EICOSANOIDES Y ESTRÉS OXIDATIVO EN EL NEOCÓRTEX DE PACIENTES CON EPILEPSIA RESISTENTE A FÁRMACOS TRATADOS MEDIANTE CIRUGÍA DE LA EPILEPSIATESIS DOCTORAL PRESENTADA POR JORDI RUMIÀ ARBOIXPARA OPTAR AL TÍTULO DE DOCTOR POR LA UNIVERSITAT DE BARCELONA

DIRECTORES: DR. FREDERIC MÁRMOL CARRERA Y DR. ENRIC FERRER RODRÍGUEZ

EICOSANOIDES Y ESTRÉS OXIDATIVO EN EL NEOCÓRTEX DE PACIENTES CON EPILEPSIA RESISTENTE A FÁRMACOS

TRATADOS MEDIANTE CIRUGÍA DE LA EPILEPSIA

Tesis Doctoral presentada por Jordi Rumià Arboix

para optar al título de Doctor por la Universitat de Barcelona

Directores:Dr. Frederic Mármol Carrera y Dr. Enric Ferrer Rodríguez

Programa de Doctorado “Medicina i Recerca Traslacional”Departament de Cirurgia i Especialitats Mèdico-Quirúrgiques

Facultat de Medicina. Universitat de Barcelona.

Julio 2018

PROGRAMA DE DOCTORADO “MEDICINA I RECERCA TRASLACIONAL”

“AVANCES EN NEUROCIRUGÍA”

DEPARTAMENT DE CIRURGIA I ESPECIALITATS MÈDICO-QUIRÚRGIQUES

FACULTAT DE MEDICINA UNIVERSITAT DE BARCELONA

JULIO 2018

8

ÍND

ICE

ÍNDICE

ÍNDICE 8

ABREVIATURAS 10

1. INTRODUCCIÓN 13

1.1 EPILEPSIA 13 1.1.1 Definición y concepto 13

1.1.2 Epidemiología e impacto socioeconómico 13

1.1.3 Clasificación de las epilepsias y los síndromes epilépticos 14

1.1.4 Etiología de la epilepsia 15

1.1.5 Historia natural de la epilepsia 16

1.1.6 Resultados del tratamiento de la epilepsia 18

1.1.7 Epilepsia resistente a fármacos 19

1.1.8 Cirugía de la epilepsia 20

1.2 EICOSANOIDES Y NEUROINFLAMACIÓN 22

1.2.1 Biosíntesis y función de los eicosanoides 24

1.2.2 Metabolitos de las ciclooxigenasas 24

1.2.2.1 Prostaglandina E2 25

1.2.2.2 Prostaglandina I2 26

1.2.2.3 Tromboxano A2 27

1.2.3 Metabolitos de las lipooxigenasas 27

1.2.3.1 Leucotrieno B4 28

1.2.3.2 Leucotrieno C4 28

1.2.4 Metabolitos del citocromo P450 28

1.3 ESTRÉS OXIDATIVO 29

1.3.1 Especies reactivas de oxígeno (ROS) 29

1.3.2 Especies reactivas de nitrógeno (RNS) 31

1.3.3 Daño oxidativo al ADN, lípidos y proteínas 31

1.3.4 Sistemas antioxidantes 32

1.3.4.1 Superóxido dismutasa 2 32

1.3.4.2 Catalasa 32

1.3.4.3 Glutatión peroxidasa 32

1.3.4.4 Antioxidantes no enzimáticos 33

1.4 NEUROINFLAMACIÓN, ESTRÉS OXIDATIVO Y EPILEPSIA 34

1.4.1 Eicosanoides y neuroinflamación en la epilepsia 34

1.4.2 El estrés oxidativo en la epilepsia 36

2. HIPÓTESIS 42

3. OBJETIVOS 43

9

ÍND

ICE

4. MÉTODOS 44

4.1 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE NEOCÓRTEX HUMANO 44

4.2 DETERMINACIÓN DE NIVELES DE EICOSANOIDES 45

4.3 DETERMINACIÓN DE MARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO 45

4.3.1 Anión superóxido (O2−) 46

4.3.2 Superóxido dismutasa (SOD) 46

4.3.3 Catalasa 46

4.3.4 Glutatión peroxidasa (GPX) 46

4.3.5 Glutatión reductasa (GR) 46

4.3.6 Peroxidación de lípidos 46

4.3.7 Determinación de proteínas 46

4.3.8 Oxidación del ADN 47

4.4 ANÁLISIS DE LOS DATOS 47

4.4.1 Eicosanoides 47

4.4.2 Estrés oxidativo 47

5. RESULTADOS 48

5.1 ARTÍCULO 1 48

5.2 ARTÍCULO 2 54

5.3 RESUMEN DE LOS RESULTADOS 63

5.3.1 ARTÍCULO 1: Niveles de eicosanoides en el neocórtex de pacientes con epilepsia 63

5.3.2 ARTÍCULO 2: Marcadores de estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes con epilepsia 63

6. DISCUSIÓN 64

7. CONCLUSIONES 69

8. BIBLIOGRAFÍA 70

9. ANEXOS 88

9.1 ANEXO 1 88

9.2 ANEXO 2 89

9.3 ANEXO 3 90

9.4 ANEXO 4 91

9.5 ANEXO 5 104

10. RESUMEN 120

11. SUMMARY 128

12. MIND MAP 136

10 11

AB

REV

IATU

RA

S

AA: Ácido araquidónico ADN: Ácido desoxirribonucleíco AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos ARN: Ácido ribonucleico ATP: Adenosín trifosfato BER: Reparación por escisión de base del ADN CF: Crisis focales. Denominadas crisis parciales (CP) antes de la Clasificación de 2017 COX: Ciclooxigenasa CYP: Citocromo P450 EEG: Electroencefalograma EET: Ácidos epoxieicosatrienoicos FAE: Fármacos antiepilépticos GEPR: Ratas genéticamente propensas a la epilepsia GPx: Glutatión peroxidasa GR: Glutatión reductasa GSH: Glutatión sulfhidrilo, reducido GSSG: Glutatión disulfuro, oxidado H2O2: Peróxido de hidrógeno HETE: Ácido hidroxieicosatetraenoico HO·: Radical hidroxilo HPETE: Ácido hidroperoxieicosatetraenoico HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución ILAE: Liga Internacional Contra la Epilepsia KA: Ácido kaínico LCFA: Ácidos grasos de cadena larga LCR: Líquido céfalorraquídeo LOX: Lipooxigenasa LT: Leucotrieno MAPAG: Proteínas de membrana asociadas al metabolismo de eicosanoides y glutatión

ABREVIATURAS

AB

REV

IATU

RA

S MDA: Malondialdehido MERRF: Epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas rasgadas NADPH: Nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato NMDA: N-metil-D-aspartato NO·: Óxido nítrico NOS: Óxido nítrico sintetasa O2

–: Anión superóxido ONOO–: Anión peroxinitrito PG: Prostaglandina PGE2: Dinoprostona PGI2: Prostaciclina PLA2: Fosfolipasa A2 Proteína-SH: Proteína sulfhidrilo o reducida Proteína-SSG: Proteína disulfuro u oxidada PTZ: Pentilentetrazol PUFAs: Ácidos grasos poliinsaturados RE: Retículo endoplasmático RNS: Especies reactivas de nitrógeno ROH: Alcohol estable ROO·: Radicales peroxilo ROOH: Peróxido orgánico ROS: Especies reactivas de oxígeno RTAM: Resección temporal antero-medial SNC: Sistema nervioso central SOD: Superóxido dismutasa Sod2-/+: Ratones parcialmente deficientes en SOD2 SUDEP: Muerte súbita inesperada en epilepsia TBARS: Sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico TXA2: Tromboxano A2 UCP-2: Proteína desacoplante mitocondrial 2

13

INTR

OD

UC

CIÓ

N

1.1 EPILEPSIA

1.1.1 Definición y conceptoLa epilepsia es un trastorno neurológico caracterizado por una predisposición continuada a desarrollar interrupciones impredecibles y recurrentes de la función cerebral normal denominadas crisis epilépticas, así como por las consecuencias neurobiológicas, cognitivas, psicológicas y sociales de las mismas. La enfermedad no debe considerarse como una entidad individual, sino como una variedad de trastornos que son el resultado de una disfunción cerebral subyacente, la cual puede tener diferentes causas (Fisher et al., 2005).

Una crisis epiléptica se define como las manifestaciones clínicas transitorias que resultan de un episodio de actividad neuronal epiléptica. La actividad neuronal epiléptica es una disfunción específica caracterizada por una sincronización anormal, excitabilidad excesiva y/o inhibición inadecuada, y puede afectar tanto a poblaciones neuronales pequeñas como grandes. Las manifestaciones clínicas son repentinas, transitorias y generalmente breves. Incluyen fenómenos motores, psíquicos, autonómicos y sensoriales, con o sin alteración de la conciencia, y dependen del área cerebral involucrada en la descarga neuronal epiléptica y de la intensidad de dicha descarga (Shorvon, 2005).

La Liga Internacional Contra la Epilepsia (ILAE) propuso una definición clínica práctica de la epilepsia como una enfermedad cerebral que se define por cualquiera de las siguientes circunstancias (Fisher et al., 2014):

1. Al menos dos crisis no provocadas (o reflejas) con menos de 24 horas de separación.2. Una crisis no provocada (o refleja) y una probabilidad de presentar nuevas crisis durante los 10 años siguientes similar (al menos del 60 %) al riesgo general de recurrencia tras la aparición de dos crisis no provocadas.3. Diagnóstico de un síndrome de epilepsia.

Según esta definición, una crisis provocada por un factor transitorio que actúa reduciendo temporalmente el umbral de crisis no se considera diagnóstico de epilepsia. El término «crisis provocada» puede considerarse como sinónimo de «crisis reactiva» o «crisis sintomática aguda» (Beghi et al, 2010). La aparición de una crisis tras una contusión cerebral o relacionada con la presencia de fiebre o abstinencia alcohólica serían ejemplos de crisis provocadas que no se considerarían diagnóstico de epilepsia.

Conceptualmente, existe epilepsia cuando el paciente ha presentado al menos una crisis no provocada y existe un alto riesgo de que aparezca una nueva crisis (Fisher et al., 2014). Después

1. INTRODUCCIÓN

14

INTR

OD

UC

CIÓ

N

15

INTR

OD

UC

CIÓ

N

de una única crisis no provocada, el riesgo de presentar otra crisis es del 40-52 % (Berg y

Shinnar, 1991). En sujetos que han presentado dos crisis no provocadas, la probabilidad de sufrir una tercera en el plazo de 4 años aumenta hasta el 73 % (Hauser et al., 1998).

La consideración de un alto riesgo de recurrencia para el diagnóstico de la epilepsia, que refleja el segundo punto de la definición de la ILAE, pretende adaptarse a las circunstancias por las que algunos médicos y expertos tratan a sus pacientes como si presentasen epilepsia después de una única crisis no provocada (Villanueva et al., 2010; Wilden y Cohen-Gadol, 2012), ya que es posible que la primera crisis se presente en forma de estado epiléptico (Camfield y

Camfield, 2012) pero ésto, por sí solo, no implica epilepsia. Sin embargo, si lesión ha generado una predisposición continuada a la aparición de crisis no provocadas, con un riesgo comparable al de los pacientes que han presentado dos crisis no provocadas, cabe considerar el diagnóstico de epilepsia.

El riesgo de recurrencia tras haber sufrido crisis no provocadas disminuye con el tiempo, aunque no llega a alcanzar el nivel de las personas que nunca han padecido una crisis. El grupo de trabajo de la ILAE optó por definir la epilepsia como resuelta en los sujetos que presentan un síndrome epiléptico dependiente de la edad y han superado la edad correspondiente, y en los que la ausencia de crisis se ha mantenido durante los últimos 10 años sin tomar medicación antiepiléptica desde hace al menos 5 años (Fisher et al., 2014).

Por último, cabe destacar que el diagnóstico de epilepsia tiene serias consecuencias para la salud, la autonomía personal, el bienestar psicosocial y la situación económica del paciente y, por tanto, el grado de certeza a la hora de emitirlo debe ser el máximo posible (Fisher y Leppik,

2008). La definición práctica permite un diagnóstico precoz que resulta especialmente útil para prevenir los riesgos innecesarios provocados por las lesiones físicas o las consecuencias sociales resultantes de las crisis recurrentes en aquellos pacientes en los que se estime un alto riesgo de recurrencia. La nueva definición también amplía la posibilidad de aplicar intervenciones modificadoras de la enfermedad que eviten la progresión de la epilepsia y la aparición de comorbilidades (Fisher et al., 2014).

1.1.2 Epidemiología e impacto socioeconómicoLa epilepsia es una de las afecciones neurológicas no transmisibles más prevalentes, y una causa importante de discapacidad y mortalidad (Ngugi et al., 2011). En la actualidad, unos 65 millones de personas en el mundo padecen epilepsia. La proporción estimada de la población general con epilepsia activa (es decir, ataques continuos o necesidad de tratamiento) oscila entre 4 y 10 por 1000 personas. Sin embargo, algunos estudios realizados en países de menor renta “per capita” sugieren una proporción mayor, entre 7 y 14 por 1000 personas. Cerca del 80 % de los pacientes con epilepsia viven en países en desarrollo (Organización Mundial de la Salud, 2018).

En España se calcula que hay unos 400.000 pacientes con epilepsia. La incidencia anual de epilepsia es de 31 a 57/100.000 (entre 12.400 y 22.000 casos nuevos cada año), siendo esta incidencia superior en niños de entre 6 y 14 años (incidencia de 3,7/1.000 habitantes), adolescentes y ancianos (en las edades por encima de 60 años la incidencia se sitúa 134/100.000 habitantes). La incidencia acumulada de epilepsia hasta la edad de 80 años alcanza el 3 %. Aproximadamente el 5-10 % de la población experimentará una crisis a lo largo de su vida y, de éstos, hasta un 20 % tendrán crisis recurrentes (García-Ramos et al., 2011).

Los pacientes con epilepsia y sus familias sufren una gran carga de problemas médicos y sociales relacionados con las crisis recurrentes, la enfermedad neurológica subyacente, los efectos secundarios de la medicación y la estigmatización social, especialmente la forma resistente a fármacos (Més-Sesé et al., 2006).

La epilepsia es una de las patologías neurológicas que con mayor frecuencia genera ingresos hospitalarios en España (Barrero-Hernández et al., 2003; Més-Sesé et al., 2006), representando el 13,06 % de los pacientes atendidos en urgencias. El ingreso o la morbilidad de los pacientes epilépticos no sólo ocurre por la presencia de crisis epilépticas, sino también por los accidentes que se derivan de estas, en especial cuando las crisis son muy frecuentes o son tónico-clónicas generalizadas (García-Ramos et al., 2003).

En cuanto a la mortalidad, un paciente con epilepsia tiene dos o tres veces más riesgo de muerte prematura que un sujeto no epiléptico (Nei y Bagla, 2007). Las tasas de mortalidad oscilan entre un 1 a un 2 por 100.000 pacientes epilépticos en la mayoría de los países. La menor tasa de mortalidad la encontramos en las epilepsias idiopáticas, pero sigue siendo mayor que la de la población general, mientras que la mortalidad más alta se corresponde con las epilepsias sintomáticas, encontrando una tasa de mortalidad estandarizada en estos pacientes de hasta el 4,3 % (García-Ramos et al., 2011).

El aumento de la mortalidad en los pacientes epilépticos de reciente diagnóstico se relaciona en gran medida con la etiología de la epilepsia. La mayoría de las muertes en pacientes con epilepsia crónica resistente a fármacos parecen estar relacionadas con las crisis y, a menudo, ocurren por muerte súbita durante una crisis. Tambien se ha registrado una mayor tasa de accidentes de tráfico en los pacientes con epilepsia, y muchos de estos accidentes se relacionan con la presentación de crisis durante la conducción (Tomson et al., 2006).

La mayoría de los pacientes con epilepsia presentan un buen control de sus crisis gracias al tratamiento farmacológico. Sin embargo, existe un porcentaje importante, de hasta el 30% (Engel, 1996), que continúa sufriendo crisis epilépticas a pesar del tratamiento farmacológico. Las crisis no controlables con tratamiento farmacológico suponen para los pacientes una limitación grave y una calidad de vida muy mermada. En los pacientes con epilepsia resistente a fármacos el índice de mortalidad por causas ajenas a las propias crisis (muerte súbita, suicidio) y de comorbilidad psiquiátrica es más elevado que en los pacientes con epilepsia controlada (Peña et al., 2009). El 75 % del gasto sanitario generado por la epilepsia se concentra en este grupo de pacientes (Grupo de Cirugía Funcional de la Sociedad Española de

Neurocirugía, 2009).

1.1.3 Clasificación de las epilepsias y los síndromes epilépticosBajo el término “epilepsia” se agrupa un elevado número enfermedades y síndromes que cursan con crisis epilépticas. Las epilepsias pueden ser muy distintas entre sí en aspectos relevantes, como manifestaciones clínicas, evolución, sustrato, o respuesta al tratamiento. Por tanto, es necesario disponer de un sistema de clasificación. La ILAE ha llevado a cabo este trabajo de sistematización casi desde su creación en 1909, que se intensificó a comienzos de los años sesenta, cuando Henri Gastaut propuso nuevos criterios de clasificación. Durante más de 40 años, se han propuesto y revisado varios sistemas de clasificación, con un impacto notable en el tratamiento y la investigación de la epilepsia en todo el mundo (Engel, 2006).

16

INTR

OD

UC

CIÓ

N

17

INTR

OD

UC

CIÓ

N

En 2017, la ILAE publicó la actual “Clasificación de las Epilepsias” (Scheffer et al., 2017) con su correspondiente “Clasificación operativa de tipos de crisis” (Fisher et al., 2017). Se trata de una clasificación con tres niveles de diagnóstico (Figura 1):

1. Tipos de crisis, de acuerdo con la clasificación operativa actual2. Tipos de epilepsia: a. Focal b. Epilepsia generalizada c. Epilepsia combinada generalizada y focal d. Epilepsia desconocida 3. Síndromes epilépticos

Figura 1 | Marco actual para la clasificación de las epilepsias (adaptado de Scheffer et al., 2017).

Además, la nueva clasificación incorpora los factores etiológicos a lo largo los tres niveles, enfatizando en la necesidad de considerar la etiología cada paso del diagnóstico. La etiología se divide en seis subgrupos, según sus implicaciones terapéuticas. Siempre que sea posible, se debe buscar un diagnóstico en los tres niveles, así como la etiología de la epilepsia del paciente.

1.1.4 Etiología de la epilepsiaLa epilepsia es, por lo general, un trastorno multifactorial. Incluso aunque exista una etiología predominante, otros factores (genéticos y ambientales) pueden participar en el desarrollo de las manifestaciones clínicas (Bladin, 2010; Shorvon, 2011).

Las causas más frecuentes de epilepsia varían en los diferentes grupos de edad, grupos de pacientes y localizaciones geográficas (Figura 2). En términos generales, las afecciones congénitas y perinatales (factores metabólicos, la anoxia cerebral, infecciones y anomalías

del desarrollo) son las causas más comunes de epilepsia de inicio temprano en la infancia, mientras que en la vida adulta es más probable que la epilepsia se deba a causas externas no genéticas. Esta distinción no es, de ninguna forma, categórica. En las personas mayores de 40 años, los traumatismos, los tumores y los accidentes cerebrovasculares son factores de riesgo significativos. En los adolescentes, la esclerosis del hipocampo, las malformaciones vasculares y los traumatismos son los principales factores etiológicos (Bhalla et al., 2011).

Figura 2 | Distribución de las etiologías de la epilepsia por edad (adaptado de Bhalla et al., 2011).

En lo que se refiere a la distribución geográfica, la importancia de ciertos factores etiológicos individuales (accidente cerebrovascular, traumatismo perinatal, infecciones en países en desarrollo) es variable, y la presencia de cofactores (otras enfermedades o síntomas clínicos) puede dar lugar la existencia una frecuencia de epilepsia específica para cada área geográfica. Así, en ciertas partes del mundo, las infecciones endémicas, entre las que se incluyen tuberculosis, neurocisticercosis y enfermedades virales son las causas más comunes de epilepsia. Los factores e infecciones perinatales parecen ser importantes en muchos países en desarrollo (Bhalla et al., 2011).

18

INTR

OD

UC

CIÓ

N

19

INTR

OD

UC

CIÓ

N

La investigación permite identificar factores etiológicos de epilepsia poco reconocidos previamente. Así, en los últimos años, se han descrito como causa de epilepsia enfermedades autoinmunes, como la encefalitis límbica (Carreño et al., 2017), que existe una base genética de la epilepsia relacionada con la enfermedad de Alzheimer y con las malformaciones corticales, así como el descubrimiento de varios genes o mutaciones que son causa de formas de epilepsia poco frecuentes (Bhalla et al., 2011).

1.1.5 Historia natural de la epilepsiaLa evolución de la actividad de la epilepsia a lo largo del tiempo es un factor fundamental para establecre un pronóstico y seleccionar el tratamiento del paciente.

La Comisión de Epidemiología y Pronóstico de la ILAE define la epilepsia activa como aquella en la que el paciente ha sufrido al menos una crisis en los últimos 5 años, independientemente del tratamiento farmacológico (Commission on Epidemiology and Prognosis, International League

Against Epilepsy, 1993).

Los estudios en pacientes epilépticos seguidos desde la primera crisis son más valiosos para examinar la historia natural de la epilepsia tratada (Schmidt, Sillanpää, 2012).

Basado en las observaciones de distintos estudios epidemiológicos, el pronóstico de los pacientes epilépticos de nuevo diagnóstico en cuanto a la evolución de las crisis se puede categorizar en tres grupos (Kwan y Sander, 2004):

• Pronóstico excelente: En aproximadamente el 30% de los pacientes, las crisis epilépticas remiten a largo plazo tras un período variable de tiempo y nivel de actividad, incluso en ausencia de tratamiento con fármacos antiepilépticos. Cuando son tratados, estos pacientes quedan libres de crisis con la primera o segunda monoterapia y, a menudo, requieren solo dosis moderadas de antiepilépticos, las cuales pueden retirarse con éxito una vez que se produce la remisión. El principal objetivo del tratamiento farmacológico transitorio en este grupo de pacientes es suprimir las crisis hasta que se produzca la remisión espontánea, si las crisis en sí mismas pueden causar una considerable morbilidad o incluso mortalidad. Entre los síndromes de epilepsia que encajan en esta categoría, se incluyen las crisis neonatales benignas, la epilepsia rolándica benigna y las ausencias infantiles.

• Remisión solo con tratamiento: el segundo grupo está compuesto por otro 20-30% de los pacientes que quedan libres de crisis, y permanecen así con tratamiento farmacológico antiepiléptico continuo. Algunos pueden requerir más de un antiepiléptico y puede ser necesario probar varias pautas de tratamiento hasta encontrar la combinación más adecuada. Sin embargo, el proceso epiléptico subyacente no remite, y las crisis reaparecen si se retira el tratamiento. Es necesario un tratamiento farmacológico matenido para evitar la recurrencia de las crisis. Son ejemplos de este grupo la epilepsia mioclónica juvenil y buena parte de las epilepsias focales.

• Persistencia de las crisis a pesar del tratamiento: en el restante 30-40% de los pacientes, se producen las crisis recurrentes en diversos grados de intensidad y frecuencia a pesar del tratamiento con fármacos antiepilépticos. Este tipo de epilepsia denomina epilepsia refractaria o resistente a fármacos. En estos pacientes el tratamiento con fármacos antiepilépticos solo puede, en el mejor de los casos, reducir la gravedad o la frecuencia de las crisis. En esta categoría se incluyen muchas epilepsias sintomáticas o criptogénicas focales, como las asociadas con la esclerosis temporal medial, los trastornos del desarrollo

cortical, las lesiones estructurales cerebrales macroscópicas, las epilepsias mioclónicas progresivas y el síndrome de West.

1.1.6 Resultados del tratamiento de la epilepsiaEl uso de fármacos antiepilépticos (FAE) es la principal estrategia para lograr el control de las crisis en los pacientes epilépticos, ya que es el tratamiento más eficaz, reconocido y económico. Sin embargo, el tratamiento con este tipo de medicamentos se acompaña de efectos secundarios importantes (Huang et al., 2015). Además, en su gran mayoría no son fármacos dirigidos al tratamiento etiológico de la epilepsia, sino que mitigan, en mayor o menor grado, las manifestaciones clínicas y bioeléctricas de la epilepsia, y no suelen modificar el curso de la enfermedad.

Los FAE, no obstante, son claramente eficaces para controlar las crisis. En estudios poblacionales, se ha descrito que, al iniciar el tratamiento, entre el 80 y el 90 % de los pacientes obtienen una remisión de las crisis durante 1-2 años, y se logra la remisión a largo plazo en casi el 65-70% de los pacientes tratados con fármacos antiepilépticos. Sin embargo, en el 35-35% restante, el control de las crisis es menos efectivo y el tratamiento resulta más complejo. El éxito de la terapia en estos pacientes es lograr el equilibrio entre los beneficios y los efectos adversos de los FAE y poner en práctica aspectos más amplios del tratamiento de la epilepsia (Shorvon, 2005).

La ausencia de crisis a largo plazo sin la aparición de efectos adversos puede considerase el mejor resultado clínico de cualquier tratamiento de la epilepsia (Sillanpää et al., 2004; Jacoby et

al., 2007; Téllez-Zenteno et al., 2007).

Para establecer lo que constituye un período adecuado sin crisis para que un paciente se considere “libre de crisis”, se tiene en cuenta dos factores principales:

• La duración del seguimiento requerido para determinar si una intervención terapéutica ha tenido un impacto apreciable en la aparición de crisis depende de la frecuencia de las crisis previas a la intervención.

• Que la respuesta sostenida que sea clínicamente significativa. Distintos estudios con pacientes tratados médicamente (Sillanpää y Shinnar, 2005; Jacoby et al., 2007) o quirúrgicamente (Markand et al., 2000; Spencer et al., 2007) demostraron que la ausencia de crisis absoluta, generalmente considerada como de al menos 12 meses, era el único resultado relevante que se asociaba de manera consistente con una mejoría significativa en la calidad de vida de los pacientes.

En la práctica clínica existen otras dimensiones de los resultados del tratamiento de la epilepsia que son relevantes. Entre ellas, se pueden incluir factores tales como los resultados psicosociales y el nivel de satisfacción del paciente. Se ha desarrollado una amplia variedad de escalas que evalúan la calidad de vida de los pacientes y se aplican ampliamente en el campo de la investigación (Leone et al., 2005).

Desde un punto de vista centrado en el paciente, los resultados de satisfacción deben ser el elemento clave para definir el éxito o el fracaso de un tratamiento. Sin embargo, la satisfacción de los pacientes va más allá del control de las crisis, los efectos adversos o la evaluación de la calidad de vida, y puede estar influenciada por numerosas variables

20

INTR

OD

UC

CIÓ

N

21

INTR

OD

UC

CIÓ

N

internas y externas, como expectativas, la capacidad de abandonar el rol de enfermo, la obtención posterior de empleo y el éxito percibido (Wass et al., 1996; Wilson et al., 1999; Reid et

al., 2004; Chin et al., 2006).

1.1.7 Epilepsia resistente a fármacosEl Grupo de Trabajo de la Comisión de Estrategias Terapéuticas de la ILAE propuso que la epilepsia reftactraria o resistente a fármacos podía definirse como “aquella en la que se ha producido el fracaso a dos ensayos de FAE, ya sea en monoterapia o en combinación, tolerados, apropiadamente elegidos y empleados de forma adecuada para lograr la ausencia mantenida de crisis”, entendiendo por ausencia mantenida de crisis a un periodo libre de crisis de un año o superior a tres veces el intervalo entre crisis que mostraba antes de iniciar el tratamiento (Kwan et al., 2010).

La epilepsia resistente a fármacos se asocia con un incremento de la morbilidad y mortalidad, consecuencias psicosociales graves, problemas cognitivos, y una reducción de la calidad de vida (Figura 3). Además, es la responsable del 80% del gasto sanitario generado por la epilepsia (Engel, 1996).

Figura 3 | Efectos de la epilepsia resistente a fármacos en el paciente. FAE: Fármacos antiepilépticos; SUDEP (sudden unexpected death in epilepsy) (adaptado de Tang et al., 2017).

A pesar de la introducción de una gran cantidad de nuevos FAE desde la década de 1990, la mejoría en el pronóstico de las epilepsias comunes y los síndromes de epilepsia infantil ha sido pequeña, y la epilepsia resistente a fármacos continúa siendo uno de los grandes retos del tratamiento de la epilepsia (Tang et al., 2017).

Inicialmente se consideraba que la epilepsia resistente a fármacos era constitutiva o progresiva y, en consecuencia, se postuló como paradigma clínico que una respuesta temprana a la terapia antiepiléptica indicaba un pronóstico favorable (Kwan y Brodie, 2002). Sin embargo, los patrones temporales de resistencia farmacológica de la epilepsia son más complejos de lo que se suponía inicialmente, y hasta el 30 % de los pacientes con epilepsia resistente siguen un curso

fluctuante con períodos de remisión y recaída (Schmidt y Sillanpää, 2012). Asi pues, la ausencia mantenida de crisis puede ser el resultado tanto del curso de desarrollo de una epilepsia benigna, como del efecto del tratamiento con fármacos antiepilépticos (Briggs y French, 2003).

La identificación precoz de los pacientes epilépticos que se harán resistentes al tratamiento con fármacos puede ayudar directamente a establecer el tratamiento no farmacológico más adecuado para ellos (Briggs y French, 2003; Schiller y Najjar, 2008; Mohanraj y Brodie, 2013). Otros, por el contrario, han argumentado que dicha identificación puede ser difícil dado que un considerable número de pacientes puede presentar períodos alternos de remisión y recaída (Laxer et al., 2014).

Factores de cierto valor predictivo de resistencia a fármacos (Mohanraj y Brodie, 2013): • Respuesta inicial: Una mala respuesta inicial a la medicación antiepiléptica parece ser el

indicador más potente de epilepsia resistente a fármacos (Kwan y Brodie, 2000; French, 2006;

Mohanraj y Brodie, 2013). • Etiología subyacente: La epilepsia sintomática caracterizada por una anormalidad

estructural cerebral tiende a ser más resistente que la epilepsia idiopática (Briggs y French,

2003; French, 2007).• La frecuencia de crisis del paciente: una frecuencia elevada antes del inicio de los

antiepilépticos es un factor de mal pronóstico (Kwan y Brodie, 2000).

Una vez establecida la resistencia a fármacos, las estrategias de tratamiento actualmente disponibles pueden dividirse en tres categorías principales: farmacoterapia, cirugía de la epilepsia, incluyendo la neuroestimulación, y tratamientos alternativos, como la dieta cetogénica y cambios en el estilo de vida (Sisodiya, 2007).

Opciones terapeúticas en epilepsia resistente a fármacos:

• Farmacoterapia: La evidencia clínica muestra que los pacientes que no responden a dos fármacos antiepilépticos tienen solo una pequeña probabilidad (<5%) de ver controladas sus crisis con cualquier otro antiepiléptico administrado adicionalmente (Kwan et al., 2010).

• Cirugía de la epilepsia: Los pacientes con epilepsia fármaco-resistente son potenciales candidatos a cirugía de la epilepsia (Kwan y Brodie, 2006). La cirugía de la epilepsia ha demostrado ser superior al uso mantenido de los FAE en la epilepsia refractaria, con evidencia clínica respaldada por ensayos clínicos controlados y aleatorizados en epilepsia del lóbulo temporal (Wiebe et al., 2001; Perry y Duchowny, 2013). Puesto que es objeto de esta tesis, la cirugía de la epilepsia se aborda en mayor profundidad en la siguiente sección.

• Dieta cetogénica: Habitualmente en pacientes pediátricos. Aunque el mecanismo subyacente sigue siendo desconocido, la dieta cetogénica ha demostrado cierta eficacia en ciertos estudios que muestran una reducción superior al 50 % del número de crisis en aproximadamente la mitad de los pacientes (Felton y Cervenka, 2015). Sin embargo, la aplicación de la dieta cetogénica en niños resulta en la práctica un desafío, debido a las dificultades de cumplimiento y los potenciales efectos adversos a corto y largo plazo, que hacen necesario el seguimiento regular y la supervisión clínica (Vaccarezza y Silva, 2015).

• Cambios en el estilo de vida: Minimizar los factores desencadenantes puede reducir el número de crisis. Entre los factores desencadenantes más comunes, se encuentran la falta

22

INTR

OD

UC

CIÓ

N

23

INTR

OD

UC

CIÓ

N

de sueño, el ayuno, el alcohol, la nicotina, las drogas de abuso, el estrés psicológico, la tensión emocional y algunos estímulos sensoriales, como ruidos inesperados en epilepsia audiogènica o la luz parpadeante en la epilepsia fotosensible (Sisodiya, 2007).

1.1.8 Cirugía de la epilepsiaLa intervención quirúrgica óptima para el tratamiento de la epilepsia es la que suprime o desconecta la cantidad justa de tejido neural para eliminar las crisis, sin provocar déficits neurológicos añadidos. Este volumen de tejido neural es la llamada zona epileptógena (Engel, 1996).

La correcta selección de los pacientes candidatos es el factor más relevante para obtener buenos resultados con una morbilidad mínima (Elices et al., 2002). Por lo tanto, el objetivo de la evaluación prequirúrgica es: 1º) la identificación del área del cerebro cuya responsabilidad en la génesis de las crisis habituales es máxima, y 2º) demostrar de manera fehaciente que dicha zona puede ser extirpada sin causar déficits neurológicos o cognitivos inaceptables.

Aunque la primera cirugía de la epilepsia documentada se realizó en 1880 (Asadi-Pooya y

Rostami, 2017), no fue hasta finales de la década de 1930 cuando la ausencia de fármacos antiepilépticos y la introducción del electroencefalograma (EEG) marcaron el comienzo de un período de desarrollo intensivo en el tratamiento quirúrgico de la epilepsia durante las siguientes décadas (Penfield y Flanigin, 1950). Hasta hace unos 30 años, no obstante, se mantuvo restringida a pocos centros en todo el mundo, tanto por las limitaciones técnológicas como por la introducción de medicamentos antiepilépticos eficaces. El reconocimiento de la gravedad clínica y epidemiológica de la epilepsia refractaria y la aparición de la Resonancia Magnética en los años 80 supusieron el inicio de su expansión, que continúa en la actualidad. La Unidad de Epilepsia del Hospital Clínic de Barcelona es un centro de referencia reconocido para pacientes con epilepsia fármacorresistente de toda España, y viene realizando cirugía de la epilepsia interrumpidamente desde 1995, con más de 500 pacientes operados. En 2006 la actividad se amplió a pacientes pediáticos por un acuerdo con el Hospital Sant Joan de Déu de Barcelona.

En cuanto a los resultados de la cirugía de la epilepsia, los datos publicados demuestran que las crisis refractarias se controlan tras la cirugía en más de un 50% de los pacientes, con resultados aún mejores en síndromes específicos.

Existen tres síndromes epilépticos cuyo tratamiento de elección es neuroquirúrgico: la epilepsia temporal medial, las lesiones neocorticales delimitadas y las enfermedades hemisféricas difusas. Son las tres entidades clínicas de las que conocemos en buena parte tanto su fisiopatología como historia natural. Tienen en común que su pronóstico es desfavorable cuando se aplica únicamente tratamiento médico (control crisis <5%), mientras que responden al tratamiento quirúrgico de manera muy favorable (control crisis >60%).

• Epilepsia temporal medial: Es el prototipo de síndrome susceptible de tratamiento neuroquirúrgico. Tiene una presentación clínica característica y una base fisiopatológica específica: la esclerosis del hipocampo. Posiblemente es la forma más común de epilepsia al tiempo que una de las más refractarias al tratamiento médico. La cirugía ha demostrado una eficacia superior al tratamiento farmacológico en estudios controlados (Wiebe et al.,

2001). La resección temporal anteromedial (RTAM) es la técnica más empleada, también en nuestra unidad, y puede obtener el control de las crisis en un 70% de los pacientes.

• Lesiones neocorticales delimitadas: Los pacientes que padecen crisis parciales refractarias causadas por lesiones estructurales en el neocórtex, como malformaciones congénitas o tumores neurogliales, también son tributarios de tratamiento neuroquirúrgico. A pesar de ello, la evaluación y descisión quirúrgica en estos casos requiere una cautela especial, ya que algunas lesiones estructurales no son valorables desde un punto de vista clínico y otras pueden formar parte de una patología multifocal, en la cual otra lesión no detectada puede ser la verdadera causa de la epilepsia. La resección subpial de la lesión mediante técnica microquirúrgica es el tratamiento de elección en estos casos, y logra el control de las crisis en un 80% de los casos.

• Epilepsias Hemisféricas: Algunos de los síndromes epilépticos catastróficos focales o generalizados que aparecen en niños y lactantes pueden tener su origen en enfermedades confinadas en un hemisferio cerebral o parte de éste. En este grupo se incluyen la hemimegancefalia, las displasias corticales difusas, el síndrome de Sturge-Weber, los quistes porencefálicos de gran tamaño y la encefalitis de Rassmussen. La evaluación preoperatoria de estos pacientes permite en muchos casos demostrar que las anomalías epileptógenas quedan confinadas a un solo hemisferio, mientras que el contralateral mantiene su función relativamente intacta. La hemisferotomía permite la desconexión funcional completa del hemisferio, al tiempo que preserva su aporte vascular e integridad anatómica. Debido a que la hemisferotomía se practica por lo general sólo en aquellos pacientes que ya han desarrollado una hemiparesia grave con pérdida de función en la mano, estas intervenciones no suelen causar déficit motor añadido. De hecho, la función de las extremidades afectas a menudo mejora si se practica a edades tempranas. Sin cirugía estos niños suelen verse condenados a profundas minusvalías y a una institucionalización de por vida, mientras que si la intervención se lleva a cabo en el momento oportuno la probabilidad de desarrollar una vida casi normal alcanza el 60-80%.

• Una alternativa de tratamiento paliativo cuando la resección o desconexión no es posible se basa en técnicas de neuroestimulación eléctrica, como la estimulación del nervio vago, la estimulación cerebral profunda y la neuroestimulación receptiva (Laxer et al., 2014; Felton

y Cervenka, 2015).

Las complicaciones de la cirugía de la epilepsia son relativamente infrecuentes y en general son responsables de secuelas de escasa entidad. En el caso de las resecciones localizadas, menos del 5% de los pacientes presenta algún déficit neurológico postoperatorio, relacionado con un compromiso vascular involuntario u otro daño accidental sobre tejido nervioso esencial. La gran mayoría de estas alteraciones es transitoria y se resuelve en pocos meses. En algunas circunstancias, no obstante, las secuelas postquirúrgicas son inevitables, pero asumidas tanto por el paciente como por sus médicos como una contrapartida tolerable. Para ello es imprescindible ofrecer una información detallada y veraz previamente a la toma de cualquier decisión quirúrgica.

A la hora de valorar la relación coste/beneficio de la cirugía de la epilepsia, sin embargo, es esencial traducir el éxito clínico que supone la supresión de las crisis en términos de rehabilitaciòn psicosocial, eliminación de incapacidades y mejoría de la calidad de vida. Aunque la curación de las crisis en un paciente suponga un ahorro importante en cuanto a gasto sanitario directo, parte de los intervenidos puede continuar dependiendo de sus familias o de la administración pública, generando un elevado coste indirecto asociado a su invalidez.

24

INTR

OD

UC

CIÓ

N

25

INTR

OD

UC

CIÓ

N

Las probabilidades de éxito de la cirugía de la epilepsia en cuanto a limitación del daño neurológico y a la reintegración psicosocial aumentan cuanto más precozmente se practica la intervención quirúrgica dentro del curso de la enfermedad epiléptica. Este criterio es de particular trascendencia en pacientes pediátricos (Cross et al, 2018). En la práctica, sin embargo, solo un pequeño porcentaje de los candidatos quirúrgicos potenciales es remitido a las unidades de cirugía de la epilepsia (Anyanwu y Motamedi, 2018).

La cirugía de la epilepsia no es, por tanto, un tratamiento de último recurso para los pacientes con epilepsia fármacorresistente. De hecho, dada la abundante experiencia y los favorables resultados de la cirugía, ésta se postula como un tratamiento de elección en pacientes seleccionados cuyas crisis no han sido controladas con dos o tres antiepilépticos. Aproximadamente la cuarta parte de los pacientes fármacorresistentes podrían beneficiarse del tratamiento quirúrgico, lo que para España supone una estimación de unos 20.000 candidatos a cirugía de la epilepsia. (Grupo de Cirugía Funcional de la Sociedad Española de

Neurocirugía, 2009).

Por último, y no menos impotante, cabe destacar el valor de la cirugía de la epilepsia como una oportunidad insustituible para investigar los mecanismos de la epilepsia humana. Esta es la motivación básica de la presente tesis doctoral (Ver “Mapa Conceptual”, pág. 136).

1.2 EICOSANOIDES Y NEUROINFLAMACIÓN

El término eicosanoides engloba a un amplio grupo de compuestos de carácter lipídico que derivan del ácido araquidónico (AA) u otros ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs, poly unsaturated fatty acids) de 20 átomos de carbono. Actúan localmente como moléculas de señalización de gran potencia, regulando diversos procesos homeostáticos e inflamatorios (Dennis y Norris, 2015).

1.2.1 Biosíntesis y función de los eicosanoidesLos eicosanoides no se almacenan en la célula para su liberación posterior, como ocurre con otras moléculas de señalización, sino que sus precursores, el AA y otros PUFAs se encuentran esterificados con el glicerol de los fosfolípidos de la membrana celular.

La biosíntesis se activa cuando un estímulo inflamatorio (Figura 4) activa la Fosfolipasa A2 (PLA2), la cuál libera el AA y otros PUFAs de la membrana celular (Burke y Dennis, 2009). Éstos, a su vez, son transformados en eicosanoides por tres familias de enzimas: ciclooxigenasas (COX), lipooxigenasas (LOX), enzimas del citocromo P450 (CYP), y también por vías no enzimáticas (Funk, 2001).

Figura 4 | Cascada de biosínteis de eicosanoides a partir del AA. En rojo, fármacos bloqueantes su síntesis. (Adaptado de Burke y Dennis, 2009).

La cascada de eicosanoides juega un papel esencial en la iniciación, progresión y resolución de la inflamación e interacciona con otras múltiples vías de señalización (como las cascadas de citoquinas), regulando así aspectos clave de la inmunidad tales como la expansión, diferenciación, adhesión, migración y quimiotaxis de células inmunes especializadas y no especializadas (macrófagos y linfocitos, células endoteliales y fibroblastos) (Koeberle y Werz,

2018). Participan en una gran variedad de procesos inflamatorios relacionados con la artritis, la aterosclerosis, el dolor y el cáncer, así como en enfermedades neurodegenerativas, isquemia y epilepsia (Phillis et al., 2006).

Aunque los eicosanoides se asocian habitualmente a la inflamación, también desempeñan una amplia variedad de funciones homeostáticas. Las células son altamente selectivas en cuanto a los eicosanoides específicos que producen, y los niveles generados varían en función de su estado de activación y las condiciones fisiológicas del tejodo corrspondiente. La expresión de los receptores específicos para eicosanoides también depende del tipo de células y tejidos (Dennis y Norris, 2015). Los principales eicosanoides, sus receptores y sus funciones fisiológicas más características se recogen en Anexo 1.

1.2.2 Metabolitos de las ciclooxigenasas Las prostaglandinas (PG) son las moléculas de señalización derivadas de la acción de la COX y posterior actividad de la PG sintasas sobre el AA (Simmons et al., 2004).

Las COX presentan dos sitios activos diferentes, uno de ellos con actividad ciclooxigenasa y el otro con actividad peroxidasa. El sitio COX sintetiza la PGG2. El sitio peroxidasa da lugar a la PGH2, que es el sustrato de las diversas PG sintasas, y da lugar moléculas de señalización tan importantes como la PGI2 (o prostaciclina), el tromboxano A2 (TXA2), la PGE2 (o dinoprostona), la PGD2 y PGF2α (Figura 5).

26

INTR

OD

UC

CIÓ

N

27

INTR

OD

UC

CIÓ

N

Figura 5 | Vía de la ciclooxigenasa de biosíntesis de eicosanoides. Las enzimas de la ruta de la ciclooxigenasa generan prostaglandinas, tromboxanos y lipoxinas a partir del AA (adaptado de Dennis y Norris, 2015.

