Eduardo Caetano Albino da Silva ESTUDO DA EXPRESSÃO DE ... · CD147 em tumores benignos e malignos de ovário (Barretos, 2015) 24 Tabela 8 - Concordância entre expressão das proteínas

Eduardo Caetano Albino da Silva

ESTUDO DA EXPRESSÃO DE MARCADORES METABÓLICOS EM TUMORES DE CÉLULAS

GERMINATIVAS, COM ÊNFASE NOS TRANSPORTADORES DE MONOCARBOXILATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer

de Barretos para obtenção do Título de Mestre em

Ciências da Saúde

Área de Concentração: Oncologia

Orientadora: Profª. Dra. Céline Marques Pinheiro

Co-orientador: Dr. Cristovam Scapulatempo Neto

Barretos, SP

2016

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570

Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

S586e Silva, Eduardo Caetano Albino da.

Estudo da expressão de marcadores metabólicos em tumores de células germinativas, com ênfase nos transportadores de monocarboxilatos / Eduardo Caetano Albino da Silva. - Barretos, SP 2016.

80 f. : il. Orientador: Drª. Céline Marques Pinheiro Co-Orientador: Dr. Cristovam Scapulatempo Neto Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital

de Câncer de Barretos, 2016. 1. Neoplasias Embrionárias de Células Germinativas. 2. Metabolismo

Energético. 3. Transportadores de Ácidos Monocarboxílicos. 4. Ácido Lático. 5. Imuno-Histoquímica. 6. Análise Serial de Tecidos. I. Autor. II.Pinheiro, Céline Marques. III. Scapulatempo Neto, Cristovam. IV. Título

CDD 571.6

FOLHA DE APROVAÇÃO

Eduardo Caetano Albino da Silva

Estudo da expressão de marcadores metabólicos em tumores de células germinativas, com ênfase

nos transportadores de monocarboxilatos.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de

Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de Concentração: Oncologia

Data da aprovação: 28/03/2016

Banca Examinadora:

Prof.ª Dra. Maria de Fátima Monginho Baltazar

Instituição: Escola de Ciências da Universidade do Minho

Prof.ª Dra. Kátia Ramos Moreira Leite

Instituição: Fundação Antônio Prudente – Hospital AC Camargo

Prof.ª Dra. Céline Marques Pinheiro

Orientador

Prof. Dra. Rozany Mucha Dufloth

Presidente da Banca

SUPORTE À PESQUISA POR AGÊNCIA DE FOMENTO

Este trabalho recebeu apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) através de auxílio à Pesquisa (processo número 480119/2013-9).

“Esta pesquisa foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós

Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento

do Programa de Pós Graduação em Oncologia e no Manual de apresentação de Dissertações

e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram que este trabalho foi

realizado em concordância com Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP), não havendo

nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou falsificação de

dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são

de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão da Fundação Pio XII

– Hospital de Câncer de Barretos”.

“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha

realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia

estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvidos”.

À minha esposa Ana Carolina e ao meu filho Lucas,

com muito amor, pelo companheirismo, compreensão,

apoio e afeto em todos os nossos momentos.

Aos meus pais Mário e Eliana, com todo o amor,

respeito e admiração, pela presença, confiança e

suporte, desde os meus primeiros passos e primeiras

palavras.

Aos meus irmãos Danilo e Henrique, pela parceria e

amizade, desde nossa infância.

Ao meu sogro José Mauro, minha sogra Mara e

meus cunhados Felipe e Gabriel, por serem minha

segunda família, pelo apoio e paciência em tantos fins

de semana de estudos.

AGRADECIMENTOS

À Profª Drª Céline Pinheiro, que muito me ensina, com seu amplo conhecimento,

paciência, parceria e orientação.

Ao amigo Cristovam Scapulatempo, pelo companheirismo, apoio e orientação em

todas as etapas deste projeto.

Ao Dr. Flavio Cárcano, pela parceria e dedicação no desenvolvimento deste trabalho.

À Profª Drª Fátima Baltazar, pelo apoio e contribuição nas bancas de

acompanhamento e qualificação.

Ao Dr. Luiz Fernando Lopes pelas contribuições com o trabalho e o conhecimento.

Aos amigos do Departamento de Patologia, pela compreensão e apoio ao longo destes

anos de convivência.

À Fabiana, Letícia e Patrícia, pela paciência e dedicação na construção dos TMAs.

À equipe do Núcleo de Apoio ao Pesquisador, especialmente Thais, Cleyton e Marcos,

pelo suporte, paciência e dedicação na consistência e análise dos dados.

Aos pacientes e ao Hospital de Câncer de Barretos, pela estrutura e o apoio à

pesquisa e ao conhecimento.

“Se eu vi mais longe, foi por estar sobre ombros de gigantes”.

Isaac Newton

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

1

1.1 Tumores de células germinativas 1

1.2 Metabolismo tumoral 3

1.2.1 Metabolismo e carcinogênese 4

1.2.2 MCTs 5

1.2.2.1 MCTs e câncer 6

1.2.2.2 MCTs como potenciais alvos terapêuticos 8

1.2.3 Metabolismo e TCGs

9

2 JUSTIFICATIVA

10

3 OBJETIVOS 11

3.1 Objetivo geral 11

3.2 Objetivos específicos

11

4 MATERIAL E MÉTODOS 12

4.1 Delineamento do estudo 12

4.2 População de estudo 12

4.3 Metodologia 12

4.3.1 Seleção dos casos 12

4.3.2 Construção de TMAs 13

4.3.3 Reações de imuno-histoquímica 14

4.3.4 Variáveis de estudo 16

4.3.5 Análise estatística 16

4.3.6 Questões éticas

17

5 RESULTADOS 18

5.1 Caracterização da amostra 18

5.2 Avaliação da marcação imuno-histoquímica e definição dos pontos

de corte de positividade dos marcadores

22

5.3 Caracterização da expressão dos marcadores metabólicos em

amostras de TCG e de tecido normal

23

5.4 Validação do método de TMA 26

5.5 Associação entre a expressão das proteínas relacionadas ao

metabolismo e os parâmetros clinicopatológicos dos pacientes

27

5.5.1 Associação entre a coexpressão dos MCTs e a chaperona CD147 e

os parâmetros clinicopatológicos dos pacientes

37

6 DISCUSSÃO

42

7 CONCLUSÕES

47

REFERÊNCIAS 48

ANEXOS 57

Anexo A Ficha de coleta de dados 57

Anexo B Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa 63

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática do metabolismo de glicose por fosforilação

oxidativa e glicólise anaeróbica em tecidos diferenciados, assim como

da glicólise aeróbica nos tecidos proliferativos e neoplásicos

3

Figura 2 - Características fundamentais das células malignas, incluindo a

reprogramação metabólica

4

Figura 3 - Representação esquemática da carcinogênese, representando desde

células normais (cinza), hiperplásicas (rosa), hipóxicas (azul). A

adaptação para fenótipo glicolítico (verde) e seleção de células móveis

capazes de romper a membrana basal (amarela)

5

Figura 4 - Representação esquemática evidenciando em vermelho o efluxo de

lactato mediado por MCTs, como por exemplo MCT1 e MCT4, e em

verde o influxo de lactato mediado por MCT2, por exemplo

6

Figura 5 - Representação esquemática da exportação de lactato por MCT1 e

MCT4 e sua associação com a proteína CD147

7

Figura 6 - FDG-PET de um paciente de 48 anos com suspeita de câncer de

testículo, pré-orquiectomia

9

Figura 7 - Tipos histológicos de TCGs à coloração de H&E. A) Teratoma maduro; B)

Teratoma imaturo; C) Seminoma; D) Tumor do Seio endodérmico; E)

Carcinoma embrionário; F) Coriocarcinoma

19

Figura 8 - Intensidades de marcação membranar à imuno-histoquímica (MCT4

como exemplo). A) Negativo; B) Fraco; C) Moderado; D) Intenso

22

Figura 9 - Expressão dos marcadores metabólicos em tecido normal. A) MCT1 em

ovário; B) MCT4 em ovário; C) MCT4 em testículo; D) CD147 em

testículo

24

Figura 10 - Expressão dos marcadores metabólicos em tumores benignos

(teratomas maduros). A) MCT1; B) MCT2; C) MCT4, D) CD147

25

Figura 11 - Expressão dos marcadores metabólicos em seminomas. A) MCT1; B)

MCT2 (citoplasmático); C) MCT4; D) CD147

25

Figura 12 - Expressão dos marcadores MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 nos TMAs

(colunas 1 e 3) e nos cortes inteiros (colunas 2 e 4). Magnificação de

100x (colunas 1 e 2) e 400x (colunas 3 e 4)

26

Figura 13 - Curvas de sobrevida global (Kaplan-Meier) dos pacientes com tumores

malignos de testículo associadas à expressão membranar das proteínas

MCT1, MCT2, MCT4 e CD147

32


malignos de ovário associadas à expressão membranar das proteínas


35

Figura 15 - Curvas de sobrevida livre de evento (Kaplan-Meier) dos pacientes com

tumores malignos de testículo associadas à expressão membranar das

proteínas MCT1, MCT2, MCT4 e CD147

36


tumores malignos de ovário associadas à expressão das proteínas


37


malignos de testículo associadas à coexpressão das proteínas

MCT1/CD147 e MCT4/CD147

41


tumores malignos de testículo associadas à coexpressão das proteínas

MCT1/CD147 e MCT4/CD147

41

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Caracterização do perfil demográfico e clínico dos pacientes

estudados (n=262) (Barretos, 2015)

18

Tabela 2 - Caracterização do perfil clínico dos pacientes com tumores benignos

(n=67) (Barretos, 2015)

19

Tabela 3 - Caracterização do perfil clínico e anatomopatológico dos pacientes

com tumores malignos de testículo (n=160) (Barretos, 2015)

20

Tabela 4 - Caracterização do perfil clínico e anatomopatológico dos pacientes

com tumores malignos de ovário (n=30) (Barretos, 2015)

21

Tabela 5 - Pontos de corte da expressão dos marcadores metabólicos com base

na curva Roc, com medidas de discriminação (Barretos, 2015)

23

Tabela 6 - Frequências de expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e

CD147 em tecido normal e tumores malignos de testículo (Barretos,

2015)

24

Tabela 7 - Frequências de expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e

CD147 em tumores benignos e malignos de ovário (Barretos, 2015)

24

Tabela 8 - Concordância entre expressão das proteínas nos TMAs e cortes

inteiros

27

Tabela 9 - Associação da expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147

com as características clinicopatológicas em TCGs testiculares de

adultos (Barretos, 2015)

28

Tabela 10 - Associação entre a expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e

CD147 e o tamanho das neoplasias testiculares (Barretos, 2015)

29

Tabela 11 - Associação da expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147

com características clínico patológicas em TCGs de ovário (Barretos,

2015)

29

Tabela 12 - Estimativa da sobrevida global considerando variáveis clínicas e

expressão das proteínas em TCGs testiculares (Barretos, 2015)

30

Tabela 13 - Estimativa da sobrevida global considerando variáveis clínicas e

expressão das proteínas em TCGs ovarianos (Barretos, 2015)

31

Tabela 14 - Estimativa da sobrevida livre de evento considerando variáveis clínicas

e expressão das proteínas em TCGs testiculares (Barretos, 2015)

33

Tabela 15 - Estimativa da sobrevida livre de evento considerando variáveis clínicas

e expressão das proteínas em TCGs ovarianos (Barretos, 2015).

34

Tabela 16 - Associação da expressão de MCT1, MCT2 e MCT4 com a expressão de

CD147 em TCGs de testículo (Barretos, 2015)

38

Tabela 17 - Associação entre coexpressão de MCT1/CD147 e MCT4/CD147 com

características clínico patológicas em TCGs de testículo (Barretos,

2015)

39

Tabela 18 - Associação entre coexpressão MCT1/CD147 e MCT4/CD147 e o

tamanho das neoplasias testiculares (Barretos, 2015)

40

Tabela 19 - Associação entre coexpressão MCT1/CD147 e MCT4/CD147 com

características clínico patológicas em TCGs de ovário (Barretos, 2015)

40

LISTA DE ABREVIATURAS

EUA

Estados Unidos da América

FDG-PET Pósitrons com Fluorodesoxiglicose

HE Hematoxilina e Eosina

HIF-1 Fator Induzido por Hipóxia-1

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

IC Intervalo de Confiança

IHQ Imuno-histoquímica

MCTs Transportadores de Monocarboxilatos

pH Potencial Hidrogênico

SAME Serviço de Arquivo Médico e Estatística

TMA Tissue Microarray

TCGs Tumores de Células Germinativas

VEGFs Fatores de Crescimento Endotelial Vascular

VPN Valor Preditivo Negativo

VPP Valor Preditivo Positivo

LISTA DE SÍMBOLOS

< Menor que

> Maior que

% Porcentagem

≥ Maior ou igual a

RESUMO

SILVA ECA. Estudo da expressão de marcadores metabólicos em tumores de células

germinativas, com ênfase nos transportadores de monocarboxilatos. Dissertação

(Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2016.

