Construção de biossensores baseados em biomoléculas e ... · RESUMO Galhardo, K. S., Construção de biossensores baseados em biomoléculas e líquidos iônicos, 2010.80p. Dissertação

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

Kelly Suely Galhardo

Construção de biossensores baseados em biomoléculas e líquidos iônicos

São Paulo

19/05/2010

KELLY SUELY GALHARDO


Orientadora: Profa. Dra. Susana Inés Córdoba de Torresi

São Paulo 2010

Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Química (Físico-Química)



Dissertação apresentada ao Instituto

de Química da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Mestre em Físico-

Química

Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Dedico este trabalho aos meus pais, Pedro e Norma, aos meus

irmãos Caroline e Pedro Jr. e ao meu namorado Leonardo, pelo

amor e pelo apoio que me deram.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Pedro e Norma (in memorian) que me ensinaram a lutar

pelos meus objetivos e me deram educação, amor e apoio.

Quero agradecer a Profa. Dra. Susana Inés Córdoba de Torresi pela

oportunidade que me foi dada de realizar o Mestrado, bem como por sua orientação

nas diretrizes deste projeto e pela amizade e conselhos.

Ao Prof. Dr. Roberto Torresi pelas discussões de grupo e sugestões. A

Profa. Dra. Patrícia Inés Ortiz e a Profa. Dra. Carla Eugenia Giacomelli da Facultad

de Ciencias Químicas da Universidad Nacional Córdoba - Argentina pelo auxílio na

técnica de injeção de fluxo e pela acolhida na Cidade de Córdoba - Argentina.

Aos meus irmãos Carol e Junior pelo apoio e compreensão nos

momentos em que não pude estar com eles.

Ao me namorado pelo apoio, ajuda, amor, carinho e dedicação que ele

me proporcionou para que eu pudesse continuar minha pesquisa.

Aos meus amigos do Laboratório de Materiais Eletroativos (LME) do

Instituto de Química da USP, Fernanda, Fernando, Gisela, Leonardo (Leovis),

Marcelo, Mariana (Mari), Simone (Simonete), Suelen (Su), Tânia, Tatiana (Tati),

Vinícius (Vina) e Vitor, pelo auxílio no desenvolvimento do meu trabalho,

compreensão, amizade, bem como pelos momentos de descontração.

Agradeço também aos funcionários da secretaria de pós-graduação, da

biblioteca da química e aos técnicos de laboratório do Instituto de Química da USP

por todo o auxílio dado frente as minhas necessidades.

Ao CNPq pela bolsa de mestrado que me concederam.

E a todas as pessoas que me esqueci de citar e que de alguma forma

fizeram parte desta etapa tão importante da minha vida.

RESUMO

Galhardo, K. S., Construção de biossensores baseados em biomoléculas e

líquidos iônicos, 2010. 80p. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-

Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São

Paulo.

Este trabalho consiste em estudar o comportamento eletroquímico de

biomoléculas imobilizadas sobre o eletrodo de carbono vítreo, utilizando materiais

biocompatíveis como meios imobilizadores para detecções em meios aquosos.

Foram utilizados inicialmente compósitos de hidrogéis capazes de auxiliar a

permanência da enzima sobre a superfície do eletrodo e beneficiar a transferência

de carga entre a enzima e o eletrodo de trabalho. Para melhorar a resposta

eletroquímica do biossensor, também foram estudados métodos que utilizam

líquidos iônicos no processo de imobilização da enzima.

Deste modo a eletroatividade da enzima foi inicialmente estudada por

voltametria cíclica, a fim de evidenciar tal eletroatividade no meio totalmente iônico,

como também avaliar o melhor método de imobilização, para futuras aplicações em

detecções de analitos. Os líquidos iônicos utilizados são compostos por cátions

alquil-imidazol com ânions de natureza orgânica ou inorgânica. Como se sabe os

íons que compõem o líquido iônico podem distinguir sua funcionalidade, pois é o

tamanho desses íons que influencia na maioria das suas propriedades físico-

químicas, tais como hidrofobicidade e viscosidade.

Palavra Chave: biomoléculas, líquidos iônicos, citocromo c e glicose oxidase.

ABSTRACT

Galhardo, K. S., Construction of biosensors based on biomolecules and ionic

liquids , 2010. 80p. Masters Thesis. Graduate Program in Chemistry. Instituto de

Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

The aim of this work is to study the electrochemical behavior of

biomolecules immobilized on a glassy carbon electrode, using biocompatible

materials as a way for immobilizing detection in aqueous media. Initially, hydrogels

composite were used because they are able to assist the permanence of the enzyme

on the electrode surface and they are benefit to the charge transfer between enzyme

and electrode surface. To improve the electrochemical response of the biosensor,

methods using ionic liquids in the process of immobilization of the enzyme were also

studied.

Thus the electroactivity of the enzyme was initially analyzed by cyclic

voltammetry in order to show that the electroactivity remains in an entirely ionic

media, as well as evaluating the best method of immobilization, for future applications

in biosensors. The ionic liquids used are composed of imidazole-alkyl cations with

anions of organic or inorganic nature. As it is well known, the ions in the ionic liquid

can distinguish its functionality, due to the fact that it is the size of these ions that

influences most on their physicochemical properties such as hydrophobicity and

viscosity.

Keywords: biomolecules, ionic liquids, cytochrome c and glucose oxidase.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Líquidos iônicos [5]. .................................................................................16

Figura 2 - Aplicações dos líquidos iônicos [11].........................................................17

Figura 3 – Elementos e componentes de um biossensor típico [40]. .......................21

Figura 4 - Estrutura da quitina, quitosana e celulose [20].........................................24

Figura 5 - Esquema de funcionamento do biossensor com citocromo c imobilizado

sobre um eletrodo, onde C é o eletrodo Carbono vítreo e M é a modificação feita

na superfície.......................................................................................................27

Figura 6 - Representação da reação de GOx [45]....................................................28

Figura 7 – Biossensor com o Azul da Prússia e enzima oxidase [46]. .....................29

Figura 8 – Preparação dos líquidos iônicos..............................................................34

Figura 9 – Voltametria cíclica em PBS 0.1mol L-1 do eletrodo contendo 5L da

solução (170µL de quitosana 0.5wt% + 100µL de citocromo c 10mg mL-1 +

830µL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 8% v/v de BMMIBF4) ciclando várias vezes

em velocidade de varredura de 100mV s-1.........................................................37

Figura 10 – Voltametria cíclica de a) Cit c/GC; b) Qui-LI-MWNTs/GC; c) Qui-cit c-

MWTNs/GC e d) Qui-cit c-LI-MWNTs/GC em PBS 0.1mol L-1 pH7.0. Imagem

retirada da referência [48]. .................................................................................38

Figura 11 – Voltametria cíclica do eletrodo de carbono vítreo na detecção de H2O2

em meio de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 com velocidade de varredura de 100mV s-1.

...........................................................................................................................40

Figura 12 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico de

glicose. ...............................................................................................................41

Figura 13 – Cronoamperometria com potencial aplicado de: (A) 0,7V; (B) 0,8V; (C)

0,9V e (D) 1,0V no eletrodo contendo 5µL de solução (300µL de quitosana

0.5wt% + 80µL glicose oxidase 10mg mL-1 + 3% v/v BMMIBF4), com adições

0.1mmol L-1 de glicose.......................................................................................42

Figura 14 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico baseado

na detecção de glicose medida pelo híbrido. .....................................................43

Figura 15 – Voltametria cíclica em meio de K3Fe(CN)6 0.02mol L-1, KCl 0.1mol L-1 e

pirrol 0.015mol L-1, 10 ciclos com velocidade de varredura de 50mV s-1. ..........44

Figura 16 – Voltametria cíclica em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e KCl 0.1mol l-1, 20

ciclos com velocidade de varredura de 50mV s-1. ..............................................44

Figura 17 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo de carbono vítreo com o híbrido

contendo 5µL de solução A (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase

10mg mL-1); B(300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 5mg mL-1); C

(300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 2.5mg mL-1) . Adições de

0.1mmol L-1 de glicose. ......................................................................................46

Figura 18 – Ligação cruzada envolvendo a reação entre glutaraldeído e os grupos

amina residuais livres de enzimas [47]...............................................................48

Figura 19 – O gráfico A representa a cronoamperometria a 0V do eletrodo

modificado com o híbrido e com a mistura de 10µL de solução 10µL de

glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de (40mg de BSA + 10mg GOx + 1mL de PBS

0.1mol L-1 pH7 + 3% v/v BMMIBF4). O gráfico B1 representa a

cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido com o híbrido e

com a mistura de 10µL de solução 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de

(10mg GOx + 1mL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 3% v/v BMMIBF4). E o gráfico B2

representa sensibilidade. Realizaram-se adições de 0.1mmol L-1 de glicose. ...49

Figura 20 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido e com

uma mistura de 10µL de solução 25µL de GOx 10mg mL-1 + 10µL de

glutaraldeído 2.5%v/v.C1 é a detecção e C2 é a sensibilidade. Adições de

0.1mmol L-1 de glicose. ......................................................................................50

Figura 21 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os

eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido

seguido da adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4,

após seco acrescentou-se 2(A) ou 10(B)µL de glutaraldeído 2.5%v/v em água.