Las COX están codificadas por dos genes diferentes que dan lugar a las isoformas COX1 y COX2. La COX1 es constitutiva en la mayoría de los tipos celulares y participa en varios procesos homeostáticos, como el control de la acidez gástrica, el ciclo endometrial y la función renal. Por el contrario, la COX2 es inducible, su expresión está controlada por el factor de transcripción proinflamatorio NF-κB, y aumenta marcadamente en respuesta a la infección, aterosclerosis y varios tipos de cáncer (Simmons et al., 2004). Una tercera isoforma de la COX, la COX3, se ha relacionado con el efecto analgésico y antipirético de ciertos fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) como el paracetamol. La expresión de la COX3 es mayoritaria en las arterias y, especialmente, en la microvasculatura del sistema nervioso central (SNC) (Kis et al., 2004).

1.2.2.1 Prostaglandina E2

La PGE2 es probablemente la molécula de señalización mejor caracterizada dentro del grupo de los eicosanoides. La PGE2 participa en innumerables procesos biológicos y patológicos, como el parto, broncodilatación, señalización del dolor, respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, cáncer, artritis y aterosclerosis. El amplio espectro de señalización de esta prostaglandina puede atribuirse a las diferencias de expresión y función de sus cuatro receptores conocidos, los receptores EP1-4. (Park et al., 2006).

1.2.2.2 Prostaglandina I2 La PGI2 o prostaciclina fue identificada por primera vez en 1976 y es sintetizada por la prostaciclina sintasa, un miembro de la superfamilia de las monooxigenasas del citocromo P450 (Wu y Liou, 2005). La PGI2 se une al receptor IP acoplado a proteínas G (Katsuyama et al.,

1994), y es un potente vasodilatador e inhibidor de la agregación plaquetaria (Kojo et al., 2003).

1.2.2.3 Tromboxano A2

Identificado en 1975, el TXA2 es la señal fisiológica que contrarresta los efectos biológicos de la PGI2, facilitando la agregación plaquetaria y la vasodilatación. De forma similar a la PGI2, su biosíntesis es catalizada por una enzima que forma parte de la superfamilia del citocromo P450, la TXA sintasa (Hecker y Ullrich, 1989).

1.2.3 Metabolitos de las lipooxigenasasLos metabolitos de la vía 5-lipoxigenasa (5-LOX) se caracterizaron estructuralmente por primera vez en 1979 en los leucocitos, cuando se identificó el leucotrieno C4 (LTC4) como un componente de la reacción lenta de la anafilaxia (Murphy et al., 1979). Los leucotrienos (LT) comprenden una familia de moléculas de señalización sintetizadas por la actividad de la 5-LOX sobre el AA (Figura 6). Los LT son constrictores muy potentes de la musculatura lisa y desempeñan un papel fundamental en la fisiopatología del asma (Murphy y Gijón, 2007).

Figura 6 | Vía de la lipooxigenasa de biosíntesis de eicosanoides. Las enzimas de la ruta de la lipooxigenasa generan leucotrienos, HETEs y hepoxilinas a partir del AA (adaptado de Dennis y Norris, 2015).

28

INTR

OD

UC

CIÓ

N

29

INTR

OD

UC

CIÓ

N

1.2.3.1 Leucotrieno B4

El LTB4 se caracterizó como un metabolito de la 5-LOX producido por leucocitos polimorfonucleares y produce una potente activación autocrina de la quimiotaxis y la agregación leucocitaria (Ford-Hutchinson et al., 1980; Tager et al., 2000).

1.2.3.2 Leucotrieno C4

LTA4 podría conjugarse con glutatión para formar LTC4. La principal enzima responsable de la producción de LTC4 es la LTC4 sintasa, identificada como una proteína transmembrana de la superfamilia MAPAG (membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism) (Welsch et al., 1994). Otras enzimas MAPEG, mGST-2 y mGST-3, también presentan actividad de LTC4 sintasa y parecen jugar un papel en la biosíntesis del LTC4 en células epiteliales y testículos (Scoggan et al., 1997).

1.2.4 Metabolitos del citocromo P450Las enzimas del citocromo P450 (CYP) comprenden una superfamilia diversa de enzimas que juegan un papel importante en el metabolismo hepático de las toxinas, así como de señalización en la mayoría de los tejidos del organismo.

Figura 7 | Vía del citocromo P450 de biosíntesis de eicosanoides. Las enzimas de la ruta del citocromo P450 generan ácidos EET y HETEs a partir del AA (adaptado de Dennis y Norris, 2015).

En la biosíntesis de eicosanoides, las enzimas del CYP presentan actividad hidrolasa y epoxigenasa sobre el AA, que da como resultado la formación de mediadores lipídicos bioactivos denominados ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETE) y ácidos epoxieicosatrienoicos (EET), respectivamente (Hirao et al., 2005) (Figura 7).

1.3 ESTRÉS OXIDATIVO

El estrés oxidativo es la situación que aparece en un sistema biológico cuando el equilibrio entre los prooxidantes y los antioxidantes del organismo se desplaza hacia los primeros, creando un estado de potencial daño orgánico. Los prooxidantes son, por definición, radicales libres, es decir, átomos o grupos de átomos con un único electrón desapareado (Emerit et al., 2004).

Harman propuso la “teoría de los radicales libres” del proceso de envejecimiento: los radicales libres producidos durante la respiración aeróbica mitocondrial ejercen efectos nocivos sobre los componentes celulares, causando un daño acumulativo cuyo resultado es el proceso de envejecimiento (Harman, 1956; Harman 1972).

De todo el oxígeno consumido en la respiración celular sólo se reduce entre el 2 y el 5 %, lo que deja una gran cantidad de especies químicas altamente reactivas, conocidas como especies reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species), así como especies reactivas de nitrógeno (RNS, reactive nitrogen species).

Las células disponen diferentes sistemas y mecanismos antioxidantes que, en una situación normal, son capaces de contrarrestar el efecto de estos radicales libres. Sin embargo, cuando la producción de ROS y RNS predomina sobre la de antioxidantes se genera en la célula un estado de estrés oxidativo. Las vías de estrés oxidativo y nitrosativo son inducidas por las respuestas inflamatorias y los subsiguientes procesos metabólicos mitocondriales que generan radicales libres altamente reactivos (Maes et al., 2011).

La producción de radicales libres se ha asociado con el daño causado a las estructuras celulares y la patogénesis de afecciones del SNC, como la enfermedad de Parkinson, el accidente cerebrovascular, la demencia y la epilepsia (Aguiar et al., 2012). Esto resulta coherente con el hecho de que el SNC es altamente sensible al estrés oxidativo y nitrosativo debido a su alto consumo de oxígeno, a su elevado contenido lipídico y a la baja actividad de las defensas antioxidantes (Halliwell, 1996).

1.3.1 Especies reactivas de oxígeno (ROS)ROS es un concepto global que describe las especies químicas que se forman tras la reducción incompleta de oxígeno e incluye el anión superóxido (O2–), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO·). Las ROS poseen un elevado potencial de toxicidad celular por ser mucho más reactivas que el oxígeno (D’Autréaux B, Toledano MB, 2007).

El HO· es el radical libre que causa un mayor daño a las células. Es inestable, con una vida media de milisegundos y, por tanto, raramente puede obtenerse in vivo. Los radicales HO· reaccionan con las moléculas captando hidrógeno y cediéndolo a una insaturación. Los “ataques” intensos y frecuentes promovidos por este radical causan daño al ácido desoxirribonucleíco (ADN), ácido ribonucleico (ARN), proteínas, lípidos y membranas celulares del núcleo y las mitocondrias (Valko et al., 2006).

La producción de O2– ocurre principalmente dentro de la mitocondria durante la cadena de transporte electrónico cuando una pequeña cantidad de electrones escapa formando el anión. Debido a su carga electronegativa no atraviesan fácilmente las membranas celulares,

30

INTR

OD

UC

CIÓ

N

31

INTR

OD

UC

CIÓ

N

pero pueden reducir el hierro iónico y los complejos que forma con proteínas y alterar la estructura de los aminoácidos causando la pérdida de la función proteica (Valko et al., 2007). El H2O2 no es propiamente un radical libre, pero es extremadamente nocivo porque actúa de intermediario en las reacciones que producen HO·, como la reacción de Fenton (Gulumian

y van Wyk, 1987). Se estima que, en condiciones fisiológicas, la producción de H2O2 representa aproximadamente el 2 % de la captación total de oxígeno por el organismo (Valko et al., 2006). El H2O2 tiene una vida media larga y puede atravesar varias capas de lípidos y reaccionar con metales de transición y algunas hemoproteínas. También puede inducir alteraciones en el ADN (Voss et al., 2008).

Existen numerosas fuentes intracelulares de ROS (Figura 8), siendo las más importantes las siguientes (Holmström y Finkel, 2014):

• Mitocondria. En la mayoría de los tipos celulares la mitocondria parece ser, desde un punto de vista cuantitativo, el principal contribuyente la producción de oxidantes intracelulares. La mitocondria genera adenosín trifosfato (ATP) de forma dependiente de oxígeno durante la cadena respiratoria en la que el flujo de electrones culmina con la reducción del oxígeno molecular (O2) que da lugar a una molécula de agua. Durante este proceso, el O2 también puede ser reducido para generar O2–.

• NADPH oxidasas. Otra importante fuente intracelular de ROS es la familia de enzimas conocidas como NADPH oxidasas. Esta familia fue descrita por primera vez en los neutrófilos, que al ser activados por los mediadores inflamatorios producen una importante cantidad de ROS como parte de su papel esencial en la defensa del organismo. En este contexto, la principal fuente de producción de ROS es un complejo proteico que transfiere electrones desde el NADPH citosólico al O2 con la finalidad de generar O2–.

Figura 8 | Fuentes intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS). Varios orgánulos celulares pueden generar ROS, incluyendo la mitocondria, el retículo endoplasmático (RE, especialmente en un entorno de estrés de RE) y los peroxisomas (como parte de su papel en la metabolización de los ácidos grasos de cadena larga (LCFA, long-chain fatty acids)). Además, varias enzimas, incluyendo oxidasas y oxigenasas, generan ROS como parte de sus ciclos de reacción (adaptado de Holmström y Finkel, 2014).

• Otras enzimas. La mitocondria y la familia de las NADPH oxidasas son los sistemas productores de ROS mejor caracterizados, pero existe además una amplia variedad de enzimas, como la xantina oxidasa, la óxido nítrico sintasa (NOS), las COX, las LOX y el sistema enzimático del CYP, que también pueden generar ROS. De forma similar, otros orgánulos celulares además de las mitocondrias, como los peroxisomas y el retículo endoplasmático, son también una fuente de oxidantes.

1.3.2 Especies reactivas de nitrógeno (RNS)El óxido nítrico (NO·) es un abundante radical reactivo que actúa como una importante molécula de la señalización biológica en una amplia variedad de procesos fisiológicos, como la neurotransmisión, la regulación de la presión sanguínea, mecanismos de defensa, la relajación del músculo liso y la regulación del sistema inmune (Bergendi et al., 1999). El NO· es generado en los tejidos por la acción de la enzima NO sintasa a partir del aminoácido arginina (Ghafourifar y Cadenas, 2005). En el medio extracelular, el NO· reacciona con oxígeno y agua formando aniones nitrato y nitrito (Chiueh, 1999).

La producción excesiva de RNS, denominada estrés nitrosativo, ocurre cuando la generación de radicales libres de nitrógeno excede a la capacidad de la célula de neutralizarlos y eliminarlos. El estrés nitrosativo puede conducir a reacciones de nitrosilación que pueden alterar la estructura de las proteínas (Ridnour et al., 2004).

Las células del sistema inmune producen tanto O2– como NO· durante el proceso inflamatorio.

Ambos radicales pueden potenciarse entre sí para producir cantidades significativas de moléculas reactivas con una capacidad oxidativa mucho mayor, como el anión peroxinitrito (ONOO–) que es un potente agente oxidante capaz de causar fragmentación del ADN y oxidación lipídica (Carr et al., 2000).

1.3.3 Daño oxidativo al ADN, lípidos y proteínasA concentraciones elevadas, las ROS pueden ser importantes mediadores del daño a estructuras celularesy biomoléculas. El HO· reacciona con todos los componentes de la molécula de ADN, alterando tanto las bases nitrogenadas como el esqueleto de desoxirribosa (Valko et al., 2006). La modificación permanente del material genético puede causar mutagénesis y envejecimiento.

La generación de ROS también afecta a los ácidos grasos poliinsaturados que forman parte de los fosfolípidos, extremadamente sensibles a la oxidación (Valko et al., 2006). Una vez formados, los radicales peroxilo (ROO·) pueden reorganizarse mediante una reacción de ciclación en endoperóxidos, dando como producto final el malondialdehido (MDA), compuesto que ha demostrado ser mutagénico en bacterias y células de mamíferos y carcinogénico en ratas (Wang et al., 1996).

En el caso de las proteínas, las cadenas laterales de todos los aminoácidos y, en particular, los residuos de cisteína y metionina son susceptibles a la oxidación mediada por la acción de las ROS/RNS (Stadtman, 2004).

32

INTR

OD

UC

CIÓ

N

33

INTR

OD

UC

CIÓ

N

1.3.4 Sistemas antioxidantesLos efectos nocivos que producen los radicales libres al organismo inducen distintos mecanismos defensivos, que incluyen la eliminación de los radicales libres por enzimas como la catalasa, la superóxido dismutasa (SOD) y el glutatión peroxidasa (GPx), así como la acción protectora de antioxidantes no enzimáticos (Aguiar et al., 2012).

1.3.4.1 Superóxido dismutasaEl papel de la SOD es proteger a la célula de la acción del O2–, ya que cataliza la dismutación de este anión en H2O2 y O2. En humanos, se han identificado tres isoformas de la SOD: Cu/Zn-SOD citosólica (SOD1), Mn-SOD mitocondrial (SOD2) y SOD extracelular (EC-SOD o SOD3) (Miao y Clair, 2009).

La SOD 1 está presente mayoritariamente en el citoplasma y en los peroxisomas, y cataliza específicamente la dismutación del O2– de forma independiente del pH del medio (Limón-

Pacheco y Gonsebatt, 2009).

La SOD 2 es la forma mitocondrial de la SOD, y reduce el O2– generado durante la cadena de transporte electrónico mitocondrial. El contenido en Mn-SOD en el interior celular varía en función del número de mitocondrias presente en cada tipo celular (Valko et al., 2006).

La SOD-3 es secretada a la matriz extracelular (Limón-Pacheco y Gonsebatt, 2009).

De las tres isoformas de la SOD, la mitocondrial es la única que es esencial para la supervivencia de los organismos aerobios (Carlioz y Touati, 1986). Los ratones deficientes en la forma mitocondrial de la SOD presentan cardiomiopatía dilatada y neurodegeneración y mueren poco después del nacimiento (Lebovitz et al., 1996).

1.3.4.2 CatalasaLa catalasa es una enzima localizada principalmente en los peroxisomas. Cataboliza grandes cantidades de H2O2 para formar H2O y O2. También reacciona con otros peróxidos orgánicos (metanol, etanol, ácido fórmico o fenoles). La catalasa protege a las células de la generación de H2O2 en su interior (Valko et al., 2007), como parte de la respuesta adaptativa al estrés oxidativo (Usui et al., 2009).

1.3.4.3 Glutatión peroxidasaExisten en los humanos cuatro tipos diferentes de glutatión peroxidasa (GPx): una forma citosólica clásica (GPx1), una forma gastrointestinal (GPx2), una forma extracelular (GPx3) y una GPx fosfolipídica asociada a la membrana (GPx4). El sustrato de la GPx es el H2O2 y los peróxidos orgánicos (Valko et al., 2007) y sus propiedades antioxidantes se basan en la adicción de dos electrones para reducir los peróxidos. En la reacción interviene el tripéptido glutatión (GSH), que está presente en las células en una concentración elevada.

El GSH es un constituyente esencial de todas las células del organismo, actuando como un tampón redox, como un cofactor para la transducción de señales, en la defensa antioxidante y en la protección electrofílica, especialmente en el cerebro (Johnson et al., 2012).

La importancia del GSH deriva principalmente de dos factores. En primer lugar, es el nucleófilo intracelular más abundante y sirve como sustrato para muchas enzimas antioxidantes y

depuradoras de electrófilos. En segundo lugar, su inusual enlace γ-amida entre el ácido glutámico y la cisteína otorga especificidad y resistencia a la degradación peptídica. El glutatión está presente en la célula en forma reducida (GSH) y forma oxidada (GSSG). La relación entre ambas formas (GSH:GSSG) es normalmente superior a 100:1, lo que sirve como un importante sistema de tampón redox (Johnson et al., 2012). El GSH reducido sirve como sustrato para la GPx en la reacción de reducción de los peróxidos, con la consiguiente producción de GSSG oxidado, el cual se recicla nuevamente a GSH por acción de la glutatión reductasa (GR) (Figura 9).

Figura 9 | Ciclo del glutatión. Las funciones celulares requieren un equilibrio dinámico en la relación GSH/GSSG. GSH: Glutatión reducido; GSSG: Glutatión oxidado; GPx: Glutatión peroxidasa; GR: Glutatión reductasa; Proteína-SSG: Proteína disulfuro o oxidada; Proteína-SH: Proteína sulfhidrilo o reducida; ROOH: Peróxido orgánico; ROH: alcohol estable.

1.3.4.4 Antioxidantes no enzimáticosLa mayoría de las células dispone, además, de sistemas antioxidantes no enzimáticos, entre los que se incluye el propio glutatión, el ácido ascórbico (vitamina C), el α-tocoferol (vitamina E), los carotenoides y los flavonoides (Valko et al., 2006).

La vitamina C es un antioxidante hidrosoluble, lo que facilita su difusión a las matrices extra e intracelular. Su potencial antioxidante está relacionado con la eliminación directa del O2– y el HO·, y contribuye, además, a regenerar la vitamina E oxidada. Sin embargo, la vitamina C también posee actividad prooxidante (Kojo, 2004). Probablemente es el único compuesto, además del HO·, que puede convertir el Fe3+ en Fe2+, el cual reacciona con el H2O2 para formar OH. La vitamina E o α-tocoferol interfiere en la peroxidación lipídica eliminando rápidamente los radicales peroxilo e interrumpiendo la propagación de la cascada (Niki, 1987). Durante esta reacción, la vitamina E se transforma en el radical libre tocoferilo, que es menos reactivo que el radical lipídico, y se dirige a la superficie de la membrana para convertirse de nuevo en

34

INTR

OD

UC

CIÓ

N

35

INTR

OD

UC

CIÓ

N

tocoferol a través de la acción de la vitamina C. Sin embargo, a concentraciones elevadas, el radical tocoferilo puede actuar como prooxidante (Valko et al., 2006).

El β-caroteno es un precursor hidrofílico de la vitamina A y se acumula en grandes concentraciones en las membranas de ciertos tejidos. Su actividad antioxidante está relacionada con la eliminación de O2– y los radicales libres formados durante la peroxidación lipídica (Rahman et al., 2006).

Los flavonoides tienen una estructura ideal para la eliminación de radicales libres. Son antioxidantes más eficaces que las vitaminas C y E. La actividad antioxidante de los flavonoides depende de su estructura y puede estar determinada por cinco factores: su reactividad como agente donador de hidrógeno y electrones, la estabilidad del radical flavanol formado, su reactividad en comparación con otros antioxidantes, su capacidad para formar quelatos con metales y su solubilidad e interacción con membranas celulares (Valko et al., 2007).

1.4 NEUROINFLAMACIÓN, ESTRÉS OXIDATIVO Y EPILEPSIA

En la epilepsia, el daño cerebral que resulta de las crisis es un proceso dinámico que comprende múltiples factores que contribuyen a la muerte neuronal. Los factores implicados incluyen factores genéticos, excitotoxicidad inducida por la disfunción mitocondrial, niveles elevados de marcadores proinflamatorios y estrés oxidativo (Ferriero, 2005).

En la literatura científica podemos encontrar un volumen creciente de evidencias experimentales procedentes de estudios “in vitro” y en animales que demuestran el importante papel de la neuroinflamación y del estrés oxidativo en la patogenia de la epilepsia. Estos hallazgos han sido revisados por diferentes autores (Patel, 2004; Shin et al., 2011;

Vezzani et al., 2011a; Aguiar et al., 2012). Los datos disponibles en epilepsia humana, sin embargo, son mucho más escasos. Para situar la presente tesis en este contexto, hemos procedido a revisar de forma sistemática los estudios llevados a cabo en pacientes epilépticos en los que se evalúen mediadores inflamatorios y marcadores de estrés oxidativo. El procedimiento de revisión de la literatura y sus resultados completos pueden ser consultados en los Anexos 3, 4 y 5, respectivamente.

1.4.1 Eicosanoides y neuroinflamación en la epilepsiaLos eicosanoides son especialmente abundantes en las neuronas, los astrocitos, las células endoteliales de la vasculatura cerebral y el líquido céfalorraquídeo (LCR). No solo regulan los procesos de transmisión de señales y la transcripción génica resultante, sino que también inducen y mantienen la respuesta inflamatoria (Phillis et al., 2006).

En la última década, las evidencias clínicas y experimentales apoyan la hipótesis de que los procesos inflamatorios en el cerebro podrían constituir un mecanismo común y decisivo en la fisiopatología de la epilepsia humana (Vezzani et al., 2011a, 2011b). Los nuevos hallazgos experimentales sugieren que la inflamación podría ser una consecuencia y también una causa de epilepsia (Vezzani et al., 2011a). Se han detectado varios mediadores inflamatorios en el tejido cerebral extraído quirúrgicamente de pacientes con epilepsias resistentes a fármacos, incluyendo la epilepsia del lóbulo temporal y la epilepsia relacionada con la displasia cortical (Vezzani y Granata, 2005; Choi et al., 2009; Riazi et al., 2010).

La constatación de procesos inflamatorios en la epilepsia humana (Anexo 4) ha llevado al uso de modelos experimentales de roedores para identificar los factores desencadenantes de la inflamación cerebral en la epilepsia y establecer vínculos causales recíprocos entre la inflamación y las crisis epilépticas. Así, estudios experimentales han demostrado que la actividad convulsiva per se puede inducir inflamación cerebral y que las crisis recurrentes perpetúan la inflamación crónica (Vezzani et al., 2000; Samland et al., 2003; Balosso et al., 2005). La pérdida de células asociada a las crisis puede contribuir a la inflamación, pero no es un requisito previo para que ocurra la inflamación. Además, los modelos de infecciones sistémicas o del SNC sugieren que una inflamación cerebral preexistente aumenta la predisposición a las crisis, lo que se relaciona con alteraciones en la excitabilidad neuronal (Kelley et al., 1999; De Sarro et al., 2004).

Se ha demostrado, además, un papel destacado de las células gliales en los mecanismos de inicio y recurrencia de las crisis epilépticas (Vezzani et al., 2013). En particular, algunas lesiones cerebrales o circunstancias proconvulsivas pueden activar la microglía y los astrocitos para liberar una serie de mediadores proinflamatorios, iniciando así una cascada de procesos inflamatorios en el tejido cerebral, perturbando así la comunicación glio-neuronal. En modelos experimentales, estos cambios contribuyen a disminuir el umbral de las crisis y pueden afectar la supervivencia neuronal (Riazi et al., 2010). Asimismo, el examen neuropatológico de muestras de cirugía de epilepsia ha evidenciado la existencia de un fenómeno inflamatorio complejo y sostenido. En pacientes con epilepsia temporal medial, además de la astrogliosis, que es una de las principales características histopatológicas de la esclerosis del hipocampo, se ha detectado una notable activación de las células de la línea microglia/macrófagos en el propio hipocampo (Aronica y Gorter, 2007; Ravizza et al., 2008).

Desde 1970 se conocen evidencias bioquímicas de que una de las principales dianas de los cambios inducidos por las crisis epilépticas es la membrana celular de las neuronas. Con las crisis, aparecen niveles aumentados de diacilgliceroles y PUFAs, que son productos de la degradación de los fosfolípidos (Bazan, 1971). La producción de PGs a partir del AA también se activa después de las convulsiones (Bazan et al., 1986). Las crisis activan la PLA2 citosólica (Visioli et al., 1994) e inducen su expresión, así como la de la COX2 (Kajiwara et al., 1996; Marcheselli y Bazan, 1996). Como consecuencia, el AA se acumula y conduce a la formación de PGs (Bazan et al., 1986; Birkle y Bazan, 1987) que juegan un importante papel en el desarrollo de inflamación local.

Distintos estudios han encontrado que la expresión de la COX2 en el cerebro de ratas era estimulada por las crisis inducidas por el ácido kaínico (KA) (Chen et al., 1995; Tocco et al., 1997). La excitotoxicidad del glutamato en cultivos primarios de neuronas cortico-hipocampales de rata también se ha asociado a una mayor expresión de la COX2 (Tocco et al., 1997). Además, se ha demostrado que la inducción de la COX2, pero no de la expresión del gen COX1, precede a la aparición de apoptosis en la capa de células granulares del giro dentado (Ho et al., 1998)

y puede contribuir a los mecanismos que conducen a la apoptosis celular en el hipocampo.Las crisis espontáneas en jerbos se han relacionado con aumentos en las concentraciones de PGD2 en la corteza cerebral, el hipocampo y el cuerpo estriado y con la presencia en el córtex de una sustancia similar al LTC4 (Leifke et al., 1994). La presencia de actividad PGF2α inmunorreactiva y de LT se ha detectado en el cerebro de jerbos que sufren crisis espontáneas (Simmet et al., 1988). Asimismo, PG y ácidos HETE aparecían en el cerebro de ratas tras las convulsiones inducidas por bicuculina, antagonista gabaérgico (Birkle y Bazan, 1987),

36

INTR

OD

UC

CIÓ

N

37

INTR

OD

UC

CIÓ

N

lo que indicaba la estimulación de la actividad de la COX y de la LOX. La administración de dexametasona, un inhibidor de la PLA2, atenuaba el efecto inductor de la bicuculina en la acumulación de ácidos grasos libres de manera dependiente de la dosis (Bazan et al., 1986).

En otro modelo experimental, el ratón E1 susceptible a la epilepsia genética, la expresión de COX-2 en el hipocampo estaba regulada positivamente después de las crisis epilépticas, y la indometacina, un inhibidor de la COX, reducía la duración desde el inicio de la crisis hasta la recuperación completa (Okada et al., 2001). En el mismo sentido, en un modelo de rata de estimulación de la COX2, codificada en un gen de respuesta temprana, esta enzima aumentaba de forma dependiente de la actividad sináptica, con una inducción evidente inicialmente en las neuronas del hipocampo y extendiéndose posteriormente a las neuronas corticales, que, además, era atenuada por la nimesulida, un inhibidor selectivo de la COX2 (Tu y Bazan, 2003). Por tanto, la inducción del gen neuronal COX2 y la activación de la PLA2 parecen ser eventos clave de señalización en la epileptogénesis.

Takemiya y colaboradores examinaron los efectos de la COX2 en el desarrollo de “kindling” rápido en ratones knock-out para la COX2 y ratones tratados con nimesulida (Takemiya et

al., 2003). La estimulación de las neuronas del hipocampo de los ratones control aumentaba marcadamente los niveles cerebrales de ARN mensajero de la COX2, junto con un incremento significativo de los niveles de la PGE2. Además, la deficiencia de COX2 disminuía significativamente la incidencia de convulsiones, lo que sugiere que la inducción de la COX2 podría facilitar las crisis recurrentes en el hipocampo. En un enfoque inverso, Kelley y colaboradores desarrollaron un modelo de ratón transgénico con sobreexpresión neuronal de la COX2 humana que potenciaba la intensidad y letalidad de la excitotoxicidad del KA, demostrando así una relación causa-efecto entre la expresión neuronal de la COX2 y la excitotoxicidad (Kelley et al., 1999).

El rofecoxib, un inhibidor de la COX-2, redujo significativamente la muerte celular inducida por el KA en el hipocampo de ratas (Kunz y Oliw, 2001a). El cerecoxib, otro inhibidor de la COX-2, fue eficaz para reducir las crisis inducidas por electrochoque en ratas (Shafiq et al.,

2003). Sin embargo, la nimesulida agravaba las crisis inducidas por el KA en ratas (Kunz y Oliw,

2001b). Esto, junto con datos previos que indicaban que la indometacina potencia la acción neurotóxica del KA (Baran et al., 1994), hace suponer que la reducción en un cierto tipo de PG potencia la acción del KA en el desarrollo de crisis. De manera similar, ni la aspirina, un inhibidor de la COX, ni el NS-398, un inhibidor de la COX2, por sí mismos protegían contra la neurotoxicidad inducida por el KA (Kim et al., 2000). Por el contrario, los signos tóxicos, el estrés oxidativo (peroxidación lipídica y oxidación de proteínas), la alteración del equilibrio del glutatión y la pérdida de neuronas del hipocampo inducidos por el KA eran atenuados de manera dependiente de la dosis por la fenidona, un inhibidor doble de las vías COX y LOX, el NS-398 más esculetina (inhibidor de la LOX) o la aspirina más esculetina (Wie et

al., 1999). Por lo tanto, es posible que sean necesarias tanto la ruta COX como la LOX para desencadenar el síndrome del KA.

1.4.2 El estrés oxidativo en la epilepsiaEl cerebro es particularmente sensible al estrés oxidativo debido a que utiliza una elevada cantidad de O2 en comparación con otros tejidos del organismo. Además, presenta una alta concentración en PUFAs muy susceptibles a la peroxidación lipídica, es rico en hierro, que cataliza la formación de radicales HO·, y tiene una baja actividad catalasa. El estrés oxidativo

contribuye a la alteración de la función y daño celular que puede causar la muerte celular a través de la oxidación de macromoléculas como proteínas, lípidos y nucleótidos (Shin et al., 2011).

El mantenimiento de niveles bajos de ROS es crítico para la función neuronal normal y, por tanto, aumentos prolongados de la producción de ROS conllevan un riesgo inherente de incrementar la neurodegeneración, como la que se observa en la epilepsia (Shin et al.,

2011). Así, el estrés oxidativo ha sido implicado en la patogénesis de una serie de trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (Emerit et al., 2004). Sin embargo, el papel del estrés oxidativo en las epilepsias se ha reconocido más recientemente (Anexo 5).

La existencia de un exceso de producción de radicales libres y la consecuente muerte neuronal durante la actividad epiléptica ha sido bien establecida in vitro (Frantseva et al., 2000). Los estudios en modelos animales se han centrado en dilucidar si una actividad convulsiva prolongada da como resultado una mayor producción de ROS y si la lesión oxidativa contribuye al daño cerebral inducido por crisis epilépticas. Las son un modelo de epilepsia tónica-clónica generalizada utilizado para estudiar los mecanismos básicos de la epilepsia humana, y presentan crisis en respuesta a la estimulación acústica (Dailey et al., 1989). Shin y colaboradores demostraron que en GEPR que presentan crisis severas (GEPR-9) el desarrollo del hipocampo está acompañado de estrés oxidativo. Las GEPR-9 presentan una reducida actividad enzimática de GPx, una menor relación GSH/GSSG y un incremento de la peroxidación lipídica y de la oxidación de proteínas, lo que sugiere que el aumento del estrés oxidativo en este modelo puede atribuirse a su falta de respuesta a la reducción de la GPx, junto con la alteración del equilibrio del glutatión (Shin et al., 2008b).

Por su parte, el modelo de crisis inducidas por el ácido kaínico (KA) es especialmente útil en el estudio de la evolución, propagación y consecuencias patológicas de la descarga epiléptica en el sistema límbico. La activación de los receptores de glutamato ionotrópicos del subtipo KA da como resultado una actividad epiléptica sostenida en el hipocampo, seguida de un patrón selectivo de neuropatología que es similar a la epilepsia del lóbulo temporal humana (Ben-Ari, 1985). El KA aumenta la producción de ROS, la disfunción mitocondrial y la apoptosis en las neuronas de muchas regiones del cerebro, particularmente en las regiones CA1 y CA3 del hipocampo y en el giro dentado. Así, se ha descrito una elevación de la oxidación de proteínas y la peroxidación lipídica en el hipocampo de ratas a tiempos cortos (4 y 24 horas) tras el tratamiento con KA (Kim et al., 1997). En otro estudio, Tang y colaboradores sugerían que la 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdG), un marcador oxidativo de daño al ADN puede estar aumentado en el hipocampo y la corteza cerebral a las 8 horas después del tratamiento con KA (Tang et al., 1998).

Los mecanismos moleculares exactos de muerte neuronal inducida por crisis epilépticas siguen siendo desconocidos, aunque el modelo de crisis inducidas por el KA ha proporcionado evidencias importantes (Patel, 2004):

a. El estrés oxidativo inducido por la producción mitocondrial de radicales superóxido desempeña un papel relevante en la excitotoxicidad resultante de las crisis inducidas por el KA.

b. Las ROS derivadas de radicales superóxido, como los radicales HO·, pueden oxidar las proteínas mitocondriales, el ADN y los lípidos, lo que causa daño celular.

38

INTR

OD

UC

CIÓ

N

39

INTR

OD

UC

CIÓ

N

c. El aumento en la producción de O2– y el daño oxidativo al ADN son indicios de daño mitocondrial y oxidativo inducido por el KA.

d. La exposición al KA puede aumentar significativamente la producción de malondialdehído (MDA) y 4-hidroxi-alquenales, lo que sugiere un aumento de la peroxidación lipídica.

e. La administración sistémica de KA también causaba una mayor disminución de los niveles GSH en el hipocampo de ratas GEPR-9 en comparación con ratas control (Shin et al., 2008b).

f. La administración intravenosa de GSH evitaba la pérdida neuronal inducida por el KA en el hipocampo y el posterior desarrollo de edema. Por tanto, el glutatión reducido puede proteger a las células neuronales contra la neurotoxicidad del KA a través de un mecanismo asociado a la eliminación de ROS.

La proteína desacoplante mitocondrial 2 (UCP-2) se expresa en regiones específicas del cerebro y es la única de los tres tipos de proteínas desacoplantes que se expresa en muchas regiones del SNC (Richard et al., 1998). La UCP-2, al estabilizar el potencial de membrana mitocondrial, puede ayudar a reducir el riesgo de muerte celular. Así, la activación de UCP-2 puede proteger a las neuronas en procesos degenerativos asociados al estrés oxidativo mitocondrial y cambios en el potencial transmembrana, como los que ocurren durante las crisis epilépticas inducidas por el KA (Shin et al., 2008a).

Otro modelo experimental ampliamente utilizado el estudio de la patogénesis de la epilepsia consiste en la administración a roedores de altas dosis de pilocarpina. Aunque se desconoce el mecanismo el mecanismo exacto por el cual la pilocarpina induce crisis neurotóxicas, se piensa que está basado en el aumento patológico del daño neuronal en respuesta a un exceso de producción de ROS. La peroxidación lipídica y la formación de nitritos en el hipocampo, el cuerpo estriado y la corteza frontal se incrementan durante las crisis inducidas por pilocarpina, lo que sugiere un posible daño neuronal (Freitas et al.,

2004). Se ha sugerido que los factores más importantes que contribuyen a las crisis inducidas por pilocarpina son la concentración de GSH, la peroxidación de lípidos y el contenido de nitrito. Mostraron que el daño neuronal en el hipocampo resultaba de una disminución de la concentración de GSH y un aumento de la peroxidación lipídica y el contenido en nitrito. Asimismo, la actividad de la catalasa en el hipocampo estaba incrementada, mientras que la actividad SOD permanecía inalterada, lo que sugiere una implicación de esta falta de respuesta de la actividad antioxidante de la SOD ante el aumento de ROS en los mecanismos que promueven la iniciación y/o la propagación de las crisis inducidas por pilocarpina (Freitas et al., 2005). Además, datos más recientes han demostrado la participación del estrés oxidativo mitocondrial en el daño al ADN que puede ocurrir en las diferentes etapas de la epileptogénesis desencadenada por la pilocarpina o el KA (Waldbaum et al., 2010).

El fármaco pentilentetrazol (PTZ) es un inhibidor selectivo del canal de cloruro del receptor GABA-A muy utilizado para inducir crisis epilépticas en modelos animales. Tras las crisis inducidas por PTZ, se apreciaban disminuciones significativas en los niveles de GSH, GSSG, cisteína y proteínas con grupos tiol, así como incrementos en los niveles de proteínas con grupos carbonílicos y disulfuro, en la corteza cerebral de ratones (Patsoukis et al., 2004). Además, otros estudios mostraban que la administración de PTZ resultaba en un aumento de los niveles cerebrales de ácidos grasos libres y una disminución de la actividad enzimática GPx y SOD en áreas específicas del cerebro (Eraković et al., 2003), así como en una marcada elevación del NO en la corteza cerebral (Bashkatova et al., 2003).

El modelo knockout para la forma mitocondrial de la SOD, la Mn-SOD o SOD2, también puso de manifiesto la conexión entre el estrés oxidativo y la epilepsia. Los ratones parcialmente deficientes en SOD2 (Sod2-/+) son particularmente útiles porque proporcionan un modelo de elevación crónica subletal de O2

– mitocondrial en el que comprobar esta hipótesis. Mientras que los ratones Sod2-/- muestran una extensa disfunción mitocondrial, ataxia y crisis epilépticas antes de la muerte neonatal, los ratones Sod2-/+ son bioquímica y fenotípicamente normales al nacer, pero desarrollan crisis espontáneas e inducidas relacionadas con la edad que se correlacionan con un incremento del estrés oxidativo mitocondrial y de la disfunción mitocondrial (Williams et al., 1998; Kokoszka et al., 2001). Antes de la aparición de crisis relacionadas con la edad, los ratones Sod2-/+ mostraban una mayor susceptibilidad a las crisis inducidas por el KA y una pérdida de células del hipocampo (Liang y Patel, 2004).

La participación de la disfunción mitocondrial y de los mecanismos de estrés oxidativo mitocondrial en el desarrollo de las crisis epilépticas permanece sin conocerse por completo. Dado que el cerebro es rico en mitocondrias, que son la principal fuente de O2– formado durante la respiración, es plausible que las crisis prolongadas generen suficiente producción de O2

– para vencer a las defensas antioxidantes mitocondriales endógenas a través de una cascada de eventos iniciados por un aumento de descargas neuronales, liberación excesiva de glutamato, activación del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), entrada de calcio al citosol y a la mitocondria y un mayor consumo de ATP (Shin et al., 2011). En este sentido, las crisis inducidas por el KA inactivaban selectivamente la aconitasa mitocondrial, que es un marcador de la producción de O2

–, en el hipocampo de las ratas, y que la inactivación máxima de la enzima ocurría en el área vulnerable CA3 del hipocampo, en ocasiones, precediendo a la muerte neuronal manifiesta. (Liang et al., 2000). Esta inactivación mitocondrial inducida por el KA y la pérdida neuronal del hipocampo estaban atenuadas en ratones transgénicos que sobreexpresan la Mn-SOD, lo que sugiere un papel del anión O2

– mitocondrial en daño neuronal del hipocampo causado por en crisis inducidas experimentalmente (Waldbaum y Patel, 2010).

Waldbaum y colaboradores investigaron si las lesiones agudas inducidas por la formación de ROS podían contribuir al desarrollo de la epilepsia crónica. Se plantearon si las alteraciones mitocondriales y celulares tenían lugar durante el período de latencia entre la lesión cerebral inicial y la aparición de crisis espontáneas recurrentes, induciendo la progresión a la epilepsia crónica. Encontraron un aumento adaptativo de la reparación del ADN mitocondrial inmediatamente después del aumento de las ROS inducido por las crisis agudas. Sin embargo, el aumento crónico de la producción de ROS se acompañaba de un fallo en la inducción de la reparación del ADN mitocondrial. Además, a pesar de que la producción mitocondrial de H2O2 volvía a niveles normales durante el período de latencia, las mediciones de índices de estrés oxidativo más sensibles sugerían su presencia, especialmente en el compartimento mitocondrial, durante el período de latencia (Waldbaum et al., 2010).

Por otro lado, la disfunción mitocondrial originada por mutaciones del ADN mitocondrial ha demostrado ser la causa de ciertos tipos de epilepsia huamana. Uno de ellos es el síndrome de epilepsia mioclónica asociada a fibras rojas rasgadas (MERRF, myoclonic epilepsy with ragged red fibers) que es una enfermedad mitocondrial hereditaria que cursa con epilepsia mioclónica progresiva, degeneración neuronal con atrofia cerebral y cerebelar y presencia de fibras rojas rasgadas en la biopsia del músculo. (Wallace et al., 1988). Una posibilidad es que la generación de radicales libres mitocondriales y la disfunción resultante puedan contribuir a

40

INTR

OD

UC

CIÓ

N

41

INTR

OD

UC

CIÓ

N

las crisis epilépticas asociadas a enfermedades mitocondriales. La creciente evidencia sugiere que alteraciones en los complejos de la fosforilación oxidativa mitocondrial pueden resultar en una mayor producción de O2

–. Además, la activación sináptica del receptor NMDA, que conduce a un aumento de la producción de O2

–, es un factor necesario para la generación de crisis epilépticas. Así, la sobreproducción de mitocondrial de O2

– resultaba en actividad convulsiva en ratones Sod2-/-, y la gravedad de las crisis de ratones Sod2

-/+ se correlacionaba con la inactivación de la aconitasa mitocondrial durante el avance de la edad (Liang y Patel,

2004).

Dado que la fosforilación oxidativa mitocondrial es la principal fuente de ATP para las neuronas y la mitocondria tiene un papel en la homeostasis del calcio intracelular, su disfunción puede afectar notablemente a la excitabilidad neuronal y a la transmisión sináptica (Patel, 2004). Por lo tanto, la disminución de los niveles intracelulares de ATP y los cambios en la homeostasis del calcio neuronal pueden ser factores que contribuyan a una mayor susceptibilidad a las crisis epilépticas asociadas a la disfunción mitocondrial. Estos cambios ejercen una importante influencia en la excitabilidad neuronal y la transmisión sináptica, que parecen ser muy relevante para la generación de las crisis (Kudin et al., 2009).

La implicación del estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial ha sido también estudiada en la epilepsia del lóbulo temporal humana, que es la más importante de las epilepsias adquiridas y frecuentemente cursa con una lesión cerebral inicial (un episodio prolongado de crisis o estatus epiléptico, crisis febriles complicadas en niños, hipoxia o traumatismo), que tras un período de latencia conduce a epilepsia crónica o crisis espontáneas recurrentes (Rowley y Patel, 2013). Un importante hallazgo que sugiere la participación de las mitocondrias en este tipo de epilepsia es la presencia de cambios metabólicos y bioenergéticos tras las crisis agudas y durante varias fases de la epilepsia crónica. Las tasas glucolíticas, el flujo sanguíneo y actividad cerebral y la proporción lactato/piruvato se incrementan de forma aguda durante la actividad convulsiva (Kawai et al., 2006). Este aumento del metabolismo ictal en los focos epilépticos humanos es seguido por un hipometabolismo inter-ictal, que puede reflejar un “circuito metabólicamente estresado” debido al agotamiento de la capacidad bioenergética mitocondrial, sugerido en base a la pérdida de N-acetil aspartato mitocondrial en el tejido epiléptico humano (Vielhaber et al, 2008).

La pérdida neuronal en la formación del hipocampo o en la esclerosis del hipocampo es un hallazgo patológico distintivo de la epilepsia del lóbulo temporal y se cree que es importante en el desarrollo y progresión de la enfermedad. La vulnerabilidad de las neuronas principales del hipocampo se debe en gran parte a la participación de esta estructura cerebral en el circuito convulsivo y al exceso de neurotransmisión glutamatérgica que conduce a la muerte celular por excitotoxicidad. Los hallazgos neuropatológicos en la epilepsia del lóbulo temporal proporcionan una evidencia de la existencia de cambios morfológicos y funcionales en las mitocondrias de los pacientes epilépticos. Por ejemplo, el daño neuronal provocado por la isquemia y los eventos relacionados con las crisis causa inflamación e interrupción mitocondrial (Meldrum, 1993), así como la activación de las proteínas de la maquinaria apoptótica (Henshall et al., 2000; Kilany et al., 2012). Otro estudio muestra una disminución en el número de copias de ADN mitocondrial y una reducción de la actividad de la aconitasa mitocondrial en el área CA3 del hipocampo (Baron et al., 2007). Además, la actividad oxidante de las ROS se ha implicado en la muerte celular apoptótica inducida por crisis epilépticas en el hipocampo (Chuang et al., 2009). El estado redox, medido por la relación GSH/GSSG,

cambia a un estado más oxidado en ciertas regiones del cerebro y en el plasma de pacientes epilépticos (Mueller et al., 2001). Otros estudios han encontrado incrementos en la actividad de la catalasa, de la SOD y de marcadores de peroxidación lipídica, mientas que la actividad de la GPx estaba disminuida, en pacientes con epilepsia del lóbulo temporal (Turkdogan et al.,

2002; López et al., 2007; Yiş et al., 2009). Sudha y colaboradores describieron una disminución de la actividad de la glutatión reductasa (GR) eritrocitaria y un incremento de la peroxidación lipídica y del porcentaje de hemólisis. Además, las concentraciones plasmáticas de la vitamina C y la vitamina A eran menores en los pacientes epilépticos que en los controles (Sudha et al.,

2001). Por el contrario, Verrotti y colaboradores no encontraron cambios en las actividades catalasa, SOD, GPx y GR (Verrotti et al., 2002).

