DETECO E CARACTERIZAO DE MICRORGANISMOS SULFETOGNICOS NO SOLO DO IFBAIANO CAMPUS CATU: DIAGNSTICO PRELIMINARAlexandra Souza de CARVALHO (1); Victria Maria de Almeida Santos CEDRAZ (2); Weldon Fernandes dos SANTOS (3)(1) (2) (3) Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia Baiano - IFBaiano, Rua Baro de Camaari, Catu-Bahia, e-mail: alexandrasc@eafcatu.gov.br Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia Baiano - IFBaiano, Rua Baro de Camaari, Catu-Bahia, e-mail: vick.cedraz@gmail.com Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia Baiano - IFBaiano, Rua Baro de Camaari, Catu-Bahia, e-mail: weldon_gts15@hotmail.com

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RESUMO

A produo de gs sulfdrico ou sulfeto de hidrognio (H2S) por bactrias redutoras de sulfato (BRS) um problema mundial da indstria de petrleo e gs natural e as regies circunvizinhas, gerando impactos ao meio ambiente. Os problemas de corroso industrial esto associados produo desulfeto de hidrognio (biossulfetognese), alm disso, o aumento do teor de enxofre no petrleo bruto e gs importante. O presente trabalho tem como objetivo a deteco e caracterizao preliminar de microrganismos sulfetognicos, bem como a determinao da concentrao de sulfeto presente no solo do Instituto Federal Baiano da cidade de Catu, interior da Bahia, por ser uma regio circunvizinha da Indstria de Petrleo. Os microrganismos sulfetognicos foram cultivados em meios de cultura especficos e posteriormente sero isolados os gneros anaerbios mais comuns atravs das tcnicas microbiolgicas usuais. A populao microbiana total foi determinada atravs da tcnica do nmero mais provvel (NMP). Sulfeto de hidrognio (H2S) foi detectado nas diversas amostras de solo atravs do mtodo do azul de metileno. As concentraes encontradas variaram de 10 a 100 ppm. Concentraes abaixo de 10 ppm foram encontradas na regio anaerbia de uma coluna de Winogradsky. A coluna serviu para os testes estticos e preliminares.

Palavras-chave: biossulfetognese, BRS, petrleo

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INTRODUO

2.1 BIOSSULFETOGNESE2.1.1 Bactrias redutoras de sulfato

As Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS), descobertas por Beijerinck (1895) e que vm sendo estudadas exaustivamente ao longo deste sculo, so microrganismos que realizam a reduo desassimilatria de sulfato. Esse processo difere da reduo assimilatria que realizada por todas as plantas, fungos e a maioria das bactrias, onde os ons sulfato so reduzidos a sulfeto e este incorporado s vrias molculas orgnicas