...........................................................................................................................53

Figura 22 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, o

eletrodo foi preparado a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da

adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx, após seco acrescentou-se 2µL

de glutaraldeído 2.5%v/v em água.....................................................................54

Figura 23 - Espectro de UV–vis da GOx em PBS contendo 0 vol% (a), 2 vol% (b), 5

vol% (c)10 vol% (d), 15 vol% (e), e 20 vol% (f) de BMMIBF4. Esta imagem foi

retirada da referência 42. ...................................................................................56

Figura 24 - Espectro de dicroísmo circular (CD) da GOx PBS (0.1M, pH8.2)

contendo 0 (preto), 2 (vermelho), 5 (verde), 10 (azul), 15 (azul claro), e 20 vol%

(lilás) de BMMIBF4 na região UV-distante (A)e UV-perto (B).Estas imagens

foram retiradas da referência 42. .......................................................................57

Figura 25 - Espectro Raman de (a) 10mM glicose em PBS 0.1mol L-1; (b) Mistura

GOx-BMMIBF4–PBS contendo 20 vol% de BMMIBF4 ; e (c) Espectro Raman do

BMMIBF4 registrado na mistura BMMIBF4–PBS (20 vol% BMMIBF4). O espectro

foi registrado usando energia de excitação em 514.5nm. Esta imagem foi

retirada da referência 42. ...................................................................................58

Figura 26 – Estimativa da constante aparente de Michalis-Menten. ........................60

Figura 27- Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os


seguido da adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4 (A)

ou 4% BMMITFSI(B), após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v

em água. ............................................................................................................62

Figura 28 - Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os


seguido da adição de 5µL de solução 10mg GOx dissolvida parcialmente em

1mL de BMMITFSI, após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v em

água. ..................................................................................................................63

Figura 29 – Detecção de glicose utilizando FIA do eletrodo modificado com o híbrido

seguido da adição de 5µL de solução (GOx 10mg mL-1 com 4% v/v BMMIBF4),

após seco acrescentou-se 2µL de Glut 2.5% v/v em água. Foram realizadas 3

adições de cada concentração: 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.1, 0.4, 0.8 e 1mmol L-1

de glicose. ..........................................................................................................65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Tabela de reagentes utilizados................................................................32

Tabela 2 – Modificações feitas no eletrodo de carbono vítreo .................................39

Tabela 3 – Modificação da quantidade de quitosana. ..............................................47

Tabela 4 – Modificação das quantidades de glutaraldeído, glicose oxidase e líquido

iônico..................................................................................................................51

Tabela 5 – Modificação da forma de adição do glutaraldeído. .................................55

Tabela 6 – Valores de KMap para outros sistemas.....................................................61

Tabela 7 – Eletrodos modificados com glicose oxidase. ..........................................67

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

BMMIBr – brometo de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio

BMMIBF4 – tetrafluoroborato de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio

BMMITFSI - bis(trifluorometanosufonil)imideto de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio

Cit c – Citocromo c

CuHCNFe - hexacianoferrato de cobre

CuHCNFe/ppi - hexacianoferrato de cobre/polipirrol

CNTs – nanotubos de carbono

GOx – glicose oxidase

LI(s) – líquido iônico(s)

PPi – poli(pirrol)

PBS – tampão fosfato

Qui - quitosana

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................... 15

1.1 Biossensores ............................................................................................20

1.2 Líquidos iônicos .......................................................................................21

1.3 Quitosana ..................................................................................................23

1.4 Enzimas .....................................................................................................25

1.4.1 Citocromo c ...........................................................................................26

1.4.2 Glicose oxidase .....................................................................................27

1.5 Híbrido .......................................................................................................28

2 OBJETIVOS........................................................................ 31

3 PARTE EXPERIMENTAL.................................................. 32

3.1 Eletrodos utilizados..................................................................................32

3.2 Reagentes..................................................................................................32

3.3 Instrumentação .........................................................................................33

3.4 Enzimas .....................................................................................................34

3.4.1 Preparação e caracterização de líquidos iônicos ..................................34

3.4.2 Preparação da quitosana.......................................................................35

3.5 Preparação do híbrido..............................................................................36

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................... 37

4.1 Citocromo c...............................................................................................37

4.2 Glicose oxidase.........................................................................................41

4.2.1 Modificações realizadas no biossensor de glicose................................46

4.2.2 Adição de glutaraldeído substituindo a quitosana .................................48

4.2.3 Variação da forma de adição do glutaraldeído ......................................53

4.2.4 Cálculo da constante aparente de Michaelis-Menten (KMap)..................60

4.2.5 BMMIBF4 versus BMMITFSI..................................................................62

4.3 Detecção de glicose por Análise por Injeção em Fluxo (FIA) ...............65

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................. 67

6 CONCLUSÃO..................................................................... 69

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................. 70

8 SÚMULA CURRICULAR................................................... 79

Introdução 15

1 INTRODUÇÃO

A utilização de enzimas em solventes não-aquosos tem se tornado foco de

intensa pesquisa devido a alguns benefícios deste meio em relação aos meios

reacionais aquosos convencionais. Podendo-se destacar a alta solubilidade dos

substratos, a supressão de reações indesejáveis promovidas pela água, na favorável

imobilização das enzimas devido a sua insolubilidade, e em alguns casos

considerável melhora na estabilidade, atividade e seletividade dessas biomoléculas

[1, 2]. Tal fato, por exemplo, permite a aplicação, com sucesso, de hidrolases em

reação não hidrolítica, tais como a acilação de álcoois e aminas, as quais são de

interesse industrial. Neste contexto a substituição de solventes orgânicos voláteis

(VOCs) por outros meios reacionais, ambientalmente mais compatíveis, como fluidos

supercríticos (CO2) e líquidos iônicos vem se destacando. Todavia, a solubilidade

limitada de muitos substratos em CO2 supercrítico restringe a plena aplicação [3],

desvantagem esta que não ocorre em líquidos iônicos, os quais apresentam

excelente capacidade solubilizante, além de propriedades como não inflamabilidade,

boa condutividade iônica e estabilidade térmica e química [4].

Líquidos iônicos, figura 1, são solventes orgânicos compostos

exclusivamente por íons que são líquidos a temperatura ambiente [5, 6, 7]. Suas

aplicações vinculadas principalmente a reações orgânicas, incluindo biocatálise, não

se deve exclusivamente a sua baixa volatilidade e dessa forma também em sua

classificação como solvente verde, mas devido as suas propriedades únicas, tais

como polaridade, viscosidade e hidrofobicidade ajustáveis através da combinação

adequada de cátions e ânions e excelente estabilidade eletroquímica. Dessa forma,

Introdução 16

eles são considerados solventes moduláveis ou “de engenharia”, fornecendo novas

oportunidades para muitos processos biocatalíticos [8-11].

Figura 1 - Líquidos iônicos [5].

Os líquidos iônicos realçam a atividade de heme proteínas, e possibilita a

utilização dos eletrodos que têm a enzima imobilizada em meios não-aquosos [9]. A

possibilidade de utilização de meios não-aquosos, fez com que muitos trabalhos

fossem desenvolvidos empregando os líquidos iônicos em diversas áreas, como

podemos constatar na figura 2.

Introdução 17

Figura 2 - Aplicações dos líquidos iônicos [11].

O foco de nosso trabalho esta nos sensores eletroquímicos e como

podemos observar na figura 2, os métodos utilizados são: cronopotenciometria,

cronoamperometria, voltametria e microbalança de cristal de quartzo. A

cronopotenciometria consiste em aplicar uma corrente constante e monitorar o

potencial em função do tempo e a cronoamperometria consiste em aplicar um

potencial constante e monitorar a variação de corrente em função do tempo. No caso

da voltametria aplicamos uma variação de potencial e monitoramos a variação da

corrente de acordo com uma velocidade determinada. Já a microbalança de cristal

de quartzo consiste em monitorar o aumento de massa em função da variação da

frequência de oscilação do cristal de quartzo [12, 13].

O fato de se ter um crescente interesse e uso de líquidos iônicos como

novo meio para reações que envolvam enzimas, o estudo fundamental do efeito

Aplicações dos líquidos iônicos

Reações orgânicas e catalíticas

Dispositivos eletroquímicos

Análises

Baterias e capacitores Células combustíveis Células fotovoltaicas Atuação eletroquímica no estado sólido

Cronopotenciometria Cronoamperometria Voltametria Microbalança de cristal de quartzo

Sensores eletroquímicos

Extração e separação

Cromatografia gasosa Cromatografia líquida Eletroforese capilar

Sensores ópticos

Introdução 18

desses solventes sobre a atividade, estabilidade e seletividade dessas biomoléculas

está apenas no início. Diversos fatores, tais como polaridade, capacidade de

formação de ligações de hidrogênio, nucleofilicidade e viscosidade são alguns dos

aspectos sugeridos para explicar este diferenciado comportamento em um meio

totalmente iônico. Dentre esses fatores, hidrofobicidade e viscosidade parecem ser

os mais relevantes na atividade da enzima [11, 14, 15].

O uso de enzimas com atividade redox é de grande interesse na área

eletroquímica, visando principalmente seu uso em biossensores através de sua

imobilização em eletrodos, o que confere uma maior estabilidade a essas

biomoléculas [16, 17]. Devido à natureza condutiva intrínseca dos líquidos iônicos o

que exclui a necessidade de eletrólitos e a estabilidade e atividade diferenciada que

enzimas podem apresentar neste meio totalmente iônico, tal emprego torna-se bem

oportuno [18].

O modo como a enzima é imobilizada sobre o eletrodo, é um dos fatores

determinantes para a estabilização e boa reprodutibilidade do biossensor. Para

alcançar o melhor aproveitamento da enzima, existem três fatores que devem ser

superados para permitir a transferência direta de elétrons sobre a superfície sólida

do eletrodo, sendo eles: (i) centros ativos não acessíveis da enzima; (ii) mudanças

de conformação da enzima devido à adsorção sobre o eletrodo e (iii) orientação não

organizada da enzima adsorvida sobre o eletrodo. A imobilização de enzimas sobre

eletrodos pode ser realizada de diversas maneiras, utilizando materiais como

polímeros condutores, surfactantes, filmes sol-gel, nanomateriais, materiais híbridos,

compósitos, hidrogéis e outros [19-32, 48-50].

Dentre as enzimas com atividade redox, o citocromo c e a glicose oxidase,

representam excelentes modelos de biomoléculas para investigar a bioeletroquímica

Introdução 19

em meios aquosos mistos e mesmo em solventes orgânicos devido a sua estrutura,

atividade e caracterização espectroeletroquímica e a manutenção de sua atividade

em sistemas não aquosos [16, 33-35]. Frente tais vantagens, essas enzimas tornam-

se atraentes como material ativo em biossensores, destacando para a detecção de

radicais superóxidos e NO [2, 36-39]. Vale mencionar que a maioria das técnicas

utilizadas para detectar estes radicais tem usado métodos espectroscópicos

indiretos como, por exemplo, meios espectrofotométricos, quimiluminescência e

ressonância de elétron spin. No entanto, estes métodos são de detecção ex situ com

baixo grau de seletividade e sensibilidade. Além disso, a detecção quantitativa

destes radicais em modelos biológicos é muito dificultada, devido a sua baixa

concentração e curta estabilidade nos meios eletrolíticos convencionais.

Neste trabalho iniciamos a imobilização das enzimas, citocromo c e

glicose oxidase, utilizando líquido iônico e quitosana como matriz para a formação

do biossensor.

Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com o intuito de verificar a

transferência direta de elétrons de biomoléculas na presença de líquidos iônicos,

alguns exemplos são listados a seguir:

a) Eletrodo de carbono vítreo modificado com uma mistura de quitosana,

nanotubos de carbono, líquido iônico (BMMIBF4) e citocromo c [48];

b) Eletrodo de ouro modificado com nanopartículas de ouro, quitosana,

líquido iônico e glicose oxidase [49];

c) Carbono vítreo modificado com nanotubos de carbono, nanopartículas

de ouro, líquido iônico e glicose oxidase [50];

d) Grafite com líquido iônico substituindo o nujol em eletrodos de pasta

de carbono, com adição de glicose oxidase [51, 52].