JUSTIFICATIVA: Ao considerar que o papel dos transportadores de monocarboxilatos (MCTs)

nos tumores de células germinativas (TCGs) foi pouco explorado, surge a oportunidade de

pesquisar a relevância biológica destes marcadores metabólicos e da chaperona CD147

neste tipo tumoral. O estudo dos marcadores metabólicos em TCGs pode contribuir para a

identificação destes como potenciais marcadores prognósticos e preditivos, e, além disso,

auxiliar na identificação de novos alvos terapêuticos. OBJETIVOS: Caracterizar a expressão

de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 em amostras de TCGs de pacientes do Hospital de Câncer de

Barretos organizadas em Tissue Microarray (TMA) e validar este método para o estudo da

expressão destas proteínas. Comparar a expressão destas proteínas entre TCGs e tecido não

neoplásico, e associar os dados de expressão com os dados clinicopatológicos dos pacientes.

MATERIAIS E MÉTODOS: Estudo de coorte retrospectivo, com 262 casos de TCG com tecido

tumoral disponível no serviço de patologia do Hospital do Câncer de Barretos. A coleta de

dados clínicos foi realizada por meio de revisão de prontuários dos pacientes selecionados

para o estudo. Foram confeccionados 9 blocos de Tissue Microarray (TMA) para análise

imuno-histoquímica (IHQ), sendo 6 blocos de tecido tumoral e 3 blocos de tecido normal.

Para validação da técnica de TMA, 45 casos foram selecionados aleatoriamente e

submetidos a IHQ em cortes de lâmina inteira do bloco doador. Foram utilizados o teste qui

quadrado de Pearson ou teste Exato de Fisher para comparar a frequência de expressão dos

diferentes marcadores e a sua associação com os dados clinicopatológicos dos pacientes. O

teste de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a associação entre a expressão dos

marcadores e o tamanho tumoral. As curvas de sobrevida global e livre de doença foram

estimadas utilizando o método de Kaplan-Meier e os dados comparados usando o teste de

log rank. RESULTADOS: Observou-se uma concordância substancial entre TMAs e cortes

inteiros para MCT2 e CD147, e moderada para MCT1 e MCT4. As proteínas MCT1, MCT4 e

CD147 foram sobrexpressas nos TCGs malignos, enquanto o MCT2 foi sobrexpresso em TCGs

benignos. Nos tumores malignos de testículo, houve associação estatisticamente

significativa entre MCT1 e maiores estadios, maior estadiamento M, maior estadiamento N e

tipo histológico; entre MCT4 e maiores estadios, maior estadiamento M, maior tamanho

tumoral, maiores estadiamentos T, tipo histológico, maiores estratificações de risco e

presença de invasão vascular; e a CD147 apresentou associação com maiores estadios, maior

estadiamento M, maior estadiamento N e tipo histológico. Nestes tumores, a expressão de

MCT4 foi associada a menor sobrevida global e livre de eventos. Nos tumores malignos de

ovário, observou-se associação apenas entre MCT1 e o tipo histológico. Nestes tumores, a

expressão de CD147 foi associada a menor sobrevida global e livre de eventos.

CONCLUSÕES: O TMA demonstrou ser um método de concordância substancial a moderada

com cortes inteiros para estudo dos marcadores metabólicos em TCGs. Estes marcadores

foram associados a características clinicopatológicas de pior prognóstico, além de menor

sobrevida global e livre de eventos, principalmente nos tumores testiculares. Deste modo,

reforça-se a importância dos MCTs e o CD147 como potenciais marcadores prognósticos ou

preditivos, além de possíveis alvos terapêuticos.

Palavras-chave: Neoplasias Embrionárias de Células Germinativas, Metabolismo Energético,

Transportadores de Ácidos Monocarboxílicos, Ácido Lático, Imuno-Histoquímica, Análise

Serial de Tecidos.

ABSTRACT

SILVA ECA. Study of the expression of metabolic markers in germ cell tumors, with emphasis

on monocarboxylate transporters. Dissertation (Master’s degree). Barretos: Barretos Cancer

Hospital; 2016.

BACKGROUND: Since the role of monocarboxylate transporters (MCTs) in germ cell tumors

(GCTs) is little explored, the opportunity to search the biological relevance of these

metabolic markers and their auxiliary protein CD147 in this type of tumor arises. The study

of these metabolism-related proteins in GCTs may contribute to their identification as

potential prognostic and predictive markers, and, moreover, assist in the identification of

new therapeutic targets. AIMS: To evaluate the expression of MCT1, MCT2, MCT4 and

CD147 in tumor samples from patients with GCTs from Barretos Cancer Hospital organized in

Tissue Microarrays (TMAs) and validate this technique for evaluation of the expression of

these proteins. To compare the expression on GCTs and non-neoplastic tissue and correlate

the expression with clinicopathological data. MATERIALS AND METHODS: Retrospective

cohort study, with 262 GCT cases with tumor tissue available in the pathology service of

Barretos Cancer Hospital. The clinical data collection was performed by means of a review of

the medical records of the patients selected for the study. A total of 9 blocks of tissue

microarray (TMA) were obtained for immunohistochemistry (IHC), being 6 blocks of tumor

tissue and 3 blocks of normal tissue. To validate the technique of TMA, 45 cases were

randomly selected and submitted to IHC in whole slide cuts of donor block. Pearson chi

square test or Fisher exact test were used to compare the frequency of expression of the

different proteins and their association with patients’ clinicopathological data. The Mann-

Whitney test was used to evaluate the association between the expression of markers and

tumor size. Overall survival and disease-free survival curves were estimated using the

Kaplan-Meier method and data were compared using the log rank test. RESULTS: There was

substantial agreement between the expression of MCT2 and CD147 in TMAs and whole

sections, while for MCT1 and MCT4 the agreement was moderate. The proteins MCT1, MCT4

and CD147 were overexpressed in malignant GCTs, while MCT2 was overexpressed in benign

GCTs. In malignant testicle tumors, MCT1 was associated with higher stages, higher M stage,

higher N stage and histological type; MCT4 with higher stages, higher M stage, higher tumor

size, higher T stage, histological type, higher risk stratification and presence vascular

invasion; while CD147 was associated with greater stages, greater M stage, greater N stage

and histological type. Among these tumors, the expression of MCT4 was associated with

lower overall and event free survival. In malignant ovarian tumors, there was only

association between MCT1 and histological type. Among these tumors, CD147 expression

was associated with lower overall and event free survival. CONCLUSIONS: TMA

demonstrated a substantial to moderate agreement with whole sections for the metabolic

markers on GCTs. The metabolism-related proteins evaluated in the present study were

associated with clinicopathological characteristics of worst prognosis, as well as lower global

and event free survival, especially in testicular tumors. Therefore, this study highlights the

importance of MCTs and CD147 as potential prognostic or predictive markers, and also as

possible therapeutic targets in GCTs.

Keywords: Neoplasms, Germ Cell and Embryonal; Energy Metabolism; Monocarboxylic Acid

Transporters; Lactic Acid; Immunohistochemistry; Tissue Array Analysis.

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Tumores de células germinativas

Os Tumores de Células Germinativas (TCGs) englobam um grupo variado de neoplasias

com diferentes apresentações clínicas, características histológicas e comportamento

biológico1, 2. São neoplasias que atingem ambos os sexos, crianças e adultos, com sítio

primário gonadal ou extra-gonadal1, 2.

Os TCGs de testículo são entidades relativamente raras, mas, em homens jovens,

representam as neoplasias malignas sólidas mais frequentes1-4. Um estudo epidemiológico

realizado nos Estados Unidos da América (EUA) identificou que os TCGs são as neoplasias

malignas mais comuns em norte-americanos do sexo masculino entre 15 a 34 anos,

correspondendo a 98% de todos os tumores malignos de testículo4. Estes tumores

apresentam um pico precoce entre zero e um ano de idade e um aumento acentuado após a

puberdade5. Apesar dos variados subtipos histológicos, para fins prognósticos e

terapêuticos, os TCGs testiculares são frequentemente agrupados em seminomatosos e não-

seminomatosos4.

Em mulheres, os TCGs representam dois terços das neoplasias malignas de ovário em

pacientes menores de 20 anos6. Estes compartilham vários aspectos histológicos e

citogenéticos com os TCGs testiculares1. Diferentemente dos tumores testiculares, a sua

incidência tem um aumento considerável a partir dos cinco anos de idade5. Tanto nos

tumores ovarianos quanto testiculares, nota-se a sua correlação clínica e fisiopatológica com

as disgenesias gonadais1, 6.

Em adultos, menos de 20% dos TCGs são extra-gonadais. Estes têm uma

predominância no sexo masculino e, às vezes, estão associados à síndrome de Klinefelter1.

Os TCGs extra-gonadais têm morfologia semelhante aos gonadais e podem ser encontrados

em diferentes localizações. Os sítios mais frequentes são ao longo da linha média, como por

exemplo, o sistema nervoso central, mediastino, retroperitônio e sacrococcígeo. A

ocorrência preferencial ao longo da linha média pode ser justificada por um defeito na

migração das células germinativas primordiais durante o período embrionário. Os TCGs

extra-gonadais seriam portanto, resultado da transformação maligna destes resquícios de

células germinativas primordiais5. As localizações extra-gonadais mais frequentes são

2

mediastino, pineal, retroperitônio e encéfalo para o sexo masculino, e placenta, pelve, útero

e encéfalo para o sexo feminino. O local acometido também tem diferentes incidências de

acordo com a faixa etária, sendo notável o aumento após a puberdade em mediastino e

retroperitônio5. Tais diferenças epidemiológicas referentes à localização em relação à faixa

etária sugerem que podem haver diferenças etiológicas entre TCGs gonadais e extra-

gonadais. Em geral, o prognóstico é pior nos TCGs extra-gonadais do que nos gonadais5.

Há também diferenças clínicas e biológicas entre as neoplasias de crianças e adultos,

que sugerem diferenças etiológicas entre as idades. Estas podem ser explicadas pelas

características da célula germinativa e seu estágio de evolução embrionária ou sua relação

com a maturação sexual2. Por exemplo, teratomas testiculares em meninos são clinicamente

benignos, enquanto em homens pós-púberes são malignos, independente do grau de

imaturidade7.

Apesar de apresentarem tantas diferenças, os TCGs compartilham a célula germinativa

primordial como a sua presumida "célula de origem"1.

Considerando as características histológicas, tradicionalmente, os TCGs são

classificados em teratoma (maduro e imaturo), seminoma, germinoma, disgerminoma,

seminoma espermatocítico, carcinoma embrionário, tumor do seio endodérmico,

coriocarcinoma e poliembrioma. Tais histologias podem ocorrer na forma pura ou mista,

quando há combinação de proporções variáveis de dois ou mais tipos diferentes. O

comportamento clínico reflete esta heterogeneidade histológica e pode variar desde

neoplasias benignas, com prognóstico favorável, a neoplasias malignas, com maior risco de

recaída pós-tratamento e menores taxas de sobrevida3, 7, 8.

O diagnóstico dos TCGs é geralmente baseado em manifestações clínicas, identificação

de lesões em exames de imagem e avaliação histológica. Há também marcadores séricos

(alfa-feto-proteína e gonadotrofina coriônica) que são úteis tanto para o diagnóstico quanto

para a avaliação de resposta ao tratamento.

Como opções terapêuticas há o tratamento cirúrgico, além de quimioterapia e,

raramente, radioterapia. O esquema terapêutico adotado depende da histologia, da

localização e do estadio das neoplasias.

Apesar das opções terapêuticas e do bom potencial de cura para boa parte dos

tumores germinativos, certos pacientes mantêm prognóstico desfavorável, a despeito da

3

terapêutica. Isto reforça a necessidade de se entender melhor a complexidade e

heterogeneidade biológica dos TCGs, a fim de melhorar a estratificação de risco e otimizar o

tratamento3. Desta forma, a identificação de novos marcadores prognósticos pode ser útil

naqueles pacientes de maior risco para prognóstico desfavorável. Além disso, a identificação

de novos alvos terapêuticos seria útil para fornecer a estes pacientes de risco esquemas

alternativos ou adicionais aos atualmente empregados.

1.2 Metabolismo tumoral

Os tecidos normais diferenciados obtêm energia preferencialmente pela fosforilação

oxidativa, que ocorre na presença de oxigênio, sendo uma via bastante eficiente do ponto de

vista energético. Na ausência de oxigênio, estes tecidos fazem glicólise anaeróbica (ou

fermentação lática), a qual é menos eficaz energeticamente e leva à produção lactato. Já os

tecidos proliferativos e neoplásicos tendem a obter energia através de glicólise aeróbica, na

qual há grande consumo de glicose e alta produção de lactato, tanto na presença quanto

ausência de oxigênio9 (Figura 1). Esta preferência pelo metabolismo glicolítico, mesmo na

presença de oxigênio, foi inicialmente descrita por Otto Warburg, em 195610 e atualmente

esta reprogramação metabólica é considerada uma das características fundamentais das

células malignas11, 12 (Figura 2).