Un estudio particularmente interesante es el que investigaba el impacto de la cirugía de la epilepsia en los niveles plasmáticos de marcadores de estrés oxidativo de pacientes con epilepsia del lóbulo temporal resistente a fármacos (López et al., 2007). Antes de la cirugía, encontraron que las actividades catalasa y SOD y marcadores de peroxidación lipídica estaban incrementados, mientras que había una disminución de la actividad de la GPx. Tras la cirugía los pacientes mostraban una tendencia a la normalización de estos marcadores de estrés oxidativo, excepto de la actividad SOD. Además, existía una correlación positiva entre la duración de la enfermedad y los niveles de productos avanzados de oxidación proteica, sugiriendo la presencia de daño oxidativo a las proteínas en las etapas iniciales de la enfermedad (López et al., 2007). A pesar de los hallazgos en pacientes epilépticos, el papel del daño oxidativo en la epilepsia del lóbulo temporal todavía no ha sido claramente establecido.

Por todo lo anterior, es posible afirmar que los datos disponibles hasta el momento que relacionan el estrés oxidativo y la epilepsia son diversos y la mayor dificultad continúa siendo poder determinar si el daño oxidativo es causa o consecuencia de la epileptogénesis y la generación de crisis. Algunos autores proponen un modelo que relaciona las alteraciones agudas con el desarrollo de epilepsia crónica (Waldbaum y Patel, 2010), mientras que otros interpretan que la epilepsia es un proceso dinámico en el que las crisis conducen a la muerte neuronal, lo cual, a su vez, promueve la epileptogénesis, siendo el riesgo de nuevas crisis es cada vez mayor (Costello y Delanty, 2004).

42 43

HIPÓ

TESIS

2. HIPÓTESIS

I. En el neocórtex de los seres humanos con epilepsia establecida se producen fenómenos neuroinflamación mediados por eicosanoides.

II. En el neocórtex de los seres humanos con epilepsia establecida se genera un estado de estrés oxidativo.

III. La intensidad de ambas alteraciones es proporcional a la gravedad de la epilepsia del paciente.

IV. La neuroinflamación y el estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes epilépticos son equivalentes a los descubiertos en los modelos experimentales de epilepsia.

V. Los modelos experimentales de epilepsia, pese a sus características (duración limitada, cerebro no humano) son válidos, y proporcionan una información relevante sobre la neuroinflamación y el estrés oxidativo en neocórtex humano expuesto de manera crónica a crisis epilépticas.

OB

JETI

VO

S

3. OBJETIVOS

Aunque existen pruebas experimentales muy sólidas de la presencia de neuroinflamación y de estrés oxidativo cerebral en modelos experimentales de epilepsia, estos hallazgos no se han verificado de manera tan inequívoca en el cerebro epiléptico humano.

El propósito principal del presente estudio es determinar y comparar la presencia de neuroinflamación y estrés oxidativo en el neocórtex de humanos con y sin epilepsia, para confirmar ambos fenómenos en la fisiopatología de la epilepsia humana y sugerir así nuevas estrategias terapéuticas.

i. Neuroinflamación, a través de la determinación de niveles cerebrales de eicosanoides, incluyendo prostanoides (TXA2, la PGE2 y la PGI2) y leucotrienos (LTB4 y LTC4).

ii. Estrés oxidativo, cuantificando sus marcadores principales: especies reactivas de

oxígeno (O2-), actividad de enzimas antioxidantes (SOD, catalasa, GPx, GR) y marcadores

de daño a biomoléculas (peroxidación de lípidos, oxidación de proteínas y oxidación de ácidos nucleicos).

iii. Identificar una posible correlación entre la intensidad de la alteración de los

parámetros citados y la gravedad de la epilepsia del paciente. iv. Comparar los hallazgos en muestras de neocórtex humano epiléptico con los obtenidos

por los modelos exprimentales de epilepsia, para contribuir a su validación mútua, y a la investigación traslacional en epilepsia.

44 45

MÉT

OD

OSM

ÉTOD

OS

4. MÉTODOS

4.1 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE NEOCÓRTEX HUMANO

Los especímenes quirúrgicos de neocórtex se obtendrán de veinte (n = 20) pacientes con epilepsia focal resistente a tratamiento farmacológico operados consecutivamente. La selección de los pacientes candidatos a cirugía de la epilepsia, así como la determinación de la zona epileptógena, se establecerá según los resultados del protocolo de evaluación multidisciplinaria de la Unidad de Epilepsia del Hospital Clínic de la Universitat de Barcelona (Elices et al., 2002). Se registrarán los parámetros más relevantes de la epilepsia de cada paciente, en especial la frecuencia media de las crisis antes de la cirugía.

El procedimiento neuroquirúrgico consistirá en la extirpación microquirúrgica de la zona epileptógena con el objetivo de controlar las crisis epilépticas. La zona extirpada siempre comprenderá neocórtex, y en el caso de la epilepsia del lóbulo temporal, también estructuras alocorticales, es decir, hipocampo y parahipocampo (Wiebe et al., 2001). Con el fin de matener una uniformidad entre las muestras, todas ellas procederán de tejido neocortical.

Figura 10 | Resección Temporal Antero Medial (RTAM): Extirpación neocortical* y del hipocampo# en epilepsia temporal medial refractaria a fármacos.

La resección temporal ántero-medial (RTAM) será la técnica quirúrgica más empleada, tanto por su seguridad como por sus buenos resultados en el control de las crisis para el tratamiento quirúrgico de la epilepsia temporal medial (Spencer et al., 1984). La resección en bloque estándar incluye unos 3,5 cm de tejido del neocórtex temporal anterior y de 1 a 3 cm de las estructuras mediales (Figura 10). La porción principal del tejido resecado se remitirá para estudio por Anatomía Patológica. De esta porción principal, apartaremos una muestra neocortical de aproximadamente 1 cm3, que se congelará en el quirófano inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido, y quedará almacenada a −80º C en el laboratorio.

El Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona ha autorizado este estudio (Anexo 2). Todos los pacientes deberán otorgar su consentimiento informado, y la privacidad se mantendrá mediante la codificación anónima en el cifrado de las muestras.

Se aplicarán los mismos criterios a los especímenes de control, muestras de corteza cerebral humana no epiléptica (n = 11), que serán proporcionadas por el Banco de Tejidos Neurológicos del Instituto de Neuropatología del Hospital Universitario de Bellvitge. Dichas muestras procederán de donantes cuya causa de fallecimiento no podrá estar relacionada con enfermedades o lesiones cerebrales. En el momento de la necropsia, uno de los hemisferios cerebrales se fijará en formaldehído al 10% durante un mínimode tres semanas. El otro hemisferio cerebral será cortado en secciones coronales de 1 cm, congelado en hielo seco y almacenado a −80º C en el laboratorio. Las muestras de control para el presente estudio se tomarán del neocórtex temporal del hemisferio procesado por congelación, para evitar en lo posible diferencias de procesado con los especímenes provenientes de pacientes con epilepsia.

4.2 DETERMINACIÓN DE NIVELES DE EICOSANOIDES

Para la medición de los niveles de eicosanoides en el neocórtex de pacientes y controles, homogeneizaremos (Fisher Scientific) aproximadamente un gramo de neocórtex con 6 ml de tampón fosfato pH = 7,4 + EDTA (0,1 mm), manteniendo la muestra a 4º C. Los homogeneizados se centrifugarán a 800 x g durante 10 min a 4º C. A su vez, el sobrenadante obtenido se centrifugará a 10,000 x g por 60 min a 4º C.

De este sobrenadante, emplearemos 50 μl para el ensayo proteico. El el volumen principal del sobrenadante se repartirá en alícuotas, volúmenes iguales de 250 μl, de composición y características idénticas. Todas las alícuotas se almacenarán a -80º C. Una de las alícuotas preparadas se descongelará para la determinación de los niveles de PGE2, TXB2 (metabolito de TXA2), 6-Keto-PGFα (metabolito de la PGI2), Ltb4 y LTC4 utilizando el kit de inmunoensayo enzimático apropiado (Cayman Chemical).

4.3 DETERMINACIÓN DE MARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO

Las muestras de corteza cerebral se descongelarán, homogenizarán y centrifugarán según el procedimiento descrito en el punto anterior. Las alícuotas de 250 μl quedarán almacenadas a -80º C hasta la realización del correspondiente ensayo.

46 47

MÉTO

DO

S MÉT

OD

OS

4.3.1 Anión superóxido (O2−)

El homogeneizado de corteza cerebral se incubará en solución de Tyrode durante 30 min. a 37º C con borboteo continuo de aire y a continuación lo introduciremos en una cubeta de luminescencia que contiene Tyrode y lucigenina (5 μM) y se colocará en un luminómetro (Bio-Orbit 1251) a 37º C. Los resultados se expresarán como unidades de luminescencia/mg proteína.

4.3.2 Superóxido dismutasa (SOD)Para la determinación de su actividad enzimática emplearemos un método espectrofotométrico basado en la auto-oxidación de la quercitina inducida por el O2

−, a un pH de 10 y en presencia de TMEDA (N,N,N,N-tetrametilendiamina) y EDTA (ácido diamino-tretracético).

4.3.3 CatalasaMediremos la actividad peroxidásica -supresora de H2O2 en grandes cantidades- de la catalasa mediante el seguimiento de la desaparición de H2O2 en la muestra con espectrofotometría. El método se basa en la reacción del enzima con metanol en presencia de concentraciones óptimas de peróxido de hidrógeno. El formaldehído generado se valora espectrofotometricamente con 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4 triazol (Purpald) como cromógeno. El Purpald reacciona con los aldehídos los cuales al oxidarlo pasa de incoloro a color púrpura (240nm).

4.3.4 Glutation peroxidasa (GPx)La GPx es la enzima responsable de la eliminación de bajas concentraciones de H2O2. Para evitar la interferencia de la catalasa en la muestra, determinaremos la actividad de la GPx por via indirecta mediante una reacción acoplada con la glutation reductasa (GR). El glutation oxidado (GSSG) producido por la GPx como consecuencia de la reducción de un hidroperóxido orgánico (hidroperóxido del tert-butilo) es reciclado a su estado reducido por la GR y NADPH. La oxidación de la NADPH a NADP se acompaña de un descenso en absorbancia a una longitud de onda de 340 nm que es directamente proporcional a la actividad GPx de la muestra.

4.3.5 Glutation reductasa (GR)La Gr es el enzima responsable de la regeneración de la glutation peroxidasa. Su actividad la valoraremos determinando la oxidación de la NADPH. La oxidación de la NADPH a NADP se acompaña de un descenso en absorbancia a una longitud de onda de 340nm, lo que nos permite calcular su actividad.

4.3.6 Peroxidación de lípidosEl malondialdehído (MDA) es uno de los principales productos de la peroxidación de los lípidos causada por el estrés oxidativo, y por tanto un buen marcador de la intensidad de dicha reacción. Mediremos los niveles de MDA a través de su reacción con el ácido tiobarbitúrico, cuyo producto es un complejo de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) que absorbe la luz de 532 nm de longitud de onda.

4.3.7 Determinación de proteínasLa cuantificación de proteínas en la muestra se llevará a cabo por el método del folín fenol, empleando como referencia albúmina sérica.

4.3.8 Oxidación del ADN La cuantificación de la base modificada 8-oxo-dG en el ADN genómico a partir de tejido se realizará extrayendo primero el ADN genómico purificado que se digerirá con enzimas (ARNsa, ADNsa, Nucleasa P1, Fosfatasa alcalina) para obtener los nucleósidos libres. Seguidamente se pasará por un HPLC con las condiciones cromatográficas de 1 ml/min de flujo. Fase móvil: tampón fosfato potásico 50 mM pH 5,1 y Acetonitrilo al 5%. Se realizará la cromatografía en una columna Waters Spherisorb 5 µm ODS2 4.6 x 250 mm y se cuantificará haciendo una relación entre la base modificada y la no modificada.

4.4 ANÁLISIS DE LOS DATOS

4.4.1. EicosanoidesPara determinar las posibles diferencias con significación estadística entre los niveles de eicosanoides entre las muestras procedentes de los pacientes con epilepsia y los controles emplearemos la prueba t de Student. Los resultados se expresarán como la media ± Error Estándar de la Media.

Dentro el grupo de pacientes epilépticos, intentaremos analizar una posible correlación (Pearson) entre los niveles de eicosanoides y la frecuencia de crisis focales antes de la cirugía. Para ello, estratificaremos dicha fecuencia en tres grupos: alta (≥60 crisis/mes), moderada (11—30 crisis/mes) y baja (≤10 crisis/mes).

4.4.2 Estrés oxidativoEn primer lugar, se llevará a cabo el análisis descriptivo de las muestras, seguido de un análisis de varianza (multivariante) mediante un contraste “a priori” de tipo simple. Se define un contraste como la diferencia entre el valor medio de la variable dependiente (datos farmacológicos) y su valor medio correspondiente en el grupo control. Los resultados se expresarán como tal diferencia, más su intervalo de confianza del 95%. Las diferencias de P ≤ 0,05 serán consideradas como significativas. Asimismo, se buscarán posibles correlaciones entre las variables independientes (datos clínicos) y también entre las diferentes variables dependientes e independientes. Los resultados se expresarán como media ± error estándar. El análisis estadístico se realizará mediante el programa SPSS 15.0.

4948

AR

TÍC

ULO

1R

ESULTA

DO

S

5. RESULTADOS

5.1 ARTÍCULO 1

Título EICOSANOID LEVELS IN THE NEOCORTEX OF DRUG-RESISTANT EPILEPTIC PATIENTS SUBMITTED TO EPILEPSY SURGERY

AutoresJordi Rumià, Frederic Marmol, Juan Sanchez, Mar Carreño, Núria Bargalló, Teresa Boget, Luis Pintor, Xavier Setoain, Eva Bailles, Antonio Donaire, Enric Ferrer, Pere Puig-Parellada.

Rumià, J., Marmol, F., Sanchez, J., Carreño, M., Bargalló, N., Boget, T., Pintor, L., Setoain, X., Bailles, E., Donaire, A., Ferrer, E., Puig-Parellada, P. (2012) Eicosanoid levels in the neocortex of drug-resistant epileptic patients submitted to epilepsy surgery. Epilepsy Res. 99, 127—131.Factor de Impacto: 2,491 (2017)

Cuartil Segundo (Neurology Q2)

Citado porDominiak A, Wilkaniec A, Wroczyński P, Adamczyk A. (2016) Selenium in the Therapy of Neurological Diseases. Where is it Going? Curr Neuropharmacol. 14(3):282–99.

Contribución del Doctorando Diseño del estudio, selección de candidatos quirúrgicos, intervención neuroquirúrgica (neurocirujano principal en todas las operaciones), obtención y manipulación inicial de muestras de neocórtex de los pacientes epilépticos. Como asistente en procesado de muestras y en los ensayos de determinación de eicosanoides. Participación en el análisis estadístico e interpretación de los resultados. Elaboración del manuscrito y de sus sucesivas revisiones.

Epilepsy Research (2012) 99, 127—131

journa l homepage: www.e lsev ier .com/ locate /ep i lepsyres

Eicosanoid levels in the neocortex of drug-resistantepileptic patients submitted to epilepsy surgery

Jordi Rumiàa,∗, Frederic Marmolb, Juan Sanchezb, Mar Carrenoc,Núria Bargallóc, Teresa Bogetc, Luis Pintorc, Xavier Setoainc, Eva Baillesc,Antonio Donairec, Enric Ferrera, Pere Puig-Parelladab

a Department of Neurosurgery, Hospital Clínic of the University of Barcelona, 08036 Barcelona, Spainb Pharmacology Unit, University of Barcelona School of Medicine, 08036 Barcelona, Spainc Epilepsy Unit, Hospital Clínic of the University of Barcelona, 08036 Barcelona, Spain

Received 26 July 2011; received in revised form 26 October 2011; accepted 30 October 2011Available online 21 November 2011

KEYWORDSSeizures;Drug-resistantepilepsy;Epilepsy surgery;Neocortex;Cyclooxygenase;Lipoxygenase

Summary There is an increasing body of evidence implicating eicosanoids (arachidonic acidmetabolites) in the experimental generation of epileptic seizures and the development ofepilepsy. Our purpose was to measure the synthesis of eicosanoids from the cyclooxygenaseand lipoxygenase pathways in human brain neocortex tissue samples obtained from epilep-tic patients, and to compare them with non-epileptic control subjects. Epileptic neocortexspecimens demonstrated a significant increase (P < 0.001) in the levels of three eicosanoidsderived from the cyclooxygenase pathway: Prostaglandin E2 (PGE2), Thromboxane A2 (TXA2),and Prostacyclin (PGI2), compared to controls. In the epileptic samples the level of TXA2 wastwice as much the levels of PGI2, while in the control samples the levels of PGI2 were slightlyhigher than TXA2. Conversely, there were no detectable levels of eicosanoids derived from thelipoxygenase pathway: Leukotriene B4 (LTB4) and Leukotriene C4 (LTC4). The lack of leukotrienessynthesis illustrates that COX pathway is dominant in neocortex of epileptic patients. Our humandata are consistent with the results obtained in experimental animal models of epilepsy. Theimportant increase in PGE2 and TXA2 suggests that selective inhibition of prostanoid synthe-sis or blockage of prostanoid receptors might provide novel antiepileptic strategies in humanepilepsy.© 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

∗ Corresponding author at: Hospital Clínic de Barcelona, Servei deNeurocirurgia, Villarroel 170, 08036 Barcelona, Spain.Tel.: +34 932275514; fax: +34 932275514.

E-mail address: jrumia@clinic.ub.es (J. Rumià).

Introduction

Arachidonic acid is released from membrane phospholipidsduring seizures (Phillis et al., 2006) and is implicatedin epilepsy. Seizures activate cytosolic phospholipase A2

(PLA2) (Bazan et al., 1986; Sandhya et al., 1998; Farooquiet al., 2001) an enzyme that catalyzes a receptor-mediated

0920-1211/$ — see front matter © 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.doi:10.1016/j.eplepsyres.2011.10.034

50 51

AR

TÍC

ULO

1A

RTÍC

ULO

1

128 J. Rumià et al.

Table 1 Clinical data corresponding to the operated drug-resistant epileptic patients in this study (CPS = complex partialseizures).

Patientnumber

Site of resection Sex Age at surgery(years)

Age at seizureonset (years)

Duration ofepilepsy (years)

Frequency ofCPS/month

1 Right temporal M 59 39 20 52 Right temporal F 35 6 29 203 Left temporal M 33 6 27 604 Right parietal M 34 22 12 305 Right temporal M 61 37 24 36 Right temporal M 30 20 10 47 Right temporal M 47 38 9 78 Right temporal M 44 28 16 49 Right temporal F 36 5 31 8

10 Right temporal M 24 13 11 9011 Right temporal F 34 11 23 2012 Right temporal M 41 33 7 313 Left temporal M 36 12 24 214 Right temporal F 34 16 24 215 Right temporal F 35 12 23 716 Right temporal M 32 2 30 3017 Right temporal F 48 26 22 218 Left temporal M 29 5 24 719 Left temporal M 36 7 29 1020 Left temporal M 39 6 33 10

hydrolysis of arachidonic acid from membrane phospho-lipids. The conversion of arachidonic acid to endoperoxidesis catalyzed by COX enzymes, endoperoxides are furthermetabolized to physiologically active protaglandins, PGI2and TXA2. COX, which is the rate limiting enzyme inprostaglandin synthesis, exists in two isoenzymes, one con-stitutive, COX-1, and the other inducible, COX-2 (Sandhyaet al., 1998). COX-2 is expressed in discrete populations ofneurons and is abundant in the cortex and hippocampus,structures that demonstrate a prominent role in the onsetand propagation of seizures. During an epileptic seizure,there is an induction of COX-2 isoenzyme initially only in thehippocampus neurons which spreads to neocortical neurons(Kulkarni and Dhir, 2009).

COX-2 is induced rapidly in several cell types in responseto various stimuli, as cytokines, and pro-inflammatorymolecules, and also by substances like kainic acid orpentylenetetrazol (PTX) that induce seizures in laboratoryanimals (Chen et al., 1995; Kunz and Oliw, 2001; Ciceri et al.,2002; Kawaguchi et al., 2005; Takemiya et al., 2003, 2006).Similar results have been obtained in patients suffering drug-resistant epilepsy with hippocampal sclerosis (Desjardinset al., 2003). Conversely, no changes in COX-1 expressionwere found (Ciceri et al., 2002).

PGE2 is the major prostaglandin produced, both centrallyand in the periphery, in models of acute and chronic inflam-mation (Ciceri et al., 2002). The principal prostaglandinformed by cerebral blood vessels and capillaries is PGI2,which relaxes basilar artery strips and is a potent vasodilatorof the cerebral vascular bed. By far, the most potent con-tractor of cerebral vessels is TXA2 released from plateletsaggregation or from other activated blood cells; TXA2 for-mation in human brain is detectable in inflammatory andautoimmune reactions (Wolfe, 1982).

The lipoxygenase pathway converts arachidonic acid toleukotrienes by the activation of the 5-lipoxygenase enzyme(5-LOX), which gives rise to the biosynthesis of LTA4, LTB4,and the cysteinyl leukotrienes (LTC4 to LTF4). LTB4 is a pow-erful chemotactic and chemokinetic agent, LTC4 and D4

increase vascular permeability; these mediators contributeto inflammation (Simmet and Peskar, 1990).

Glutamate is the primary excitatory neurotransmitterof mammalian brain. Abnormalities in the glutamate sys-tem have been implicated in experimental and humanepilepsy. Prostaglandins and leukotrienes modulate gluta-mate receptors in the hippocampus. Under pathological sit-uations the interactions among glutamate, prostaglandins,leukotrienes, and thromboxane, may promote neuronalinjury that depends on the magnitude of COX-2 and 5-LOXexpression, enhancing excitotoxicity (Phillis et al., 2006). Animportant consequence of COX-2 activation is the generationof reactive oxygen species with potentially damaging effectson lipids, proteins, and DNA which means an increase in braintissue oxidative stress. The reactive oxygen species are gen-erated, at the endoperoxide level, during the synthesis ofCOX metabolites.

In this study, our main purpose was to determinethe production of eicosanoids either from the cyclooxy-genase and lipoxygenase pathways in neocortex samplesobtained from drug-resistant epileptic patients submittedto neurosurgery for controlling their seizures, comparingthem with the levels found in non-epileptic neocor-tex samples. The results are contrasted with the onesobtained by experimental animal models of epilepsy. Similarresults in both settings might validate the pharmaco-logical model for the study of antiepileptic drugs, andalso can give support to new therapeutic strategies inepilepsy.

Eicosanoid levels in the neocortex of drug-resistant epileptic patients 129

Figure 1 Levels of PGE2, TXA2 and PGI2 in neocortex samples from drug-resistant epileptic patients submitted to neurosurgery.The results are expressed as pg/mg protein. Number of patients = 20. Number of controls = 11. Each value represents mean ± SEM.***P < 0.001 versus control group.

Methods

Subjects

Surgical specimens were obtained from twenty (n = 20) epilepticpatients with focal epilepsy, all of them suffering from drug-resistant complex partial seizures (CPS) (Table 1). The epilepticarea was localized as revealed by physical, neuropsychological andpsychiatric examination, Magnetic Resonance Imaging (MRI), SinglePhoton Emission Computed Tomography (SPECT), Positron EmissionTomography (PET), and long-term video monitoring. The epilepticarea was removed surgically to achieve seizure control. The mainportion of the resected tissue was submitted for pathological eval-uation. A neocortical sample of approximately 1 cm3 was separatedfrom it and immediately frozen by immersion in liquid nitrogen inthe operating room, and stored at −80 ◦C in the laboratory.

Ethical permission for this study was granted by the Ethics Com-mittee of the Hospital Clínic, University of Barcelona. All patientsgave their informed consent, and the privacy was guaranteedby anonymous cipher coding of the samples. The same criteriawere applied to the control, non-epileptic cortex samples (n = 11)which were provided by the Neurological Bank of Tissues of theNeuropathology Institute, Bellvitge University Hospital (Bellvitge,Barcelona, Spain), from donors whose cause of death was unrelatedto brain disease or injury. All control specimens were obtained fromtemporal lobe neocortex.

Eicosanoids assay

Approximately 1 g of cortex was homogenized (Fisher Scientific)with 6 ml of phosphate buffer pH = 7.4 + EDTA (0.1 mM) maintainingthe sample at 4 ◦C. The homogenate were centrifuged at 800 × gfor 10 min at 4 ◦C. The obtained supernatant was centrifuged at10,000 × g for 60 min at 4 ◦C. 50 �l of the supernatant were used forthe protein assay. With the remaining supernatant aliquots of 250 �lwere prepared. All the aliquots were stored at −80 ◦C. One of theprepared aliquots were defrosted and measured the levels of PGE2,TXB2 metabolite of TXA2, 6-keto-PGF1� metabolite of PGI2, LTB4and LTC4 using the appropriate enzyme immunoassay kit (CaymanChemical).

Data analysis

Statistical significance of differences between the epileptic andcontrol groups was determined by unpaired t-test. The results areexpressed as mean ± Standard Error of the Mean (SEM). The corre-lation (Pearson) between levels of eicosanoids and CPS frequencyhas also been analysed. We stratified CPS frequencies in threegroups: high (≥60 CPS/month), moderate (11—30 CPS/month) andlow (≤10 CPS/month). The number of patients included in eachgroup was 2, 6, and 12 respectively (Table 1). Differences of P < 0.05were considered significant. The statistical analysis was carried outusing the InStat© 3.0 program.

Results

The three metabolites of the COX pathway assayed, PGE2,TXA2 and PGI2, displayed a noteworthy increase in neo-cortical samples from epileptic patients when comparedwith the control group samples. For the three metabolitesthe statistical significance was P < 0.001 (Fig. 1). A 3.8, 9.7and 4.3-fold increase was obtained in relation to the con-trol group for PGE2, TXA2 and PGI2 respectively. The ratiobetween TXA2 and PGI2 is considered a more significantdata than the independent values themselves. In epilep-tic neocortex the levels of TXA2 found were 2 times higherthan the levels of PGI2. In contrast, the control group dis-played levels of TXA2 slightly lower than PGI2 (Fig. 2).In the lipoxygenase pathway, the results obtained forLTB4 and LTC4 were undetectable with our methodologicalapproach.

The results obtained from the correlation analysisshowed a positive and significant correlation between thelevels of the two eicosanoids: TXA2 (r = 0.9970 and P ≤ 0.05)and PGI2 (r = 0.9970 and P ≤ 0.05), and CPS frequencies. Incontrast, no correlation was found between PGE2 levels andCPS frequencies.

52 53

AR

TÍCU

LO 1 A

RTÍ

CU

LO 1

130 J. Rumià et al.

Figure 2 TXA2/PGI2 ratio in neocortex samples from drug-resistant epileptic patients submitted to neurosurgery. Numberof patients = 20. Number of controls = 11. Each value representsmean ± SEM. ***P < 0.001 versus control group.

Discussion

Our results show a significant increase in the arachidonicacid metabolites of the cyclooxygenase pathway, PGE2, TXA2

and PGI2 in the neocortical samples from epileptic patients,

when compared with the results obtained in the samplesfrom non-epileptic subjects (control group). The observedincrease of eicosanoids in epileptic patients is in accordancewith the data that implicates seizures in the liberation ofarachidonic acid (Bazan et al., 1986; Baran et al., 1987;Sandhya et al., 1998; Farooqui et al., 2001; Kulkarni andDhir, 2009) and in the activation of COX-2 (Chen et al., 1995;Kunz and Oliw, 2001; Ciceri et al., 2002; Kawaguchi et al.,2005; Takemiya et al., 2003, 2006). Our finding of a positivecorrelation between CPS frequencies and the increase in thelevels of two eicosanoids (TXA2 and PGI2) gives further sup-port to these findings in humans. In the control group thelevels of arachidonic acid metabolites obtained where verylow, which is consequence of the absence of seizures or anyother brain injury. In rats using liquid chromatography—massspectrometry it has been demonstrated the implication ofkainic acid treatment in the levels of eicosanoids (Yoshikawaet al., 2006). Our results also show there is no activationof the lipoxygenase pathway (LTB4 and LTC4). This resultagrees with those obtained by other authors in kainic acidand PTZ induced seizures in rats. A small increase in LTC4

was observed in gerbils (Simmet et al., 1987; Simmet andPeskar, 1990; Simmet and Tippler, 1991; Yoshikawa et al.,2006). The lack of leukotrienes synthesis illustrates that COXpathway is dominant in neocortex of epileptic patients.

Seizures induced by kainic acid, increases the levels ofPGE2 in the hippocampus and neocortical neurons. Thereis experimental evidence that PGE2, one of the majorprostaglandins synthesized in the mammalian brain, facil-itates convulsions and neuronal death (Naffah-Mazzacorattiet al., 1995; Baik et al., 1999; Ciceri et al., 2002; Kawaguchiet al., 2005; Phillis et al., 2006). COX-2 inhibitors such ascelecoxib, refecoxib, decrease the levels of PGE2 and signif-icantly reduce epilepsy-related neuronal death, microglialactivation, inhibit the neurogenesis and the astrogliosis inthe hippocampus and cortical neurons (Kunz and Oliw, 2001;

Ciceri et al., 2002; Jung et al., 2006; Dhir et al., 2006a,b;Zhang et al., 2008; Kulkarni and Dhir, 2009). A comparableinhibitory response can be obtained by glutamate receptorantagonists (Phillis et al., 2006; Kulkarni and Dhir, 2009).

Administration of PGE2 is another approach to confirmthe role of this eicosanoid in epilepsy. PGE2 combined withsubconvulsant doses of PTZ was found to produce seizures.Anti-PGE2 antibodies attenuate the PTZ induced seizures,and the anticonvulsant action of celecoxib was reversed byintracerebroventricular (icv) administration of PGE2. Theseresults give support to a facilitating role of the COX-2/PGE2

pathway in the seizures induced by PTZ (Chen et al., 2002;Oliveira et al., 2008; Kulkarni and Dhir, 2009).

Transgenic animals overexpressing human COX-2 at neu-ronal levels display a clear increase in the intensity andlethality of the kainic acid induced excitotoxicity (Kelleyet al., 1999). Consistently, COX-2 knockout mice show dis-played prevention of PGE2 increase and neuronal deathinduced by kainic acid (Takemiya et al., 2006).

The administration of convulsant doses of PTZ inducedan increase in TXA2 in the mouse brain tissue, being theonset of TXA2 increase coincident with the appearance ofclonic seizures (Steinhauer et al., 1979). The treatmentwith TXA2 synthesis inhibitors that selectively decreaseTXA2 production in brain, however, had no effect on tonicseizure threshold (McGinley et al., 1985). In relation toPGI2, in a model of induced convulsions be electroshock,the icv administration of PGI2 blocks the incidence oftonic convulsions in mice and protects the animals fromdeath induced by the convulsions (Rosenkranz and Killam,1978).

Although we found an increase in the levels of PGI2 inepileptic neocortex, our data also show that there is twicemore TXA2 than PGI2 in the neocortical samples obtainedfrom epileptic patients. The predominance of TXA2 has beenrelated to vasoconstriction and platelet aggregating activitythat may contribute to neuronal damage.

In summary, the present study demonstrates a signif-icant increase in the levels of three eicosanoids derivedfrom the cyclooxygenase pathway (PGE2, TXA2, and PGI2)in cortex samples obtained from drug-resistant epilep-tic patients submitted to neurosurgery. In contrast, nodetectable levels were found in the eicosanoids derivedfrom the lipoxygenase pathway (LTB4 and LTC4) suggestingthat the COX pathway is dominant in the neocortex of epilep-tic patients. Our data also validate the results obtained inanimal epilepsy models, supporting an extrapolation fromexperimental results to clinical application. The importantincrease in COX metabolites, PGE2 and TXA2 in epilepticpatients, gives support to the relevance of an inflammatoryprocess in epilepsy, and suggests that selective inhibitionof prostanoid synthesis or blockage of prostanoid recep-tors might provide novel antiepileptic strategies for humanepilepsy.

Acknowledgment

We thank Professor Isidre Ferrer, Director of the Banc deTeixits Neurològics, Institut de Neuropatologia de l’HospitalUniversitari de Bellvitge, for providing the control speci-mens.

Eicosanoid levels in the neocortex of drug-resistant epileptic patients 131

References

Baik, E.J., Kim, E.J., Lee, S.H., Moon, C.H., 1999. Cyclooxygenase-2 selective inhibitors aggravate kainic acid induced seizureand neuronal cell death in the hippocampus. Brain Res. 843,118—129.

Baran, H., Heldt, R., Hertting, G., 1987. Increased prostaglandinformation in rat brain following systemic application of kainicacid. Brain Res. 404, 107—112.

Bazan, N.G., Birkle, D.L., Tang, W., Reddy, T.S., 1986. The accumu-lation of free arachidonic acid, diacylglycerols, prostaglandins,and lipoxygenase reaction products in the brain during experi-mental epilepsy. Adv. Neurol. 44, 879—902.

Chen, C., Magee, J.C., Bazan, N.G., 2002. Cyclooxygenase-2 reg-ulates prostaglandin E2 signaling in hippocampal long-termsynaptic plasticity. J. Neurophysiol. 87, 2851—2857.

Chen, J., Marsh, T., Zhang, J.S., Graham, S.H., 1995. Expressionof cyclo-oxygenase 2 in rat brain following kainate treatment.Neuroreport 26, 245—248.

Ciceri, P., Zhang, Y., Shaffer, A.F., Leahy, K.M., Woerner, M.B.,Smith, W.G., Seibert, K., Isakson, P.C., 2002. Pharmacology ofcelecoxib in rat brain after kainate administration. J. Pharma-col. Exp. Ther. 302, 846—852.

Desjardins, P., Sauvageau, A., Bouthiller, A., Navarro, D.,Hazell, A.S., Christopher, R., Butterworth, R.F., 2003. Induc-tion of astrocytic cyclooxygenase-2 in epileptic patients withhippocampal sclerosis. Neurochem. Int. 42, 299—303.

Dhir, A., Naidu, P.S., Kulkarni, S.K., 2006a. Effect of rofe-coxib, a cyclo-oxygenase-2 inhibitor, on various biochemicalparameters of brain associated with pentylenetetrazol-inducedchemical kindling in mice. Fundam. Clin. Pharmacol. 20,255—261.

Dhir, A., Naidu, P.S., Kulkarni, S.K., 2006b. Effect of cyclooxygenaseinhibitors on pentylenetetrazol (PTZ)-induced convulsions: pos-sible mechanism of action. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.Psychiatry 30, 1478—1485.

Farooqui, A.A., Yi Ong, W., Lu, X.R., Halliwell, B., Horrocks, L.A.,2001. Neurochemical consequences of kainate-induced toxicityin brain: involvement of arachidonic acid release and preventionof toxicity by phospholipase A(2) inhibitors. Brain Res. Brain Res.Rev. 38, 61—78.

Jung, K.H., Chu, K., Lee, S.T., Kim, J., Sinn, D.I., Kim, J.M.,Park, D.K., Lee, J.J., Kim, S.U., Kim, M., Lee, S.K., Roh,J.K., 2006. Cyclooxygenase-2 inhibitor, celecoxib, inhibits thealtered hippocampal neurogenesis with attenuation of sponta-neous recurrent seizures following pilocarpine-induced statusepilepticus. Neurobiol. Dis. 23, 237—246.

Kawaguchi, K., Hickey, R.W., Rose, M.E., Zhu, L., Chen, J.,Graham, S.H., 2005. Cyclooxygenase-2 expression is inducedin rat brain after kainate-induced seizures and promotesneuronal death in CA3 hippocampus. Brain Res. 1050,130—137.

Kelley, K.A., Ho, L., Winger, D., Freire-Moar, J., Borelli, C.B., Aisen,P.S., Pasinetti, G.M., 1999. Potentiation of excitotoxicity intransgenic mice overexpressing neuronal cyclooxygenase-2. Am.J. Pathol. 155, 995—1004.

Kulkarni, S.K., Dhir, A., 2009. Cyclooxygenase in epilepsy: from per-ception to application. Drugs Today 45, 135—154.

Kunz, T., Oliw, E.H., 2001. The selective cyclooxygenase-2 inhibitorrofecoxib reduces kainate-induced cell death in the rat hip-pocampus. Eur. J. Neurosci. 13, 569—575.

McGinley, S., Centra, M., Lysz, T.W., 1985. The effect of inhibitingbrain thromboxane biosynthesis on pentylenetetrazole-inducedseizure threshold. J. Neurosci. Res. 13, 563—567.

Naffah-Mazzacoratti, M.G., Bellíssimo, M.I., Cavalheiro, E.A., 1995.Profile of prostaglandin levels in the rat hippocampus in pilo-carpine model of epilepsy. Neurochem. Int. 27, 461—466.

Oliveira, M.S., Furian, A.F., Freire, L.F., Fighera, M.R., Fiorenza,N.G., Castelli, M., Machado, P., Bohrer, D., Veiga, M.,Ferreira, J., Cavalheiro, E.A., Mello, C.F., 2008. Cyclooxygenase-2/PGE2 pathway facilitates pentylenetetrazol-induced seizures.Epilepsy Res. 79, 14—21.

Phillis, J.W., Horrocks, L.A., Farooqui, A.A., 2006. Cyclooxygenases,lipoxygenases, and epoxygenases in CNS: their role and involve-ment in neurological disorders. Brain Res. Rev. 52, 201—243.

Rosenkranz, R.P., Killam Jr., K.F., 1978. Effects of prostacyclin and6-keto PGF1alpha on electrically induced convulsions in mice.Life Sci. 23, 2609—2616.

Sandhya, T.L., Ong, W.Y., Horrocks, L.A., Farooqui, A.A., 1998. Alight and electron microscopic study of cytoplasmic phospholi-pase A2 and cyclooxygenase-2 in the hippocampus after kainatelesions. Brain Res. 788, 223—231.

Simmet, T., Peskar, B.A., 1990. Lipoxygenase products of polyun-saturated fatty acid metabolism in the central nervous system:biosynthesis and putative functions. Pharmacol. Res. 22,667—682.

Simmet, T., Seregi, A., Hertting, G., 1987. Formation ofsulphidopeptide-leukotrienes in brain tissue of spontaneouslyconvulsing gerbils. Neurophamacology 26, 107—110.

Simmet, T., Tippler, B., 1991. On the relation between cerebralcysteinyl-leukotriene formation and epileptic seizures. BrainRes. 540, 283—286.

Steinhauer, H.B., Anhut, H., Hertting, G., 1979. The synthesis ofprostaglandins and thromboxane in the mouse brain in vivo.Influence of drug induced convulsions, hypoxia and the anti-convulsants trimethadione and diazepam. Arch. Pharmacol. 310,53—58.

Takemiya, T., Maehara, M., Matsumura, K., Yasuda, S., Sugiura, H.,Yamagata, K., 2006. Prostaglandin E2 produced by late inducedCOX-2 stimulates hippocampal neuron loss after seizure in theCA3 region. Neurosci. Res. 56, 103—110.

Takemiya, T., Suzuki, K., Sugiura, H., Yasuda, S., Yamagata, K.,Kawakami, Y., Maru, E., 2003. Inducible brain COX-2 facilitatesthe recurrence of hippocampal seizures in mouse rapid kindling.Prostaglandins Other Lipid Mediat. 71, 205—216.

Wolfe, L.S., 1982. Eicosanoids: prostaglandins, thromboxanes,leukotrienes, and other derivatives of carbon-20 unsaturatedfatty acids. J. Neurochem. 38, 1—14.

Yoshikawa, K., Kita, Y., Kishimoto, K., Shimizu, T., 2006. Profil-ing of eicosanoid production in the rat hippocampus duringkainic acid-induced seizure. Dual phase regulation and differ-ential involvement of COX-1 and COX-2. J. Biol. Chem. 281,14663—14669.

Zhang, H.J., Sun, R.P., Lei, G.F., Yang, L., Liu, C.X., 2008.Cyclooxygenase-2 inhibitor inhibits hippocampal synaptic reor-ganization in pilocarpine-induced status epilepticus rats. J.Zhejiang Univ. Sci. B 9, 903—915.

54 55

RES

ULT

AD

OSR

ESULTA

DO

S

5.2 ARTÍCULO 2

TítuloOXIDATIVE STRESS MARKERS IN THE NEOCORTEX OF DRUG-RESISTANT EPILEPSY PATIENTS SUBMITTED TO EPILEPSY SURGERY

Autores Jordi Rumià, Frederic Marmol, Juan Sanchez, José Giménez-Crouseilles, Mar Carreño, Núria Bargalló, Teresa Boget, Luis Pintor, Xavier Setoain, Eva Bailles, Antonio Donaire, Guillermo T. Saez, Teresa Ribalta, Enric Ferrer, Pere Puig-Parellada.

Rumià, J.; Marmol, F.; Sanchez, J.; Giménez-Crouseilles, J.; Carreño, M.; Bargalló, N.; Boget, T.; Pintor, L.; Setoain, X.; Donaire, A.; Saez, G.T.; Ribalta, T.; Ferrer, E.; Puig-Parellada, P. (2013) Oxidative stress markers in the neocortex of drug-resistant epilepsy patients submitted to epilepsy surgery. Epilepsy Res. 107(1-2), 75-81.

Factor de Impacto2,491 (2017)

Cuartil Segundo (Neurology Q2)

Citado porCevik B, Solmaz V, Aksoy D, Erbas O. (2015) Montelukast inhibits pentylenetetrazol-induced seizures in rats. Med Sci Monit. 24; 21:869-874.

Dominiak A, Wilkaniec A, Wroczyński P, Adamczyk A. (2016) Selenium in the Therapy of Neurological Diseases. Where is it Going? Curr Neuropharmacol. 14(3):282-99.

Guo C, Ding P, Xie C, Ye C, Ye M, Pan C, Cao X, Zhang S, Zheng S. (2017) Potential application of the oxidative nucleic acid damage biomarkers in detection of diseases. Oncotarget. 8;8(43):75767-75777.

Pearson JN, Rowley S, Liang LP, White AM, Day BJ, Patel M. (2015) Reactive oxygen species mediate cognitive deficits in experimental temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 82:289-297.

Pearson-Smith JN, Patel M. (2017) Metabolic Dysfunction and Oxidative Stress in Epilepsy. Int J Mol Sci. 8;18(11)

Puttachary S, Sharma S, Stark S, Thippeswamy T. (2015) Seizure-induced oxidative stress in temporal lobe epilepsy. Biomed Res Int. 2015:745613.

Sheng J, Liu S, Qin H, Li B, Zhang X. (2018) Drug-Resistant Epilepsy and Surgery. Curr Neuropharmacol. 16(1):17-28.

Contribución del Doctorando Diseño del estudio, selección de candidatos quirúrgicos, intervención neuroquirúrgica (neurocirujano principal en todas las operaciones), obtención y manipulación inicial de muestras de neocórtex de los pacientes epilépticos. Como asistente en procesado de muestras y en los ensayos de determinación de marcadores de estrés oxidativo. Participación en el análisis estadístico e interpretación de los resultados. Elaboración del manuscrito y de sus sucesivas revisiones.