Introdução 20

Estes autores afirmam que a transferência direta de elétrons é dada pela

presença do líquido iônico, porém não há como saber se a resposta é referente à

presença do líquido iônico, aos nanotubos de carbono ou as nanopartículas

presentes na superfície. No caso dos eletrodos de pasta de carbono os autores

substituem o nujol por líquido iônico e afirmam que ocorre uma melhora muito

grande da resposta do eletrodo.

A partir destas constatações, decidimos estudar a interação da

biomolécula com o líquido iônico, sem a presença de nanotubos ou nanopartículas,

e assim verificar se a transferência direta de elétrons é realmente devida à presença

do líquido iônico.

1.1 Biossensores

Um biossensor é geralmente definido como um dispositivo analítico que

converte uma resposta biológica em um sinal mensurável. A figura 3 ilustra

esquematicamente as partes típicas de um biossensor: a) o bioreceptor ligado ao

analito; b) a arquitetura da interface onde um evento biológico específico ocorre e

que ocasiona um aumento de sinal; c) o transdutor que converte o sinal eletrônico e

amplifica para o circuito de detecção usando uma referência apropriada; d) um

computador que converte o sinal para um significado físico descrevendo o processo

investigado; e finalmente, e) o resultado é apresentado em uma interface para o

operador humano.

Introdução 21

Figura 3 – Elementos e componentes de um biossensor típico [40].

Biossensores eletroquímicos são baseados no consumo de espécies

eletroquímicas e/ou geração durante interação biológica e química no processo de

ativação biológica da substância e do substrato. Neste processo, um detector mede

o sinal eletroquímico produzido pela interação [32, 41].

1.2 Líquidos iônicos

Os eletrólitos normalmente são obtidos pela dissolução de um sal em

solventes moleculares. Estes sistemas consistem em íons solvatados, sua

combinação carregada (ou neutra) e moléculas de solvente. Um sal pode ser

liquefeito combinando íons livres em moléculas de solvente, neste caso temos o

líquido iônico (LI) [5].

Líquidos iônicos (LIs) usualmente são sais de amônio quaternário, como

tetraalquilamônio [R4N]+ ou baseados em aminas cíclicas, ambos aromáticos

(piridina, imidazol) e saturados (piperidina, pirrolidinio). Um LI típico é uma

combinação de um cátion orgânico (N-alquilpiridina, N,N-dialquilimidazol) com uma

variedade de ânions orgânicos ou inorgânicos (Cl-, Br-, I-, AlCl4-, NO3-, PF6

-, BF4-,

Introdução 22

CF3SO3-, CF3COO-, [(CF3SO2)2N-=Tf2N-], [(C2F5SO2)2N-=Pf2N-] ). Possuem alta

viscosidade que provoca dificuldades na manipulação dos mesmos [5, 11].

As propriedades dos líquidos iônicos como o ponto de fusão, constante

dielétrica, viscosidade, polaridade, miscibilidade em água, podem ser controladas

pela combinação de cátions com ânions apropriados. A viscosidade de líquidos

iônicos hidrofóbicos é fortemente dependente da quantidade dissolvida em água. A

presença de água e solventes orgânicos decresce a viscosidade dos LIs, enquanto

que a presença de cloro aumenta a viscosidade. Estudos eletroquímicos mostram

que a janela eletroquímica alcança até 4.5V em comparação com 1.2V na maioria

dos eletrólitos aquosos. Propriedades como a não inflamabilidade, boa

condutividade iônica, eletroquímica e estabilidade térmica dos LIs fazem com que

eles sejam aplicados em vários dispositivos eletroquímicos, como baterias,

capacitores, células combustível, células fotovoltaicas e sensores eletroquímicos [11,

15].

Métodos eletroquímicos como a potenciometria, voltametria e

microbalança de cristal de quartzo têm sido utilizados com líquidos iônicos, para

desenvolver uma nova geração de sensores íon seletivos, dispositivos voltamétricos,

sensores a gás e biossensores [11].

No trabalho a seguir, utilizamos os líquidos iônicos BMMIBF4 (hidrofílico) e

BMMITFSI (hidrofóbico), para verificar se a presença deles melhora a resposta

eletroquímica do biossensor.

Introdução 23

1.3 Quitosana

As propriedades de enzimas imobilizadas são governadas pelas

propriedades de ambas, da enzima e do material de suporte. A interação entre a

imobilização da enzima e suas propriedades físico-químicas e cinéticas pode ser

decidida de acordo com a aplicação e a escolha do suporte que pode significar um

desempenho operacional do sistema imobilizado. É conhecido que não há um

suporte universal para todas as enzimas e suas aplicações, um número de

características desejáveis podem ser comum para qualquer material: alta afinidade

com a proteína, disponibilidade de grupos de funções reativos para reações diretas

com enzimas e para modificações químicas, hidrofílico, estabilidade mecânica,

rigidez, regenerabilidade, e fácil preparação em diferentes configurações que

fornecem ao sistema permeabilidade e área superficial apropriada para a

biotransformação escolhida [17, 20].

Muitos portadores têm sido considerados e estudados para imobilização

de enzimas, orgânicos e inorgânicos, naturais e sintéticos, quitina e quitosana são

de interesse da maioria, devido ao fato de oferecerem a maioria das características

citadas acima [20-23].

Quitina e quitosana são poliaminosacarídeos naturais, quitina é um dos

recursos orgânicos renováveis mais abundantes no mundo. A quitina é o principal

constituinte de conchas de crustáceos, de exoesqueletos de insetos e paredes de

célula de fungos que fornece força e estabilidade. Quimicamente, a quitina é

composta por β(1→4) unidades ligadas de 2-acetamida-2-dioxi-β-D-glicose (ou N-

acetil-D-glicosamina), formam uma longa cadeia linear de polímero, sendo insolúvel

na maioria dos solventes. Quitosana, o principal derivado da quitina, é obtido pela N-

desacetilação para uma extensão variada caracterizada pelo grau de desacetilação,

Introdução 24

sendo consequentemente um copolímero de N-acetil-D-glicosamina e D-

glicosamina. Quitina e quitosana são quimicamente consideradas análogas a

celulose, em que o hidroxil do carbono-2 é substituído pelo acetamida e grupos

aminas, respectivamente. Quitosana é insolúvel em água, mas a presença de grupos

amina torna solúvel em soluções ácidas em pH próximo a 6.5 [20-23].

Figura 4 - Estrutura da quitina, quitosana e celulose [20].

Materiais baseados em quitina e quitosana são aplicados em muitas áreas

como: estação de tratamento de água (remover metais pesados,

floculação/coagulação de tinturas e proteínas, processo de purificação de

membrana), indústria de alimentos (anticolesterol e gordura ligada, preservativo,

material de embalagem, aditivo de alimento animal), agricultura (semente e camada

de fertilizante, controlar agroquímico livre), indústria de polpa e papel (tratamento de

superfície, papel fotográfico), cosméticos e artigos para banho (hidratante, cremes

para o corpo e loção de banho) [20].

Para suporte de imobilização de enzimas a quitina e a quitosana são

usadas na forma de pós, flocos e géis com configurações geométricas diferentes. A

preparação de géis é promovida pelo fato de que a quitosana dissolve prontamente

Introdução 25

em soluções diluídas da maioria dos ácidos orgânicos, incluindo fórmico, acético,

tartárico, e ácido cítrico, para formar soluções viscosas que precipitam em um

aumento de pH. Frequentemente, diferentes tratamentos e modificações são

aplicados para promover géis estáveis e duráveis [20-23].

Neste trabalho utilizaremos a quitosana na forma de gel formando um

filme sobre a superfície do eletrodo.

1.4 Enzimas

Enzimas exibem características vantajosas em relação a catalise

convencional. Primeiro têm nível alto de eficiência catalítica, frequentemente

superior a catalisadores químicos, e alto grau de especificidade que permite a

discriminação não apenas entre reações, mas também entre substratos (substrato

específico), partes similares da molécula (regioseletividade) e entre isômeros ópticos

(estereoespecificidade). Geralmente as enzimas operam em condições moderadas

de temperatura, pressão e pH com velocidade de reação da ordem daquelas

alcançadas pelos catalisadores químicos em condições extremas [20].

Existem muitos problemas práticos no uso de enzimas: o alto custo de

isolamento e purificação, a instabilidade de suas estruturas quando são isoladas de

fontes naturais, sensibilidade a condições de processo e condições ópticas, e o fato

de que traços de algumas substâncias podem inibir sua ação [20].

Muitos métodos são propostos para superar essas limitações, um método

bem sucedido é a imobilização de enzimas, que pode ser realizada por vários

métodos, sendo classificados como método físico, onde há interações fracas entre o

Introdução 26

suporte e a enzima ou métodos químicos, onde há ligações covalentes formadas

com a enzima [20].

A imobilização de enzimas envolve efeitos agravantes para o desempenho

das enzimas. Comparando com as enzimas livres, é comum a maioria imobilizada

ter sua atividade diminuída e a constante de Michaelis aumentada. Estas alterações

resultam da mudança da estrutura da enzima devido ao procedimento de

imobilização e da criação de microambiente que a enzima trabalha, diferente da

solução estoque [20].

As enzimas imobilizadas são aplicadas principalmente em biossensores,

que são construídos pela integração de sistema biológico, no caso a enzima, como

transdutor. As enzimas na maioria dos casos são imobilizadas diretamente na ponta

de trabalho do transdutor ou sobre uma membrana polimérica que embrulha

firmemente a enzima.

A seguir vamos caracterizar as enzimas, citocromo c e glicose oxidase,

que foram utilizadas neste trabalho.

1.4.1 Citocromo c

O citocromo c (Cit c) é uma heme proteína que está associada à

membrana interna da mitocôndria. É uma proteína com alta solubilidade em água, ao

contrário de outros citocromos, e é um componente essencial da cadeia

transportadora de elétrons. É capaz de realizar oxidações e reduções, mas não se

liga ao oxigênio. Transfere elétrons entre o complexo citocromo c redutase e a

citocromo c oxidase. Portanto, o estudo eletroquímico do Cit c é muito importante.

Porém, é usualmente difícil para o Cit c transferir elétron a um eletrodo convencional.

Introdução 27

Para remediar este problema, vários promotores, como surfactantes, biopolímeros,

nanopartículas, polieletrólitos, líquidos iônicos, tem sido empregados para promover

a transferência direta de elétron entre o Cit c e o eletrodo, na figura 5 podemos

observar o funcionamento de um biossensor baseado na imobilização do Cit c [43].

Figura 5 - Esquema de funcionamento do biossensor com citocromo c imobilizado sobre um eletrodo, onde C é o eletrodo Carbono vítreo e M é a modificação feita na superfície.

Pela figura acima, constatamos que o Cit c tem em seu centro ativo o ferro

que é reduzido e oxidado na superfície do eletrodo modificado. Este é o esquema de

funcionamento do biossensor.

