DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE EMULSÕES CONTENDO … › bitstream › 123456789 › 10135 › 1... · 74 Figura 17: Reogramas das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20. 79 . iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

Departamento de Farmácia - Escola de Farmácia

Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas

Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos

Sub-área: Estudo e Desenvolvimento de Medicamentos

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE EMULSÕES

CONTENDO CRISTAIS LÍQUIDOS UTILIZANDO ÓLEO

DE AÇAÍ (Euterpe oleracea) E RESVERATROL PARA

USO TÓPICO COMO RADIOPROTETOR

Vanessa Teixeira Jerônimo

Ouro Preto

Setembro/2013

VANESSA TEIXEIRA JERÔNIMO

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE EMULSÕES

CONTENDO CRISTAIS LÍQUIDOS UTILIZANDO ÓLEO

DE AÇAÍ (Euterpe oleracea) E RESVERATROL PARA

USO TÓPICO COMO RADIOPROTETOR

Ouro Preto

Setembro/2013

Dissertação de mestrado apresentado

ao programa de pós-graduação em

Ciências Farmacêutica da Universidade

Federal de Ouro Preto, como parte das

exigências do programa.

Orientação: Prof. Dr. Orlando David

Henrique dos Santos

Dedico à minha família e meus

amigos, sem os quais essa

jornada não seria possível.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha família pelo apoio, pelo amor e por sempre acreditar

em mim. Por me fornecer a base e os princípios necessários para essa

conquista.

Ao professor Orlando pela oportunidade.

Aos irmãos: Simone, Ricardo e Karen por todo crescimento que tivemos

juntos. E pela cumplicidade, conversas e risadas dentro e fora dos laboratórios.

Aos companheiros do Cipharma: Carol, Thaís, Shiara, Zabelê, Levi,

Renata, Patrícia, Lorena, Polly, Ana Paula, Fred, Giani e Liliam por todas as

experiências compartilhadas.

Agradeço a República Sedução, minha eterna casa, minha segunda

família.

À República MóiCana e a todos os móicanos que tive o prazer e a sorte

de conviver por tornarem meus dias em Ouro Preto muito mais felizes.

Aos amigos que conheci nessa etapa: Eveline, Júnia, André, Jamille,

Rockita.

Ao Leo, a Patrícia e a Mirela por todo auxílio e esclarecimento que

prestaram.

Aos professores Bibo, Gustavo, Luís Fernando por todos os ensinamentos

compartilhados.

À gloriosa Escola de Farmácia de Ouro Preto, por me permitir fazer parte

de sua longa, gloriosa e imortal história.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 17

2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 20

2.1. PATOGENIA E INCIDÊNCIA DO CÂNCER ............................................. 20

2.2 . RADIOTERAPIA ....................................................................................... 21

2.3 . RADIODERMATITES ............................................................................... 26

2.4 . RADIOPROTETORES ............................................................................. 33

2.5 . EMULSÕES E CRISTAIS LÍQUIDOS ..................................................... 37

2.6 . ÓLEO DE AÇAÍ ........................................................................................ 41

2.7 . RESVERATROL ....................................................................................... 45

3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 49

3.1 -OBJETIVOS GERAIS ............................................................................... 49

3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 49

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 51

4.1. MATERIAL ................................................................................................. 51

4.2 MÉTODOS ................................................................................................. 51

4.2.1 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO DE AÇAÍ IN

VITRO ............................................................................................................ 51

4.2.2 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES .............................................. 53

4.2.3- DIAGRAMA DE FASES ...................................................................... 53

4.2.4 - DETERMINAÇÃO DO TIPO DE EMULSÃO ..................................... 56

4.2.5- AVALIAÇÃO DE ESTABILIDADE ...................................................... 57

4.2.6 - DETERMINAÇÃO DO COMPORTAMENTO REOLÓGICO ............ 58

4.2.7- TESTE DE LIBERAÇÃO ..................................................................... 59

5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 62

5.1 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO DE AÇAÍ IN

VITRO ............................................................................................................... 62

5.2- DESENVOLVIMENTO DA FORMULAÇÃO ............................................. 65

5.3 - AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE ........................................................... 72

5.3.1 - AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA ....................................................... 72

5.3.2 - ANÁLISE MICROSCÓPICA .............................................................. 74

5.3.3 - TESTE DE CENTRIFUGAÇÃO ......................................................... 76

5.3.4- TESTE DE ESTRESSE TÉRMICO .................................................... 77

5.3.5 - ANÁLISE DO COMPORTAMENTO REOLÓGICO .......................... 78

5.4 - AVALIAÇÃO DO PERFIL DE LIBERAÇÃO DA FORMULAÇÃO ........... 82

6 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 86

7 - REFERÊNCIAS ............................................................................................... 88

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo celular. 24

Figura 2: Principais sinais e sintomas da radiodermatite: (a)

eritema, (b) hiperpigmentação, (c) descamação, (d) ulceração, (e)

necrose, (f) atrofia epitelial, (g) telangiectasia, (f) fibrose.

31

Figura 3: Classe de radioprotetores segundo tempo de utilização

em relação à exposição à radiação.

36

Figura 4: Representação dos glóbulos de emulsões do tipo A/O e

O/A.

38

Figura 5: Representação da ordenação tridimensional das fases

cristalinas, líquido-cristalinas e líquida isotrópicas.

40

Figura 6: Açaizeiro (Euterpe oleracea).

42

Figura 7: Estrutura química do trans-resveratrol.

46

Figura 8: Diagrama de fases.

56

ii

Figura 9: Gráfico correlacionando o percentual de sequestro do

radical DPPH• a diferentes concentrações do óleo de açaí.

62

Figura 10: Gráfico da curva de calibração com α-tocoferol no teste

de ABTS•1.

63

Figura 11: Diagrama de fases para a combinação de tensoativos

Brij CS20 e Brij S2 (50:50).

65

Figura 12: Diagrama de fases para a combinação de tensoativos

Brij CS20 e Brij S2 (50:50).

66

Figura 13: Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a

36 com a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij O20 (aumento

40 vezes).

68

Figura 14: Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a

36 com a combinação de tensoativos Brij S2 e Brij CS20 (aumento

40 vezes).

69

iii

Figura 15: Fotografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20

nos dias 1, 8, 15, 22 e 29.

73

Figura 16: Fotomicrografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-

S2CS20 nos dias 1, 8, 15, 22 e 29.

74

Figura 17: Reogramas das formulações 35-S2CS20 e 35R-

S2CS20.

79

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais sinais e sintomas da radiodermatite. 29

Tabela 2: Concentração dos principais compostos fenólicos presentes

no óleo de açaí.

44

Tabela 3: Concentração dos ácidos graxos presentes no óleo de açaí. 44

Tabela 4: Formulações utilizadas no diagrama de fases e respectivas

concentrações de seus componentes.

53

Tabela 5: Descrição dos componentes e suas respectivas proporções

nas formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20.

71

Tabela 6: Resultados do teste de centrifugação. 76

Tabela 7: Resultados do teste de estresse térmico. 78

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

35-S2CS20 emulsão constituída de 10% de óleo de açaí, 10% de Brij

S2, 10% de Brij CS20 e 70% de água

35R-S2CS20 emulsão constituída de 10% de óleo de açaí, 10% de Brij

S2, 10% de Brij CS20, 1% de resveratrol e 69% de água

A/O água em óleo

ABTS Ácido 2,2’-azino-bis-(3- etilbenzotiazolina)-6-sulfônico

CLAE cromatografia líquida de alta eficiência

DNA ácido desoxirribonucléico

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

nm nanômetro

O/A óleo em água

r2 coeficiente de correlação linear

RNA ácido ribonucléico

RNAm ácido ribonucleico mensageiro

RPM rotação por minuto

UV ultravioleta

vi

RESUMO

vii

Durante o tratamento radioterápico de tumores, comumente surgem

reações na pele em decorrência da exposição à radiação. Essas reações,

denominadas radiodermatites, afetam a qualidade de vida do paciente e podem

levar a interrupção da terapia. Nesse contexto, é interessante a utilização tópica

de substâncias radioprotetoras que têm a capacidade de atenuar ou impedir os

danos causados pela radiação.

Nesse estudo, desenvolveu-se emulsões com cristais líquidos utilizando

tensoativos não-iônicos da classe dos álcoois graxos etoxilados (Brij CS 20 e Brij

S2) e óleo de açaí como fase oleosa, na qual foi incorporada o ativo resveratrol.

As emulsões foram desenvolvidas através de diagrama de fases

ternário, onde foi possível determinar, por análise macroscópica e microscópica

sob luz polarizada, qual proporção dos componentes da formulação

(combinação de tensoativos, óleo e água) resultava em formulações estáveis e

com maior presença de cristais líquidos. Após a escolha da formulação, foram

realizados testes de estabilidade, nos quais a formulação mostrou-se estável.

A atividade antioxidante do óleo de açaí foi comprovada por dois

métodos. Na determinação através do sequestro do radical DPPH, apresentou

IC50 de 13,06 mg/mL. No teste que utiliza o radical ABTS•1 liofilizado, o resultado

encontrado foi de 1882 mg equivalente de tocoferol por kg do óleo.

O comprovado efeito radioprotetor do resveratrol somado à atividade

antioxidante do óleo de açaí e ao poder hidratante de emulsões indicam que a

formulação desenvolvida tem potencial para ser utilizada topicamente durante o

tratamento radioterápico com a finalidade de minimizar os efeitos da radiação

ionizante sobre a pele.

viii

Palavras-chave: radiodermatite, radioproteção, emulsão, cristal líquido,

atividade antioxidante, óleo de açaí, resveratrol.

ix

ABSTRACT

x

During tumor radiotherapy, usually skin reactions arise as a result of

radiation exposure. These reactions, called radiodermatitis, affect the quality of

life of patients and may lead to discontinuation of therapy. In this context, it is

interesting to make use of topical substances that present radioprotector activity

which have the ability to mitigate or prevent the damage caused by radiation.

In the present study, emulsions with liquid crystals were developed using

non-ionic surfactants of the class of ethoxylated fatty alcohols (Brij CS 20 and Brij

S2) and acai oil as the oil phase, which was incorporated into the active

resveratrol.