como aminocidos e coenzimas. Na reduo desassimilatria, o on sulfato atua como agente oxidante para a metabolizao da matria orgnica, da mesma forma como atua o oxignio na respirao convencional. Uma pequena parcela do enxofre reduzido assimilada pelos microrganismos, porm, a maior parte excretada na forma de on sulfeto normalmente hidrolisado a sulfeto de hidrognio (H2S) livre. Algumas linhagens de bactrias redutoras de sulfato podem apresentar crescimento fermentativo na ausncia de ons sulfato, analogamente ao crescimento fermentativo das leveduras na ausncia de oxignio. No entanto, nenhuma das linhagens at hoje estudadas se mostrou capaz de crescer utilizando o oxignio como aceptor final de eltrons, e este, por sua vez desempenha sempre o papel de inibidor de crescimento. Desta forma essas bactrias so consideradas anaerbias estritas (ALMEIDA, P.F., 2006). O grupo das bactrias redutoras de sulfato compreende 09 gneros segundo Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, que a no ser pela capacidade de reduzir os ons sulfato, so biologicamente distintos. Os 02 gneros h mais tempo conhecidos so Desulfovibrio e Desulfotomaculum e nestes foram distribudas as espcies inicialmente isoladas. O gnero Desulfovibrio foi o mais estudado, e compreende nove espcies sendo Desulfovibrio desulfuricans o membro tpico deste grupo (VOORDOUW, G., 2003). Ao longo dos anos, novos gneros foram identificados, como por exemplo, Desulfobacter, Desulfonema, Desulfobulbus, etc. Estas bactrias, em sua maioria gram-negativas, apresentam-se geralmente na forma de vbrios de 0,5 -1,0 mm, podendo tambm ocorrer na forma sigmide; no esporulam e so mveis por meio de flagelo monotrquio. So mesoflicas com temperatura tima de crescimento na faixa de 34 a 37oC, com tolerncia mxima de 42 a 45oC, existindo tambm linhagens termoflicas com crescimento timo na faixa de 50 a 70oC. Normalmente utiliza-se como temperatura de incubao 30oC. A faixa de pH mais comumente empregada para crescimento de 7,2 a 7,6. O crescimento das bactrias redutoras de sulfato mesoflicas normalmente lento, a 30o C, levando de alguns dias at semanas de acordo com a espcie. J no caso das bactrias redutoras de sulfato termoflicas o crescimento mais acelerado levando em torno de 12 a 18 horas, a 55oC. Uma das razes do crescimento lento que o H2S, produto do metabolismo destas bactrias, reduz a taxa de crescimento e pode, quando em altas concentraes, lev-la a zero. Este fenmeno devido toxicidade intrnseca do H2S aos organismos vivos. Sabendo-se que o crescimento dessas bactrias no cultivo em regime de batelada freqentemente no exponencial, raramente referencia-se na literatura seu tempo de duplicao. No entanto, possvel generalizar, de forma qualitativa, que microrganismos produtores de acetato, como o caso da maioria das espcies de Desulfovibrio e Desulfotomaculum, parecem ser capazes de apresentar tempos de duplicao, a 30o C, em torno de 3 a 6 horas ou at menos. J microrganismos consumidores de acetato, como as espcies de Desulfobacter, crescem mais lentamente, com tempos de duplicao em torno de 20 horas. Devido s incertezas introduzidas pela dependncia do crescimento das bactrias redutoras de sulfato com o potencial de oxirreduo, o pH e a composio do meio, alm dos problemas causados pela acumulao dos ons sulfeto, o crescimento destas bactrias em regime contnuo tem sido preferido. A gama de substratos utilizados pelas bactrias redutoras de sulfato como fonte de energia para crescimento engloba lactato, citrato, formiato, piruvato, colina e certos alcois primrios como metanol, etanol, propanol e butanol, e como aceptor final de eltrons o on sulfato que pode ser substitudo por tiossulfato, tetrationato, sulfito ou metabissulfito (ALMEIDA, P.F., 2006). Em adio aos substratos orgnicos, hidrognio gasoso pode atuar como doador na cadeia de transporte de eltrons realizada por Desulfovibrio. Conforme foi verificado no mecanismo de reao do seu metabolismo, uma molcula de ATP gerada ao nvel do catabolismo do substrato orgnico e uma molcula de ATP consumida na reduo do on sulfato. Desta forma se somente essas reaes ocorressem a nvel celular, os microrganismos no poderiam apresentar crescimento. No entanto, o que se observa o crescimento dos microrganismos e a cadeia respiratria o sistema alternativo de fosforilao mais provvel para a gerao de ATP. A maneira com que as bactrias redutoras de sulfato reduzem o on sulfato a sulfeto e a natureza das enzimas envolvidas vm despertando o interesse dos cientistas h anos. Os ons sulfato presentes no exterior da clula bacteriana ao entrarem reajam com ATP para formar Adenosinafosfosulfato (APS) mais pirofosfato (PP), reao esta que se processa preferencialmente para a direita quando o pirofosfato removido como fosfato inorgnico (P). APS ento reduzida a sulfito (SO3=) e AMP. O sulfito convertido at metabissulfito (S2O5=) que , ento, reduzido a tritionato (S3O6=), passando por alguns intermedirios ainda no completamente definidos, sendo o S2O4= um dos mais provveis. Parte do tritionato formado convertido a tiossulfato (S2O3=) e parte usada para regenerar sulfito. O tiossulfato ento reduzido a sulfeto (S=) e outra parte convertida a mais sulfito (CARNEIRA, 2003). O metabolismo oxidativo das bactrias redutoras de sulfato conduzido em ambientes cujo potencial de oxirreduo se encontre na faixa de -150 a -200 mV, uma vez que esses microrganismos no necessitam possuir co-fatores da cadeia de transporte de eltrons cujas formas estveis s so encontradas em valores de potencial redox positivos. Sendo assim um dos pr-requisitos para o cultivo e

