Animais Transgnicos

A transgenia animal a criao de indivduos contendo genes heterlogos

de interesse, sem a necessidade de intercruzamento. Este objetivo alcanado

aps a transfeco celular, o que permite que a sequncia exgena seja inserida no

material gentico do hospedeiro. Sua justificativa consiste no estabelecimento, em

curto prazo e a um custo menor, de caractersticas no alcanadas facilmente por

outros meios, como a obteno da conformao correta de protenas de interesse.

A aplicao de animais transgnicos ampla e inclui estudos bsicos, como:I. Pesquisas mdicas, como modelos de enfermidades humanas para a

identificao e estudo de fatores envolvidos em sistemas homeostticos;

II. Em toxicologia, como organismos destinados a testes biolgicos;

III. Na produo industrial, para obter protenas especficas;

IV. Na agricultura e zootecnia, para o melhoramento da carne e de outros

produtos de origem animal; e

V. Na gerao de animais resistentes a doenas.

Novos modelos de animais vm sendo utilizados tambm para avaliar

mecanismos patognicos, procedimentos teraputicos e de diagnstico, nutrio e

doena metablica, alm de eficcia de novas drogas desenvolvidas. Contudo, esta

apostila ir destacar somente algumas destas aplicaes.

5.7.1 Animais Resistentes a Doenas

Uma grande preocupao na produo agropecuria inclui os gastos

relacionados com o controle e o tratamento de doenas infecciosas, o que tem sido

estimado em cerca de 10-20% dos custos de produo total. Alm disso, uma das

caractersticas da criao de animais consiste na aglomerao dos mesmos, o que

permite a rpida disseminao dos patgenos. Animais transgnicos gerados para

serem mais resistentes a uma determinada doena constituem ento uma alternativa

interessante para o problema.


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Vrios genes esto sendo testados para a gerao de transgnicos

resistentes s patologias. Estudos iniciais foram realizados em camundongos. Umdos testes nesta espcie foi o de obter animais com menor propenso a desenvolver

mastite. Com este objetivo, clulas de camundongos foram transfectadas com o

gene da lisostafina. Esta protena possui potente atividade contra Staphylococcus

sp, um dos agentes etiolgicos frequentemente envolvidos em casos de mastite. Os

animais transgnicos foram testados contra o desafio por esta bactria.

Os camundongos, cujas clulas da glndula mamria eram capazes de

secretar protenas antibacterianas, mostraram-se mais resistentes infeco emcomparao com aqueles que no tinham essa capacidade. Isto demonstra o

potencial da transgenia na criao de animais resistentes. Caso contrrio, o uso

desse tipo de antibacterianos por via oral ou outra forma de administrao no

utilizada, pois perde sua atividade aps destruio na via digestiva ou h uma

resposta imune mediada contra ela. No animal transgnico, esta protena no ser

reconhecida como exgena.

Camundongos transgnicos ainda foram testados quanto ao seu potencial

em resistir a infeces virais. Para isto, clulas destes animais foram transfectadas

com os alelos do gene MXl. Este gene codifica uma protena que interfere na

replicao do vrus de influenza, prevenindo o crescimento, tanto in vitro como in

vivo. Esta protena ainda tem a mesma ao contra vrus de RNA fita simples, como

outros da famlia Orthomixoviridae.

A metodologia utilizada para prevenir a infeco pelo vrus da Influenza

consistiu na observao de que a citocina interferon beta tem seus nveis de

expresso aumentados aps a infeco. Esta protena estimula o sistema

imunolgico de forma a polarizar a resposta contra o ataque viral. A associao

desta informao com as caractersticas da ao antiviral da protena MXI foi a

responsvel pela metodologia adotada na construo gentica para a criao de

animais resistentes. Colocando-se o gene MXI sob o comando de um promotor

induzido por interferon, o gene ativado somente no local de infeco, impedindo

assim a propagao do vrus. Este processo, denominado de imunizao


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intracelular, aliado transfeco de uma linhagem germinativa, gerou camundongos

transgnicos que expressavam a protena MXI. A introduo deste gene emcamundongos susceptveis os tornou resistentes ao ataque viral.