Fonte: Vander Heiden et al. 9

Figura 1 - Representação esquemática do metabolismo de glicose por fosforilação

oxidativa e glicólise anaeróbica em tecidos diferenciados, assim como da glicólise

aeróbica nos tecidos proliferativos e neoplásicos

4

1.2.1 Metabolismo e carcinogênese

A carcinogênese e o desenvolvimento de um fenótipo maligno ocorrem em um

ambiente avascular e as células cancerosas tornam-se dependentes da difusão de glicose e

oxigênio para satisfazer as suas necessidades metabólicas13, 14. Assim, quando as lesões

hiperplásicas se desenvolvem mais do que algumas camadas de células além da membrana

basal, ocorre o desenvolvimento de hipóxia regional, limitando o crescimento celular. Esta

hipóxia intermitente irá promover a seleção de células com glicólise anaeróbia

constitutivamente aumentada, permitindo o crescimento de células13-15 (Figura 3). Neste

contexto, proteínas chave para o estabelecimento do fenótipo hiperglicolítico e de

resistência à acidez surgem como atores essenciais nesta reprogramação metabólica das

células cancerosas. A resposta glicolítica é principalmente regulada pelo Fator Induzido por

Hipóxia-1 (HIF-1), um fator de transcrição que induz à expressão de genes de

sobrevivência, incluindo transportadores de glicose, fatores angiogênicos como os Fatores

de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFs), hexoquinase II, entre outros. Com frequência,

altos níveis de HIF-1 estão associados com alto consumo de glicose13. O alto consumo de

glicose é mediado pelos transportadores de glicose (principalmente GLUT1 e GLUT3) e o seu

metabolismo auxiliado pelas hexoquinases I e II. Outras proteínas fundamentais à adaptação

Fonte: Hanahan & Weinberg. 11

Figura 2 - Características fundamentais das células malignas, incluindo a

reprogramação metabólica

5

ao fenótipo glicolítico são os Transportadores de Monocarboxilatos (MCTs), por sua ação no

efluxo de lactato e no controle do pH intracelular.

1.2.2 MCTs

Os MCTs são codificados pelos genes da família SLC16A, atualmente composta por 14

membros. As isoformas MCT1-MCT4 são simportadores com prótons, com diferentes

afinidades para os substratos, levando a uma diferente expressão tecidual. O MCT1 é

codificado pelo gene SLC16A1 e, sendo um transportador com afinidade intermédia para o

substrato, age tanto no influxo quanto no efluxo do lactato e tem distribuição ubíqua. O

MCT2, codificado pelo gene SLC16A7, é a isoforma com maior afinidade para o substrato16-18

e é encontrado em tecidos que consomem lactato, como fígado, rim, testículo e cérebro. O

MCT3, codificado pelo gene SLC16A8, é encontrado exclusivamente no epitélio pigmentar da

retina e no epitélio do plexo coroide do cérebro. O MCT4, codificado pelo gene SLC16A3, é

um transportador de baixa afinidade, com função principal de exportar lactato e está

Fonte: Gatenby & Gillies. 13

Figura 3 - Representação esquemática da carcinogênese, representando desde células normais

(cinza), hiperplásicas (rosa), hipóxicas (azul). A adaptação para fenótipo glicolítico (verde) e

seleção de células móveis capazes de romper a membrana basal (amarela).

6

presente em tecidos altamente glicolíticos (por exemplo, o músculo esquelético)19 (Figura 4).

É importante notar que estes transportadores necessitam de proteínas auxiliares, de forma a

serem corretamente expressos na membrana, assim como promoverem a sua atividade

como transportadores. Assim, no caso do MCT1, MCT3 e MCT4, foi encontrada uma

associação com a proteína CD14720, 21. Já no caso do MCT2, a proteína auxiliar associada é a

gp7022. Além disso, é relevante a participação do HIF-1 como indutor da expressão de

MCT4, tanto na presença de oxigênio, quanto em condições de hipóxia23-25.

1.2.2.1 MCTs e câncer

Uma vez que o MCT1 e MCT4 são vitais para a homeostase do pH intracelular, por

exportação de lactato e de prótons27, é razoável colocar a hipótese de que estas isoformas

Fonte: Modificado de Halestrap & Price 26

Figura 4 - Representação esquemática evidenciando em vermelho o efluxo de lactato

mediado por MCTs, como por exemplo MCT1 e MCT4, e em verde o influxo de lactato

mediado por MCT2, por exemplo.

7

estejam sobrexpressas em células tumorais altamente glicolíticas, nas quais são produzidos

níveis elevados de lactato, contribuindo para o fenótipo hiperglicolítico das células tumorais.

Além disto, sendo importantes reguladores de pH, os MCTs também vão contribuir para o

fenótipo resistente ao ácido das células tumorais, realizando um duplo papel proeminente

nas adaptações metabólicas que ocorrem nestas células. Cabe ressaltar o importante papel

do lactato na agressividade tumoral e no comportamento maligno das células, devido à sua

contribuição para o potencial de invasão tecidual, diminuição da resposta imune às células

neoplásicas, além de rádio e quimiorresistência13, 28. O excesso de lactato e a acidez tumoral

estão associados a progressão tumoral, recidivas, metástases e menor sobrevida, com

evidências destes fatores de pior prognóstico em tumores de cabeça e pescoço29, 30 e colo

uterino31-33, por exemplo. Uma vez que o pH intersticial está também associado a um

aumento na expressão de várias moléculas angiogênicas, tais como o VEGF, à invasão e ao

desenvolvimento de metástases34, a inibição dos MCTs pode também levar a uma redução

na angiogênese, invasão e metastização tumoral (Figura 5).

Fonte: Pinheiro C et al. 27

Figura 5 - Representação esquemática da exportação de lactato por MCT1 e MCT4 e

sua associação com a proteína CD147.

8

1.2.2.2 MCTs como potenciais alvos terapêuticos

Além da importância da acidez tumoral e da expressão de MCTs no desenvolvimento

do fenótipo maligno e na agressividade tumoral, há também evidências de estudos in vitro e

in vivo de que a inibição destas proteínas surge como potencial alvo terapêutico do câncer,

por inibição da fase final da glicólise35-43. A inibição ou silenciamento dos MCTs em culturas

celulares de gliomas leva a um menor consumo de glicose e menor produção de lactato, com

consequente efeito citotóxico ao reduzir a proliferação e induzir morte celular37, 44. Efeito

semelhante foi obtido em culturas de células de carcinoma de colo uterino, além de modelo

animal de câncer de pulmão e colorretal39. Estudo recente demonstra que o silenciamento

de MTC1 e MCT4 pode reduzir significativamente o tamanho tumoral, ou até mesmo

impedir o desenvolvimento de alguns tumores em modelos in vivo de câncer de mama43. A

inibição dos MCTs também pode potencializar o efeito citotóxico do quimioterápico

comumente utilizado 5-fluorouracil, em linhagens celulares de carcinomas colorretais45.

Além disso, a inibição da glicólise por silenciamento do gene que codifica a CD147 e inibição

de MCTs sensibiliza células de câncer de pulmão à ação de biguanidas, como a fenformina,

resultando em menor crescimento tumoral in vivo46.

Para serem considerados como alvos terapêuticos, os MCTs devem estar expressos de

forma diferente nas células tumorais, ou em quantidade ou em isoforma, quando em

comparação com as células normais, e esta informação só pode ser obtida usando amostras

humanas, ao invés de se estudarem apenas modelos in vitro e in vivo. De fato, alguns

resultados in vitro não são suportados por estudos em amostras humanas47. A

sobrexpressão de MCTs está presente em diferentes tipos de tumores, incluindo tumores

colorretais48, do colo uterino33, gástricos49, hepáticos50, mamários51, 52, pulmonares53,

prostáticos54, renais55, vesicais56, do estroma gastrointestinal57 e do cérebro44. Há evidências

de que esta expressão está associada ao desenvolvimento do fenótipo maligno33, 52 e

também geralmente têm associação com o comportamento clínico e prognóstico das

neoplasias49, 50, 52, 53, 55-57. Estudo recente de meta-análise mostrou que o aumento da

expressão de MCT4 e/ou CD147 está associado a menor sobrevida global e/ou menor

sobrevida livre de doença em vários tipos diferentes de câncer, por exemplo os de mama,

estômago, fígado, cabeça e pescoço, pâncreas, cólon, esôfago, bexiga, testículo e ovário58.

9

Além disso, a caracterização da expressão dos MCTs em diferentes tipos tumorais

ganha relevância acrescida, uma vez que os MCTs, em oposição ao seu potencial como alvos

terapêuticos, também podem atuar como mediadores do transporte de moléculas tóxicas

alquilantes e antiglicolíticas para o meio intracelular, especialmente o 3-bromopiruvato59-62.

1.2.3 Metabolismo e TCGs

Apesar da falta de estudos sobre a expressão de MCTs nos TCGs malignos, há

evidências de que estas neoplasias sejam altamente glicolíticas, uma vez que expressam

GLUT363, 64, um transportador de glicose sobrexpresso em neoplasias malignas64, 65. Além

disso, podem ser detectadas em exames de tomografia de emissão de pósitrons com

fluorodesoxiglicose (FDG-PET) durante o estadiamento66 (Figura 6) ou na avaliação de

neoplasia residual pós tratamento67-70. A tomografia de emissão de pósitrons é um exame de

imagem que utiliza um análogo da glicose marcado, a FDG, o que permite a identificação dos

tecidos que consomem elevadas quantidades de glicose para obtenção de energia,

realçando aqueles mais glicolíticos68, 71, 72.

Fonte: Cremerius C et al. 65

Figura 6 - FDG-PET de um paciente de 48 anos com suspeita de câncer de testículo,

pré-orquiectomia. Há intensa captação no testículo e linfonodos retroperitoneais,

ilíacos e paratraqueais.

10

2 JUSTIFICATIVA

Considerando que o papel dos MCTs foi ainda pouco explorado, sobretudo nos TCGs,

surge a importante oportunidade de pesquisar a relevância biológica destes marcadores

metabólicos e da chaperona CD147 neste tipo tumoral relativamente raro. Dadas as

características clínicas, nomeadamente a heterogeneidade e a falta de resposta por parte de

alguns pacientes ao tratamento, e a falta de caracterização da expressão destes marcadores

neste tipo tumoral, considera-se que este estudo pode ser uma maior valia para a

abordagem clínica aos TCGs.

Desta forma, o estudo dos marcadores metabólicos em TCGs pode contribuir para a

identificação destes como potenciais marcadores prognósticos ou preditivos, além da

possibilidade de identificação de possíveis alvos terapêuticos.

11

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Caracterizar a expressão de marcadores metabólicos em amostras de TCGs de

pacientes do Hospital de Câncer de Barretos.

3.2 Objetivos específicos

Avaliar a expressão dos transportadores de lactato MCT1, MCT2, MCT4 e sua

chaperona CD147, em amostras das diferentes histologias de TCGs assim como tecidos

normais correspondentes, através da realização de imuno-histoquímica em plataformas de

Tissue Microarray (TMA).

Validar o método de TMA para avaliação destes marcadores neste tipo tumoral, por

comparação com cortes inteiros.

Comparar a expressão entre os TCGs e tecido normal.

Correlacionar os dados de expressão dos marcadores com os dados clínico-

patológicos dos pacientes.

12

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Delineamento do estudo

O presente estudo de coorte retrospectivo foi realizado no Hospital de Câncer de

Barretos com a colaboração dos Departamentos de Patologia, Oncologia Clínica, Oncologia

Pediátrica, Urologia e Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular.

4.2 População de estudo

A população de estudo é composta por pacientes com diagnóstico de neoplasia de

células germinativas benignas e malignas, de ambos os sexos, independente da idade, que

tenham amostras em bloco de parafina com material suficiente para construção de TMAs,

no serviço de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos.

Foram excluídos casos de tumores primários de sistema nervoso central, devido às

peculiaridades de apresentação clínica e abordagem terapêutica, além da frequente

escassez de material biológico disponível destas neoplasias.

De acordo com a busca nos arquivos do serviço de Patologia, após revisão das lâminas

e seleção dos blocos de parafina, selecionando todos os pacientes diagnosticados com TCGs

entre dezembro de 2007 e maio de 2013, o tamanho da amostra foi de 262 casos, incluindo

157 casos com tecido normal disponível para o estudo.

O período selecionado foi desde dezembro de 2007, pois este foi o início dos registros

no atual sistema eletrônico de laudos do serviço de patologia. O término em maio de 2013

foi indicado por permitir um período mínimo de dois anos de seguimento dos pacientes,

para avaliação de sobrevida e possíveis recaídas.

4.3 Metodologia

4.3.1 Seleção dos casos

A seleção dos casos foi realizada a partir do sistema eletrônico de laudos do serviço de

Patologia, considerando os diagnósticos anatomopatológicos confirmados de TCGs no

período entre dezembro de 2007 e maio de 2013 devidamente registrados no sistema.

13

Foram selecionados apenas os casos de tumores primários, com material disponível para

confecção dos TMAs. Casos cujas amostras eram de metástases ou após quimioterapia

foram excluídos.

Inicialmente, foram selecionados 326 casos com diagnóstico confirmado de TCG.

Destes, foram excluídos 37 casos que não tinham material tumoral suficiente para confecção

dos TMAs (incluindo 7 biópsias por agulha), 25 metástases e 2 pós quimioterapia. Desta

forma, foram obtidos 262 casos com tecido tumoral disponível para estudo.

