VALRIA GOMES BARBOSA

Comparao entre as tcnicas de reao em cadeia da polimerase

convencional e em tempo real na deteco do Mycobacterium leprae

nos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de Belo

Horizonte

Dissertao apresentada ao curso de Mestrado na

rea de Medicina e Biomedicina do Instituto de

Ensino e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte,

como requisito parcial obteno do ttulo de mestre.

Orientadora: Rachel Basques Caligiorne

Belo Horizonte

Novembro, 2011

Aos pacientes do ambulatrio de dermatologia da Santa Casa de BH.

AGRADECIMENTOS

Agradeo a DEUS por todos os instantes da minha vida.

Agradeo aos l de cima, que indiretamente me inturam e esto sempre me ensinando

atravs dos acontecimentos do cotidiano.

Agradeo minha me querida, Lygia de Vannio Gomes onde o estmulo e a dedicao so

infindos.

Agradeo razo Clara da minha vida, minha alegria ntima e infinita.

Agradeo ao Ronaldo Bartholo, meu companheiro amado de todos os momentos, pela

compreenso e amor sem medida, alm dos ensinamentos de informtica, imprescindvel

neste estudo.

Agradeo Dra Rachel Basques Caligiorne, minha orientadora, pela presena amiga,

confiana e constante nimo, mesmo quando estes me faltavam.

Agradeo Dra Laila A. Nahum por me ensinar com o maior carinho e pacincia a organizar

os estudos e reviso dos artigos.

Agradeo aos competentes jovens Jlia Caligiorne Santos e Johan Maurice pelas tradues e

dicas necessrias.

Agradeo Fabiana Rocha pelas dicas, reviso do artigo e preciosos ensinamentos no

laboratrio de biologia molecular e fundamental participao na dissertao.

Agradeo aos acadmicos da FCMMG: Guilherme Vieira Cunha e Adriano Guimares Franco

pelo auxlio na extrao do DNA.

Agradeo aos queridos residentes: Tatiana L. Drumond, Ldia F. Gontijo, Isabela V. Gomide,

Ndia C. Bavoso, Marcos S. A. Junior, Marcela Mattos, Amanda G. DellHorto e Denise B.

Carvalho pelo auxlio impagvel quanto ao preenchimento da maioria das fichas da pesquisa

com carinho e dedicao.

Agradeo Dra Dulcila Ferraz Rodrigues, minha grande amiga, pelas inmeras dicas.

Agradeo a todos os professores da ps-graduao da Santa Casa de BH, principalmente:

Carlos Maurcio F. Antunes, Evaldo Nascimento, Francisco da Chagas C.L e Silva, Geraldo

Magela G. Cruz, Giovanni Gazzinelli, Jos Augusto N. Machado, Ken Gollob, Marcus

Vincius Gomez, Rachel B. Caligiorne, Renata T. Simes e Valria C. Sandrim pelo estmulo

aquisio de conhecimentos. Eles, certamente, no fazem idia da importncia que tiveram

para mim.

Agradeo Patrcia Carneiro, minha colega do curso de mestrado pela boa vontade e

disponibilidade incondicional.

Agradeo s funcionrias Zlia, Shirley e Carla, sempre disponveis.

Agradeo s auxiliares de enfermagem do Centro de Especialidades Mdicas (CEM),

principalmente Adriana Marques pela boa vontade na coleta de sangue dos pacientes para a

pesquisa.

Agradeo aos tcnicos do laboratrio do CEM: Lvia Teodoro e Rodrigo Cndido pela coleta

dos raspados drmicos para baciloscopia.

Agradeo Dra Luciana Paione de Carvalho, dermatologista do hospital Eduardo de

Menezes, pela boa vontade e organizao do curso de baciloscopia fornecido aos tcnicos da

Santa Casa de BH.

Agradeo ao Dr. Marcelo Grossi Arajo, coordenador do ambulatrio de hansenase do HC -

UFMG, pela reviso do projeto e sbias observaes.

Agradeo ao coordenador da Dermatologia da Santa Casa de BH, Dr. Jackson Machado Pinto,

pela reviso do projeto deste estudo, pela confiana, carinho, disponibilidade e oportunidade

de trabalhar no ambulatrio de hansenase.

Agradeo Dra Maria Slvia Laborne Alves de Sousa pelo estmulo constante, quase dirio e

encaminhamento de pacientes.

Enfim, agradeo a todos os pesquisadores que foram citados nesta reviso, os quais, juntos

trabalham para o progresso da cincia e para a melhor qualidade de vida dos pacientes com

hansenase.

Uma profisso s adquire vida, quando a gente lhe empresta a nossa prpria vida

para o resto da vida.

(baseado em frase de Vincius de Moraes)

RESUMO

Na hansenase, assim como em muitas outras doenas, a clnica incontestavelmente

soberana. Entretanto, em muitos casos no conseguimos diagnosticar ou mesmo monitorar a

involuo da doena sem o auxlio de exames que ofeream maior segurana no

diagnstico. Atualmente, a biologia molecular vem proporcionando a ampliao dos

conhecimentos em torno da gentica e biologia do Mycobacterium leprae, os quais so

imprescindveis para o desenvolvimento de novas tcnicas que possam aprimorar o arsenal

de exames que auxiliam tanto no diagnstico quanto no controle de cura do paciente. Nesse

trabalho, foram avaliadas as tcnicas de reao em cadeia da polimerase (PCR)

convencional e em tempo real (qPCR) para a deteco do M. leprae em trs tipos de

amostras biolgicas: sangue total, bipsia e raspado drmico de 55 pacientes atendidos no

ambulatrio de hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte, onde h predominncia de

pacientes j tratados mantendo reaes hansnicas e pacientes em tratamento da hansenase.

De acordo com os resultados obtidos, foi possvel observar que, apesar da aplicao da PCR

no sangue total ser uma opo menos invasiva em relao biopsia de pele, a positividade

consideravelmente baixa, em torno de 46% para a PCR convencional e ultrapassou 60%

para a qPCR. Os resultados gerados pelas reaes da qPCR demonstraram uma positividade

de 62% das amostras de sangue, de 75% das amostras de bipsia e de 100% das amostras de

raspado drmico nos pacientes em tratamento. Ambas as tcnicas de PCR apresentaram

amplificaes em todas as amostras de sangue, bipsia de pele e raspado drmico,

demonstrando que a PCR pode ser uma importante ferramenta para auxiliar no diagnstico

da hansenase. Estes dados confirmam outros estudos, sugerindo que as padronizaes

laboratoriais para diagnstico molecular da hansenase devem se direcionar para a aplicao

da tcnica de qPCR.

Palavras-chave: Hansenase. Genmica comparativa. Alvos moleculares.

PCR. Mycobacterium leprae.

ABSTRACT

In leprosy, as in many other diseases, the clinic picture is incontestably supreme. However, in

many cases we cannot diagnose or monitor the regression of the disease without laboratory

tests, which provide an accurate diagnostic confidence. Currently, molecular biology has

provided the expansion of knowledge about genetics and biology of Mycobacterium leprae,

which is essential to the development of new techniques that can improve the arsenal of tests

that contribute to diagnosis and cure control of the patient. We aimed at evaluating the

techniques of conventional polymerase chain reaction (PCR) and real time (qPCR) for the

detection of M. leprae in three types of biological samples: whole blood, skin biopsy and skin

smears of 55 patients seen at the leprosy clinic of hospital da Santa Casa in Belo Horizonte,

where there is a predominance of patients still undergoing treatment as well as those who

have already been treated, but have kept leprosy reactions. According to the results obtained,

it was possible to observe that, despite PCR in whole blood being a less invasive option in

relation to skin biopsy, its positivity was low, around 46% for conventional PCR. The results

generated by qPCR showed a positivity of 62% in blood samples, 75% in biopsy samples and

100% in skin smears. Both PCR types presented amplifications in all samples of blood, skin

biopsies and skin smear. Therefore, PCR can be an important tool to study leprosy. Our data

confirm those from other studies suggesting that the standardization for the molecular

diagnosis of leprosy should be directed to the application of the qPCR technique.

Keywords: Leprosy. Comparative genomics. Molecular target. PCR.

Mycobacterium leprae.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Classificao (em percentual) do diagnstico clnico dos 55 pacientes atendidos

no ambulatrio de hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte de agosto de 2010 a agosto de

2011. 44

FIGURA 2 - Procedncia dos 55 pacientes atendidos no ambulatrio de hansenase da Santa

Casa de Belo Horizonte de agosto de 2010 a agosto de 2011. 45

FIGURA 3 - Procedncia dos 37 pacientes com hansenase ou aps o tratamento da mesma,

acompanhados na Santa Casa de Belo Horizonte de agosto de 2010 a agosto de 2011. 45

FIGURA 4 - Nvel de escolaridade dos 55 pacientes atendidos no ambulatrio de hansenase

da Santa Casa de Belo Horizonte de agosto de 2010 a agosto de 2011. 46

FIGURA 5 - Nvel de escolaridade dos 37 pacientes acompanhados no servio de

dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte com diagnstico de hansenase ou aps o

tratamento da mesma em 2010-2011. 46

FIGURA 6 - Faixa etria dos 55 pacientes atendidos no ambulatrio de hansenase da Santa

Casa de BH no perodo de agosto de 2010 a agosto de 2011. 47

FIGURA 7 - Faixa etria dos 37 pacientes com hansenase ou aps tratamento da mesma no

ambulatrio de dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte no perodo de agosto de 2010 a

agosto de 2011. 47

FIGURA 8 - Distribuio de doenas por sexo, com manifestaes cutneas ou no dos 55

pacientes atendidos no ambulatrio de hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte de agosto

de 2010 a agosto de 2011. 48

FIGURA 9 - Cicatriz da vacina BCG nos 37 pacientes atendidos no ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de BH que esto em tratamento para hansenase ou terminaram o

mesmo, examinados no perodo de agosto de 2010 a agosto de 2011. 48

FIGURA 10 - Classificao dos diagnsticos de 37 pacientes em tratamento de hansenase ou

j tratados, atendidos no ambulatrio de hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte no

perodo de agosto 2010 a agosto de 2011. 49

FIGURA 11 - Distribuio por diagnstico dos 37 pacientes com hansenase ou j tratados,

atendidos no ambulatrio de hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte no perodo de

agosto de 2010 a agosto de 2011. 49

FIGURA 12 - Classificao (Ridley-Jopling) dos pacientes em tratamento no ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de BH no perodo entre agosto 2010-2011. 50