1.4.2 Glicose oxidase

A glicose oxidase é uma flavoproteína que catalisa a oxidação da β-D-

glicose a D-Glucomo-δ-lactona e H2O2 usando oxigênio como elétron aceptor. Esta

reação pode ser dividida em etapa redutiva e oxidativa (figura 6). Na reação metade

redutiva, GOx catalisa o oxigênio da β-D-glicose a D-Glucomo-δ-lactona, com

Introdução 28

hidrólise não enzimática do ácido glucônico. Subsequentemente, a adenina flavina

dinucleotídeo (FAD) rodeando a GOx é reduzida a FADH2. Na metade da reação

oxidativa, a redução da GOx é re-oxidada pelo oxigênio a H2O2. O H2O2 é clivado a

catálise para produção de água e oxigênio [44].

Figura 6 - Representação da reação de GOx [45].

Este é o esquema de reações químicas que acontecem com a GOx que

produz H2O2 que é detectado no final da reação, assim, o biossensor só terá

resposta se a reação química acima ocorrer.

Os biossensores compostos por glicose oxidase podem ser construídos

com diversos materiais combinados, como quitosana, nanotubo de carbono, líquidos

iônicos e nanopartículas de ouro [28, 29, 42, 49, 50].

1.5 Híbrido

Mediadores eletroquímicos inorgânicos que catalisam a oxidação e a

redução do peróxido de hidrogênio têm sido utilizados como base para

Introdução 29

biossensores, já que diminuem o potencial aplicado e consequentemente evitam

muitos interferentes eletroquímicos. Nesta perspectiva, hexacianoferratos e em

particular o Azul da Prússia (hexacianoferrato férrico - AZ) é usado em grande

escala, durante a reação redox do hexacianoferrato, a compensação de carga é

dada pela inserção e ejeção de contra-íons de metal alcalino. No caso específico do

Azul da Prússia, a atividade eletroquímica é suportada pela presença de K+, Rb+,

Cs+ e NH4+. Na+, Li+, H+ e todos os cátions do grupo II bloqueiam a atividade do Azul

da Prússia. Uma alternativa para evitar o bloqueio é utilizar hexacianoferrato de

níquel (NiHCNFe), hexacianoferrato de cobalto (CoHCNFe) e hexacianoferrato de

cobre (CuHCNFe) [26, 27, 46, 47]. A seguir temos o esquema do sistema de oxi-

redução do eletrodo com o AZ.

Figura 7 – Biossensor com o Azul da Prússia e enzima oxidase [46].

A sensibilidade alcançada por estes materiais durante a detecção de

H2O2, mesmo contendo K+, é menor que os medidos com o azul da Prússia

modificando eletrodos. Para superar este problema têm sido desenvolvidos materiais

híbridos inorgânicos/orgânicos para tentar obter um reforço ou sinergia entre eles.

Alguns hexacianoferratos de metal NiHCNFe e CuHCNFe, têm sido introduzidos em

Introdução 30

uma matriz com polipirrol criando um material híbrido de hexacianoferrato de

cobre/polipirrol (CuHCNFe/ppi) e hexacianoferrato de níquel/polipirrol (NiHCNFe/ppi)

com características mecânicas e eletroquímicas melhores [26, 27, 47].

Objetivos 31

2 OBJETIVOS

Desenvolver um biossensor utilizando um composto formado por uma

biomolécula (citocromo c ou glicose oxidase) e líquido iônico (BMMIBF4 ou

BMMITFSI), para futuras aplicações em soluções aquosas.

O objetivo específico é:

A imobilização da biomolécula do sistema eletrodo/biomolécula/líquido iônico

por quitosana analisando a atividade redox (via voltametria cíclica e

cronoamperometria) desses eletrodos modificados.

Parte Experimental 32

3 PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Eletrodos utilizados

Eletrodo de carbono vítreo de área 0.0707cm2 previamente polido com

alumina 1, 0.3 e 0.05µm e em seguida foi levado ao banho de ultrassom 10 minutos

com etanol e 10 minutos com água deionizada antes de ser modificado.

3.2 Reagentes

Os reagentes listados na tabela 1 foram utilizados sem purificação prévia.

Tabela 1 - Tabela de reagentes utilizados.

Reagente Fórmula Massa Molar / g mol-1

Teor % Procedência

Acetonitrila CH3CN 41.05 99.5 Synth Ácido tetrafluorbórico HBF4 87.81 48% Aldrich

1-Bromobutano CH3(CH2)3Br 137.03 99.0 Aldrich Bis(trifluorometanosulfonil)imideto

de Lítio (CF3SO2)2NLi 287.08 97.0 Aldrich

Cloreto de potássio KCl 74.55 99-100.5 Synth Cloreto de sódio NaCl 58.44 99 Synth

Cloreto de cobre II CuCl2.2H20 170.48 99 Cromoline Diclorometano CH2Cl2 84.93 99.5 Synth

1,2-dimetilimidazol C5H8N2 96.13 98.0 Aldrich Ferricianeto de potássio K3Fe(CN)6 329.25 99 Synth

Fosfato de sódio monobásico NaH2PO4.H20 98-102 Reagen

Fosfato de sódio bibásico heptahidratado

Na2HPO4.7H20 268.07 98-102 Nuclear

D-glicose C6H12O6 180.16 - Synth Pirrol* C4H5N 67.09 98 Aldrich

Sulfato de Magnésio MgSO4 anidro 120.37 >97.0 Synth

* O pirrol foi destilado e estocado na geladeira.

Foi utilizado Citocromo c proveniente de coração de cavalo com pureza de

99%, com 7.2% de água procedente da Sigma; glicose oxidase 174400 unidades g-1


da Sigma; glutaraldeído 25%, 1L=1.06Kg da Merck; peróxido de hidrogênio (H2O2)

30% em peso, 34.02%, Sigma-Aldrich; e quitosana (C12H24N2O9) 75-85% de

desacetilação da Aldrich.

3.3 Instrumentação

VOLTAMETRIA CÍCLICA: Utilizamos um potenciostato da Eco Chemie,

Autolab PGSTAT 30. A cela eletroquímica usada nos experimentos de voltametria

cíclica consistia em uma cela de vidro com três eletrodos com capacidade

aproximada de 5mL.

CRONOAMPEROMETRIA: Os experimentos de cronoamperometria foram

realizados nas mesmas condições que a voltametria cíclica.

ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO (FIA): Os aparatos usados para os

experimentos de injeção de fluxo foram uma válvula de injeção manual de fabricação

caseira, uma célula eletroquímica montada em uma configuração de jato de parede

e a solução foi propulsada com o auxílio de uma bomba peristáltica. A detecção

eletroquímica (cronoamperometria) foi realizada em um potenciostato da Eco

Chemie Autolab PGSTAT 30.


3.4 Enzimas

3.4.1 Preparação e caracterização de líquidos iônicos

Os líquidos iônicos foram preparados em duas etapas consecutivas, sendo

a primeira relacionada à quaternização de aminas seguido por uma reação de troca

iônica, conforme mostrado na figura 8.

Figura 8 – Preparação dos líquidos iônicos.

A amina (1.2-dimetilimidazol), o haleto de alquila (1-bromobutano) e o sal

para troca iônica (HBF4 e o LiTFSI) são disponíveis comercialmente e serão

utilizadas após purificação prévia.

Em um balão de fundo redondo conectado a um condensador de refluxo

adicionamos 10mmol de 1.2-dimetilimidazol e 10mmol de 1-bromobutano. A mistura

foi então aquecida a 100ºC em banho de óleo sob agitação. Ao resfriar obteve-se um

sólido branco que foi recristalizado com acetonitrila e seco a pressão reduzida,

obtendo assim o brometo de 1-butil-2.3-dimetilimidazol (BMMIBr), com rendimento

de 95%.

Em outro frasco dissolvemos 5mmol do BMMIBr obtido em 5mL de água e

foi adicionado a uma solução de 5mmol de ácido tetrafluorbórico (HBF4) ou

bis(trifluorometanosulfoni)imedeto de lítio (LiTFSI) dissolvidos em 5mL de água. Esta


mistura reacional foi deixada sob agitação por 3 horas onde foi observada a

formação de duas fases heterogêneas. A esta mistura foi adicionado 15mL de

diclorometano para auxiliar na separação dos compostos e em seguida foi colocado

em um funil de separação.

No caso do BMMIBF4 separamos a fase orgânica e fizemos lavagens da

fase aquosa com diclorometano separando a fase orgânica. O LI embora seja

hidrofílico ele tem uma afinidade maior pelo diclorometano. No caso do BMMITFSI a

fase contendo o líquido iônico foi lavada várias vezes com água, desprezando-se a

fase aquosa, pois ela contém as substâncias resultantes da reação (LiBr).

Na fase orgânica resultante das lavagens com diclorometano,

adicionamos sulfato de magnésio anidro, como secante, e em seguida efetuou-se

uma filtração simples. Finalmente o diclorometano foi retirado via sistema de

evaporação à pressão reduzida, e os líquidos iônicos BMMIBF4 e BMMITFSI obtidos

foram colocados para secar em estufa a 100ºC à pressão reduzida por três dias.

Este método de preparo dos líquidos iônicos foi desenvolvido no

laboratório [53, 54, 55].

3.4.2 Preparação da quitosana

A solução de quitosana 0.5wt% foi preparada a partir da dissolução de

5mg de quitosana em 1mL de ácido clorídrico 0.5mol L-1 e o pH foi ajustado para

pH5 com a utilização de NaOH 1mol L-1 em seguida a solução foi filtrada em uma

seringa de 5mL contendo algodão na parte inferior e a solução foi estocada na

geladeira quando não utilizada.


3.5 Preparação do híbrido

Preparamos soluções de ferrocianeto de potássio (K3Fe(CN6)) 0.02mol L-1

com cloreto de potássio (KCl) 0.1mol L-1 e cloreto de cobre II (CuCl2) 0.02mol L-1

com KCl 0.1mol L-1.

Adicionamos 0.015mol L-1 de pirrol destilado a 10mL da solução

K3Fe(CN)6 e aplicamos 10 ciclos de voltametria cíclica de 0.95 a -0.25V com

velocidade de varredura de 50mV s-1.

Após, colocarmos o eletrodo mergulhado em solução de CuCl2 0.02mol L-1

por 2 horas e na sequência realizamos a 20 ciclos de voltametria cíclica de 0.95 a -

0.25V com velocidade de varredura de 50mV s-1.

Com isso temos o eletrodo modificado com o híbrido CuHFeCN/ppi. Esta

técnica foi desenvolvida em nosso laboratório [26, 27, 47].