4.3.2 Construção de TMAs

Os estudos de expressão de proteínas foram realizados em plataforma de Tissue

Microarray (TMA). Cortes histológicos representativos de todos os casos, corados com

hematoxilina e eosina (HE), foram revisados para identificação de disponibilidade de

material e confirmação diagnóstica. Em casos de neoplasias gonadais bilaterais, foi

selecionado o maior tumor. Quando necessário, foi realizado estudo imuno-histoquímico

para confirmação diagnóstica. Houve mudança no diagnóstico do tipo histológico de TCG em

2 casos após revisão de lâminas e/ou realização de novo estudo imuno-histoquímico. As

áreas de interesse tumorais e de tecido normal (quando disponível e suficiente) foram então

marcadas nas lâminas daqueles cortes histológicos revisados. Para contemplar a

variabilidade histológica, as áreas tumorais de interesse foram selecionadas com base no

tipo histológico de cada neoplasia. Portanto, em tumores mistos, foram marcadas diferentes

áreas representativas de cada tipo histológico. As mesmas áreas foram identificadas e

marcadas nos respectivos blocos de parafina doadores dos tecidos. Cilindros de 1mm de

diâmetro das áreas marcadas nos blocos de parafina doadores foram transportados para um

bloco de parafina receptor através de um sistema mecanizado de precisão (Beecher

Instruments), com um intervalo de 0,3mm entre os cilindros. Cada cilindro amostral foi

alocado em uma posição do bloco receptor definida em um sistema cartesiano de

coordenadas e o conjunto das amostras constituiu uma micromatriz tecidual (TMA).

Anteriormente à construção dos blocos de TMA, uma planilha contemplando cada posição e

os respectivos casos contidos foi elaborada para posterior registro dos resultados. Para

orientação no momento da leitura, foram incluídos tecidos controle em locais estratégicos

14

do TMA. Sempre que possível, as amostras foram dispostas em triplicata, a fim de aumentar

a representatividade tumoral e minimizar as eventuais perdas inerentes ao método de TMA.

Após a revisão e seleção das áreas de interesse, os blocos de TMA foram

confeccionados, originando 6 blocos de tecido tumoral e 3 blocos de tecido normal.

4.3.3 Reações de imuno-histoquímica

Dentre os 262 casos, 45 casos foram selecionados aleatoriamente com base em cálculo

amostral com intervalo de confiança de 95%, para fins de validação da técnica de TMA.

Nestes 45 casos, foi realizada imuno-histoquímica tanto em TMA quanto em cortes da área

inteira do bloco doador. Os resultados da positividade foram comparados, para validação da

técnica73-75.

Cortes parafinados dos TMAs e dos cortes inteiros foram submetidos à técnica de

imuno-histoquímica utilizando os anticorpos primários específicos para cada reação,

conforme instruções dos fabricantes e de acordo com a padronização previamente descrita

pelo grupo33, 44, 48, 49, 51, 54, 57, 76-78. Os anticorpos a utilizar neste projeto foram: anti-MCT1

(AB3538P, EMD Millipore), anti-MCT2 (sc-50322, SantaCruz), anti-MCT4 (sc-50329,

SantaCruz) e anti-CD147 (sc-71038, SantaCruz). Os anticorpos anti-MCT1, MCT2 e MCT4 são

policlonais enquanto anti-CD147 é monoclonal (clone 1.BB.218). Inicialmente, foi realizada a

remoção da parafina, acomodando as lâminas em berço e levando à estufa a 80°C por

aproximadamente 5 minutos, até o material da lâmina ficar translúcido. Ao retirar da estufa,

as lâminas foram transferidas diretamente para o xilol, onde ocorreu a remoção completa da

parafina, e, em seguida, foi realizada a hidratação dos cortes histológicos. Para a hidratação,

os cortes foram submetidos a uma bateria de álcoois com concentrações decrescentes,

desde 100%, passando por 95%, 70%, 50%, e por fim água, para então seguir para próxima

etapa, a recuperação antigênica. Para tal, as lâminas foram acomodadas em recipiente em

banho- maria (98°C) contendo citrato (pH = 6,0) para os anticorpos anti-MCT1, anti-MCT2 e

anti-MCT4 ou EDTA (pH = 8,0) para o anticorpo anti-CD147, por 20 minutos, seguidos de 20

minutos de arrefecimento. Em seguida, as lâminas foram lavadas com TBS, durante 5

minutos, por 2 vezes, e então incubadas com uma solução de peróxido de hidrogênio (H2O2)

a 3% em metanol, durante 10 minutos. Após, as lâminas foram submetidas a um novo passo

de lavagem com TBS, durante 5 minutos, por 2 vezes, seguido de incubação com o

15

bloqueador proteico Ultra V block (TL-125-HL, Thermo Scientific™ Lab Vision™ UltraVision™

LP Detection System: HRP Polymer para MCT1 ou TP-125-HL, Thermo Scientific™ Lab Vision™

UltraVision™ Large Volume Detection System: anti-Polyvalent, HRP para MCT2 e MCT4) por

10 minutos ou Normal Horse Serum (PK-7200, VECTASTAIN Elite ABC kit R.T.U.) por 20

minutos para CD147. Após esta etapa, as lâminas foram sopradas e então foi aplicado o

anticorpo primário, diluído em diluente de anticorpo (TA-125-UD, Thermo Scientific™ Lab

Vision™ Large Volume UltrAb Diluent). As diluições dos anticorpos primários foram de 1:000

para MCT1, 1:200 para MCT2; 1:500 para MCT4 e 1:400 para CD147. O tempo de incubação

foi de 2 horas para MCT2 e MCT4, e overnight para MCT1 e CD147. Novamente, as lâminas

foram lavadas com TBS, durante 5 minutos, por duas vezes, e incubadas com Primary

Antibody Enhancer (TL-125-HL, Thermo Scientific™ Lab Vision™ UltraVision™ LP Detection

System: HRP Polymer) por 10 minutos para MCT1, Biotinylated Goat Anti-Polyvalent (TP-125-

HL, Thermo Scientific™ Lab Vision™ UltraVision™ Large Volume Detection System: anti-

Polyvalent, HRP) por 10 minutos para MCT2 e MCT4 ou Biotinylated Universal Secondary

Antibody (PK-7200, VECTASTAIN Elite ABC kit R.T.U.) por 30 minutos para CD147. Após nova

lavagem com TBS, durante 5 minutos, por 2 vezes, as lâminas foram incubadas durante 10

minutos com HRP Polymer (TL-125-HL, Thermo Scientific™ Lab Vision™ UltraVision™ LP

Detection System: HRP Polymer) por 15 minutos para MCT1, Streptavidin Peroxidase (TP-

125-HL, Thermo Scientific™ Lab Vision™ UltraVision™ Large Volume Detection System: anti-

Polyvalent, HRP) para MCT2 e MCT4 ou RTU Vectastain ABC elite reagente (PK-7200,

VECTASTAIN Elite ABC kit R.T.U.) por 45 minutos, a 37°C, para CD147, seguindo nova

lavagem com TBS, durante 5 minutos, por 2 vezes. Em seguida, as lâminas foram incubadas

com o cromógeno DAB (K346811, DAB+, Liquid, Dako) por 10 minutos e, ao final desta

incubação, as lâminas foram lavadas com água, seguido de contra-coloração utilizando

hematoxilina por 1 minuto. Por último, as lâminas foram desidratadas utilizando

concentrações crescentes de álcool (50%, 70%, 95% e 100%) e por último xilol (5 minutos,

por 2 vezes) e montadas de forma permanente utilizando Entellan® e lamínula. Como

controles positivos, foram usados cólon normal para MCT1, adenocarcinoma de cólon para

MCT4 e CD147 e tecido renal normal para MCT2.

16

Finalmente, as reações foram sujeitas à avaliação independente por dois patologistas

em estudo duplo-cego. As avaliações discordantes foram revistas em conjunto e a

positividade final foi considerada em consenso entre os dois observadores.

Para avaliação da extensão da imunoexpressão foi utilizada a seguinte graduação semi-

quantitativa: 0: 0% de células positivas; 1: <5% de células positivas; 2: 5-50% de células

positivas; 3: >50% de células positivas. A intensidade da marcação foi graduada como 0:

negativa; 1: fraca; 2: intermediária; 3: intensa. A graduação final foi dada pela soma dos

parâmetros extensão e intensidade48. A positividade para cada marcador foi definida

considerando como ponto de corte a graduação final que demonstrou melhor combinação

de sensibilidade e especificidade na associação com eventos (recidiva/recaída, progressão e

óbito), tendo como base a área sob a curva Roc. Apesar de ter sido avaliada a marcação na

membrana plasmática e no citoplasma, dada a relevância das proteínas no contexto tumoral

como transportadores transmembrana (e chaperona) com localização na membrana

plasmática, apenas esta localização celular foi considerada na construção da curva Roc.

Naqueles casos de marcação heterogênea entre os cilindros em triplicata, foi considerada a

maior extensão e intensidade observadas.

Os mesmos procedimentos de dupla avaliação, consenso e graduação da expressão

foram realizados para as diferentes histologias nos cortes inteiros, para fins de validação.

4.3.4 Variáveis de estudo

A coleta de dados foi realizada por meio de revisão de prontuário dos pacientes

incluídos no estudo. A ficha de coleta contempla idade, sexo, localização da lesão, data do

diagnóstico, marcadores séricos pré e pós tratamento, tamanho da neoplasia, tipos

histológicos, graduação (quando aplicável), estadiamento (TNM), presença de invasão

vascular, o status da margem de ressecção, a data da cirurgia, início da quimioterapia, início

da radioterapia, data da recidiva e data do óbito (Anexo 1).

A sobrevida global foi definida como o tempo entre a data do diagnóstico e a data da

última informação ou óbito. A sobrevida livre de eventos foi definida como o tempo entre a

data do diagnóstico e a data do evento (recidiva/recaída, progressão e óbito).

17

4.3.5 Análise estatística

Os resultados obtidos na avaliação da expressão das proteínas foram analisados

utilizando o software estatístico IBM-SPSS (versão 23.0). A comparação entre a frequência

de expressão dos diferentes marcadores, assim como a associação da expressão dos

marcadores com os dados clínico-patológicos dos pacientes, foi avaliada para significância

estatística utilizando o teste McNemar, qui quadrado de Pearson ou o teste exato de Fisher,

de acordo com a característica da amostra analisada. Para a associação entre a expressão

dos marcadores e o tamanho tumoral, foi utilizado o teste de Mann-Whitney. A

concordância entre a expressão das proteínas nos TMAs e cortes inteiros foi avaliada através

do coeficiente kappa78-80. As curvas de sobrevida global e livre de doença foram estimadas

utilizando o método de Kaplan-Meier e os dados comparados usando o teste de log rank.

Para análise multivariada de sobrevida, foi utilizada a regressão de Cox. O nível de

significância considerado em todos os testes foi de 5%. Casos que não apresentem

informação para um ou mais dados clínico-patológicos foram excluídos da análise específica.

4.3.6 Questões éticas

Este é um estudo retrospectivo de pacientes admitidos no Hospital de Câncer de

Barretos com diagnóstico incidente de tumor de células germinativas. O referido estudo foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da mesma unidade sob o número de parecer

541.235 (Anexo B).

Não foi aplicado o termo de consentimento livre e esclarecido e os dados de pacientes

foram obtidos exclusivamente de forma retrospectiva em prontuários arquivados no Serviço

de Arquivo Médico e Estatística (SAME) e nos blocos de parafina obtidos e arquivados no

serviço de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos / Fundação Pio XII. Será garantido o

sigilo de todos os indivíduos, não havendo divulgação pública do nome ou de qualquer outra

informação que possa identificar o envolvimento dos mesmos neste estudo. Devido à

necessidade de se manter material estocado na patologia para possíveis testes diagnósticos

futuros, o bloco de parafina não foi esgotado ou prejudicado. Assim, trata-se de um projeto

de pesquisa com um risco mínimo ao participante. Não haverá benefício direto ao

participante, no entanto, futuros pacientes diagnosticados com tumor de células

germinativas poderão beneficiar-se do conhecimento gerado durante este estudo.

18

5 RESULTADOS

5.1 Caracterização da amostra

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 1, a amostra é composta

predominantemente por pacientes com idade média de 32,5 anos, do sexo masculino

(62,6%), brancos (72,3%), com tumores malignos primários de testículo (61,1%).

Tabela 1 - Caracterização do perfil demográfico e clínico dos pacientes estudados (n=262)

(Barretos, 2015).

n (%) Média (DP) Mediana Intervalo

Idade 32,5 (13,7) 30,4 0,16-84,8

Sexo

Masculino 164 (62,6)

Feminino 98 (37,4)

Etnia

Branco 162 (72,3)

Negro/preto 11 (4,9)

Pardo/mulato 47 (21,0)

Outras 4 (1,7)

Localização do tumor primário

Testículo 160 (61,1)

Ovário 92 (35,1)

Sacrococcígeo 1 (0,4)

Mediastino 6 (2,3)

Outros 3 (1,1)

Tipos de tumores

Benigno 67 (25,6)

Testículo Maligno 160 (61,1)

Ovário Maligno 30 (11,4)

Maligno - outras localizações 5 (1,9)

(DP) Desvio padrão

19

A Tabela 2 mostra a caracterização do perfil clínico dos pacientes com tumores

benignos, especificamente teratomas maduros. Dentre estes, a maioria dos pacientes é do

sexo feminino (98,5%), com tumores ovarianos (92,5%).