FIGURA 13 - Distribuio (em percentual) das reaes hansnicas e seus subtipos nos 17

pacientes apresentando reaes atendidos no ambulatrio de hansenase da Santa Casa de

Belo Horizonte no perodo entre agosto de 2010 a agosto de 2011. 50

FIGURA 14 - Distribuio do diagnstico dos 9 pacientes atendidos no ambulatrio de

dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte que, aps o trmino do tratamento de

hansenase, apresentaram sequelas entre agosto de 2010 a agosto de 2011. 51

FIGURA 15 - Curva de Melt utilizando os iniciadores P2 P3 52

FIGURA 16 - Curva de Melt utilizando os iniciadores LP1 LP2 53

FIGURA 17- Curva de Melt utilizando os iniciadores para a -Globina 53

FIGURA 18- Curva de Melt utilizando os iniciadores F1-F2 53

FIGURA 19 - Resultados da PCR convencional e qPCR de acordo com o estado clnico e o

tipo de amostra biolgica dos 37 pacientes que estavam em tratamento ou j haviam sido

tratados para hansenase, atendidos na Santa Casa de Belo Horizonte entre agosto de 2010 a

agosto de 2011. 62

FIGURA 20- Representao dos resultados da amplificao para a PCR convencional de

acordo com os pares de iniciadores e o tipo de amostra biolgica dos 13 pacientes em

tratamento para hansenase na Santa Casa de Belo Horizonte no perodo entre agosto de 2010

a agosto de 2011. 64

FIGURA 21. Representao dos resultados da amplificao para a qPCR de acordo com os

pares de iniciadores e o tipo de amostra biolgica dos 13 pacientes em tratamento para

hansenase na Santa Casa de Belo Horizonte no perodo entre agosto de 2010 a agosto de

2011. 65

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Solues de uso para extrao de DNA 38

TABELA 2 Descrio dos iniciadores de DNA utilizados para a comparao das tcnicas

de PCR na deteco do Mycobacterium leprae em amostras de pacientes do servio de

dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte. 41

TABELA 3 - Relao dos pacientes atendidos no ambulatrio de dermatologia da Santa Casa

de Belo Horizonte de agosto de 2010 a agosto de 2011. 43

TABELA 4 - Resultado das tcnicas de PCR convencional e PCR em tempo real das 55

amostras de sangue, comparando os trs pares de iniciadores escolhidos. 54

TABELA 5 - Positividade das tcnicas de PCR convencional e PCR em tempo real em

amostras de bipsias de pele de 9 pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de

BH, comparando os trs pares de iniciadores escolhidos. 56

TABELA 6 - Positividade das tcnicas de PCR convencional e PCR em tempo real (qPCR)

em amostras de raspado drmico de 14 pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa

de BH, comparando os trs pares de iniciadores escolhidos. 56

TABELA 7 - Comparao dos resultados de PCR convencional no sangue, bipsia de pele e

raspado drmico dos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH, utilizando

o par de iniciadores F1- F2. 57

TABELA 8 - Comparao dos resultados de PCR convencional no sangue, bipsia de pele e

raspado drmico dos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH, utilizando

o par de iniciadores P2 P3. 57

TABELA 9 - Comparao dos resultados de PCR convencional no sangue, bipsia de pele e

raspado drmico dos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH, utilizando

o par de iniciadores LP1 - LP2. 57

TABELA 10 - Comparao dos resultados de PCR em tempo real no sangue, bipsia de pele

e raspado drmico, dos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH

utilizando o par de iniciadores F1 - F2. 58

TABELA 11 - Comparao dos resultados de PCR em tempo real no raspado drmico,

bipsia de pele e sangue, dos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH

utilizando o par de iniciadores P2 P3. 58

TABELA 12 - Comparao dos resultados de PCR em tempo real no raspado drmico,

bipsia de pele e sangue, dos pacientes do ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH

utilizando o par de iniciadores LP1 - LP2. 58

TABELA 13 - Positividade de PCR convencional no sangue dos pacientes do ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de BH. 60

TABELA 14 - Positividade da PCR convencional em bipsia de pele dos pacientes do

ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH. 60

TABELA 15 - Positividade de PCR convencional em raspado drmico dos pacientes do

ambulatrio de hansenase da Santa Casa de BH. 60

TABELA 16 - Positividade de qPCR no sangue dos 55 pacientes do ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte de acordo com os pares de iniciadores utilizados.

61

TABELA 17 - Positividade de qPCR nas bipsias de pele de pacientes do ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte de acordo com os pares de iniciadores utilizados.

61

TABELA 18 - Positividade de qPCR nos raspados drmicos de pacientes do ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte de acordo com os pares de iniciadores utilizados.

61

TABELA 19 - Iniciadores descritos na reviso bibliogrfca de PCR para deteco do

Mycobacterium leprae. 82

ABREVIATURAS

APCs: antigen presenting cell

BAAR: bacilo lcool cido resistente

BCG: bacilo de Calmette e Gurin

CCL11: chemokine (C-C motif) ligand 11

CCL24: chemokine (C-C motif) ligand 24

CD1b+DC: molcula do gene CD1B

CEM: centro de especialidades mdicas

DCs: dentritic cells

DNA: deoxyribonucleic acid

ENH: eritema nodoso hansnico ou reao tipo II

GM-CSF: granulocyte macrophage colony-stimulating factor

FOXP3: forkhead box P3

HLA DR: human leukocyte antigen DR

HLA-DRB1: human leukocyte antigen DR beta 1

hsp65: heat shock protein 65

iNOS: inducible nitric oxide synthase

IB: ndice baciloscpico

IFN-: interferon-gamma

LTA: lymphotoxin alpha

MHC: major histocompatibility complex

M. leprae: Mycobacterium leprae

MB: multibacilares

M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis

NOD2: nucleotide-binding oligomerization domain containing 2

OMS: Organizao Mundial de Sade

PB: paucibacilares

PCR: polymerase chain reaction

PGL-1: phenolic glycolipid -1

PQT poliquimioterapia

RIPK2: receptor-interacting protein (RIP) family of serine/threonine protein kinases

RNA: Ribonucleic acid

rpoBC: C terminal -subunit of RNA polymerase

http://en.wikipedia.org/wiki/Granulocyte_macrophage_colony-stimulating_factorhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=8767

RR: reao hansnica reversa ou tipo I

RT-PCR: Reversal Transcriptase PCR

SNPs: single nucleotide polymorphisms

TD-PCR: Touchdown PCR

TNF-: tumor necrosis factor-alpha

TNFSF15: tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 15

TLR: toll like receptor

VNTR: Variable number tandem repeat

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=9966http://www.google.com.br/url?sa=t&source=web&cd=1&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FVariable_number_tandem_repeat&ei=LBeSTtWqOubs0gGt8uQy&usg=AFQjCNHxLwzX5QpbqHTcSelmohzbnv6-FQ

SUMRIO

1 INTRODUO 17

2 REVISO BIBLIOGRFICA 18

2.1 A hansenase 18

2.2 Classificao e patologia da hansenase 18

2.3 Diagnstico da hansenase 20

2.4 Tratamento da hansenase 21

2.5 Aspectos imunolgicos da doena 22

2.6 Genes humanos relacionados susceptibilidade hansenase 25

2.7 O Mycobacterium leprae 26

2.8 O Genoma do M. leprae e Genmica comparativa 26

2.9 Deteco do M. leprae utilizando a biologia molecular 30

3 OBJETIVO GERAL 35

4 OBJETIVOS ESPECFICOS 35

5 METODOLOGIA 36

5.1 Amostras 36

5.2 Extrao de DNA 37

5.2.1 Sangue total 37

5.2.2 Bipsia de pele 39

5.2.3 Raspado drmico 40

5.3 Dosagem do DNA 40

5.4 Amplificao do material gentico pela tcnica PCR 40

5.4.1 Iniciadores 40

5.4.2 PCR convencional 41

5.4.3 PCR em tempo real 42

6 RESULTADOS 43

7 ANLISE ESTATSTICA 66

8 DISCUSSO 67

9 CONCLUSO 72

REFERNCIAS 73

APNDICES 81

ANEXO 98

17

1 INTRODUO

A hansenase causada pelo microrganismo Mycobacterium leprae, a nica espcie de

micobactria incapaz de crescer em meios de cultura artificiais, necessitando ser cultivado em

cultura de clulas 1,2,3,4

. Em 2001, foi publicada a seqncia do genoma deste bacilo,

coordenado por Stewart Cole do Instituto Pasteur na Frana 5. O genoma pequeno e

apresenta caractersticas peculiares e arcaicas.

A meta de controle da hansenase (plano 2011-2015) reduzir em 35% o nmero de casos

novos com grau 2 de incapacidade no mundo, tendo como base os 13.275 casos que foram

descritos no final de 2010 6

. A estratgia diminuir os diagnsticos realizados tardiamente 6.

O controle da hansenase s ser possvel atravs de uma identificao rpida de todos os

casos infecciosos, o que possibilitar o tratamento destes pacientes impedindo que eles sejam

potenciais transmissores da doena 7.

O tratamento consiste numa combinao de antimicrobianos com a finalidade de evitar o

desenvolvimento da resistncia droga 8. No entanto, a hansenase permanece como lder de

causa de neuropatia perifrica e incapacidades no mundo, apesar de extensos esforos para

reduzir a doena 6.

A reao em cadeia da polimerase (PCR) a tcnica que consegue detectar o menor nmero

de bacilos em relao a outros exames. capaz de detectar o DNA em pequena quantidade de

M. leprae no sangue circulante, a partir de 100 bacilos 9. Neste estudo foi avaliada a aplicao

da tcnica de PCR convencional e PCR em tempo real, utilizando trs tipos de amostras

biolgicas: sangue, raspado drmico e bipsia de leso cutnea de 55 pacientes atendidos no

ambulatrio de hansenase do servio de Dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte.

Participaram do estudo pacientes com reaes hansnicas; pacientes com dor neuroptica

residual; pacientes em tratamento para hansenase e indivduos que entraram nesta pesquisa

como controle negativo. A avaliao do desempenho de tcnicas no-invasivas, como a PCR

no sangue, aplicada ao diagnstico da hansenase deve ser considerada como um instrumento

til na estruturao de programas de controle da doena.