A resistncia contra doenas infecciosas extremamente importante para os

animais de produo e, por isso, testes de transgenia em espcies alvos tambm

tm sido realizados. Em aves, a expresso da capa viral do vrus da Leucose em

alguns de seus receptores protegeu esses animais do desafio com o vrus em

questo, sugerindo a possibilidade de se conseguir a resistncia viral nesta espcie

animal. Gado transgnico tambm foi testado quanto sua susceptibilidade aoataque viral. Para isso, utilizaram-se mtodos que permitiram atingir altos nveis de

expresso do interferon beta e a expresso de anticorpos contra um determinado

agente etiolgico. Estas metodologias demonstraram resultados promissores.

Em sunos, a metodologia utilizada para criar animais resistentes ao ataque

viral foi a mesma da adotada em camundongos. A expresso da protena MXI

induzida pelo interferon teve sucesso em duas linhagens transgnicas. Apesar disso,

este modelo adotado tambm um bom exemplo dos problemas enfrentados na

produo de animais transgnicos resistentes a doenas. A introduo de um nico

gene pode no ser totalmente eficaz. No caso da protena MXI, sua ao

diferenciada de acordo com o estgio celular, resultando em uma eficcia diferente

na proteo das clulas alvo. Alm disso, a expresso dessa protena suprimida

aps meses, processo cuja causa ainda no foi esclarecido.

Outro problema discutido a respeito da produo de animais transgnicos se

refere s determinadas construes genticas utilizadas para este propsito. Em

sunas, houve rearranjo das sequncias que aboliram a sntese proteica. O uso de

determinados elementos genticos podem ser prejudiciais, como um promotor

constitutivo de humano que se mostrou deletrio para a espcie em questo.

Portanto, percebe-se a necessidade de obter mais conhecimentos de cada via

envolvida no processo, alm da genmica funcional para melhorar os sistemas

genticos a serem utilizados na criao de animais transgnicos.


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5.7.2 Animais Transgnicos como Biorreatores

Um grande interesse industrial e da rea da sade a produo de

protenas recombinantes, como enzimas, hormnios e fatores de crescimento. As

protenas recombinantes, como discutido no mdulo III, podem ser obtidas a partir

de sistemas de expresso procariotos ou eucariotos. Os procariotos so teis, pois

crescem facilmente; contudo, so limitados em suas habilidades quanto s

modificaes ps-traducionais. Este problema pode ser solucionado pela expresso

em sistemas eucariotos, como as leveduras.As desvantagens deste incluem a falta de identidade nas modificaes ps-

traducionais, afetando a imunogenicidade e a atividade da protena gerada. As

clulas mamferas so as hospedeiras que produzem com maior eficincia protenas

eucariotas. Apesar disso, sua produo no satisfatria em escala industrial,

exigindo um alto custo de manuteno. Uma opo para driblar estas desvantagens

o uso de animais transgnicos como biorreatores.

Animais transgnicos so considerados como biofbricas alternativas para a

produo de protenas. Este sistema apresenta vantagens relevantes sobre a cultura

de clulas. Em primeiro lugar, as protenas recombinantes so expressas em clulas

de mamferos e, por isso, as macromolculas so submetidas a todas as

modificaes ps-traducionais necessrias para que a protena tenha a conformao

e a atividade biolgica adequadas. Em segundo lugar, estes animais podem ser

considerados como fermentadores de larga escala. Aliado a este fato, a alta

produo da protena de interesse obtida a um baixo custo.

As vantagens do uso de animais transgnicos como biorreatores incluem um

aspecto relevante para a comercializao de produtos humanos. Alm de preservar

a conformao proteica, outro ponto inclui a reduo da contaminao do material

com algo patognico, como o HIV e o vrus da hepatite, se comparado aos produtos

isolados do sangue humano, por exemplo.

Alguns modelos j foram testados quanto possibilidade de produo em

animais transgnicos. Este sistema utiliza como ferramenta gentica a expresso


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regulada por promotores tecido-especfico. Um exemplo so as protenas expressas

no leite atravs da expresso dirigida na glndula mamria. Outro exemplo o fatorVIII, cuja deficincia est relacionada com o desenvolvimento da hemofilia. Esta

macromolcula pode ser obtida aps a purificao do sangue de humanos.