56 57

AR

TÍC

ULO

2A

RTÍC

ULO

2

Epilepsy Research (2013) 107, 75—81

journa l homepage: www.e lsev ier .com/ locate /ep i lepsyres

Oxidative stress markers in the neocortexof drug-resistant epilepsy patientssubmitted to epilepsy surgery

Jordi Rumiàa,∗, Frederic Marmolb, Juan Sanchezb,José Giménez-Crouseillesc, Mar Carrenod, Núria Bargallód,Teresa Bogetd, Luis Pintord, Xavier Setoaind, Antonio Donaired,Guillermo T. Saeze, Teresa Ribalta f, Enric Ferrera,Pere Puig-Parelladab

a Department of Neurosurgery, Hospital Clínic of the University of Barcelona, 08036 Barcelona, Spainb Pharmacology Unit, University of Barcelona School of Medicine, 08036 Barcelona, Spainc Department of Anesthesiology, Parc Sanitari Sant Joan de Déu, 08830 Sant Boi de Llobregat, Barcelona,Spaind Epilepsy Unit, Hospital Clínic of the University of Barcelona, 08036 Barcelona, Spaine Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Service of Clinical Analysis-CDBHGUV University of Valencia, 46010 Valencia, Spainf Department of Pathology, Hospital Clínic of the University of Barcelona, 08036 Barcelona, Spain

Received 21 October 2012 ; received in revised form 19 February 2013; accepted 8 August 2013Available online 4 September 2013

KEYWORDSSeizures;Oxidative stress;Neocortex;Drug-resistantepilepsy;Epilepsy surgery

SummaryPurpose: While there is solid experimental evidence of brain oxidative stress in animal modelsof epilepsy, it has not been thoroughly verified in epileptic human brain. Our purpose was todetermine and to compare oxidative stress markers in the neocortex of epileptic and non-epileptic humans, with the final objective of confirming oxidative stress phenomena in humanepileptic brain.Methods: Neocortical samples from drug-resistant epilepsy patients submitted to epilepsysurgery (n = 20) and from control, non-epileptic cortex samples (n = 11) obtained from brainbank donors without neurological disease, were studied for oxidative stress markers: levels ofreactive oxygen species (ROS), such as superoxide anion (O2

−); activity of antioxidant enzymes:superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GPx), and glutathione reductase(GR); and markers of damage to biomolecules (lipid peroxidation and DNA oxidation).

∗ Corresponding author at: Servei de Neurocirurgia, Hospital Clínic, Universitat de Barcelona, Carrer de Villarroel, no 170, Escala 8, Planta4, 08036-Barcelona, Spain. Tel.: +34 932275514; fax: +34 932275514.

E-mail addresses: jrumia@clinic.ub.es, jrumia@gmail.com (J. Rumià).

0920-1211/$ — see front matter © 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.eplepsyres.2013.08.020

76 J. Rumià et al.

Results: Compared with non-epileptic controls, the neocortex of epileptic patients dis-played increased levels of superoxide anion (P ≤ 0.001), catalase (P ≤ 0.01), and DNA oxidation(P ≤ 0.001); a decrease in GPx (P ≤ 0.05), and no differences in SOD, GR and lipid peroxidation.Conclusions: Our findings in humans are in agreement with those found in animal models, sup-porting oxidative stress as a relevant mechanism also in human epilepsy. The concurrent increasein catalase and decrease in GPx, together with unchanged SOD levels, suggests catalase as themain antioxidant enzyme in human epileptic neocortex. The substantial increase in the levelsof O2

− and 8-oxo-dG in epileptic patients supports a connection between chronic seizures andROS-mediated neural damage.© 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.

Introduction

There are solid pieces of evidence linking oxidative stressto the initiation and progression of epilepsy in experimen-tal models. Oxidative stress is known to be triggered byepileptic seizures. Conversely, intense seizure activity suchas the produced in animal models, can lead to cytotoxiceffects mediated by oxidative stress. A central mediator ofoxidative stress is cellular superoxide anion (O2

−), whichinfluences both physiological and pathological processes(Patel and Li, 2003). The main physiological sources of O2

−

are mitochondria (Waldbaum and Patel, 2010), but in braintissue O2

− can also arise from other sources (Patel et al.,2005; Rumià et al., 2012). Hydrogen peroxide (H2O2) isformed whenever O2

− is generated because of its rapid con-version to H2O2 by the superoxide dismutase (SOD) enzyme.The conversion of H2O2 to H2O can be accomplished bothby catalase and glutathione peroxidase (GPx), the latterinvolving the glutathione, a cofactor of this enzyme. Asteady-state level of O2

− and H2O2 is always present in cellsas a result of normal metabolism (Liang and Patel, 2006;Freitas, 2009). The cytotoxic mechanisms by which ROSinduce neuronal damage may involve direct oxidative attackon cellular macromolecules (protein, lipids, DNA and sugars)and initiation or propagation of free radical chain reaction,ultimately leading to macromolecular damage (Patel, 2002;Shin et al., 2011). The present study also addresses theissue of lipid peroxidation and DNA oxidation. Lipid per-oxidation is relevant in brain because of its high contentin polyunsaturated fatty acids (PUFA), prone to lipid per-oxidation. The oxidation of PUFA causes them to be morehydrophilic, thereby altering the structure of cell membranewith resultant changes in fluidity and permeability (Gibertiand Trombetta, 2000). It has also been established thatROS damages DNA through an oxidative mechanism, produc-ing 8-oxo-7,8-dihydro-2�-deoxyguanosine (8-oxo-dG), whichis considered to be an important biomarker of generalizedcellular oxidative stress (Waldbaum and Patel, 2010).

The vast majority of animal models report the relation-ship between oxidative stress and acute seizures, while themain burden of epilepsy in clinical practice is owed to itscondition of chronic disease afflicting more than 65 mil-lion people worldwide (England et al., 2012). In clinicalpractice, the surgical resection of the epileptic foci not onlydramatically improves the condition (Patel, 2002, 2004),but also leads to a normalization of oxidative stress mark-ers in the serum of drug-resistant epileptic patients (Lópezet al., 2007). Epilepsy surgery also allows access to humanbrain tissue resected for therapeutic reasons from chronic

drug-resistant epilepsy patients. With the purpose of findingout if experimental data can be reproduced in humans, wehave carried out a comparative analysis of oxidative stressmarkers between neocortical tissue samples obtained fromoperated epilepsy patients, and control, non-epileptic neo-cortical specimens from Neurological Tissue Bank. The mainobjectives have been: (1) to quantify and compare oxida-tive stress markers, thus providing support to free radicalimplication in the pathogenesis of epilepsy in humans; (2)to evaluate lipid peroxidation and DNA oxidation, as mark-ers of sustained ROS production in the context of chronicseizures.

Methods

Subjects

Surgical specimens were obtained from twenty (n = 20)patients with focal epilepsy, all of them suffering fromdrug-resistant complex partial seizures (CPS) (Table 1). Theseizure onset zone was localized using physical, neuropsy-chological and psychiatric examination, Magnetic ResonanceImaging (MRI), Single Photon Emission Computed Tomo-graphy (SPECT), Positron Emission Tomography (PET), andlong-term video monitoring. The seizure onset zone wasremoved surgically to achieve seizure control. In patientswith medically intractable epilepsy of medial temporalonset, the surgical technique used was standard anterome-dial temporal resection with amygdalo-hippocampectomy(Spencer et al., 1984). In case of extratemporal epilepsy,a cortical resection was performed. The main portion ofthe resected tissue was submitted for pathological eval-uation. A neocortical sample of approximately 1 cm3 wasseparated from it and immediately frozen by immersion inliquid nitrogen in the operating room, and stored at −80 ◦C inthe laboratory. Ethical permission for this study was grantedby the Ethics Committee of the Hospital Clínic, Universityof Barcelona. All patients gave their informed consent, andthe privacy was assured by anonymous cypher coding of thesamples. The same criteria were applied to the control,non-epileptic cortex samples (n = 11) provided by the Neu-rological Bank of Tissues of the Neuropathology Institute,Bellvitge University Hospital, University of Barcelona (Bel-lvitge, Barcelona, Spain), from donors whose cause of deathwas confirmed as unrelated to any brain disease or injury(Table 2). At autopsy, half of the brain was fixed in 10% for-malin for no less than 3 weeks, whereas the other half wascut in coronal sections 1-cm thick, frozen on dry ice, and

58 59

AR

TÍC

ULO

2A

RTÍC

ULO

2

Oxidative stress in human epileptic cortex 77

Table 1 Demographic, clinical and neocortical histological data corresponding to the operated drug-resistant epilepsy patientsin this study.

Patientnumber

Site of resection Gender Age atsurgerya

Age at seizureonseta

Duration ofepilepsya

FrequencyCPS/monthb

Neocortical histology

1 Right temporal M 59 39 20 5 Gliosis2 Right temporal F 35 6 29 20 Gliosis + neuron loss3 Left temporal M 33 6 27 60 Gliosis + neuron loss4 Right parietal M 34 22 12 30 Gliosis + neuron loss5 Right temporal M 61 37 24 3 Gliosis6 Right temporal M 30 20 10 4 Gliosis7 Right temporal M 47 38 9 7 FCD8 Right temporal M 44 28 16 4 Gliosis + infarction9 Right temporal F 36 5 31 8 Gliosis

10 Right temporal M 24 13 11 90 Gliosis11 Right temporal F 34 11 23 20 Gliosis + infarction12 Right temporal M 41 33 7 3 Gliosis13 Left temporal M 36 12 24 2 Gliosis14 Right temporal F 34 16 24 2 Gliosis15 Right temporal F 35 12 23 7 Gliosis16 Right temporal M 32 2 30 30 Gliosis17 Right temporal F 48 26 22 2 Gliosis18 Left temporal M 29 5 24 7 Gliosis + neuron loss19 Left temporal M 36 7 29 10 Gliosis20 Left temporal M 39 6 33 10 Gliosis

a In years.b Mean frequencies during the 6 months before surgery. CPS, complex partial seizures; FCD, focal cortical dysplasia.

stored at −80 ◦C until use. The control samples used in thepresent research were taken from the temporal neocortexof the deep-frozen hemisphere, and stayed in deep freezeconditions for six months as an average in the brain bank.

Tissue preparation

Approximately one gram of cortex was homogenized (FisherScientific) with 6 ml of phosphate buffer pH = 7.4 + EDTA(0.1 mM) maintaining the sample at 4 ◦C. The homogenatewere centrifuged at 800 × g for 10 min at 4 ◦C. From the

Table 2 Data corresponding to donors of control tis-sue samples from brain bank. All control specimens wereobtained from temporal neocortex.

Controlnumber

Post-mortemtime

Gender Age at death(years)

1 7 h 30 m M 492 5 h 40 m M 553 7 h 05 m M 594 9 h 15 m M 405 6 h F 246 9 h 35 m F 477 6 h 25 m M 598 5 h 55 m M 439 7 h 25 m M 53

10 3 h 30 m M 3911 4 h 55 m M 47

supernatant 250 �l were introduced on an eppendorf tubecontaining 5 �l of BHT 0.5% which were used for the TBARSassay, 250 �l were used for the superoxide anion assay and25 �l were put in a propylene test tube for the proteinquantification. The first two samples were stored at −80 ◦C.The remaining supernatant was centrifuged at 10,000 × gfor 60 min at 4 ◦C. 50 �l of the supernatant were used forthe protein quantification. With the remaining supernatantaliquots of 250 �l were prepared. All the aliquots werestored at −80 ◦C.

Assays

Superoxide anion (O2−)

A luminescence technique developed by Pagano et al. (1995)was used with a single modification; we use a non-redoxcycling concentration of lucigenin (5 �M).

Superoxide dismutase (SOD)The spectrophotometric method employed follows thesuperoxide-driven autooxidation of quercitin at pH 10 in thepresence of TMEDA (N,N,N�,N�-tetramethylenediamine) andEDTA (ethylene-diaminotetraacetic acid) (Bruce and Baudry,1995).

CatalaseCatalase activity was measured by a method in which thedisappearance of H2O2 is followed spectrophotometricallyat 240 nm (Bruce and Baudry, 1995).

78 J. Rumià et al.

Glutathione peroxidase (GPx)This method uses tert-butyl hydroperoxide as the substrate;thus avoiding any problem related to the presence of cata-lase in the sample. The assay is based on the oxidation ofreduced glutathione (GSH) by GPx coupled to the disappear-ance of NADPH by glutathione reductase (Del Maestro andMcDonald, 1985).

Glutathione reductase (GR)In a system containing oxidized glutathione and NADPH theenzyme activity was quantified by measuring the disappear-ance of NADPH at 340 nm (Liang and Patel, 2006).

Lipid peroxidationMalondialdehyde (MDA) is one of the products of lipid perox-idation and is therefore a good indicator of the rate of lipidperoxidation. MDA is quantified by its reaction with the thio-barbituric acid (TBA) to generate a complex of thiobarbituricacid reactive substances (TBARS), which absorbs light at awavelength of 532 nm.

Protein determinationProtein quantification was performed following the methoddescribed by Lowry et al. (1951) using serum albumin asstandard.

DNA oxidationOnce the purified DNA have been extracted, is digestedwith different enzymes (RNase, DNase, nuclease P1, alka-line phosphatase) to obtain the free nucleosides. After thatwe apply the samples to a HPLC with a flow rate of 1 ml/min.The running buffer was potassium phosphate 50 mM pH 5.1and 5% acetonitrile. This separation was carried out using5 �m Waters Spherisorb ODS2 columns (4.6 mm × 250 mm).The amount of 8-oxo-dG and dG in the DNA digest wasmeasured by electrochemical and UV absorbance detectionrespectively. The results are expressed as a relation betweenmodified bases and non-modified ones (Muniz et al., 1995).

Data analysis

First, a descriptive analysis of the samples was carried out,followed by a variance (multivariate) analysis performing‘‘a priori’’ contrast simple type. A contrast is defined asthe difference between the mean value of the dependentvariable (pharmacological data) and its corresponding meanvalue in the control group. The results are expressed assuch difference, plus its 95% confidence interval (CI). Dif-ferences of P ≤ 0.05 were considered significant and arepresented below. We also searched for correlations amongthe independent variables (clinical data) and also among thedifferent dependent and independent variables. The resultsare expressed as mean ± standard error (SE). The statisticalanalysis was carried out using the SPSS 15.0 programme.

Results

Global analysis showed a significant F value of 1 per1000 (F11, 20, 0.001 = 25.821), allowing to reject the hypoth-esis of equal means. Superoxide anion, the first ROS

Figure 1 Levels of superoxide anion (O2−) in neocortex

samples from controls and drug-resistant epilepsy patients sub-mitted to neurosurgery. The results are expressed as arbitraryunits of emitted light per g of protein per minute. Number ofpatients = 20. Number of controls = 11. Each value representsmean ± SE. ***P < 0.001 versus control group.

generated, displayed an important difference betweenthe mean values in control group and epileptic group,−72.23 units/g protein/min (CI 95%: −92.26 ÷ −62.20)(P ≤ 0.001). The observed difference corresponds to a 337%increase in relation to the control group (Fig. 1). SOD, theenzyme that scavenges O2

−, showed no significant differ-ences between the control and epileptic group. Catalase,an enzyme responsible of the H2O2 metabolism, presenteda significant difference between the control and epilepticgroup, −12.14 ng/mg protein, (CI 95%: −19.06 ÷ −2.41)(P ≤ 0.01). The observed difference represents a 95%increase in relation to the control group (Fig. 2). Compar-ison between the control and epileptic group also foundsignificant differences in GPx enzyme activity, 24.52 units/gprotein (CI 95%: 3.17 ÷ 46.96) (P ≤ 0.05) (Fig. 3), being thedifference in percentage of 30% respect to the controls.TBARS, the classical parameter to detect lipid peroxidationdid not show a significant difference between the controland epileptic group. Regarding chronic DNA damage inducedby ROS, 8-oxo-dG displayed a significant difference betweencontrol and epileptic groups, −11.25 8-oxo-dG/106dG (CI95%: −13.99 ÷ −8.51) (P ≤ 0.001). The observed differencecorrespond to a 284% increase in relation to the controlgroup (Fig. 4). There was no significant correlation betweenthe dependent and independent variables.

Discussion

The presented results obtained from human epileptic neo-cortex have been contrasted with those obtained fromlaboratory animals, in which seizures are usually provokedwith kainic acid or pilocarpine. Both agents are able to

60 61

AR

TÍC

ULO

2A

RTÍC

ULO

2

Oxidative stress in human epileptic cortex 79

Figure 2 Levels of catalasein neocortex samples fromcontrols and drug-resistant epilepsy patients submitted to neu-rosurgery. The results are expressed as ng per mg protein.Number of patients = 20. Number of controls = 11. Each valuerepresents mean ± SE. **P < 0.01 versus control group.

induce progressive limbic seizures in rats, which resemblehuman temporal lobe epilepsy, the most common type ofadult human epilepsy (Dal-Pizzol et al., 2000; Tejada et al.,2006; Waldbaum and Patel, 2010). All patients in the presentstudy but one suffered from temporal lobe epilepsy. Despite

Figure 3 Levels of glutathione peroxidase (GPx) in neocor-tex samples from controls and drug-resistant epilepsy patientssubmitted to neurosurgery. The results are expressed in unitsof GPx per g of protein. Number of patients = 20. Number ofcontrols = 11. Each value represents mean ± SE. *P < 0.05 versuscontrol group.

Figure 4 Levels of 8-oxo-dG in neocortex samples fromcontrols and drug-resistant epilepsy patients submitted to neu-rosurgery. The results are expressed as the quotient of oxidizedbases per 106 of 2-deoxyguanosine. Number of patients = 20.Number of controls = 11. Each value represents mean ± SE.***P < 0.001 versus control group.

having different etiologies, similarities in the pathologybetween human conditions and experimental models arelikely to result from common mechanisms underlying thegeneration of spontaneous seizures in both situations (Dalbyand Mody, 2001). This extrapolation seems to be verified bythe present results.

Superoxide anion showed a highly significant increasein the neocortex of drug-resistant epileptic patients whencompared with the control group. The importance ofthis free radical in seizure induction is supported byresults obtained with transgenic animals. Transgenic miceoverexpressing mitochondrial SOD (SOD2) are resistant toseizure-induced neural damage, whereas mice with par-tial SOD2 deficiency (SOD±) showed exacerbation of theseeffects, with increased seizure susceptibility. These studiessuggest that O2

− may play an important role in seizure-induced brain damage (Liang et al., 2000; Patel, 2004; Liangand Patel, 2004). Researchers have observed contradictoryresults in the levels of SOD, the enzyme that dismutates O2

−,either in acute and chronic experimental models. In acutemodels, most of the authors find an increase in SOD lev-els (Bruce and Baudry, 1995; Giberti and Trombetta, 2000;Cheng et al., 2004; Tejada et al., 2006), but other studieshave reported no significant changes (Freitas et al., 2005)and even a reduction in SOD levels (Candelario-Jalil et al.,2001; Rauca et al., 2004) when compared with the controlgroup. Chronic experimental epilepsy models have displayedeither increase (Freitas, 2009) or decrease (Bellissimo et al.,2001) in SOD levels. We did not find significant differencesin the activity of SOD in epileptic neocortex when comparedto controls. The unchanging SOD activity might be explainedby simultaneous upregulation of SOD and its degradationcaused by oxidative stress (Erakovic et al., 2003) due, for

80 J. Rumià et al.

instance, to the ability of H2O2 to inactivate SOD (Marklund,1984).

Catalase is able to scavenge great amounts of H2O2

very rapidly, being its levels lower in brain tissue than inother organs. A significant increase in catalase was foundin the neocortex of epileptic patients, matching the resultsobtained in laboratory animals both in acute (Freitas et al.,2004, 2005; Tejada et al., 2006; Xavier et al., 2007; Barroset al., 2007; Devi et al., 2008) and chronic (Freitas, 2009)models of epilepsy. The remarkable increase in catalaseactivity is interpreted as an enzymatic antioxidant responseto augmented basal free radical production, harmful forneural tissue; also suggesting that free radical scaveng-ing may be involved in controlling seizure-induced neuraldamage (Barros et al., 2007). GPx is very efficient in thedestruction of small amounts of H2O2. The results in epilepsypatients show a significant decrease in the levels of GPx,which could be the result of increased protein inactiva-tion or degradation (Erakovic et al., 2000). The resultsin laboratory animals for GPx present conflicting results,from no alteration (Bruce and Baudry, 1995; Cheng et al.,2004; Tejada et al., 2006), to decrease (Erakovic et al.,2000, 2003; Rajasekaran, 2005), and increase (Giberti andTrombetta, 2000; Bellissimo et al., 2001; Cheng et al., 2004;Rajasekaran, 2005; Liang and Patel, 2006; Tejada et al.,2006). GR usually shows a decrease in laboratory animals(Liang and Patel, 2006; Waldbaum and Patel, 2010). Ourfindings regarding GPx—GR system can be interpreted as ifthis system played a minor role as free radical scavengerin human epileptic cortex, but sufficient enough to main-tain glutathione in the reduced state (GSH) (Tejada et al.,2006). The finding of an increase in catalase and a con-current decrease in GPx gives support to the idea that thebalance between SOD and catalase on one hand, and GPxon the other, is more important than the absolute amountof single antioxidant enzymes, as far as sensitivity to freeradicals is concerned (Erakovic et al., 2000). Regarding lipidperoxidation, similar TBARS levels were found in epilepticsamples and controls. In kainic acid and pilocarpine models,increased TBARS were reported 12—14 h post-treatment,which later decreased or reached basal levels. This‘‘normalization’’ may suggest hypometabolism, neuronalloss and/or compensatory mechanisms that may be activelymodulating enzymes related to ROS catabolism (Giberti andTrombetta, 2000; Dal-Pizzol et al., 2000; Waldbaum andPatel, 2010). Concerning DNA oxidation, we found a highlysignificant increase in the levels of 8-oxo-dG in epilepsypatients when compared to controls. Parallel results havebeen observed in acute and chronic models of epilepsy(Liang et al., 2000; Patel and Li, 2003). Acute status epilep-ticus caused increased oxidative mtDNA damage, togetherwith mitochondrial H2O2 production, activation of mtBERpathway to attempt to repair mtDNA lesions, and a tran-sient decrease in mtDNA repair capacity. The mtDNA damageis observed in experimental models immediately after sta-tus epilepticus, followed by a recovery during the ‘‘silentperiod’’ of low seizure probability, and recrudescence ofmtDNA damage during the chronic phase of epilepsy, whenfrequent seizures occur. Recurrent seizures associated withthe chronic phase of epilepsy coincided with mitochondrialROS production which is expressed by elevated mitochon-drial oxidative stress, as demonstrated by increased H2O2

and O2− levels, accumulation of mtDNA damage, a com-

plete failure of mtBER response, and impaired mtDNArepair capacity. Spontaneous motor seizures occurred con-currently with the re-emergence of mtDNA damage (Jarretet al., 2008). High levels of H2O2 and O2

− may trigger theHaber—Weiss reaction and, as a result, the production ofhighly reactive species hydroxyl radical (OH•). This rad-ical has a great affinity towards guanine in DNA and inthe nucleotide pool, increasing the formation of 8-oxo-dG(Halliwell and Gutteridge, 2007). The present results sup-port the association between DNA oxidation -sustained ROSproduction- and chronic seizures in human epilepsy.

In summary, the presented findings agree with thosefound in animal experimental models, and strongly sug-gest that oxidative stress may be a key phenomenon alsoin human epilepsy. The increase in catalase and decreasein GPx, together with the unchanging SOD levels, suggestthat catalase is the main enzymatic antioxidant in humanepileptic neocortex, while GPx and SOD do not appear to bemajor free radical scavenger systems in epilepsy. Besides,the substantial increase in the levels of O2

− and 8-oxo-dG inepileptic patients, give support to the connection betweenchronic seizures and ROS-mediated neural damage.

Acknowledgement

We thank Professor Isidre Ferrer Abizanda, Director ofthe Banc de Teixits Neurològics, Institut de Neuropatolo-gia de l’Hospital Universitari de Bellvitge (L’Hospitalet deLlobregat, Barcelona, Spain), for providing the control non-epileptic cortex specimens.

References

Barros, D.O., Xavier, S.M.L., Barbosa, C.O., Silva, R.F., Freitas,R.L.M., Maia, F.D., Oliveira, A.A., Freitas, R.M., Takahashi, R.N.,2007. Effects of the vitamin E in catalase activities in hippocam-pus after status epilepticus induced by pilocarpine in Wistar rats.Neurosci. Lett. 416, 227—230.

Bellissimo, M.I., Amado, D., Abdalla, D.S.P., Ferreira, E.C., Cav-alheiro, E.A., Naffah-Mazzacoratti, M.da.G., 2001. Superoxidedismutase, glutathione peroxidase activities and the hydroper-oxide concentration are modified in the hippocampus ofepileptic rats. Epilepsy Res. 46, 121—128.

Bruce, A.J., Baudry, M., 1995. Oxygen free radicals in rat limbicstructures after kainate-induced seizures. Free Radic. Biol. Med.18, 993—1002.

Candelario-Jalil, E., Al-Dalain, S.M., Castillo, R., Martínez, G., Fer-nandez, O.S.L., 2001. Selective vulnerability to kainate-inducedoxidative damage in different rat brain regions. J. Appl. Toxicol.21, 403—407.

Cheng, H., Fu, Y.S., Guo, J.W., 2004. Ability of GDNF to diminish freeradical production leads to protection against kainate-inducedexcitotoxicity in hippocampus. Hippocampus 14, 77—86.

Dal-Pizzol, F., Klamt, F., Vianna, M.M.R., Schroder, N., Quevedo, J.,Benfato, M.S., Moreira, J.C.F., Walz, R., 2000. Lipid peroxidationin hippocampus early and late after status epilepticus inducedby pilocarpine or kainic acid in Wistar rats. Neurosci. Lett. 291,179—182.

Dalby, N.O., Mody, I., 2001. The process of epileptogenesis: a patho-physiological approach. Curr. Opin. Neurol. 14, 187—192.

Del Maestro, R.F., McDonald, W., 1985. Oxidative enzymes in tis-sue homogenates. In: Greenwald, R.A. (Ed.), CRC Handbook of

6362

RES

ULT

AD

OSA

RTÍC

ULO

2

Oxidative stress in human epileptic cortex 81

Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton,FL, USA, pp. 291—296.

Devi, P.U., Manocha, A., Vohora, D., 2008. Seizures, antiepileptics,antioxidants and oxidative stress: an insight for researchers.Expert Opin. Pharmacother. 9, 3169—3177.

England, M.J., Liverman, C.T., Schultz, A.M., Strawbridge, L.M.,2012. Epilepsy Across the Spectrum: Promoting Health andUnderstanding. The National Academies Press, Washington, DC,USA, pp. 13—34.

Erakovic, V., Zupan, G., Varljen, J., Laginja, J., Simonic, A., 2000.Lithium plus pilocarpin induced status epilepticus-biochemicalchanges. Neurosci. Res. 36, 157—166.

Erakovic, V., Zupan, G., Varljen, J., Simonic, A., 2003.Pentylenetetrazol-induced seizures and kindling: changes in freefatty acids, superoxide dismutase, and glutathione peroxidaseactivity. Neurochem. Int. 42, 173—178.

Freitas, R.M., Nascimento, V.S., Vasconcelos, S.M.M., Sousa, F.C.F.,Viana, G.S.B., Fonteles, M.M.F., 2004. Catalase activity in cere-bellum, hippocampus, frontal cortex and striatum after statusepilepticus induced by pilocarpine in Wistar rats. Neurosci. Lett.365, 102—105.

Freitas, R.M., Vasconcelos, S.M.M., Souza, F.C.F., Viana, G.S.B.,Fonteles, M.M.F., 2005. Oxidative stress in the hippocampusafter pilocarpine-induced status epilepticus in Wistar rats. FASEBJ. 272, 1307—1312.

Freitas, R.M., 2009. Investigation of oxidative stress involvementin hippocampus in epilepsy model induced by pilocarpine. Neu-rosci. Lett. 462, 225—229.

Giberti, E.A., Trombetta, L.D., 2000. The relationship betweenstress protein induction and the oxidative defense system in therat hippocampus following kainic acid administration. Toxicol.Lett. 116, 17—26.

Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., 2007. Free Radicals in Biologyand Medicine, 4th ed. Oxford University Press, Oxford, UK, pp.220—230.

Jarret, S.G., Liang Li-Ping, Hellier, J.L., Staley, K.J., Patel, M., 2008.Mitochondrial DNA damage and impaired base excision repairduring epileptogenesis. Neurobiol. Dis. 30, 130—138.

Liang, L.P., Ho, Y.S., Patel, M., 2000. Mitochondrial superoxide pro-duction in kainate-induced hippocampal damage. Neuroscience101, 563—570.

Liang, L.P., Patel, M., 2004. Mitochondrial oxidative stress andincreased seizure susceptibility in SOD2(±) mice. Free Radic.Biol. Med. 36, 542—554.

Liang, L.P., Patel, M., 2006. Seizure-induced changes in mitochon-drial redox status. Free Radic. Biol. Med. 40, 316—322.

López, J., González, M.E., Lorigados, L., Morales, L., Riverón, G.,Bauzá, J.Y., 2007. Oxidative stress markers in surgically treatedpatients with refractory epilepsy. Clin. Biochem. 40, 292—298.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J., 1951. Pro-tein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem.193, 265—275.

Marklund, S.L., 1984. Properties of extracellular superoxide dismu-tase from human lung. Biochem. J. 220, 269—272.

Muniz, P., Valls, V., Perez-Broseta, C., Iradi, A., Climent, J.V., Oliva,M.R., Saez, G.T., 1995. The role of 8-hydroxy-2�-deoxyguanosinein rifamycin-induced DNA damage. Free Radic. Biol. Med. 18,747—755.

Pagano, P.J., Ito, Y., Tornheim, K., Gallop, P.M., Tauber, A.I., Cohen,R.A., 1995. An NADPH oxidase superoxide-generating systemin the rabbit aorta. Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) 268,H2274—H2280.

Patel, M., 2002. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction, andepilepsy. Free Radic. Res. 36, 1139—1146.

Patel, M., Li, Q.Y., 2003. Age dependence of seizure-induced oxida-tive stress. Neuroscience 118, 431—437.

Patel, M., 2004. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress:cause and consequence of epileptic seizures. Free Radic. Biol.Med. 37, 1951—1962.

Patel, M., Li, Q.Y., Chang, L.Y., Crapo, J., Liang, L.P., 2005. Activa-tion of NADPH oxidase and extracellular superoxide productionin seizure-induced hippocampal damage. J. Neurochem. 92,123—131.

Rajasekaran, K., 2005. Seizure-induced oxidative stress in rat brainregions: blockade by nNOS inhibition. Pharmacol. Biochem.Behavior 80, 263—272.

Rauca, C., Wiswedel, I., Zerbe, R., Keilhoff, G., Krug, M.,2004. The role of superoxide dismutase and alpha-tocopherolin the development of seizures and kindling induced bypentylenetetrazol-influence of the radical scavenger alpha-phenyl-ter-butyl nitrone. Brain Res. 1009, 203—212.

Rumià, J., Marmol, F., Sanchez, J., Carreno, M., Bargalló, N., Boget,T., Pintor, L., Setoain, X., Bailles, E., Donaire, A., Ferrer, E.,Puig-Parellada, P., 2012. Eicosanoid levels in the neocortex ofdrug-resistant epileptic patients submitted to epilepsy surgery.Epilepsy Res. 99, 127—131.

Shin, E.-J., Jeong, J.H., Chung, Y.H., Kim, W.-K., Ko, K.-H.,Bach, J.-H., Hong, J.-S., Yoneda, Y., Kim, H.-C., 2011. Roleof oxidative stress in epileptic seizures. Neurochem. Int. 59,122—137.

Spencer, D.D., Spencer, S.S., Mattson, R.H., Williamson, P.D., Nov-elly, R.A., 1984. Access to the posterior medial temporal lobestructures in the surgical treatment of temporal lobe epilepsy.Neurosurgery 15, 667—671.

Tejada, S., Roca, C., Sureda, A., Rial, R.V., Gamundi, A.,Esteban, S., 2006. Antioxidant response analysis in thebrain after pilocarpine treatments. Brain Res. Bull. 69,587—592.

Waldbaum, S., Patel, M., 2010. Mitochondria, oxidative stress, andtemporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 88, 23—45.

Xavier, S.M., Barbosa, C.O., Barros, D.O., Silva, R.F., Oliveira, A.A.,Freitas, R.M., 2007. Vitamin C antioxidant effects in hippocam-pus of adult Wistar rats after seizures and status epilepticusinduced by pilocarpme. Neurosci. Lett. 420, 76—79.

5.3 RESUMEN DE LOS RESULTADOS

Las características de los pacientes epilépticos con crisis focales (CF) (antes denominadas crisis parciales (CP)) resistentes al tratamiento farmacológico (n=20) que fueron intervenidos quirúrgicamente, están recogidas en la Tabla 1 del artículo 1. La edad de los pacientes (14 hombres y 6 mujeres) era de 38,4 ± 9,4 años, con una duración de la epilepsia de 21,4 ± 7,9 años y frecuencia de CF al mes de 16,2 ± 22,4. Como controles se emplearon muestras neocorticales de 11 donantes (9 hombres y 2 mujeres) sin antecedentes de enfermedades o lesiones cerebrales, fallecidos por otras causas, con una edad de 46,8 ± 10,2 (Tabla 2 del artículo 1).

5.3.1 ARTÍCULO 1: Niveles de eicosanoides en el neocórtex de pacientes con epilepsia 1) Los tres metabolitos de la vía COX (PGE2, TXA2 y PGI2) mostraron un notable aumento

en las muestras neocorticales de pacientes con epilepsia cuando se compararon con las muestras del grupo de control. Se detectó un incremento de 3,8, 9,7 y 4,3 veces para la PGE2, el TXA2 y la PGI2, respectivamente (p<0,001) (Figura 1 del artículo 1).

2) La relación TXA2 / PGI2 se considera un marcador de neuroinflamación más representativo que los valores absolutos en sí mismos. En el neocórtex epiléptico, los niveles del TXA2

fueron 2 veces superiores a los niveles de la PGI2. Por el contrario, en el grupo control los niveles del TXA2 eran ligeramente más bajos que los de la PGI2 (Figura 2 del artículo 1).

3) En la vía de la LOX, los resultados obtenidos para el LTB4 y el LTC4 fueron indetectables con nuestro enfoque metodológico.

4) El análisis de correlación entre los niveles de los eicosanoides y la frecuencia de CF en cada paciente detectó una correlación positiva para TXA2 (r=0,9970, p≤0,05) y PGI2 (r=0,9970 y p≤0,05). Por el contrario, no se encontró correlación significativa entre los niveles de la PGE2 y la frecuencia de CF.

5.3.2 ARTÍCULO 2: Marcadores de estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes con epilepsia1) Detectamos un incremento muy imporante en los niveles de O2

- en el neocórtex de pacientes epilépticos (-72,23 unidades/g de proteína/min [IC 95%: -92,26 ± -62,20], p≤0,001). La diferencia observada se corresponde con un aumento del 337% en los pacientes epilépticos en relación con el grupo control (Figura 1 del artículo 2).

2) La actividad de la enzima SOD no mostró diferencias significativas entre el control y el grupo de pacientes epilépticos.

3) La actividad de la catalasa se encontró muy aumentada en las muestras de pacientes epilépticos (-12,14 ng/mg de proteína [IC 95% -19,06 ± -2,41], p≤0,01), lo que que supone un incremento del 95% en relación con el grupo de control (Figura 2 del artículo 2).

4) La actividad de la enzima GPx en el neocórtex epiléptico fue menor que en el grupo control (24,52 unidades/g de proteína [IC 95%: 3,17 ± 46,96], p≤0,05) (Figura 3 del artículo 2), siendo la diferencia en porcentaje del 30% menor que en los controles.

5) Los niveles de TBARS, indicadores de peroxidación lipídica, no mostraron diferencias significativas entre el grupo control y el grupo de pacientes epilépticos.

6) Con respecto al daño crónico al ADN inducido por las ROS, la 8-oxo-2’-desoxiguanosina (8-oxo-dG) presentó niveles muy evevados entre pacientes epilépticos (-11,25 8-oxo-dG/106 dG (IC 95%: -13,99 ± -8,51], p≤0,001). La diferencia observada se corresponde a un aumento del 284% en relación con el grupo control (Figura 4 del artículo 2).

7) No encontramos ninguna correlación significativa entre las variables dependientes y las independientes.

64 65

DIS

CU

SIÓ

ND

ISCU

SIÓN

6. DISCUSIÓN

Los resultados experimentales obtenidos de muestras humanas de neocórtex epiléptico han sido contrastados con los obtenidos de modelos animales de epilepsia, en los cuales las convulsiones generalmente se provocan con ácido kaínico o pilocarpina. Ambos agentes son capaces de inducir en ratas crisis límbicas progresivas, que se asemejan a la epilepsia humana del lóbulo temporal, el tipo más común de epilepsia en adultos (Dal-Pizzol et al., 2000;

Tejada et al., 2006; Waldbaum y Patel, 2010). Todos los pacientes del presente estudio, salvo uno, sufrían este tipo de epilepsia. A pesar de tener una etiología diferente, es muy probable que las similitudes entre la epilepsia experimental y humana resulten de mecanismos comunes subyacentes a la generación de crisis epilépticas espontáneas en ambas situaciones (Dalby y

Mody, 2001).

Los resultados del presente estudio muestran un aumento significativo de los metabolitos del ácido araquidónico (AA) de la vía de la ciclooxigenasa (COX), la PGE2, el TXA2 y la PGI2, en el tejido neocortical de pacientes epilépticos, cuando los comparamos con los resultados obtenidos en las muestras de sujetos no epilépticos. Este aumento de eicosanoides observado en pacientes epilépticos del estudio es coherente con los datos que implican la liberación de AA durante las crisis epilépticas (Bazan et al., 1986; Baran et al., 1987; Sandhya et al., 1998; Farooqui et

al., 2001; Kulkarni y Dhir, 2009) y en la activación de COX2 (Chen et al., 1995; Kunz y Oliw, 2001a; Ciceri

et. al., 2002; Kawaguchi et al., 2005; Takemiya et al., 2003; Takemiya et al., 2006).

El hallazgo de una correlación positiva entre la frecuencia de crisis focales (CF) de nuestros pacientes y el aumento de los niveles de dos eicosanoides (TXA2 y PGI2) respalda aún más estos datos en la epilepsia humana. En el grupo control, los niveles de metabolitos de AA obtenidos eran muy bajos, lo que probablemente es debido a la ausencia de crisis epilépticas o cualquier otro tipo de lesión cerebral.

Los estudios disponibles en la literatura que analizan los niveles de eicosanoides en la epilepsia humana son muy escasos. Los niveles de las prostaglandinas PGF2α, PGE2 y PGD2 estaban significativamente aumentados en el plasma de pacientes pediátricos con convulsiones febriles en comparación con niños sanos (Tütüncüoğlu et al., 2001). Otros autores también encontraron incrementada la PGF2α en pacientes epilépticos (Egg et al., 1980; Wolfe y

Mamer, 1975).

Nuestros resultados también indican que no hay activación de la ruta de la lipoxigenasa (LOX), pues no encontramos diferencias significativas en los niveles del LTB4 y el LTC4 en las muestras de pacientes epilépticos en comparación con las del grupo control. Este resultado está en consonancia con los obtenidos por otros autores en ratas con crisis inducidas por ácido kaínico y PTZ. Se observó un pequeño aumento en los niveles de LTC4 en jerbos (Simmet

et al., 1987; Simmet y Peskar, 1990; Simmet y Tippler, 1991; Yoshikawa et al., 2006). La falta de síntesis de leucotrienos sugiere que la vía COX es dominante en el neocórtex de pacientes epilépticos.

Las crisis inducidas por ácido kaínico (KA) aumentan los niveles de PGE2 en el hipocampo y en las neuronas neocorticales (Yoshikawa et al., 2006). Existe evidencia experimental de que la PGE2, una de las principales prostaglandinas sintetizadas en los mamíferos, facilita la generación de crisis y la muerte neuronal (Naffah-Mazzacoratti et al., 1995; Baik et al., 1999; Ciceri

et al., 2002; Kawaguchi et al., 2005; Phillis et al., 2006). Los inhibidores de la COX2, tales como celecoxib o rofecoxib, disminuyen los niveles de PGE2 y reducen significativamente la muerte neuronal relacionada con la epilepsia, la activación de la microglia, e inhiben la neurogénesis y la astrogliosis en el hipocampo y en las neuronas corticales (Kunz y Oliw, 2001a;

Ciceri et al., 2002; Jung et al., 2006; Dhir et al., 2006ª; Dhir et al., 2006b; Zhang et al., 2008; Kulkarni y Dhir,

2009). Además, los antagonistas del receptor de glutamato pueden producir una respuesta inhibitoria comparable (Phillis et al., 2006; Kulkarni y Dhir, 2009).

La administración de PGE2 es otra aproximación para confirmar el papel de este eicosanoide en la epilepsia. Se encontró que la administración de PGE2 combinada con dosis subconvulsivas de PTZ producía crisis epilepticas. Los anticuerpos anti-PGE2 atenuaban las crisis inducidas por PTZ y la acción anticonvulsiva de celecoxib fue revertida mediante la administración intracerebroventricular de PGE2. Estos resultados apoyan la función facilitadora de la vía COX2/PGE2 en las crisis epilépticas inducidas por PTZ (Chen et al., 2002; Oliveira et al., 2008;

Kulkarni y Dhir, 2009).

Los animales transgénicos que sobreexpresan la COX2 humana a nivel neuronal muestran un claro aumento de la intensidad y letalidad de la excitotoxicidad inducida por el KA (Kelley et

al., 1999). Consistentemente, en los ratones knock-out para la COX2 no se produce el aumento de la PGE2 y la muerte neuronal inducida por KA (Takemiya et al., 2006).

La administración de dosis convulsivas de PTZ inducía un aumento del TXA2 en el tejido cerebral de ratón, siendo el inicio de dicho aumento coincidente con la aparición de crisis epilépticas clónicas (Steinhauer et al., 1979). Sin embargo, el tratamiento con inhibidores de la síntesis de TXA2 que disminuyen selectivamente la producción de TXA2 a nivel cerebral, no tenía efecto sobre el umbral convulsivo tónico (McGinley et al., 1985).

En cuanto a la PGI2, en un modelo de crisis inducidas por electrochoque, la administración intracerebroventricular de PGI2 reducía la incidencia de crisis epilépticas tónicas en ratones y protegía a los animales de la muerte inducida por las crisis (Rosenkranz y Killam, 1978). Aunque encontramos un aumento de los niveles de la PGI2 en el neocórtex epiléptico, nuestros datos también muestran que hay dos veces más TXA2 que PGI2 en las muestras neocorticales obtenidas de pacientes epilépticos. El predominio del TXA2 se ha relacionado con la vasoconstricción y la agregación plaquetaria que pueden contribuir al daño neuronal en pacientes epilépticos.

El análisis del anión superóxido (O2–) mostró un aumento muy significativo en el neocórtex

de pacientes epilépticos resistentes a fármacos en comparación con el grupo control. La importancia de este radical libre en la inducción de crisis epilépicas ha sido respaldada por los resultados obtenidos con animales transgénicos. Mientras que los ratones transgénicos que sobreexpresan la SOD mitocondrial (Sod2) eran resistentes al daño neuronal inducido por las crisis, el modelo de ratón con deficiencia parcial de SOD2 (Sod2-/+) mostraba una exacerbación de estos efectos, con una mayor susceptibilidad a las crisis. Puesto que la actividad superóxido dismutasa (SOD) se encarga de eliminar los O2

– generados, estos estudios sugieren que el

66 67

DIS

CU

SIÓ

ND

ISCU

SIÓN

O2– puede jugar un papel importante en el daño cerebral inducido por crisis epilépticas

(Liang et al., 2000, Patel, 2004, Liang y Patel, 2004). Sin embargo, distintos autores han observado resultados contradictorios en los niveles de la actividad SOD en modelos experimentales de epilepsia aguda y crónica. En modelos agudos, la mayoría de los autores encontraban un aumento en los niveles de SOD (Bruce y Baudry, 1995; Gilberti y Trombetta, 2000; Cheng et al., 2004;

Tejada et al., 2006), aunque otros estudios no observaron cambios significativos (Freitas et al.,

2005) o incluso encontraron una reducción de los niveles de SOD (Candelario-Jalil et al., 2001;

Rauca et al., 2004). Los modelos experimentales de epilepsia crónica mostraron tanto aumento (Freitas, 2009) como disminución (Bellissimo et al., 2001) de los niveles de SOD.