The emulsions were developed using a ternary phase diagram. By this

diagram and using macroscopic analysis and microscopic under polarized light

analysis, the proportion of the components of the formulation (combination of

surfactants, oil and water) that result in stable emulsions and enhanced amount

of liquid crystals was determinate. After the choice of the formulation and the

incorporation of resveratrol (1% w/w), the stability tests were performed, in these

test the formulation showed to be stable.

The antioxidant activity of the acai oil was confirmed by two methods. In

determining through DPPH radical, was founded IC50 of 13.06 mg / mL. In the

test using the ABTS • 1 lyophilised, the result was equivalent to 1882 mg of

tocopherol per kg of oil.

The proved radioprotective effect of resveratrol, the antioxidant activity of

acai oil and the moisturizing capacity of emulsions indicate that the proposed

formulation can be used topically during radiotherapy treatment in order to

minimize the effects of ionizing radiation on the skin.

xi

Keywords: radiodermatitis, radioprotection, emulsion, liquid crystal, antioxidant,

acai oil, resveratrol.

INTRODUÇÃO

Introdução

17

1. INTRODUÇÃO

O câncer é uma doença com alta incidência em todo o planeta, ocupando

o primeiro lugar na lista de doenças que mais resultam em óbito

(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).

Uma técnica muito comum e eficiente no tratamento dessa doença é a

radioterapia que, através de radiações ionizantes, forma radicais livres e

desencadeia reações intracelulares que culminam em alterações no material

genético e morte das células tumorais. No entanto, durante a utilização desse

tratamento, comumente tecidos saudáveis também são afetados, causando

efeitos adversos principalmente em tecidos com alta taxa de divisão celular como

os formados por células epiteliais.

Inevitavelmente a radiação ionizante atravessa a pele para atingir o sítio

alvo da terapia, desse modo, esse órgão é o mais frequentemente afetado. Há

estudos que estimam que ocorra pelo menos uma forma de reação cutânea em

aproximadamente 95% dos pacientes que utilizam esse tratamento (CONNO;

VENTAFTIDDA, 1991). Tais reações cutâneas, denominadas radiodermatites,

se manifestam como prurido, edema, eritema, descamação seca e úmida,

sangramento e necrose. Seus sinais e sintomas resultam em desconforto para o

paciente, descontinuação da radioterapia e aumento do risco de infecções

(HYMES et al., 2006).

Desse modo, faz-se necessário o desenvolvimento de uma formulação

tópica que minimize os efeitos da radiação sobre a pele, evitando a interrupção

do tratamento e melhorando a qualidade de vida do paciente.

Introdução

18

As emulsões são amplamente utilizadas para veiculação de fármacos.

Esse tipo de formulação pode alterar a biodisponibilidade do ativo de diferentes

formas. Suas características podem resultar em aumento da hidratação da pele,

controle na taxa de difusão do ativo, além de aumentar a permeação pelo estrato

córneo (ECCLESTON, 1997). A formação dos cristais líquidos nesse sistema é

vantajosa, pois auxilia na estabilização da emulsão e na solubilização de alguns

ativos (SANTOS, 2006).

Nesse contexto, a utilização do óleo de açaí é adequada. Suas

propriedades antioxidantes podem exercer ação sinérgica com o resveratrol, um

radioprotetor com atividade comprovada, em atuar na diminuição da incidência

e intensidade dos sinais e sintomas das reações cutâneas em resposta a

exposição à radiação.

REVISÃO

DA LITERATURA

Revisão da Literatura

20

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Patogenia e incidência do câncer

A Organização Mundial de Saúde utiliza o termo câncer para definir um

amplo conjunto de doenças que podem afetar qualquer parte do organismo. Esse

grupo possui como característica comum o rápido e exacerbado surgimento de

células anormais que crescem além de seus limites habituais e podem atingir

tecidos adjacentes e posteriormente invadir outros órgãos (ORGANIZAÇÃO

MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).

O câncer surge de uma única célula. A transformação de uma célula

normal em uma célula tumoral é um processo com múltiplas etapas. Tais

mudanças são resultantes da interação entre fatores genéticos do indivíduo e

agentes externos físicos, químicos ou biológicos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE

SAÚDE, 2013).

O envelhecimento é outro fator fundamental, pois a incidência da doença

aumenta drasticamente com a idade. Isso ocorre pela ação sinérgica de dois

fatores: a menor eficiência dos mecanismos de reparo à medida que a pessoa

envelhece e a exposição cumulativa aos fatores de risco (ORGANIZAÇÃO

MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).

Câncer é a principal causa de morte em todo mundo e é responsável por

13% do total de mortes por ano, essa porcentagem corresponde a 7,6 milhões

de óbitos. A previsão é que este número continue aumentando e atinja 13,1

milhões de mortes em 2030 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2013).


21

No Brasil, desde 2003, as neoplasias malignas são classificadas como a

segunda causa de morte na população, representando quase 17% dos óbitos de

causa conhecida, notificados no Sistema de Informações sobre Mortalidade. E

esta situação tende a se agravar devido ao crescimento e envelhecimento da

população (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2009).

O tratamento engloba uma série de intervenções que objetiva a cura da

doença ou a prolongação e melhora na qualidade de vida do paciente.

Geralmente, utiliza-se radioterapia, cirurgia, quimioterapia, suporte psicossocial,

ou uma combinação desses procedimentos (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE

SAÚDE, 2013).

2.2 . Radioterapia

Radiação pode ser definida como a propagação de energia através do

espaço ou da matéria. Essa propagação é classificada em duas categorias:

corpuscular e eletromagnética. As propagações corpusculares são constituídas

por partículas subatômicas, quando estas obtém energia necessária para

adquirir velocidade. Já as eletromagnéticas não são formadas por partículas, são

radiações que possuem oscilações elétricas e magnéticas e viajam numa

velocidade característica (SCAFF, 1997).

Radiações ionizantes podem ser eletromagnéticas ou corpusculares.

São caracterizadas por possuírem energia suficiente para ionizar átomos ou

moléculas, ou seja, promover a ejeção de elétrons de seus orbitais (SCAFF,

1997).


22

Desde o final do século XIX, quando houve a descoberta de meios de

gerar Raios X por Wilhelm Röentgen, a terapia com radiação tem sido

desenvolvida como uma parte essencial do tratamento contra o câncer (IARC,

2008). A submissão do artigo de Roentgen sumarizando a descoberta dos raios

X em 28 de dezembro de 1895 a Wurzburg Physico-Medical Society é

considerada o marco para o nascimento dos campos de radiologia e da

oncologia da radiação. Apenas sete meses após essa descoberta, um trabalho

da Medical Record descreveu um paciente com carcinoma gástrico que se

beneficiou da radioterapia (CONNEL e HELLMAN, 2012). Essa técnica contribui

tanto para a cura quanto para a paliação da doença. Estima-se que mais de 50

% dos pacientes utilizam essa forma de terapia em algum momento do

tratamento (DELANEY et al., 2005).

A radioterapia se divide em duas categorias: teleterapia e braquiterapia.

A teleterapia ou radioterapia externa é realizada mantendo uma distância física

entre o paciente e a fonte da radiação. Na braquiterapia, são usadas fontes de

radiação em contato direto com os tecidos a serem irradiados (MARTA, 2012).

O objetivo dos tratamentos radioterápicos é irradiar uniformemente o

tumor, enquanto se poupa o máximo possível de tecido saudável adjacente,

evitando-se com isto o surgimento de efeitos colaterais (WARDE, 2004).

Os efeitos da radiação podem ser divididos em quatro etapas:

Física, na qual há absorção da radiação nos tecidos, resultando na

ionização e excitação dentro dos átomos;


23

Química, na qual os átomos e moléculas alteradas reagem com

outros componentes celulares resultando na quebra de ligações

químicas e formação de radicais livres;

Biológica, que inclui os processos subsequentes, como lesões na

membrana da célula, alteração de processos bioquímicos, danos ao

material genético;

Clínica, que inclui manifestação dos sinais e sintomas da exposição

à radiação (GWYNNE e STAFFURTH, 2012) (BOURGIER, 2012).

A radioterapia exerce sua atividade através da lesão de componentes

intracelulares. Quando a radiação ionizante atravessa tecidos vivos radicais

livres são gerados. Esses radicais tem a capacidade de interagir com moléculas

vitais como o DNA, proteínas ou lipídios de membranas, e podem induzir danos

celulares, culminando em uma célula disfuncional ou morta (BOURGIER, 2012).

O dano ao DNA é o fator mais importante nas alterações celulares.

(GWYNNE; STAFFURTH, 2012). Radiação ionizante causa uma variedade de

lesões no DNA, incluindo oxidação de bases, perda de bases, quebras simples

de fita e quebra dupla de fita. Esses danos culminam em alterações na divisão

celular, morte celular, depleção das células tronco, disfunção em órgãos e

sistemas e, se a dose for suficientemente alta, a morte do organismo (BEGG et

al., 2011).

O efeito máximo da radiação ocorre imediatamente antes (G2) ou durante

(M) a divisão celular (NAYLOR; MALLETT, 2001).


24

Figura 1: Ciclo celular (NAYLOR; MALLETT, 2001).

,

Na Figura 1, está representado o ciclo celular, onde:

G0 = Fase de repouso, onde divisão celular está interrompida, mas a

célula mantém suas funções;

S = Fase de síntese, na qual há replicação dos cromossomos (síntese de

DNA);

G2 = Fase pré-mitótica, onde há crescimento da célula e produção de

RNA;

M= Fase mitótica, durante a qual há a divisão celular (NAYLOR;

MALLETT, 2001).

A radioterapia é um tratamento de sucesso para muitos tipos de tumores

devido, principalmente, a soma de dois fatores. Primeiramente, as células

tumorais sofrem mitose em uma taxa anormalmente alta, o que as torna muito

propensas a sofrer os efeitos da radioterapia. Além disso, células tumorais não


25

possuem a capacidade de reparar danos intracelulares (NAYLOR; MALLETT,

2001).

Efeitos indiretos como redução da vascularidade ao redor do tumor ou

aumento do reconhecimento imunológico também podem ser importantes

durante a utilização da radioterapia (GWYNNE; STAFFURTH, 2012).

Os tecidos normais também são afetados pela radiação resultando em

sintomas e sinais, classificados em agudos ou tardios. Esses efeitos adversos

são causados por uma combinação de morte celular e estimulação dos

processos inflamatórios, trombóticos e fibrogênicos (BEGG et al, 2011).