Entretanto, o custo envolvido neste processo extremamente alto, inviabilizando-o.

Outra desvantagem a possibilidade de contaminao do produto purificado por

outros compostos de origem humana.

Estes aspectos restringem o uso do fator VIII na profilaxia e terapia dos

pacientes afetados. Alm das vantagens j relatadas da produo de protenas deinteresse em animais transgnicos, neste caso especfico se destaca a alta

produo deste fator no leite de vacas, que foi de 35 a 200 vezes maior se

comparado ao obtido a partir do plasma sanguneo humano.

A expresso de protenas recombinantes em animais transgnicos tambm

tem sido obtida em outras espcies alvo, como as cabras. Um exemplo do uso deste

sistema a produo da antitrombina III em leite de cabras, processo que se

encontra na fase III de teste clnico. Este ltimo fato demonstra o potencial do uso de

animais transgnicos como biorreatores na produo de protenas de interesse.

As protenas podem ainda ser expressas em diferentes localizaes, alm

da glndula mamria. Outros fluidos, como espao extracelular, urina, plasma

seminal, leite e sangue, so alternativas potenciais. Estas opes so extremamente

vantajosas, uma vez que constituem fluidos de fcil acesso e que so produzidos

constantemente.

A escolha do tipo de animal transgnico a ser utilizado depende da

finalidade do estudo. Fatores como produo anual e com que velocidade ela

alcanada devem ser vistas para a escolha do sistema de animais transgnicos mais

apropriados. As regras seriam:

I. Gado, para produo em toneladas;

II. Caprinos e ovinos, para produo em centenas de kilogramas;

III. Coelhos, para produo em kilograma.


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Modelos de estudos em aves tambm vm sendo realizados. As vantagens

da produo em ovos em relao a outros sistemas so bem mais interessantes. Asprotenas expressas por esta espcie apresentam modificaes ps-traducionais

corretas, alm de ser um procedimento de baixo custo em relao cultura de

clulas e a outros animais transgnicos. Alm disso, considerando que a produo

derivada destes animais se d em um perodo relativamente rpido, os produtos so

obtidos em um menor tempo.

A produo de protenas recombinantes em aves ainda apresenta outras

peculiaridades que as tornam bons veculos de produo. Alguns dosoligossacardeos adicionados aos peptdeos das aves tm grandes similaridades

com o de humanos em relao a outros mamferos. Aves no produzem 1,3-Gal,

reduzindo risco potencial de uma resposta imunolgica adversa a protenas

farmacuticas produzidas no ovo. Aliado a este fato, a produo no ovo poderia ser

o mtodo de escolha para protenas txicas a mamferos. Ainda, o ovo um veculo

atrativo de recuperao das protenas, j que o seu contedo relativamente estril

e as protenas em ovos brancos so estveis, sugerindo que as protenas

teraputicas poderiam ter uma meia-vida maior neste produto de aves.

5.7.3 Animais Transgnicos e as Caractersticas de Interesse Econmico

A obteno de caractersticas de interesse, sem a necessidade de

intercruzamentos seguidos de outras selees para o melhoramento animal, pode

ser obtida com o auxlio da tecnologia do DNA recombinante. Este melhoramento

gentico visa introduzir de maneira rpida uma modificao da anatomia e fisiologia

do animal, propiciando o aparecimento de caractersticas como a maior produo de

carne e leite, melhora no desempenho reprodutivo, melhora na converso alimentar

e da composio da carcaa.

Diversas espcies de animais foram submetidas ao melhoramento gentico

por meio de tcnicas biotecnolgicas. Sunos transgnicos apresentaram maior taxa

de crescimento com uma qualidade de carne superior, o que se deve melhora na


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converso alimentar. Ovelhas transgnicas demonstraram maior produo de l,

sem a necessidade de suplementar a dieta com aminocidos. Salmes transgnicosapresentaram uma maior taxa de crescimento (de 30% a 60%) quando comparado

aos controles. Estes mesmos animais ainda esto sendo analisados quanto

possibilidade de criar uma gerao que expresse uma protena anticongelamento,

permitindo a sobrevivncia dessa espcie em baixas temperaturas. Estes exemplos

suportam a afirmao de que a biotecnologia uma ferramenta potencial para o

melhoramento gentico de animais em menor tempo.