crescimento de bactrias redutoras de sulfato que o potencial de oxirreduo do ambiente esteja estabelecido inicialmente em torno de -100mV. Isto significa dizer que a simples excluso do ar do sistema no suficiente para garantir o crescimento. Verificou-se que um meio contendo lactato e sulfato, aps ebulio, apresentou um Eh de aproximadamente +200mV, e quando da adio de quantidade suficiente de sulfeto de sdio (Na2S) para produzir no sistema uma concentrao de 5mM, este valor foi reduzido para aproximadamente -220mV. necessrio ento, em algumas situaes, que seja adicionado um agente redutor, como o Na2S, at que o crescimento vigoroso da cultura seja estabelecido e assim as prprias bactrias gerem H2S suficiente para manter o potencial de oxirreduo baixo (VOORDOUW, G., 2003). Como acontece com quase todos os microrganismos, a concentrao mnima das substncias bactericidas e bacteriostticas vai depender da natureza do meio onde a substncia adicionada e tambm do tamanho da cultura presente. As bactrias do gnero Desulfotomaculum so normalmente mais sensveis aos inibidores. O gnero Dessulfovibrio apresenta extraordinria resistncia aos inibidores convencionais como, por exemplo, fenis, sais quaternrios, corantes, antibiticos e metais. A ineficcia dos metais como inibidores de crescimento em grande parte conseqncia da precipitao desses como sulfetos insolveis. Na ausncia de ons sulfeto esses metais so realmente bastante txicos aos microrganismos. O ar o mais barato e o mais eficiente inibidor de crescimento das bactrias redutoras de sulfato. Estas bactrias, quando em contato com o oxignio no sero mortas, porm permanecero em fase lag at que se restabeleam as condies de anaerobiose do sistema. As bactrias redutoras de sulfato so encontradas nos ambientes os mais diversos como solos, guas marinhas, poos artesianos, reas geotrmicas, depsitos sulfurosos, esgoto, rumina de boi, vceras de insetos, etc. Por tolerarem temperaturas na faixa de -5 a 75o C e valores de pH variando entre 5 a 9,5, esses microrganismos apresentam considervel adaptao s mais variadas condies ambientais. A nica exceo feita ao mais comum dos ambientes, o aerbio. A necessidade de um baixo potencial de oxirreduo restringe sua atividade a ambientes redutores como j citado. No entanto esses microrganismos podem sobreviver a longas exposies ao oxignio, retomando sua atividade quando o ambiente redutor restabelecido. 2.1.2 Fontes Antropognicas As principais atividades humanas emissoras de sulfeto de hidrognio e de outros gases reduzidos de enxofre so: a explorao de gs natural e petrleo, o refino de petrleo, a queima de carvo, a produo de celulose e indstrias variadas. Apesar da dificuldade existente para quantificar as taxas de emisso de sulfeto de hidrognio pelas diferentes atividades antropognicas existentes, algumas estimativas podem ser deduzidas pela quantidade de enxofre liberado nesses processos. A queima do carvo gera quantidades apreciveis de gases de enxofre, devido existncia do enxofre em sua composio que um constituinte no-desejvel, encontrando-se presente em quantidades que variam desde traos at maiores que 10% (em peso). O enxofre encontra-se presente no carvo na forma de sulfatos (FeSO4.7H2O), pirita (FeS2) e enxofre orgnico (Mercaptana ou Tiol, RSH; sulfeto ou tiol-eter RSR; dissulfeto, RSSR) e sistemas aromticos que contm o anel do Tiofeno). O enxofre orgnico ocorre quimicamente ligado parte orgnica da estrutura do carvo, cujas concentraes variam de 0,3 a 2,4% ( em peso), constituindo cerca de 20 a 85% da quantidade total de enxofre presente no carvo. Sempre que o enxofre ou certos compostos de enxofre entrar em contato com materiais orgnicos a altas temperaturas h possibilidade de ser produzido o sulfeto de hidrognio. Nas indstrias, o sulfeto de hidrognio normalmente um produto indesejvel, embora seja um reagente importante ou intermedirio em alguns processos. A explorao do petrleo propicia a emisso de sulfeto de hidrognio para a atmosfera tambm como resultado de decomposio anterior pela a ao de bactrias no subsolo oriundas de condies redutoras. Compostos reduzidos de enxofre (sulfeto de carbonila COS, dissulfeto de carbono CS2, sulfeto de dimetila- DMS, dissulfeto de dimetila- DMSD, etc), so emitidos para atmosfera devido as fontes naturais, biogeoqumicas e fontes antropognicas (CARVALHO, A.S., 2007). 2.1.3 Exposio Ambiental e Efeitos sobre a Sade Humana A exposio do homem ao H2S pode decorrer por exposio profissional ou ambiental ou, at mesmo, natural. O grau de incmodo e de intoxicao depende dos nveis de exposio. Em reas urbanas, as concentraes de H2S encontram-se, geralmente, abaixo de 0,0015 mg/m3 (1ppb ), embora picos de concentrao em torno de 0,20 mg/m3 (0,13 ppm ) tenham sido encontrados perto de fbricas de celulose e de papel. O valor limite de percepo do odor desagradvel causado pelo H2S considerado pela OMS Organizao Mundial de Sade como sendo na faixa de 0,0008 a 0,2 mg/m3 (0,5 130 ppb ). No entanto, em