Resultados e discussões 37

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Citocromo c

A princípio utilizamos o citocromo c para estudar a interação com o líquido

iônico já que muitos trabalhos foram desenvolvidos usando esta biomolécula em

conjunto com líquido iônico e quitosana [24, 43, 48, 56-58].

Baseado nos resultados obtidos no trabalho de Zhang e Zheng (2008) [48]

preparou-se uma solução contendo 170µL de quitosana 0.5wt%, 100µL de citocromo

c 10mg mL-1, 830µL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 e 8% v/v de BMMIBF4 adicionando-se

5µL dessa mistura sobre o eletrodo de carbono vítreo previamente polido e tratado,

deixando-o secar em temperatura ambiente. Após seco, aplicamos voltametria

cíclica em meio de PBS e o resultado é mostrado na figura 9 a seguir. Antes de

medir, borbulhamos N2 por 30min, para reduzir a quantidade de O2 presente em

solução.

-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2

-8

-6

-4

-2

0

2

I /

A

E / V vs. Ag/AgCl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 9 – Voltametria cíclica em PBS 0.1mol L-1 do eletrodo contendo 5L da solução (170µL de

quitosana 0.5wt% + 100µL de citocromo c 10mg mL-1 + 830µL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 8% v/v de

BMMIBF4) ciclando várias vezes em velocidade de varredura de 100mV s-1.


Quando colocamos o eletrodo no tampão para realizarmos a medida,

observamos que ocorreu o desprendimento do filme, que é confirmado pela redução

da corrente na figura 9, podemos comparar com o resultado obtido por Zhang e

Zheng (2008) [48] da figura 10 a seguir.

Figura 10 – Voltametria cíclica de a) Cit c/GC; b) Qui-LI-MWNTs/GC; c) Qui-cit c-MWTNs/GC e d) Qui-cit c-LI-MWNTs/GC em PBS 0.1mol L-1 pH7.0. Imagem retirada da referência [48].

Os resultados obtidos na figura 9 mostram que na ausência de nanotubos

de carbono não há a transferência direta de elétrons do citocromo c, enquanto que

na figura 10, obtida pelos autores, vemos que a transferência direta de elétrons esta

presente. Isto sugere que não é a presença do líquido iônico que leva a

transferência direta de elétrons e sim a presença dos nanotubos de carbono. Se

observarmos a figura 9 há um pico de redução próximo ao potencial de -0.4V e na

figura 10 tem-se um pico de redução e de oxidação próximo ao potencial de -0.2V,

que caracteriza a transferência direta de elétrons do citocromo c. Provavelmente o

pico de redução que observamos na figura 9 é devido à redução do O2 presente em


solução, pois mesmo borbulhando N2 antes da medida, um pouco de O2 continua

dissolvido já que a medida é feita sem borbulhar N2.

Outros testes foram realizados modificando as quantidades de quitosana,

citocromo c e líquido iônico, para confirmar o resultado obtido, como é mostrado na

tabela 2.

Tabela 2 – Modificações feitas no eletrodo de carbono vítreo

Qui 0.5wt%/ µL Cit c 10mg mL-1 / µL BMMIBF4 / % v/v PBS 0.1mol L-1 pH7.0 / µL

170 100 8 830 170 100 5 300 100 3 300 100 1 300 100 5

Em todas as modificações feitas os voltamogramas obtidos foram

semelhantes aos obtidos na figura 9, exceto que no caso do eletrodo contendo 3%

de líquido iônico não houve desprendimento total do filme. Com isso, constatamos

que não foi observada a transferência direta de elétrons do citocromo c devido à

presença do líquido iônico.

Podemos então partir para o estudo da interação da glicose oxidase com o

líquido iônico, cuja detecção de glicose é feita pelo monitoramento da quantidade de

peróxido de hidrogênio.

Para o estudo com a glicose oxidase a técnica de voltametria cíclica não é

satisfatória porque a resposta é muito pequena, sendo muitas vezes necessário o

uso de outros artifícios como os nanotubos de carbono ou nanopartículas para se

obter uma resposta melhor. Assim, para realizar os testes de detecção partimos para

outra técnica, a cronoamperometria, e a fim de determinar o potencial de resposta do


eletrodo de carbono vítreo realizamos uma voltametria cíclica aplicando potencial de

-0.8 a 1.2V com velocidade de varredura de 100mV s-1, com adições de 1mmol L-1

de H2O2.

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5-40

-20

0

20

40

60

80

0mmol L-1

1mmol L-1

5mmol L-1

10mmol L-1

1,0

0

I /

A

E / V vs. Ag/AgCl

I /

A

E / V vs. Ag/AgCl

Figura 11 – Voltametria cíclica do eletrodo de carbono vítreo na detecção de H2O2 em meio de PBS

0.1mol L-1 pH7.0 com velocidade de varredura de 100mV s-1.

O voltamograma obtido mostra que na região de 0.7 a 1.2V ocorre o

aumento de potencial com a adição de H2O2, logo podemos aplicar o potencial nesta

faixa para a cronoamperometria.


4.2 Glicose oxidase

Antes de iniciar os estudos com a glicose oxidase é importante lembrar

que a detecção da glicose é feita de forma indireta pela detecção de peróxido de

hidrogênio como é mostrado no esquema a seguir, na figura 12.

Figura 12 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico de glicose.

O esquema mostra que a reação da glicose com a enzima promove a

formação de H2O2 que é detectada pelo eletrodo, por isso dizemos que a detecção

da glicose é indireta.

A partir dos resultados obtidos com o citocromo c (quantidade de

quitosana e líquido iônico que não desgruda do eletrodo), preparou-se um eletrodo

contendo 5µL de solução 300µL de quitosana 0.5wt%, 80µL de glicose oxidase

10mg mL-1 e 3% v/v BMMIBF4. Após secar 24 horas na geladeira realizou-se a

cronoamperometria em meio de PBS 0.1mol L-1 pH7.0. O potencial aplicado variou

de 0.7 a 1.0V e os resultados obtidos são mostrados a seguir.


A

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

i / n

A

t / s

B

0 1000 2000 3000 4000 50000

5

10

15

20

25

30

i / n

A

t / s

C

0 1000 2000 3000 4000 5000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

i / n

A

t / s

D

0 1000 2000 3000 4000 50000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

i / n

A

t / s

Figura 13 – Cronoamperometria com potencial aplicado de: (A) 0,7V; (B) 0,8V; (C) 0,9V e (D) 1,0V

no eletrodo contendo 5µL de solução (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 10mg mL-1

+ 3% v/v BMMIBF4), com adições 0.1mmol L-1 de glicose.

Para o potencial de 0.7 e 0.8V não observamos resposta significativa do

biossensor, a corrente aumenta pouco com as adições. Enquanto que para o

potencial de 0.9 e 1.0V observa-se que embora a corrente seja significativa, não há

a formação de patamares de corrente. Isto pode ocorrer porque a transferência de

carga pode não ser efetiva.


Para melhorar este problema, podemos colocar sobre a superfície do

carbono vítreo um filme híbrido que facilita a transferência de carga do eletrodo,

como é mostrado na figura 14.

Figura 14 – Representação esquemática de um biossensor amperométrico baseado na detecção de glicose medida pelo híbrido.

Quando colocamos o híbrido sobre a superfície do eletrodo de carbono

vítreo a redução do peróxido de hidrogênio é catalisada, já que diminui o potencial

aplicado e consequentemente evita muitos interferentes eletroquímicos.

A formação do híbrido (HCuFeCN/ppi) consiste de 3 etapas:

1) Voltametria cíclica aplicando potencial de -0.25 a 0.95V em meio de

K3Fe(CN)6 0.02mol L-1, KCl 0.1mol L-1 e pirrol 0.015mol L-1, 10 ciclos com velocidade

de varredura de 50mV s-1;


-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

i / m

A

E / V vs. Ag/AgCl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 15 – Voltametria cíclica em meio de K3Fe(CN)6 0.02mol L-1, KCl 0.1mol L-1 e pirrol 0.015mol L-

1, 10 ciclos com velocidade de varredura de 50mV s-1.

2) O eletrodo da etapa 1 é mergulhado em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e

KCl 0.1mol L-1 por 2 horas;

3) Voltametria cíclica em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e KCl 0.1mol L-1

usado na etapa 2, nas mesmas condições da etapa 1, porém 20 ciclos.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

i / m

A

E / V vs. Ag/AgCl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

i / m

A

E / V vs. Ag/AgCl

2 4 8 12 16 20

Figura 16 – Voltametria cíclica em meio de CuCl2 0.02mol L-1 e KCl 0.1mol l-1, 20 ciclos com

velocidade de varredura de 50mV s-1.


O híbrido que utilizamos neste trabalho foi desenvolvido em nosso grupo

de pesquisa por Fiorito (2005) [47], o autor realizou estudos referente a sensibilidade

do híbrido a detecção de peróxido de hidrogênio e encontrou os valores de 0.14µA

mmol-1 L cm-2 para o eletrodo que contém CuHCNFe e encontrou 899.41µA mmol-1 L

cm-2 para o eletrodo com CuHCNFe/ppi, comprovando o fato de que o híbrido

catalisa a redução do peróxido de hidrogênio.

O eletrodo de carbono vítreo modificado com o híbrido foi então submetido

a modificações com glicose oxidase e quitosana como é mostrado a seguir.


4.2.1 Modificações realizadas no biossensor de glicose

Vários testes foram realizados modificando a quantidade de enzima, de

quitosana e também de líquido iônico. O resultado obtido modificando a

concentração de glicose oxidase é mostrado a seguir na figura 17.

A

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

j - j 0 /

A c

m-2

t / s

B

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

j - j 0 /

A c

m-2

t / s

C

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600-8

-6

-4

-2

0

2

j - j 0 /

A

cm

-2

t / s

Figura 17 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo de carbono vítreo com o híbrido contendo 5µL de

solução A (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase 10mg mL-1); B(300µL de quitosana

0.5wt% + 80µL glicose oxidase 5mg mL-1); C (300µL de quitosana 0.5wt% + 80µL glicose oxidase

2.5mg mL-1) . Adições de 0.1mmol L-1 de glicose.

Para a figura 17 observamos que para a concentração de glicose oxidase

de 10mg mL-1 a resposta é melhor do que para a concentração de 5mg mL-1 e 2.5mg


mL-1, não foi possível calcular a sensibilidade já que os gráficos obtidos não

fornecem valores apropriados para traçar uma reta.

Nas medidas realizadas anteriormente, observamos que não se forma

patamares de corrente quando adicionamos a glicose. A fim de evitar este problema

fizemos a modificação da quantidade de quitosana, esperando que o problema

diminuísse.

Tabela 3 – Modificação da quantidade de quitosana.