5.7.4 Animais Transgnicos na Pesquisa Biomdica e de Xenotransplante

O objetivo da pesquisa biomdica que utiliza modelos animais conciliar

fenmeno biolgico entre as espcies, onde o conhecimento adquirido de uma

possa ser extrapolado para outra. Apesar dos principais modelos atualmente

utilizados (camundongos e cobaias, por exemplo), serem bem caracterizados e de

custo mais acessvel para tal finalidade, animais domsticos tambm vm sendo

testados para este fim. Isto se deve s similaridades anatmicas e fisiolgicas que

estas espcies apresentam em relao aos humanos. Isto justifica o crescimento de

pesquisas biomdicas para xenotransplantes com animais domsticos, o que tem

sido caracterizado em um aumento de 10-20% por ano.

Modelos animais transgnicos tm sido utilizados com a finalidade de

compreenso das causas, progresso, estgios e sintomas de uma determinada

doena. Acredita-se que eles desempenhem um papel fundamental na pesquisa

teraputica das patologias, constituindo fontes para novas formas de tratamento,

desenvolvimento de testes de diagnsticos, agentes teraputicos mais eficazes e

baratos, alm de teste para a terapia gnica.

Para isto, os animais a serem utilizados na pesquisa devem apresentar uma

alta similaridade a humanos. Este fato est baseado na observao de que os genes

humanos tm uma verso equivalente em outros animais, aumentando a

probabilidade de elucidar determinados processos e reaes do organismo, e,


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consequentemente, a patognese de enfermidades at a sua progresso e

resoluo.As reas de pesquisa nos estudos biomdicos incluem: fisiologia,

farmacologia, toxicologia, radiologia, cirurgia e transplantes de rgos,

traumatologia, patologia, embriologia, gastroenterologia, nefrologia e pediatria,

sendo intensivamente estudados na rea de cardiovascular (dietas com alto

colesterol apresentam leses arteroesclerticas histologicamente similares a de

humanos). Exemplos de patologias em que os animais transgnicos servem como

modelo o diabetes mellitus (at mesmo com o processo de catarata), ahipercolesterolemia (onde a elucidao do processo poderia prover um modelo para

terapia gnica) e o modelo de estudo da obesidade humana, j que um lcus

mapeado no cromossomo quatro dos sunos similar a outro presente no

cromossomo 1q humano.

Geralmente, os sunos so os animais de eleio para os estudos de

xenotransplantes. Isto se deve s grandes similaridades anatmicas e fisiolgicas

desta espcie em relao aos humanos. Por isso, muitas pesquisas tm sido

desenvolvidas na rea, como a utilidade e aplicao de rgos de sunos em

transplantes, alm de sua aplicao em cirurgias plsticas e reconstitutivas.

O principal objetivo dos xenotransplantes se refere possibilidade de

fornecimento ilimitado de rgos para uso em transplantes humanos. A espcie

suna e a sua miniatura (pequeno o suficiente na maturidade e facilmente

manipulado em condies de laboratrio, mantendo a similaridade anatmica e

fisiolgica quanto aos humanos) esto sendo muito estudadas. Um dos principais

estudos a respeito dos xenotransplantes inclui as pesquisas com as ilhotas

pancreticas. Contudo, os sunos apresentam um epitopo de galactose em suas

glicoprotenas e glicolipdeos, o qual reconhecido pelo sistema imunolgico

humano. Por isso, esta sequncia responsabilizada pelo fenmeno de rejeio

aguda dos xenotransplantes.

Alternativas para que o xenotransplante suno se torne efetivo incluem o

knockout ou a inativao da sequncia codificadora de um gene, como forma


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imunorreguladora para permitir a tolerncia aos rgos transplantados. Outra

consiste na gerao de sunos transgnicos contendo o gene da fucosiltransfease.Esta enzima est envolvida com a apresentao dos epitopos H na superfcie das

clulas, os quais so universalmente tolerados.