Os resultados obtidos destas pesquisas podero ajudar a reduzir a transmisso da doena e,

assim, tambm diminuir incapacidades, deformidades, medo e preconceito, que geram danos

fsicos, psquicos e sociais nos doentes, afetando ainda seus familiares. A PCR multiplex e a

PCR em tempo real quantitativa provavelmente contribuiro para o melhor monitoramento da

ao do M. leprae e sua resposta poliquimioterapia (PQT).

18

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 A hansenase

Hansenase uma doena milenar, causada pelo Mycobacterium leprae, com registros

encontrados dos anos 600 aC, na China, ndia e Egito. O aparecimento da doena na Amrica

ocorreu h 500 anos, durante o processo de colonizao. Portanto, o bacilo co-habita com o

homem h cerca de 2600 anos, permanecendo nos pases tropicais como o Brasil, em segundo

lugar mundial, perdendo em nmero de casos para a ndia, em seguida, desponta a frica 10

.

A prevalncia global, registrada em 130 pases e territrios no incio de 2011 foi de 192.246

casos, sendo que 228.474 casos novos foram registrados em 2010 6. H relatos da existncia

da doena em algumas espcies de primatas na frica (macacos mangabeys e chimpanzs

Cynomolgus), alm de tatus (Dasypus novemcinctus) localizados no Texas e Louisiana, nos

Estados Unidos 10

.

Foi o mdico Gerhard Armauer Hansen, pesquisador noruegus, que identificou em 1873 o

bacilo M. leprae como o causador da lepra, a primeira associao de um microrganismo a

uma doena humana e, ironicamente, este microrganismo at hoje no cultivvel em meios

artificiais 1,2

, apenas em meios de cultivo celular 3,4

.

Esta doena teve seu nome trocado para hansenase em homenagem ao seu descobridor. A

mudana do nome lepra para hansenase, proposta por Abro Rotberg no final da dcada de

1960, buscou afastar as fantasias e os preconceitos sobre a molstia, alm de favorecer a

educao para a sade 11

.

2.2 Classificao e patologia da hansenase

A hansenase manifesta-se nas formas indeterminada (I), a qual a forma inicial da

hansenase e pode evoluir para qualquer outra forma; tuberculide (T), dimorfa (D) e suas

subformas: dimorfa tuberculide (DT), dimorfa dimorfa (DD), dimorfa virchowiana (DV) e

virchowiana (V), de acordo com a resposta imunolgica do paciente frente ao bacilo 12

. Esta

classificao, baseada na descrita por RIDLEY-JOPLING em 1971, identifica em um

extremo, pacientes com alto grau de imunidade celular, como forma tuberculide (TT) e no

outro, pacientes sem resistncia aparente ao M. leprae, como forma virchowiana (VV) 13

. H

tambm uma forma neural pura, onde apenas os nervos so afetados, dificultando o

diagnstico, j que os exames convencionais so negativos. Jardim e colaboradores (2004)

mostraram fibrose em 73,6% das biopsias neurais realizadas14

.

19

Da maioria das pessoas expostas ao M. leprae, onde a hansenase endmica, poucas

desenvolvem a doena, sugerindo, que a minoria suscetvel doena, enquanto a maioria da

populao apresenta alguma resistncia de origem gentica 15,16,17

. Scollard e colaboradores

(2006) estimam que mais de 95% das pessoas so resistentes hansenase 7 .

A OMS recomenda a classificao segundo o nmero de leses, ou seja, paucibacilares (PB):

pacientes com at cinco leses e baciloscopia negativa e multibacilares (MB): pacientes com

mais de cinco leses e baciloscopia positiva, com a finalidade de simplificar a classificao

6,18. Contudo, a mais utilizada e completa a de Ridley-Jopling, j citada, cuja descrio e

correlao entre os dados clnicos e histopatolgicos, geralmente, caracterstica.

A hansenase indeterminada caracteriza-se por mcula hipocrmica, acompanhada ou no de

leve hipoestesia. Geralmente nica, mas, pode se manifestar em pequeno nmero de leses.

Os BAAR so ausentes na bipsia ou no raspado drmico. A histologia mostra infiltrado

inflamatrio celular inespecfico com tendncia a circundar os anexos cutneos 13

.

Os pacientes com hansenase tuberculide apresentam resposta imune celular especfica

exacerbada e baixos ttulos de anticorpos para o M. leprae. Os tecidos infectados apresentam

pouca quantidade de bacilos e caracteriza-se por numerosos linfcitos e granulomas de clulas

epiteliides envolvendo nervos 19

. A evoluo da doena varivel, depende da resposta do

hospedeiro e, pode acometer os nervos assimetricamente. H diminuio ou ausncia de plos

nas reas afetadas. Por outro lado, os pacientes com hansenase virchowiana apresentam altos

ttulos de anticorpos e resposta celular especfica baixa ou ausente frente aos antgenos de M.

leprae 7. Observa-se ento, uma grande quantidade de bacilos nos macrfagos da derme e nas

clulas de Schwann dos nervos perifricos, sendo separados da epiderme por uma camada de

colgeno normal. O infiltrado causa a destruio de anexos cutneos e se extende at o

subcutneo. Macrfagos com citoplasma com aspecto espumoso, devido ao contedo lipdico,

so chamados de clulas de Virchow19

. a forma mais infecciosa da hansenase. A evoluo

deste subtipo progressiva, com placas eritematosas infiltradas localizadas ou difusas e

ndulos denominados hansenomas. A neuropatia se desenvolve mais lentamente que na forma

tuberculide, decorrente do processo inflamatrio crnico e fibrose, resultando em anestesia e

paralisia dos msculos intrnsecos e extensores das mos e ps. Conseqentemente, o risco de

traumatismos recorrentes maior, gerando reabsoro ssea e dos dedos 7. A doena acomete

principalmente o sistema nervoso perifrico e a pele, podendo gerar deformidades e

incapacidades associadas a um estigma antigo da doena. Acometimento de olhos, nariz,

boca, laringe, faringe, rins, testculos, articulaes, msculos, ossos, endotlio dos vasos e

linfonodos so descritos 13

.

20

A forma dimorfa caracterizada por mculas ou placas eritematosas ou cor de cobre,

anulares, foveolares (leses em queijo suo), com bordas internas ntidas. Apresentam

instabilidade imunolgica, ou seja, pode se movimentar em ambas as direes do espectro

dimorfo, dependendo da evoluo do quadro clnico e imunolgico. Nesta forma h tendncia

para aparecimento de reaes hansnicas e deformidades resultantes. BAAR so frequentes na

DV e escassos ou ausentes na DT 13

. Histologicamente apresenta caractersticas das duas

formas, ou seja, clulas epiteliides e clulas xantomatosas. A proporo varivel,

dependendo da forma clnica19

. Em todas as trs subformas h uma zona subepidrmica

livre13

. O exame histolgico muito importante como auxiliar da clnica na classificao de

Ridley- Jopling da hansenase.

O contgio pode ocorrer, principalmente, pela inalao de aerossis infecciosos de pacientes

MB no tratados ou tratados de forma incompleta ou irregular. Aps o contgio, o perodo de

incubao pode durar, em mdia, de dois a sete anos. Pode-se encontrar o M. leprae em

secrees nasais e saliva de pacientes com hansenase dimorfa ou virchowiana 13,20

. Contudo,

no se sabe com certeza, todas as maneiras de contgio ou qual o tempo de incubao, de

forma precisa. Patrocnio e colaboradores (2005) identificaram a presena do bacilo em

10,1% dos contatos, sugerindo o acompanhamento dos mesmos, j que podem evoluir com

infeco subclnica 20

.

2.3 Diagnstico da hansenase

O diagnstico se faz pela anamnese, exame dermatoneurolgico, testes de sensibilidade,

pesquisa de BAAR (bacilo lcool-cido resistentes) que podem ser encontrados isoladamente

ou em feixes paralelos, ou ainda em massas globulares denominadas globias, em raspados

drmicos e biopsia de pele ou nervo 13,21,22

. Testes de histamina e pilocarpina podem ser

complementares 20,12,23

. Os raspados da pele so corados em lmina pela tcnica de Ziehl-

Nielsen, que cora as micobactrias. O teste diagnstico ideal deveria ser simples, identificar

todos os casos (100% de sensibilidade) e no s apresentar 100% de especificidade

(reconhecer as pessoas que no tm a doena). Portanto, ainda no h um mtodo isolado que

podemos considerar como padro ouro para esta doena 3,20

.

O ndice baciloscpico (IB) varia de zero a seis, onde zero significa ausncia de bacilos em

100 campos examinados, 1 a menor quantidade de bacilos (1 a10 em 100 campos) e 6 a

maior (1000 ou mais bacilos em cada campo examinado). Com este conhecimento de quatro

stios do pacientes, calcula-se o IB, atravs da mdia aritmtica deles. O IB cai vagarosamente

com o tratamento 13

. A deteco limite na microscopia de 104

bacilosg de tecido 22,24

. A

21

bipsia da pele ou de um nervo espessado revela um quadro histolgico tpico, quando se

acha os bacilos, portanto, muitas vezes importante na classificao e definio do diagnstico.

Os testes lepromnicos (Mitsuda) auxiliam na pesquisa, mas no no diagnstico, no so mais

utilizados. Apresentam-se positivos na forma tuberculide e negativos na virchowiana.

O teste ELISA para detectar anticorpos anti PGL-1 (glicolipdeo fenlico-1) positivo nas

formas multibacilares (MB), mas, tambm mostra positividade nos indivduos saudveis em

regies endmicas, sugerindo a ocorrncia de infeco subclnica 25

. O PGL-1 especfico

deste bacilo e constitui cerca de 2% da massa total bacteriana e pode ser encontrado nos

tecidos, no sangue circulante e na urina de doentes multibacilares. Este teste vem sendo

utilizado em todo o mundo como mtodo auxiliar de classificao, cujo resultado

relacionado carga bacilar, ou seja, quanto maior a exposio bacilar, maior a positividade

do teste que varia de 1+ (carga bacilar baixa) a 4+ (carga bacilar alta) 26

. Portanto, possui

limitado valor para hansenase PB, pois esta categoria possui IB baixo ou ausente. No entanto,

a deteco de anticorpos IgM contra PGL-1 pode ser til para identificar contatos sem sinais

clnicos da doena, auxiliando em programas de controle 27

. Ainda neste estudo, os autores

estimam que 70% dos pacientes com hansenase podem ser diagnosticados pelos sinais

clnicos e diminuio da sensibilidade. Entretanto, 30%, inclusive muitos MB no apresentam

estes sinais 27

.