Embora células e tecidos sejam equipados com enzimas endógenas

capazes de detoxificar e remover os produtos da radiólise, quando essas

espécies reativas de oxigênio estão muito altas nos sistemas biológicos após a

exposição à radiação, os sistemas endógenos são incapazes de proteger as

células dos efeitos nocivos dos radicais livres.

Os efeitos agudos da radiação são mais proeminentes em tecidos com

alta taxa de proliferação, como a superfície epitelial da pele e ou sistema

digestivo (STONE et al., 2003). Os sintomas variam conforme o local irradiado,

mas comumente são observados náusea, xerostomia, vômitos, alopecia,

mucosite, diarreia, e alteração transitória do estado neurológico (WARDE, 2004;

BEGG et al, 2011).

Efeitos tardios se desenvolvem meses ou anos após o tratamento. Os

sintomas podem ser brandos ou severos, autolimitados ou progressivos, e

podem se desenvolver gradualmente ou repentinamente. Efeitos tardios tendem

a ocorrer em tecidos com baixa taxa de renovação celular, como o tecido


26

subcutâneo, tecido adiposo, muscular, cerebral, renal e hepático. As lesões são

patologicamente diversas, mas comumente ocorre fibrose, necrose, atrofia, dano

vascular e insuficiência cardíaca (STONE et al., 2003; BEGG et al, 2011).

Durante a radioterapia externa, o feixe de raios ionizantes inevitavelmente

necessita atravessar a pele para atingir o tecido alvo, desse modo os efeitos

adversos cutâneos, conhecidos como radiodermatites, são os mais

frequentemente observados (HARRIS, 2011).

2.3 . Radiodermatites

A pele é um dos maiores órgãos do corpo humano e reveste toda a

superfície corporal. Apresenta-se constituída por dois segmentos: epiderme e

derme (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

A epiderme possui origem ectodérmica e é constituída por epitélio

estratificado pavimentoso queratinizado. Essa camada forma-se principalmente

por melanócitos, células de Langerhans, células de Merkel e queratinócitos,

sendo essas últimas a classe mais abundante (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

Além disso, contém uma ampla gama de sistemas sensores capazes de detectar

mudanças nas condições ambientais como temperatura, pressão e estímulos

químicos (OMATA, 2012).

Pode-se dividir a região epidérmica em cinco camadas distintas:

A camada córnea é a mais superficial e atua como barreira contra a

perda excessiva de água (HYMES et al., 2006). Representa o produto

final da diferenciação da epiderme e é caracterizada por uma matriz

celular rica em lipídios. Além disso, há a presença de células cujo


27

citoplasma está repleto de queratina e apresentam-se como

estruturas achatadas, anucleadas e mortas, que se descamam

continuamente (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

A camada lúcida se localiza imediatamente abaixo do estrato córneo

e distingue-se por possuir células achatadas, eosinófilas e

translúcidas, cujos núcleos e organelas citoplasmáticas foram

digeridos por enzimas dos lisossomos e desapareceram

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

A terceira camada é denominada granulosa e apresenta-se como

fileiras de células achatadas com núcleo centralizado e citoplasma

carregado de grânulos basófilos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

A próxima é denominada espinhosa, devido ao fato que as células

que a compõem possuem expansões citoplasmáticas que se

assemelham a espinhos. Essas células são cuboides e apresentam

núcleo central. Há ainda a presença de células-tronco dos

queratinócitos, que auxiliam na renovação celular (JUNQUEIRA;

CARNEIRO, 2004).

A última camada epidérmica é chamada de basal ou germinativa.

Suas células prismáticas e basófilas se localizam acima da

membrana basal que separa a epiderme da derme. Outro fator

importante é a existência de grande quantidade de células-tronco e

alta atividade mitótica, tornando assim, esse estrato, o responsável

pela constante renovação da epiderme (JUNQUEIRA; CARNEIRO,

2004)


28

Após as cinco camadas que formam a epiderme, é possível observar a

camada dérmica, composta por tecido conjuntivo. Essa é responsável por

fornecer suporte à epiderme e uni-la ao tecido celular subcutâneo ou hipoderme

(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

Reações de pele provocadas por radiação, denominadas radiodermatites,

são os efeitos adversos mais comuns do tratamento radioterápico externo

(HARRIS, 2011). A alta incidência dessas reações é explicada pela rápida

divisão celular que ocorre na camada basal da epiderme somada ao fato que

durante o tratamento com radiação externa inevitavelmente os feixes necessitam

atravessar a pele para alcançar o sítio alvo (NAYLOR; MALLET, 2001;

MADDOCK-JENNINGS et al., 2005).

Mesmo quando a pele não é o alvo principal do tratamento radioterápico,

ela geralmente apresenta danos funcionais, estruturais ou moleculares (HYMES

et al., 2006). Estima-se que 95% dos pacientes apresentem algum tipo de reação

cutânea em resposta ao tratamento com radiação (CONNO; VENTAFTIDDA,

1991).

O primeiro caso de radiodermatite publicado foi registrado por Frieben em

1902, apenas seis anos após a descoberta dos raios X por Roetgen. Foi um

relato de caso cujo paciente apresentava carcinoma de célula escamosa no

dorso da mão após trabalhar com tubos Roentgen por quatro anos (VAN

VLOTTEN et al., 1987).

As alterações podem durar horas ou perdurar por muitos meses. Em

alguns casos essas mudanças se tornam permanentes (MADDOCK-JENNINGS,

2005).


29

A pele é um órgão em constante renovação, e a radioterapia interfere com

a maturação, reprodução e repopulação das células germinativas e dos folículos

pilosos. Além disso, causa danos aos fibroblastos e as células da vasculatura

cutânea (HYMES et al., 2006). A fisiopatologia é uma complexa combinação dos

danos diretos causados pela radiação e a reação inflamatória subsequente,

culminando em comprometimento da função de barreira exercida pela pele,

colonização bacteriana e superprodução de antígenos (HEMATI et al., 2011).

Os principais sinais e sintomas estão apresentados na Tabela 1:

Tabela 1: Principais sinais e sintomas da radiodermatite

Alteração

na pele

Tempo de

surgimento

Descrição Tempo de

cura

Eritema Horas – 3

semanas

Aumento do volume

sanguíneo abaixo da

epiderme, resultando em

aspecto avermelhado

Meses após

o tratamento

Pigmentação e

epilação

Horas – 3

semanas

Destruição celular devido

à ativação de enzimas

proteolíticas

Meses após

o tratamento

Descamação

seca

3-6 semanas Queratinização atípica

devido a redução de

células linolênicas

resultando em

reprodução reduzida.

6-8 semanas

após o

tratamento

Descamação

úmida

4-6 semanas Perda de epiderme

devido à esterilização de

células linolênicas

3-6 semanas

após o

tratamento


30

Ulceração

secundária

Superior a 6

semanas

Dano secundário a

epiderme devido à

desidratação e infecção a

partir de um prolongado

processo de descamação

úmida

Dano

permanente

Necrose

epitelial

Superior a

10 semanas

Morte do tecido devido à

insuficiência vascular

Dano

permanente

Atrofia epitelial Superior a

26 semanas

Contração da área

irradiada

Dano

permanente

Telangiectasia Superior a

52 semanas

Dilatação atípica dos

capilares da superfície

dérmica

Dano

permanente

Fibrose

invasiva

Sem prazo Processo curativo

resultante em formação

de cicatriz

Dano

permanente

Ulceração

aguda

Inferior a 10

dias

Perda precoce da

epiderme devido à morte

celular na interfase

Cicatriz

permanente

Necrose aguda Inferior a 10

dias

Morte de queratinócitos Dano

permanente

A Figura 2 representa as principais alterações na pele em decorrência do

tratamento com radiação externa.


31

Figura 2: Principais sinais e sintomas da radiodermatite: (a) eritema, (b)

hiperpigmentação, (c) descamação, (d) ulceração, (e) necrose, (f) atrofia epitelial,

(g)telangiectasia, (f) fibrose. (colocar a fonte)

Eritema Hiperpigmentação

Descamação Ulceração

Necrose Atrofia epitelial

Telangiectasia Fibrose

a b

c d

e f

g

c

h

c


32

De acordo com National Cancer Institute Common Terminology Criteria for

Adverse Events (versão 3), as radiodermatites são classificadas em cinco graus

diferentes.

Grau 1: eritema fraco ou descamação seca.

Grau 2: eritema moderado a intenso, descamação úmida irregular

principalmente nas regiões com dobras e vincos; edema moderado.

Grau 3: descamação úmida não limitada a dobras e vincos; sangramento

induzido por pequenos traumas ou abrasões.

Grau 4: necrose ou ulcerações na pele; sangramento espontâneo.

Grau 5: morte.

As alterações na pele em decorrência da terapia com radiação dependem

de fatores associados ao tratamento e ao paciente, tais como: local irradiado,

tipo de radiação, estado nutricional do paciente, presença de dobras na pele e

quimioterapia concomitante (MADDOCK-JENNINGS, 2005).

Além do desconforto físico, essas manifestações cutâneas estão

associadas com prejuízos na qualidade de vida do paciente, incluindo: fadiga,

problemas com a imagem corporal, alterações de sono, stress emocional e

mudanças na funcionalidade cotidiana do paciente. O aumento nos custos do

tratamento devido a gastos com medidas para minimizar os distúrbios físicos e

emocionais também é relatado (SCHNUR, 2011; SCHNUR, 2012).

Em casos graves, esses efeitos adversos frequentemente causam

limitação das doses da terapia ou interrupção do tratamento, fatos que podem

afetar negativamente o resultado da radioterapia e consequentemente, a

evolução do paciente (HEMATI, 2011).


33

Não existe consenso na literatura quanto à orientação para procedimentos

e cuidados que o paciente e a equipe de saúde devem se ater para minimizar

esses prejuízos. Com isso, torna-se necessário um tratamento tópico efetivo

para radiodermatite que evite, reduza e amenize os efeitos adversos da radiação

na pele.Isto irá permitir um tratamento radioterápico mais eficiente, aumentando,

desse modo a possibilidade de cura do paciente (BLECHA et al., 2004).

2.4 . Radioprotetores

Radioprotetores podem ser conceituados como substâncias capazes de

reduzir os efeitos prejudiciais da radiação (ESCO et al., 2004).