Qui 0.5wt%/ µL GOx 10mg mL-1 / µL BMMIBF4 / % v/v 300 80 150 80 80 80 80 80 3 40 80 3 20 3

Para as modificações realizadas constatou-se que não ocorre a

estabilização dos patamares de corrente, os cronoamperogramas obtidos foram

semelhantes aos obtidos na figura 17. No caso do eletrodo com 20µL de quitosana o

filme desgrudou do eletrodo e não foi observada nenhuma resposta de corrente

significativa. O problema persiste mesmo modificando a concentração de enzima e a

quantidade de quitosana, portanto decidimos modificar a forma de imobilização da

enzima.

Alguns trabalhos foram desenvolvidos utilizando o híbrido e o glutaraldeído

como forma de imobilizar a glicose oxidase [26, 27], decidimos então constatar se é

possível imobilizar a enzima juntamente com glutaraldeído e líquido iônico e se o

problema da não formação de um patamar de corrente será minimizado.


4.2.2 Adição de glutaraldeído substituindo a quitosana

O glutaraldeído forma ligações covalentes com grupos amina residuais

livres de enzimas, como é mostrado na figura 18, muito estável do ponto de vista

mecânico alterando a estrutura secundária da proteína [59].

Figura 18 – Ligação cruzada envolvendo a reação entre glutaraldeído e os grupos amina residuais livres de enzimas [47].

Preparamos uma solução de glutaraldeído 2.5% v/v em água, em seguida

fizemos uma solução contendo BSA e GOx em PBS 0,1mol L-1 pH7,0 e

acrescentamos 3% v/v de BMMIBF4.

Em um eletrodo acrescentamos 10µL de uma mistura de 10µL de

glutaraldeído e 25µL de solução BSA, GOx, BMMIBF4. Em outro eletrodo

acrescentamos 10µL de uma mistura contendo 10µL de glutaraldeído e 25µL de

solução GOx, BMMIBF4. Os resultados obtidos estão a seguir na figura 19.


A

0 200 400 600 800 1000-1,50

-1,45

-1,40

-1,35

-1,30

-1,25

-1,20

-1,15

-1,10

i /

A

t / s

B1

0 500 1000 1500 2000-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

j - j 0 /

A c

m-2

t / s

B2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

1

2

3

4

5

6

Y = A + B * XParameter Value Error---------------------------------------------A -0,38 0,16B 7,90 0,33---------------------------------------------

R SD N P---------------------------------------------0,99 0,25 9 <0.0001---------------------------------------------

j- j 0 /

A

cm-2

[glicose] / mmol L-1

Figura 19 – O gráfico A representa a cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido e com a mistura de 10µL de solução 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de (40mg de BSA + 10mg

GOx + 1mL de PBS 0.1mol L-1 pH7 + 3% v/v BMMIBF4). O gráfico B1 representa a cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido com o híbrido e com a mistura de 10µL

de solução 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v + 25µL de (10mg GOx + 1mL de PBS 0.1mol L-1 pH7.0 + 3% v/v BMMIBF4). E o gráfico B2 representa sensibilidade. Realizaram-se adições de 0.1mmol L-1 de

glicose.

Observamos que para a medida feita com o eletrodo contendo BSA e

líquido iônico não há o aumento de corrente conforme acrescentamos a glicose, o

que sugere que o BSA interfere na resposta do líquido iônico. Quando retiramos o

BSA vemos que a resposta melhora e temos uma sensibilidade de 7.90µA cm-2

mmol-1 L, que difere muito dos resultados obtidos com quitosana. Podemos fazer


uma comparação com o eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de

GOx e glutaraldeído. E o resultado obtido esta na figura a seguir.

C1

0 500 1000 1500 2000 2500 3000-10

-8

-6

-4

-2

0

j - j 0 /

A

cm-2

t / s

C2

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

0

2

4

6

8

10

Y = A + B * XParameter Value Error--------------------------------------------A -0,223 0,104B 7,48 0,148--------------------------------------------R SDN P--------------------------------------------0,998 0,199 13 <0.0001--------------------------------------------

j - j 0 /

A

cm-2


Figura 20 – Cronoamperometria a 0V do eletrodo modificado com o híbrido e com uma mistura de 10µL de solução 25µL de GOx 10mg mL-1 + 10µL de glutaraldeído 2.5%v/v.C1 é a detecção e C2 é a

sensibilidade. Adições de 0.1mmol L-1 de glicose.

Quando comparamos o resultado obtido na presença de líquido iônico e

na ausência dele (figura19B e figura 20) vemos que a sensibilidade obtida na

presença do líquido iônico é maior do que a obtida em sua ausência. Porém a

diferença é muito pequena, para melhorar a sensibilidade, decidimos modificar

alguns parâmetros como é mostrado na tabela 4 a seguir. Foram calculados além da

sensibilidade o limite de detecção e o tempo de resposta. A estabilidade de um

biossensor está diretamente relacionada com o tipo de imobilização da camada do

material biológico, outro fator que altera a estabilidade de alguns biossensores é a

perda do cofator dos sítios ativos das enzimas que dele necessitam para a sua

atividade [59-61].

A sensibilidade é o intervalo de concentração linear das curvas de

calibração no estado estacionário determinada pelo de gráfico de (j-j0) /c ou (j-j0)/log


c/c0 versus log c/c0. A sensibilidade descreve quanto a resposta (corrente) varia

com a variação da concentração do analito, pode ser expressa como a inclinação da

curva analítica (coeficiente angular), expresso pela equação S=dx/dc, onde

dx:variação da resposta e dc:variação da concentração. O limite de detecção é o

mínimo de concentração da substância em análise que pode ser detectada. O tempo

de resposta de um biossensor é afetado por vários fatores, tais como: velocidade de

agitação da solução, concentração do substrato, concentração da biomolécula, pH e

temperatura[59, 60].

Tabela 4 – Modificação das quantidades de glutaraldeído, glicose oxidase e líquido iônico.

Biossensor Sensibilidade / µA cm-2 mmol-1 L

LD / µmol L-1 tr / s

10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 3%BMMIBF4)

7.90 151.2 14.8


10.4 190 15.4


- - -

2.5µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4)

5.61 177.5 38


7.03 78.9 23.2


9.60 89.4 25.4

10µL Glut + 25µL (GOx 2.5mg mL-1 + 4%BMMIBF4)

11.4 73.7 27.8

10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1) 7.48 42.5 71.6

Todos os eletrodos da tabela 4 foram modificados com o híbrido antes da

adição da mistura contendo glutaraldeído, glicose oxidase e líquido iônico. Foi

adicionado sobre o eletrodo 10µL dessa mistura esperando-o secar 24h em

temperatura ambiente antes da cronoamperometria.


Comparando as sensibilidades o eletrodo que contem 2.5mg mL-1 de GOx

apresentou a maior sensibilidade, 11.4µA cm-2 mmol-1 L, e o eletrodo que contem

2.5µL de Glut apresentou a menor sensibilidade, 5.61µA cm-2 mmol-1 L. No caso do

limite de detecção o eletrodo que não contem líquido iônico apresentou o menor

limite de detecção, porém, neste caso temos que lembrar que este eletrodo contem

maior quantidade de enzima já que não tem líquido iônico e isso pode favorecer o

limite de detecção, já que uma quantidade maior de biomolécula normalmente

acarreta em menor limite de detecção. Agora, comprando os outros eletrodos, o que

contem 2.5mg mL-1 de GOx apresentou o menor LD, 73.7µmol L-1; em relação ao

tempo de resposta, o melhor resultado foi obtido para o eletrodo com 3% de

BMMIBF4.

Se analisarmos com maior detalhe os resultados obtidos, vemos que eles

não diferem muito, e que podem ser melhorados. Com este intuito, resolvemos

modificar a forma de adição do glutaraldeído.


4.2.3 Variação da forma de adição do glutaraldeído

Realizamos o teste em que ao invés de misturarmos o glutaraldeído com a

enzima e o líquido iônico optamos por colocá-lo por cima do eletrodo e o resultado

obtido esta a seguir, na figura 21.

A1

0 800 1600

-12

-6

0

j - j 0 /

A c

m-2

t / s

A2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-2

0

2

4

6

8

10

12

14

Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 0,07279 0,05562B 17,06625 0,11683------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0,99984 0,09049 9 <0.0001------------------------------------------------------------

j - j 0 /

A c

m-2


B1

0 500 1000 1500 2000-25

-20

-15

-10

-5

0

5

j - j 0 /

A

cm

-2

t / s

B2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

5

10

15

20

25

Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------A -0,2717 0,1329B 22,98668 0,3177------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0,99943 0,20589 8 <0.0001------------------------------------------------------------

j - j 0 /

A c

m-2


Figura 21 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4, após seco acrescentou-se 2(A) ou 10(B)µL de glutaraldeído 2.5%v/v

em água.


Não há uma diferença significativa na sensibilidade entre o eletrodo que

contem 2 ou 10µL de glutaraldeído, porém no eletrodo que contem 10µL

observamos que há um problema na estabilização dos patamares no final da

medida, que não é observado para o eletrodo com 2µL. Determinado a quantidade

de glutaraldeído podemos comprar com eletrodo sem o líquido na figura 22.

0 500 1000 1500 2000-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

j - j 0 /

A

cm-2

t / s

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-2

0

2

4

6

8

10

12

14

Y = A + B * XParameter Value Error----------------------------------------------A -0,352 0,224B 14,6 0,421----------------------------------------------R SD N P----------------------------------------------0,997 0,382 10 <0.0001

j - j 0 /

A c

m-2


Figura 22 – Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, o eletrodo foi preparado a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg

mL-1 de GOx, após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v em água.

Vemos que a sensibilidade para o eletrodo sem o líquido iônico (figura 22)

foi de 14.6µA cm-2 mmol-1 L enquanto que para o eletrodo com o líquido iônico

(figura 21A) foi de 17.1µA cm-2 mmol-1 L.

Os resultados obtidos adicionando glutaraldeído por cima, levam aos

seguintes limites de detecção e tempo de resposta mostrados na tabela 5.


Tabela 5 – Modificação da forma de adição do glutaraldeído.

Biossensor Sensibilidade / µA cm-2 mmol-1 L

LD / µmol L-1 tr / s

5µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4) depois de seco 2µL de Glut

17.1 38.8 12.4

5µL (GOx 10mg mL-1 + 4%BMMIBF4) depois de seco 10µL de Glut

23.0 61.6 10.8

5µL (GOx 10mg mL-1) depois de seco 2µL de Glut

14.6 13.7 36.2

10µL Glut + 25µL (GOx 10mg mL-1) 7.48 42.5 71.6

A sensibilidade do eletrodo com 2µL de glutaraldeído foi 17.1µA cm-2

mmol-1 L e o com 10µL foi 23.0µA cm-2 mmol-1 L, mas o limite de detecção é menor

para o de 2µL, 38.8µmol L-1 e o tempo de resposta entre eles é praticamente igual.