De forma similar a los trabajos realizados en modelos animales, los resultados de la actividad SOD encontrados en pacientes epilépticos en comparación con individuos no epilépticos son también contradictorios, describiendo aumento de la misma (Ben-Menachem et al. 2000;

Turkdogan et al., 2002; López et al., 2007; Ercegovac et al., 2010), disminución (Sudha et al., 2002; Günes et

al., 2009; Ogurno et al, 2013; Saad et al., 2014; Prasad et al., 2017) o sin observar cambios significativos (Yuksel et al., 2001; Peker et al., 2009; Yis et al, 2009).

Nosotros no encontramos diferencias significativas en la actividad de SOD en el neocórtex de pacientes epilépticos en comparación con las muestras control. La actividad invariable de la SOD podría explicarse por una simultánea inducción y degradación de la SOD causada por el estrés oxidativo (Eraković et al., 2003) debido, por ejemplo, a la capacidad del H2O2 de inactivar la enzima (Marklund, 1984).

La catalasa es capaz de eliminar grandes cantidades de H2O2 muy rápidamente, siendo su nivel de expresion en el tejido cerebral más bajo que en otros órganos. Se encontró un aumento significativo de la actividad catalasa en el neocórtex de pacientes epilépticos, de forma consistente con los resultados obtenidos en modelos animales de epilepsia tanto aguda (Freitas et al., 2004, Freitas et al., 2005; Tejada et al., 2006; Xavier et al., 2007; Barros et al., 2007;

Devi et al., 2008) como crónica (Freitas, 2009). El notable aumento de la actividad catalasa puede interpretarse como una respuesta de la actividad enzimática antioxidante ante el incremento de la producción basal de radicales libres, gravemente nocivo para el tejido neuronal, y sugiere, además, que la eliminación de radicales libres puede estar involucrada en el daño neuronal inducido por las crisis epilépticas (Barros et al., 2007). En el mismo sentido, en dos estudios de epilepsia humana la actividad catalasa plasmática (López et al., 2007) o eritrocitaria (Sudha et al., 2002) estaba aumentada en pacientes epilépticos en comparación con sujetos control no epilépticos.

La glutatión peroxidasa (GPx) es una enzima antioxidante muy eficaz en la destrucción de pequeñas cantidades de H2O2. Los resultados en pacientes con epilepsia mostraron una disminución significativa de los niveles de GPx (Sudha et al., 2002; López et al., 2007; Ogurno et al,

2013, Saad et al., 2014), lo que podría ser el resultado de una mayor inactivación o degradación proteica (Eraković et al., 2000). Por el contrario, dos trabajos describieron un aumento de la actividad GPx en pacientes epilépticos (Günes et al., 2009; Ercegovac et al., 2010). Los hallazgos en animales de experimentación para la GPx son también contradictorios, sin ninguna alteración (Bruce y Baudry, 1995; Cheng et al., 2004; Tejada et al., 2006), encontrando disminución (Eraković et al., 2000, Eraković et al., 2003; Rajasekaran, 2005) o aumento (Gilberti y Trombetta, 2000;

Bellissimo et al., 2001; Cheng et al., 2004; Rajasekaran, 2005; Liang y Patel, 2006; Tejada et al., 2006).

Con relación a la actividad glutatión reductasa (GR), se ha descrito una disminución en modelos animales de epilepsia (Liang y Patel, 2006; Waldbaum y Patel, 2010) y en pacientes epilépticos (Sudha et al., 2002). Nuestros hallazgos sugieren que el sistema GPx-GR desempeña un papel menor como sistema de eliminación de radicales libres en la corteza epiléptica humana, pero lo suficientemente importante para mantener el glutatión en estado reducido (Tejada et al., 2006).

El hallazgo de un aumento de la actividad catalasa y una simultánea disminución de la GPx apoya la idea de que el equilibrio entre la actividad enzimática antioxidante (SOD y catalasa) y la actividad oxidante de la GPx es más importante que la cantidad absoluta de las enzimas individuales, en lo que se refiere a la sensibilidad a los radicales libres (Eraković et al., 2000).

Con respecto a la peroxidación lipídica, se encontraron niveles similares de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) en muestras y controles epilépticos. En los modelos animales de crisis epilépticas inducidas por ácido kaínico y pilocarpina, se describió un aumento de los niveles de TBARS a las 12-14 horas de la administración, disminuyendo más tarde hasta volver a niveles basales. Esta “normalización” puede sugerir un hipometabolismo, una pérdida neuronal y/o la presencia de mecanismos compensatorios que pueden modular la actividad de enzimas relacionadas con el catabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) (Gilberti y Trombetta, 2000; Dal-Pizzol et al., 2000; Waldbaum y Patel, 2010). En los estudios revisados de epilepsia humana que analizaban los niveles plasmáticos de malondialdehído (MDA) se observaron, en la mayoría de ellos, incrementos significativos de este producto de la peroxidación lipídica en pacientes epilépticos (Turkdogan et al., 2002; López et al., 2007; Verrotti

et al., 2008; Günes et al., 2009; Menon et al., 2012; Ogurno et al, 2013; Prasad et al., 2017; Saad et al., 2014;

Sudha et al., 2002; Araújo et al., 2018).

En cuanto a la oxidación del ADN, encontramos un aumento muy significativo en los niveles de la 8-oxo-dG en pacientes con epilepsia en comparación con los sujetos control. Se han observado resultados similares en modelos de epilepsia aguda y crónica (Liang et al., 2000; Patel

y Li, 2003).

El “status epilepticus” agudo causa un aumento del daño oxidativo al ADN mitocondrial, junto con la producción mitocondrial de H2O2, la activación de la vía de reparación del ADN mitocondrial (mtBER) y la disminución transitoria de la capacidad mitocondrial de reparación del ADN. El daño al ADN mitocondrial se ha observado en modelos experimentales inmediatamente después del “status epilepticus”, seguido por una recuperación durante el “período de latencia” de baja probabilidad de crisis y, posteriomente, la exacerbación del daño al ADN durante la fase crónica de la epilepsia, cuando las crisis son más frecuentes.

Las crisis recurrentes asociadas con la fase crónica de la epilepsia se relacionaban con la producción de ROS mitocondriales, como demuestra el aumento de los niveles de H2O2 y de O2

–, la acumulación de daño al ADN mitocondrial, resultado de la ausencia de respuesta de la vía mtBER, y la alteración de la capacidad de reparación del ADN mitocondrial. Las crisis motoras espontáneas ocurrían al mismo tiempo que la reaparición del daño al ADN mitocondrial (Jarrett et al., 2008). Niveles elevados de H2O2 y O2

– pueden desencadenar la reacción de Haber-Weiss y, como resultado, la producción de especies altamente reactivas del radical hidroxilo. Este radical tiene una gran afinidad por la guanina del ADN, lo que incrementa la formación de la 8-oxo-dG (Halliwell y Gutteridge, 2007).

68 69

CO

NC

LUSI

ON

ESD

ISCU

SIÓN

Nuestros resultados apoyan la asociación entre la oxidación del ADN (por una producción sostenida de ROS) y las crisis crónicas en la epilepsia humana. Ercegovac y colaboradores describieron resultados similares con niveles aumentados de la 8-OHdG, un importante marcador de daño oxidativo al ADN, en la orina de pacientes epilépticos (Ercegovac et al., 2010).

En resumen, los datos obtenidos concuerdan con los encontrados en modelos animales de epilepsia y sugieren de forma importante que el estrés oxidativo puede ser un fenómeno clave en la epilepsia humana. Asimismo, demuestran un significativo aumento de los niveles de eicosanoides derivados de la ruta de la ciclooxigenasa en muestras neocorticales de pacientes epilépticos resistentes a fármacos. Además, los niveles indetectables de eicosanoides derivados de la ruta de la lipoxigenasa indican que la vía COX es predominante en el neocórtex de pacientes con epilepsia resistente a los medicamentos antiepilépticos habituales.

Estos hallazgos podría indicar la posibilidad de nuevas estrategias en el tratamiento de la epilepsia dirigidas a modificar el curso de la enfermedad, más alla de los tratamientos médicos actuales, los cuáles en su mayoría son sintomáticos en cuanto que anticonvulsivantes, y no propiamente antiepilépticos o anti-epileptogénicos.

7. CONCLUSIONES

Por los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral, podemos llegar a las siguientes conclusiones:

1. El marcado incremento de los niveles de prostaglandinas y tromboxano en pacientes tratados mediante cirugía confirma la presencia de neuroinflamación mediada por eicosanoides en el cerebro de pacientes con epilepsia.

2. El aumento de los marcadores de estrés oxidativo a nivel cerebral, junto con el aumento de la peroxidación lipídica y la oxidación del ADN, corroboran un estado de estrés oxidativo sostenido en la epilepsia humana.

3. La relación entre la frecuencia de crisis epilépticas focales de los pacientes y sus niveles neocorticales de Tromboxano A2 y de Prostacilclina, indica cierto grado de proporcionalidad entre la gravedad de la epilepsia y el daño neural asociado.

4. La coincidencia de los hallazgos en el cerebro humano con epilepsia establecida valida los resultados obtenidos en los modelos experimentales, pese a sus disparidades metodológicas.

5. La inhibición selectiva de la síntesis o de los receptores de prostanoides, y los tratamientos dirigidos a restablecer el equilibrio oxidativo cerebral podrían ser nuevas líneas de investigación terapéutica en la epilepsia.

70 71

BIB

LIO

GR

AFÍ

AB

IBLIO

GR

AFÍA

8. BIBLIOGRAFÍA

Aguiar CC, Almeida AB, Araújo PV, de Abreu RN, Chaves EM, do Vale OC, Macêdo DS, Woods DJ, Fonteles MM,

Vasconcelos SM. (2012). Oxidative stress and epilepsy: literature review. Oxid Med Cell Longev. 2012:795259.

Ahmedov ML, Kemerdere R, Baran O, Inal BB, Gumus A, Coskun C, Yeni SN, Eren B, Uzan M, Tanriverdi T.

(2017). Tissue Expressions of Soluble Human Epoxide Hydrolase-2 Enzyme in Patients with Temporal Lobe

Epilepsy. World Neurosurg. 106:46-50.

Alapirtti T, Rinta S, Hulkkonen J, Mäkinen R, Keränen T, Peltola J. (2009). Interleukin-6, interleukin-1 receptor

antagonist and interleukin-1beta production in patients with focal epilepsy: A video-EEG study. J Neurol Sci.

280(1-2):94-97.

Anyanwu C, Motamedi GK. (2018). Diagnosis and Surgical Treatment of Drug-Resistant Epilepsy. Brain Sci.

8(4):E49.

Arhan E, Serdaroglu A, Ozturk B, Ozturk HS, Ozcelik A, Kurt N, Kutsal E, Sevinc N. (2011). Effects of epilepsy

and antiepileptic drugs on nitric oxide, lipid peroxidation and xanthine oxidase system in children with

idiopathic epilepsy. Seizure. 20(2):138-142.

Aronica E, Gorter JA. (2007). Gene expression profile in temporal lobe epilepsy. Neuroscientist. 13(2):100-108.

Asadi-Pooya AA, Rostami C. (2017). History of surgery for temporal lobe epilepsy. Epilepsy Behav. 70(Pt A):57-60.

Baik EJ, Kim EJ, Lee SH, Moon C. (1999). Cyclooxygenase-2 selective inhibitors aggravate kainic acid induced

seizure and neuronal cell death in the hippocampus. Brain Res. 843(1-2):118-129.

Balosso S, Ravizza T, Perego C, Peschon J, Campbell IL, De Simoni MG, Vezzani A. (2005). Tumor necrosis

factor-alpha inhibits seizures in mice via p75 receptors. Ann Neurol. 57(6):804-812.

Baran H, Heldt R, Hertting G. (1987). Increased prostaglandin formation in rat brain following systemic

application of kainic acid. Brain Res. 404(1-2):107-112.

Baran H, Vass K, Lassmann H, Hornykiewicz O. (1994). The cyclooxygenase and lipoxygenase inhibitor

BW755C protects rats against kainic acid-induced seizures and neurotoxicity. Brain Res. 646(2):201-206.

Barnham KJ, Masters CL, Bush AI. (2004). Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug

Discov. 3(3):205-214.

Baron M, Kudin AP, Kunz WS. (2007). Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disorders. Biochem

Soc Trans. 35(Pt 5):1228-1231.

Barrero-Hernández FJ, Muñuzuri-Sanz D, Casado-Torres A. (2003). A descriptive study of intrahospital

neurology service consultations. Rev Neurol. 36(11):1001-1004.

Barros DO, Xavier SM, Barbosa CO, Silva RF, Freitas RL, Maia FD, Oliveira AA, Freitas RM, Takahashi RN.

(2007). Effects of the vitamin E in catalase activities in hippocampus after status epilepticus induced by

pilocarpine in Wistar rats. Neurosci Lett. 416(3):227-230.

Bashkatova V, Narkevich V, Vitskova G, Vanin A. (2003). The influence of anticonvulsant and antioxidant

drugs on nitric oxide level and lipid peroxidation in the rat brain during penthylenetetrazole-induced

epileptiform model seizures. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 27(3):487-492.

Bazan NG, Birkle DL, Tang W, Reddy TS. (1986). The accumulation of free arachidonic acid, diacylglycerols,

prostaglandins, and lipoxygenase reaction products in the brain during experimental epilepsy. Adv Neurol.

44:879-902.

Bazan NG. (1971). Changes in free fatty acids of brain by drug-induced convulsions, electroshock and

anesthesia. J Neurochem. 18(8):1379-1385.

Beghi E, Carpio A, Forsgren L, Hesdorffer DC, Malmgren K, Sander JW, Tomson T, Hauser WA. (2010).

Recommendation for a definition of acute symptomatic seizure. Epilepsia. 51(4):671-675.

Bellissimo MI, Amado D, Abdalla DS, Ferreira EC, Cavalheiro EA, Naffah-Mazzacoratti MG. (2001). Superoxide

dismutase, glutathione peroxidase activities and the hydroperoxide concentration are modified in the

hippocampus of epileptic rats. Epilepsy Res. 46(2):121-128.

Ben-Ari Y. (1985). Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid: mechanisms and relevance to

human temporal lobe epilepsy. Neuroscience. 14(2):375-403.

Ben-Menachem E, Kyllerman M, Marklund S. (2000). Superoxide dismutase and glutathione peroxidase

function in progressive myoclonus epilepsies. Epilepsy Res. 40(1):33-39.

Berg AT, Shinnar S. (1991). The risk of seizure recurrence following a first unprovoked seizure: a quantitative

review. Neurology. 41(7):965-972.

Bergendi L, Benes L, Duracková Z, Ferencik M. (1999). Chemistry, physiology and pathology of free radicals.

Life Sci. 65(18-19):1865-1874.

Bhalla D, Godet B, Druet-Cabanac M, Preux PM. (2011). Etiologies of epilepsy: a comprehensive review.

Expert Rev. Neurother. 11(6): 861-876.

Bidmon HJ, Görg B, Palomero-Gallagher N, Behne F, Lahl R, Pannek HW, Speckmann EJ, Zilles K. (2004). Heat

shock protein-27 is upregulated in the temporal cortex of patients with epilepsy. Epilepsia. 45(12):1549-1559.

Birkle DL, Bazan NG. (1987). Effect of bicuculline-induced status epilepticus on prostaglandins and

hydroxyeicosatetraenoic acids in rat brain subcellular fractions. J Neurochem. 48(6):1768-1778.

Bladin PF. (2010). The threshold of the new epileptology: Dr Lennox at the London Congress, 1935. J Clin

Neurosci. 17(1):16-21.

72 73

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Briggs DE, French JA. (2003). What makes epilepsy drug refractory? Expert Rev Neurother 3(1):127-131.

Bruce AJ, Baudry M. (1995). Oxygen free radicals in rat limbic structures after kainate-induced seizures. Free

Radic Biol Med. 18(6):993-1002.

Burke JE, Dennis EA. (2009). Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling. J Lipid Res. 50

Suppl:S237-242.

Camfield P, Camfield C. (2012). Unprovoked status epilepticus: the prognosis for otherwise normal children

with focal epilepsy. Pediatrics. 130(3):e501-e506.

Candelario-Jalil E, Al-Dalain SM, Castillo R, Martínez G, Fernández OS. (2001). Selective vulnerability to

kainate-induced oxidative damage in different rat brain regions. J Appl Toxicol. 21(5):403-407.

Carlioz A, Touati D. (1986). Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide

dismutase necessary for aerobic life? EMBO. 5(3):623-30.

Carr AC, McCall MR, Frei B. (2000). Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species:

reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20(7):1716-1723.

Carreño M, Bien C, Asadi-Pooya AA, Sperling M, Marusic P, Elisak M, Pimentel J, Wehner T, Mohanraj R,

Uranga J, Gómez-Ibáñez A, Villanueva V, Gil F, Donaire A, Bargalló N, Rumià J, Roldán P, Setoain X, Pintor L,

Boget T, Bailles E, Falip M, Aparicio J, Dalmau J, Graus F(2017). Epilepsy surgery in drug resistant temporal

lobe epilepsy associated with neuronal antibodies. Epilepsy Research. 129:101-105.

Chen C, Magee JC, Bazan NG. (2002). Cyclooxygenase-2 regulates prostaglandin E2 signaling in hippocampal

long-term synaptic plasticity. J Neurophysiol. 87(6):2851-2857.

Chen CM, Liu JL, Wu YR, Chen YC, Cheng HS, Cheng ML, Chiu DT. (2009). Increased oxidative damage in

peripheral blood correlates with severity of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 33(3):429-435.

Chen J, Marsh T, Zhang JS, Graham SH. (1995). Expression of cyclo-oxygenase 2 in rat brain following kainate

treatment. Neuroreport. 26;6(2):245-248.

Cheng H, Fu YS, Guo JW. (2004). Ability of GDNF to diminish free radical production leads to protection

against kainate-induced excitotoxicity in hippocampus. Hippocampus. 14(1):77-86.

Chin PS, Berg AT, Spencer SS, Lee ML, Shinnar S, Sperling MR, Langfitt JT, Walczak TS, Pacia SV, Bazil CW,

Vassar S, Vickrey BG. (2006). Patient-perceived impact of resective epilepsy surgery. Neurology. 66(12):1882-1887.

Chiueh CC. (1999). Neuroprotective properties of nitric oxide. Ann NY Acad Sci. 890():301-311.

Choi J, Nordli DR Jr, Alden TD, DiPatri A Jr, Laux L, Kelley K, Rosenow J, Schuele SU, Rajaram V, Koh S. (2009).

Cellular injury and neuroinflammation in children with chronic intractable epilepsy. J Neuroinflammation. 6:38.

Chuang YC, Chen SD, Liou CW, Lin TK, Chang WN, Chan SH, Chang AY (2009). Contribution of nitric oxide,

superoxide anion, and peroxynitrite to activation of mitochondrial apoptotic signaling in hippocampal CA3

subfield following experimental temporal lobe status epilepticus. Epilepsia. 50(4):731-746.

Ciceri P, Zhang Y, Shaffer AF, Leahy KM, Woerner MB, Smith WG, Seibert K, Isakson PC. (2002). Pharmacology

of celecoxib in rat brain after kainate administration. J Pharmacol Exp Ther. 302(3):846-852.

Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy. (1981). Proposal

for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures. 22(4):489-501.

Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy. (1985) Proposal

for classification of epilepsies and epileptic syndromes. Epilepsia. 26(3):268-278.

Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy. (1989). Proposal

for revised classification of epilepsies and epileptic syndromes. Epilepsia. 30(4):389-399.

Commission on Epidemiology and Prognosis, International League Against Epilepsy. (1993). Guidelines for

epidemiologic studies on epilepsy. Epilepsia. 34:592-596.

Costello DJ, Delanty N. (2004). Oxidative injury in epilepsy: potential for antioxidant therapy? Expert Rev

Neurother. 4(3):541-553.

Crespel A, Coubes P, Rousset MC, Brana C, Rougier A, Rondouin G, Bockaert J, Baldy-Moulinier M, Lerner-

Natoli M. (2002). Inflammatory reactions in human medial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis.

Brain Res. 952(2):159-169.

Cross JH, Arzimanoglou A, Kahane P, Holthausen H, Mathern G, Gaillard WD, Jayakar P. (2018) Epilepsy

surgery in children: Time is critical, en Arzimanoglou A, Cross JH, Gaillard WD, Holthausen H, Jayakar P,

Kahane P, Mathern G (editores), Pediatric Epilepsy Surgery, Montrouge, Francia. Éditions John Libbey

Eurotext. XIX-XXII.

Dailey JW, Reigel CE, Mishra PK, Jobe PC. (1989). Neurobiology of seizure predisposition in the genetically

epilepsy-prone rat. Epilepsy Res. 3(1):3-17.

Dalby NO, Mody I. (2001). The process of epileptogenesis: a pathophysiological approach. Curr Opin Neurol.

14(2):187-192.

Dal-Pizzol F, Klamt F, Vianna MM, Schröder N, Quevedo J, Benfato MS, Moreira JC, Walz R. (2000). Lipid

peroxidation in hippocampus early and late after status epilepticus induced by pilocarpine or kainic acid in

Wistar rats. Neurosci Lett. 291(3):179-182

D’Autréaux B, Toledano MB. (2007). ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS

homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(10):813-824.

Davies NM, Good RL, Roupe KA, Yáñez JA. (2004). Cyclooxygenase-3: axiom, dogma, anomaly, enigma or

splice error? Not as easy as 1, 2, 3. J Pharm Pharm Sci. 7(2):217-226.

De Araújo Filho GM, Martins DP, Lopes AM, de Jesus Brait B, Furlan AER, Oliveira CIF, Marques LHN, Souza

DRS, de Almeida EA. (2018). Oxidative stress in patients with refractory temporal lobe epilepsy and mesial

temporal sclerosis: Possible association with major depressive disorder? Epilepsy Behav. 80:191-196.

De Sarro G, Russo E, Ferreri G, Giuseppe B, Flocco MA, Di Paola ED, De Sarro A. (2004). Seizure susceptibility

to various convulsant stimuli of knockout interleukin-6 mice. Pharmacol Biochem Behav. 77(4):761-76.

74 75

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Dennis EA, Norris PC. (2015). Eicosanoid storm in infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 15(8):511-523.

Desjardins P, Sauvageau A, Bouthillier A, Navarro D, Hazell AS, Rose C, Butterworth RF. (2003). Induction of

astrocytic cyclooxygenase-2 in epileptic patients with hippocampal sclerosis. Neurochem Int. 42(4):299-303.

Devi PU, Manocha A, Vohora D. (2008). Seizures, antiepileptics, antioxidants and oxidative stress: an insight

for researchers. Expert Opin Pharmacother. 9(18):3169-3177.

Dhir A, Naidu PS, Kulkarni SK. (2006a). Effect of rofecoxib, a cyclo-oxygenase-2 inhibitor, on various

biochemical parameters of brain associated with pentylenetetrazol-induced chemical kindling in mice.

Fundam Clin Pharmacol. 20(3):255-261.

Dhir A, Naidu PS, Kulkarni SK. (2006b). Effect of cyclooxygenase inhibitors on pentylenetetrazol (PTZ)-induced

convulsions: Possible mechanism of action. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 30(8):1478-1485.

Dönmezdil N, Çevik MU, Özdemir HH, Taşin M. (2016). Investigation of PON1 activity and MDA levels in

patients with epilepsy not receiving antiepileptic treatment. Neuropsychiatr Dis Treat. 12:1013-1017.

Egg D, Herold M, Rumpl E, Günther R. (1980). Prostaglandin F2 alpha levels in human cerebrospinal fluid in

normal and pathological conditions. J Neurol. 222(4):239-248.

Elices E, Rumià J, Cañizares S, Boget T, Setoain J, Pintor L, Bargalló N, Ribalta T, Arroyo S. (2002). Resultados

de la cirugía de la epilepsia en un centro de referencia. Rev Neurol. 35:635-639.

Emerit J, Edeas M, Bricaire F. (2004). Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Biomed Pharmacother.

58(1):39-46.

Engel J Jr. (1996). Surgery for seizures. N Engl J Med. 334(10):647-652.

Engel J Jr. (2006). Report of the ILAE classification core group. Epilepsia. 47(9):1558-1568.

ErakovićV, Zupan G, Varljen J, Laginja J, Simonić A. (2000). Lithium plus pilocarpine induced status epilepticus-

-biochemical changes. Neurosci Res. 36(2):157-166.

Eraković V, Zupan G, Varljen J, Simonić A. (2003). Pentylenetetrazol-induced seizures and kindling: changes

in free fatty acids, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activity. Neurochem Int. 42(2):173-178.

Ercegovac M, Jovic N, Simic T, Beslac-Bumbasirevic L, Sokic D, Djukic T, Savic-Radojevic A, Matic M, Mimic-

Oka J, Pljesa-Ercegovac M. (2010). Byproducts of protein, lipid and DNA oxidative damage and antioxidant

enzyme activities in seizure. Seizure. 19(4):205-210.

Farooqui AA, Yi Ong W, Lu XR, Halliwell B, Horrocks LA. (2001). Neurochemical consequences of kainate-

induced toxicity in brain: involvement of arachidonic acid release and prevention of toxicity by phospholipase

A(2) inhibitors. Brain Res Brain Res Rev. 38(1-2):61-78.

Felton EA, Cervenka MC. (2015). Dietary therapy is the best option for refractory nonsurgical epilepsy.

Epilepsia 56(9):1325-1329.

Ferrer I, Martinez A, Boluda S, Parchi P, Barrachina M. (2008). Brain banks: benefits, limitations and cautions

concerning the use of post-mortem brain tissue for molecular studies. Cell Tissue Bank. 9(3):181-194.

Ferriero DM. (2005). Protecting neurons. Epilepsia. 46(Suppl 7):45-51.

Fiala M, Avagyan H, Merino JJ, Bernas M, Valdivia J, Espinosa-Jeffrey A, Witte M, Weinand M. (2013).

Chemotactic and mitogenic stimuli of neuronal apoptosis in patients with medically intractable temporal

lobe epilepsy. Pathophysiology. 20(1):59-69.

Fisher RS, Acevedo C, Arzimanoglou A, Bogacz A, Cross H, Elger CE, Engel Jr J, Forsgren L, French JA, Glynn

M, Hesdorffer DC, Lee BI, Mathern GW, Moshé SL, Perucca E, Scheffer IE, Tomson T, Watanabe W, Wiebe S.

(2014). A practical clinical definition of epilepsy. Epilepsia. 55(4):475-482.

Fisher RS, Cross JH, French JA, Higurashi N, Hirsch E, Jansen FE, Lagae L, Moshé SL, Peltola J, Roulet Perez E,

Scheffer IE, Zuberi SM. (2017). Operational classification of seizure types by the International League Against

Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58(4):522-530.

Fisher RS, Leppik I. (2008). Debate: When does a seizure imply epilepsy? Epilepsia. 49 Suppl 9:7-12.

Fisher RS, van Emde Boas W, Blume W, Elger C, Genton P, Lee P, Engel J Jr. (2005). Epileptic seizures and

epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International

Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46(4):470-472.

Ford-Hutchinson AW, Bray MA, Doig MV, Shipley ME, Smith MJ. (1980). Leukotriene B, a potent chemokinetic

and aggregating substance released from polymorphonuclear leukocytes. Nature. 286(5770):264-265.

Frantseva MV, Velazquez JL, Hwang PA, Carlen PL. (2000). Free radical production correlates with cell death

in an in vitro model of epilepsy. Eur J Neurosci. 12(4):1431-1439.

Freitas RM, Sousa FC, Vasconcelos SM, Viana GS, Fonteles MM. (2004). Pilocarpine-induced status epilepticus

in rats: lipid peroxidation level, nitrite formation, GABAergic and glutamatergic receptor alterations in the

hippocampus, striatum and frontal cortex. Pharmacol Biochem Behav. 78(2):327-332.

Freitas RM, Vasconcelos SM, Souza FC, Viana GS, Fonteles MM. (2005). Oxidative stress in the hippocampus

after pilocarpine-induced status epilepticus in Wistar rats. FEBS J. 272(6):1307-1312.

Freitas RM. (2009). Investigation of oxidative stress involvement in hippocampus in epilepsy model induced

by pilocarpine. Neurosci Lett. 462(3):225-229.

French JA. (2006). Refractory epilepsy: one size does not fit all. Epilepsy Curr. 6(6):177-80.

French JA. (2007). Refractory epilepsy: clinical overview. Epilepsia. 48(Suppl 1):3-7.

Funk CD. (2001). Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294(5548):1871-1875.

Galasko D, Montine TJ. (2010). Biomarkers of oxidative damage and inflammation in Alzheimer’s disease.

Biomark Med. 4(1):27-36.

García-Ramos R, García Pastor A, Masjuan J, Sánchez C, Gilbe A. (2011). FEEN: Informe sociosantario FEEN

sobre la epilepsia en España. Neurología. 26(9):548-555.

García-Ramos R, Moreno T, Camacho A, Gonzalez V, Bermejo F. (2003). Neurological emergencies in a

university hospital. Neurologia. 18:431-438.

76 77

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Ghafourifar P, Cadenas E. (2005). Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26(4):190-195.

Gilberti EA, Trombetta LD. (2000). The relationship between stress protein induction and the oxidative

defense system in the rat hippocampus following kainic acid administration. Toxicol Lett. 116(1-2):17-26.

Grosso S, Longini M, Rodriguez A, Proietti F, Piccini B, Balestri P, Buonocore G. (2011). Oxidative stress in

children affected by epileptic encephalopathies. J Neurol Sci. 300(1-2):103-106.

Grupo de Cirugía Funcional de la Sociedad Española de Neurocirugía (SENEC). (2009). Guías clínicas para la

cirugía de la epilepsia y de los trastornos del movimiento. Neurocirugía. 20(4):329-334.

Gulumian M, van Wyk JA. (1987). Hydroxyl radical production in the presence of fibres by a Fenton-type

reaction. Chem Biol Interact. 62(1):89-97.

Güneş S, Dirik E, Yiş U, Seçkin E, Kuralay F, Köse S, Unalp A. (2009). Oxidant status in children after febrile

seizures. Pediatr Neurol. 40(1):47-49.

Halliwell B. (1996). Free radicals, proteins and DNA: oxidative damage versus redox regulation. Biochem Soc

Trans. 24(4):1023-1027.

Halliwell B y Gutteridge JMC. (2007) Free Radicals in Biology and Medicine. 4th Edition, Oxford University

Press, Oxford, 230-240.

Harman D. (1956). Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol. 11(3):298-300.

Harman D. (1972). The biologic clock: the mitochondria? J Am Geriatr Soc. 20(4):145-147.

Hauser WA, Rich SS, Lee JR, Annegers JF, Anderson VE. (1998). Risk of recurrent seizures after two unprovoked

seizures. N Engl J Med. 338(7):429-434.

Hecker M, Ullrich V. (1989). On the mechanism of prostacyclin and thromboxane A2 biosynthesis. J Biol

Chem. 264(1):141-150.

Henshall DC, Clark RS, Adelson PD, Chen M, Watkins SC, Simon RP. (2000). Alterations in bcl-2 and caspase

gene family protein expression in human temporal lobe epilepsy. Neurology. 55(2):250-257.

Hirao H, Kumar D, Thiel W, Shaik S. (2005). Two states and two more in the mechanisms of hydroxylation and

epoxidation by cytochrome P450. J Am Chem Soc. 127(37):13007-13018.

Hirvonen J, Kreisl WC, Fujita M, Dustin I, Khan O, Appel S, Zhang Y, Morse C, Pike VW, Innis RB, Theodore

WH. (2012). Increased in vivo expression of an inflammatory marker in temporal lobe epilepsy. J Nucl Med.

53(2):234-240.

Ho L, Osaka H, Aisen PS, Pasinetti GM. (1998). Induction of cyclooxygenase (COX)-2 but not COX-1 gene

expression in apoptotic cell death. J Neuroimmunol. 89(1-2):142-9.

Holmström KM, Finkel T. (2014). Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent

signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15(6):411-421.

Huang H, Zhou H, Wang N. (2015). Recent Advances in Epilepsy Management. Cell Biochem Biophys. 73(1):7-10.

Jacoby A, Gamble C, Doughty J, Marson A, Chadwick D; Medical Research Council MESS Study Group. (2007).

Quality of life outcomes of immediate or delayed treatment of early epilepsy and single seizures. Neurology.

68(15):1188-1196.

Jarrett SG, Liang LP, Hellier JL, Staley KJ, Patel M. (2008). Mitochondrial DNA damage and impaired base

excision repair during epileptogenesis. Neurobiol Dis. 30(1):130-138.

Johnson WM, Wilson-Delfosse AL, Mieyal JJ. (2012). Dysregulation of glutathione homeostasis in

neurodegenerative diseases. Nutrients. 4(10):1399-1440.

Jung KH, Chu K, Lee ST, Kim J, Sinn DI, Kim JM, Park DK, Lee JJ, Kim SU, Kim M, Lee SK, Roh JK. (2006).

Cyclooxygenase-2 inhibitor, celecoxib, inhibits the altered hippocampal neurogenesis with attenuation of

spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus. Neurobiol Dis. 23(2):237-246.

Kajiwara K, Nagawawa H, Shimizu-Nishikawa S, Ookuri T, Kimura M, Sugaya E. (1996). Molecular

characterization of seizure-related genes isolated by differential screening. Biochem Biophys Res Commun.

219(3):795-799.

Kan AA, de Jager W, de Wit M, Heijnen C, van Zuiden M, Ferrier C, van Rijen P, Gosselaar P, Hessel E, van

Nieuwenhuizen O, de Graan PN. (2012). Protein expression profiling of inflammatory mediators in human

temporal lobe epilepsy reveals co-activation of multiple chemokines and cytokines. J Neuroinflammation. 9:207.

Katsuyama M, Sugimoto Y, Namba T, Irie A, Negishi M, Narumiya S, Ichikawa A. (1994). Cloning and expression

of a cDNA for the human prostacyclin receptor. FEBS Lett. 344(1):74-78.

Kawaguchi K, Hickey RW, Rose ME, Zhu L, Chen J, Graham SH. (2005). Cyclooxygenase-2 expression is induced

in rat brain after kainate-induced seizures and promotes neuronal death in CA3 hippocampus. Brain Res.

1050(1-2):130-137.

Kawai N, Miyake K, Kuroda Y, Yamashita S, Nishiyama Y, Monden T, Sasakawa Y, Nagao S. (2006). Magnetic

resonance imaging and positron emission tomography findings in status epilepticus following severe

hypoglycemia. Ann Nucl Med. 20(5):371-376.

≠Kelley KA, Ho L, Winger D, Freire-Moar J, Borelli CB, Aisen PS, Pasinetti GM. (1999). Potentiation of

excitotoxicity in transgenic mice overexpressing neuronal cyclooxygenase-2. Am J Pathol. 155(3):995-1004.

Kilany A, Raouf ER, Gaber AA, Aloush TK, Aref HA, Anwar M, Henshall DC, Abdulghani MO. (2012). Elevated

serum Bcl-2 in children with temporal lobe epilepsy. Seizure. 21(4):250-253.

Kim HC, Jhoo WK, Bing G, Shin EJ, Wie MB, Kim WK, Ko KH. (2000). Phenidone prevents kainate-induced

neurotoxicity via antioxidant mechanisms. Brain Res. Aug 18; 874(1):15-23.

Kis B, Snipes A, Bari F, Busija DW. (2004). Regional distribution of cyclooxygenase-3 mRNA in the rat central

nervous system. Brain Res Mol Brain Res. 126(1):78-80.

Koeberle A, Werz O2. (2018). Natural products as inhibitors of prostaglandin E2 and pro-inflammatory

5-lipoxygenase-derived lipid mediator biosynthesis. Biotechnol Adv. pii: S0734-9750(18)30026-0.

78 79

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Kojo H, Fukagawa M, Tajima K, Suzuki A, Fujimura T, Aramori I, Hayashi K, Nishimura S. (2003). Evaluation

of human peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) subtype selectivity of a variety of anti-

inflammatory drugs based on a novel assay for PPAR delta(beta). J Pharmacol Sci. 93(3):347-355.

Kojo S. (2004). Vitamin C: basic metabolism and its function as an index of oxidative stress. Curr Med Chem.

11(8):1041-1064.

Kokoszka JE, Coskun P, Esposito LA, Wallace DC. (2001). Increased mitochondrial oxidative stress in the Sod2

(+/-) mouse results in the age-related decline of mitochondrial function culminating in increased apoptosis.

Proc Natl Acad Sci U S A. 98(5):2278-2283.

Kudin AP, Zsurka G, Elger CE, Kunz WS. (2009). Mitochondrial involvement in temporal lobe epilepsy. Exp

Neurol. 218(2):326-332.

Kulkarni SK, Dhir A. (2009). Cyclooxygenase in epilepsy: from perception to application. Drugs Today (Barc).

45(2):135-154.

Kunz T, Oliw EH. (2001a). The selective cyclooxygenase-2 inhibitor rofecoxib reduces kainate-induced cell

death in the rat hippocampus. Eur J Neurosci. 13(3):569-575.

Kunz T, Oliw EH. (2001b). Nimesulide aggravates kainic acid-induced seizures in the rat. Pharmacol Toxicol.

88(5):271-276.

Kwan P, Arzimanoglou A, Berg AT, Brodie MJ, Allen Hauser W, Mathern G, Moshé SL, Perucca E, Wiebe,

French J. (2010). Definition of drug resistant epilepsy: consensus proposal by the ad hoc task force of the ILAE

Commission on therapeutic strategies. Epilepsia. 51(6):1069-1077.

Kwan P, Brodie MJ. (2000). Early identification of refractory epilepsy. N Engl J Med. 342(5):314-319.

Kwan P, Brodie MJ. (2002). Refractory epilepsy: a progressive, intractable but preventable condition? Seizure.

11(2):77-84.

Kwan P, Brodie MJ. (2006). Refractory epilepsy: mechanisms and solutions. Expert Rev Neurother. 6(3):397-406.

Kwan P, Sander J. (2004). The natural history of epilepsy: an epidemiological view. J Neurol Neurosurg

Psychiatry. 75(10):1376-1381.

Laxer KD, Trinka E, Hirsch LJ, Cendes F, Langfitt J, Delanty N, Resnick T, Benbadis SR. (2014). The consequences

of refractory epilepsy and its treatment. Epilepsy Behav. 37:59-70.

Leal B, Chaves J, Carvalho C, Rangel R, Santos A, Bettencourt A, Lopes J, Ramalheira J, Silva BM, da Silva AM,

Costa PP. (2017). Brain expression of inflammatory mediators in Mesial Temporal Lobe Epilepsy patients. J

Neuroimmunol. 313:82-88.

Lebovitz RM, Zhang H, Vogel H, Cartwright J Jr, Dionne L, Lu N, Huang S, Matzuk MM. (1996).

Neurodegeneration, myocardial injury, and perinatal death in mitochondrial superoxide dismutase-deficient

mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93(18):9782-9787.

Lehtimäki KA, Keränen T, Huhtala H, Hurme M, Ollikainen J, Honkaniemi J, Palmio J, Peltola J. (2004).

Regulation of IL-6 system in cerebrospinal fluid and serum compartments by seizures: the effect of seizure

type and duration. J Neuroimmunol. 152(1-2):121-125.

Leifke E, Seregi A, Heldt R, Hertting G. (1994). In vivo comparative study of the seizure- and ischemia-induced

synthesis of eicosanoids in the brain of gerbils. Arch Int Pharmacodyn Ther. 328(2):145-154.

Leone MA, Beghi E, Righini C, Apolone G, Mosconi P. (2005). Epilepsy and quality of life in adults: a review

of instruments. Epilepsy Res. 66(1-3):23-44.

Liang LP, Ho YS, Patel M. (2000). Mitochondrial superoxide production in kainate-induced hippocampal

damage. Neuroscience. 101(3):563-570.

Liang LP, Patel M. (2004). Mitochondrial oxidative stress and increased seizure susceptibility in Sod2(-/+) mice.

Free Radic Biol Med. 36(5):542-554.

Liang LP, Patel M. (2006). Seizure-induced changes in mitochondrial redox status. Free Radic Biol Med.

40(2):316-322.

Limón-Pacheco J, Gonsebatt ME. (2009). The role of antioxidants and antioxidant-related enzymes in

protective responses to environmentally induced oxidative stress. Mutat Res. 674(1-2):137-47.

López J, González ME, Lorigados L, Morales L, Riverón G, Bauzá JY. (2007). Oxidative stress markers in

surgically treated patients with refractory epilepsy. Clin Biochem. 40(5-6):292-298.

Löscher W, Siemes H. (1988). Increased concentration of prostaglandin E-2 in cerebrospinal fluid of children

with febrile convulsions. Epilepsia. 29(3):307-310.

Maes M, Galecki P, Chang YS, Berk M. (2011). A review on the oxidative and nitrosative stress (O&NS)

pathways in major depression and their possible contribution to the (neuro)degenerative processes in that

illness. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 29;35(3):676-692.

Marcheselli VL, Bazan NG. (1996). Sustained induction of prostaglandin endoperoxide synthase-2 by seizures

in hippocampus. Inhibition by a platelet-activating factor antagonist. J Biol Chem. 271(40):24794-24799.

Marcourakis T, Camarini R, Kawamoto EM, Scorsi LR, Scavone C. (2008). Peripheral biomarkers of oxidative

stress in aging and Alzheimer’s disease. Dement Neuropsychol. 2(1):2-8.

Markand ON, Salanova V, Whelihan E, Emsley CL. (2000). Health-related quality of life outcome in medically

refractory epilepsy treated with anterior temporal lobectomy. Epilepsia. 41(6):749-759.

Marklund SL. (1984). Properties of extracellular superoxide dismutase from human lung. Biochem J.

220(1):269-272.

Matsuo M, Hamasaki Y, Masuyama T, Ohta M, Miyazaki S. (1996). Leukotriene B4 and C4 in cerebrospinal

fluid from children with meningitis and febrile seizures. Pediatr Neurol. 14(2):121-124.

McGinley S, Centra M, Lysz TW. (1985). The effect of inhibiting brain thromboxane biosynthesis on

pentylenetetrazole-induced seizure threshold. J Neurosci Res. 13(4):563-567.

80 81

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Medina S, Miguel-Elízaga ID, Oger C, Galano JM, Durand T, Martínez-Villanueva M, Castillo ML, Villegas-Martínez

I, Ferreres F, Martínez-Hernández P, Gil-Izquierdo Á. (2015). Dihomo-isoprostanes-nonenzymatic metabolites

of AdA-are higher in epileptic patients compared to healthy individuals by a new ultrahigh pressure liquid

chromatography-triple quadrupole-tandem mass spectrometry method. Free Radic Biol Med. 79:154-163.

Meldrum BS. (1993). Excitotoxicity and selective neuronal loss in epilepsy. Brain Pathol. 3(4):405-412.

Menon B, Ramalingam K, Kumar RV. (2012). Oxidative stress in patients with epilepsy is independent of

antiepileptic drugs. Seizure. 21(10):780-784.

Més-Sesé G, Plaza-Macías I, González-Caballero G, Sola-Martínez D, Hernández-Hortelano E, Martín-Bautista

D, López-Hernández N, García-Quesada MA, Alom-Poveda J. (2006). An analysis of avoidable admissions to

a neurology service. Rev Neurol. 43(12):714-718.

Miao L, St Clair DK. (2009). Regulation of superoxide dismutase genes: implications in disease. Free Radic Biol

Med. 47(4):344-356.

Mohanraj R, Brodie MJ. (2013). Early predictors of outcome in newly diagnosed epilepsy. Seizure. 22(5):333-344.

Mueller SG, Trabesinger AH, Boesiger P, Wieser HG. (2001). Brain glutathione levels in patients with epilepsy

measured by in vivo (1)H-MRS. Neurology. 57(8):1422-1427.

Murphy RC, Gijón MA. (2007). Biosynthesis and metabolism of leukotrienes. Biochem J. 405(3):379-395.

Murphy RC, Hammarström S, Samuelsson B. (1979). Leukotriene C: a slow-reacting substance from murine

mastocytoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4275-4279.

Naffah-Mazzacoratti MG, Bellíssimo MI, Cavalheiro EA. (1995). Profile of prostaglandin levels in the rat

hippocampus in pilocarpine model of epilepsy. Neurochem Int. 27(6):461-466.

Nei M, Bagla R. (2007). Seizure-related injury and death. Curr Neurol Neurosci Rep. 7(4):335-341.