Durante a guerra fria, o governo dos Estados Unidos iniciou um programa

com o objetivo de pesquisar agentes químicos que tivessem a capacidade de

proteger os soldados dos efeitos da exposição à radiação durante um possível

ataque nuclear. Em 1979, aproximadamente quatro mil substâncias já estavam

caracterizadas (BOURGIER, 2012; FERNANDEZ, 2009).

Os radioprotetores podem exercer sua atividade por diferentes

mecanismos, sendo estes: (1) supressão da formação de espécies reativas, (2)

detoxificação das espécies reativas, (3) estabilização do alvo, (4) aumento dos

processos de recuperação e reparo (NAIR et al., 2001).

Na supressão da formação de espécies reativas, os compostos

radioprotetores agem induzindo hipóxia local. Por exemplo, algumas substâncias

tem a capacidade de sofrer reações que resultam no consumo químico ou

bioquímico de oxigênio, tornando esse menos disponível para a formação de

espécies reativas de oxigênio (NAIR et al., 2001; FERNANDEZ, 2003). Para


34

causar a morte de células em hipóxia é necessária de duas a três vezes a dose

de radiação suficiente para matar as células em condições normais (POGGI et

al, 2001).

A eliminação ou detoxificação dos radicais livres pode abrandar

significativamente os danos produzidos pela radiação. Sequestradores de

radicais livres interagem com esses e previnem a morte da célula. Outro

mecanismo de eliminação de radicais livres é através da estimulação das

enzimas com atividade antioxidante como a glutationa redutase, superóxido

dismutase e catalase. Um terceiro mecanismo possível para a eliminação de

radicais livres é através da neutralização dessas espécies reativas através da

doação de um átomo de hidrogênio (FERNANDEZ, 2003; NAIR et al., 2001).

Os radioprotetores também podem interagir com as moléculas de DNA

formando complexos que estabilizam essas estruturas e previnem os danos da

radiação (FERNANDEZ, 2003; NAIR et al., 2001).

Em uma última forma, o processo de recuperação celular é reforçado por

algumas substâncias que, por exemplo, possuem a capacidade de reparar

rupturas nas cadeias de ácidos nucléicos (FERNANDEZ, 2003; NAIR et al.,

2001).

O conhecimento sobre as propriedades dos radioprotetores adquirido

durante as pesquisas militares e sobre os mecanismos envolvidos nas

consequências da exposição à radiação ionizante gerou interesse em

abordagens farmacêuticas sobre o tema (BOURGIER, 2012).


35

A radioproteção farmacológica pode ser dividida em três categorias, de

acordo com o período em que exercem sua atividade em relação à exposição:

protetores, mitigadores e agentes de tratamento (BRIZEL, 2007).

Os agentes protetores são aqueles administrados previamente à

exposição, usados como estratégia profilática (BOURGIER, 2012). Incluem-se,

nessa classe, os antioxidantes que possuem a capacidade de doar um átomo de

hidrogênio como o ácido ascórbico, tocoferóis, polifenóis e tióis. Nesse caso os

oxidantes formados são neutralizados pela doação de um átomo de hidrogênio,

resultando em produtos menos reativos ou não reativos (CITRIN et al., 2010;

STONE et al., 2004).

A segunda classe é chamada de mitigadores e são administrados durante

ou imediatamente após a irradiação, mas antes do surgimento de sinais e

sintomas (BOURGIER, 2012). Após ocorrer o dano no DNA, uma variedade de

processos ocorre na célula, tecido ou organismo, incluindo ativação dos

processos de reparo de DNA, ativação da transdução de sinal, expressão de

genes em resposta a radiação e estimulação da inflamação. Essas vias podem

ser importantes para recuperação dos danos, mas podem também desempenhar

um papel importante no desenvolvimento da toxicidade. A administração de

compostos mitigadores objetiva agir nesses processos para prevenir ou reduzir

os danos causados pela radiação (CITRIN et al., 2010). Um exemplo é

administração de inibidores da enzima conversora de angiotensina para reduzir

os danos pulmonares, renais e neurológicos (STONE et al., 2004).

As substâncias para tratamento são utilizadas após o surgimento de sinais

e sintomas, com a intenção de revertê-los ou minimizá-los (BOURGIER, 2012).


36

Exemplos dessa classe são a pentoxifilina para tratar a fibrose resultante e os

fatores de crescimento hematopoiético que auxiliam na recuperação dos danos

hematológicos (STONE et al., 2004).

Figura 3: Classe de radioprotetores segundo tempo de utilização em relação a exposição à radiação. Adaptado de CITRIN et al. 2010 e BOURGIER, 2012.


37

Tióis são moléculas contendo grupos sulfidrilas livres ou em potencial nas

suas estruturas. Tióis e seus derivados foram a primeira geração de

radioprotetores e receberam grande atenção, de 1950 a 1985, como

radioprotetores de células de mamíferos. Muitos mecanismos foram propostos

para este grupo, incluindo inativação de radicais livres, transferência de

hidrogênio, indução de hipóxia e estabilização de DNA através de ligação direta.

Apesar da comprovada eficácia dessa geração de radioprotetores, o perfil

de efeitos adversos gerados por essas substâncias criou a necessidade da

busca por uma segunda geração de fármacos que fossem mais efetivos, menos

tóxicos e com rotas de administração mais confortáveis (HOSSEINIMEHR,

2007).

Muitos estudos têm estudado os efeitos radioprotetores de compostos

naturais objetivando utilizá-los como uma alternativa ao perfil de toxicidade

exibido pelos compostos tiólicos (SAMMARTH et al., 2007; ARORA, 2005;

SINGH, 2005; GOEL et al., 2004; VEERAPUR et al.,2007).

O radioprotetor ideal deve ser estável, com possibilidade de uma fácil

administração e sem toxicidade relevante e/ou permanente (ESCO et al., 2004).

2.5 . Emulsões e cristais líquidos

A biodisponibilidade do fármaco em um sítio de ação é afetada pelas

características da formulação utilizada para veicular o ativo (ECCLESTON,

1997).

A pele representa uma barreira natural à penetração de substâncias

Desse modo, dificilmente um fármaco administrado por via tópica, sem uma


38

formulação adequada, conseguirá atingir as camadas mais profundas da pele

em concentrações suficientes para exercer atividade terapêutica (FLEURY,

2009).

Veículos com propriedades coloidais podem influenciar a difusão do ativo

para a pele, além de interagir com as camadas do estrato córneo, tornando-o

mais permeável. Outro efeito que pode ser observado é a oclusão, a qual reduz

a evaporação e aumenta o grau de hidratação da pele, resultando em maior

permeabilidade (ECCLESTON, 1997).

Uma emulsão é conceituada como um sistema no qual um líquido

encontra-se disperso em outro líquido no qual é imiscível. A estrutura de uma

emulsão consiste em gotículas da fase interna (dispersa) envoltas na fase

externa (dispersante). Podem ser A/O, na qual a fase dispersa é aquosa e a fase

externa é oleosa ou O/A, onde o óleo representa a fase interna e a parte aquosa

é a fase dispersante (AGUIAR, 2010).

Figura 4 - Representação dos glóbulos de emulsões do tipo A/O e O/A

Os cristais líquidos com frequência se formam em sistemas emulsionados

(MORAIS, 2006). Esses são uma fase intermediária da matéria, descoberta pelo

cientista Friedrich Reinitzer ao observar o comportamento do benzoato de

colesterila. Reinitzer ao estudar as características ópticas desse material em

função da temperatura observou que ele apresentava dois pontos de transição,

no primeiro a substância passava do estado cristalino para um líquido translúcido


39

e no segundo havia a mudança desse líquido translúcido para um líquido

transparente (LAGERWALL; SCALLIA 2012).

Quando uma substância está no estado sólido cristalino apresenta

ordenamento tridimensional de suas moléculas. Há ordem translacional,

orientacional e rotacional de longo alcance, formando uma rede no qual os

átomos ou moléculas estão fixos em uma posição. Normalmente são

anisotrópicos, ou seja, possuem propriedades que se alteram de acordo com a

direção analisada (ECCHER, 2010).

Quando uma substância se encontra no estado líquido, suas moléculas

constituintes estão distribuídas aleatoriamente em um determinado volume. Não

há ordem posicional de longo alcance, orientacional e rotacional em nenhuma

direção do espaço. Desse modo, apresentam isotropia, ou seja, possuem

propriedades que não se alteram qualquer que seja a direção da análise

(ECCHER, 2010).

Os cristais líquidos representam uma fase intermediária entre os cristais

sólidos e os líquidos isotrópicos. Essa mesofase apresenta características de

ambos os estados. Possui ordem estrutural, ligações definidas, e rigidez como

os sólidos e possui simultaneamente fluidez e regiões desordenadas como os

líquidos (MORAIS, 2006).


40

Figura 05:Representação da ordenação tridimensional das fases cristalinas,

líquido-cristalinas e líquida isotrópicas (ECCHER, 2010).

Os cristais líquidos podem ser classificados em termotrópicos e

liotrópicos.

Os primeiros são constituídos por uma substância pura ou por uma

mistura de moléculas que possuem forma geométrica semelhante e se

apresentam no estado mesofásico em uma determinada temperatura (SANTOS,

2006; MORAIS, 2006). Ou seja, a temperatura é o parâmetro fundamental para

o controle termodinâmico dessa fase. Há dois pontos chaves que determinam o

início e o término da fase líquido cristalina: a temperatura de fusão que marca a

passagem do sólido cristalino para a mesofase e a ponto de clareamento que

marca a transformação dessa mesofase em um líquido isotrópico (LAGERWALL,

2012).

Os cristais liotrópicos, os mais comumente encontrados em emulsões,

são formados por uma mistura de moléculas que sofrem influência crítica da

concentração do solvente durante sua estruturação (SANTOS, 2006; MORAIS,

2006). São misturas de moléculas anfifílicas e solventes, e o ponto chave que

determina a formação da mesofase é a proporção entre esses componentes

(NETO, 2013).


41

Uma propriedade compartilhada por todas as substância mesogênicas é

serem anisométricas, isto é, são moléculas em que uma ou duas dimensões são

muito maiores que a terceira (MARTINS, 2013).