Tabela 2 - Caracterização do perfil clínico dos pacientes com tumores benignos (n=67)

(Barretos, 2015).

n (%)

Sexo

Masculino 1 (1,5)

Feminino 66 (98,5)

Localização do tumor primário

Ovário 62 (92,5)

Mediastino 3 (4,5)

Outros 2 (3,0)

Os tipos histológicos de TCG identificados foram teratoma maduro, teratoma

imaturo, seminoma/germinoma/disgerminoma, tumor do seio endodérmico, carcinoma

embrionário, coriocarcinoma e tumor misto de células germinativas (com proporções

variadas de diferentes histologias) (Figura 7).

F

A B C

D E

Figura 7 - Tipos histológicos de TCGs à coloração de H&E. A) Teratoma maduro; B) Teratoma

imaturo; C) Seminoma; D) Tumor do Seio endodérmico; E) Carcinoma embrionário; F)

Coriocarcinoma.

20

De acordo com a Tabela 3, os tipos histológicos mais frequentes nos tumores malignos

testiculares foram seminoma (48,1%) e tumor misto de células germinativas (40,1%). O

estadio I foi o predominante (48,7%) e a maioria dos pacientes foi submetida à

quimioterapia (56,8%). Após tratamento, na data da última informação disponível, a maioria

dos pacientes encontrava-se vivo e sem doença (86,6%).

Tabela 3 - Caracterização do perfil clínico e anatomopatológico dos pacientes com tumores

malignos de testículo (n=160) (Barretos, 2015).

n (%)

Tipo histológico

Seio endodérmico 3 (1,9)

Coriocarcinoma 2 (1,3)

Carcinoma embrionário 11 (6,9)

Teratoma imaturo grau I 2 (1,2)

Teratoma imaturo grau III 1 (0,6)

Seminoma 77 (48,1)

TCG misto 64 (40,1)

Estadiamento ao diagnóstico

I 76 (48,7)

II 37 (23,7)

III 33 (21,2)

IV 3 (1,9)

IS 7 (4,5)

Submetidos à quimioterapia

Não 67 (43,2)

Sim 88 (56,8)

Status – pós tratamento

Vivo sem doença 136 (86,6)

Vivo em tratamento 5 (3,2)

Óbito por câncer 13 (8,3)

Óbito outras causas 3 (1,9)

21

Conforme a Tabela 4, o tipo histológico mais frequente nos tumores malignos de

ovário foi disgerminoma (30,0%) e o estadio mais frequente foi estadio I (42,9%). A maior

parte das pacientes foi submetida à quimioterapia (63,3%) e encontrava-se viva e sem

doença na data da última informação disponível (80,0%).

Tabela 4 - Caracterização do perfil clínico e anatomopatológico dos pacientes com tumores

malignos de ovário (n=30) (Barretos, 2015).

n (%)

Tipo histológico

Seio endodérmico 4 (13,3)

Teratoma imaturo grau I 2 (6,7)

Teratoma imaturo grau II 4 (13,3)

Teratoma imaturo grau III 4 (13,3)

Teratoma imaturo grau não definido 1 (3,3)

Disgerminoma 9 (30,0)

TCG Misto 6 (20,0)

Estadiamento ao diagnóstico

I 12 (42,9)

II 5 (17,9)

III 3 (10,7)

IV 8 (28,6)

Submetidos à quimioterapia

Não 11 (36,7)

Sim 19 (63,3)

Status – pós tratamento

Vivo sem doença 24 (80,0)

Óbito por câncer 3 (10,0)

Óbito toxicidade 3 (10,0)

22

5.2 Avaliação da marcação imuno-histoquímica e definição dos pontos de corte de

positividade dos marcadores

As reações de imuno-histoquímica foram graduadas em extensão (porcentagem de

células positivas) e intensidade (fraco/moderado/intenso), conforme a Figura 8. Aqueles

casos em que houve perda dos cilindros de TMA ou a determinada histologia não estava

representada no corte de imuno, considerou-se como perda para o respectivo marcador e

histologia.

Para definição dos pontos de corte considerados como positivos para cada marcador,

foi utilizada a área sob a curva Roc, levando-se em consideração a soma dos escores de

positividade e a ocorrência de eventos clínicos de recidiva, recaída, progressão e óbito. Para

MCT1 e MCT4, o escore positivo com melhor sensibilidade e especificidade foi seis,

enquanto para MCT2 foi três e para CD147 foi cinco (Tabela 5).

A B

C D

Figura 8 - Intensidades de marcação membranar à imuno-histoquímica

(MCT4 como exemplo). A) Negativo; B) Fraco; C) Moderado; D) Intenso.

23

Tabela 5 – Pontos de corte da expressão dos marcadores metabólicos com base na curva

Roc, com medidas de discriminação (Barretos, 2015).

Legenda: IC - Intervalo de confiança; VPP - Valor preditivo positivo; VPN - Valor preditivo negativo

5.3 Caracterização da expressão dos marcadores metabólicos em amostras de TCG e de

tecido normal De acordo com os resultados apresentados na Tabela 6, relativa à expressão

membranar das proteínas, houve uma diferença estatisticamente significativa entre tecido

normal e tumores malignos de testículo nas amostras pareadas para a expressão membranar

de MCT4 (p<0,001) e CD147 (p<0,001). Para os tumores de ovário não houve positividade

para nenhum dos marcadores em tecido normal, nas amostras pareadas com tumores

malignos, o que impossibilita a comparação. Quando comparados os tumores benignos e

malignos de ovário, houve diferença significativa para a expressão de MCT1 (p<0,001), MCT2

(p<0,001), MCT4 (p<0,001) e CD147 (p=0,013) (Tabela 7).

De notar, nas amostras de tecido normal que apresentaram expressão das diferentes

proteínas, mas com graduação final abaixo do ponto de corte para positividade, a expressão

foi predominantemente observada nos folículos e corpos lúteos ovarianos e nos túbulos

seminíferos dos testículos (Figura 9).

Nos tumores benignos, a expressão membranar foi mais frequente em glândulas

sebáceas e também em outras células epiteliais dos teratomas (Figura 10).

Marcador Ponto de corte

Sensibilidade

(%)

Especificidade

(%)

VPP VPN Área sob a curva Roc

(IC)

MCT1 ≥6 62,3 65,3 22,7 91,4 0,668

(0,576-0,760)

MCT2 ≥3 80,0 56,4 19,0 95,6 0,709

(0,558-0,860)

MCT4 ≥6 69,0 62,0 24,4 91,8 0,678

(0,581-0,775)

CD147 ≥5 65,6 60,0 28,77 87,64 0,608

(0,483-0,733)

24

Tabela 6 - Frequências de expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 em tecido

normal e tumores malignos de testículo (Barretos, 2015).

Teste de McNemar

Tabela 7 - Frequências de expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT 4 e CD147 em

tumores benignos e malignos de ovário (Barretos, 2015).

Qui-quadrado de Pearson; (*)Exato de Fisher

MCT1 MCT2 MCT4 CD147

n Positivo

(%) p n

Positivo

(%) p n

Positivo

(%) p n

Positivo

(%)

p

Normal

97

47 (48,5)

0,888

96

11 (11,5)

0,118

92

19 (20,7)

<0,001

92

13 (14,1)

<0,001

Maligno

49 (50,5)

4 (4,2)

41 (44,6)

35 (38,1)


n Positivo

(%) p n

Positivo

(%) p n

Positivo

(%) p n

Positivo

(%) p

Benigno

60

1 (1,7)

<0,001*

56

32 (57,1)

<0,001

55

0 (0,0)

<0,001

*

60

2 (3,3)

0,013

*

Maligno

29

9 (31,0)

29

3 (10,3)

29

7 (24,1)

29

6 (20,7)

A B

C D

Figura 9 - Expressão dos marcadores metabólicos em tecido normal. A) MCT1 em ovário; B) MCT4 em ovário; C) MCT4 em testículo; D) CD147 em testículo

25

A Figura 11 ilustra a marcação nos tumores malignos, tomando como exemplo os

seminomas. Cabe ressaltar que o MCT2 foi usado marcação citoplasmática nesta figura.

C D

B A

Figura 10 - Expressão dos marcadores metabólicos em tumores benignos

(teratomas maduros). A) MCT1; B) MCT2; C) MCT4, D) CD147.

A B

C D

Figura 11 - Expressão dos marcadores metabólicos em seminomas. A) MCT1;

B) MCT2 (citoplasmático); C) MCT4; D) CD147.

26

5.4 Validação do método de TMA

A validação do método de TMA foi realizada através das reações de imuno-

histoquímica em cortes histológicos inteiros e seus respectivos cilindros de TMA, conforme

ilustrado na Figura 12.

Houve concordância moderada entre TMAs e cortes inteiros para MCT1 e MCT4, e

concordância substancial para MCT2 e CD147, o que foi estatisticamente significativo para

todos os marcadores (p<0,001). A porcentagem de casos concordantes entre os métodos

revelou uma acurácia do TMA de 80,5% para MCT1, 93,2% para MCT2, 79,1% para MCT4 e

83,3% para CD147 (Tabela 8).

1 2 3 4

MCT1

MCT2

MCT4

CD147

Figura 12 - Expressão dos marcadores MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 nos TMAs (colunas 1 e 3) e

nos cortes inteiros (colunas 2 e 4). Magnificação de 100x (colunas 1 e 2) e 400x (colunas 3 e 4).

27

Tabela 8 - Concordância entre expressão das proteínas nos TMAs e cortes inteiros (Barretos,

2015).

(*) Coeficiente kappa

5.5 Associação entre a expressão das proteínas relacionadas ao metabolismo e os

parâmetros clínico-patológicos dos pacientes

Os resultados expressos na Tabela 9 mostram a análise das associações entre a

expressão das proteínas relacionadas ao metabolismo e as características clínico-patológicas

dos pacientes adultos com TCGs de testículo. Como pode ser observado, houve associação

estatisticamente significativa entre a expressão de MCT1 e a presença de metástase nos

linfonodos regionais (estadiamento N) (p=0,015), a maiores estadiamentos M (p=0,002),

estadios maiores que I (p=0,001) e tumores não seminomatosos (p<0,001). A expressão de

MCT4 apresentou associação com maiores estadiamentos T (p=0,004) e M (p=0,037),

estadios maiores que I (p=0,045), presença de invasão vascular (p=0,002), histologia não

seminomatosa (p<0,001) e maiores estratificações de risco (p=0,030). A expressão de CD147

esteve associada a estadio maior que I (p=0,003), metástase nos linfonodos regionais

(p=0,022), metástase à distância (p=0,020) e histologia não seminomatosa (p<0,001).

Marcador Porcentagem de casos

concordantes (%)

Concordância (*)

MCT1 80,5 0,591

MCT2 93,2 0,633

MCT4 79,1 0,567

CD147 83,3 0,611

28

Tabela 9 - Associação da expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 com as

características clínico-patológicas em TCGs testiculares de adultos (Barretos, 2015).

Qui-quadrado de Pearson; (*)Exato de Fisher

A Tabela 10 evidencia que houve associação estatisticamente significativa apenas

entre o tamanho tumoral e a expressão de MCT4 nos tumores testiculares, sendo que

tumores positivos para MCT4 apresentam um tamanho do maior eixo superior aos dos

tumores negativos para MCT4.


n Positivo

(%) p n

Positivo (%)

p n Positivo

(%) p n

Positivo (%)

p

Estadiamento T 0,148 0,081* 0,004 0,069

*

T1 85 35

(41,2) 85 5 (5,9) 83

29 (34,9)

82 25

(30,5)

T2+T3+T4 58 31

(53,4) 58 0 (0,0) 57

34 (59,6)

57 26

(45,6)

Estadiamento N 0,015 1,000* 0,094 0,022

*

N0 84 33

(39,3) 83 4 (4,8) 81

33 (40,7)

80 23

(28,8)

N1+N2+N3 62 37

(59,7) 62 2 (3,2) 62

34 (54,8)

60 29

(47,5)

Estadiamento M 0,002 1,000* 0,037 0,020

*

M0 122 52 (42,6) 121 5 (4,1) 120 52(43,3) 118 39 (33,1)

M1 25 19 (76,0) 25 1 (4,0) 24 16(66,7) 24 14 (58,3)

Estadio 0,001 1,000* 0,045 0,003

*

I 74 26 (35,1) 73 3 (4,1) 72 28 (38,9) 71 18 (25,4)

IS+II+III+IV 73 45 (61,6) 73 3 (4,1) 72 40 (55,6) 71 35 (49,3)

Invasão vascular/linfática

0,889 0,178* 0,002 0,493

*

Não 99 45 (45,5) 99 6 (6,1) 97 35 (36,1) 96 33 (34,4)

Sim 43 19 (44,2) 43 0 (0,0) 42 27 (64,3) 42 17 (40,5)

Histologia <0,001 0,114* <0,001 <0,001

*

Seminoma 75 17 (22,7) 75 1 (1,3) 73 23 (31,5) 73 10 (13,7)

Não seminoma 74 54 (73,0) 73 5 (6,8) 73 46 (63,0) 71 43 (60,6)

Classificação (IGCCG)

0,194* 0,452

* 0,030

* 0,801

*

Baixo risco 45 26 (57,8) 45 2 (4,4) 45 21 (46,7) 44 22 (50,0)

Risco intermédio 11 7 (63,6) 11 0 (0,0) 11 8 (72,7) 11 7 (63,6)

Alto risco 10 9(90,0) 10 1(10,0) 9 8(88,9) 9 5 (55,6)

Recidiva/Recaídas 0,108 0,542* 0,303 0,682

*

Não 125 55 (44,0) 125 5 (4,0) 123 56 (45,5) 122 44 (36,1)

Sim 17 11 (64,7) 17 1 (5,9) 17 10 (58,8) 17 7 (41,2)

Progressão 0,468* 0,287

* 0,725

* 1,000

*

Não 68 40 (58,8) 68 2(2,9) 68 37(54,4) 67 31 (46,3)

Sim 8 6 (75,0) 8 1 (12,5) 8 5 (62,5) 8 4 (50,0)

29

Tabela 10 - Associação entre a expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 e o

tamanho das neoplasias testiculares (Barretos, 2015).