Ngugi AK, Kariuki SM, Bottomley C, Kleinschmidt I, Sander JW, Newton CR. (2011). Incidence of epilepsy: a

systematic review and meta-analysis. Neurology. 6;77(10):1005-1012.

Niki E. (1987). Antioxidants in relation to lipid peroxidation. Chem Phys Lipids. 44(2-4):227-253.

Ogunro PS, Mustapha AF, Salau AA. (2013). Lipid peroxidation and antioxidant status in patients with primary

generalized epilepsy. Archives of Applied Science Research. 5 (1):68-74.

Okada K, Yuhi T, Tsuji S, Yamashita U. (2001). Cyclooxygenase-2 expression in the hippocampus of genetically

epilepsy susceptible El mice was increased after seizure. Brain Res. 894(2):332-335.

Oliveira MS, Furian AF, Royes LF, Fighera MR, Fiorenza NG, Castelli M, Machado P, Bohrer D, Veiga M, Ferreira

J, Cavalheiro EA, Mello CF. (2008). Cyclooxygenase-2/PGE2 pathway facilitates pentylenetetrazol-induced

seizures. Epilepsy Res. 79(1):14-21.

Organización Mundial de la Salud. (2018). Epilepsia. Nota descriptiva. Disponible en http://www.who.int/es/

news-room/fact-sheets/detail/epilepsy

Park JY, Pillinger MH, Abramson SB. (2006). Prostaglandin E2 synthesis and secretion: the role of PGE2

synthases. Clin Immunol. 119(3):229-240.

Patel M, Li QY. (2003). Age dependence of seizure-induced oxidative stress. Neuroscience. 118(2):431-437.

Patel M. (2004). Mitochondrial dysfunction and oxidative stress: cause and consequence of epileptic seizures.

Free Radic Biol Med. 37(12):1951-1962.

Patsoukis N, Zervoudakis G, Panagopoulos NT, Georgiou CD, Angelatou F, Matsokis NA. (2004). Thiol redox

state (TRS) and oxidative stress in the mouse hippocampus after pentylenetetrazol-induced epileptic seizure.

Neurosci Lett. 357(2):83-6.

Pecorelli A, Natrella F, Belmonte G, Miracco C, Cervellati F, Ciccoli L, Mariottini A, Rocchi R, Vatti G, Bua A,

Canitano R, Hayek J, Forman HJ, Valacchi G. (2015). NADPH oxidase activation and 4-hydroxy-2-nonenal/

aquaporin-4 adducts as possible new players in oxidative neuronal damage presents in drug-resistant

epilepsy. Biochim Biophys Acta. 1852(3):507-519.

Peker E, Oktar S, Ari M, Kozan R, Doğan M, Cağan E, Söğüt S. (2009). Nitric oxide, lipid peroxidation, and

antioxidant enzyme levels in epileptic children using valproic acid. Brain Res. 1297:194-197.

Peltola J, Hurme M, Miettinen A, Keränen T. (1998). Elevated levels of interleukin-6 may occur in cerebrospinal

fluid from patients with recent epileptic seizures. Epilepsy Res. 31(2):129-133.

PenfieldW, Flanigin H. (1950). Surgical therapy of temporal lobe seizures. AMA Arch Neurol. Psychiatry.

64(4):491-500.

Peña P, Sancho J, Rufo M, Martínez S, Rejas J; LINCE Study Collaborative Group. (2009). Driving cost factors

in adult outpatients with refractory epilepsy: a daily clinical practice in clinics of neurology in Spain. Epilepsy

Res 83(2-3):133-143.

Perry MS, Duchowny M. (2013). Surgical versus medical treatment for refractory epilepsy: outcomes beyond

seizure control. Epilepsia. 54(12):2060-2070.

Phillis JW, Horrocks LA, Farooqui AA. (2006). Cyclooxygenases, lipoxygenases, and epoxygenases in CNS: their

role and involvement in neurological disorders. Brain Res Rev. 52(2):201-243.

Prasad DKV, Satyanarayana U, Shaheen U, Prabha TS, Munshi A. (2017). Oxidative Stress in the Development

of Genetic Generalised Epilepsy: An Observational Study in Southern Indian Population. J Clin Diagn Res.

11(9): BC05-BC08.

Quirico-Santos T, Meira ID, Gomes AC, Pereira VC, Pinto M, Monteiro M, Souza JM, Alves-Leon SV. (2013).

Resection of the epileptogenic lesion abolishes seizures and reduces inflammatory cytokines of patients with

temporal lobe epilepsy. J Neuroimmunol. 254(1-2):125-130.

Rahman I, Biswas SK, Kode A. (2006). Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases.

Eur J Pharmacol. 533(1-3):222-239.

Rajasekaran K. (2005). Seizure-induced oxidative stress in rat brain regions: blockade by nNOS inhibition.

Pharmacol Biochem Behav. 80(2):263-272.

82 83

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Rauca C, Wiswedel I, Zerbe R, Keilhoff G, Krug M. (2004). The role of superoxide dismutase and alpha-

tocopherol in the development of seizures and kindling induced by pentylenetetrazol - influence of the

radical scavenger alpha-phenyl-N-tert-butyl nitrone. Brain Res. 1009(1-2):203-212.

Ravizza T, Gagliardi B, Noé F, Boer K, Aronica E, Vezzani A. (2008). Innate and adaptive immunity during

epileptogenesis and spontaneous seizures: evidence from experimental models and human temporal lobe

epilepsy. Neurobiol Dis. 29(1):142-160.

Reid K, Herbert A, Baker GA. (2004). Epilepsy surgery: patient perceived long-term costs and benefits.

Epilepsy Behav. 5(1):81-87.

Riazi K, Galic MA, Pittman QJ. (2010). Contributions of peripheral inflammation to seizure susceptibility:

cytokines and brain excitability. Epilepsy Res. 89(1):34-42.

Ridnour LA, Thomas DD, Mancardi D, Espey MG, Miranda KM, Paolocci N, Feelisch M, Fukuto J, Wink DA.

(2004). The chemistry of nitrosative stress induced by nitric oxide and reactive nitrogen oxide species. Putting

perspective on stressful biological situations. Biol Chem. 385(1):1-10.

Rosenkranz RP, Killam KF Jr. (1978). Effects of prostacyclin and 6-keto PGF1alpha on electrically induced

convulsions in mice. Life Sci. 23(26):2609-2616.

Rouzer CA, Marnett LJ. (2009). Cyclooxygenases: structural and functional insights. J Lipid Res. 50 Suppl:S29-34.

Rowley S, Patel M. (2013). Mitochondrial involvement and oxidative stress in temporal lobe epilepsy. Free

Radic Biol Med. 62:121-131.

Saad K, Hammad E, Hassan AF, Badry R. (2014). Trace element, oxidant, and antioxidant enzyme values in

blood of children with refractory epilepsy. Int J Neurosci. 124(3):181-186.

Samland H, Huitron-Resendiz S, Masliah E, Criado J, Henriksen SJ, Campbell IL. (2003). Profound increase in

sensitivity to glutamatergic- but not cholinergic agonist-induced seizures in transgenic mice with astrocyte

production of IL-6. J Neurosci Res. 73(2):176-187.

Sandhya TL, Ong WY, Horrocks LA, Farooqui AA. (1998). A light and electron microscopic study of cytoplasmic

phospholipase A2 and cyclooxygenase-2 in the hippocampus after kainate lesions. Brain Res. 788(1-2):223-223.

Scheffer IE, Berkovic S, Capovilla G, Connolly MB, French J, Guilhoto L, Hirsch E, Jain S, Mathern GW, Moshé SL,

Nordli DR, Perucca E, Tomson T15, Wiebe S, Zhang YH, Zuberi SM. (2017). ILAE classification of the epilepsies:

Position paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58(4):512-521.

Schiller Y, Najjar Y. (2008). Quantifying the response to antiepileptic drugs: effect of past treatment history.

Neurology 70(1):54-65.

Schmidt D, Sillanpää M. (2012). Evidence-based review on the natural history of the epilepsies. Curr Opin

Neurol. 25(2):159-163.

Scoggan KA, Jakobsson PJ, Ford-Hutchinson AW. (1997). Production of leukotriene C4 in different human

tissues is attributable to distinct membrane bound biosynthetic enzymes. J Biol Chem. 272(15):10182-10187.

Shafiq N, Malhotra S, Pandhi P. (2003). nticonvulsant action of celecoxib (alone and in combination with

sub-threshold dose of phenytoin) in electroshock induced convulsion. Methods Find Exp Clin Pharmacol.

25(2):87-90.

Shin EJ, Jeong JH, Bing G, Park ES, Chae JS, Yen TP, Kim WK, Wie MB, Jung BD, Kim HJ, Lee SY, Kim HC. (2008a).

Kainate-induced mitochondrial oxidative stress contributes to hippocampal degeneration in senescence-

accelerated mice. Cell Signal. 20(4):645-658.

Shin EJ, Jeong JH, Chung YH, Kim WK, Ko KH, Bach JH, Hong JS, Yoneda Y, Kim HC. (2011). Role of oxidative

stress in epileptic seizures. Neurochem Int. 59(2):122-137.

Shin EJ, Ko KH, Kim WK, Chae JS, Yen TP, Kim HJ, Wie MB, Kim HC. (2008b). Role of glutathione peroxidase

in the ontogeny of hippocampal oxidative stress and kainate seizure sensitivity in the genetically epilepsy-

prone rats. Neurochem Int. May. 52(6):1134-1147.

Shorvon SD. (2005). Handbook of Epilepsy Treatment. Forms, Causes and Therapy in Children and Adults. 2nd

edition. London: Blackwell Publishing.

Shorvon SD. (2011). The causes of epilepsy: Changing concepts of etiology ofepilepsy over the past 150 years.

Epilepsia. 52(6):1033-1044.

Sillanpää M, Haataja L, Shinnar S. (2004). Perceived impact of childhood onset epilepsy on quality of life as

an adult. Epilepsia. 45(8):971-977.

Sillanpää M, Shinnar S. (2005). Obtaining a driver’s license and seizure relapse in patients with childhood-

onset epilepsy. Neurology. 64(4):680-686.

Simmet T, Peskar BA. (1990). Lipoxygenase products of polyunsaturated fatty acid metabolism in the central

nervous system: biosynthesis and putative functions. Pharmacol Res. 22(6):667-682.

Simmet T, Seregi A, Hertting G. (1987). Formation of sulphidopeptide-leukotrienes in brain tissue of

spontaneously convulsing gerbils. Neuropharmacology. 26(1):107-110.

Simmet T, Seregi A, Hertting G. (1988). Characterization of seizure-induced cysteinyl-leukotriene formation

in brain tissue of convulsion-prone gerbils. J Neurochem. 50(6):1738-1742

Simmet T, Tippler B. (1991). On the relation between cerebral cysteinyl-leukotriene formation and epileptic

seizures. Brain Res. 540(1-2):283-286.

Simmons DL, Botting RM, Hla T. (2004). Cyclooxygenase isozymes: the biology of prostaglandin synthesis and

inhibition. Pharmacol Rev. 56(3):387-437.

Sisodiya S. (2007). Etiology and management of refractory epilepsies. Nat Clin Pract Neurol. 3(6):320-330.

Spencer DD, Spencer SS, Mattson RH, Williamson PD, Novelly RA. (1984) Access to the posterior medial

temporal lobe structures in the surgical treatment of temporal lobe epilepsy. Neurosurgery. 15(5):667–671

Spencer SS, Berg AT, Vickrey BG, Sperling MR, Bazil CW, Haut S, Langfitt JT, Walczak TS, Devinsky O;

Multicenter Study of Epilepsy Surgery. (2007). Health-related quality of life over time since resective epilepsy

surgery. Ann Neurol. 62(4):327-334.

Stadtman ER. (2004). Role of oxidant species in aging. Curr Med Chem. 11(9):1105-1112.

84 85

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Steinhauer HB, Anhut H, Hertting G. (1979). The synthesis of prostaglandins and thromboxane in the mouse

brain in vivo. Influence of drug induced convulsions, hypoxia and the anticonvulsants trimethadione and

diazepam. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 310(1):53-58.

Strauss KI, Elisevich KV. (2016). Brain region and epilepsy-associated differences in inflammatory mediator

levels in medically refractory mesial temporal lobe epilepsy. J Neuroinflammation. 13(1):270.

Sudha K, Rao AV, Rao A. (2001). Oxidative stress and antioxidants in epilepsy. Clin Chim Acta. 303(1-2):19-24.

Tager AM, Dufour JH, Goodarzi K, Bercury SD, von Andrian UH, Luster AD. (2000). BLTR mediates leukotriene

B(4)-induced chemotaxis and adhesion and plays a dominant role in eosinophil accumulation in a murine

model of peritonitis. J Exp Med. 192(3):439-446.

Takemiya T, Maehara M, Matsumura K, Yasuda S, Sugiura H, Yamagata K. (2006). Prostaglandin E2 produced

by late induced COX-2 stimulates hippocampal neuron loss after seizure in the CA3 region. Neurosci Res.

56(1):103-110.

Takemiya T, Suzuki K, Sugiura H, Yasuda S, Yamagata K, Kawakami Y, Maru E. (2003). Inducible brain COX-

2 facilitates the recurrence of hippocampal seizures in mouse rapid kindling. Prostaglandins Other Lipid

Mediat. 71(3-4):205-216.

Tang F, Hartz AMS, Bauer B. (2017). Drug-Resistant Epilepsy: Multiple Hypotheses, Few Answers. Front

Neurol. 8:301.

Tang L, Reiter RJ, Li ZR, Ortiz GG, Yu BP, Garcia JJ. (1998). Melatonin reduces the increase in 8-hydroxy-

deoxyguanosine levels in the brain and liver of kainic acid-treated rats. Mol Cell Biochem. 178(1-2):299-303.

Tejada S, Roca C, Sureda A, Rial RV, Gamundí A, Esteban S. (2006). Antioxidant response analysis in the brain

after pilocarpine treatments. Brain Res Bull. 69(5):587-592.

Téllez-Zenteno JF, Dhar R, Hernandez-Ronquillo L, Wiebe S. (2007). Long-term outcomes in epilepsy surgery:

antiepileptic drugs, mortality, cognitive and psychosocial aspects. Brain. 130(Pt 2):334-345.

Teocchi MA, Ferreira AÉ, da Luz de Oliveira EP, Tedeschi H, D’Souza-Li L. (2013). Hippocampal gene expression

dysregulation of Klotho, nuclear factor kappa B and tumor necrosis factor in temporal lobe epilepsy patients.

J Neuroinflammation. 10:53.

Tocco G, Freire-Moar J, Schreiber SS, Sakhi SH, Aisen PS, Pasinetti GM. (1997). Maturational regulation

and regional induction of cyclooxygenase-2 in rat brain: implications for Alzheimer’s disease. Exp Neurol.

144(2):339-349.

Tomson T, Beghi E, Sundqvist A, Johannessen SI. (2004). Medical risks in epilepsy: a review with focus on

physical injuries, mortality, traffic accidents and their prevention. Epilepsy Res. 60(1):1-16.

Turkdogan D, Toplan S, Karakoc Y. (2002). Lipid peroxidation and antioxidative enzyme activities in childhood

epilepsy. J Child Neurol. 17(9):673-676.

Tütüncüoğlu S, Kütükçüler N, Kepe L, Coker C, Berdeli A, Tekgül H. (2001). Proinflammatory cytokines,

prostaglandins and zinc in febrile convulsions. Pediatr Int. 43(3):235-239.

Usui S, Komeima K, Lee SY, Jo YJ, Ueno S, Rogers BS, Wu Z, Shen J, Lu L, Oveson BC, Rabinovitch PS,

Campochiaro PA. (2009). Increased expression of catalase and superoxide dismutase 2 reduces cone cell

death in retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17(5):778-786.

Vaccarezza MM, Silva WH. (2015). Dietary therapy is not the best option for refractory nonsurgical epilepsy.

Epilepsia. 56(9):1330-1334.

Valavanidis A, Vlachogianni T, Fiotakis C. (2009). 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker

of oxidative stress and carcinogenesis. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 27(2):120-139.

Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. (2007). Free radicals and antioxidants in normal

physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39(1):44-84.

Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. (2006). Free radicals, metals and antioxidants in oxidative

stress-induced cancer. Chem Biol Interact. 160(1):1-40.

van Gassen KL, de Wit M, Koerkamp MJ, Rensen MG, van Rijen PC, Holstege FC, Lindhout D, de Graan PN.

(2008). Possible role of the innate immunity in temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49(6):1055-1065.

Verrotti A, Basciani F, Trotta D, Pomilio MP, Morgese G, Chiarelli F. (2002). Serum copper, zinc, selenium,

glutathione peroxidase and superoxide dismutase levels in epileptic children before and after 1 year of

sodium valproate and carbamazepine therapy. Epilepsy Res. 48(1-2):71-75.

Verrotti A, Scardapane A, Franzoni E, Manco R, Chiarelli F. (2008). Increased oxidative stress in epileptic

children treated with valproic acid. Epilepsy Res. 78(2-3):171-177.

Vezzani A, Aronica E, Mazarati A, Pittman QJ. (2013). Epilepsy and brain inflammation. Exp Neurol. 244:11-21.

Vezzani A, French J, Bartfai T, Baram TZ. (2011a). The role of inflammation in epilepsy. Nat Rev Neurol.

7(1):31-40.

Vezzani A, Granata T. (2005). Brain inflammation in epilepsy: experimental and clinical evidence. Epilepsia.

46(11):1724-1743.

Vezzani A, Maroso M, Balosso S, Sanchez MA, Bartfai T. (2011b). IL-1 receptor/Toll-like receptor signaling in

infection, inflammation, stress and neurodegeneration couples hyperexcitability and seizures. Brain Behav

Immun. 25(7):1281-1289.

Vezzani A, Moneta D, Conti M, Richichi C, Ravizza T, De Luigi A, De Simoni MG, Sperk G, Andell-Jonsson

S, Lundkvist J, Iverfeldt K, Bartfai T. (2000). Powerful anticonvulsant action of IL-1 receptor antagonist on

intracerebral injection and astrocytic overexpression in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97(21):11534-11539.

Vielhaber S, Niessen HG, Debska-Vielhaber G, Kudin AP, Wellmer J, Kaufmann J, Schönfeld MA, Fendrich R,

Willker W, Leibfritz D, Schramm J, Elger CE, Heinze HJ, Kunz WS. (2008). Subfield-specific loss of hippocampal

N-acetyl aspartate in temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49(1):40-50.

Villanueva V, Sanchez-Alvarez JC, Pena P, Puig JS, Caballero-Martínez F, Gil-Nagel A. (2010). Treatment

initiation in epilepsy: an expert consensus in Spain. Epilepsy Behav. 19(3):332-342.

86 87

BIB

LIOG

RA

FÍAB

IBLI

OG

RA

FÍA

Visioli F, Rodriguez de Turco EB, Kreisman NR, Bazan NG. (1994). Membrane lipid degradation is related to

interictal cortical activity in a series of seizures. Metab Brain Dis. 9(2):161-170.

Voss P, Engels M, Strosova M, Grune T, Horakova L. (2008). Protective effect of antioxidants against

sarcoplasmic reticulum (SR) oxidation by Fenton reaction, however without prevention of Ca-pump activity.

Toxicol In Vitro. 22(7):1726-1733.

Waldbaum S, Liang LP, Patel M. (2010). Persistent impairment of mitochondrial and tissue redox status during

lithium-pilocarpine-induced epileptogenesis. J Neurochem. 115(5):1172-1182.

Waldbaum S, Patel M. (2010). Mitochondria, oxidative stress, and temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res.

88(1):23-45.

Wallace DC, Zheng XX, Lott MT, Shoffner JM, Hodge JA, Kelley RI, Epstein CM, Hopkins LC. (1988). Familial

mitochondrial encephalomyopathy (MERRF): genetic, pathophysiological, and biochemical characterization

of a mitochondrial DNA disease. Cell. 55(4):601-610.

Wang M, Dhingra K, Hittelman WN, Liehr JG, de Andrade M, Li D. (1996). Lipid peroxidation-induced putative

malondialdehyde-DNA adducts in human breast tissues. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 5(9):705-710.

Wass CT, Rajala MM, Hughes JM, Sharbrough FW, Offord KP, Rademacher DM, Lanier WL. (1996). Long term

follow up of patients treated surgically for medically intractable epilepsy: results in 191 patients treated at

Mayo Clinic Rochester between July 1972 and March 1985. Mayo Clin Proc. 71(11):1105-1113.

Welsch DJ, Creely DP, Hauser SD, Mathis KJ, Krivi GG, Isakson PC. (1994). Molecular cloning and expression of

human leukotriene-C4 synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 91(21):9745-9749.

Wie MB, Cho YJ, Jhoo WK, Kim HC. (1999). Phenidone attenuates oxygen/glucose deprivation-induced

neurotoxicity by antioxidant and antiapoptotic action in mouse cortical cultures. Neurosci Lett. 272(2):91-94.

Wiebe S, Blume WT, Girvin JP, Eliasziw M; Effectiveness and Efficiency of Surgery for Temporal Lobe Epilepsy

Study Group. (2001). A randomized, controlled trial of surgery for temporal-lobe epilepsy. N Engl J Med.

345(5):311-338.

Wilden JA, Cohen-Gadol AA. (2012). Evaluation of first nonfebrile seizures. Am Fam Physician. 86(4):334-340.

Williams MD, Van Remmen H, Conrad CC, Huang TT, Epstein CJ, Richardson A. (1998) Increased oxidative

damage is correlated to altered mitochondrial function in heterozygous manganese superoxide dismutase

knockout mice. J Biol Chem. 273(43):28510-28515.

Wilson SJ, Saling MM, Lawrence J, Bladin PF. (1999). Outcome of temporal lobectomy: expectations and the

prediction of perceived success. Epilepsy Res. 36(1):1-14.

Witko-Sarsat V, Nguyen Khoa T, Jungers P, Drüeke T, Descamps-Latscha B. (1998). Advanced oxidation protein

products: oxidative stress markers and mediators of inflammation in uremia. Adv Nephrol Necker Hosp.

28:321-341.

Wolfe LS, Mamer OA. (1975). Measurement of prostaglandin F2alpha levels in human cerebrospinal fluid in

normal and pathological conditions. Prostaglandins. 9(2):183-192.

Wu KK, Liou JY. (2005). Cellular and molecular biology of prostacyclin synthase. Biochem Biophys Res

Commun. 338(1):45-52.

Xavier SM, Barbosa CO, Barros DO, Silva RF, Oliveira AA, Freitas RM. (2007). Vitamin C antioxidant effects in

hippocampus of adult Wistar rats after seizures and status epilepticus induced by pilocarpine. Neurosci Lett.

420(1):76-9.

Yiş U, Seçkin E, Kurul SH, Kuralay F, Dirik E. (2009). Effects of epilepsy and valproic acid on oxidant status in

children with idiopathic epilepsy. Epilepsy Res. 84(2-3):232-237.

Yoshikawa K, Kita Y, Kishimoto K, Shimizu T. (2006). Profiling of eicosanoid production in the rat hippocampus

during kainic acid-induced seizure: dual phase regulation and differential involvement of COX-1 and COX-2.

J Biol Chem. 281(21):14663-14669.

Yüksel A, Cengiz M, Seven M, Ulutin T. (2001). Changes in the antioxidant system in epileptic children

receiving antiepileptic drugs: two-year prospective studies. J Child Neurol. 16(8):603-606.

Zhang HJ, Sun RP, Lei GF, Yang L, Liu CX. (2008). Cyclooxygenase-2 inhibitor inhibits hippocampal synaptic

reorganization in pilocarpine-induced status epilepticus rats. J Zhejiang Univ Sci B. 9(11):903-915.

88 89

AN

EXO

2A

NEX

O 1

9. ANEXOS

Vías de los eicosanoides, mediadores, receptores y sus funciones fisiológicas (Dennis y Norris, 2015).

Vía principal Mediador ReceptorRespuestas fisiológicas y efectos bioquímicos

COX

PGE2

EP1, EP2, EP3 y EP4

↑ Permeabilidad vascular y vasodilatación; hiperalgesia; fiebre; ↑ IL-10; ↓ TNF; cambio de clase de eicosanoides de neutrófilos

15-ceto-PGE2 PPARγ ↑ Adipogénesis; ↓ retención mucosa; ↑ secreción de bicarbonato

PGD2

DP1Maduración de mastocitos; vasodilatación; neuroprotección

DP2↑ Reclutamiento de eosinófilos y respuestas alérgicas

15-desoxi-PGJ2 PPARγ ↑ Adipogénesis

PGF2α FPContracción del músculo liso uterino, vascular y respiratorio; ↓ presión intraocular

PGI2

IP↓ Agregación plaquetaria; hiperalgesia; vasodilatación; ↑ IL-10; ↓ TNF

PPARδ Implantación embrionaria

TXA2 TP↑ Agregación plaquetaria; vasoconstricción; ↓ activación de células T

5-LOX

LTB4

BLT1 Reclutamiento de neutrófilos; ↑ permeabilidad vascular

BLT2Mejora de la función de la barrera epitelial

PPARα Retroalimentación negativa de la biosíntesis de LTB4

LTC4, LTD4 y LTE4 CYSLT1 y CYSLT2 Broncoconstricción; ↑ permeabilidad vascular; extravasación de neutrófilos

8-LOX, 12-LOX y 15-LOX

HPETEs,HETEs y diHETEs

TRPV1 Hiperalgesia

PPARα y PPARγ

↑ Expresión de la translocasa de ácidos grasos (CD36)

CYP EETs PPARα y PPARγ Vasodilatación; antihiperalgesia; ↓ expresión de COX2

LOX-LOX y COX-LOX

HXA3 y HXB3

TRPA1 y TRPV2 Hiperalgesia

DesconocidoReclutamiento de neutrófilos dirigido a la mucosa epitelial

LXA4, 15-epi-LXA4, LXB4 y 15-epi-LXB4

ALX ↓ Reclutamiento de neutrófilos; ↑ eferocitosis

Eicosanoides esterificadosde membrana

PL-HETE DesconocidoModulación de la transducción de señales; almacenamiento de precursores de lipoxinas

PL-PG Desconocido ↓ Respuesta de los TRL

No enzimáticasIsoPs Desconocido Función no establecida

AA-NO2 Desconocido Inhibición de la COX1

AA: ácido araquidónico; COX: ciclooxigenasa; CYP: citocromo P450; CYSLT: receptor de cisteinil leucotrieno; DP: receptor de PGD; EET: ácido epoxieicosatrienoico; EP: receptor de PGE; FP: receptor de PGF; HETE: ácido hidroxieicosatetraenoico; HPETE: ácido hidroperoxieicosatetraenoico; HX: hepoxilina; IL-10: interleucina-10; IP: receptor de PGI; IsoPs: isoprostanos; LOX: lipooxigenasa; LT: leucotrieno; LX: lipoxina; NO2, dióxido de nitrógeno; PG: prostaglandina; PL: fosfolípido; PPAR: receptor activado por proliferadores de peroxisomas; TLR: receptor tipo Toll; TNF: factor necrosis tumoral; TP: receptor de tromboxano; TRPA1: transient receptor potential ankyrin 1; TRPV1: transient receptor potential vanilloid 1; TXA2: tromboxano A2.

ANEXO 1 ANEXO 2 Certificado del Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Clínic, Universitat de Barcelona

90 91

AN

EXO

4A

NEX

O 3

La identificación de los estudios se llevó a cabo mediante una búsqueda bibliográfica exahustiva utilizando la base de datos PubMed (National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nih.gov/PubMed) y el empleo de palabras clave específicas (términos mesh [mesh], «medical subject headings»), sin restricción de idioma, y que fue actualizada a día 30 de mayo de 2018.

La primera estrategia de búsqueda incluyó los términos Epilepsia, «Epilepsy» [mesh], y Marcadores de Estrés Oxidativo, «Oxidative Stress Markers»; Radicales Libres «Free radicals» [mesh]; Especies Reactivas de Oxígeno, «Reactive Oxygen Species» [mesh], Óxido Nítrico, «Nitric Oxid» [mesh]; Peróxidos lipídicos, «Lipid Peroxides» [mesh]; Superóxidos, «Superoxides» [mesh] o Antioxidantes, «Antioxidants» [mesh], con la restricción a Humanos. Se obtuvieron 59 citas que fueron revisadas manualmente, de las cuales 16 cumplían los criterios de selección. Otras 7 publicaciones, que cumplían los criterios de selección, fueron identificadas al realizar búsquedas en otras bases de datos (Scopus, GoogleScholar) o revisar las referencias bibliográficas de artículos publicados.

En una segunda búsqueda bibliográfica incluimos los términos Epilepsia, «Epilepsy» [mesh], y Neuroinflamación, «Brain Inflammation»; Eicosanoides «Eicosanoids» [mesh]; Prostaglandinas, «Prostaglandins» [mesh], Prostaglandinas I, «Prostaglandins I» [mesh]; Tromboxanos, «Thromboxanes» [mesh]; Leucotrienos, «Leukotrienes» [mesh]; Ciclooxigenasa, «Cyclooxygenase» [mesh] o Lipooxigenasa «Lipoxygenase» [mesh], con la restricción a Humanos. Se obtuvieron 117 citas que fueron revisadas manualmente, de las cuales 14 cumplían los criterios de selección. Adicionalmente, 6 publicaciones fueron identificadas al realizar búsquedas en otras bases de datos (Scopus, GoogleScholar) o revisar las referencias bibliográficas de artículos publicados.

Los criterios de selección de los artículos identificados fueron los siguientes:

1. Estudios realizados en pacientes epilépticos, independientemente de la etiología de la epilepsia y de la presencia o ausencia de tratamiento farmacológico. Se consideraron más relevantes aquellos estudios que incluyeron pacientes epilépticos resistentes al tratamiento farmacológico y/o que fueron sometidos a cirugía de la epilepsia.

2. Medida cuantitativa de uno o más biomarcadores de interés (relacionados con la producción de estrés oxidativo, el estado redox o la actividad antioxidante en el caso de la primera búsqueda bibliográfica, y relacionados con la neuroinflamación o la producción de eicosanoides, en el caso de la segunda búsqueda, mediante métodos validados y estandarizados.

3. Estudios controlados, de comparación de los resultados obtenidos entre pacientes epilépticos y resultados en sujetos no epilépticos con características demográficas similares.

4. Estudios con análisis estadístico de los resultados, con preferencia sobre los meramente descriptivos.

ANEXO 3Procedimiento de revisión sistemática los estudios llevados a cabo en pacientes epilépticos, en los que se evalúan mediadores inflamatorios y marcadores de estrés oxidativo.

Como resultado de la búsqueda bibliográfica, se obtuvieron 20 artículos que analizaban biomarcadores relacionadas con la biosíntesis de eicosanoides y otros mediadores inflamatorios, como citoquinas y quimioquinas. Las características de dichos estudios y la comparación de los resultados obtenidos se describen en las Tablas 4.1 y 4.2, respectivamente.

• Estudios sobre eicosanoides en pacientes epilépticos Los estudios disponibles en los que se analizaron los niveles de eicosanoides y/o de

las enzimas implicadas en la metabolización del AA para producir estos compuestos en pacientes epilépticos son muy escasos. Más abundares fueron los artículos identificados en los que se evaluaba la presencia en el tejido epiléptico o a nivel periférico de mediadores inflamatorios, tales como citoquinas o quimioquinas.

• Niveles de eicosanoides Solamente pudimos identificar cuatro artículos, publicados entre 1975 y 2001,

que aportaban datos acerca de los niveles de prostaglandinas en pacientes con epilepsia (Egg et al., 1980; Loscher y Siemes, 1988; Matsuo et al., 1996; Tütüncüoğlu et al., 2001;

Wolfe y Mamer, 1975). La prostaglandina más comúnmente medida fue la PGF2α, cuya presencia a nivel del SNC se ha relacionado con la epilepsia en modelos animales (Simmet et al., 1988). Los niveles de esta PG estaban significativamente aumentados en el LCR (Loscher y Siemes, 1988) o en el plasma (Tütüncüoğlu et al., 2001) de niños con crisis epilépticas febriles, así como en el LCR de pacientes epilépticos (Egg et al., 1980; Wolfe y

Mamer, 1975) en comparación con sujetos sanos. Otras PG analizadas por Tütüncüoğlu y colaboradores fueron la PGE2 y la PGD2, igualmente aumentadas el plasma y en el LCR, en el caso de la PGD2, de los pacientes con epilepsia (Tütüncüoğlu et al., 2001).

En el único artículo identificado con datos de leucotrienos en pacientes epilépticos, Matsuo y colaboradores analizaron los niveles de LTB4 y LTC4 en el LCR de pacientes con meningitis viral y presencia o ausencia de crisis febriles. Los investigadores observaron niveles elevados de ambos LT en los pacientes con meningitis, especialmente en aquellos que presentaban encefalitis. Sin embargo, no encontraron diferencias significativas entre los pacientes que sufrían crisis febriles y los que estaban libres de ellas (Matsuo et al., 1996), por lo que no pudieron demostrar su implicación en las crisis epilépticas.

• Enzimas del metabolismo del AA La forma inducible de la ciclooxigenasa, la COX2, es la enzima de la vía del AA

más ampliamente estudiada y que ha demostrado su implicación en modelos experimentales de epilepsia (Chen et al., 1995; Tocco et al., 1997; Okada et al., 2001; Tu y Bazan,

2003; Takemiya et al., 2003). En la epilepsia humana, identificamos dos estudios que analizaron su expresión en la corteza temporal anterior (Fiala et al., 2013) o en tejido del hipocampo (Desjardins et al., 2003), encontrando una inducción de la misma en los

ANEXO 4Estudios que evalúan el papel de los eicosanoides y la neuroinflamación en pacientes con epilepsia

92

AN

EXO

4

pacientes epilépticos. Además, Desjardins y colaboradores observaron un aumento del 43 % en la expresión de la COX2 en los tejidos obtenidos de pacientes epilépticos con esclerosis del hipocampo en relación a los pacientes que no presentaban dicha esclerosis (Desjardins et al., 2003).

En la búsqueda de artículos que estudiaran la posible implicación en la epilepsia humana de las lipooxginenasas, enzimas responsables de la síntesis de LT a partir del AA, no obtuvimos ningún resultado. Identificamos, sin embargo, un estudio reciente que analizaba la expresión de la enzima epóxido hidrolasa humana 2 soluble (sHEH-2) en pacientes con ELT sometidos a lobectomía temporal anterior (Ahmedov et al.

2017). Encontraron un incremento significativo de la expresión de esta enzima en la corteza temporal de los pacientes epilépticos, apareciendo también aumentada en el tejido del hipocampo de estos pacientes, aunque sin alcanzar la significación estadística (Ahmedov et al. 2017).

• Estudios sobre mediadores de neuroinflamación en pacientes epilépticos La neuroinflamación es una condición caracterizada por la presencia de una serie de

moléculas, tales como citoquinas, quimioquinas y otros mediadores de inflamación bien establecidos, que no son detectables o apenas se detectan en situaciones fisiológicas. Estas moléculas son producidas clásicamente por células del sistema inmune en respuesta a infecciones o diversos tipos de amenazas patológicas. Sin embargo, está bien establecido que los mediadores inflamatorios también son producidos por las células del parénquima cerebral (microglia, astrocitos y neuronas) y por las células de la barrera hemato-encefálica y del plexo coroideo (Vezzani y Granata,

2005).

En este sentido, identificamos ocho estudios llevados a cabo en pacientes epilépticos tratados mediante cirugía y que evaluaron la presencia de una gran variedad de mediadores inflamatorios en el tejido cerebral de dichos pacientes (Choi et al., 2009;

Crespel et al., 2002; Fiala et al., 2013; Kan et al., 2012; Leal et al., 2017; Strauss y Elisevich, 2016;

Teocchi et al., 2013; van Gassen et al., 2008). Muchos de los mediadores inflamatorios analizados estaban incrementados significativamente en las muestras de epilepsia humana, siendo algunos de los más frecuentes las citoquinas IL-1β, IL-6, IL-10 y TNF-α (Choi et al., 2009; Fiala et al., 2013; Leal et al., 2017; Strauss y Elisevich, 2016) y las quimioquinas CCL3 y CCL4 (Kan et al., 2012; van Gassen et al., 2008). Otros cuatro estudios analizaron estos mismos mediadores inflamatorios en el LCR o en el plasma de pacientes epilépticos, hallando resultados similares (Lehtimäki et al., 2004; Peltola et al., 2008; Quirico-Santos et al.,

2013; Tütüncüoğlu et al., 2001).

94 95

AN

EXO

4A

NEX

O 4

Descripción de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de neuroinflamación en pacientes epilépticos.

Referencia Localización Casos (n) y características Controles (n) y característicasEdad (años, media ± DE) Género (hombres/ mujeres) Biomarcadores

de interésCasos Controles Casos Controles

Ahmedov et al. 2017 Estambul, Turquía20 pacientes con ELT sometidos a lobectomía temporal anterior

15 sujetos fallecidos por accidentes o tráfico o caídas en altura

31,2 ± 10,8 38,0 ± 10,7 11/9 5/10 sHEH-2

Alapirtti et al., 2009 Tampere, Finlandia20 pacientes epilépticos resistentes a fármacos, con ELT (11) o EET (9), sometidos a estudio de video-EEG

-ELT: 41,3EET:28,1

- 7/13 - IL-6, IL-1β, IL-1Ra

Choi et al., 2009 Chicago, EE.UU.13 pacientes con epilepsia crónica resistente, sometidos a cirugía de epilepsia

8 sujetos fallecidos sin patología neurológica 11,1 ± 7,7 n.e.1 6/7 n.e.1

Fragmentación ADN, degeneración neuronal, citoquinas proinflamatorias

Crespel et al., 2002 Montpellier, Francia18 pacientes con ELT con esclerosis del hipocampo resistente a fármacos, sometidos a lobectomía temporal anterior

3 pacientes no epilépticos con tumores cerebrales y 4 pacientes con ELT sin esclerosis del hipocampo, sometidos a cirugía

33,6 ± 8 50,8 ± 16,9 7/11 4/3 NFκB

Desjardins et al., 2003 Montreal, Canadá

5 pacientes con ELT medial, con crisis parciales complejas y el foco epiléptico localizado en el lóbulo temporal, sometidos a resección del hipocampo

2 pacientes sin esclerosis del hipocampo, con crisis parciales complejas y el foco epiléptico localizado en el lóbulo temporal, sometidos a resección del hipocampo

33,4 ± 6,2 23,5 ± 12,0 3/2 2/0 COX2

Egg et al., 1980 Innsbruck, Austria122 pacientes con distintos desórdenes del SNC (12 con epilepsia)

54 sujetos sin evidencia de patología cerebral n.e.1 n.e.1 n.e.1 n.e. PGF2α

Fiala et al., 2013 Los Ángeles, EE.UU.

13 pacientes con ELT con crisis parciales complejas y el foco epiléptico localizado en el lóbulo temporal, sometidos a lobectomía temporal anterior en bloque

5 muestras procedentes de cirugía por trauma (1), tumor cerebral (1) o de autopsias (3)

18-50 n.e.1 n.e.1 n.e.1 COX2, IL-1β, IL-6, RANTES (CCR5), E2F1

Hirvonen et al., 2012 Bethesda (Maryland), EE.UU.16 pacientes con ELT, estudiados por PET

30 sujetos sanos escaneados por PET de alta resolución (7) o PET avanzado (23)

36 ± 1045 ± 1148 ± 17

8/84/314/9

TSPO

Kan et al., 2012 Utrecht, Países Bajo20 pacientes con ELT resistente sometidos a cirugía de epilepsia, con (13) o sin (17) esclerosis del hipocampo

10 sujetos fallecidos no epilépticos42,5 ± 6 (con)40,5 ± 10,4 (sin)

65,0 ± 15,67/6 (con)10/7 (sin)

6/7Citoquinas y quimioquinas proinflamatorias

Leal et al., 2017 Oporto, Portugal

23 pacientes con ELT con esclerosis del hipocampo, sometidos a amigdalo-hipocampecto- mía o lobectomía temporal anterior

10 sujetos fallecidos no epilépticos 39,6 ± 9,8 67,0 ± 10,9 10/13 8/2 TLR4, IL-1β, IL-10

Lehtimäki et al., 2004 Tampere, Finlandia

33 pacientes con crisis agudas, con una sola (16) o ≥ 2 crisis tónico-clónicas generalizadas recientes (10), o con crisis parciales prolongadas (7)

17 pacientes sin patología neurológica n.e.1 n.e.1 n.e.1 n.e.1 IL-6, sIL-6R

Loscher y Siemes, 1988 Berlín, Alemania17 pacientes con 1ª (15) o 2ª (2) convulsión febril

12 niños con fiebre sin convulsiones 1-7 1-14 7/10 7/5 PGF2α

Matsuo et al., 1996 Saga, Japón18 pacientes con meningitis aséptica, con encefalitis viral (2) o crisis febriles (4)

12 pacientes sin enfermedad inflamatoria5,9 (encefali-tis), 0,9 (crisis febriles)

9,1 n.e.1 n.e.1 LTB4, LTC4

TABLA 4.1. Descripción de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de neuroinflamación en pacientes epilépticos

96 97

AN

EXO

4A

NEX

O 4

Peltola et al., 2008 Tampere, Finlandia

Grupo I: 15 pacientes epilépticos recién diagnosticados y sin tratar, con crisis en <72 h.Grupo II: 14 pacientes sin tratar con crisis en >2 semas previas.

22 pacientes sin patología neurológica 15-60 Equipara-dos 12/3 Equipara-dos IL-6

Quirico-Santos et al., 2013 Río de Janeiro, Brasil35 pacientes con ELT con atrofia del hipocampo, sometidos a lobectomía temporal anterior (10) o no operados (25)

45 sujetos sanos 39,8 n.e.1 19/16 n.e.1 IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL3

Strauss y Elisevich, 2016 Detroit, EE.UU.58 pacientes con epilepsia focal resistente, sometidos a cirugía de epilepsia

4 sujetos no epilépticos operados por otras causas

39 ± 1 65 ± 3 38/2425 mediadores inflamatorios

Teocchi et al., 2013 Campinas, Brasil14 pacientes con ELT sometidos a amigdalo-hipocampecto- mía

5 sujetos fallecidos no epilépticos 39,3 ± 12,8 28,2 ± 13,1 5/9 4/1 NFκB, TNF-α

Tütüncüoğlu et al., 2001 Esmirna, Turquía 15 pacientes con convulsiones febriles 20 niños con fiebre y meningismo 1,1 ± 0,2 1,9 ± 0,1 n.e.1 n.e.1 PGs (PGE2, PGF2α, PGD ), IL-1β, TNF-α

van Gassen et al., 2008 Utrecht, Países Bajos8 pacientes con ELT con (4) y sin esclerosis del hipocampo (4), sometidos a cirugía de epilepsia

4 sujetos fallecidos sin historia de patología neurológica

37 ± 3,4 40 ± 5,5

52,5 ± 5,0 5/2 2/2 CCL3, CCL4

Wolfe y Mamer, 1975 Montreal, Canadá

Grupo 2: 10 pacientes con ELT (7), epilepsia generalizada (2), alteración EEG difusa (1) o crisis focales por infarto cerebral.Grupo 3: pacientes con meningitis o meningo-encefalitis viral.Grupo 4: 5 pacientes sometidos a cirugía de epilepsia.Grupo 5: 5 pacientes con lesiones vasculares y hemorragia subaracnoidea.

Grupo 1 (normal): 16 pacientes con EEG normal y sin evidencia de patología cerebral.

n.e.1 n.e.1 n.e.1 n.e.1 PGF2α

1No especificado.CCL: ligandos de quimioquinas CC; EET: epilepsia extratemporal; ELT: epilepsia de lóbulo temporal; IL: interleuquina 1β; IL-1Ra: antagonista del receptor de interleuquina 1; LT: leucotrienos; NF-kB: factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas; PET: tomografía por emisión de positrones; PGs: prostaglandinas; RANTES: del inglés, regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, también conocida como CCR5 -quimioquina CC receptora de tipo 5-; sHEH-2: epóxido hidrolasa humana 2 soluble; sIL-6R: receptor de interleuquina 6 soluble; TLR4: receptor tipo Toll 4; TNF-α:factor de necrosis tumoral α; TSPO: proteína translocadora.

98 99

AN

EXO

4A

NEX

O 4

Comparación de los resultados de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de neuroinflamación en pacientes epilépticos.