A presença de cristais líquidos na formulação pode resultar em algumas

propriedades vantajosas. Uma delas é a prevenção de processos de

coalescência, devido à formação de multicamadas ao redor das gotículas da

emulsão, que atuam como barreira reológica contra a coalescência. Ainda é

possível que haja a liberação controlada do ativo, proteção do ativo contra

degradação e aumento da concentração de água no estrato córneo (SANTOS,

2006; MORAIS, 2006).

Uma formulação com aplicação dermatológica deve possuir bom perfil de

estabilidade químico e físico, além de promover um ambiente adequado para

que o princípio ativo possa alcançar o sítio alvo. Outros fatores importantes são

a facilidade na aplicação e remoção, e a ausência de componentes que possam

exercer atividade irritante sobre a pele (ECCLESTON, 1997).

2.6 . Óleo de açaí

A palmeira Euterpe oleracea Mart, conhecida como açaizeiro, é nativa no

Brasil principalmente na região amazônica, se estendendo por todo esse

estatuário, e ainda pelas regiões litorâneas do Amapá, Pará, Piauí, Guiana e

Venezuela (FAVACHO, 2009). Pertencente à família Arecaceae (Palmae), é uma

espécie de clima tropical quente e úmido (BENTES-GAMA, 2005).

O açaizeiro cresce por brotações sucessivas a partir de uma unidade de

dispersão. Pode alcançar uma altura de 30 metros. Cada uma das

inflorescências gera um cacho com centenas de frutos, caracterizados pela


42

forma esférica com diâmetro de 1,0 a 1,5 centímetros e cor violácea escura

(FAVACHO, 2009).

Figura 6: Açaizeiro (Euterpe Oleracae).

O Brasil tem grande destaque, posicionando-se como o maior produtor,

consumidor e exportador dessa espécie que se caracteriza como a palmeira

mais produtiva da região, tanto em frutos como em gêneros derivados da planta

(MENEZES, 2005).

Grande interesse tem surgido a cerca da espécie Euterpe oleracea devido

a estudos que comprovam suas atividades farmacológicas (KANG et al., 2010;

FERRARI; ROCHA-FILHO, 2011; FAVACHO et al., 2011; COSTA et al., 2010).

A polpa desse fruto possui grande quantidade de antocianinas, pigmentos

hidrossolúveis responsáveis pela cor arroxeada (MENEZES, 2008). As

antocianinas são glicosídeos das antocianidinas, fazem parte do grupo dos

flavonóides, em que o núcleo básico é a estrutura do íon 4-hidroxiflavilium, e são

compostos de duas ou três partes: a aglicona (antocianidina); o carboidrato e,

freqüentemente, um grupo acil (GUIMARÃES, 1987). São reconhecidas por

diversas propriedades farmacológicas, incluindo anticarcinogênica,


43

antiinflamatória e antimicrobiana e a prevenção da oxidação de proteínas de

baixa densidade (MENEZES, 2008). E, além disso, agem como antioxidante,

eliminando diretamente as espécies reativas de oxigênio (PACHECO-

PALENCIA et al., 2009; ZHANG et al., 2010).

Schauss et al. (2006) investigaram por meio de diferentes ensaios a

capacidade antioxidante de um pó formado pela liofilização da polpa e casca do

fruto da Euterpe oleracea. Foi demonstrada a atividade antioxidante mais alta

relatada para qualquer fruta ou vegetal contra o radical livre peroxila (RO2.-).

Além disso, foi mostrada atividade excelente contra superóxido e atividade

moderada contra os radicais peroxinitrito (ONOO-) e hidroxila (OH.). Ainda nesse

estudo, o liofilizado apresentou capacidade para inibir as enzimas COX-1 e COX-

2, indicando potencial atividade anti-inflamatória.

O óleo fixo de Euterpe oleracea contem diversos compostos fenólicos,

que possuem propriedades antioxidantes. Esse fato o torna interessante para o

mercado alimentício, cosmético e farmacêutico (PACHECO-PALENCIA et al.,

2008).

Esse óleo é constituído majoritariamente de ácidos graxos

monoinsaturados (60%) e poliinsaturados (14%). Os ácidos graxos tem

reconhecido efeito em atenuar o processo inflamatório interferindo em diferentes

pontos da cascata inflamatória como a vasoconstrição, quimiotaxia, adesão,

diapedese, ativação e morte celular (FAVACHO, 2009).

Tabela 2: Concentração dos principais compostos fenólicos presentes

no óleo de açaí (PACHECO-PALENCIA, 2008).


44

Composto fenólico Concentração relativa (%)

Trímeros de Procianidinas 27,0

Ácido Vanílico 21,6

Dímeros de Procianidinas 14,3

Ácido Siríngico 14,3

Ácido p-Hidrobenzóico 11,9

Ácido Protocatecuico 8,4

Ácido Ferúlico 1,4

Outros 1,1

Tabela 3 - Concentração dos ácidos graxos presentes no óleo de açaí

(NASCIMENTO, 2006).

Ácidos Graxos Concentração relativa (%)

C16:0 Ácido Palmítico 22,0

C16:1 Ácido Palmitoléico 2,0

C18:0 Ácido Esteárico 2,0

C18:1 Ácido Oléico 60,0

C18:2 Ácido Linoléico 12,0

C18:3 Ácido Linolênico Traços

C20:0 Ácido Araquídico 2,0


45

2.7 . Resveratrol

Os compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas no

reino vegetal. São subdivididos em duas categorias: os flavonóides, tais como a

quercetina e a catequina e os não-flavonóides, que incluem o resveratrol

(BACHUR, 2008).

O resveratrol é uma fitoalexina polifenólica da classe dos estilbenos,

produzida por uma grande variedade de vegetais como uvas, amendoins,

oxicocos, mirtilos (SAUTTER, 2008; CARSTEN, 2008). Fitoalexinas são

compostos antimicrobianos de baixo peso molecular e fazem parte do

mecanismo de auto-defesa de diversas plantas. Sua síntese é naturalmente

desencadeada em situações de estresse (MORENO, 2009).

A biossíntese do resveratrol ocorre através de um sinal químico, gerado

por estresse, que induz o aumento da expressão do gene estibeno sintetase, o

qual promove o acúmulo de mRNAestilbeno sintetase, responsável pela

formação da enzima estilbeno sintetase. Por sua vez, esta enzima catalisa a

reação entre uma molécula de p-coumaroyl-CoA e três moléculas de malonyl-

CoA, substratos estes presentes nas plantas, originando o resveratrol na área

afetada (MORENO, 2009).

Essa fitoalexina pode ser encontrada sob duas formas isoméricas trans-

resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbeno) e cis-resveratrol (cis-3,5,4’-

trihidroxiestilbeno) (SAUTTER, 2008).


46

Figura 7: Estrutura química do trans-resveratrol.

Muitos estudos atribuem atividades terapêuticas ao isômero trans-

resveratrol: como ação antiinflamatória, antimicrobiana, antioxidante,

anticarcinogênica, radioprotetora e a redução do risco de aterosclerose

(SAUTTER, 2008; FANG, 2012; CHAN et al., 2002; CARSTEN, 2008; SHAW,

2007).

As atividades antioxidantes são relacionadas com sua habilidade de

neutralizar diretamente os radicais livres. Somada a isso, há ainda capacidade

de promover a ativação de enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase,

catalase, peroxidase, glutationa redutase, glutationa redutase, selenofosfato

sintetase (CARSTEN, 2008; DENISSOVA, 2011).

O resveratrol tem a habilidade de aumentar o tempo de permanência das

células na fase S do ciclo celular, e consequentemente provocar uma diminuição

das fases G2 e M. Desse modo, as células permanecem menos tempo nas fases

mais susceptíveis aos danos causados pela radiação. (SGAMBATO et al., 2001).

Carsten et al. (2008), em um estudo sobre a atividade radioprotetora in

vivo, constataram que o grupo camundongos não-tratados submetidos a

radiação desenvolveu muito mais aberrações cromossômicas nas células da


47

medula óssea que o grupo de camundongos submetido a mesma quantidade de

radiação mas sob tratamento prévio com resveratrol.

O resveratrol tem potencial para inibir as infecções secundárias que

muitas vezes são observadas em casos de dermatites. Foi demonstrado por

Chan e colaboradores (2002) o potencial antimicrobiano do resveratrol. Essa

substância inibe in vitro o crescimento das bactérias Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococus aureus e Enterococcus faecalis; e de alguns fungos dos gêneros

Tricophyton, Epidermophyton e Microsporum.

As atividades antioxidantes, a capacidade de alterar a duração das fases

ciclo celular e sua baixa toxicidade fazem o resveratrol um candidato atraente

para a radioproteção das células saudáveis (JUAN et al., 2002; CARSTEN,

2008).

Ainda não é descrito na literatura um procedimento padrão para evitar e

tratar casos de radiodermatite. Devido a isso, é necessário o desenvolvimento

de uma terapia tópica que resulte na redução dos efeitos adversos da radiação

na pele e que não altere a ação da radiação ionizante no tratamento

antineoplásico. Desse modo, evita-se a interrupção do tratamento radioterápico

e aumenta a qualidade de vida do paciente (NAIR et al., 2001)..

OBJETIVOS

Objetivos

49

3. OBJETIVOS

3.1 - Objetivos gerais

O objetivo desse estudo é desenvolver e caracterizar emulsões estáveis

com a presença de cristais líquidos utilizando tensoativos não-iônicos e

empregando óleo de açaí como fase oleosa para a incorporação do ativo

resveratrol, para aplicação como radioprotetor de uso tópico

3.2 - Objetivos específicos

Avaliar a atividade antioxidante do óleo de açaí;

Realizar diagrama de fases da composição óleo de açaí/ Brij O3 e Brij

O20/Água;

Realizar diagrama de fases com a combinação de tensoativos Brij S2 e

Brij CS20.

Escolher entre as formulações desenvolvidas uma emulsão estável e com

presença de cristais líquidos e incorporar 1 % de resveratrol;

Caracterizar e avaliar a estabilidade das emulsões obtidas com

resveratrol;

Avaliar o perfil de liberação do resveratrol a partir da formulação.

MATERIAL E MÉTODOS

Material e métodos

51

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material

Para o desenvolvimento das emulsões foram utilizados:

Óleo de açaí (Euterpe oleracea Mart.) refinado - Beraca Ingredientes Ltda.