tal faixa de valores, nenhum efeito biologicamente significativo no homem ou em animais foi observado. Irritao nos olhos pode ocorrer depois de vrias horas de exposio ao sulfeto de hidrognio a concentrao de 16-32 mg/m3 (10,5-21ppm). Quando inalado, o sulfeto de hidrognio exerce uma ao irritante no trato respiratrio, onde os maiores prejuzos so notados nas estruturas mais profundas (alvolos pulmonares) (CARVALHO, A.S., 2007). 2.1.4 Importncia Industrial da Biossulfetognese

Os problemas de corroso industrial esto associados produo de sulfeto de hidrognio (H2S), ao entupimento das tubulaes na formao do petrleo e a segurana ambiental. Alm disso, o aumento do teor de enxofre no petrleo bruto e gs importante. Estimou-se que cerca de 20% a 50% dos problemas que ocorrem nas companhias petrolferas so devidas a corroso por microrganismos (ALMEIDA, P.F., 2006). Muitas vezes, as perdas financeiras devido manuteno de um equipamento deteriorado por biocorroso so combinadas com as resultantes de biofouling. Sulfeto provoca corroso de material de ferro e ao inoxidvel em tanques, tubulaes, e na produo do leo. A formao de H2S por acidificao tambm causa toxicidade e a deteriorao do gs e petrleo, diminuindo assim o valor desses produtos. Nos reservatrios de petrleo, a reduo na permeabilidade pode ser induzida pelo crescimento de bactrias em rochas porosas (entupimento), levando ineficincia da recuperao secundria de petrleo.