Argumentos contra o uso de animais para a pesquisa biomdica e de

xenotransplantes tm sido debatidos. O primeiro ponto consiste na presena de

retroviroses de animais que podem ser expressas aps o transplante. Para

solucionar este problema, o uso de RNAi (RNA de interferncia) para suprimir a

expresso de retrovrus sunos foi testado.Esta estratgia se baseia no anelamento ao RNAm complementar,

inativando a expresso do produto neste codificado. Esta soluo demonstrou ser

efetiva contra a expresso de retroviroses sunas. Alm da questo moral, muitas

inferncias a respeito da progresso e, principalmente, do tratamento a partir desses

modelos animais devem ser analisados com cautela. As respostas geradas diferem

entre as espcies, interferindo com a anlise e a associao dos fenmenos

observados. As aplicaes da biotecnologia na agropecuria vo alm de testes em

animais. Vrias plantas transgnicas tm sido obtidas, sendo que os alimentos

geneticamente modificados merecem ateno especial.

5.8 Alimentos Geneticamente Modificados

Os estudos iniciais sobre as aplicaes da biotecnologia nos produtos

agrcolas se iniciaram entre 1986 e 1995. A transferncia de tecnologia para esta

rea se deve demanda de melhorar a produo e a distribuio de gneros

alimentcios para a populao mundial crescente, ao mesmo tempo em que so

reduzidos os impactos ambientais.

A tecnologia dos transgnicos tem sido utilizada para produzir as

caractersticas preferidas pelo mercado, tendo uma grande aplicao tanto na

alimentao como no vesturio. Entre as mais pesquisadas, esto a tolerncia a

herbicidas, resistncia a insetos, qualidade do produto e a resistncia a vrus. No


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entanto, as caractersticas que visam aumentar a qualidade nutricional dos alimentos

vm se tornando progressivamente mais importante e devero prevalecer nasprximas geraes de produtos transgnicos.

Diversos exemplos de produtos agrcolas modificados pela tecnologia do

DNA recombinante esto em testes, sendo que alguns j foram disponibilizados ao

mercado. Dentre eles, podem ser utilizados como exemplo:

I. Plantas resistentes aos ataques virais, como o arroz transgnico

resistentes ao vrus Mottle Amarelo do arroz (RYMV), que devasta os arrozais

africanos. Outro exemplo a papaia resistente ao vrus Ringspot e que tem sidocomercializada e plantada no Hava desde 1996. Este exemplo demonstra a

eficincia da modificao gentica em vegetais, visando obter maior resistncia a

uma praga especfica;

II. Plantaes transgnicas persistentes aos insetos do Bacillus

thuringiensis e o algodo transgnico, o qual possui o gene de resistncia a

infestao por larvas. Um dos benefcios deste tipo de plantas a reduo

significativa no uso de inseticidas. Alm disso, a alta resistncia do algodo

transgnico aumenta consequentemente, a sua produo, beneficiando a indstria

de vesturios;

III. Alimentos de alto rendimento, como o trigo semiano. Esta planta

modificada mais baixa, mais forte e aumenta o rendimento da safra diretamente,

uma vez que se reduz o alongamento das clulas na parte vegetativa. Desta forma,

a planta desenvolve mais sua parte reprodutiva (comestvel);

IV. Transgnicos cujo cultivo possa ser feito em terras marginalizadas. Um

exemplo o tomate resistente ao excesso de sal. Este transgnico contm um gene

capaz de crescer e se desenvolver em um ambiente com excedente de sal nas

plantaes;

V. Benefcios nutricionais, como a maior produo de beta caroteno,

precursor da vitamina A, cuja deficincia nos animais causa cegueira. Outro caso o

arroz transgnico, que apresenta elevados nveis de ferro, de forma a combater a

anemia.


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A aplicao da tecnologia do DNA recombinante na gerao de alimentos

transgnicos no apenas um campo de pesquisa em desenvolvimento. Na dcadade 90, os EUA aprovaram dezenas de produtos geneticamente modificados e outra

grande quantidade apareceu tambm no mercado europeu. No Brasil, muitos

alimentos transgnicos importados j so comercializados e o pas planeja importar

trs milhes de toneladas de milho da Argentina e dos EUA, onde as lavouras

transgnicas so liberadas oficialmente.