Teste de Mann-Whitney

Para os tumores malignos de ovário, houve associação estatisticamente significativa

somente entre a expressão membranar de MCT1 e a histologia de não germinoma (p=0,033,

Tabela 11).

Tabela 11 - Associação da expressão membranar de MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 com características clínico-patológicas em TCGs de ovário (Barretos, 2015).

Exato de Fisher

Tamanho do maior eixo (mm)

n Mean rank p

MCT1 0,672

Negativo 65 60,72

Positivo 58 63,44

MCT2 0,268

Negativo 119 60,92

Positivo 3 84,50

MCT4 0,034

Negativo 63 54,51

Positivo 58 68,05

CD147

Negativo 77 60,44 0,852

Positivo 42 59,20


n Positivo

(%) p n

Positivo (%)

p n Positivo

(%) p n

Positivo (%)

p

Estadio 1,000 0,569 0,091 1,000

I 12 4 (33,3) 12 2 (16,7) 12 1 (8,3) 12 2 (16,7)

II+III+IV 15 4 (26,7) 15 1 (6,7) 15 6 (40,0) 15 3 (20,0)

Estadiamento M 0,172 0,536 0,142 0,123

M0 20 4 (20,0) 20 3 (15,0) 20 3 (15,0) 20 2 (10,0)

M1 8 4 (50,0) 8 0 (0,0) 8 4 (50,0) 8 3 (37,5)

Histologia 0,033 0,540 0,068 0,148

Germinoma 8 0 (0,0) 8 0 (0,0) 8 4 (50,0) 8 0 (0,0)

Não Germinoma

21 9 (42,9) 21 3 (14,3) 21 3 (14,3) 21 6 (28,6)

30

Como pode ser observado nas Figuras 13 e 15 e nas Tabela 12 e 14, encontrou-se uma

associação estatisticamente significativa entre a expressão de MCT4 e menor sobrevida

global (p=0,011) e menor sobrevida livre de eventos (p=0,027) para tumores testiculares na

análise univariada. Entretanto, na análise multivariada por Regressão de Cox, a única

variável associada às taxas de sobrevida global e sobrevida livre de eventos foi a presença de

metástase à distância (p<0,001).

Tabela 12 - Estimativa da sobrevida global considerando variáveis clínicas e expressão das

proteínas em TCGs testiculares (Barretos, 2015).

Variáveis Categorias nº de casos nº de óbitos

Probabilidade de

sobrevida (%) p

2 anos 5 anos

Estadiamento T T1 85 4 96,2 96,2 0,010

T2+T3+T4 57 9 85,7 82,6

Estadiamento N N0 83 1 98,7 98,7 <0,001

N1+N2+N3 62 14 80,3 77,4

Estadio I 73 0 100 100 <0,001

IS+II+III+IV 73 16 81,9 80,4

Estadiamento M M0 121 4 97,4 95,9 <0,001

M1 25 12 54,9 64,9

Tipo histológico Seminoma 74 6 94,3 90,4 0,447

Não seminoma 74 10 87,5 87,5

IGCCG Baixo 45 2 95,5 95,5 <0,001

Intermédio 11 4 72,7 62,3

Alto 10 8 30

Invasão Vascular Não 98 8 93,6 92,5 0,176

Sim 43 6 88,1 83,7

MCT1 Negativo 77 5 94,5 93,0 0,106

Positivo 71 11 87,0 84,7

MCT2 Negativo 141 15 90,3 89,1 0,650

Positivo 6 1 83,3 83,3

MCT4 Negativo 76 4 95,8 95,8 0,011

Positivo 69 11 84,8 82,0

CD147 Negativo 90 8 92,9 91,2 0,270

Positivo 53 7 86,3 86,3

Kaplan-Meier, Log Rank

31

Tabela 13 - Estimativa da sobrevida global considerando variáveis clínicas e expressão das

proteínas em TCGs ovarianos (Barretos, 2015).

Variáveis Categorias nº de casos nº de óbitos

Probabilidade

de sobrevida (%) p

2 anos 5 anos

Estadio I 11 0 100 100 0,085

IS+II+III+IV 16 5 75 75

Estadiamento N N0 25 4 87,8 87,8 0,340

N1+N2+N3 3 1 66,7 66,7

Tipo histológico Seminoma 9 0 100 100 0,110

Não seminoma 20 6 74,7 74,7

Estadiamento M M0 20 1 94,7 94,7 0,011

M1 8 4 62,5 62,5


Não seminoma 20 6 74,7 74,7

MCT1 Negativo 20 3 84,7 84,7 0,264

Positivo 8 3 75 75

MCT2 Negativo 25 5 84 84 0,562

Positivo 3 1 66,7 -

MCT4 Negativo 21 3 85,7 85,7 0,229

Positivo 7 3 71,4 71,4

CD147 Negativo 22 3 90,9 90,9 0,005

Positivo 6 3 50 -


32

Conforme as Figuras 14 e 16 e as Tabelas 13 e 15, observou-se uma associação

estatisticamente significativa entre a expressão de CD147 e a sobrevida global (p=0,005) e a

sobrevida livre de eventos para tumores ovarianos na análise univariada.

p= 0,106 p= 0,650

p= 0,011 p= 0,270

Figura 13 - Curvas de sobrevida global (Kaplan-Meier) dos pacientes com tumores malignos

de testículo associadas à expressão membranar das proteínas MCT1, MCT2, MCT4 e CD147.

33

Tabela 14 - Estimativa da sobrevida livre de evento considerando variáveis clínicas e

expressão das proteínas em TCGs testiculares (Barretos, 2015).

Variáveis Categorias nº de casos nº de eventos

Probabilidade de

sobrevida (%) p

2 anos 5 anos

Estadiamento T T1 85 11 90 86,7 0,221

T2+T3+T4 57 11 83,9 75,4

Estadiamento N N0 83 6 94,8 93,2 <0,001

N1+N2+N3 62 18 75,6 67

Estadiamento M M0 121 9 94,8 92,3 <0,001

M1 25 26 43,1 32,8

Estadio I 73 5 95,5 93,7 0,001

IS+II+III+IV 73 20 76,4 68,9

Tipo histológico Seminoma 74 10 90 85,9 0,283

Não

seminoma 74 15 82 76,5

IGCCG Baixo 45 3 95,6 92 <0,001

Intermédio 11 6 53 39,8

Alto 10 9 20 -

Invasão Vascular Não 98 16 86,1 83,2 0,848

Sim 43 7 88,2 74,5

MCT1 Negativo 77 9 91,9 86,2 0,095

Positivo 71 16 79,8 75,6

MCT2 Negativo 141 24 85,9 80,7 0,991

Positivo 6 1 83,3 83,3

MCT4 Negativo 76 8 92 90,3 0,027

Positivo 69 16 80,1 71,1

CD147 Negativo 90 14 88,4 82,6 0,430

Positivo 53 10 82,5 79,4


34

Tabela 15 - Estimativa da sobrevida livre de evento considerando variáveis clínicas e

expressão das proteínas em TCGs ovarianos (Barretos, 2015).


Variáveis Categorias

nº de casos nº de eventos

Probabilidade de

sobrevida (%) p

2 anos 5 anos

Estadio I 11 0 100 100 0,081

IS+II+III+IV 16 5 75 75

Estadiamento N N0 25 4 88 88 0,335

N1+N2+N3 3 1 66,7 66,7


Não

seminoma 20 6 75 75

Estadiamento M M0 20 1 95 95 0,011

M1 8 4 62,5 62,5

MCT1 Negativo 20 3 85 85 0,259

Positivo 8 3 75 75

MCT2 Negativo 25 5 84 84 0,556

Positivo 3 1 66,7 66,7

MCT4 Negativo 21 3 85,7 85,7 0,224

Positivo 7 3 71,4 71,4

CD147 Negativo 22 3 90,9 90,9 0,007

Positivo 6 3 50 50

35

p= 0,264 p= 0,562

p= 0,005 p= 0,229


de ovário associadas à expressão membranar das proteínas MCT1, MCT2, MCT4 e CD147.

36

p= 0,095 p= 0,991

p= 0,027 p= 0,430

Figura 15 - Curvas de sobrevida livre de evento (Kaplan-Meier) dos pacientes com tumores

malignos de testículo associadas à expressão membranar das proteínas MCT1, MCT2, MCT4

e CD147.

37

5.5.1 Associação entre a coexpressão dos MCTs e a chaperona CD147 e os parâmetros

clínico-patológicas dos pacientes

Os resultados apresentados na Tabela 16 evidenciam que houve associação

estatisticamente significativa entre a expressão de MCT1 e CD147 (p<0,001) e entre a

expressão de MCT4 e CD147 (p<0,001) para tumores testiculares. Para os tumores ovarianos

não houve associação estatisticamente significativa entre nenhum dos MCTs e CD147.

p= 0,259 p= 0,556

p= 0,224 p= 0,007


tumores malignos de ovário associadas à expressão das proteínas MCT1, MCT2, MCT4 e

CD147.

38

Tabela 16 - Associação da expressão de MCT1, MCT2 e MCT4 com a expressão de CD147 em

TCGs de testículo (Barretos, 2015).

Foram também avaliadas as coexpressões de MCT1/CD147 e MCT4/CD147 e suas

associações com dados clínico-patológicos. Para os tumores testiculares os resultados

evidenciaram associação significativa entre MCT1/CD147 e metástase nos linfonodos

regionais (p=0,001), metástase à distância (p=0,001), estadios maiores que I (p<0,001) e

histologia não seminomatosa (p<0,001). A coexpressão MCT4/CD147 esteve associada a

estadiamento maiores que T1 (p=0,011), metástase nos linfonodos regionais (p=0,023),

metástase à distância (p=0,003), estadios maiores que I (p=0,004), à invasão vascular

(p=0,032) e histologia não seminomatosa (p<0,001) (Tabela 17). Não houve associação entre

as coexpressões e o tamanho tumoral (Tabela 18).

CD147

n Positivo (%) p

MCT1 <0,001

Positivo 68 42 (61,8)

Negativo 76 11 (14,5)

MCT2 0,669

Positivo 6 3 (50,0)

Negativo 138 50 (36,2)

MCT4 <0,001

Positivo 68 42 (61,8)

Negativo 76 11 (14,5)

39

Tabela 17 - Associação entre coexpressão de MCT1/CD147 e MCT4/CD147 com

características-clínico patológicas em TCGs de testículo (Barretos, 2015).

Qui-quadrado de Pearson; (*) Exato de Fisher

MCT1+CD147 MCT4+CD147

n Positivo (%) p n Positivo (%) p

Estadiamento T 0,084 0,011

T1 83 19 (22,9) 83 17 (20,5)

T2+T3+T4 58 21 (36,2) 57 23 (40,4)

Estadiamento N 0,001 0,023*

N0 82 15 (18,3) 80 17 (21,3)

N1+N2+N3 61 26 (42,6) 62 25 (42,5)

Estadiamento M 0,001 0,003*

M0 120 29 (23,3) 119 29 (24,4)

M1 24 14 (58,3) 24 13 (54,2)

Estadio <0,001 0,004*

I 73 11 (15,1) 71 13 (18,3)

IS+II+III+IV 71 31 (43,7) 72 29 (40,3)

Invasão vascular/linfática 0,676 0,032

Não 97 26 (26,8) 97 27 (22,7)

Sim 43 13 (30,2) 42 11 (40,5)

Histologia <0,001 <0,001*

Seminoma 75 7 (9,3) 73 8 (12,0)

Não seminoma 71 35 (49,3) 72 34 (12,9)

Classificação (IGCCG) 0,476* 0,185

*

Baixo risco 44 19 (43,2) 45 16 (35,6)

Risco intermédio 11 7 (63,6) 11 7 (63,6)

Alto risco 9 5 (55,6) 9 5 (55,6)

Recidiva/Recaídas 0,253 0,255*

Não 124 33 (26,6) 123 33 (26,8)

Sim 17 7 (41,2) 17 7 (41,2)

Progressão 0,706* 0,705

*

Não 67 26 (38,8) 68 26 (38,2)

Sim 8 4 (50,0) 8 4 (50,0)

40

Tabela 18 - Associação entre coexpressão MCT1/CD147 e MCT4/CD147 e o tamanho das

neoplasias testiculares (Barretos, 2015).