2.1.5 Coluna de Winogradsky A coluna de Winogradsky um sistema que permite demonstrar, de uma maneira simples, a enorme diversidade metablica dos organismos procaritas. A forma como os microrganismos ocupam zonas altamente especficas de acordo com a sua tolerncia ao meio envolvente (microambiente) e s fontes de energia e carbono disponveis, bem patente nesse sistema. A coluna de Winogradsky ilustra, igualmente o papel dos microrganismos no estabelecimento dos ciclos dos elementos minerais como, por exemplo no ciclo do enxofre, essenciais manuteno da vida na Terra. Este dispositivo, criado em 1880 pelo microbiologista russo Sergei Winogradsky para estudar microrganismos do solo utilizado, tradicionalmente para isolar microrganismos anaerbios (bactrias fototrficas verdes e prpura e outros microrganismos anaerbios). Uma das maneiras de desenvolver um sistema destes, consiste em colocar num recipiente transparente (coluna) uma determinada quantidade de lama recolhida no fundo de um lago ou rio, suplementada com celulose (e.g. folha de jornal), com uma fonte de sulfato e uma substncia para tamponar o meio, i.e., para manter o pH aproximadamente constante. Em seguida, essa mistura coberta com gua do lago ou rio. Se esse recipiente for colocado num local onde apanhe bastante luz solar, ao fim de algumas semanas desenvolver-se- ao longo da coluna, de uma forma estratificada, uma comunidade de microrganismos de acordo com as condies ambientais que naquela se estabeleceram. A coluna deWinogradsky ilustra, igualmente o papel dos microrganismos no estabelecimento dos ciclos dos elementos minerais como, por exemplo no ciclo do enxofre, essenciais manuteno da vida na Terra. (GAMAZO,

C., 2005)O presente trabalho teve como objetivo a deteco e caracterizao preliminar de microrganismos sulfetognicos, bem como a determinao da concentrao de sulfeto presente no solo do Instituto Federal Baiano da cidade de Catu, interior da Bahia, por ser uma regio circunvizinha da Indstria de Petrleo.

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METODOLOGIA

3.1 Coleta das amostras Inicialmente foram coletadas amostras de sedimentos e gua de um Lago do Campus Catu (07 coletas foram realizadas), as amostras foram armazenadas sob refrigerao 4oC. 3.2 Cultivo dos microrganismos Foram preparados meios de cultura especficos para o cultivo de microrganismos sulfetognicos contendo em sua composio os nutrientes mnimos necessrios para o crescimento microbiano (fonte de carbono, fonte de nitrognio, fonte de enxofre, sais fosfatos e carbonatos e agentes redutores). Aps o preparo,

autoclavou-se a 121oC durante 15 minutos. Pesou-se 1 g do solo para 10 mL de meio de cultura. As amostras foram incubadas em estufa temperatura de 37oC por 24h. 3.3 Caracterizao dos microrganismos Para identificarmos a morfologia da microbiota presente, coloraes (Gram, Loeffler) foram realizadas utilizando-se um microscpio ptico existente no Laboratrio de Biologia do IF Catu. Para a identificao das espcies microbianas presentes, alguns testes bioqumicos foram realizados (motilidade, reduo de nitratos e sulfatos, catalase e oxidase, utilizao da uria, pH, etc). O mtodo convencional de cultivo atravs da tcnica do nmero mais provvel (NMP) foi utilizado para encontrar a populao total de microrganismos sulfetognicos originalmente presentes. 3.4 Determinao de sulfeto de hidrognio Sulfeto de hidrognio (H2S) produzido pelos microrganismos sulfetognicos foi detectado utilizando-se o mtodo do azul de metileno, este mtodo baseia-se na reao entre sulfeto de hidrognio e N,N-dimetilparafenilenodiamina-hidroclordrico na presena de cloreto de ferro com formao de azul de metileno. A intensidade da cor do complexo proporcional a concentrao de sulfeto na amostra, esta determinada pela medida da absorvncia em espectrofotmetro utilizando o comprimento de onda de 650-660 nm. Retirou-se 3 mL da amostra de gua. Adicionou-se 1,0 mL de acetato de zinco 1% para precipitao do sulfeto como sulfeto de zinco (ZnS), 0,3 mL NaOH 0,1moL L-1 para precipitar o ZnS como hidrxido, 0,5 mL de soluo de N,N-dimetil-parafenilenodiamino e 0,3 mL cloreto frrico 2% em HCl 1:20, logo aps aqueceu-se a mistura em banho-maria a 30 C por 30 segundos e resfriou-se. 3.5 Construo da coluna de Winogradsky Uma coluna de Winogradsky foi construda para simulao da microbiota presente no solo do IFBAIANO Catu. A coluna foi confeccionada com material de vidro com dimenses de 20x10x10 cm. A coluna foi preenchida com sedimento de um Lago do IFBAIANO-Catu, adicionou-se papel como fonte de celulose, tiossulfato de sdio como fonte de enxofre e sais de fosfato e carbonato. Ajustou-se o pH do meio para 6,8. A coluna foi completada com gua do mesmo Lago. Deixou-se sob a presena de luz durante quatro semanas. Aps este perodo, as amostras foram coletadas utilizando-se uma seringa descartvel estril.