2.4 Tratamento da hansenase

No tratamento da hansenase, a resistncia sulfona ou rifampicina conhecida h alguns

anos. Por este motivo, o tratamento consiste numa combinao de antimicrobianos 8.

Atualmente, no Brasil, de acordo com as normas do Ministrio da Sade, o tratamento

consiste na PQT (rifampicina, clofazimina e dapsona) para MB por um ano e, rifampicina e

dapsona para PB por seis meses. Alm disso, na Portaria liberada pelo Ministrio da Sade

(07-10-2010), h mais informaes, inclusive sobre esquemas alternativos para resistncia

medicamentosa 18

.

Para o tratamento das reaes hansnicas, que sero detalhadas no prximo tpico, j que

podem tambm surgir aps o tratamento da hansenase, utiliza-se prednisona ou similar

(reaes tipo I e II) e talidomida (tipo II). Mesmo assim, vrios pacientes evoluem com efeitos

colaterais destes medicamentos, muitas vezes, irreversveis, j que os tomam por muitos anos,

pois, nem sempre as reaes hansnicas so controlveis facilmente.

Para os contatos intradomiciliares, preconiza-se a vacina com BCG, com a finalidade de

proporcionar maior proteo. Segundo Scollard e colaboradores (2006), a tentativa de usar

22

vacinas com o Mycobacterium w, juntamente com a PQT nos pacientes com hansenase,

induziu o aparecimento de reaes hansnicas tipo1 7. No h ainda uma vacina especfica

eficaz.

difcil conduzir testes de resistncia a droga em perodos curtos utilizando amostras clnicas

devido ao fato do M. leprae no ser cultivvel em meios artificiais. Por isso, o M. leprae deve

ser inoculado em patas de cobaias para obter os padres de suscetibilidade a droga 8,22

. Os trs

genes associados a mutaes relacionadas resistncia das drogas so: folP, rpoB e gyrA, os

quais so responsveis pela resistncia a dapsona, rifampicina e ofloxacin, respectivamente 8.

A maioria das mutaes relacionadas com resistncia rifampicina pelo M. leprae envolvem

o cdon 425 do gene rpoB 7,28

.

2.5 Aspectos imunolgicos da doena

Os pacientes podem desenvolver reaes hansnicas antes, durante ou depois do tratamento.

Estas reaes podem ser do tipo I ou reversa (RR), que consiste em piora das leses

anteriores, edema das mesmas e/ou de mos e ps e neurite. O tipo II, cujo quadro clnico

mais freqente o eritema nodoso hansnico (ENH), pode ulcerar, gerando lceras profundas,

ou seja, eritema nodoso necrosante. H variaes mais graves e raras, muitas vezes evoluindo

para bito, ainda no bem classificadas, provavelmente, devido raridade com que ocorrem.

Estas variaes so representadas pelo fenmeno de Lcio, o qual surge na grande maioria

dos poucos casos descritos, antes do tratamento. A histologia consiste em vasculite e globias.

As reaes hansnicas podem se manifestar mesmo sem a presena do bacilo vivo. A RR

geralmente ocorre em pacientes que possuem a forma dimorfa (D), que se divide nas

subformas: (DT), (DD) e (DV) 29

. Na maioria dos casos, a RR se manifesta com incio

insidioso. Representa a resposta Th1, com aumento de CD4+, gerando aumento de interleucina

2, 12, IFN- e TNF- 25,30,31,32

. A presena de clulas epiteliides e clulas gigantes so

observadas no local, produzindo TNF- e IFN-, os quais atuam como potentes bactericidas,

atravs de metablitos de oxignio e derivados nitrogenados, resultando em formao de

granulomas. A presena de grandes quantidades de IFN- e TNF- no local exercem um

efeito sinrgico na transcrio de xido ntrico sintase (iNOS) nos macrfagos, os quais

ativam o xido ntrico, resultando na destruio do bacilo e na degradao do DNA 25

. Os MB

desenvolvem, em muitas ocasies, reaes tipo II, ou seja, eritema nodoso hansnico (ENH).

Elas so caracterizadas por incio rpido, repercusso sistmica como mal estar, febre e dor

nos ndulos eritematosos, podendo evoluir com orquite, irite, episclerite, vasculite, neurite, ou

23

seja, outras consequncias de resposta imunolgica com padro Th2 de produo de citocinas:

GM-CSF e interleucinas 4, 5, 6, 10 e 13 12,29,31,32

.

Forkhead box P3 (FoxP3) um fator de transcrio associado s clulas T regulatrias

funcionais (T-regs). As clulas CD4+ CD25 FoxP3, ou seja, um subtipo de T-regs tm sido

descritas nas infeces crnicas . As T-regs podem contribuir para a manuteno das clulas

de memria, consequentemente, para uma resposta anti patgeno efetiva na hansenase 29

. A

IL-2 responsvel pela manuteno das T-regs 29

, as quais podem ser induzidas por TGF- 33

.

A induo de tolerncia imunolgica ao M. leprae em pacientes com hansenase na forma VV

atua como uma forma de impedir que o hospedeiro destrua os microrganismos 33

.

Attia e colaboradores (2010) demonstraram que a expresso de FoxP3, est diminuda nos

pacientes VV e elevada nos pacientes com ENH e nos pacientes classificados como TT.

Contudo, apesar do FoxP3 estar aumentado nos pacientes com ENH, a funo das t-regs de

uma forma global se encontra diminuda nos VV e ENH 29

.

Clulas da linhagem monoctica podem ser ativadas por vrios receptores e citocinas para

diferenciarem em clulas ativadas do sistema imune inato incluindo clulas dendrticas (DCs),

as quais so clulas apresentadoras de antgeno (APCs), estas tm funo crucial na regulao

da resposta imune inata e no incio da resposta imune adquirida 34

. M. leprae descrito como

um fraco ativador de macrfagos e DCs in vitro em estudos usando clulas sanguneas de

doadores humanos saudveis 35

.

Molculas de HLA-DR apresentam os antgenos de peptdeos de M. leprae para as clulas T

CD4+, as quais se tornam ativadas, estimulando a resposta Th1, havendo produo de IFN-,

resultando na maturao de macrfagos e formao de molculas antimicobacterianas. Na

falncia deste processo pensa-se na suscetibilidade hansenase e outras micobactrias.

Embora o HLA-DR seja bem conhecido como iniciador do processo, a theoretical biologic

network gerada pelo uso de unsupervised Ingenuity Pathways Analysis sugere que o IFN-

possa ser regulado pelos genes: NOD2, RIPK2 e TNFSF15. Esta hiptese estaria em

conformidade com o fato de pessoas com o IFN- mutante serem suscetveis infeco

micobacteriana 36

.

Anlises genticas identificaram associaes entre polimorfismos especficos em genes TLR e

suscetibilidade a hansenase 35

. Sinsimer e colaboradores (2010) mostraram uma variante

comum no TLR1 associada com respostas alteradas de citocinas nos moncitos do sangue

perifrico ao M. leprae e com proteo contra reao reversa, uma complicao imunolgica

aguda j descrita anteriormente, mais comum na forma dimorfa da hansenase e seus subtipos

35.

24

Sieling e colaboradores (2008) obtiveram clones de clulas T CD4+ provenientes de biopsias e

usados para identificar antgenos de M. leprae nativos. Eles utilizaram clones de clulas T

CD4+

MHC II de uma leso de hansenase e sangue do paciente para identificar os antgenos

reconhecidos pela resposta do hospedeiro e descobriram que o antgeno pertencia a uma

classe de protenas (lipoglicoprotenas), descrita apenas em Mycobacterium spp, cuja funo

ativar a resposta imune inata e adquirida atravs do TLR2 37

.

Polimorfismos no locus TLR2 esto muito associados com RR e suscetibilidade hansenase.

Os autores identificaram polimorfismos nos TLR4 associados com suscetibilidade

hansenase e mostraram que o M. leprae inibe a produo de IL1- e IL6 mediadas por TLR4

nos moncitos. Os autores destacaram a importncia da ao de polimorfismos nos TLRs

induzidos pela resposta imune inata desencadear a progresso da doena com o M. leprae e os

estados reacionais que podem ocorrer nos pacientes com hansenase 35

.

A ativao dos TLRs especficos desencadeia a rpida diferenciao dos moncitos em duas

populaes de clulas CD1b+DC que so potentes APCs e macrfagos CD209

+ que so muito

fagocticos. CD1b+DC acumulam-se no stio de infeco e se correlacionam com resistncia

contra o patgeno na hansenase 34

.

Montoya e colaboradores (2009) observaram que a via fagoctica dos macrfagos era induzida

pela interleucina 10, lectina tipo C CD209 e receptores scavenger, resultando em fagocitose

da micobactria e lipoprotenas de baixa densidade oxidadas, comuns nas formas

multibacilares. Observaram tambm, a expresso da via antimicrobiana dependente da

vitamina D e CD209 induzida pela interleucina 15, apesar desta ser menos fagoctica nas

formas auto limitadas da hansenase 38

.

Teles e colaboradores (2010) investigaram a interao do M. leprae com as clulas de

Schwann de pessoas com hansenase em biopsias de nervo perifrico e acharam a expresso

da lectina tipo-C CD209 diretamente proporcional concentrao de interleucina 4, a qual

est aumentada nos pacientes multibacilares. A CD209 no induzida na reposta Th1,

segundo os autores 39

.

Mendona e colaboradores (2010) dosaram no plasma de 33 pacientes multibacilares, as

quimiocinas CCL11 e CCL24, as quais estavam aumentadas antes do tratamento, sendo que a

CCL11 permaneceu elevada durante e aps o tratamento com a PQT (poliquimioterapia)

convencional e a CCL24 diminuiu com a PQT. Sugerindo a possibilidade de CCL24 ser um

biomarcador para a forma multibacilar da hansenase 40

.

25

Santos e colaboradores (2010) encontraram, em suas pesquisas, a expresso de B7 precedendo

os episdios reacionais nas formas multibacilares, sugerindo que esta molcula, B7, seja um

marcador da imunidade celular nos estados reacionais da hansenase41

.

2.6 Genes humanos relacionados susceptibilidade hansenase

No genoma humano, h vrias regies cromossmicas onde polimorfismos existentes so

relacionados com suscetibilidade hansenase e suas formas pauci e multibacilares 7,42

.