Tamanho do maior eixo (mm)

n Mean rank p

MCT1+CD147 0,636

Negativo 87 61,94

Positivo 34 58,59

MCT4+CD147 0,768

Negativo 86 59,91

Positivo 34 61,99

Teste de Mann-Whitney

Para os tumores ovarianos, não houve associação estatisticamente significativa entre

as coexpressões MCT1/CD147 e MCT4/CD147 e as variáveis clínico-patológicas analisadas

(Tabela 19).

Tabela 19 - Associação entre coexpressão MCT1/CD147 e MCT4/CD147 com características

clínico-patológicas em TCGs de ovário (Barretos, 2015).

Teste Exato de Fisher

MCT1+CD147 MCT4+CD147

n Positivo (%) p n Positivo (%) p

Estadio 1,000 1,000

I 12 1 (8,3) 2 0 (0,0)

IS+II+III+IV 15 2 (13,3) 15 1 (6,7)

Estadiamento N 1,000 1,000

N0 26 3 (11,5) 26 1 (3,8)

N1+N2+N3 12 0 (0,0) 2 0 (0,0)

Estadiamento M 0,188 0,286

M0 20 1 (5,0) 20 0 (0,0)

M1 8 2 (25,0) 8 1 (12,5)

Histologia 0,552 1,000

Germinoma 8 0 (0,0) 8 0 (0,0)

Não germinoma 21 4 (19,0) 21 1 (4,8)

41

Não houve associação estatisticamente significativa entre a coexpressão das proteínas

e as taxas de sobrevida para os TCGs testiculares (Figuras 17 e 18). Para os tumores

ovarianos, houve apenas 4 casos positivos para MCT1/CD147 e um caso positivo para

MCT4/CD147. Dado o pequeno número de casos positivos, os dados de sobrevida não estão

representados.

p= 0,059 p= 0,059


de testículo associadas à coexpressão das proteínas MCT1/CD147 e MCT4/CD147.

p= 0,076 p= 0,066

Figura 18 - Curvas de sobrevida livre de evento (Kaplan-Meier) dos pacientes com tumores

malignos de testículo associadas à coexpressão das proteínas MCT1/CD147 e MCT4/CD147.

42

6 DISCUSSÃO

O presente estudo permitiu caracterizar a expressão dos marcadores metabólicos

MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 em uma amostra representativa de TCGs de pacientes do

Hospital de Câncer de Barretos, através de um método de alto rendimento que é o TMA. É

importante considerar que este foi o primeiro estudo que avaliou a expressão destes

marcadores em TCGs no contexto nacional e internacional.

De acordo com os resultados, a amostra foi composta predominantemente por

homens, com idade média de 32,5 anos, tumores malignos de testículo predominantemente

seminomatosos, o que corrobora outros estudos que incluíram estes tipos tumorais3, 4.

Destes pacientes, 48,7% foram diagnosticados em estadio clínico I, com elevado índice de

sobrevida, tendo 86,6% vivos sem doença, conforme esperado4, 82. Dentre os tumores

malignos de ovário, também predominou o estadio I ao diagnóstico e alta taxa de sobrevida

(80,0%), conforme previamente relatado para estes tumores83.

A definição dos pontos de corte de positividade imuno-histoquímica baseada na área

sob a curva Roc permitiu definir os escores associados a eventos clínicos de recidiva, recaída,

progressão e óbito, assim como determinar a sua sensibilidade e especificidade. Deste

modo, os pontos de corte encontrados foram MCT1 ≥ 6, MCT2 ≥3, MCT4 ≥6 e CD147 ≥5.

Com exceção do MCT2, estes pontos de corte diferem dos utilizados em estudos prévios do

grupo, uma vez que consideram a importância do desfecho clínico33, 48.

O TMA, quando comparado aos cortes inteiros, demonstrou ser um método com

concordância moderada para MCT1 e MCT4 a substancial para MCT2 e CD147, medida pelo

coeficiente kappa. Uma potencial limitação deste método é a heterogeneidade tumoral, tão

frequente nos TCGs. No entanto, no presente estudo, foram utilizados três cilindros para

cada tipo histológico de todos os casos, numa tentativa de não perder esta

heterogeneidade. O presente estudo é semelhante a outros que avaliaram TCGs por imuno-

histoquímica em TMAs, nos quais foram usados cilindros em triplicata63, 85, porém, difere

destes e de outro estudo recente nos quais a marcação nos TMAs não foi comparada com

cortes inteiros63, 85, 86. Também difere de outro estudo, no qual foram usados cilindros em

duplicata para parte dos casos e a comparação foi feita com um número muito menor de

43

cortes inteiros (n=10) e não foi utilizado o coeficiente kappa para avaliar a concordância87.

Este estudo apresenta o diferencial de ter amostragem com cilindros em triplicata de cada

histologia, além de utilizar o coeficiente kappa que mostrou uma concordância moderada a

substancial, comparando 45 casos de cortes inteiros numa amostra de 262 casos de TMA.

A comparação da expressão das proteínas entre tecido normal e neoplásico em

amostras pareadas revelou maior expressão de MCT4 e CD147 nos tumores testiculares que

no tecido normal. Para os tumores ovarianos, não foi possível a comparação entre tecido

normal e tumores malignos, devido à ausência de casos positivos nas amostras pareadas.

Entretanto, a comparação entre neoplasias benignas e malignas de ovário evidenciou maior

frequência de expressão de MCT1, MCT4 e CD147 nas neoplasias malignas. A sobrexpressão

de MCT1, MCT4 e CD147 nos TCGs malignos sugere que as células destas neoplasias tenham

um alto efluxo de lactato e, portanto, um fenótipo hiperglicolítico, sobretudo quando

comparados ao tecido normal e TCGs benignos. O fenótipo glicolítico geralmente é

associado com características de maior agressividade tumoral, como previamente descrito

em tumores adrenocorticais88 e outros tipos de neoplasias65, 89, 90. A maior expressão destas

proteínas em neoplasias malignas corrobora achados prévios de sobrexpressão das

proteínas em outros tipos tumorais e sua associação com o fenótipo glicolítico e

comportamento maligno28, 33, 37, 44, 48, 50, 52, 56, 57, 78, 88, 91-93. Nos tumores ovarianos, o MCT2 foi

mais frequentemente expresso em tumores benignos do que em malignos, o que sugere que

os TCGs benignos tenham a tendência a um fenótipo oxidativo, em contraste com os

malignos que seriam hiperglicolíticos, com base no aumento da expressão de MCT1, MCT4 e

CD147. Esta hipótese surge considerando a função do MCT2, que é o transportador com

maior afinidade para o substrato e atua principalmente no influxo de monocarboxilatos, o

que é reforçado pela sua expressão em tecidos que consomem lactato16-18, 88. O fenótipo

oxidativo, assim como a positividade para MCT2, está geralmente associado a características

de menor agressividade tumoral, conforme previamente descrito em tumores da córtex

adrenal88. Os achados de maior expressão de MCT2 em TCGs benignos corroboram o fato de

que os tumores que consomem lactato sejam menos agressivos do que aqueles glicolíticos.

Ao avaliar a expressão dos marcadores em TCGs, os achados mostraram associação

entre a expressão de MCT1, MCT4 e CD147 com fatores associados a pior prognóstico, como

histologia não-seminomatosa, estadios mais elevados, maior ocorrência de metástases,

44

invasão vascular, tamanho tumoral e estratificação de risco. A maior ocorrência de

metástases e os maiores estadios associados à expressão de MCT1, MCT4 e CD147 refletem

o papel biológico destas proteínas no efluxo do lactato, na manutenção do pH ácido

extracelular, e portanto, no fenótipo glicolítico de maior agressividade tumoral. A

associação da expressão de MCT4 com maiores taxas de invasão vascular reflete o papel do

lactato extracelular como estimulador da angiogênese13, 28, enquanto o maior tamanho

tumoral para aqueles TCGs que expressam MCT4 pode ser explicado pela maior resistência à

hipóxia, presente nos tumores de fenótipo glicolítico13-15, 28. Apesar de não haver estudos

destes marcadores em TCGs, nossos achados corroboram as evidências prévias da literatura

que demonstram associação entre a expressão destas proteínas e pior prognóstico em

outros tipos de câncer de fenótipo glicolítico33, 49, 50, 52, 53, 55-58. Na presente amostra, estes

achados foram mais evidentes para os tumores testiculares. Nestes tumores, a frequência

de expressão de CD147 foi maior naqueles casos que também foram MCT1 e MCT4

positivos, mas não nos MCT2 positivos, o que está de acordo com a função biológica desta

proteína20-22. No entanto, em linha com estudos prévios24, 49, 51, 54, 57, 76, a expressão de CD147

no presente estudo não explica a expressão membranar de todos os casos positivos para

MCT1 e MCT4, sugerindo a existência de uma outra chaperona. De fato, uma outra proteína,

a CD44, foi também apontada como chaperona do MCT1 e MCT494, no entanto, estudos

adicionais são necessários para verificar a possível existência de chaperonas adicionais78. De

notar, a coexpressão de MCT1 e MCT4 com a sua chaperona CD147 também demonstrou

associação com fatores de pior prognóstico. Nos tumores testiculares, a presença de MCT1

ou MCT4 coexpressos com CD147 esteve associada a maior número de metástase nos

linfonodos regionais, metástase à distância, estadios mais elevados e histologia não

seminomatosa. Além disso, a coexpressão MCT4/CD147 também foi associada a maior

invasão vascular. Estas associações foram semelhantes àquelas obtidas analisando as

proteínas expressas isoladamente. A exceção foi a coexpressão MCT4/CD147 que

apresentou associação com maior número de metástases ganglionares, conforme a

expressão isolada de CD147,mas que não esteve presente nos casos de MCT4 expresso

isoladamente. Estes achados de coexpressão são condizentes com a função reguladora de

CD147 e corroboram resultados de estudos prévios51, 54, 56, 57, 76. Já para os tumores

ovarianos, a única associação foi entre a expressão de MCT1 e a histologia não-

45

germinomatosa. A ausência de outras associações entre a expressão dos marcadores e as

características clínicas está provavelmente relacionada ao reduzido tamanho da amostra de

tumores malignos de ovário (30 pacientes neste estudo).

A análise univariada de sobrevida revelou que a sobrexpressão de MCT4 esteve

associada a menores taxas de sobrevida global e livre de eventos para tumores testiculares.

Já para os TCGs ovarianos, observou-se uma associação apenas entre CD147 e as taxas de

sobrevida global e livre de eventos. Tais associações também foram previamente observadas

em outros tipos de tumores sólidos58, como hepatocarcinoma50, carcinomas de mama52, de

pulmão53, de rim55 e de bexiga56, e tumores estromais gastrointestinais57, por exemplo.

Entretanto, na análise multivariada por Regressão de Cox, não houve associação

estatisticamente significativa entre a expressão das proteínas e as curvas de sobrevida.

Somente a presença de metástase à distância esteve associada a menores taxas de

sobrevida global e sobrevida livre de eventos avaliada pela Regressão de Cox. Avaliando o

impacto da coexpressão MCT1/CD147 e MCT4/CD147 na sobrevida, não foi observada

associação entre a coexpressão das proteínas e as taxas de sobrevida nos tumores

testiculares. Apesar deste achado diferir de um estudo onde a coexpressão MCT1/CD147

esteve associada a menor sobrevida global em tumor estromal gastrointestinal57, nota-se

que, isoladamente, o MCT1, o MCT4 e a CD147 já foram associados a menores taxas de

sobrevida em outros tipos tumorais48, 55, 56, 58, 93.

Os resultados encontrados na avaliação da expressão das proteínas MCT1, MCT4 e

CD147 e das coexpressões MCT1/CD147 e MCT4/CD147 reforçam a sua importância como

potenciais marcadores biológicos de prognóstico nos TCGs, sobretudo naqueles primários de

testículo.

Como perspectiva futura, está prevista a avaliação de outros marcadores metabólicos,

em especial o GLUT1 e anidrase carbônica IX (CAIX), nesta mesma amostra, a fim de

complementar a compreensão do perfil metabólico dos TCGs. Esta melhor compreensão

poderá permitir a definição de perfis de expressão e coexpressão de proteínas que melhor

estejam associadas ao comportamento clínico destes tumores. Além disto, está também

previsto um estudo in vitro de inibição dos MCTs, sobretudo MCT1 e MCT4, em culturas

celulares de TCGs. Este estudo de inibição poderá contribuir para a identificação destas

proteínas como potenciais alvos terapêuticos em TCGs. Para complementar a identificação

46

de possíveis alvos terapêuticos, deverão também ser conduzidos ensaios de inibição dos

MCTs utilizando modelos in vivo de TCGs.

47

7 CONCLUSÕES

Os resultados encontrados no presente estudo podem contribuir para a compreensão

das alterações metabólicas presentes nos TCGs.

Primeiramente, o TMA mostrou ser um método de concordância substancial a

moderada com cortes inteiros para estudo das proteínas MCT1, MCT2, MCT4 e CD147 em

TCGs.

Os marcadores MCT1, MCT4 e CD147 apresentaram uma sobrexpressão neste tipo

tumoral e reforçaram a sua importância como potenciais marcadores prognósticos,

isoladamente ou em coexpressões, uma vez que se apresentaram associadas a

características clínico-patológicas de pior prognóstico e também a menor sobrevida global e

livre de eventos (MCT4) nos tumores testiculares.