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RESULTADOS E DISCUSSES

A populao microbiana total determinada pela tcnica do NMP foi de aproximadamente 1x 105 NMP/mL. Este valor est de acordo com a populao encontrada em campos de petrleo (CARVALHO, A.S., 2007). O ambiente do Lago um reservatrio natural de substratos para o crescimento destes microrganismos. Foram utilizados dez cultivos para os testes bioqumicos, sendo que a maioria foi positiva para a reduo de sulfato principalmente, confirmando a presena de microrganismos sulfetognicos. Sulfeto de hidrognio (H2S) foi detectado em algumas amostras de solo e culturas atravs do mtodo de azul de metileno. As concentraes encontradas variaram de 10 a 100 ppm. Concentraes abaixo de 10 ppm foram encontradas na regio anaerbia da coluna de Winogradsky. A coluna serviu para os testes estticos. Estes valores esto de acordo com a literatura que prev em reas circunvizinhas Indstria de Petrleo at 600 ppm de sulfeto. Anlises cromatogrficas sero realizadas posteriormente, para serem avaliados os subprodutos orgnicos produzidos pelos microrganismos sulfetognicos durante o seu metabolismo.

5 CONCLUSES O presente trabalho desenvolvido teve como proposta avaliar atravs de um diagnstico preliminar a microbiota sulfetognica presente no solo do IFBAIANO-Catu. O estudo inicial indicou a presena desses microrganismos atravs da deteco de H2S produzido, portanto, a presena de sulfeto de hidrognio servir para o biomonitoramento ambiental da regio. A construo da coluna

de Winogradsky uma alternativa para simulao do ambiente encontrado no solo, alm de ser de fcil execuo. A Regio de Catu encontra-se dentro da esfera de explorao terrestre da Petrobras, por isso, o estudo de microrganismos sulfetognicos presentes no ambiente de suma importncia. 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALMEIDA, P.F.; ALMEIDA, R.C.C.; CARVALHO, E.B.; SOUZA, E.R.; CARVALHO, A.S.; SILVA, C.H.T.P.; CARLTON, A. T. Overview of sulfate-reducing bacteria and strategies to control biosulfide generation in oil waters. Research Signpost, Fort P.O., Trivandrum-695 023, 37, 2, 661, Kerala, 2005. CARNEIRA, C.; MOURA, J.G.M. Biogeociclos: uma viso molecular das enzimas e dos mecanismos envolvidos nos ciclos dos elementos. Boletim da Sociedade Portuguesa de Qumica, Part II, p.47-55, 2003. CARVALHO, A.S. Otimizao e Validao de Mtodo Analtico para Determinao de Sulfeto em Matrizes Aquosas da Indstria do Petrleo. 2007. 65p. Dissertao (Mestrado em Qumica Analtica) Instituto de Qumica, Universidade Federal da Bahia, Salvador. GAMAZO, C., LPEZ-GOI, I. & DAZ, R. Manual Prctico de Microbiologa. 3 edio, Masson, Barcelona, 2005.

MARIANO, J. B. Impactos Ambientais do Refino do Petrleo. Rio de Janeiro: COPPE/UFRJ, 2001.VOORDOUW, G.; HUBERT, C.; NEMATI, M.; JENNEMAN, G.E. Containment of biogenic sulfide production in continuous up-flow packed-bed bioreactors with nitrate or nitrite. Biotechnology Progress, v.19, n.2, p.338-345, 2003.