Brij O20 (álcool oleíco etoxilado - Oleth-20 ) – Croda do Brasil

Brij O3 (álcool oleíco etoxilado - Oleth-3 ) – Croda do Brasil

Brij S2 (álcool esterarílico etoxilado - Steareth-2) – Croda

Brij CS20 (álcool cetoestearílico etoxilado - Ceteareth 20) – Croda

Água recém destilada

Resveratrol - FAGRON

4.2 Métodos

4.2.1 Avaliação de atividade antioxidante do óleo de açaí in vitro

4.2.1.1 Sequestro do radical DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

1,0 ml de uma solução etanólica de DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

(0,3 mM) foi adicionado a 2,5 ml de soluções do óleo em diferentes

concentrações.

Após incubação de 30 e de 60 minutos, a absorbância resultante no

comprimento de onda de 517 nm foi determinada com auxílio de um

espectrofotômetro (Thermo Spectronic modelo - Helios α).

Como controle negativo foi utilizada uma solução de 1 ml DPPH (0,3mM)

somada a 2,5 ml de acetona. Para cada concentração do óleo foi utilizado uma

Material e métodos

52

referência (branco) diferente contendo solução do óleo na concentração avaliada

(2,5 mL) e acetona (1,0 mL).

A partir do decréscimo da absorvância foi calculado o percentual de inibição

segundo a fórmula (Equação 1):

Eq. 1:

Percentual de inibição = (Aborvânciacontrole-Absorvânciaamostra/Absorvânciacontrole) x 100

Na qual:

absorvânciacontrole equivale a absorbância do controle negativo;

absorvânciaamostra é a absorbância corrigida da amostra (absorvância resultante

subtraída do branco com mesma concentração do óleo);

Através do gráfico construído com base no percentual de inibição

calculado e as concentrações do óleo foi determinada a concentração que

resulta em 50 % de inibição do radical (IC50 %) (MEZADRI, 2010).

4.2.1.2 Método do ABTS.liofilizado

Para se obter o liofilizado, o radical ABTS foi solubilizado com uma

solução de persulfato de sódio 2,45 mM a fim formar uma solução de ABTS 7

mM (RE, 1999). Essa solução foi mantida protegida da luz por 16 horas a

temperatura ambiente e posteriormente congelada em freezer a -80 oC. Após o

completo congelamento, o material foi liofilizado em um equipamento Liobras

L101. O tempo de liofilização somado ao tempo de congelamento foi equivalente

a 6 horas. O liofilizado resultante foi usado nas análises.

Em seguida, um grama de óleo foi diluído 10 vezes em uma solução

metanol: clorofórmio (1:1). O liofilizado foi dissolvido no mesmo solvente para

Material e métodos

53

formar uma solução com absorvância de 0,700±0,030 no comprimento de onda

de 752 nm.

Uma quantidade equivalente a 100 µL do óleo diluído foi misturada com

2,9 ml da solução do liofilizado e após 10 minutos de incubação a temperatura

ambiente, a absorvância resultante foi medida no comprimento de onda de 752

nm. A curva de calibração foi construída através de concentrações conhecidas

de α-tocoferol e o resultado expresso em mg de α-tocoferol equivalente por kg

do óleo (DURMAZ, 2012).

4.2.2 Preparação das formulações

As emulsões foram desenvolvidas segundo o método de inversão de

fases, no qual a fase aquosa e a fase oleosa (óleo de açaí e combinação de

tensoativos) foram aquecidas separadamente até atingirem a temperatura de 75

± 1 graus Celsius. Posteriormente, a fase aquosa foi vertida sobre a fase oleosa

sob agitação de 600 RPM com o agitador FISATOM Mod. 315D e manteve-se

agitação constante até que a formulação atingisse a temperatura ambiente.

Durante a preparação das formulações contendo o Resveratrol, seguiu-

se o mesmo procedimento, porém foi acrescentada a quantidade equivalente a

1% (p/p) do fármaco na fase oleosa previamente ao aquecimento.

4.2.3- Diagrama de fases

Foi elaborado um diagrama de fases ternário, construído a partir da

variação das concentrações dos constituintes em valores correspondentes a

10% da formulação (Tabela 3). As formulações foram avaliadas

Material e métodos

54

macroscopicamente e microscopicamente após 24 horas e determinou-se a

região do diagrama onde as emulsões se apresentaram estáveis e com presença

de cristais líquidos.

Tabela 3: Concentrações dos constituintes das formulações

desenvolvidas através do diagrama de fases

Formulação Concentração

do óleo (%p/p)

Concentração

da mistura de

tensoativos

(%p/p)

Água

(%p/p)

1 80 10 10

2 70 20 10

3 70 10 20

4 60 30 10

5 60 20 20

6 60 10 30

7 50 40 10

8 50 30 20

9 50 20 30

10 50 10 40

11 40 50 10

Material e métodos

55

12 40 40 20

13 40 30 30

14 40 20 40

15 40 10 50

16 30 60 10

17 30 50 20

18 30 40 30

19 30 30 40

20 30 20 50

21 30 10 60

22 20 70 10

23 20 60 20

24 20 50 30

25 20 40 40

26 20 30 50

27 20 20 60

28 20 10 70

29 10 80 10

Material e métodos

56

30 10 70 20

31 10 60 30

32 10 50 40

33 10 40 50

34 10 30 60

35 10 20 70

36 10 10 80

Figura 08 - Diagrama de fases

4.2.4 - Determinação do tipo de emulsão

Material e métodos

57

Para avaliação do tipo de emulsão (A/O ou O/A) foi utilizado o teste de

diluição que consiste na determinação da solubilidade da fase externa da

emulsão em água (DAVIS, 1977). Foram adicionados 3 gramas da emulsão em

um tubo de ensaio contendo 7,0 mL de água destilada. Após agitação, o sistema

foi avaliado e classificado através do seguinte critério:

Emulsão O/A = quando a mistura apresentou-se com aspecto

homogêneo;

Emulsão A/O = quando a mistura apresentou-se com aspecto não

homogêneo, com aparência de mistura coagulada.

4.2.5- Avaliação de estabilidade

4.2.5.1 – Análise macroscópica

As formulações, após 24 horas do preparo, foram submetidas à

verificação do surgimento de sinais de instabilidade. Baseado no aspecto

macroscópico, foram classificadas em um dos seguintes padrões:

inalterado;

separação de fases.

4.2.5.2 - Análise microscópica

Sobre uma lâmina de vidro, foi colocada uma gota da formulação e cobriu-

se com lamínula. As amostras foram analisadas sob luz polarizada em um

microscópio Zeiss Scope A1 e as fotos obtidas com câmera AxioCam ICc3.

4.2.5.3 Teste de estresse térmico

Material e métodos

58

As amostras, em duplicata, foram submetidas ao aumento gradual de

temperatura em banho-maria termostatizado (Thermomix®18BU B.Braun

Biotech Internacional) e analisadas macroscopicamente quanto ao surgimento

de sinais de instabilidade. O teste iniciou-se em 40º e a cada 30 minutos, as

amostras eram analisadas e a temperatura era elevada em 5ºC. O procedimento

foi repetido até que a temperatura atingisse 80ºC.

4.2.5.4 Teste de centrifugação

Um grama de cada formulação foi colocado em microtubo e submetido a

ciclos de 10 minutos em três taxas de rotações (7500 RPM, 10000 RPM e 12500

RPM) em uma centrífuga Eppendorf 5415D. O teste foi realizado em duplicada

e ao final de cada ciclo as amostras eram analisadas macroscopicamente quanto

ao surgimento de sinais de instabilidade.

4.2.6 - Determinação do comportamento reológico

As determinações foram realizadas em Reômetro (Brookfield modelo

RVDV -III) tipo cone/placa, acoplado a um Software Rheocalc versão V 3.0,

utilizando o spindle CP51 e 1,0 g de amostra a 25°C. As medidas foram feitas

utilizando velocidade de rotação de 1 a 60 RPM, com variação em intervalo de

10 em 10 rpm, para se obter uma curva ascendente. O procedimento foi repetido

no sentido inverso, com velocidades progressivamente decrescentes (60-10

RPM), para se obter a curva descendente.

Material e métodos

59

4.2.7- Teste de liberação

4.2.7.1 - Diálise

Três gramas amostra da emulsão foram colocadas dentro de uma solução

tampão acetato (pH=5,5) contendo 5 % de PEG-8 Caprylic/Capric Glycerides

(Labrasol®-Gateffosse). Dentro desta solução foram acomodadas as bolsas de

diálise constituídas por membrana de celulose (Dialysis tubing cellulose

membrane, Sigma-Aldrich) e contendo 2 mL da mesma solução citada

anteriormente. O sistema foi mantido a 37 ± 1°C por um banho-maria

termostatizado e sob agitação constante. Alíquotas de 1 mL do meio doador e

do saco de diálise foram coletadas a intervalos de tempos pré-determinados (0h,

0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 3h, 4h, 6h, 12h e 24h) e 1 mL de tampão foi adicionado ao

sistema em reposição a cada alíquota retirada. O conteúdo de fármaco foi

quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE e a

percentagem de liberação foi calculada pela relação entre a concentração de

princípio ativo dentro do saco de diálise e no meio doador.

4.2.7.2 – Quantificação do resveratrol

A quantificação da concentração de Revesratrol no teste de liberação foi

feita através de CLAE. Foram utilizadas condições estabelecidas pelo método

desenvolvido e validado por Nenem (2010) para dosagem de resveratrol.

Material e métodos

60

Fase móvel: Metanol : Água (47:53)

Fase estacionária: Coluna cromatográfica Nucleosil 100-5 (MACHEREY-

NAGEL, Duren, Alemanha) de octedecilsílica C18,

tamanho de partícula 3µm, dimensões 4,6X150mm

Fluxo: 1,0 mL/min

Detecção: UV 312 nm

Volume de injeção: 20 µL

Resultados e discussão

61

RESULTADOS E DISCUSSÃO


62

5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 – Avaliação da atividade antioxidante do óleo de açaí in vitro

Para avaliar a atividade antioxidante do óleo de açaí, soluções com

diferentes concentrações foram utilizadas para a verificação de sua capacidade

de sequestro do radical DPPH•. Os resultados para as diferentes concentrações

do óleo de açaí são apresentados na Figura 09.