Schurr e colaboradores (2006) identificaram variaes genticas na regio promotora dos

genes PARK2 e PACRG como maior fator de risco de suscetibilidade hansenase.

Especificamente, PARK2, a causa do incio precoce da doena de Parkinson, uma E3 ligase,

a qual provavelmente est envolvida no controle da protelise, na resposta antioxidante

celular e na regulao da resposta imune inata. Alm disso, numerosas E3 ligases, foram

descritas como importantes reguladoras da imunidade, segundo os autores 43

.

Alcais e colaboradores (2007) demonstraram que a baixa produo de linfotoxina alfa

(LTA+80) um fator de suscetibilidade para hansenase em jovens menores de 25 anos de

idade 44

.

Zhang e colaboradores (2009) realizaram um estudo baseando-se na associao genowide.

Utilizaram 706 pacientes com hansenase e 1225 controles, todos eram chineses de uma

regio especfica. Foram encontrados 93 SNPs com fortes associaes com suscetibilidade

doena, tambm com a regio do MHC no cromossoma 6p21 e associaes adicionais com o

cromosomo 16q12 e cromosomo 13q14. A associao com o locus HLA-BHLA-C foi

significativa. Variantes dos genes HLA: HLA-DRB1, principalmente, tm sido associadas com

hansenase 36,44.

Os autores tambm observaram uma associao da hansenase dentro da regio do MHC

(SNP rs602875, prximo ao HLA-DRB1), entretanto, eles no observaram associao da

doena com loci de risco descrito em outros estudos prvios: PARK2PACRG, LTA e um

locus no cromosomo 10p13. A associao da doena com o locus HLA-DRDQ observado

neste estudo est em conformidade com a associao verificada previamente entre hansenase

e HLA-DRB1 e o fato da existncia de um grande desequilbrio de ligao na regio do MHC

36.

Hansenase e doena de Crohn apresentam em comum, caractersticas imunolgicas,

incluindo resposta Th1 com formao de granulomas. Alm da infeco pelo M. leprae ser

descrita como fator de risco para doena de Crohn, os autores afirmam tambm que variantes

dos genes no NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain containing 2) mediados por

26

vias de sinalizao (as quais regulam a resposta imune inata) so associados com

suscetibilidade a infeco com M. leprae 36

.

Wong e colaboradores (2010) observaram associaes entre a hansenase e SNPs no C13orf31

(gene encoding chromosome 13 open reading frame 31) e CCDC122 (gene encoding coiled-

coil domain containing 122). Estes autores no observaram associaes entre a doena e os

outros quatro genes no MHC relacionados via de NOD2 (NOD2; RIPK2 (O gene que

codifica o receptor que interage serinethreonine kinase 2); TNFSF15 (O gene que codifica o

fator de necrose tumoral superfamily member 15), e LRRK2 (O gene que codifica repeties

de Kinase 2 ricas em leucina). Uma anlise de 27 SNPs adicionais no NOD2 em um estudo de

coorte em New Delhi forneceu recursos para a afirmao da ausncia de uma associao

consistente neste locus. Os autores enfatizaram que estes resultados indicam heterogeneidade

entre as populaes e sugeriram que estudos funcionais futuros devam focalizar em

populaes, nas quais, associaes genticas relevantes possam ocorrer 45

.

2.7 O Mycobacterium leprae

O M. leprae um parasita intracelular, possui reduzida capacidade de sobreviver a

temperaturas acima de 33C, carecendo de resposta ao choque trmico 2,46

. um bacilo lcool

cido resistente, ou seja, cora-se em vermelho pela fucsina e no se descolora pelo lcool e

cidos. um microrganismo aerbico, rico em (G-C) (6270%). Contm cido miclico na

sua parede celular e possui forma de bastonete 2,12,47

. O crescimento lento deste patgeno

dentro das clulas do hospedeiro comum a outros membros do gnero. O tempo de

multiplicao do bacilo de 11 a 16 dias e apenas 1 % parece permanecer vivel no meio

ambiente por at sete dias 12

. a nica espcie de micobactria que acomete nervos

perifricos, especificamente as clulas de Schwann, com possibilidade de ocasionar

neuropatia sensitiva e motora 46

.

2.8 O Genoma do M. leprae e Genmica comparativa

O tamanho do genoma, obtido por seqenciamento do DNA, publicado em 2001, de

3.268.203 pares de bases 2,5.

Sabe-se que este genoma possui em torno de 1133 pseudogenes,

quantidade relativamente grande no s em comparao com as demais espcies, como a

maior dos genomas j publicados e apresenta apenas 50 % dos genes expressando protenas

7,48,49. A sua mnima quantidade de genes ativos (1614) necessria para a adaptao do

bacilo ao hospedeiro, sem perder a sua patogenicidade caracterstica. Este processo de

27

estagnao na sua evoluo indica que o microrganismo tentou rearranjos e delees no

genoma e sofreu um processo de adaptao muito estvel no hospedeiro humano 10, 49

.

Dai e colaboradores (2011) conduziram uma comparao de multiple-genome de um total

de 27 genomas sequenciados na sub order de Corynebacterineae, sendo 18 provenientes do

gnero Mycobacterium; sete do gnero Corynebacterium; um de Nocardia e um do gnero

Rhodococcus, com a finalidade de localizar loci teis para identificao de espcies e para

potencializar o conhecimento da estrutura populacional e variabilidade gentica do gnero

Mycobacterium. Um sistema de anlise da sequncia de vrios locus incluindo os loci rpoBC,

dnaK, e hsp65 loci uma importante ferramenta para a identificao precisa das espcies de

micobactrias. As rvores filogenticas geradas destes loci mostram topologias semelhantes

50.

Entre as 130 espcies que constituem o gnero Mycobacterium, a maioria so saprbios do

meio ambiente. Poucas so patgenos importantes para os humanos 51

. Os mais prejudiciais

para os seres humanos so M. tuberculosis e M. leprae, contudo, outros como M. avium, M.

ulcerans, M. marinum, M. kansasii (crescimento lento) e M. smegmatis, M. fortuitum e M.

chelonae/abscessus (crescimento rpido) so tambm importantes 52

.

Muro e colaboradores (2010) comentam que o genoma do M. leprae pode ser comparado com

o genoma do M. tuberculosis, o qual possui 3.959 genes que codificam protenas e apenas seis

pseudogenes. Estes autores estudaram a posio dos pseudogenes nos operons do M. leprae e

seus ortlogos no M. tuberculosis. Estes operons foram primeiramente descritos no estudo de

Jacob e colaboradores no incio da dcada de 1960. Uma anlise comparativa entre M. leprae

e M. tuberculosis sugere que a maioria dos pseudogenes no M. leprae so degenerados aps a

inativao geneporgene. Os resultados dos autores indicam que os genes dispensveis

possuem uma tendncia de se localizar na direo 3 (downstream), final do operon 49

.

A maioria dos genes essenciais no M. tuberculosis so conservados no M. leprae e a maioria

dos pseudogenes no M. leprae correspondem aos genes M. tuberculosis no essenciais, como

ocorre no M. tuberculosis no essencial impA, o qual um pseudogene no M. leprae. No

entanto, h duas excees. Uma delas : pca (pyruvate carboxylase), essencial para o M.

tuberculosis, um pseudogene no M. leprae. Como uma tendncia, pseudogenes do M. leprae

so observados na regio do 3- final dos operons. Contudo, observa-se operons onde o

primeiro elemento um pseudogene 49

. Esta a segunda exceo.

Marri e colaboradores (2006) abordam os genes presentes em algumas vias metablicas e

comparam estes genes nos cinco genomas sequenciados de Mycobacterium, pertencentes a

quatro espcies (M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae e Mycobacterium avium ssp.

28

paratuberculosis), estes apresentaram seus dados sequenciados e outros 14 genomas

micobacterianos esto em vrios estgios de completude 53

.

Uma anlise comparativa dos produtos gnicos das vias metablicas que revelaram maiores

diferenas entre as espcies so os produtos gnicos constituintes da parede celular e as

famlias dos genes que codificam as protenas acidic glycine-rich (PE/PPE/PGRS). O M.

leprae apresenta genes mnimos para a maioria das famlias de genes, enquanto o M. avium

ssp. paratuberculosis adquiriu alguns dos fatores de virulncia por transferncia lateral de

genes 53

.

Quanto ao metabolismo lipdico, as micobactrias apresentam inmeros genes envolvidos,

entretanto, no M. leprae, a maioria reduzida a pseudogenes, enquanto o M. avium apresenta

uma alta redundncia de genes comparados ao M. tuberculosis. Como a parede celular a

interface entre o microrganismo e o hospedeiro, as diferenas na constituio da mesma

podem interferir na variao da patognese entre as espcies. H aproximadamente 65 genes

envolvidos na biossntese e modificao dos cidos graxos e cido miclico em todas as

espcies 53

.

As protenas da membrana (envelope celular) so importantes na diferenciao da virulncia

entre as espcies. Os genes associados biossntese de aminocidos so conservados na

maioria das espcies das micobactrias, destacando suas funes como genes essenciais,

exceto no M. leprae, onde h perda de alguns destes genes 53

.

Os genes envolvidos na biossntese de tiamina, piridoxina, pantotenato e cido flico so

muito conservados em todas as espcies. M. tuberculosis e M. bovis possuem alguns genes

duplicados enquanto M. avium ssp. paratuberculosis e M. leprae requisitam poucos genes

para o metabolismo, possuem portanto, um processo racionalizado 53

.

Ribeiro-Guimares e colaboradores (2007) utilizaram a bioinformtica para comparar os

genes presentes no genoma do M. leprae, M. tuberculosis, M. bovis e M. avium

paratuberculosis que codificam a protease. Eles destacaram a grande conservao dos genes

que codificam as proteases no M. leprae quando comparada com outras famlias de genes. O

core de genes de 38 proteases bem conservados encontrados nas quatro espcies citadas foi

descrito. Enfatizaram que este core proveniente das proteases so provavelmente essenciais

para a sobrevida no hospedeiro e surgimento da doena, podendo constituir novos alvos para

o desenvolvimento de drogas para o controle de doenas bacterianas 54,55

.

Todos os genomas possuem genes pertencentes a antgenos do complexo 85. O M. leprae no

apresenta a maioria dos genes envolvidos na duplicao e reparo do DNA ao longo do operon

recBCD. Ele apresenta apenas quatro genes funcionais (SigA, SigB, SigC e SigE). A perda de

29

nitrato redutase, nitrito redutase, fumarato redutase, urease e NADH oxidase pelo operon do

M. leprae contribui para o crescimento reduzido em condies anaerbias e microaerfilas 53

.