Deste modo, reforça-se a importância dos MCTs e da CD147 como potenciais

marcadores prognósticos ou preditivos, além de possíveis alvos terapêuticos em TCGs.

48

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57

ANEXO A – Ficha de coleta de dados

TCG Informações do médico responsável

1 ID NAP (NUMERAÇÃO NO BANCO DE DADOS)

1

2 ID protocolo

Descrever; 88- Não se aplica; 99-Ignorado 2

3 Médico responsável

Descrever; 88- Não se aplica; 99-Ignorado 3 Eduado Caetano A. da

Silva

4 Celular

88- Não se aplica; 99-Ignorado 4

5 Hospital oncológico de origem

Descrever; 88- Não se aplica; 99-Ignorado 5 Hospital de Câncer

Barretos

6 e-mail

Descrever; 88- Não se aplica; 99-Ignorado 6 [email protected]

Dados pessoais

7 IARC


8 CID O


9 Nome do paciente


10 Iniciais

Descrever; 88- Não se aplica;99-Ignorado 10

11 Registro na instituição (RGH)


12 Naturalidade (Estado)


13 Data de nascimento

DD/MM/AAAA 13 ___/___/______

14 Data de diagnóstico

DD/MM/AAAA 14 ___/___/______

15 Sexo

1- Masculino; 2- Feminino 15

16 Etnia

1- Branco;2- Negro/preto; 3- Pardo/mulato; 4- Amarelo; 5- Indígena; 99- Ignorado 16

Dados clínicos - Diagnóstico

17 Data do 1º atendimento no HCB

DD/MM/AAAA 17 ___/___/______

18 Data do início do tratamento

DD/MM/AAAA 18 ___/___/______

19 Estadiamento

1- I; 2- II;3- III; 4- IV; 5- IS; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 19

20 Se ovário Protocolo 2008, classificar: (Se não for 2008, colocar 88- não se aplica)

1- a; 2- b; 3- c; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 20

21 Primário

1- Test; 2- Ovário; 3- Sacroc; 4- Med; 5- Vag; 6- Retro; 7- SNC; 8- Outro; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

21

22 Se outro primário, detalhar:

Descrever;99-Ignorado 22

23 Apresentação ao diag-micro

1- Totalmente ressec.;2- Cir. resto; 3- Cir. resto macro; 4- Biopsia; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

23

Metástase

24 Meta ao diagnóstico?

0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado 24

25 Metástase ao dx. - pulmão

0- Não; 1- Sim; 88- Não se aplica;99- Ignorado 25

26 Metástase ao dx. - hepática


27 Metástase ao dx. - óssea


28 Metástase ao dx. - SNC


29 Metástase ao dx. - ganglionar


30 Se ganglionar:

0- Não regional; 1- Regional; 3- Ambos; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 30

58

31 Metástase ao dx. - outras

Descrever;99-Ignorado 31

32 Se linfonodo regional comprometido: Tamanho do maior eixo da Massa Metastática do Linfonodo Regional

Em cm; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

32

33 N

0- NX; 1- N0; 2- N1; 3-N2;4- N3;88-Não se aplica; 99- Ignorado 33

34 M

0- M0; 1- M1a; 2- M1b; 88-Não se aplica; 99- Ignorado 34

Marcadores - SE testículo adulto: PRÉ-QT

35 Alfa feto ao diagnóstico

Em ng/mL; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 35


Valor de referência; 88- Não se aplica;99- Ignorado 36


1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizado;88- Não se aplica; 99- Ignorado 37

38 Data Alfa feto ao diagnóstico

DD/MM/AAAA 38 ___/___/______

39 BHCG ao diagnóstico

Em um/mL; 88- Não se aplica;99- Ignorado 39


Valor de referência; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 40



42 Data BHCG ao diagnóstico

DD/MM/AAAA 42 ___/___/______

43 DHL ao diagnóstico

Em UI/mL;88- Não se aplica; 99- Ignorado 43


Valor de referência; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 44



46 Data DHL ao diagnóstico

DD/MM/AAAA 46 ___/___/______

Histologia

47

Histologia 1- Seio endodérmico; 2- Coriocarcinoma; 3- CA embrionário; 4- Teratoma puro; 5- Teratoma imaturo com Grau não definido; 6- T.imat.I; 7- T. imat.II; 8- T.imat.III; 9- Terat.mist.(Quando um dos componentes do misto for teratoma); 10-Disg./seminoma/germinoma; 11- TCG Misto (Quando os componentes mistos não forem teratoma); 12- Outro(nesse caso, preencher variável197 detalhando) 88- Não se aplica; 99- Ignorado

47

48

Tipo histológico 0- Indefinido; 1- Seminoma; 2- Não seminoma; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

48

49 Número do exame na patologia

Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 49

50

Se misto, qual o Predomínio no Tumor Misto 1- Seio endodérmico; 2- Coriocarcinoma; 3- CA embrionário; 4- Teratoma puro;5- Teratoma imaturo com Grau não definido; 6- T.imat.I; 7- T. imat.II; 8- T.imat.III; 9-Disg./seminoma/germinoma; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

50

51 Tumor misto: seio endodérmico

Em %;888- Não se aplica;999- Ignorado 51

52 Tumor misto: CorioCA


59

53 Tumor misto: CA Embrionário


54 Tumor misto: Seminoma


55 Tumor misto: Teratoma Maduro


56 Tumor misto: Teratoma Imaturo I


57 Tumor misto: Teratoma Imaturo II


58 Tumor misto: Teratoma Imaturo III


Tratamento

59 Serviço que tratou:

1- Brasil; 2- Chile; 3- Uruguai; 4- Argentina; 5- Tratado pela oncologia pediátrica de Barretos; 6- Tratado pela oncologia clínica de Barretos;7-Gineco; 99- Ignorado

59

60

Protocolo do estudo: 0- TCG91; 1- TCG99; 2- TCG2008; 3- Outros; 88- Não se aplica; 99-

Ignorado

60

61 Cirurgia


62 Se sim, qual tipo de cirurgia?

1- Orquiectomia; 2- Ooforectomia; 3- Ressecção de lesão extra-gonadal; 4- Outro; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

62

63 Se outro tipo de cirurgia, definir:


64 Data da cirurgia

DD/MM/AAAA 64 ___/___/______

65 Lateralidade da gônada:

1- Direita; 2- Esquerda; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 65

66 Radioterapia


67

Se foi feita radioterapia, detalhar local: 1- Pelve; 2- Coluna; 3- Apêndices esqueléticos; 4- SNC; 5- Retroperitôneo; 6- Mediastino; 7- Outro; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

67

68 Se outro local de Rxt, detalhar:


69 Quimioterapia


70 Data do início da QT

DD/MM/AAAA 70 ___/___/______

71

Quimio(Se adulto, considerar apenas o protocolo) 0- RI (91, 99 ou 2008) - PE; 1- RI (91, 99 ou 2008) - PE+IVB; 2- (91) AR HPE; 3- (91) AR HPE+IVB; 4- (99) AR PEI 4 ciclos; 5- (99) AR PEI 6 ciclos; 6- (2008) AR PEI 5 ciclos; 7- (2008) AR PEI 3 ciclos + 3 TIPs; 8- BEP; 9- Carboplatina; 10- EP (adulto) 11- Outro 88- Não se aplica (sem Quimio); 99- Ignorado

Legenda: BR= Baixo risco; AR= Alto risco; PE= plat+etoposide + I (Ifo); HPE= High dose PE; IVB= Ifo/Velben/Bleo; TIP= Taxol/Ifo/Plat

71

72 Se outro, detalhar: Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

72

73 Número de ciclo (protocolos adulto)

Número; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 73

74

Risco 1- Baixo Risco (Brasileira); 2- Risco intermédio (Brasileira); 3- Alto risco (Brasileira); 4- Baixo Risco (IGCCCG); 5- Risco intermédio (IGCCCG); 6- Alto risco (IGCCCG); 99- Ignorado

74

Após 1º Ciclo de QT (em torno do 21º dia)

75 Alfa feto após o 1º Ciclo


60


Valor de referência 76


1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizado; 99- Ignorado 77

78 Data Alfa feto após o 1º Ciclo

DD/MM/AAAA 78 ___/___/______

79 BHCG após o 1º Ciclo

Em um/mL; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 79


Valor de referência; 99- Ignorado 80



82 Data BHCG após o 1º Ciclo

DD/MM/AAAA 82 ___/___/______

83 DHL após o 1º Ciclo

UI/mL; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 83





Reavaliação

86 Foi feita a reavaliação?


87 Resposta da reavaliação - término tratamento

0- Sem remissão; 1- Remissão completa (>75%); 2- Remissão parcial (<75%); 3- Progressão; 99- Ignorado

87

88 Data da reavaliação

DD/MM/AAAA 88 ___/___/_____

89 Doença residual pós QT 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

89

90 Ressecção doença residual (second look)


91 Data da ressecção de doença residual

DD/MM/AAAA 91 ___/___/_____

92 Achados na lesão residual

0- Câncer viável; 1- Teratoma maduro; 2- Necrose/fibrose; 3- Câncer viável + teratoma maduro; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

92

93 Quimioterapia Após Ressecção da Lesão Residual


94 Alfa feto na reavaliação






97 BHCG na reavaliação






100 DHL na reavaliação

Em UI/mL; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 100





103 Audiometria na reavaliação

1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizada; 99- Ignorado 103

104 Se audiometria na reavaliação, especificar


105 Avaliação renal

1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizada; 99- Ignorado 105

106 Se alteração na avaliação renal, especificar:


Término

107 Data do término

DD/MM/AAAA 107 ___/___/______

108 Alfa feto no término






111 BHCG no término


61





114 DHL no término


115 DHL no término


116 DHL no término


117 No término do tratamento:

1- Considerado em remissão; 2- Resposta parcial; 3- Progressão da doença; 99- Ignorado

117

118 Audiometria no término

1- Normal; 2- Alterada; 3- Não realizada; 99- Ignorado 118

119 Se audiometria no término, especificar:

Descrever;88- Não se aplica; 99- Ignorado 119

120 Avaliação renal no término


121 Se alteração na avaliação renal no término, especificar:


122 Uso de amifostina (ethyol) no término


123 Toxicidade medula óssea no término


124 Se toxicidade de medula óssea no término, quais ciclos?


125 Se toxicidade de medula óssea no término, qual nível de toxicidade?


Acompanhamento pós término de terapia

126 Recidiva/Recaída


127 Pulmão

0- Não; 1- Sim; 88- Não se aplica (se não houve recidiva) 99- Ignorado 127

128 Fígado


129 Linfonodos


130 Local primário


131 Outros


132 Se outros, detalhar:


133 Data da recidiva/ recaída

DD/MM/AAAA 133 ___/___/______

134 Alfa feto recidiva


135 Alfa feto recidiva


136

Alfa feto recidiva 1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizado; 88- Não se aplica (se não houve recidiva); 99- Ignorado

136

137 BHCG recidiva


138 BHCG recidiva


139

BHCG recidiva 1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizado; 88- Não se aplica (se não houve recidiva); 99- Ignorado

139

140 DHL recidiva


141 DHL recidiva


142 DHL recidiva

1- Normal; 2- Aumentada; 3- Não realizado; 88- Não se aplica (se não houve recidiva); 99-

142

62

Ignorado

143 Quimioterapia de resgate

0- Não; 1- TIP; 2- VeIP; 3- VIP; 4- Outro(s); 88- Não se aplca; 99- Ignorado 143

144 Se outra, detalhar:


145 Data de quimioterapia de resgate

DD/MM/AAAA 145 ___/___/______

146 Progressão

0- Não; 1- Sim;99- Ignorado 146

147 Data da progressão da doença

DD/MM/AAAA 147 ___/___/______

148 Maior ou igual a 3 linhas de quimioterapia


149

TMO? 0- Não; 1- Sim, após 1ªrecidiva; 2- Sim, na consolidação do final do 1º tratamento; 3- Sim, após a 2ª recidiva; 4- Sim, após 3ªrecidiva; 99- Ignorado

149

150 Status

1- Vivo sem doença; 2- Vivo em tratamento; 3- Óbito por câncer; 4- Óbito outras causas; 5- Morte por toxicidade

150

151 Se óbito por outras causas, detalhar:


152 Perda de seguimento


153 Data da última informação ou óbito

DD/MM/AAAA 153 ___/___/______

154 2ª opinião

0- Não; 1- Sim; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 154

Tratamento antes da inclusão no protocolo brasileiro

155 Radioterapia


156 Quimioterapia


157 Se quimioterapia, qual esquema?


158 Cirurgia


159 Biopsia


160 Data da Biopsia

DD/MM/AAAA 160 ___/___/_____

161 Abordagem cirúrgica

0- Biopsia; 1- Totalmente ressecado; 2- Resíduo microscópico; 3- Resíduo macroscópico; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

161

162 Revisão do AP


63

ANEXO B - Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

64

65

66

67

68

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Eduardo Caetano Albino da Silva ESTUDO DA EXPRESSÃO DE ... · CD147 em tumores benignos e malignos de ovário (Barretos, 2015) 24 Tabela 8 - Concordância entre expressão das proteínas