A correlação entre o percentual de inibição e a concentração de óleo de

açaí (y = 31,685ln(x) - 31,44) forneceu um IC50 de 13,06 mg/mL. Uma alta

atividade antioxidante é indicada por um baixo valor de IC50. O resultado

encontrado para o óleo de açaí é comparável ao valor encontrado para o óleo de

buriti (12,60 mg/mL), um óleo com potencial antioxidante previamente descrito

na literatura e com alta quantidade de substâncias como carotenoides e α-

tocoferol (ZANATTA et al., 2010).

O radical DPPH• possui coloração arroxeada e apresenta absorvância no

comprimento de onda de 517 nm, mas há uma diminuição desta absorvância

quando o radical reage com algum agente antioxidante. Informações sobre a

capacidade antioxidante de uma substância podem ser fornecidas relacionando

o decréscimo da absorvância da solução de DPPH• com o percentual de inibição

da substância sobre esse radical.


63

Figura 9: Gráfico correlacionando o percentual de sequestro do radical DPPH•

a diferentes concentrações do óleo de açaí.

Existem outros métodos para caracterização in vitro de atividade

antioxidante que se baseiam na reação do material a ser testado com um radical.

Um destes é a utilização do radical monocátion ABTS•1 (2,29-azinobis-(3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) que é originado pela oxidação do ABTS

com persulfato de potássio e reduzido na presença de algum antioxidante doador

de oxigênio, resultando em diminuição da absorvância da solução no

comprimento de onda de 752 nm.

O resultado do teste é baseado na comparação da absorvância resultante

após a reação com a amostra com uma curva de calibração (Figura 10) feita com

o padrão α-tocoferol, uma vitamina lipofílica com atividade antioxidante bem

descrita pela literatura (ACKER, VAN et al., 2000).

y = 31,685ln(x) - 31,44R² = 0,9911

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60

Pe

rce

ntu

al d

e in

ibiç

ão (

%)

Concentração do óleo de açaí (mg/mL)


64

Após a realização do teste com o radical DPPH, foi realizada a avaliação

do potencial antioxidante do óleo de açaí através da inibição do radical ABTS•1,

visando a confirmação e melhor caracterização de possível mecanismo de ação

deste material.

A solução de ABTS•1 após incubação com óleo de açaí apresentou

absorvância resultante de 0,523, a qual representa 1882 miligramas equivalente

de tocoferol por quilo do óleo, calculada com a utilização da curva de calibração

(Figura 10). Esse valor é superior aos valores descritos na literatura para os

óleos de milho, oliva, semente de uva, amêndoas e de gergelim (DURMAZ,

2012).

Figura 10: Gráfico da curva de calibração com α-tocoferol no teste de

ABTS•1

.

Durante o processo de extração do óleo de açaí, as antocianinas não são

retidas na polpa, resultando em um óleo de coloração verde escura e não a cor

violácea característica do fruto do açaizeiro (PEREIRA, 2008). A atividade

antioxidante do óleo de açaí provavelmente está relacionada aos compostos

y = -0,0005x + 0,6671R² = 0,991

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 100 200 300 400 500 600

Ab

sorv

ânci

a

Concentração de α-tocoferol (mg/mL)

Curva de calibração


65

polifenólicos presentes em sua composição como o ácido vanílico, ácido p-

hidrobenzóico e ácido siríngico. Os polifenóis são agentes redutores capazes de

doar um elétron de hidrogênio, ou seja, esses compostos tem a capacidade de

neutralizar espécies reativas (CITRIN, 2010). A incorporação do óleo de açaí em

uma formulação para uso tópico pode ser extremamente útil para a diminuição

da formação de radicais livres, reduzindo, desse modo, os danos causados pela

radiação.

5.2- Desenvolvimento da formulação

Para que haja a formação de uma emulsão, normalmente combinam-se

os seguintes componentes: óleo, água e tensoativo. E quando necessário,

utiliza-se um co-tensoativo. Uma forma de determinar esse sistema de

componentes é através do diagrama de fase pseudoternário, no qual as fases

aquosa, oleosa e a mistura de tensoativo/co-tensoativo são representadas nos

vértices de um triângulo. O desenvolvimento de emulsões seguindo o diagrama

de fases permite identificar qual a proporção dos componentes (óleo, água e

tensoativos) que resulta em melhor estabilidade ou a obtenção de sistemas com

características distintas, como emulsões com cristais líquidos (OLIVEIRA, 2004).

Para a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij O20 na proporção (80:20),

as formulações 4, 6, 9, 11, 14, 16, 22, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35 e 36 mantiveram-

se estáveis durante a análise macroscópica de 24 horas.

Na análise macroscópica após 24 horas para a combinação de

tensoativos Brij CS20 e Brij S2 (50:50), as formulações 6, 9, 10,11, 14,15, 16,

22, 26,27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35 e 36 mantiveram-se estáveis.


66

As regiões do diagrama de fases que fornecem proporções de água,

tensoativo e óleo adequadas para a formação de emulsões estáveis para as

combinações de tensoativos utilizadas estão representadas na Figura 11 e na

Figura 12.

Figura 11 - Diagrama de fases para a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij

O20 (80:20)


67

Figura 12 - Diagrama de fases para a combinação de tensoativos Brij CS20 e

Brij S2 (50:50)

Quando dois líquidos imiscíveis são colocados em um mesmo sistema e

mantidos sob agitação constante, há a tendência de que um dos líquidos forme

gotículas e se disperse no outro. No entanto, quando essa agitação cessa, o

fenômeno observado é a coalescência das gotículas e a consequente separação

dos líquidos (OLIVEIRA, 2004).

Termodinamicamente, esse processo de emulsificação resulta em

aumento da área interfacial e consequentemente em aumento da energia livre,

tornando o sistema instável. Nesse aspecto, os tensoativos tem a função

fundamental na estabilização das emulsões, pois possuem a capacidade de

reduzir a tensão interfacial entre a fase aquosa e a fase oleosa (OLIVEIRA,

2004).


68

A estabilidade de uma emulsão é determinada pelas propriedades da

camada de tensoativos formada na superfície das gotículas. Essas propriedades

são dependentes da composição e concentração dos tensoativos utilizados

(MORAIS, 2006).

As fotomicrografias na Figura 13 mostram os resultados da análise

microscópica com luz polarizada para a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij

O20 na proporção (80:20) e a Figura 14 para a combinação de tensoativos Brij

CS20 e Brij S2 (50:50).


69

Figura 13:Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a 36 com a combinação de tensoativos Brij O3 e Brij O20 (aumento 40 vezes).

q


70

Figura 14: Fotomicrografias sob luz polalizada das formulações 1 a 36 com a

combinação de tensoativos Brij S2 e Brij CS20 (aumento 40 vezes)


71

Os cristais líquidos quando ocorrem em emulsões podem ser detectados

por microscopia com luz polarizada, pois possuem a característica de serem

birrefrigentes (FRIBERG et al., 1987).

Através da análise microscópica sob luz polarizada foi possível constatar

que a combinação de tensoativos Brij S2 e Brij CS20 resulta em maior

quantidade de estruturas birrefringentes identificadas como cristais líquidos.

A maior presença de cristais líquidos é vantajosa devido à possibilidade

de estas estruturas aumentarem a estabilidade da emulsão pela prevenção de

processos como a coalescência (SANTOS, 2006). Outra vantagem é que a

presença de cristais líquidos pode aumentar a permeação percutânea de

substâncias encapsuladas na formulação (BRINON, 1999), permitindo que maior

quantidade do ativo atinja camadas mais profundas da pele.

As emulsões consideradas macroscopicamente estáveis foram

submetidas ao teste para determinação do tipo de emulsão, no qual foi

constatado que as emulsões 14, 33, 34, 35 e 36 de ambas as combinações de

tensoativos apresentaram-se como emulsões óleo em água. É descrito na

literatura que a aplicação tópica de emulsões O/A resulta em maior hidratação

da pele. Esse fato contribui para a diminuição de reações como eritema,

descamação e prurido (JENSEN, 2011).

Desse modo, as emulsões 35 e 36 da combinação de tensoativos Brij S2

e Brij CS20 (50:50) foram selecionadas para avaliação prévia de estabilidade na

qual os emulsões foram submetidas ao teste de centrifugação. E como resultado

observou-se que a formulação 35 possuiu características mais adequadas para


72

a veiculação do principio ativo, devido ao fato de apresentar maior resistência as

taxas de rotação que a formulação 36.

Por fim, determinou-se utilização da formulação 35 da combinação de

tensoativos Brij S2 e Brij CS20, doravante denominada 35-S2CS20 para a

incorporação 1% de resveratrol. A formulação com a adição do ativo foi

denominada como 35R-S2CS20, e ambas foram submetidas aos testes de

estabilidade e caracterização.

Tabela 5 - Descrição dos componentes e suas respectivas proporções

nas formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20.

Componente 35-S2CS20 35R-S2CS20

Óleo de açaí 10% 10%

Brij S2 10% 10%

Brij CS20 10% 10%

Resveratrol - 1%

Água 70% 69%

5.3 - Avaliação da estabilidade

5.3.1 - Avaliação macroscópica

As formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 foram consideradas estáveis

na avaliação macroscópica, como pode ser observado na Figura 15.


73

Figura 15- Fotografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 nos dias 1,

8, 15, 22 e 29.

Foi possível observar que as emulsões se mantiveram homogêneas,

viscosas e com a cor original ao longo do tempo, indicando que não houve

nenhum processo de instabilidade macroscopicamente detectável nesse

período.

Para que uma emulsão seja considerada estável é necessário que ela

mantenha, dentro de limites pré-estabelecidos, a integridade química, físico-

química e microbiológica de todos os seus componentes.

A perda de estabilidade físico-química pode se manifestar através dos

seguintes processos:

Cremeação: processo no qual devido a diferença de densidade entre os

líquidos ocorre migração dos glóbulos, resultando em heterogenicidade

da distribuição dos mesmos pela fase dispersante.

Floculação: processo no qual o filme interfacial se mantém intacto, porém

há agregação dos glóbulos formando aglomerados.


74

Coalescência: processo onde há junção de dois ou mais glóbulos,

formando uma gotícula maior. Esse fato resulta em separação irreversível

da emulsão em duas fases distintas (BOOCK, 2007).

Perda de estabilidade pode resultar em mudanças no aspecto da formulação,

diminuição da atividade terapêutica ou a formação de compostos tóxicos,

irritantes ou indesejáveis.