Referencia Muestra biológica Biomarcador de neuroinflamación Resultados Comentarios

Ahmedov et al. 2017 Córtex temporal e hipocampal sHEH-2↑ pacientes vs. controles en córtex temporal (p=0,03) y en córtex hipocampal (NS2, p=0,11).

Correlación positiva con la frecuencia (r=0,7, p=0.00001 para córtex temporal; r 0,4, p=0.003 para córtex hipocampal) y duración de las crisis (r=0,06, p=0.00001 para córtex hipocampal).

Alapirtti et al., 2009 Plasma IL-6↑ grupo ELT con un pico máximo a las 6h de estado post-ictal; p=0,028 vs. 0h.Sin cambios significativos en grupo EET.

IL-1β Sin cambios significativos en estado post-ictal vs. 0h.

IL-1RaSin cambios significativos en estado post-ictal vs. 0h.Tendencia de disminución en pacientes con ELT a las 12 y 24h de estado post-ictal; p>0,059.

Choi et al., 2009 Corteza cerebralFragmentación ADN (tinción ISEL)Degeneración neuronal (Flouro Jade B)

↑ pacientes epilépticos (p<0,0001), en neuronas (60%), astrocitos (26%) y otros tipos celulares (14%).Sin detección en tejidos control.

La fragmentación del DNA se correlaciona positivamente con la frecuencia de las crisis antes de la cirugía (p<0,003).

Citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-8, IL-12p70, MIP-1β ↑ en pacientes vs. controles; p<0,05.

Crespel et al., 2002 Tejido del hipocampo NFκB↑ en área CA1 (p<0,0001) e hilus (p<0,01) del hipocampo de pacientes con ELT con esclerosis vs. pacientes no epilépticos y con ELT sin esclerosis.

Desjardins et al., 2003Tejido del hipocampo en la región CA1

COX2 (ARNm) ↑ 43% en pacientes con esclerosis vs. sin esclerosis del hipocampo; p<0,05.Sin correlación significativa entre el nivel de ARNm de COX2 y la frecuencia, la edad de inicio o la duración de las crisis.

Egg et al., 1980 LCR PGF2α ↑ pacientes epilépticos (132 [25-480] ng/ml) vs. sujetos normales (67 [25-150] pg/ml).

Fiala et al., 2013 Córtex temporal lateral COX2 Expresión en neuronas de pacientes con ELT y trauma cerebral.La apoptosis en neuronas de pacientes con ELT intratable puede ser inducida por una combinación de estímulos quimiotácticos y mitogénicos.

IL-1β

IL-6 Expresión en células endoteliales de pacientes con ELT y trauma cerebral.

RANTES (CCR5) y otras quimioquinas CCCaspasas 3, 8 y 94

Expresión en neuronas laterales temporales corticales e hipocampales de los pacientes con ELT, pero no en neuronas de los tejidos control.RANTES, generalmente de localización citoplasmática y extracelular, en neuronas de pacientes con TLE, aparece en el núcleo, una ubicación inusual.

E2F15Expresado exclusivamente en el citoplasma (localización inusual) de neuronas de pacientes con ELT.

Hirvonen et al., 2012Captación del radio-ligando 11C-PBR28 por PET

TSPO6↑ expresión en el hipocampo ipsilateral al foco epiléptico de pacientes con ELT vs. controles.

TABLA 4.2. Comparación de los resultados de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de neuroinflamación en pacientes epilépticos.

100 101

AN

EXO

4A

NEX

O 4

Kan et al., 2012Neocórtex (giro temporal medial) y tejido del hipocampo

Citoquinas y quimioquinas proinflamatorias↑ 10 citoquinas (IL-7; IL-13; IL-22; IL-5; IL-25; IL-1RA; IL-1a; IL-27; IL-10; INFα) y 7 quimioquinas (CCL22, CCL5, CCL4, CXCL9, CCL2, CCL3, CCL19) en ELT con y sin esclerosis del hipocampo vs. controles; p<0,0015.

Leal et al., 2017Tejido del hipocampo y del lóbulo temporal anterior

TLR4 ↑ 2,3 veces en hipocampo y 5 veces en corteza anterior de pacientes vs. controles; p<0,05.

IL-1β ↑ 13 veces en hipocampo y 4 veces en corteza anterior de pacientes vs. controles; p<0,05.

IL-10 ↑ 2 veces en hipocampo y 2 veces en corteza anterior de pacientes vs. controles; p<0,05.

Lehtimäki et al., 2004 LCR IL-6↑ pacientes con una o crisis generalizadas tónico-clónicas recurrentes vs. controles; p<0,001.

Suero IL-6 ↑ todos los grupos de pacientes con crisis vs. controles; p<0,001.

LCR sIL-6R↓ pacientes con una crisis generalizada tónico-clónica recurrente vs. controles; p<0,05.Sin cambios significativos en el resto de grupos de pacientes.

Suero sIL-6R↓ pacientes con crisis parciales prolongadas vs. controles; p=0,05.Sin cambios significativos en el resto de grupos de pacientes.

Loscher y Siemes, 1988 LCR PGF2α ↑ pacientes con crisis febriles (101 [15-190] ng/ml) vs, pacientes con fiebre sin crisis (66 [3-224] pg/ml), NS2 y vs. pacientes sin fiebre (12 [4-90] pg/ml), p<0,01.

Correlación positiva entre niveles de PGF2α en LCR y temperatura corporal (r=0,5839, p<0,001).

Matsuo et al., 1996 LCR LTB4

↑ pacientes con meningitis (1603,0 ± 273,5 pg/ml)1 vs. controles (1219,3 ± 161,5 pg/ml)1; p<0,01.Niveles especialmente elevados en pacientes con encefalitis.Sin diferencias significativas en pacientes con crisis febriles vs. controles.

LTC4↑ pacientes con meningitis (115,6 ± 47,7 pg/ml)1 vs. controles (83,2 ± 21,6 pg/ml)1; p<0,05.Niveles especialmente elevados en pacientes con encefalitis.Sin diferencias significativas en pacientes con crisis febriles vs. controles.

Peltola et al., 2008 Plasma y LCR IL-6↑ >7,4 pg/ml (media ± 2DE) vs. grupo control en LCR de pacientes con crisis recientes.>5,5 pg/ml (media ± 2DE) vs. grupo control en plasma de pacientes con crisis recientes.

Quirico-Santos et al., 2013

Plasma IL-1β ↑ 6,2 veces en ELT (207 ± 22,7 pg/mL; control: 33 ± 4,89 pg/mL)3; p<0,001Disminución significativa de citoquinas proinflamatorias en pacientes operados vs. no operados.

IL-6 ↑ 4,9 veces en ELT (88,34 ± 7,46 pg/mL; control: 17,89 ± 1,02 pg/mL)3; p<0,001

TNF-α ↑ 5 veces en ELT (249,1 ± 27,9 pg/mL; control: 50,9 ± 5,2 pg/mL)3; p<0,001

CCL3 ↑ 11,3 veces en ELT (158,9 ± 29,49 pg/mL; control: 14,02 ± 1,20 pg/mL)3; p<0,001

Strauss y Elisevich, 2016Corteza temporal, corteza entorrinal y tejido del hipocampo

Mediadores inflamatorios (25 analizados)↓ Eotaxina, IL-1β, IL-6, CRP y VCAM-1 pacientes vs. controles; p<0,05.↑ IL-12p70 pacientes vs. controles; p<0,05.

Teocchi et al., 2013 Tejido del hipocampo NFκB ↑ expresión génica en pacientes vs controles; p<0,03.

TNF-α ↑ expresión génica enpacientes vs controles; p<0,005.

Tütüncüoğlu et al., 2001 Plasma PGE2↑ pacientes en fase aguda (0,18 ± 0,02 μg/ml)1 vs. fase tardía (0,09 ± 0,02 μg/ml)1 y vs. controles (0,09 ± 0,12 μg/ml)1; p<0,05.

Las muestras de sangre se tomaron en fase aguda (durante 12h tras las crisis) y en fase tardía (3 meses después de las crisis).

PGF2α ↑ pacientes en fase aguda (2,33 ± 1,39 μg/ml)1 vs. fase tardía (0,88 ± 1,17 μg/ml)1 y vs. controles (1,34 ± 0,76 μg/ml)1; p<0,05.

PGD2↑ pacientes en fase aguda (0,70 ± 0,58 μg/ml)1 vs. fase tardía (0,23 ± 0,29 μg/ml)1 y vs. controles (0,24 ± 0,12 μg/ml)1; p<0,05.

IL-1β ↑ pacientes en fase aguda (4,69 [2,78–14,99] pg/ml) vs. fase tardía (2,78 [2,22–4,69] pg/ml) y vs. controles (2,78 [2,22–3,33] pg/ml); p<0,05.

TNF-α Sin cambios significativos.

102 103

AN

EXO

4A

NEX

O 4

LCR PGE2 Sin cambios significativos.

PGF2α Sin cambios significativos.

PGD2 ↑ pacientes en fase aguda (0,38 ± 0,20 μg/ml)1 vs. controles (0,07 ± 0,01 μg/ml)1; p<0,05.

IL-1β Sin cambios significativos.

TNF-α ↑ pacientes en fase aguda (27,4 [8,31–699,21] pg/ml) vs. controles (5,21 [5,21–14,56] pg/ml)1; p<0,05.

van Gassen et al., 2008 Tejido del hipocampo CCL3↑ expresión génica en pacientes con ELT con esclerosis (12,15 veces) y sin esclerosis (9,84 veces) vs. controles; p<0,0001.

CCL4↑ expresión génica en pacientes con ELT con esclerosis (21,94 veces) y sin esclerosis (24,47 veces) vs. controles; p<0,0001.

Wolfe y Mamer, 1975 LCR PGF2α ↑ pacientes con epilepsia (559 ± 411 pg/ml)1 y meningo-encefalitis (954 ± 783 7 pg/ml)1 vs. grupo normal (71,6 ± 34,7 pg/ml)1.

Incrementos elevados de PGF2α en pacientes post-cirugía, probablemente debidos al trauma quirúrgico.

1Media ± DE; 2NS, no significativo; 3Media ± SEM; 4Marcadores de apoptosis, enzimas cisteín-proteasas mediadoras esenciales en los procesos de apoptosis celular; 5Factor de transcripción regulador del ciclo celular y capaz de inducir la muerte celular por diferentes mecanismos; 6Marcador de inflamación, sobreexpresado en microglia y astrocitos activa por inflamaciónARNm: ácido desoxirribonucleico mensajero; CCL: ligandos de quimioquinas CC; INFα: interferón α; IL: interleuquina; IL-1Ra: antagonista del receptor de interleuquina 1; LCR: líquido cefalorraquídeo; LT: leucotrienos; MIP-1β: proteína inflamatoria de macrófagos 1β; NF-kB: factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas; PG: prostaglandina; RANTES: del inglés, regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, también conocida como CCR5 -quimioquina CC receptora de tipo 5-; sIL-6R: receptor de interleuquina 6 soluble; sHEH-2: epóxido hidrolasa humana 2 soluble; TLR4: receptor tipo Toll 4; TNF-α:factor de necrosis tumoral α; TSPO: proteína translocadora.

104 105

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

Como resultado de la búsqueda sistemática de literatura, identificamos 23 artículos que aportaban datos sobre biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes epilépticos. La descripción de las características de los estudios y la comparación de los resultados que obtuvieron en relación a los marcadores de estrés oxidativo están recogidos en las Tablas 5.1 y 5.2, respectivamente. Puesto que la epilepsia resistente a fármacos y su tratamiento quirúrgico son objeto de la presente tesis, se consideraron de forma particular aquellos estudios que incluían pacientes epilépticos resistentes al tratamiento farmacológico y que fueron sometidos a cirugía de la epilepsia.

Biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes con epilepsiaUn aspecto importante a tener en cuenta a la hora evaluar marcadores biológicos de cualquier patología humana es el tipo de muestra a emplear. Aunque se ha demostrado que un estado oxidativo periférico incrementado se correlaciona con daño neuronal en enfermedades neurodegenerativas (Marcourakis et al, 2008; Chen et al., 2009; Galasko y Montine,

2010), la importancia de contar con muestras de tejido cerebral humano en la investigación neuropatológica es considerable. Sin embargo, la gran dificultad para obtener muestras de neurocirugía, que resulta aún mayor en el caso de muestras de individuos sanos que puedan ser empleadas como controles (Ferrer et al., 2008), lleva en muchas ocasiones a utilizar muestras biológicas de más fácil acceso como el líquido cefalorraquídeo (LCR) o la sangre. Muy probablemente debido a esto, solo en dos de los artículos identificados se emplearon muestras humanas de neocórtex temporal (Bidmon et al., 2004; Pecorelli et al,

2015). En la mayoría de los estudios los marcadores de estrés oxidativo se midieron en muestras derivadas de sangre, como plasma, suero o eritrocitos.

Enzimas antioxidantes en pacientes con epilepsiaLa actividad de distintas enzimas antioxidantes fue medida en 13 estudios, siendo las más frecuentes las actividades SOD, GPx y catalasa, que se valoraron en 13, 11 y 6 artículos, respectivamente.

Un aumento de la actividad SOD de pacientes epilépticos, comparativamente con la de los controles, se refleja en cuatro artículos (Ben-Menachem et al. 2000; Ercegovac et al., 2010; López

et al., 2007; Turkdogan et al., 2002) de forma significativa, y en otro estudio sin llegar a ser estadísticamente significativo (Yis et al, 2009). Por el contrario, cinco estudios encontraron valores disminuidos de la actividad SOD de pacientes epilépticos (Günes et al., 2009; Ogurno

et al, 2013; Prasad et al., 2017; Saad et al., 2014; Sudha et al., 2002). No se observaron diferencias en los valores de la actividad SOD entre pacientes epilépticos y sujetos control en el resto de los artículos que la analizaron.

En cuanto a la actividad GPx, esta estaba disminuida en el suero (López et al., 2007) o en eritrocitos (Saad et al., 2014; Sudha et al., 2002; Ogurno et al, 2013) de los pacientes epilépticos de cuatro estudios, mientras que solo dos encontraron valores aumentados de la actividad GPx eritrocitaria (Günes et al., 2009) o plasmática (Ercegovac et al., 2010) de pacientes con epilepsia. El resto de los autores que analizaron la actividad de esta enzima no observaron cambios significativos entre pacientes epilépticos y sujetos sanos.

ANEXO 5 ESTUDIOS QUE EVALÚAN EL PAPEL DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON EPILEPSIA

En dos estudios la actividad catalasa estaba aumentada significativamente en el suero (López et al., 2007) o en los eritrocitos, sin llegar a la significación estadística, (Sudha et al., 2002) de pacientes epilépticos en comparación con sujetos control no epilépticos, mientras que otros dos encontraron valores significativamente menores de la actividad catalasa eritrocitaria (Ogurno et al, 2013; Prasad et al., 2017). Otros autores (Ben-Menachem et al.

2000; Peker et al., 2009) no encontraron cambios significativos.

Marcadores de daño oxidativo al ADN, lípidos y proteínas en pacientes con epilepsiaEl malondialdehído (MDA), compuesto mutagénico, carcinogénico y genotóxico, es el producto final de la peroxidación lipídica y el principal producto de oxidación secundaria de los ácidos grasos poliinsaturados. Es uno de los biomarcadores de daño oxidativo más comúnmente utilizado (Valko et al., 2007). Los niveles plasmáticos de MDA de pacientes epilépticos fueron analizados en 15 de los 23 estudios identificados, encontrando, la mayoría de ellos, aumentos significativos en pacientes epilépticos cuando se compararon con sujetos no epilépticos (Araújo et al., 2018; Günes et al., 2009; López et al., 2007; Menon et al.,

2012; Ogurno et al, 2013; Prasad et al., 2017; Saad et al., 2014; Sudha et al., 2002; Turkdogan et al., 2002;

Verrotti et al., 2008). Pecorelli y colaboradores describieron niveles elevados de aductos proteicos del 4-hidroxi-2-nonenal (HNE-PA), un producto de la peroxidación de lípidos, en el hipocampo esclerótico de pacientes con epilepsia (Pecorelli et al, 2015).

Dos artículos utilizaron como marcador de oxidación proteica los niveles plasmáticos de productos avanzados de oxidación proteica (PAOP), que proporcionan información sobre los niveles de proteínas implicadas en reacciones de radicales libres, es decir, proteínas plasmáticas oxidadas que han perdido sus propiedades oxidantes (Witko-Sarsat

et al., 1998). Ambos estudios observaron niveles significativamente aumentados de PAOP en pacientes con epilepsia en comparación con individuos sanos (Grosso et al., 2011; López

et al., 2007). Además, Menon y colaboradores describieron un incremento significativo de la carbonilación de proteínas en pacientes con epilepsia generalizada idiopática (Menon

et al., 2012). De forma similar, en el estudio de Ercegovac y colaboradores los pacientes epilépticos presentaban niveles significativamente mayores de derivados carbonílicos de proteínas que los sujetos control (Ercegovac et al., 2010).

En cuanto a marcadores de daño al ADN por estrés oxidativo, solamente un estudio analizó los niveles de 8-hidroxi-20-desoxiguanosina (8-OHdG), que es uno de los principales mediadores de daño oxidativo al ADN, por lo que ha sido ampliamente utilizado como biomarcador de estrés oxidativo y carcinogénesis (Valavanidis et al., 2008). Este estudio describe niveles de 8-OHdG incrementados de forma significativa en la orina de pacientes que habían sufrido su primera crisis epiléptica no provocada (Ercegovac et al.,

2010).

106

AN

EXO

5

Estrés oxidativo en pacientes con epilepsia resistente a tratamiento farmacológicoDel total de estudios analizados, ocho incluían un grupo de pacientes con diagnóstico de epilepsia resistente a fármacos o que, encontrándose en tratamiento con fármacos antiepilépticos, presentaban ausencia de respuesta al mismo (Ben-Menachem et al. 2000,

Turkdogan et al., 2002, Bidmon et al., 2004; López et al., 2007; Grosso et al., 2011; Saad et al., 2014;

Pecorelli et al, 2015; Araújo et al., 2018). Todos ellos encontraron evidencia de la presencia de mayor estrés oxidativo en estos pacientes en comparación con sujetos no epilépticos (Tabla 6). En tres de estos estudios (Bidmon et al., 2004; López et al., 2007; Pecorelli et al, 2015) los pacientes fueron sometidos a cirugía de la epilepsia. Bidmon y colaboradores midieron la expresión de la proteína de choque térmico 27 (HSP-27), que ha demostrado ser un marcador fiable de daño tisular por estrés oxidativo, en el neocórtex de pacientes con epilepsia fármaco-resistente. Encontraron una elevada expresión de HSP-27 en el neocórtex de los pacientes, principalmente en las paredes vasculares y en las células gliales, mientras que no se detectó en los tejidos control (Bidmon et al 2004). Más recientemente, Pecorelli y colaboradores describieron niveles elevados de HNE-PA y activación de la NADPH oxidasa 2 (NOX2), fuente celular de anión superóxido, en el tejido epiléptico obtenido quirúrgicamente de pacientes resistentes al tratamiento farmacológico (Pecorelli et al, 2015).

Solamente un estudio, el trabajo de López y colaboradores (López et al., 2008), investigó el impacto de la cirugía en el aumento de estrés oxidativo que presentan los pacientes con epilepsia resistente a fármacos. Con tal fin, los investigadores evaluaron los niveles de marcadores de daño oxidativo en el suero de 9 pacientes con epilepsia del lóbulo temporal resistente a fármacos, empleando muestras de suero de 32 individuos sanos sin ningún tratamiento farmacológico como controles. Encontraron que, en comparación con los sujetos control, los pacientes epilépticos presentaban en fase preoperatoria una actividad de enzimas antioxidantes (catalasa, SOD y GPx) alterada y niveles incrementados de marcadores de oxidación lipídica (MDA) y proteica (PAOP). Tras la cirugía, los pacientes mostraron una tendencia a la normalización de las variables estudiadas, a excepción de la actividad SOD. Además, el estado redox periférico de los pacientes mejoró notablemente tras la cirugía, lo que se evidenciaba claramente por la importante disminución de los niveles de MDA y PAOP a los dos años de la cirugía y la recuperación de la actividad GPx correlacionada positivamente con el tiempo post-cirugía (López et al., 2008).

108 109

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

TABLA 5.1.

Descripción de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes epilépticos.

Descripción de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes epilépticos.

Referencia Localización Casos (n) y característicasControles (n) y características

Edad (años, media ± DE) Género (hombres/ mujeres)Biomarcadoresde interés

Casos Controles Casos Controles

Araújo et al., 2018 São Paulo, Brasil46 pacientes con ELT con esclerosis del hipocampo resistente a fármacos

112 sujetos sanos 43,6 ± 1,3 42,7 ± 3,2 25/21 62/50 MDA, TEAC

Arhan et al., 2011 Ankara, Turquía49 pacientes con epilepsia idiopática recién diagnosticados, tratados con VPA (16) o con OXC (16)

15 niños sanosGrupo VPA: 9,5 ± 2,46Grupo OXC: 8,43 ± 3,25

8,8 ± 3,12 28/21 6/9 MDA, NO, XO

Ben-Menachem et al. 2000

Gotemburgo, Suiza5 pacientes con epilepsia mioclónica progresiva resistente a fármacos

12 sujetos sanos 19-20 16-19 2/3 n.e.1 CAT, CuZn-SOD, EC-SOD, GPx

Bidmon et al., 2004 Bielefeld, Alemania28 pacientes con epilepsia resistente a fármacos sometidos a cirugía

11 sujetos fallecidos por otras causas

32,4 ± 15,2 69,3 ± 9,4 17/11 7/4 HSP-27

Dönmezdil et al., 2016 Diyarbakir, Turquía 30 pacientes epilépticos recién diagnosticados 30 sujetos sanos 24,6 ± 8,15 23 ± 4,83 16/14 17/13 MDA, PON1

Ercegovac et al., 2010 Belgrado, Serbia60 pacientes con primera crisis no provocada

20 sujetos sanos 20-46 Equipara-dos 31/29 Equipara-dosSOD, GPx, RCD, P-SH/P, 8-Epi-PGF2α, 8-OHdG,

Grosso et al., 2011 Siena, Italia

34 pacientes con encefalopa-tía epiléptica resistente tratados con 3 aniepilépticos (grupo 1) y 31 pacientes con epilepsia idiopática tratados con VPA (grupo 2)

22 niños sanos (grupo 3)Grupo 1: 5,6 [0,7-10,1]Grupo 2: 6,4 [3,1-9,7]

6,1 [3,3-9,2] 24/1018/13

Equipara-dosEstado redox (F2-iso), PAOP, NPBI, tioles (-SH), hidroperóxidos totales

Günes et al., 2009 Esmirna, Turquía31 niños con crisis epilépticas febriles (crisis tónico-clónica de duración < 15 min.)

30 niños con fiebre y sin crisis

23,29 ± 12,50 22,97 ± 14,99 18/13 19/11 SOD, GPx, MDA

López et al., 2007 La Habana, Cuba9 pacientes con ELT resistente a fármacos (≥ 2 crisis/mes, ≥ 2 años), sometidos a lobectomía anterior temporal

32 sujetos sanos sin ningún tratamiento farmacológico

37 ± 6 37 ± 9 5/4 18/14 CAT, SOD, GPx, MDA, PAOP

Medina et al., 2015 Murcia, España 15 pacientes epilépticos 15 sujetos sanos 37 ± 11 32 ± 8 11/4 10/5 9 Neuro-Ps y 9 Dihomo-isoP

Menon et al., 2012 Nellore, India100 pacientes con epilepsia generalizada idiopática, sin tratar (25) o tratados (75)

100 sujetos sanos 26 ± 10 26 ± 8 56/44 52/47MDA, carbonilación proteica, NO

Mueller et al., 2001 Zurich, Suiza19 pacientes con epilepsia activa (12) o no activa (7), sometidos a cirugía de epilepsia

8 sujetos sanos 32,7 ± 10,2 28,4 ± 10,7 12/7 3/5 GSH

Ogurno et al, 2013 Osogbo, Nigeria25 pacientes con epilepsia generalizada primaria sin tratar y 10 tratados con fenobarbital al menos 1 año

25 sujetos sanos 37,1± 4,9 34,2 ± 7,315/107/3

16/9TAC, CAT, SOD, GPx, GSH, MDA

Pecorelli et al, 2015 Siena, Italia50 pacientes con epilepsia resistente a fármacos, sometidos a lobectomía temporal anterior

5 pacientes no epilépticos intervenidos por otras patologías

35,5 ± 11,6 n.e.1 20/30 n.e.1 HNE-PA, NOX2, AQP4

Peker et al., 2009 Hatay, Turquía21 niños epilépticos tratados con VPA al menos 1 año

26 niños sanos 7,52 ± 2,43 7,80 ± 3,12 1/10 5/11CAT, SOD, MDA, NO (nitrito/nitrato total)

Prasad et al., 2017 Hyderabad, India310 pacientes con epilepsia generalizada genética, tratados (235) o sin tratar (75)

310 sujetos sanos Equiparados Equipara-dos 203/ 107 Equipara-dos CAT, SOD, GPx, TAC, MDA, NO

Saad et al., 2014 Asiut, Egipto40 pacientes con epilepsia generalizada resistente a fármacos (≥ 1 crisis/6 meses)

40 niños sanos 8,4 ± 3,1 Equipa-rados 24/16 Equipa-rados SOD, GPx, MDA

Sudha et al., 2002 Mangalore, India29 pacientes con epilepsia generalizada primaria, sin tratar

50 sujetos sanos 20-50 20-50 19/10 30/20CAT,SOD, GPx, GR, MDA, vitaminas A, C, E

110 111

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

Turkdogan et al., 2002 Estambul, Truquía

52 niños epilépticos, con IRM normal y sin respuesta a politerapia (grupo 1: 11), con IRM anormal y sin respuesta (grupo 2: 9), con IRM normal y respuesta a monoterapia (grupo 3: 22) y con IRM anormal y respuesta (grupo 3: 12)

16 niños sanos

Grupo 1: 7,95 ± 4,1Grupo 2: 9,14 ± 1,9Grupo 3: 9,5 ± 4,6Grupo 4: 8,71 ± 7,2

8,56 ± 6,1 28/24 9/7 SOD, GPx, MDA

Verrotti et al., 2002 Chieti, Italia36 adolescentes epilépticos tratados con VPA (grupo A: 22) o con CBZ (grupo B: 14)

40 sujetos sanos sin ningún tratamiento antiepiléptico

Grupo A: 15,9 ± 1,8Grupo B: 16,4 ± 2,0

16,2 ± 1,9 16/20 18/22 SOD, GPx

Verrotti et al., 2008 Chieti, Italia31 pacientes con epilepsia criptogénica tratados con VPA

30 sujetos sanos 7,8 ± 2,4 Equipara-dos 15/16 Equipara-dos MDA, vitamina E

Yis¸ et al, 2009 Esmirna, Turquía48 pacientes epilépticos, recién diagnosticados (24) o tratados con VPA (24)

21 niños sanos

Grupo recién diagnos-ticados: 8,5 ± 3,12Grupo tratados: 9,37 ± 3,47

8,09 ± 4,31 23/25 13/8 SOD, GPx, MDA

Yuksel et al., 2001 Estambul, Turquía27 pacientes epilépticos sin tratamiento previo, tratados con VPA (14) o con CBZ (13)

25 niños sanosGrupo VPA: 6,92Grupo CBZ: 8,58

6,67 17/10 14/11 SOD, GPx, GSH, MDA

1No especificado.8-Epi-PGF2α: 8-epi-prostaglandina F2α; 8-OHdG: 8-hidroxi-20-desoxiguanosina; AQP4: acuaporina 4; CAT: catalasa; CBZ: carbamazepina; DE: desviación estándar; Dihomo-isoPs: dihomo-isoprostanos; F2-iso: F2-isoprotanos; ELT: epilepsia de lóbulo temporal; GPx: glutatión peroxidasa; GR: glutatión reductasa; GSH: glutatión reducido; HNE-PA: aductos proteicos del 4-hidroxi-2-nonenal (producto de la peroxidación lipídica); HSP-27: proteína de choque térmico 27; MDA: malondialdehído; Neuro-Ps: neuro-prostanos; NO: óxido nítrico; NOX2: NADPH oxidasa 2; OXC: oxacarbazepina; PAOP: productos avanzados de oxidación proteica; PON1: paraxonasa 1; P-SH/P: proteínas con grupos tiol por concentración proteica; RCD: derivados carbonínicos reactivos de proteínas; SOD: superóxido dismutasa; TAC: capacidad antioxidante total; TEAC: capacidad antioxidante equivalente al TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico); VPA: ácido valproico; XO: xantina oxidasa

112 113

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

Comparación de los resultados de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes epilépticos.

ReferenciaMuestra biológica

Biomarcador de estrés oxidativo

Resultados Comentarios

Araújo et al., 2018 SueroMDA ↑ Pacientes (201 ng/ml) vs. controles (137,4 ng/ml); p<0,0001.

Pacientes con ELT y trastorno depresivo mayor presentan niveles significativamente mayores de MDA y TEAC que pacientes epilépticos sin trastornos psiquiátricos.

Niveles de antioxidantes incrementados en el grupo de pacientes post-tratamiento vs. pacientes.

TEAC ↑ Pacientes (2,87 nmol/L) vs. controles (2,60 nmol/L); p<0,0001.

Arhan et al., 2011 Suero

MDA Sin cambios significativos en pacientes recién diagnosticados vs. controles sanos.El tratamiento con VPA no parece afectar al estatus oxidativo en pacientes epilépticos.

En los pacientes tratados con OXC se reducen significativamente los niveles de MDA a los 3 y 6 meses y de NO a los 3 meses de tratamiento.

El estudio carece de grupo placebo.Actividad XO Sin cambios significativos en pacientes recién diagnosticados vs. controles sanos.

NO↑ Pacientes recién diagnosticados (24,94 ± 15,50 μmol/mL)1 vs. controles (11,83 ± 3,23 μmol/mL)1; p<0,01.

Ben-Menachem et al. 2000

Eritrocitos

Actividad CAT Sin cambios significativos en pacientes vs. controles.

El tratamiento de los pacientes con el antioxidante N-acetilcisteína mejoraba notablemente los síntomas neurológicos.

No se midieron biomarcadores en estado de post-tratamiento.

Actividad GPx Sin cambios significativos en pacientes vs. controles.

Actividad CuZn-SOD ↑ Pacientes (60,5 ± 1,49 μ/mg Hb)1 vs. controles (65,9 ± 1,97 μ/mg Hb)1; p<0,03.

Plasma Actividad EC-SOD ↑ Pacientes (188 ± 27,2 ng/ml)1 vs. controles (148 ± 12,2 ng/ml)1; NS2.

Bidmon et al., 2004Neocórtex temporal

HSP-274Expresión en neocórtex de pacientes epilépticos principalmente en paredes vasculares y células gliales, mayor en procesos astrocíticos en contacto con la pared vascular que en las células endoteliales.No detectable en tejidos control procedentes de autopsias.

Dönmezdil et al., 2016

Suero

MDA ↑ Pacientes epilépticos (14,34 ± 3,59 nmol/mL)1 vs. controles sanos (13,53 ± 3,56 nmol/mL)1; NS2.

Actividad PON15 ↓ Pacientes epilépticos (0,65 ± 0,17 U/L)1 vs. controles sanos (0,71 ± 0,17 U/L)1; NS2.

Ercegovac et al., 2010

Plasma

Actividad SOD ↑ Pacientes epilépticos (2,49 U x 103/L) vs. controles (1,21 U x 103/L); p=0,001.

Incremento de la actividad de enzimas antioxidantes es probablemente un mecanismo adaptativo al aumento del estrés oxidativo.

Actividad GPx ↑ Pacientes epilépticos (556 U/L) vs. controles (298 U/L); p=0,001.

RCD6 ↑ Pacientes epilépticos (0,754 μmol/g proteína) vs. controles (0,505 μmol/g proteína); p=0,001.

P-SH/P6 ↓ Pacientes epilépticos (6,01 μmol/g proteínas) vs. controles (7,07 μmol/g proteínas); NS2.

Orina

8-Epi-PGF2α6 ↑ Pacientes epilépticos (1,39 ng/mg creatinina) vs. controles (0,60 ng/mg creatinina); p=0,001.

8-OHdG6 ↑Pacientes epilépticos (19,5 ng/mg creatina) vs. controles (6,61 ng/mg creatina); p=0,001.

TABLA 5.2.

Comparación de los resultados de los estudios revisados que evalúan biomarcadores de estrés oxidativo en pacientes epilépticos.

114 115

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

Grosso et al., 2011 Plasma

F2-iso7↑ Pacientes con encefalopatía epiléptica (181,2 ± 24,7 pg/ml)3 vs. controles (86,9 ± 10,9 pg/ml)3; p<0,005.

Sin diferencias significativas entre pacientes con epilepsia idiopática y controles sanos.

Estatus oxidativo alterado en encefalopatía epiléptica y el tratamiento con VPA no es un factor pro-oxidante por sí mismo.

PAOP ↑ Pacientes con encefalopatía epiléptica (148,7 ± 12,9 μg/dl)3 vs. controles (32,5 ± 4,4 μg/dl)3; p<0,001.

Hidroperóxidos totales ↑ Pacientes con encefalopatía epiléptica (720,5 ± 18,9 U)3 vs. controles (430,5 ± 14,6 U)3; p<0,03.

Günes et al., 2009 Eritrocitos

Actividad SOD↓ Pacientes con crisis febriles (20,90 ± 15,12 IU/ g Hb)1 vs. controles sin crisis (29,82 ± 18,81 IU/g Hb)1; p<0,045.

Actividad GPx ↑ Pacientes con crisis febriles (9,40 ± 2,19 IU/g Hb)1 vs. controles sin crisis (7,68 ± 1,72 IU/g Hb)1; p<0,01.

MDA↑ Pacientes con crisis febriles (3,84 ± 1,09 μmol/g Hb)1 vs. controles sin crisis (2,63 ± 1,30 μmol/g Hb)1; p<0,001.

López et al., 2007 Suero

Actividad CAT ↑ Pacientes a 6 meses post-cirugía vs. controles; p<0,05. Sin cambios significativos post-cirugía vs. pre-cirugía

Actividad SOD ↑ Pacientes pre-cirugía y a 1, 6, 12 y 24 meses post-cirugía vs. controles; p<0,05. Sin cambios significativos post-cirugía vs. pre-cirugía

Actividad GPx ↓ Pacientes pre-cirugía y a 1 y 6 meses post-cirugía vs. controles; p<0,05.Tendencia a la normalización tras cirugía; correlación positiva con tiempo post-cirugía (R=0,316, p<0,05).Sin cambios significativos post-cirugía vs. pre-cirugía

MDA ↑ Pacientes pre-cirugía y a 1, 6 y 12 meses post-cirugía vs. controles; p<0,05. Tendencia a la normalización tras cirugía; ↓ 12 y 24 meses post-cirugía vs. pre-cirugía (p<0,05).

PAOP ↑ Pacientes pre-cirugía y a 1, 6, 12 y 24 meses post-cirugía vs. controles; p<0,05. Tendencia a la normalización tras cirugía; ↓ 24 meses post-cirugía vs. p re-cirugía (p<0,05).

Medina et al., 2015

Orina

Neuro-Ps ↑ 4-F3t-NeuroP en pacientes epilépticos vs. controles; NS2.

Nivel total de NeuroPs/Dihomo-isoPs procedentes de la degradación de la membrana neuronal aumentado en pacientes vs. controles.

Nivel total de NeuroPs/Dihomo-isoPs procedentes del ataque de radicales libres a la mielina aumentado en pacientes vs. controles.

Dihomo-isoPs↑ 17-F2t-Dihomo-IsoP, Ent-7(R)-7-F2t-Dihomo-IsoP y Ent-7-epi-7-F2t-Dihomo-IsoP en pacientes epilépticos vs. controles; p<0,05.

Menon et al., 2012 Suero

MDA ↑ Pacientes (6,80 ± 2,84 μmol/ml)1 vs. controles (1,64 ± 0,82 μmol/ml)1; p<0,001. Sin diferencias significativas entre pacientes tratados y no tratados.

El incremento de marcadores de estrés oxidativo no está influenciado por el tratamiento con fármacos antiepilépticos.Carbonilación proteica ↑ Pacientes (0,71 ± 0,19 mg proteína/ml)1 vs. controles (0,46 ± 0,16 mg proteína/ml)1; p<0,001.

NO Sin cambios significativos en pacientes (50,41 ± 18,29)1 vs. controles (51,95 ± 9,56)1; p=0,45.

Mueller et al., 2001

ERM-1H en la región parieto-occipital de cada hemisferio cerebral

Ratio GSH/agua ↓ Pacientes epilépticos (1,6 ± 1,0 x 10-5) vs. controles (2,4 ± 1,1 x 10-5).

Sin diferencias significativas entre el hemisferio con foco epiléptico y el hemisferio sin foco epiléptico.Sin diferencias significativas entre pacientes con epilepsia activa y sin epilepsia activa.Evidencia de extensa alteración del sistema del GSH en epilepsia, independiente de la actividad epiléptica.

Ogurno et al, 2013

Plasma TAC ↓ Pacientes sin tratar (1,07 ± 0,13 mmol/L)1 vs. controles (1,96 ± 0,41 mmol/L)1; p<0,05.

Eritrocitos

Actividad CAT ↓ Pacientes sin tratar (1170,51 ± 49,6 U/g Hb)1 vs. controles (1416,12 ± 79,2 U/g Hb)1; p<0,05.

Actividad SOD ↓ Pacientes sin tratar (774,82 ± 72,63 U/g Hb)1 vs. controles (994,58 ± 18,27 U/g Hb)1; p<0,05.

Actividad GPx ↓ Pacientes sin tratar (21,13 ± 3,78 U/g Hb)1 vs. controles (36,56 ± 5,13 U/g Hb)1; p<0,01.

GSH ↓ Pacientes sin tratar (4,17 ± 0,5 μmol/g Hb)1 vs. controles (5,10 ± 0,8 μmol/g Hb)1; p<0,05.

MDA ↑ Pacientes sin tratar (4,99 ± 0,32 nmol/g Hb)1 vs. controles (2,81 ± 0,29 nmol/g Hb)1; p<0,05.

116 117

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

Pecorelli et al, 2015

Neocórtex temporal y, en algunos casos, hipocampo esclerótico

HNE-PANiveles elevados en hipocampo esclerótico.Localización preferente citoplasmática en astroglia y neuronas vs. membrana plasmática en neuronas apoptóticas.

NOX2Niveles elevados en el área C1A del hipocampo esclerótico.Localización preferente citoplasmática (inactivación) en neuronas aparentemente normales vs. membrana plasmática (activación) en neuronas apoptóticas.

AQP48↑ Neuronas positivas en neocórtex epiléptico (14,2 ± 10,5%)1 vs. control (1,45 ± 1,9%)1; p<0,001.↑ Neuronas positivas en hipocampo esclerótico (22,0 ± 12,7%)1 vs. no esclerótico (12,5 ± 9,2%)1; p<0,05.

Peker et al., 2009 Suero

Actividad CAT Sin cambios en pacientes (7,08 ± 3,04 μmol min/L)1 vs. controles (7,58 ± 2,52 μmol min/L)1; p=0,494.

El objetivo del estudio es investigar el efecto del VPA en marcadores de estrés oxidativo. Sin embargo, no hay grupo de pacientes epilépticos sin tratar, por lo que no es posible diferenciar entre efectos del tratamiento y efectos de la epilepsia.

Actividad SOD Sin cambios en pacientes (8,54 ± 0,86 U/ml)1 vs. controles (8,84 ± 0,74 U/ml)1; p=0,201.

MDA Sin cambios en pacientes (3,11 ± 0,27 μmol/L)1 vs. controles (3,34 ± 0,67 μmol/L)1; p=0,528.

NO ↑ Pacientes (56,66 ± 4,95 μmol min/L)1 vs. controles (51,45 ± 4,98 μmol/L)1; p<0,001.

Prasad et al., 2017

Eritrocitos

Actividad CAT ↓ Pacientes (5,7 ± 1,24 k/mL) vs. controles (9,39 ± 1,33 kl/mL); p<0,001.

La epilepsia parece causar estrés oxidativo en pacientes con epilepsia generalizada genética y el efecto prooxidante de los antiepilépticos podría conducir a un estrés oxidativo adicional que incrementaría la actividad epiléptica.

Actividad SOD ↓ Pacientes (606 ± 88 U/g Hb) vs. controles (843 ± 95,2 U/g Hb); p<0,001.

Actividad GPx ↓ Pacientes (53,8 ± 8,85 U/g Hb) vs. controles (76,7 ± 11,7 U/g Hb); p<0,001.

Plasma

TAC ↓ Pacientes (5,47 ± 1,23 μmol/L) vs. controles (8,58 ± 1,36 μmol/L); p<0,001.

MDA ↑ Pacientes (4,39 ± 1,65 nmol/mL) vs. controles (2,42 ± 0,87 nmol/mL); p<0,001.

NO ↑ pacientes (8,55 ± 2,0 μmol/mL) vs. controles (5,03 ± 1,27 μmol/mL); p<0,001.

Saad et al., 2014Eritrocitos

Actividad SOD ↓ Pacientes (1,693 ± 0,305 U/mg Hb)1 vs. controles (1,801 ± 0,301 U/mg Hb)1; NS2.

Actividad GPx↓ Pacientes (7,20 ±2,60 U/g Hb)1 vs. controles (14,80 ± 3,90 U/g Hb)1; p<0,001.

Plasma MDA ↑ Pacientes (6,32 ± 1,60 nmol/ml)1 vs. controles (2,58 ± 0,92 nmol/ml)1; p<0,001.

Sudha et al., 2002

Eritrocitos

Actividad CAT ↑ Pacientes (177.006 ± 23.069 U/g Hb)3 vs. controles (148.550 ± 16.686 U/g Hb)3; NS2.

Actividad SOD ↓ Pacientes (4.718 ± 267 U/g Hb)3 vs. controles (5.235 ± 239 U/g Hb)3; NS2.

Actividad GPx↓ Pacientes (9,03 ± 0,76 μmol NADPH oxidado/min/g Hb)3 vs. controles (7,94 ± 0,47 μmol NADPH oxidado/min/g Hb)3; NS2.

Actividad GR↓ Pacientes (0,61 ± 0,07 μmol NADPH oxidado/min/g Hb)3 vs. controles (1,08 ± 0,07 μmol NADPH oxidado/min/g Hb)3; p<0,0001.

↓ significativa en post-tratamiento (10 pacientes con fenobarbital durante 1 año) vs. pre-tratamiento.

MDA ↑ Pacientes (4.150± 278 mg/dl)3 vs. controles (3.159 ± 193 nmol/dl)3; p<0,01.

Plasma

Ceruloplasmina ↑ Pacientes (27,69 ± 1,63 mg/dl)3 vs. controles (17,47 ± 0,86 mg/dl)3; p<0,0001.

Vitamina A ↓ Pacientes (45,18 ± 6,23 μg/dl)3 vs. controles (70,14 ± 6,3 μg/dl)3; p<0,05

Vitamina E ↓ Pacientes (8,77 ± 0,52 mg/l)3 vs. controles (10,56 ± 0,69 mg/l)3; NS2.

Vitamina C ↓ Pacientes (15,62 ± 1,5 μmol/l)3 vs. controles (28,02 ± 2,12 μmol/d)3; p<0,001.

118 119

AN

EXO

5 A

NEX

O 5

Turkdogan et al., 2002

Eritrocitos

Actividad SOD↑ Pacientes sin anormalidad estructural, resistentes (2,23 ± 0,31 U/ml) o con respuesta a monoterapia (2,27 ± 0,22 U/ml) vs. controles (2,04 ± 0,14 U/ml); p<0,05.

Relaciona el aumento de peroxidación lipídica y disminución de sistemas antioxidantes con la presencia de anormalidad estructural, más que con la actividad epiléptica o la respuesta al tratamiento.Actividad GPx Sin cambios significativos en todos los grupos de pacientes vs. controles.

Plasma MDA↑ Pacientes con anormalidad estructural, resistentes (2,33 ± 0,96 U/ml) o con respuesta a monoterapia (2,93 ± 1,44 U/ml) vs. controles (1,49 ± 0,81 U/ml); p<0,05.

Verrotti et al., 2002 EritrocitosActividad CuZn-SOD Sin cambios significativos en los dos grupos de pacientes vs. controles. Sin diferencias significativas en pacientes epilépticos tras 1 año de tratamiento

con VPA o CBZ vs. pre-tratamiento.Actividad GPx Sin cambios significativos en los dos grupos de pacientes vs. controles.