Hoje h sementes manipuladas sendo cultivadas no mundo em uma rea de

30 milhes de hectares e seu mercado dever movimentar cerca de US$ 3 bilhes.Alm disso, o ritmo atual de liberao de Organismos Geneticamente Modificados

indica que uma centena de produtos geneticamente modificados nas prateleiras dos

supermercados chegar casa de milhares de pessoas em algumas dcadas.

Alimentos produzidos atravs de modificao gentica possuem diversas

vantagens que devem ser consideradas para a sua liberao. Eles podem ser mais

nutritivos e estveis quando armazenados. Aliado a este fato, podem, em princpio,

trazer benefcios, promovendo sade aos consumidores, seja em naes

industrializadas ou em desenvolvimento. Esforos organizados devem ser feitos

para investigar os efeitos potenciais no meio ambiente (positivos ou negativos) dos

vegetais transgnicos em suas aplicaes especficas. Eles devem ser avaliados

tomando-se como referncia os efeitos de tecnologias convencionais da agricultura,

que estejam atualmente em uso.

Assim como comentado no pargrafo anterior, uma das grandes

preocupaes da populao atual so os problemas ambientais. O crescimento

industrial e populacional desordenado utilizou fontes naturais como matria-prima,

sem considerar o seu tempo de reposio na natureza. Alm disso, a falta de

saneamento bsico e os acidentes industriais so frequentemente noticiados na

mdia como contaminantes severos do meio ambiente. Considerando estes fatos, a

tecnologia do DNA recombinante tambm pode ser aplicada para solucionar esta

questo. Um dos exemplos que vem recebendo pesquisas contnuas a

biorremediao.


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5.9 Biorremediao

Acidentes que resultam em despejo de substncias inadequadas ao

ambiente so responsveis pela contaminao dos solos, guas superficiais e

subterrneas e do ar. Diversos casos de contaminao ambiental esto sempre

sendo notcias de destaque nos meios de comunicao, como os que envolvem os

navios petroleiros e o descarte de dejetos industriais em rios e lagos. O isolamento

dos agentes contaminantes e o tratamento de recursos naturais representam perdas

financeiras significativas.A estimativa mundial de gastos com a despoluio ambiental gira em torno

de 25 a 30 bilhes de dlares, o que demonstra a necessidade de alternativas para

solucionar o problema. Entre elas, uma opo de baixo custo a biorremediao.

Consiste na eliminao de contaminantes ambientais com o uso de micro-

organismos vivos. As vantagens deste mtodo incluem o uso de agentes naturais,

que perturbam menos o ambiente e uma alternativa de baixo custo. Para a

implantao deste processo, preconiza-se que os contaminantes sejam susceptveis

ao ataque pelos micro-organismos e que os compostos produzidos por este

procedimento no devam ter efeitos adversos ao meio ambiente. medida que os

conhecimentos a este respeito aumentam, esta estratgia se torna bastante

promissora.

Inicialmente, um dos pontos que devem ser satisfeitos para a implantao da

biorremediao ter grandes conhecimentos sobre a gentica de cada micro-

organismo em particular. Isto permitir conhecer quais deles so capazes de

biotransformar um determinado contaminante ambiental. Dentro deste aspecto, a

biotecnologia pode ser aplicada, uma vez que o genoma sequenciado informa a

funo de um determinado gene. Outro aspecto envolve o conhecimento das

condies presentes nas quais o micro-organismo ser utilizado e se estas

favorecem a atividade microbiana. Entre os parmetros que devem ser observados

esto: teor de nutrientes, oxigenao, temperatura e pH.

A tecnologia do DNA recombinante ainda pode beneficiar a biorremediao


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de outra maneira. As bactrias de interesse adaptadas ao ambiente que se deseja

tratar so transformadas com um vetor de expresso. Neste estar clonado o geneque codifica o produto responsvel por solucionar um determinado problema

ambiental. Em outras palavras, a clonagem molecular pode fornecer uma

caracterstica til para a biorremediao, transformando um determinado micro-

organismo capaz de se proliferar nas condies impostas em ambientes

contaminados.

---------------- FIM DO MDULO IV ----------------


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Documents

BIOTECNOLOGIA_04