Young e colaboradores (2001) enfatizaram que mutaes que ocorrem numa populao

assexuada raramente so reversveis, proporcionando uma induo progressiva de mutaes

cada vez mais deletrias. A deleo da maioria do operon da NADH oxidase provavelmente

desencadeia prejuzo importante na habilidade do M. leprae gerar energia. A pyruvate

carboxylase no M. tuberculosis e M. bovis substituda pela phosphoenol pyruvate

carboxylase (PEPC) no M. leprae e M. avium ssp. paratuberculosis 56

.

Verkhedkar e colaboradores (2007) desenvolveram uma rede de vias metablicas do M.

leprae e do M. tuberculosis. Eles estudaram a topologia organizacional da rede metablica

construda, utilizando conceitos da teoria grfica espectral e mostraram que este mtodo til

para identificar subgrupos de reaes no sistema por computao numrica. No metaboloma

do M. leprae consta poucas reaes comparadas s do M. tuberculosis. Entretanto, a topologia

estrutural conservada entre as duas micobactrias, indicando que a grande escala

downsizing metaboloma do M. leprae no alterou a estrutura global central do sistema 57

.

Zakham e colaboradores (2011) expuseram uma anlise genmica comparativa de 14

genomas de micobactrias. Uma rvore filogentica foi construda a partir do gene 16S rRNA

para M. tuberculosis e no tuberculosis a fim de entender aspectos evolutivos destas espcies

58. Singh e colaboradores (2011) abordaram a genmica comparativa de quatro cepas

diferentes do M. leprae e revelaram grande conservao do genoma (99,995% de identidade)

com 215 stios polimrficos descobertos, principalmente single nucleotide polymorphisms

(SNPs) e novos pseudogenes. Mapeando estes polimorfismos em um grande painel de cepas,

verificou-se 16 subtipos de SNPs, os quais mostraram fortes associaes geogrficas59

.

Gillis e colaboradores (2009) investigaram VNTRs como marcadores moleculares para

distinguir as cepas do M. leprae 60

. As 475 VNTR de gentipos de cepas de M. leprae,

originalmente foram descritos em seis pases onde a hansenase endmica. O grau de

variao gentica do M. leprae extremamente baixo 61

. Matsuoka e colaboradores (2009)

descreveram os ltimos avanos na epidemiologia molecular da hansenase atravs da

genotipagem de VNTRs e SNPs. VNTRs com uma grande variedade so ferramentas teis

para anlise da genotipagem e sua transmisso em reas da comunidade, e SNPs e VNTRs

com pequeno grau de variao so favorveis para investigar a transmisso global da

hansenase 62

.

30

2.9 Deteco do M. leprae utilizando a biologia molecular

A padronizao de tcnicas de biologia molecular, como a amplificao de regies genmicas

espcies-especficas, atravs da tcnica de PCR (reao em cadeia da polimerase) de grande

importncia, uma vez que daro suporte ao diagnstico da doena e na identificao de cepas

8,20,63,64,65,66. Alm de ser uma tcnica no-invasiva, a PCR permite a deteco do DNA da

micobactria nos tecidos do hospedeiro, sem necessitar passar pela etapa do cultivo. De

acordo com os dados levantados nesta reviso, observamos que, apesar da alta sensibilidade e

especificidade da PCR para diagnstico de doenas infecciosas, a PCR ainda tem apresentado

baixa sensibilidade para deteco do DNA do M. leprae no plo tuberculide (TT e BT) da

hansenase. A PCR realizada em amostras de bipsias superior ao exame de baciloscopia

proveniente de raspado drmico para deteco do M. leprae em pacientes com hansenase

com IB de zero67

. Embora a PCR seja muito utilizada para deteco de DNA de agentes

infecciosos, a limitao a inabilidade da distino entre agentes viveis e inviveis 68,69

.

Santos e colaboradores (2001) consideraram que o M. leprae um parasita intracelular

obrigatrio de clulas de Schwann e de clulas do sistema fagoctico mononuclear, possuindo

um longo perodo de incubao e replicao e, juntamente com o conhecimento sobre a meia-

vida curta de clulas fagocticas do sangue, afirmaram que mais provvel que o DNA

amplificado seja de bacilos vivos, uma vez que os componentes celulares de bacilos mortos,

incluindo o DNA, seriam rapidamente eliminados pela excreo 68

.

A PCR a tcnica que consegue detectar o menor nmero de bacilos em relao a outros

exames 70,71

. Ela capaz de detectar o DNA de pequenas quantidades de bacilos no sangue 9,

68,72; raspado drmico

9,73,74,75,76 ; bipsia de: mucosa

20,63, pele

9,67,73,76,77,78 e nervo

14,79; swab

nasal 21,23,72,73,80,81

; urina 82

; solo 83

e at material obtido do cavum nasale de amostras

arqueolgicas 24

. Donoghue e colaboradores (2005) detectaram o M. leprae em amostras de

espcies vividas h mais de 1000 anos 84

. A amplificao do M. leprae no sangue tem

mostrado resultados inferiores em comparao com outros tipos de amostras clnicas 9.

Algumas publicaes tm demonstrado a aplicabilidade da tcnica de PCR na deteco do

genoma da micobactria em amostras biolgicas, amplificando sequncias de DNA de genes

que codificam protenas de 18 kDa, 36 kDa e 65kDa, Ag 85, hsp65, 16S-rRNA e sequncias

especficas repetitivas do M. leprae, ou seja, RLEP 10, 15, 65, 67, 70, 71, 76

. O genoma do M. leprae

mostrou a presena de uma nica cpia do gene hsp18 por cromossomo 85

.

31

H vrias tcnicas includas nos mtodos moleculares para amplificao do M. leprae, como a

nested primer 86

, TD-PCR 8,76

, LightCyclerTM

real-time PCR (LC-PCR) 87

, PCR

convencional 15

, real time PCR 65

, TaqMan real time PCR 15

e Reversal Transcriptase (RT)-

PCR 69,87

. Estas tcnicas so geralmente suplementares. So usadas quando surgem dvidas

na clnica ou histologia 66

.

Plikaytis e colaboradores (1990) justificaram a escolha do alvo do gene groEL para o seu

estudo de nested-PCR, sua estabilidade, diminuindo as chances de mutaes e resultados

falso negativos. Nesta modalidade de PCR, a sensibilidade e especificidade esto aumentadas

devido utilizao de quatro primers para amplificao 86

.

Touchdown ou TD-PCR comea com alta temperatura de anelamento inicialmente e, em

seguida, reduz esta temperatura em 1o

C a cada ciclo subsequente. TD-PCR pode reduzir a

amplificao inespecfica, melhorando a especificidade. Geralmente, o seu programa contm

mais ciclos do que a PCR convencional. A vantagem do TD-PCR que o procedimento pode

detectar DNA especfico em amostras clnicas contendo uma variedade de amostras diferentes

com maior sensibilidade. possvel detectar a mutao de vrios genes num nico regime de

amplificao 13,76

.

A LC-PCR indicada como um mtodo alternativo para a deteco e quantificao do M.

leprae. A sensibilidade alcanada foi de 100% para multibacilar e 50% para paucibacilar. O

procedimento total, incluindo a extrao de DNA apresentou durao de menos de trs horas.

Por estimativa, o nmero mnimo de bacilos detectveis nesta tcnica de quatro bacilos,

enquanto que na microscopia do raspado drmico necessrio 100 bacilos. Os autores citam

que a PCR em tempo real 25 vezes mais sensvel que o exame baciloscpico. Entretanto,

esta tcnica est restrita a poucos centros devido a razes monetrias relacionadas ao preo

dos equipamentos 87

.

A deteco do M. leprae utilizando a PCR em tempo real no apresenta maior sensibilidade,

comparada aos mtodos convencionais nos pacientes MB, segundo alguns autores 15

. Em

2010, Martins e colaboradores mostraram a positividade da PCR entre os contatos

soropositivos para a reao do anti PGL-1. A presena de DNA do M. leprae em 06 (19,35%)

destes, detectada atravs de PCR em tempo real e o maior nmero de cpias do genoma do

bacilo foram encontrados nos contatos que adoeceram. Eles concluram que testes da mucosa

nasal isolados no so capazes de fechar o diagnstico precoce da hansenase. Entretanto,

combinados, podem auxiliar a identificar infeco subclnica e monitorizar os contatos, os

quais podem contribuir com a disseminao da doena 26

.

32

Bang e colaboradores (2009) avaliaram a utilidade da anlise pela PCR, comparando-a com

outros mtodos como a baciloscopia obtida pelo raspado drmico, a histologia e a sorologia

baseada no PGL-1. A PCR foi positiva em todas as amostras histologicamente positivas e 13

(45%) das 29 histologicamente negativas. Comparadas PCR, a sensibilidade e

especificidade do exame histopatolgico foi de 75,5% e 100% respectivamente. Todos os MB

tiveram PCR (+), como esperado e, 50% dos PB mostraram DNA do M. leprae detectado 88

.

Neste mesmo estudo, um dos pares de primers usados resultou em 8, 3 bacilos detectados 88

.

A PCR taqMan real time eficaz para detectar e quantificar o DNA do M. leprae em amostras

clnicas, nas quais o bacilo indetectvel por mtodos convencionais 49

. Segundo Kang e

colaboradores (2001), o limite inferior de deteco de 10 bacilos 89

.

Martinez e colaboradores (2006) mostraram em estudo comparativo, resultados obtidos de

amostras de DNA de pacientes PB, a sensibilidade para PCR real time TaqMan 85B de

79,2%, a qual foi melhor do que o mtodo convencional , usando como alvo 85A-C (62,5%),

entretanto, este ltimo ndice tambm se mostrou alto em relao a alguns mtodos descritos

9,76. Ambas as tcnicas apresentaram 100% de especificidade. Quanto sensibilidade geral, a

PCR real time TaqMan 85B apresentou 91,3% e a PCR convencional, usando como alvo

85A-C mostrou 82,6%. Este estudo apresentou a maior taxa de deteco nos PB das amostras

de biopsia de pele. Nesta tcnica no h a etapa da hibridizao. Ambas as tcnicas mostraram

sensibilidade aumentada para os PB. Diante destes resultados, os autores sugerem o emprego

da Taq-Man real time utilizando como alvo o complexo do gene 85 juntamente com a

proteinase K na deteco do M. leprae nos casos de difcil diagnstico, ou seja, nos pacientes

apresentando forma neural pura ou BAAR (-) 15

.