Comparando com o eletrodo que não contem o LI e com o eletrodo em que

misturamos todas as substâncias, o eletrodo em que acrescentamos o glut

posteriormente apresenta melhor desempenho, já que todos os parâmetros são

melhorados. Podemos retirar uma informação muito importante deste fato,

adicionando o glutaraldeído posteriormente observamos que a interação da

biomolécula com líquido iônico é mais eficiente do que quando temos o glutaraldeído

misturado com a glicose oxidase e o líquido iônico, o fato da sensibilidade aumentar

mostra que a interação da biomolécula com o líquido iônico é benéfica.

DiCarlo et. al (2006) [62] fez um estudo em que analisa a interação do

citocromo c com diferentes líquidos iônicos, e ele constatou que ocorre uma

mudança na estrutura secundária da proteína dependendo do líquido iônico usado, e

afirmou que para evitar a perda de sinal redox em líquidos iônicos, a adição de

grupos de proteção para a proteína pode ser explorado para determinar se a

estrutura secundária de proteínas pode ser protegida da interação com os

componentes dos líquidos iônicos.


Wu et. al (2008) [42] fez um estudo da relação entre o líquido iônico

(BMMIBF4) e a glicose oxidase, e constatou que não há mudança de conformação

da estrutura secundária da proteína, os resultados obtidos pelos autores esta nas

figuras 23, 24 e 25.

Figura 23 - Espectro de UV–vis da GOx em PBS contendo 0 vol% (a), 2 vol% (b), 5 vol% (c)10 vol%

(d), 15 vol% (e), e 20 vol% (f) de BMMIBF4. Esta imagem foi retirada da referência 42.

Pela figura 23 vemos que conforme o autor aumentou a quantidade de

líquido iônico na solução o espectro de UV-vis não apresentou mudanças. Ele

sugere que grupos cromóforos da flavina adenina dinucleotídeo (FAD), que

responderam ao espectro de absorção da GOx, foram incorporados na matriz

polipeptídio. Esses grupos não são liberados quando em contato com o líquido

iônico. Alem disso, as bandas de adsorção em ~278nm para as misturas BMMIBF4-

PBS (figura 23b-f) foram as mesmas registradas em PBS puro (na ausência de

BMMIBF4, figura 23a). Esta banda é característica dos picos de cadeias

polipeptídicas da enzima. Estes resultados apóiam o fato de que a GOx manteve a

sua estrutura conformacional nativa na mistura BMMIBF4-PBS [42].


Figura 24 - Espectro de dicroísmo circular (CD) da GOx PBS (0.1M, pH8.2) contendo 0 (preto), 2 (vermelho), 5 (verde), 10 (azul), 15 (azul claro), e 20 vol% (lilás) de BMMIBF4 na região UV-distante

(A)e UV-perto (B).Estas imagens foram retiradas da referência 42.

A figura 24 registrada por Wu et. al (2008) [42] mostra que o espectro de

dicroísmo circular na região UV-distante (200-250nm) corresponde ao peptídeo na

transição eletrônica n π*. O espectro nesta região é sensível a mudanças

conformacionais da enzima e vemos que os picos são invariáveis com o aumento da

quantidade de líquido iônico (figura 24A), indicando que a estrutura secundária e a

conformação da GOx em misturas de BMMIBF4-PBS são essencialmente a mesmas

da enzima nativa. O espectro de CD na região de (250-300nm) também não sofre

mudanças (figura 24B). Estes resultados sugerem que o microambiente do sítio ativo

da GOx nas misturas também permanece já que não se observa sinais de

desnaturação da GOx, devido a dissociação da FAD da enzima.


Figura 25 - Espectro Raman de (a) 10mM glicose em PBS 0.1mol L-1; (b) Mistura GOx-BMMIBF4–PBS contendo 20 vol% de BMMIBF4 ; e (c) Espectro Raman do BMMIBF4 registrado na mistura BMMIBF4–PBS (20 vol% BMMIBF4). O espectro foi registrado usando energia de excitação em

514.5nm. Esta imagem foi retirada da referência 42.

O espectro Raman registrado por Wu et. al (2008) [42] como é mostrado

na figura 25, serve para estudar a interação da glicose com o BMMIBF4. O espectro

Raman de 10mM glicose em 0.1mol L-1 de PBS (figura 25a), e da mistura BMMIBF4-

PBS (20% vol de BMMIBF4, figura 25b) foram registrados. Para comparação, o

espectro Raman do BMMIBF4 em PBS 0.1mol L-1 (20% vol BMMIBF4, figura 25c)

também foi registrado. Nenhuma banda foi observada no espectro Raman do

BMMIBF4 em abaixo do comprimento de onda de 1.000cm-1 (Fig. 25c). No entanto,

várias bandas (~ 1020, 1390, 1420, e 1567 cm-1) apareceram quando o comprimento

de onda foi superior 1.000 cm-1. Estas bandas foram atribuídas ao espalhamento

Raman do imidazólio. Fig. 25a mostra o espectro Raman da glicose no PBS.

Existem várias bandas Raman (~ 416, 515, 557, 764, 858, e 915 cm-1) medidas

abaixo do comprimento de onda de 1000 cm-1. Estas bandas são as impressões

digitais da glicose. Fig. 25b representa o espectro de Raman da glicose em mistura

BMMIBF4-PBS. É mostrado pelo espectro que a posição e forma das bandas Raman


para BMMIBF4 foram quase as mesmas na fig. 25c, e as bandas Raman

características da impressão digital de glicose também foram as mesmas na fig. 25a.

Os resultados indicaram que as características Raman da glicose não são afetadas

por BMMIBF4 e as características do BMMIBF4 também não foram afetados pela

glicose. Estes resultados sugerem não há interação entre glicose e o BMMIBF4.

Pelos experimentos realizados por Wu et. al (2008) [42] temos que o

BMMIBF4 não apresenta mudança na estrutura secundária da glicose oxidase. Isto

justifica o fato de que quando temos a mistura glicose oxidase, líquido iônico e

glutaraldeído a sensibilidade é menor do que quando temos uma mistura de glicose

oxidase e líquido iônico. Acontece que o glutaraldeído forma ligações cruzadas com

a enzima, como foi mostrado na figura 18, que são preferenciais em relação à

interação da biomolécula com o líquido iônico, quando fazemos a mistura apenas do

líquido iônico e da biomolécula, a enzima não sofre as alterações causadas pelo

glutaraldeído em sua estrutura secundária e por isso a sensibilidade aumenta.

Zhao et. al (2010) [63] realizou experimentos de dicroísmo circular e

espectroscopia de infra-vermelho para a glicose oxidase e para o compósito GOx-

CNTs e verificou que há uma mudança conformacional da biomolécula na presença

de nanotubos de carbono, a estrutura secundária da enzima é modificada. Podemos

então afirmar que não é a presença do líquido iônico em compósitos com nanotubos

e biomoléculas que faz com que a resposta do biossensor seja melhorada, mas

provavelmente as mudanças estruturais da biomolécula ocasionada pela presença

dos nanotubos. Em nosso sistema, o biossensor possui uma resposta melhor porque

como o líquido iônico não modifica a proteína, ela se mantém em um microambiente

favorável, tem sua atividade mantida e o glutaraldeído adicionado sobre a GOx e o

BMMIBF4 não ocasiona a formação das ligações cruzadas.


4.2.4 Cálculo da constante aparente de Michaelis-Menten (KMap)

Podemos determinar a constante aparente de Michaelis-Menten (KMap)

para o biossensor desenvolvido utilizando os dados da figura 21A.

KMap pode ser estimada através da curva analítica de calibração, uma vez

que é igual à concentração de substrato para a qual a velocidade da reação é a

metade da velocidade máxima. Portanto, se uma enzima tiver um valor pequeno de

KMap, ela atingirá a máxima eficiência catalítica em baixas concentrações de

substrato [64-[66]. Pelo método acima, o valor encontrado para KMap foi 4.2mmol L-1.

Uma maneira mais precisa de se determinar o valor de KMap é alcançada

através de um gráfico de 1/(j-j0) vs. 1/[glicose]. Nesse caso, é valida a equação 1.

0 0 0max max

1 1cos

MapKj j j j j j gli e

Equação 1 [65]

Seguindo a equação apresentada acima, foi possível construir o gráfico

apresentado na figura 26.

0 2 4 6 8 100,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------A 0,0112 0,00368B 0,0555 0,00102------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------0,998 0,00889 12 <0.0001------------------------------------------------

1 / (

j - j 0)

(A

cm-2)

1 / [glicose] (mmol L-1)

Figura 26 – Estimativa da constante aparente de Michalis-Menten.


Através do coeficiente angular da parte linear do gráfico, é possível

estimar o valor de KMap como sendo 4.9mmol L-1. Esse valor é próximo do obtido

pelo método descrito anteriormente, mas é mais preciso por considerar um número

maior de pontos.

Podemos comparar o resultado de KMap com outros sistemas

desenvolvidos para a detecção de glicose como é mostrado na tabela 6 a seguir.

Tabela 6 – Valores de KMap para outros sistemas.

Eletrodo modificado KMap / mmol L-1 Referência

GC/CuHFeCN/ppi/GOx/BMMIBF4/Glut 4.9 Este trabalho

GC/CNTs/Qui/GOx 8.2 [28]

GC/CNTs/GOx/FcA 4.5 [42]

nano-Au/Qui/BMMIBF4/GOx 7.8 [49]

Vemos que o valor de KMap obtido pelo biossensor estudado é

relativamente menor do que o de outros sistemas desenvolvidos na presença de

nanotubos ou nanopartículas. Como foi dito anteriormente, valores pequenos de

KMap significam que a enzima atingirá a máxima eficiência catalítica em baixas

concentrações de substrato.

A constante aparente de Michaelis-Menten é característica do filme sobre

o eletrodo, não da enzima, e usualmente difere substancialmente da constante da

enzima, medida em solução homogênea. O valor de KM da glicose oxidase ativa em

solução é 30mM [67].


4.2.5 BMMIBF4 versus BMMITFSI

Realizamos um teste comparando diferentes líquidos iônicos, o BMMIBF4

e o BMMITFSI, a figura 27 exibe os resultados obtidos.

A1

0 800 1600

-12

-6

0

j - j 0 /

A

cm-2

t / s

A2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2-2

0

2

4

6

8

10

12

14

Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 0,07279 0,05562B 17,06625 0,11683------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0,99984 0,09049 9 <0.0001------------------------------------------------------------

j - j 0 /

A c

m-2


B1

0 500 1000 1500 2000 2500-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

j- j 0 /

A

cm-2

t / s

Figura 27- Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg

mL-1 de GOx com 4% BMMIBF4 (A) ou 4% BMMITFSI(B), após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído 2.5%v/v em água.