5.3.2 - Análise Microscópica

As formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 foram analisadas através de

microscopia sob luz polarizada e os resultados estão demonstrados na Figura

16.

Não foi observada diferença entre o perfil microscópico da formulação

com resveratrol e sem resveratrol, indicando que o ativo na concentração

utilizada não interfere no processo de formação dos cristais líquidos. Além

disso, ambas as formulações mantiveram a mesma distribuição e tamanho dos

cristais líquidos do primeiro ao vigésimo nono dia, demonstrando, que não

ocorreram alterações químicas ou físicas que poderiam alterar a estrutura dos

cristais líquidos formados.

Os cristais líquidos possuem a propriedade de alterar o plano de

polarização da luz quando esta os atravessa. Essa característica física é

denominada anisotropia óptica ou birrefringência. Desse modo, quando uma fina

camada de cristal líquido é observada entre polarizadores cruzados, é possível

visualizar diferentes padrões de cores e formas (ECCHER, 2010).


75

Figura 16 - Fotomicrografias das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 nos dias 1, 8, 15, 22 e 29

Dia 1

Dia 8

Dia 15

Dia 22

Dia 29

35-S2CS20 35R-S2CS20


76

5.3.3 - Teste de centrifugação

Na tabela 6 estão demonstrados os dados do teste de

centrifugação para as formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 ao longo do

tempo.

Tabela 6 - Resultados de centrifugação

Sem resveratrol Com resveratrol

7500

RPM

10.000

RPM

12.500

RPM

7500

RPM

10.000

RPM

12.500

RPM

Dia 1 Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt Inalt





Em um teste de centrifugação, as amostras são submetidas a forças

gravitacionais muito mais elevadas que a força exercida pela gravidade em

condições normais. Consequentemente, possíveis processos de instabilidade

são acelerados e se tornam perceptíveis em um menor tempo (ANDRADE,

2008). Desse modo, pode-se estimar o comportamento das emulsões a longo

prazo com base do comportamento destas após ciclos de centrifugação

(TADROS, 2007).


77

Ambas as formulações mantiveram-se estáveis ao longo do tempo

mesmo quando submetidas a rotações de 12500 RPM. Esse fato indica que as

formulações são fisicamente estáveis. Esse dado é condizente com dados da

literatura para formulações com cristais líquidos, pois o aumento da viscosidade

proporcionado pela presença destas estruturas diminui a ocorrência de

processos de instabilidade (ANDRADE, 2008).

5.3.4- Teste de estresse térmico

Foram notadas perda de viscosidade a partir da faixa de 60 ºC e

separação de fases na faixa de 65 ºC quando submetidas ao teste de estresse

térmico para as formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20, como pode ser

observado na Tabela 7. Isto indica que a presença do resveratrol na formulação

não acelera processos de instabilidade gerados pelo aumento de temperatura.

O aumento da temperatura é capaz de provocar processos de

instabilidade numa emulsão, devido à diminuição da viscosidade aparente da

fase dispersante. Essa perda de viscosidade aumenta a motilidade cinética das

partículas presentes no meio, favorecendo o processo de coalescência e

cremeação (AUTON, 2005).


78

Tabela 7 - Resultados do teste de estresse térmico

35-S2CS20 35R-S2CS20

40ºC 45ºC 50ºC 55ºC 60ºC 65ºC 40ºC 45ºC 50ºC 55ºC 60ºC 65ºC

Dia

1

Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep Inalt Inalt Inalt Inalt PV Sep

Dia

8


Dia

15


Dia

22


Dia

29


Legenda: Inalt = inalterado, pv= perda de viscosidade e sep= separação de fases

A perda de viscosidade e a separação de fases nas emulsões desse

estudo podem ser explicadas pela ocorrência de transição de fases dos cristais

líquidos presentes na formulação. Antes dessa faixa de temperatura, a principal

responsável pela estabilidade é a presença de uma rede liquido-cristalina que

forma uma barreira contra a coalescência dos glóbulos da fase oleosa.

Entretanto, é descrito que os cristais líquidos desaparecem em temperaturas

superiores a essa faixa devido a processo de transição de fases (fusão). Deste

modo, as emulsões ficam mais propensas a sofrerem processos de instabilidade

como a coalescência (SANTOS, 2007).

5.3.5 - Análise do comportamento reológico

De uma maneira geral, a reologia pode ser definida como a ciência que

estuda o escoamento da matéria. As propriedades reológicas de uma substância


79

têm forte impacto nos processos de produção, transporte, armazenamento e nas

ações de enchimento e retirada do material da embalagem (MILAN, 2007).

Outro fator importante é a aceitação do produto, pois características como

espalhabilidade, textura, consistência e oleosidade exercem uma ampla

influência na preferência dos pacientes. Ainda deve-se levar em conta que essas

propriedades refletem na aderência, fator importante para que a formulação se

mantenha sobre a pele tempo suficiente para exercer efeito terapêutico ou

cosmético (MILAN, 2007).

A viscosidade também exerce influência na estabilidade física do sistema.

Uma maior viscosidade pode contribuir para que fenômenos como cremeação,

coalescência, floculação e sedimentação ocorram em menor grau, visto que

haverá uma maior resistência física à movimentação das partículas

proporcionada pelo sistema emulsionado (GOTO, 2011).

Com o teste de reologia, tem-se a intenção de observar ao longo do tempo

possíveis variações na viscosidade da formulação que poderiam indicar

processos de instabilidade ou degradação. E, além disso, caracterizar a emulsão

quando as suas propriedades de escoamento.

Na figura 17, são demonstrados os gráficos resultantes desse estudo.


80

Figura 17 - Reogramas das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20

35R-S2CS20

35-S2CS20

Dia 1

Dia 8

Dia 15

Dia 22

Dia 29

a b

a

c d

c

e f

g h

i j


81

Observa-se que ambas as formulações apresentam perfis reológicos

semelhantes, indicando que a presença do resveratrol não induz processos de

instabilidade que resultam em alterações da viscosidade nesse sistema

emulsionado.

A viscosidade aparente diminui em função taxa de cisalhamento,

caracterizando perfil não-newtoniano das emulsões testadas. Fluidos não-

newtonianos são aqueles que sob temperatura e composição constantes

apresentam viscosidade aparente dependente da taxa de cisalhamento ou

tensão de cisalhamento (SILVA, 2011).

As formulações apresentaram comportamento pseudoplástico. Esse

comportamento é adequado para o uso tópico, pois promove maior facilidade de

aplicação. O cisalhamento causado durante aplicação resulta em diminuição da

viscosidade, permitindo melhor fluidez e consequentemente uma aplicação mais

homogênea e agradável.

Foi constatada a presença de tixotropia em ambas as formulações. A

tixotropia é uma alteração da viscosidade em função do tempo de deformação,

ou seja, cisalhamento aplicado ao fluido. Essa alteração é percebida como perda

de viscosidade do sistema. Caracteriza-se como um fenômeno reversível, pois

ocorre aumento da viscosidade quando se cessa a deformação, porém não se

recupera completamente seu estado inicial (ALMEIDA & BAHIA, 2003).

Formulações que apresentam tixotropia se tornam menos viscosas

quando sofrem pressão externa, consequentemente irão se espalhar mais

facilmente durante a aplicação. E a posterior recuperação da viscosidade no


82

momento em que é finalizada a aplicação impede que a formulação escorra

durante o procedimento(MILAN, 2007).

5.4 - Avaliação do perfil de liberação da formulação

A emulsão 35R-S2CS20 foi submetida ao estudo do perfil de liberação do

resveratrol a partir da formulação.

Figura 18 - Curva de calibração do resveratrol

y = 153475x + 290821R² = 0,9992

0

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

120000000

140000000

160000000

180000000

0 200 400 600 800 1000 1200

Curva de calibração do resveratrol


83

Figura 19: Gráfico de liberação do resveratrol por diálise inversa ao longo de

24 horas.

A emulsão com resveratrol apresentou perfil que atinge 25% do ativo

liberado em 6h e a partir de 12h todo o ativo já se encontrava livre. Para se obter

a eficácia da radioproteção, é necessário que os agentes radioprotetores

estejam livres e presentes no interior das células no momento ou logo após a

irradiação, pois o mecanismo de ação desses compostos é a captura dos

radicais livres presentes no meio celular (MORENO, 2009).

A quantidade de fármaco disponível para atingir os sítios alvos tem

relação direta com o processo de liberação do fármaco da formulação. Esse

processo, denominado cedência ou liberação, depende das características

físico-químicas do veículo utilizado e do modo de preparo da formulação. Desta

forma, é fundamental a avaliação desse parâmetro em um produto destinado a

uso dermatológico.

Apesar da alta incidência de radiodermatites não existe protocolo definido

para o tratamento e prevenção dos sinais e sintomas dessa doença. Resultando

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 5 10 15 20 25

Liberação


84

muitas vezes em desconforto para o paciente, aumento nos custo e interrupção

do tratamento. Desse modo, faz-se necessário o desenvolvimento de uma

formulação para utilização tópica que diminua as consequências da exposição

da pele a radiação ionizante. Nesse contexto, foi possível obter uma emulsão

estável constituída por óleo de açaí e contendo cristais líquidos que devido às

características intrínsecas da emulsão e o poder antioxidante do óleo de açaí

tem o potencial para exercer efeito hidratante e a diminuição da formação de

radicais livres.

CONCLUSÃO

6 - CONCLUSÃO

O óleo de açaí possui relevante atividade antioxidante

As emulsões com os tensoativos Brij S2 e Brij CS20 apresentaram maior

quantidade de cristais líquidos que as formulações com a combinação de

tensoativos Brij O3 e Brij O20.

A incorporação do resveratrol na emulsão 35-S2CS20 não resultou em

perda de estabilidade ou diminuição na formação dos cristais líquidos.

As emulsões 35-S2CS20 e 35R-S2CS20 mantiveram-se o mesmo perfil

de estabilidade nos testes de centrifugação, estresse térmico, análise

macroscópica e análise microscópica ao longo de 28 dias.

A partir de 12h o resveratrol já encontra-se totalmente livre da formulação

35R-S2CS20 no teste de liberação in vitro.

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DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE EMULSÕES CONTENDO … › bitstream › 123456789 › 10135 › 1... · 74 Figura 17: Reogramas das formulações 35-S2CS20 e 35R-S2CS20. 79 . iv