Kang e colaboradores (2003) mostraram que os iniciadores para a seqncia repetitiva RLEP

foram usados com sucesso para amplificar DNA de M. leprae de pacientes com hansenase

com IB de zero. Alm disso, os primers RLEP apresentaram maior sensibilidade do que os

iniciadores comumente usados de 360 bp da protena de 18 kDa76

,77

. Um razo para esta

diferena seria o menor tamanho do produto, resultando numa PCR mais confivel devido

menor chance de DNA fragmentado ou danificado 76

.

Goulart e colaboradores (2007) mostraram que a amplificao de fragmentos de 130 bp

superior de 372 bp nos pacientes classificados na forma dimorfa tuberculide (DT), por isso,

para confirmar o diagnstico, os autores propuseram o uso deste tamanho de fragmento,

alcanando 51,6% de positividade nas formas paucibacilares. O alvo genmico usado foi

RLEP3 do DNA do M. leprae 25

.

33

Martinez e colaboradores (2009) analisaram amostras de bipsias de pele de pacientes MB e

acompanharam por at dois anos aps o tratamento, demonstrando que o 16SrRNA RLEP

mas no o sodA / RLEP identificou a presena de M. leprae viveis antes do tratamento nas

amostras e os nveis de 16SrRNA diminuram no decorrer do tratamento 65

. Alm disso,

quando o IB do raspado drmico foi comparado ao nmero de DNA do M. leprae utilizando

PCR real-time RLEP, uma associao estatisticamente significativa foi observada. Altas

concentraes de DNA correlacionaram com altos nveis de IB, e baixos nveis de DNA

corresponderam a baixos nveis de IB. Entretanto, quando os dados de viabilidade usando16S

rRNA/RLEP foram comparados ao IB dos pacientes no houve correlao significativa.

Portanto, segundo estes autores, a estabilidade e o nmero de cpias do gene 16S

rRNA/RLEP e sua fcil degenerao tornam os testes utilizando esta molcula teis durante o

tratamento e aps o mesmo 65

.

A tcnica de RT-PCR reconhecida como um mtodo rpido e sensvel para a deteco de

RNA do M. leprae. A sua sensibilidade considerada mais alta que a baciloscopia obtida do

raspado drmico ou proveniente de exame histopatolgico na proporo de 53% das bipsias

negativas foram RT-PCR positivas 90

. Ainda de acordo com este trabalho, a RT-PCR de

amostras de bipsias de pele obtidas de pacientes com uma variedade de outras doenas

cutneas inflamatrias e controles saudveis tiveram resultados negativos 90

. Uma tcnica de

PCR baseada em RNA pode ser til para confirmao do diagnstico em pacientes suspeitos,

com dificuldade para fechar o mesmo, para confirmar a eficcia do tratamento, para distinguir

recidiva de reao em pacientes previamente tratados e para estudos epidemiolgicos 49,89,90

.

Portanto, a RT-PCR pode ser usada como medida de viabilidade do bacilo. Entretanto, a

deteco do mRNA relativamente difcil porque o mRNA lbil e h poucas cpias em

cada clula, comparado aos genes rRNA 69

.

Mesmo que uma quantidade considervel de DNA bacteriano possa ser detectada em todas as

amostras analisadas de ENH, mRNA bacteriano no pode ser detectado. Uma reao

hansnica tardia pode surgir aps oito anos da PQT 67,84

. Estes dados mostram que o mtodo

de deteco do DNA e mRNA especfico ajudaro a diferenciar reaes tardias de recidivas

84. A presena do DNA pode causar a gravidade das reaes. A presena de grandes

quantidades de mRNA nos episdios reacionais indica que o patgeno vivel, gerando a

dvida da real eficcia da terapia antibacteriana e eliminao do patgeno residual, portanto,

este exame pode resultar em melhor controle das reaes e identificar possveis recidivas 85

.

Lini e colaboradores (2009) mostraram que h diferena entre PCR convencional e em tempo

real para deteco de mRNA, principalmente nos pacientes com raspado drmico negativo.

34

Neste estudo, o mRNA do hsp18 pde ser detectado em todos casos dimorfos e virchowianos.

Todavia o mRNA no pde ser encontrado em dois casos de hansenase tuberculide. Os

ttulos de hsp18 mRNA foram mais altos nas amostras de hansenase virchowiana e

diminudos quando migravam em direo ao outro espectro 85

.

PCR de repeties de TTC foi til para mostrar diferenas de tamanho dos produtos da PCR,

na comparao de dois polimorfismos utilizando a mesma espcie. Os resultados deste estudo

apontam a existncia de um nmero varivel de repeties de TTC numa determinada regio

de cepas do M. leprae, sendo tambm importante para investigao epidemiolgica 78

.

Em estudos realizados em amostras de muco nasal de contatos intradomiciliares de pacientes

na Colmbia foi encontrado 12,8% de positividade na PCR, utilizando o gene LSR/A15 que

codifica a protena de 15 kDa do M. leprae 80

. Um estudo de coorte realizado com 4.903

pacientes numa rea endmica da Indonsia mostrou que os contatos intradomiciliares

portadores de PCR positiva para DNA do M. leprae no nariz possuem quase dez vezes mais

risco de desenvolver hansenase comparando com os no contatos. Os contatos de MB

tiveram um risco aumentado de desenvolver a hansenase durante quase quatro anos de

acompanhamento. Os contatos intradomiciliares que no carregam o M. leprae no nariz no

tm risco aumentado de contrair a doena. Os homens apresentaram risco duas vezes maior de

desenvolver a hansenase, comparado s mulheres. Pessoas que possuem mais de sete

contatos intradomiciliares tm trs vezes mais risco comparado com lares de uma a quatro

pessoas81

.

Caleffi e colaboradores (2010) mostraram 4,1% de PCR positiva para deteco de M. leprae

em urina, principalmente em pacientes classificados como tuberculides (TT) no tratados,

utilizando como alvo, 85A-C 82

. Matsuoka e colaboradores (1999) demonstraram a presena

de DNA de M. leprae in 47% de amostras de gua em reas endmicas na Indonsia 91

.

Lavania e colaboradores (2008) utilizaram a RT-PCR obtendo como alvo a regio do gene

16S rRNA e encontraram M. leprae viveis em 35% de amostras do solo de reas endmicas

na ndia. A diferena foi estatisticamente relevante entre as reas habitadas e no habitadas 83

.

35

3 OBJETIVO GERAL

Avaliar a aplicao das tcnicas de reao em cadeia da polimerase convencional (PCR) e

reao em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para a deteco do bacilo M. leprae

em trs tipos de amostras biolgicas: sangue total, bipsia de pele e raspado drmico de

pacientes atendidos no ambulatrio de dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte.

4 OBJETIVOS ESPECFICOS

Selecionar pares de iniciadores j descritos para amplificar diferentes regies do

genoma do Mycobacterium leprae, pela tcnica de PCR;

Analisar a porcentagem de positividade das tcnicas de PCR convencional e a

qPCR em amostras de sangue, comparando com a positividade em amostras de

bipsia de leso e raspado drmico;

Analisar a porcentagem de positividade das tcnicas de PCR convencional e a

qPCR em pacientes que esto em tratamento de hansenase; tratados, mantendo

reaes; tratados, mantendo seqelas; nos contatos intradomiciliares e nos

pacientes do grupo controle;

36

5 METODOLOGIA

5.1 Amostras

Neste estudo, foram obtidas amostras biolgicas de 55 pacientes atendidos no ambulatrio de

hansenase da Santa Casa de Belo Horizonte, no perodo de agosto de 2010 a agosto de 2011.

Todos os pacientes assinaram o Termo de Consentimento Livre Esclarecido (TCLE),

aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa (CEP) da Santa Casa de BH (modelo em anexo).

O critrio de incluso foram os pacientes que consultaram no ambulatrio neste perodo e

aceitaram participar da pesquisa. O critrio de excluso foi o no aceite a participar da

pesquisa ou dficit mental, gerando dificuldades para o entendimento do processo (s 1

paciente no aceitou participar, 1 faleceu antes de o entrevistarmos e 1 apresentava dficit

mental).

Foram obtidas amostras de sangue total, de todos os pacientes, salvo excees por motivos

tcnicos (tabela 4). Para alguns pacientes que participaram da pesquisa tambm foi possvel

coletar amostras de raspado drmico ou bipsia de pele. A coleta do raspado drmico foi

realizada em seis pacientes considerando o mnimo de quatro stios anatmicos por coleta,

como lbulos de orelhas, cotovelos, joelhos ou mesmo nas prprias leses. O procedimento

caracterizado por uma pequena inciso com lmina de bisturi (aproximadamente 5mm de

extenso por 3mm de profundidade), aps pressionar a rea com o auxlio de uma pina e, em

seguida, realiza-se a coleta do raspado drmico, retirando quantidade suficiente e visvel de

material. Foram conservados a - 40C dentro de microtubos com gotculas de lcool 70

0.

As bipsias de pele foram obtidas atravs de punch tamanho 4mm, em leses cutneas,

quando estas existiam, aps assepsia adequada e conservadas em gua pura estril a -800C.

Foram coletadas de 9 pacientes e descritos nos resultados.

Os pacientes foram classificados em trs grupos apenas para simplificar o entendimento:

pacientes que apresentaram diagnstico compatvel com a hansenase em algum momento da

vida (GRUPO 1=37); pacientes com lupus eritematoso cutneo ou sistmico, com outras

doenas cutneas e pacientes com ausncia de doenas cutneas (GRUPO 2 ou controle=12).

E, no ltimo grupo estavam os contatos (Grupo 3=6) dos pacientes com hansenase que se

encontravam no GRUPO 1.

37

5.2 Extrao de DNA

5.2.1 Sangue total

Para a extrao de DNA das amostras de DNA de sangue total dos 55 pacientes (tabela 4)

foram seguidos os seguintes passos:

Pipetagem de 500 l de amostra em um microtubo de 1,5 ml ou 2,0 ml;

Acrscimo de 1,0 ml do Tampo de Lise I, homogeneizao sem usar vortex;

Centrifugao por 5 minutos a 5.000 giros;

Descarte do sobrenadante por inverso;

OBS: Repetio da lavagem com Lise I duas vezes.