Comparando os resultados obtidos com os líquidos iônicos constatamos

que o BMMIBF4 apresenta uma linearidade maior do que o BMMITFSI. Visualmente,

quando preparamos o eletrodo com o líquido iônico BMMITFSI observamos um


aglomerado de bolhas de líquido iônico que não se misturaram à solução de enzima,

no caso do BMMIBF4, formou-se uma solução homogênea entre o líquido iônico e a

enzima glicose oxidase. Isto ocorre devido ao fato do BMMITFSI ser um líquido

iônico hidrofóbico, portanto não é dissolvido em solução que contem água enquanto

que o BMMIBF4 é hidrofílico, e se dissolve facilmente em água. Para minimizar este

efeito decidimos modificar o eletrodo com o BMMITFSI de uma forma diferente,

Dissolvemos a enzima diretamente no líquido iônico, e observamos que apenas uma

parte da enzima foi dissolvida, retiramos uma alíquota de 5µL de solução e

adicionamos sobre o eletrodo para verificar se a enzima continuava ativa.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

j - j 0 /

A

cm

-2

t / s -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Y = A + B * XParameter Value Error-------------------------------------------------A -0.056 0.0304B 1.37 0.0469-------------------------------------------------R SD N P-------------------------------------------------0.994 0.0561 12 <0.0001-------------------------------------------------

j - j 0 /

A

cm

-2


Figura 28 - Cronoamperograma a 0V, com adições de 0.1mmol L-1 de glicose, os eletrodos foram preparados a partir do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução 10mg GOx dissolvida parcialmente em 1mL de BMMITFSI, após seco acrescentou-se 2µL de glutaraldeído

2.5%v/v em água.

A sensibilidade alcançada para o eletrodo modificado com uma mistura de

enzima dissolvida diretamente no BMMITFSI foi baixa 1.37µA cm-2 mmol-1 L, mais

isso pode ter ocorrido porque não houve a dissolução completa da enzima no líquido

iônico, apenas parte da enzima foi dissolvida. Sabemos que as enzimas possuem

partes hidrofóbicas e partes hidrofílicas, porém quando adicionamos um líquido

iônico hidrofóbico, apenas parte da enzima foi dissolvida o que explica a baixa


sensibilidade obtida, mais se compararmos com o resultado obtido para o eletrodo

da figura 27B onde temos uma solução contendo apenas 4% de BMMITFSI com o

resultado da figura 28 onde dissolvemos a enzima diretamente no BMMITFSI o

resultado foi melhor, mas não supera os resultados obtidos com o BMMIBF4.


4.3 Detecção de glicose por Análise por Injeção em Fluxo (FIA)

Ao eletrodo modificado com o híbrido, GOx, LI e Glut aplicamos FIA para

detecção de glicose, com o intuito de melhorar a sensibilidade.

A otimização dos parâmetros utilizando FIA nos levaram aos seguintes

resultados:

Potencial aplicado de 0V;

Velocidade de fluxo de 0.6mL min-1;

Alça de injeção de 40µL.

Com estes resultados partimos para a determinação da detecção de

glicose e a determinação da sensibilidade. Os resultados obtidos são exibidos na

figura a seguir.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

j-j0 /

A

cm

-2

t / s

Figura 29 – Detecção de glicose utilizando FIA do eletrodo modificado com o híbrido seguido da adição de 5µL de solução (GOx 10mg mL-1 com 4% v/v BMMIBF4), após seco acrescentou-se 2µL de Glut 2.5% v/v em água. Foram realizadas 3 adições de cada concentração: 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.1,

0.4, 0.8 e 1mmol L-1 de glicose.


Pelo método de FIA os valores de corrente encontrados para as

concentrações de glicose de 0.08mmol L-1 e 0.8mmol L-1 foi inferior ao que se

esperava, já que conforme aumentamos a concentração a resposta de corrente

deveria crescer até que a saturação fosse atingida. Este problema pode ser devido

ao fato de que a análise em fluxo pode carregar parte do filme conforme o fluxo corre

assim a quantidade de enzima no biossensor diminui com o tempo. Outro problema

que foi observado foi o fato de que muitas bolhas foram formadas no sistema, o que

pode prejudicar a medida, pois as bolhas podem destruir o filme e levar a valores

incorretos de corrente. Este problema não é evidenciado na técnica de

cronoamperometria como podemos ver no gráfico da figura 21B onde os patamares

de corrente crescem em função da adição de glicose até que ocorra a saturação.

Para melhorar a detecção por FIA teremos que desenvolver um sistema que tenha o

mínimo de bolhas possível e também que tenha um fluxo muito baixo para que não

ocorra o desprendimento do filme.

Portanto pelos resultados obtidos chegamos a conclusão de que o

método de cronoamperometria é mais satisfatório para as medidas com o biossensor

que desenvolvemos em nosso trabalho.

Considerações finais 67

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Podemos comparar o biossensor desenvolvido com outros sistemas como

é mostrado na tabela 7 abaixo.

Tabela 7 – Eletrodos modificados com glicose oxidase.

Biossensores Quantidade de GOx no eletrodo /

mg

Sensibilidade / µA mmol-1 L

cm-2

Referência

GC/CuHCNFe/Ppi/GOx/BMMIBF4/Glut 0.05 17.1 Este trabalho

GOx imobilizada em hidrogel redox de ósmio com base tri-dimensional

0.008 5.2 [68]

GOx imobilizada em eletrodo de filme de carbono

0.1 0.25 [69]

GOx com filme de polipirrol eletrogerado em mesoporos deTiO2

0.2 4.0 [70]

GOx co-imobilizada com ferroceno para misturas de etanol/água

- 1.5 [71]

GOx presa em um filme eletropolimerizado

- [72]

Au/Qui/BMMIBF4/GOx - 5.2 [49] nano-Au/Qui/BMMIBF4/GOx - 14 [49]

nanoCuHCNFe/Ppy/GOx/BSA/Glut 0.07 12 [27]

Vemos que o biossensor desenvolvido apresenta uma sensibilidade maior

do que os outros sistemas, 17.1µA mmol-1 L cm-2, e no geral a quantidade de enzima

utilizada é menor do que a dos outros sistemas 0.05mg. No sistema desenvolvido

por Gonçales [27] a sensibilidade encontrada foi de 12µA mmol-1 L cm-2 usando

0.07mg de enzima. Para os outros sistemas mostrados temos valores inferiores aos

obtidos, Ohara et. al [68] obteve 5.2µA mmol-1 L cm-2, Ghica and Brett [69] obtiveram

0.25 µA mmol-1 L cm-2 e Cosnier et. al [70] obteve 4.0µA mmol-1 L cm-2. Portanto,

nosso sistema apresenta uma boa sensibilidade quando comparada com outros

Considerações finais 68

sistemas e mostra que a interação direta entre a biomolécula e o líquido iônico

auxilia no desempenho do biossensor, mantendo a atividade da biomolécula.

Conclusão 69

6 CONCLUSÃO

O biossensor desenvolvido CuHFeCN/Ppi/GOx/BMMIBF4/Glut apresentou

uma resposta satisfatória frente aos resultados obtidos por outros trabalhos, como foi

mostrado nas tabelas 6 e 7.

A sensibilidade na detecção da glicose aumenta na presença do líquido

iônico (BMMIBF4) e principalmente pelo contado direto com a enzima. O líquido

iônico pode por não modificar a estrutura secundária da biomolécula, leva ao

aumento da sensibilidade, diminuição do limite de detecção e do tempo de resposta

do biossensor, quando comparado ao sistema em que o glutaraldeído é misturado

junto com a enzima e o líquido iônico, pois a ligação cruzada entre o glutaraldeído e

a biomolécula é preferida em relação a interação com o líquido iônico e isso faz com

que a atividade da enzima diminua e por isso os resultados de sensibilidade são

menores.

Não observamos a transferência direta de elétrons do citocromo c na

presença do líquido iônico (sem os nanotubos de carbono) e o voltamograma que

obtemos refere-se provavelmente a redução do O2 presente na solução.

Vimos também que para o biossensor que desenvolvemos a técnica de

FIA não é a mais indicada, pois parte do filme é perdido no sistema e com isso

temos a diminuição da corrente detectada, portanto a técnica de cronoamperometria

é mais indicada para este sistema.

Por fim, o trabalho desenvolvido nos mostra que o BMMIBF4 tem uma

interação benéfica com a glicose oxidase, pois a mantêm em um ambiente mais

favorável sem ocasionar mudanças conformacionais e por isso melhora a detecção.

Referências bibliográficas 70

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79

8 SÚMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS


Data do Nascimento: 11 de janeiro de 1985

Local: Uberaba, Minas Gerais – Brasil

EDUCAÇÃO

Ensino

fundamental

Professor Arlindo Bittencourt (1996-1999)

Ensino médio Colégio Álvaro Guião (2000)

Colégio São Carlos (2001-2002)

Graduação Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos

(2004-2008)

Pós-Graduação Universidade de São Paulo – Instituto de Química

Mestrado em Química – Área: Físico-química (2008-2010)

OCUPAÇÃO

Bolsista de Mestrado pela Agência Financiadora CNPq (agosto/2008-

março/2010), projeto 554553/2008-2.

EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL

30 novembro - 4 dezembro 2009 Monitoria da 4º Escola de Eletroquímica Agosto 2009 – dezembro 2009 Estágio no Programa de Apoio ao Ensino

(PAE), junto à disciplina: QFL 2426 – Físico-Química XVII – IQ/USP

Janeiro 2008 – maio 2008 Estágio junto a FIPAI

Fevereiro/2005 – Dezembro/2007 Iniciação Científica – Bolsista Fapesp

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PARTICIPAÇÃO EM CONGRESSO

Participação na 30ª Reunião da Sociedade Brasileira de Química com o

trabalho “Caracterização voltamétrica de eletrodos de Au modificados com SAM para

utilização como sensores” painel EQ-55 em Junho de 2007.

Participação no 6º Encontro de Bioengenharia realizado de 7 a 9 de maio

de 2008, na Escola de Engenharia de São Carlos (USP).

CURSOS

Curso de Química Verde na Universidade de São Paulo (IQ-USP) em Janeiro

de 2007.

Curso de Cosmetologia na Universidade de São Paulo (IQSC-USP) em Abril

de 2007.

Curso de Biomateriais durante o 6º Encontro de Bioengenharia na Escola de

Engenharia de São Carlos (EESC-USP) em maio de 2008.

Curso avançado de técnicas eletroquímicas localizadas e XPS realizado em

novembro de 2008 no IQ-USP.

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Construção de biossensores baseados em biomoléculas e ... · RESUMO Galhardo, K. S., Construção de biossensores baseados em biomoléculas e líquidos iônicos, 2010.80p. Dissertação