Acrscimo ao pellet de clulas:

250 l de tampo de Lise II

5 l de SDS 20% ou 10 l de SDS 10%

Homogeneizao em vortex por 10 segundos;

Adio de 30 l de NaCl 3M;

Homogeneizao em vortex por 10 segundos e centrifugao por 15 min a 5.000 giros.

Recuperao do sobrenadante resultante em um tubo limpo (+- 300 l);

Adio de 300 l de isopropanol absoluto gelado, homogeneizao e espera por 10

horas (Overnight) a 20o C (at a total precipitao do DNA);

Centrifugao por 30 minutos a 15.000 giros (alta rotao) e descarte do sobrenadante;

Lavagem do DNA precipitado trs vezes com 1 ml da soluo de etanol 75% gelado;

Centrifugao por 15 minutos a 15.000 giros (alta rotao);

Descarte do sobrenadante e manuteno do tubo invertido em papel filtro, secando

temperatura ambiente por pelo menos 20min (pode ficar at 12h);

Hidratao do DNA com 100 l de soluo hidratante (gua ultra pura estril).

Incubao no banho seco a 65 C por 30 minutos.

Estoque do DNA extrado em freezer a -20o C para posteriores anlises.

38

Tabela 1. Solues de uso para extrao de DNA.

Reagente Composio

Tampo de Lise I

3 M de Sacarose (PM = 342,3)

10 mM Tris-HCl (pH = 7,5)

5 mM MgCl

Triton x-100 1%

OBS: Estocado em recipiente mbar, sob

refrigerao (4 C).

Tampo de Lise II

0,075 M NaCl

0,024 M Na-EDTA pH = 8,0, ajustado com

NaOH.

OBS: Estocado temperatura ambiente.

TE (Tris-EDTA) Tris-HCL a 10mM pH 7.0 e EDTA 1mM

OBS: Estocado em recipiente mbar, sob

refrigerao (4 C).

39

5.2.2 Extrao de DNA das amostras de bipsias de pele

Para a extrao de DNA das amostras de bipsia dos 9 pacientes foram seguidos os seguintes

passos:

Introduo de um fragmento de bipsia em um microtubo de 1,5 ml;

Adio de 200l do Tampo de Lise I contendo 1l da enzima Proteinase K na

concentrao final de 10U/ l;

Incubao a 37C por aproximadamente 10 horas (overnight).

Acrscimo de 1 ml do Tampo de Lise I, homogeneizao sem usar vortex;

Centrifugao por 5 minutos a 5.000 giros;

Descarte do sobrenadante por inverso;

Acrscimo ao pellet de clulas:

250 l de tampo de Lise II

5 l de SDS 20% ou 10 l de SDS 10%

Homogeneizao em vortex por 10 segundos;

Adio de 30 l de NaCl 3M;

Homogeneizao em vortex por 10 segundos e centrifugao por 15 min a 5.000 giros.

Recuperao do sobrenadante resultante em um tubo limpo (+- 300 l);

Adio de 300 l de isopropanol absoluto gelado, homogeneizao e espera por 10

horas (overnight) a 20o C (at a total precipitao do DNA);

Centrifugao por 30 minutos a 15.000 giros (alta rotao) e descarte do sobrenadante;

Lavagem do DNA precipitado trs vezes com 1 ml da soluo de etanol 75% gelado;

Centrifugao por 15 minutos a 15.000 giros (alta rotao);

Descarte do sobrenadante e manuteno do tubo invertido em papel filtro, secando

temperatura ambiente por pelo menos 20 min (pode ficar at 12h);

Hidratao do DNA com 100 l de soluo hidratante (gua ultra pura estril).

Incubao no banho seco a 65 C por 30 minutos.

Estoque do DNA extrado em freezer a -20o C para posteriores anlises.

40

5.2.3 Extrao de DNA das amostras de raspado drmico

Para a extrao de DNA das amostras de raspado drmico dos 06 pacientes foram seguidos os

seguintes passos:

Adio de 20 l de raspado drmico em um microtubo de 0,5 ml contendo gua ultra

pura estril;

Incubao no banho seco a 65 C por 30 minutos;

Estoque do DNA extrado em freezer a -20o C para posteriores anlises.

5.3 Dosagem do DNA no espectrofotmetro

Para a dosagem dos DNA extrados, foram seguidos os seguintes passos:

Diluio das amostras de DNA na proporo de 1/10 (5 l de DNA em 45 l de gua

ultra-pura estril);

Realizao da leitura de absorbncia a 260/280 nm em espectrofotmetro (marca

Eppendorf, USA), para quantificar DNA (260nm) e protena (280nm) na amostra.

5.4 Amplificao do material gentico pela tcnica PCR

5.4.1 Iniciadores

A partir da reviso de todos os iniciadores j descritos para amplificar o genoma de M. leprae

(Apndice A), foram selecionados trs pares de iniciadores que amplificam duas importantes

regies do DNA do M. leprae: a regio repetitiva RLEP e a regio do DNA ribossmico

(16rRNA). Estes iniciadores foram utilizados tanto na PCR convencional quanto na qPCR. O

par LP1-LP2 flanqueiam a regio RLEP, o par F1-F2, pequenas regies em tandem na regio

do locus AC8a e o par P2-P3, a regio do rRNA.

41

Tabela 2. Descrio dos iniciadores de DNA utilizados para a comparao das tcnicas de

PCR na deteco do Mycobacterium leprae em amostras de pacientes do servio de

dermatologia da Santa Casa de Belo Horizonte.

PRIME

R

FORWARD REVERSE

BP

ALVO

S

REFERNCIA

BIBLIOGRFI

CA

LP1-

LP2

TGCATGTCATGGCCTTGAGG CACCCGATACCAGCGGCA

GAA

12

9

RLEP 76

F1-F2 GTGTTACGCGGAACCAGGC

A

CCATCTGTTGGTACTACTG

A

12

4

STR

locus:

AC8a

60

P2-P3 CGGAAAGGTCTCTAAAAAA

TCTT

CATCCTGCACCGCAAAAA

GCTT

17

2

16rRN

A

88

5.4.2 Reao de PCR convencional

Os ensaios para avaliar a presena de DNA da M. leprae no sangue, raspado drmico e

bipsia de leso de pele pela tcnica de PCR foram realizados utilizando 1,5 UI da enzima

Taq polimerase (marca Phoneutria Biotecnologia - Belo Horizonte- Brasil); Tampo

especfico da enzima na concentrao 1X; 0,2mM de dNTP (marca Ludwig, Porto Alegre

Brasil), 1,5mM a 2,5mM MgCl2 (marca Phoneutria Biotecnologia - Belo Horizonte - Brasil);

0,5 M (F1, F2), 0,6 M (LP1, LP2), 1,0M (P2, P3) ( todos os iniciadores da marca Sigma-

Aldrich do Brasil So Paulo - Brasil); 20ng de DNA e gua ultra pura estril (qsp).

Para o controle da qualidade das reaes foi utilizado 0,3 M do iniciador para -Globina em

todas as reaes (Sigma-Aldrich do Brasil So Paulo Brasil).

42

As amplificaes foram realizadas no termociclador PX2 thermal cycler da Thermo electron

corporation (Waltham, MA; USA), seguindo os programas abaixo:

F1 e F2

95C por 5 min.

95C por 15 seg.

60C por 15 seg. 40 vezes

72C por 1 min.

72C por 7 min.

LP1, LP2

95C por 5 min.

95C por 30 seg.

58C por 30 seg. 40 vezes

72C por 1 min.

72C por 10 min.

P2, P3 95C por 3 min.

95C por 20 seg.

55C por 20 seg. 40 vezes

72C por 30 seg.

72C por 5 min.

Para visualizao e anlise do produto da PCR foi realizada uma eletroforese em gel de

acrilamida a 7% corado com nitrato de prata 2%.

5.4.3 Reao de PCR em tempo real (qPCR)

Os ensaios para avaliar a presena de DNA da M. leprae no sangue, raspado drmico e

bipsia de pele pela tcnica de qPCR foram realizados utilizando 5 l de qPCR-SYBR-Green

mix/Rox (marca Ludwig, Porto Alegre- Brasil), as concentraes dos iniciadores e DNA

foram as mesmas utilizadas na PCR convencional perfazendo um volume final de 10 l de

reao. Os ensaios foram realizados em duplicata para todos os alvos, com o gene -Globina

para controle da qualidade da reao. Foi utilizado o equipamento EcoTM

Real Time PCR da

Illumina (Uniscience, USA). Para todos os ensaios foi realizada a curva de dissociao, ou

curva de Melt. Os valores de baseline e threshold utilizados foram ajustados para cada ensaio.

43

6 RESULTADOS

Apresentamos os 55 pacientes selecionados para a pesquisa.

Tabela 3- Relao dos pacientes atendidos no ambulatrio de dermatologia da Santa Casa de

Belo Horizonte de agosto de 2010 a agosto de 2011.

PAC IDADE ESCOLARIDADE SEXO COR BCG COMORBIDADE DIAGNSTICO PROCEDNCIA TRATAMENTOGRAU

PARENTESCO

01 50 Mdio F B - - LECC Vista Alegre - BH - N

02 52 Fundamental F N - HAS, IRC e

Depresso

Ausncia de

Doenas Cutneas

Capim Branco - MG -N

03 47 Fundamental M P - - LES Goinia - BH - N

04 36 Mdio F N N - MHT J.Belmonte - BH Em tratamento N

05 56 Fundamental M P N - MHDD Estrela Indai - MG Em tratamento N

06 50 Fundamental M P S HAS, Diabetes

II

RH - Mista Floramar - BH Tratado com

reao N

07 48 Fundamental F N N HAS, Diabetes

II

RH1 Regina - BH Tratado com

reao N

08 37 Fundamental M P N Glaucoma Incapacidade 1 Rib.Neves - MG Tratado com

sequela N

09 39 Mdio F P - - Lupus Tmido Betnia - BH - N

10 21 Fundamental F N N - RH - Mista Joama - MG Tratado com

reao N

11 50 Fundamental F B N HAS Incapacidade 1 Aarao Reis - BH Tratado com

sequela N

12 51 Mdio M B S Hiperglicemia RH1 BH Tratado com

reao N

13 43 Fundamental F P - - Pnfigo Foliceo Juatuba - MG - N

14 43 Fundamental M B S - RH