Verrotti et al., 2008 Plasma

MDA↑ Pacientes tratados con ganancia de peso (0,92 ± 0,38 mmol/mg)1 vs. controles sanos (0,50 ± 0,77 mmol/mg)1; p<0,01. El aumento de marcadores de estrés oxidativo en niños con sobrepeso tras un año

de tratamiento con VPA es probablemente debido a la obesidad.Vitamina E

↓ Pacientes tratados con ganancia de peso (20,47 ± 15,06 μmol/L)1 vs. controles sanos (37,20 ± 14,67 μ mol/L)1; p<0,05.

Yis¸ et al, 2009 Eritrocitos

Actividad SOD↑ Pacientes recién diagnosticados (3018,13 ± 901,04 IU/g Hb)1 y pacientes con VPA (2944,08 ± 1073,18 IU/g Hb)1 vs. controles (2675,02 ± 794,79 IU/g Hb)1; NS2. Correlación positiva con la duración del tratamiento con VPA (r=0,481; p=0,017).

Actividad GPxSin cambios en pacientes recién diagnosticados (9,43 ± 1,73 IU/g Hb)1 y pacientes con VPA (9,74 ± 1,153 IU/g Hb)1 vs. controles (9,63 ± 2,10 IU/g Hb)1; NS2.

Sin correlación con la duración del tratamiento con VPA.

MDA↓ Pacientes recién diagnosticados (2,33 ± 0,46 μmol/g Hb)1 vs. pacientes con VPA (2,82 ± 0,78 μmol/g Hb)1 y vs. controles (2,70 ± 0,55 μmol/g Hb)1; p<0,05.

Sin correlación con la duración del tratamiento con VPA.

Yuksel et al., 2001

Eritrocitos

Actividad SOD Sin cambios significativos en los dos grupos de pacientes vs. controles. ↑ significativamente a 2 años de tratamiento con CBZ vs. pre-tratamiento.

Actividad GR Sin cambios significativos en los dos grupos de pacientes vs. controles. ↓ significativamente a 1 y 2 años de tratamiento con VPA vs. pretratamiento.

GSH Sin cambios significativos en los dos grupos de pacientes vs. controles. Sin diferencias significativas en pacientes tratados vs. pre-tratamiento.

PlasmaPeroxidación lipídica (MDA)

↑ Pacientes antes del tratamiento (grupo VPA: 4,57 ± 1,56 meq/ml; grupo CBZ: 6,29 ± 1,98 meq/ml) vs. controles (3,31 ± 0,61 meq/ml); p<0,01.

↑ significativamente a 1 y 2 años de tratamiento con VPA vs. pre-tratamiento.

1Media ± DE; 2NS, no significativo; 3media ± SEM; 4La inducción de HSP-27 se ha propuesto como marcador de células afectadas por estrés oxidativo in vitro y en modelos animales; 5Paraxonasa 1, éster hidrolasa presente en las HDL, relacionada con efecto antioxidante sobre HDL y LDL; 6Marcadores de oxidación proteica (RCD y P-SH/P), de lípidos (8-Epi-PGF2α) y del DNA (8-OHdG); 7F2-isoprostanos (8-iso-PGF2α), compuestos relacionados con las prostaglandinas formados no enzimáticamente por ataque directo de las ROS al ácido araquidónico; 8Acuaporina 4, canal acuoso implicado en la excitabilidad cerebral y en la epilepsia.8-Epi-PGF2α: 8-epi-prostaglandina F2α; 8-OHdG: 8-hidroxi-20-desoxiguanosina; AQP4: acuaporina 4; CAT: catalasa; CBZ: carbamazepina; DE: desviación estándar; Dihomo-isoPs: dihomo-isoprostanos; EC-SOD: superóxido dismutasa extracelular; ERM-1H: espectroscopia por resonancia magnética de protón; F2-iso: F2-isoprotanos; GPx: glutatión peroxidasa; GR; glutatión reductasa; GSH: glutatión reducido; Hb: hemoglobina; HNE-PA: aductos proteicos del 4-hidroxi-2-nonenal (producto de la peroxidación lipídica); HSP-27: proteína de choque térmico 27; MDA: malondialdehído; Neuro-Ps: neuro-prostanos; NO: óxido nítrico; NOX2: NADPH oxidasa 2; PAOP: productos avanzados de oxidación proteica; PON1: paraxonasa 1; P-SH/P: proteínas con grupos tiol por concentración proteica; RCD: derivados carbonínicos reactivos de proteínas; SEM: desviación estándar de la media; SOD: superóxido dismutasa; TAC: capacidad antioxidante total; TEAC: capacidad antioxidante equivalente al TROLOX (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico); VPA: ácido valproico

120 121

RES

UM

ENR

ESUM

EN

10. RESUMEN

EICOSANOIDES Y ESTRÉS OXIDATIVO EN EL NEOCÓRTEX DE PACIENTES CON EPILEPSIA RESISTENTE A FÁRMACOS TRATADOS MEDIANTE CIRUGÍA DE EPILEPSIA

10.1 INTRODUCCIÓNLa epilepsia es un trastorno neurológico grave que se caracteriza por la recurrencia de crisis epilépticas no provocadas, a menudo con efectos devastadores en los pacientes y su entorno. La generación de dichas crisis se relaciona con una situación anómala de hiperexcitabilidad e hipersincronía neuronales que desemboca en descargas eléctricas paroxísticas y en un daño cerebral potencialmente irreversible.

La epilepsia es la enfermedad neurológica crónica más frecuente que afecta a todos los grupos de edad, con más de 65 millones de pacientes en todo el mundo. Del total de pacientes epilépticos, aproximadamente un tercio no responde adecuadamente a un tratamiento farmacológico correcto.

Los pacientes con epilepsia resistente a fármacos sufren un mayor riesgo de daño cerebral, accidentes, muerte prematura y de exclusión sociolaboral que los pacientes con epilepsia controlada. Esta situación es particularmente grave en pacientes pediátricos. Por otra parte, más del 75% del gasto sanitario generado por la epilepsia se concentra en este grupo de pacientes.

En España, la prevalencia a lo largo de la vida de la epilepsia es de 14,87 casos por 1.000 personas mayores de 18 años. Por lo tanto, actualmente hay alrededor de 400.000 personas con epilepsia en España, y cerca del 30% son resistentes a los fármacos.

Un buen número de pacientes con epilepsia resistente a fármacos puede beneficiarse de un tratamiento neuroquirúrgico. La cirugía de la epilepsia no es en absoluto un tratamiento del último recurso para estos pacientes. De hecho, dada la evidencia acumulada y sus resultados favorables, la neurocirugía es el tratamiento de elección en determinados casos de epilepsia.

La cirugía de la epilepsia ofrece también una oportunidad única para estudio de muestras de cerebro epiléptico humano. Es esta oportunidad única una de las motivaciones fundamentales de la presente tesis doctoral. La elevada prevalencia de la enfermedad y la persistencia de crisis en una proporción notable de pacientes hace que la investigación en este campo sea especialmente necesaria.

La etiología exacta de la epilepsia no se conoce con exactitud. No obstante, cualquier lesión cerebral dependiendo de su gravedad tiene el potencial de inducir crisis que pueden convertirse más adelante en epilepsia. El progreso hacia tratamientos más eficaces de la epilepsia requiere conocer mejor los mecanismos subyacentes a la aparición de crisis epilépticas y al daño cerebral causado por las mismas.

Los modelos animales han sido básicos en la comprensión de la fisiopatología de la epilepsia y en los estudios preclínicos para desarrollo de nuevos fármacos. A pesar de su indiscutible utilidad, estos modelos presentan limitaciones, tanto por el predominio de experimentos con epilepsia aguda o por las diferencias metabólicas entre especies. Por ello sus hallazgos deberían ser corroborados por estudios en especímenes humanos. La cirugía de la epilepsia facilita el acceso a esta inestimable fuente de información mediante un acto terapéutico de eficacia y seguridad demostradas.

Hay pruebas sólidas que vinculan la neuroinflamación mediada por eicosanoides y el estrés oxidativo a la iniciación y progresión de la epilepsia en modelos experimentales.

Los eicosanoides (metabolitos del ácido araquidónico) son moléculas de señalización muy potentes, implicadas en una gran variedad de mecanismos fisiológicos y patológicos. Las crisis activan fosfolipasa A2 citosólica (PLA2), liberando el ácido araquidónico (AA) de los fosfolípidos de membrana. El AA es transformado en prostanoides (eicosanoides de la familia de las prostaglandinas (PG)) por el enzima ciclooxigenasa (COX). La isoenzima inducible de COX (COX-2) ve aumentada su transcripción en ante varios estímulos proinflamatorios o sustancias exógenas como el ácido kaínico (KA) o el pentilenotetrazol (PTZ), que inducen crisis en animales de laboratorio. El aumento de eicosanoides cerebrales en relación con las crisis epilépticas también se ha verificado en humanos.

La PGE2 es la prostaglandina principal en los modelos de inflamación aguda y crónica, tanto central como periférica. La PGI2 es la prostaglandina principal formada en los vasos sanguíneos cerebrales, y es un potente vasodilatador. El TXA2 es uno de los vasoconstrictores más potentes que se conocen, y se libera durante la agregación plaquetaria. Existen evidencias de que TXA2 también está implicado en procesos autoinmunes e inflamatorios cerebrales en humanos.

Así pues, el TXA2 induce vasoconstricción y la agregación plaquetaria, que pueden causar lesión neuronal isquémica y astrogliosis reactiva, mientras que prostaciclina I2 (PGI2) produce efectos opuestos en el lecho vascular y las plaquetas. Por tanto, el efecto final (vasodilatación o vasoconstricción, agregación plaquetaria o no) se basa menos en los niveles absolutos de dichos eicosanoides que en la relación entre ambos, es decir, la proporción de TXA2/PGI2.

La vía lipoxigenasa convierte el AA a leucotrienos (LT) por la activación de la enzima 5-lipoxigenasa (5-LOX), dando lugar a la biosíntesis de LTA4, LTB4, y de cisteinil-leucotrienos (LTC4 a LTF4). El LTB4 es un potente quimiotáctico, mientras que LTC4 y LTD4 aumentan la permeabilidad vascular, contribuyendo a la inflamación, en especial a nivel respiratorio.

Otra consecuencia importante de la activación COX-2 es la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) con efectos potencialmente dañinos sobre los lípidos, las proteínas y el ADN, lo que significa un aumento del estrés oxidativo del tejido cerebral. Las especies

122 123

RES

UM

ENR

ESUM

EN

reactivas de oxígeno se generan en este caso en el nivel del endoperóxido, durante la síntesis de los metabolitos de la COX.

El estrés oxidativo se define como el desequilibrio que surge en un sistema biológico cuando la actividad oxidante vinculada a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) excede la capacidad antioxidante endógena. Se considera que las ROS y las especies reactivas de nitrógeno (RNS) juegan un papel importante en diversas enfermedades del sistema nervioso, como el traumatismo craneoencefálico, enfermedad cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y ataxia de Friedreich.

El estrés oxidativo puede llegar a desencadenar crisis epilépticas. A su vez, una intensa actividad convulsiva, como la producida en modelos animales, puede llevar a efectos citotóxicos mediados por el estrés oxidativo.

De ahí nuestro interés en verificar el estado oxidativo en el cerebro epiléptico humano, analizando sus marcadores. Un mediador central del estrés oxidativo es el anión superóxido celular (O2

-), que influye tanto en procesos fisiológicos como patológicos.

La principal fuente fisiológica de O2- es la mitocondria, sede de la fosforilación oxidativa.

Los mecanismos citotóxicos por los cuales ROS inducen daño neuronal son tanto el ataque oxidativo directo sobre biomoléculas (proteínas, lípidos, ácidos nucleicos) como la iniciación o propagación de la reacción en cadena de radicales libres, que, en última instancia, conduce al daño macromolecular. La oxidación del ADN y la peroxidación lipídica son especialmente relevantes en la relación entre epilepsia y lesión neural en los humanos. Se ha establecido que ROS dañan el ADN por un mecanismo de oxidación, produciendo 8-oxo-7,8-dihydro-2´-desoxiguanosina (8-oxo-DG), considerado como uno de los biomarcadores más importantes de estrés oxidativo celular generalizado.

La lesión oxidativa por peroxidación lipídica de las neuronas es muy relevante debido su alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), muy susceptibles a la peroxidación lipídica. La oxidación de los PUFAs altera la estructura de la membrana y su permeabilidad, pudiendo ocasionar neurodegeneración en ultima instancia.

Además, la oxidación de los PUFAs de 20 átomos de carbono, como el ácido araquidónico, provoca una marcada alteración en el equilibrio eicosanoides (eicos=20). Como ya se ha mencionado, las principales consecuencias del desequilibrio eicosanoides en el cerebro están relacionadas con la microcirculación cerebral y con la neuroinflamación.

10.2 HIPÓTESIS

I. En el neocórtex de los seres humanos con epilepsia establecida se producen fenómenos neuroinflamación mediados por eicosanoides.

II. En el neocórtex de los seres humanos con epilepsia establecida se genera un estado de estrés oxidativo.

III. La intensidad de ambas alteraciones es proporcional a la gravedad de la epilepsia del paciente.

IV. La neuroinflamación y el estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes epilépticos son equivalentes a los descubiertos en los modelos experimentales de epilepsia.

V. Los modelos experimentales de epilepsia, pese a sus características (duración limitada, metabolismo no humano) son válidos, y proporcionan una información relevante sobre la neuroinflamación y el estrés oxidativo en neocórtex humano expuesto de manera crónica a crisis epilépticas.

10.3 OBJETIVOS

Aunque existen pruebas experimentales muy sólidas de la presencia de neuroinflamación y de estrés oxidativo cerebral en modelos experimentales de epilepsia, estos hallazgos no se han verificado de manera tan inequívoca en el cerebro epiléptico humano.

El propósito principal del presente estudio es determinar y comparar la presencia de neuroinflamación y estrés oxidativo en el neocórtex de humanos con y sin epilepsia, para confirmar ambos fenómenos en la fisiopatología de la epilepsia humana y sugerir así nuevas estrategias terapéuticas.

i. Neuroinflamación, a través de la determinación de niveles cerebrales de eicosanoides, incluyendo prostanoides (TXA2, la PGE2 y la PGI2) y leucotrienos (LTB4 y LTC4).

ii. Estrés oxidativo, cuantificando sus marcadores principales: especies reactivas de oxígeno (O2

-), actividad de enzimas antioxidantes (SOD, catalasa, GPx, GR) y marcadores de daño a biomoléculas (peroxidación de lípidos, oxidación de proteínas y oxidación de ácidos nucleicos).

iii. Identificar una posible correlación entre la intensidad de la alteración de los parámetros citados y la gravedad de la epilepsia del paciente.

iv. Comparar los hallazgos en muestras de neocórtex humano epiléptico con los obtenidos por los modelos experimentales de epilepsia, para contribuir a su validación mutua, y a la investigación traslacional en epilepsia.

10.4 MÉTODOS

10.4.1 Muestras de neocórtex humanoLos especímenes quirúrgicos se obtendrán de veinte (n = 20) pacientes con epilepsia resistente a fármacos, operados consecutivamente por el mismo cirujano en el Hospital Clínic de Barcelona. La selección de los pacientes candidatos a cirugía de la epilepsia, así como la determinación de la zona epileptógena a extirpar, se establecerá según los resultados del protocolo de evaluación multidisciplinaria de la Unidad de Epilepsia del Hospital Clínic de la Universitat de Barcelona. Se registrarán los parámetros más relevantes de la epilepsia de cada paciente, en especial la frecuencia media de las crisis antes de la cirugía.

124 125

RES

UM

ENR

ESUM

EN

El procedimiento neuroquirúrgico consistirá en la extirpación microquirúrgica de la zona epileptógena con el objetivo de controlar las crisis epilépticas. Con el fin de mantener una uniformidad entre las muestras, todas ellas procederán de tejido neocortical. De esta porción principal, apartaremos una muestra neocortical de aproximadamente 1 cm3, que se congelará en el quirófano inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido, y quedará almacenada a −80º C en el laboratorio. El Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona ha autorizado este estudio.

Los especímenes de control, muestras de corteza cerebral humana no epiléptica (n = 11), serán proporcionadas por el Banco de Tejidos Neurológicos del Instituto de Neuropatología del Hospital Universitario de Bellvitge. Dichas muestras procederán de donantes cuya causa de fallecimiento no podrá estar relacionada con enfermedades o lesiones cerebrales.

10.4.2 Determinación de niveles de eicosanoides y de marcadores de estrés oxidativo• Ensayo eicosanoides: Enzimoinmunoensayo• Anión superóxido (O2

-): Técnica de bioluminiscencia por reacción con Tyrode y lucigenina.• Superóxido dismutasa (SOD): Método espectrofotométrico de auto-oxidación de la

quecitina por O2-.

• Catalasa: Método espectrofotométrico. Reacción catalasa-metanol con supresión del H2O2 de la muestra.

• Glutatión peroxidasa (GPX): Método espectrofotométrico. Reducción de hidroperóxido de tert-butilo y oxidación de la NADPH.

• Glutatión Reductasa (GR): Método espectrofotométrico. Oxidación de NAPDH.• Peroxidación lipídica: Método espectrofotométrico. Sustancias reactivas del ácido

tiobarbitúrico (TBARS) con el malondialdehído (MDA).• Determinación de proteínas: Método espectrofotométrico de determinación de fenoles

provenientes de la tirosina de folín-Ciocalteu.• Oxidación de ADN: Determinación de 8-oxo-dG mediante cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC).

10.5 RESULTADOS

10.5.1 Niveles de eicosanoides en el neocórtex de pacientes con epilepsia • Los tres metabolitos de la vía COX (PGE2, TXA2 y PGI2) mostraron un notable aumento

en las muestras de pacientes con epilepsia.• La relación TXA2/PGI2 es un marcador de neuroinflamación más representativo que los

valores absolutos en sí mismos. En el neocórtex epiléptico, los niveles del TXA2 fueron 2 veces superiores a los niveles de la PGI2.

• En la vía de la LOX, los resultados obtenidos para el LTB4 y el LTC4 fueron indetectables con nuestro enfoque metodológico.

• El análisis de correlación entre los niveles de los eicosanoides y la frecuencia de CF en cada paciente detectó una correlación positiva para TXA2 y PGI2.

10.5.2 Marcadores de estrés oxidativo en el neocórtex de pacientes con epilepsia• Detectamos un incremento muy importante en los niveles de O2

- en el neocórtex de pacientes epilépticos, del 337% en los pacientes epilépticos en relación con el grupo control.

• La actividad de la enzima SOD no mostró diferencias significativas entre el control y el grupo de pacientes epilépticos.

• La actividad de la catalasa presentó un incremento del 95% en relación con el grupo de control.

• La actividad de la enzima GPx en el neocórtex epiléptico fue el 30% menor que en los controles.

• Los niveles de TBARS, indicadores de peroxidación lipídica, no mostraron diferencias significativas.

• Con respecto al daño crónico al ADN inducido por las ROS, la 8-oxo-2’-desoxiguanosina (8-oxo-dG) presentó un aumento del 284% en relación con el grupo control.

10.6 DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos de la corteza epiléptica humana han sido contrastados con los obtenidos a partir de animales de laboratorio, en los cuales las crisis suelen ser provocadas con KA, PTZ o pilocarpina. Estos agentes pueden inducir crisis límbicas progresivos en las ratas, que se asemejan a la epilepsia humana del lóbulo temporal, el tipo más común de epilepsia humana adulta. Todos los pacientes en el presente estudio, excepto uno, padecían de epilepsia del lóbulo temporal. Los hallazgos en nuestros pacientes coinciden en gran medida con los resultados en modelos experimentales

Nuestros resultados muestran un aumento significativo en los metabolitos de ácido araquidónico de la vía de la COX, PGE2, TXA2 y de PGI2 en las muestras neocorticales de pacientes epilépticos, en comparación con los resultados obtenidos en las muestras de sujetos no epilépticos del grupo control. El aumento observado de eicosanoides en pacientes epilépticos está de acuerdo con los datos que implican la liberación y transformación de ácido araquidónico durante las crisis.

Nuestro hallazgo de una correlación positiva entre la frecuencia de crisis focales para un paciente dado y el aumento de los niveles de dos eicosanoides (TXA2 Y PGI2) indica un carácter acumulativo o progresivo de la neuroinflamación con las crisis, especialmente de los mecanismos microvasculares.

No evidenciamos activación de la vía lipoxigenasa (LTB4 Y LTC4). Este resultado está de acuerdo con los obtenidos por otros autores en modelos de inducción de crisis con KA y PTZ. La ausencia de leucotrienos en el neocórtex de nuestros pacientes evidencia que la vía principal en fenómenos inflamatorios en el cerebro humano es la de COX.

Las convulsiones inducidas por KA en modelos animales aumentan los niveles de PGE2 en hipocampo y corteza cerebral. Hay pruebas experimentales de que PGE2, una de las principales prostaglandinas sintetizadas en el cerebro de los mamíferos, facilita las convulsiones y la muerte neuronal. Inhibidores de la COX-2 como el Celecoxib, o el Rofecoxib, disminuyen los niveles de PGE2 y limitan la muerte neuronal causada por las crisis, la activación microglial, la neurogénesis y la astrogliosis reactiva en el hipocampo y neuronas corticales.

El anión del superóxido (O2-) demostró un aumento altamente significativo en el neocórtex

de los pacientes con epilepsia. La importancia de este radical libre en la inducción de crisis

126 127

RES

UM

ENR

ESUM

EN

se sustenta en los resultados obtenidos con animales transgénicos. Los ratones transgénicos que sobreexpresan el SOD mitocondrial (SOD2) son resistentes daño neuronal oxidativo inducido por las crisis, mientras que los ratones con deficiencia parcial de SOD2 (Sod2±) sufren una la exacerbación de la susceptibilidad a las crisis. Estos estudios sugieren que O2

-

puede desempeñar un papel muy importante en el daño cerebral inducido por crisis. No hemos encontraron diferencias significativas en la actividad de la SOD. Los estudios experimentales sobre SOD y epilepsia también obtienen resultados aparentemente contradictorios. Este hallazgo negativo se podría explicar por el aumento simultáneo de la expresión y de la degradación SOD causada por el estrés oxidativo. Por ejemplo, por la capacidad de H2O2 de inactivar SOD.

La catalasa es capaz de eliminar grandes cantidades de H2O2 muy rápidamente, aunque sus niveles son comparativamente más bajos en el tejido cerebral que en otros órganos. Hemos encontrado un aumento significativo de la catalasa se encontró en el neocórtex de los pacientes epilépticos, coincidiendo con los resultados obtenidos en animales de laboratorio. El aumento notable en actividad de la catalasa se interpreta como respuesta antioxidante enzimática al aumento de la producción de ROS.

GPX es muy eficiente en la destrucción de pequeñas cantidades de H2O2. Los resultados en pacientes con epilepsia muestran una disminución significativa en los niveles de GPX, que podría ser el resultado del aumento de su inactivación. Los resultados en animales de laboratorio para GPX presentan resultados contradictorios. Nuestros hallazgos con respecto al sistema GPX-GR parecen indicar que este sistema desempeña un papel menor como scavenger de radicales libres en la corteza epiléptica humana, pero suficiente para los mantener el glutatión en su estado reducido (GSH).

En cuanto a la peroxidación lipídica, hemos encontrado diferencias entre los niveles de TBARS en muestras y controles epilépticos. En los modelos de KA y pilocarpina, se produce un aumento transitorio de TBARS, que se normaliza en unas 12 horas. Esta “normalización” puede sugerir hipometabolismo, pérdida neuronal y/o mecanismos compensatorios que pueden estar modulando activamente las enzimas relacionadas con el catabolismo de ROS.En cuanto a la oxidación del ADN, encontramos un aumento muy significativo en los niveles de 8-oxo-DG en los pacientes con epilepsia en comparación con los controles. Se han observado resultados paralelos en los modelos agudos y crónicos de epilepsia, y afecta especialmente al ADN mitocondrial. Si las crisis son continuadas, la capacidad de reparación del ADN (vía BER) puede quedar desbordada y producirse daños permanentes en el ADN, envejecimiento celular y apoptosis.

En resumen, los hallazgos presentados coinciden con los de los modelos experimentales. Puede afirmarse que el estrés oxidativo es un fenómeno clave también en la epilepsia humana. El aumento en la catalasa y la disminución en GPX, junto con los niveles estables de GR, sugieren que la catalasa sea el antioxidante enzimático principal en la corteza epiléptica humana. El aumento sustancial de los niveles de O2

- y 8-oxo-DG en pacientes epilépticos, dan soporte a la conexión entre las crisis crónicas y el daño neural mediado por ROS. La modulación del equilibrio oxidativo podría tener potencial terapéutico en epilepsia.

10.7 CONCLUSIONES

1. El marcado incremento de los niveles de prostaglandinas y tromboxano en pacientes tratados mediante cirugía confirma la presencia de neuroinflamación mediada por eicosanoides en el cerebro de pacientes con epilepsia.

2. El aumento de los marcadores de estrés oxidativo a nivel cerebral, junto con el aumento de la peroxidación lipídica y la oxidación del ADN, corroboran un estado de estrés oxidativo sostenido en la epilepsia humana.

3. La relación entre la frecuencia de crisis epilépticas focales de los pacientes y sus niveles neocorticales de Tromboxano A2 y de Prostacilclina, indica cierto grado de proporcionalidad entre la gravedad de la epilepsia y el daño neural asociado.

4. La coincidencia de los hallazgos en el cerebro humano con epilepsia establecida valida los resultados obtenidos en los modelos experimentales, pese a sus disparidades metodológicas.

5. La inhibición selectiva de la síntesis o de los receptores de prostanoides, y los tratamientos dirigidos a restablecer el equilibrio oxidativo cerebral podrían ser nuevas líneas de investigación terapéutica en la epilepsia.

En la actualidad, la gran mayoría de los llamados “fármacos antiepilépticos” tiene como diana terapéutica el control de la hiperexcitabilidad e hipersincronía neuronal mediante la modulación de los canales iónicos y de la neurotransmisión. Por lo tanto, su acción principal es en realidad “anticonvulsivante”. Esta estrategia, aunque realmente efectiva en el control de las crisis, no aborda el problema de la instauración y progresión de los cambios patológicos que constituyen el sustrato de la epilepsia.

Si el daño neural causado por las crisis está vinculado al estrés oxidativo y a la neuroinflamación, cabe suponer que tratamientos dirigidos a modular estos fenómenos podrían no sólo limitar el daño causado por las crisis, sino que, aplicados en fases iniciales, tendrían el potencial de modificar la consolidación o la progresión de la enfermedad epiléptica.

128 129

SUM

MA

RY

SUM

MA

RY

11. SUMMARY

EICOSANOID LEVELS AND OXIDATIVE STRESS MARKERS IN THE NEOCORTEX OF DRUG-RESISTANT EPILEPSY PATIENTS TREATED WITH EPILEPSY SURGERY.

11.1 INTRODUCTION

Epilepsy is a serious neurological disorder manifested by recurrence of unprovoked seizures resulting in devastating effects on patients and their caregivers. Seizure generation is related with underlying abnormal hyperexcitability and hypersynchronous paroxysmal cerebral discharges from the neurons which eventually results in irreversible damage to them and their surroundings.

Epilepsy is the most frequent chronic neurological disease affecting all age groups, afflicting more than 65 million people worldwide. Over 100,000 new cases are added every year. Among epileptic patients, about 30% of them are refractory to the current antiepileptic drugs and continue to suffer epileptic seizures despite correct drug treatment. In Spain, the lifetime prevalence of epilepsy is 14.87 cases per 1,000 people aged 18 years and over: 5.79 cases of active epilepsy and 9.08 cases of inactive epilepsy. Therefore, there are currently about 700,000 people with chronic epilepsy in Spain, and near 30% of them are drug-resistant. More than 75% of the financial burden generated by epilepsy is concentrated in this drug-resistant group of patients.

Many patients suffering from drug-resistant epilepsy may be cured or alleviated through surgery. Epilepsy surgery is not at all a treatment of last resort for patients with drug-resistant epilepsy. Indeed, given the abundant experience and the favorable results, neurosurgery is the treatment of choice in selected patients. Furthermore, epilepsy surgery also offers a unique opportunity to study human epileptic brain.

The exact etiology of epilepsy is not well understood, but any kind of insult to the brain depending on its severity has a potential to induce seizures which can later develop into epilepsy. The progress towards more effective treatments of epilepsy requires to understand the mechanisms underlying the appearance of epileptic seizures and the brain damage caused by them. Its high prevalence and the medically intractable nature in some of the patients make it of a top priority for research. Animal models have been instrumental in understanding the pathophysiology of epilepsy and for the preclinical studies for new drug discovery.

There is solid evidence linking neuroinflammation mediated by eicosanoids and oxidative stress to the initiation and progression of epilepsy in experimental models, yet to be fully verified in human epilepsy.

Eicosanoids (Arachidonic acid metabolites) are very powerful signaling molecules implicated on a great variety of physiological and pathological mechanisms. Seizures activate cytosolic phospholipase A2 (PLA2), releasing arachidonic acid (AA) from membrane phospholipids. AA is transformed into prostanoids (prostaglandin (PG) family signaling molecules) by Cyclooxygenase (COX). The inducible isoenzyme of COX, COX-2, is stimulated rapidly in several cell types in response to various stimuli, as pro-inflammatory molecules, and also by substances like kainic acid (KA) or pentylenetetrazol (PTZ) that induce seizures in laboratory animals. Similar results have been obtained in patients suffering drug-resistant epilepsy.

PGE2 is the major prostaglandin produced, both centrally and in the periphery, in models of acute and chronic inflammation. The principal prostaglandin formed by cerebral blood vessels and capillaries is PGI2, which is a potent vasodilator of the cerebral vascular bed. By far, the most potent contractor of cerebral vessels is TXA2 released from platelets aggregation or from other activated blood cells; TXA2 formation in human brain is detectable in inflammatory and autoimmune reactions. Thus, TXA2 induces vasoconstriction and aggregation which may lead to ischemic neuronal injury, while Prostacyclin I2 (PGI2) produces opposite effects on microvessel and platelets. Therefore, the final effect (vasodilation or vasoconstriction, platelet aggregation or not) relies less on the absolute levels of eicosanoids than in the relationship between both, i.e. the ratio of TXA2/PGI2.

The lipoxygenase pathway converts AA to leukotrienes (LT) by the activation of the 5-lipoxygenase enzyme (5-LOX), which gives rise to the biosynthesis of LTA4, LTB4, and the cysteinyl leukotrienes (LTC4 to LTF4). LTB4 is a powerful chemotactic and chemokinetic agent, LTC4 and LTD4 increase vascular permeability; these mediators contribute to inflammation.Another important consequence of COX-2 activation is the generation of reactive oxygen species with potentially damaging effects on lipids, proteins, and DNA which means an increase in brain tissue oxidative stress. The reactive oxygen species are generated, at the endoperoxide level, during the synthesis of COX metabolites.

Oxidative stress is defined as an imbalance that arises when the oxidizing activity linked to it production of species reactive of oxygen (ROS) exceeds the endogenous antioxidant capacity. Both ROS and reactive nitrogen (RNS) species are considered to play an important role in various diseases of the nervous system such as traumatic brain injury, stroke, Parkinson’s, Alzheimer’s, Huntington’s diseases, amyotrophic lateral sclerosis and Friedreich ataxia. Oxidative stress is known to be triggered also by epileptic seizures. Conversely, intense seizure activity such as the produced in animal models, can lead to cytotoxic effects mediated by oxidative stress. There would be of interest to verify the oxidative status in human epileptic brain, by analyzing its mediators. A central mediator of oxidative stress is cellular superoxide anion (O2

-), which influences both physiological and pathological processes.

The main physiological sources of O2- are mitochondria. The cytotoxic mechanisms by which

ROS induce neuronal damage may involve direct oxidative attack on cellular macromolecules (protein, lipids, DNA and sugars) and initiation or propagation of free radical chain reaction, ultimately leading to macromolecular damage.

130 131

SUM

MA

RY

SUM

MA

RY

The issues of DNA oxidation and lipid peroxidation are also considered to be relevant to relate epilepsy and oxidative neural injury in humans. It has been established that ROS damages DNA by an oxidation mechanism, producing 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxo-dG), which is considered to be an important biomarker of generalized cellular oxidative stress. Lipid peroxidation is also highly relevant in brain because of its high polyunsaturated fatty acid (PUFA) content, which are prone to lipid peroxidation. The oxidation of PUFA causes them to be more hydrophilic, thereby altering the structure of the membrane with resultant changes in fluidity and permeability, resulting in neurodegeneration. Furthermore, the oxidation of 20-carbon PUFA provokes a marked imbalance in the eicosanoid equilibrium (eicos=20). Eicosanoids (prostaglandins, thromboxanes, leukotrienes, and others) are synthetized from the arachidonic acid released from membrane phospholipids during seizures, through the cyclooxygenase (COX) and the lipoxygenase (LOX) pathways. The main consequences of eicosanoid imbalance in the brain are related to cerebral microcirculation and to neuroinflammation.

11.2 HYPOTHESIS

I. Neuroinflammation mediated by eicosanoids’ imbalance does occur in the neocortex of humans with chronic epilepsy.

II. There exists a sustained state of oxidative stress in the neocortex of humans with chronic epilepsy.

III. The intensity of both disturbances is proportional to the severity of the patient’s epilepsy. IV. Neuroinflammation and oxidative stress in the neocortex of epileptic patients are

equivalent to those discovered in experimental models of epilepsy.

V. Experimental models of epilepsy, despite its characteristics (limited duration, non-human brain) are valid, and provide relevant information on neuroinflammation and oxidative stress in human neocortex chronically exposed to seizures. Such verification might support further research on alternative therapeutic strategies in epilepsy.

11.3 OBJECTIVES

Even though there is solid experimental evidence of the presence of neuroinflammation and cerebral oxidative stress in experimental models of epilepsy, these findings have not been verified so unequivocally in the human epileptic brain.

i. The main purpose of this study is to determine and compare the presence of eicosanoid-mediated neuroinflammation and oxidative stress in the neocortex of humans with and without epilepsy, to confirm both phenomena in the pathophysiology of human epilepsy and eventually suggest novel therapeutic strategies.

ii. Neuroinflammation, through the determination of cerebral levels of eicosanoids, including Prostanoids (TXA2, PGE2 and PGI2) and Leukotrienes (LTB4 and LTC4).

iii. Oxidative stress, quantifying its main markers: reactive oxygen species (O2-), antioxidant

enzyme activity (SOD, catalase, GPx, GR) and markers of damage to biomolecules (lipid peroxidation, protein oxidation and DNA oxidation).

iv. To identify a possible correlation between the intensity of alteration of the parameters cited and the severity of patient’s epilepsy.

v. To compare the findings in human brain specimens with those achieved from experimental models of epilepsy to contribute to their mutual validation regarding translational research in epilepsy.

11.4 METHODS

11.4.1 SubjectsSurgical specimens were obtained from twenty (n = 20) epileptic patients suffering from drug-resistant who were operated consecutively by the same surgeon at the Hospital Clínic of Barcelona. The seizure onset zone was localized as revealed by physical, neuropsychological, and psychiatric examination, Magnetic Resonance Imaging (MRI), Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT), Positron Emission Tomography (PET), and long-term video monitoring. The seizure onset zone was removed surgically to achieve seizure control. The main portion of the resected tissue was submitted for pathological evaluation. A neocortical sample of approximately one cm3 was separated from it and immediately frozen by immersion in liquid nitrogen in the operating room and stored at −80 ºC in the laboratory. The control, non-epileptic cortex samples (n = 11) were provided by the Neurological Bank of Tissues of the Neuropathology Institute, Bellvitge University Hospital, University of Barcelona (Bellvitge, Barcelona, Spain), from donors whose cause of death was confirmed as unrelated to brain disease or injury.

Ethical approval for this study was granted by the Ethics Committee of the Hospital Clínic, University of Barcelona.

11.4.2 Assays• Eicosanoids Assay: Enzyme immunoassay• Superoxide Anion (O2-): Bioluminiscence technique by Tyrode and lucigenin reaction.• Superoxide Dismutase (SOD): Spectrophotometric method of self-oxidation of quercitin

by O2-.

• Catalase: Spectrophotometric method of suppression of H2O2 in the sample with catalase-methanol reaction.

• Glutathione Peroxidase (GPx): Spectrophotometric method of reduction of tert-butyl hydroperoxide and NADPH oxidation.

• Glutathione Reductase (GR): Spectrophotometric method of NADPH oxidation.• Lipid peroxidation: Spectrophotometric method measuring MDA TBARS.• Protein determination: Spectrophotometric method of Folin–Ciocalteu reagent (FCR) or

Folin’s phenol reagent. • DNA oxidation: Measure of 8-oxo-dG by means of high performance liquid

chromatography (HPLC).

132 133

SUM

MA

RY

SUM

MA

RY

11.5 RESULTS

11.5.1 Eicosanoid imbalance, neuroinflammation• The metabolites of the COX pathway assayed, PGE2, TXA2 and PGI2, displayed a

noteworthy increase in neocortical samples from epileptic patients when compared with the control group samples. For the three metabolites the statistical significance was P<0.001. A 3.8, 9.7 and 4.3-fold increase was obtained in relation to the control group for PGE2, TXA2 and PGI2 respectively.

• The ratio between TXA2 and PGI2 is considered a more significant data than the independent values themselves. In epileptic neocortex the levels of TXA2 found were 2 times higher than the levels of PGI2. In contrast, the control group displayed levels of TXA2 slightly lower than PGI2.

• The correlation analysis between eicosanoids levels and focal seizure frequency for each patient detected a positive correlation For TXA2 (r = 0,9970, p ≤ 0.05) and PGI2 (r = 0,9970 and P ≤ 0.05). On the contrary, no significant correlation was found between the levels of PGE2 and the frequency of focal seizures.

11.5.2 Oxidative stress markers• Superoxide Anion (O2-): displayed an important difference between the mean values in

control group and epileptic group, -72.23 units / g protein / min (CI 95%: -92.26 ÷ -62.20) (P ≤ 0.001). The observed difference corresponds to a 337% increase in relation to the control group.

• Superoxide Dismutase (SOD) had no significant differences between the means of control and epileptic group.

• Catalase showed a significant difference between the means of control and epileptic group, -12.14 ng / mg protein, (CI 95%: -19.06 ÷ -2.41) (P ≤ 0.01). The observed difference represents a 95% increase in relation to the control group.

• The differences between the means of control and epileptic group in Glutathione Peroxidase (GPx) were 24.52 units/g protein (CI 95 %: 3.17 ÷ 46.96) (P ≤ 0.05), being the difference in percentage of 30 %.

• Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), the classical parameter to detect lipid peroxidation did not show a significant difference between the means of the control and epileptic group.

• • Regarding chronic DNA damage induced by ROS, 8-oxo-dG displays an important

difference between the means of control and epileptic group, -11.25 8-oxo-dG / 106 dG (CI 95%: -13.99 ÷ -8.51) (P ≤ 0.001). The observed difference corresponds to a 284 % increase in relation to the control group.

11.6 DISCUSSION

The presented results obtained from human epileptic neocortex have been contrasted with those obtained from laboratory animals, in which seizures are usually provoked with KA, PTZ or pilocarpine. These agents are able to induce progressive limbic seizures in rats, which resemble human temporal lobe epilepsy, the most common type of adult human epilepsy. All patients in the present study but one suffered from temporal lobe epilepsy. Despite having different etiologies, similarities in the pathology between human conditions

and experimental models are likely to result from common mechanisms underlying the generation of spontaneous seizures in both situations. This extrapolation appears to be verified by the present results.

Our results show a significant increase in the arachidonic acid metabolites of the cyclooxygenase pathway, PGE2, TXA2 and PGI2 in the neocortical samples from epileptic patients, when compared with the results obtained in the samples from non-epileptic subjects (control group). The observed increase of eicosanoids in epileptic patients is in accordance with the data that implicates seizures in the liberation of arachidonic acid.

Our finding of a positive correlation between focal seizure frequency for a given patient and the increase in the levels of two eicosanoids (TXA2 and PGI2) gives further support to these findings in humans. In the control group the levels of arachidonic acid metabolites obtained where very low, which most probably is due to the lack of seizures or any other brain injury.

We found no activation of the lipoxygenase pathway (LTB4 and LTC4). This result agrees with those obtained by other authors in KA and PTZ induced seizures in rats. The absence of leukotriene synthesis illustrates that COX pathway is dominant in neocortex of epileptic patients.

Seizures induced by KA, increase the levels of PGE2 in the hippocampus and neocortical neurons. There is experimental evidence that PGE2, one of the major prostaglandins synthesized in the mammalian brain, facilitates convulsions and neuronal death. COX-2 inhibitors such as celecoxib, rofecoxib, decrease the levels of PGE2 and significantly reduce epilepsy-related neuronal death, microglial activation, inhibit the neurogenesis and the astrogliosis in the hippocampus and neocortical neurons.

Transgenic animals overexpressing human COX-2 at neuronal levels display a clear increase in the intensity and lethality of the KA induced excitotoxicity. Consistently, COX-2 knockout mice show inborn protection against PGE2 increase and neuronal death induced by KA.

The administration of convulsant doses of PTZ induced an increase in TXA2 in the mouse brain tissue, being the onset of TXA2 increase coincident with the appearance of seizures. The treatment with TXA2 synthesis inhibitors that selectively decrease TXA2 production in brain, however, had no effect on tonic seizure threshold.

In relation to PGI2, in a model of induced convulsions be electroshock, the intra cerebrum-ventricular administration of PGI2 blocks the incidence of tonic convulsions in mice and protects the animals from death induced by the convulsions. Although we found an increase in the levels of PGI2 in epileptic neocortex, our data also show that there is twice more TXA2 than PGI2 in the neocortical samples obtained from epileptic patients. The predominance of TXA2 has been related to vasoconstriction and platelet aggregating activity that may contribute to neuronal damage.

The present study demonstrates a significant increase in the levels of three eicosanoids derived from the cyclooxygenase pathway (PGE2, TXA2, and PGI2) in cortex samples obtained from drug-resistant epileptic patients submitted to neurosurgery. In contrast, no detectable levels were found in the eicosanoids derived from the lipoxygenase pathway (LTB4 and

134 135

SUM

MA

RY

SUM

MA

RY

LTC4) suggesting that the COX pathway is dominant in the neocortex of epileptic patients. Our data also validate the results obtained in animal epilepsy models, supporting an extrapolation from experimental results to clinical application. The important increase in COX metabolites, PGE2 and TXA2 in epileptic patients, gives support to the relevance of an inflammatory process in epilepsy, and suggests that selective inhibition of prostanoid synthesis or blockage of prostanoid receptors might provide novel antiepileptic strategies for human epilepsy.

Superoxide anion showed a highly significant increase in the neocortex of drug-resistant epileptic patients when compared with the control group. The importance of this free radical in seizure induction is supported by results obtained with transgenic animals. Transgenic mice overexpressing mitochondrial SOD (SOD2) are resistant to seizure-induced neural damage, whereas mice with partial SOD2 deficiency (SOD±) showed exacerbation of these effects, with increased seizure susceptibility. These studies suggest that O2

− may play an important role in seizure-induced brain damage.

Researchers have observed contradictory results in the levels of SOD, the enzyme that dismutates O2

−, either in acute and chronic experimental models. We did not find significant differences in the activity of SOD in epileptic neocortex when compared to controls. The unchanging SOD activity might be explained by simultaneous upregulation of SOD and its degradation caused by oxidative stress due, for instance, to the ability of H2O2 to inactivate SOD.

Catalase is able to scavenge great amounts of H2O2 very rapidly, being its levels lower in brain tissue than in other organs. A significant increase in catalase was found in the neocortex of epileptic patients, matching the results obtained in laboratory animals both in acute and chronic models of epilepsy. The remarkable increase in catalase activity is interpreted as an enzymatic antioxidant response to augmented basal free radical production, harmful for neural tissue; also suggesting that free radical scavenging may be involved in controlling seizure-induced neural damage.

GPx is very efficient in the destruction of small amounts of H2O2. The results in epilepsy patients show a significant decrease in the levels of GPx, which could be the result of increased protein inactivation or degradation. The results in laboratory animals for GPx present conflicting results. Our findings regarding GPx—GR system can be interpreted as if this system played a minor role as free radical scavenger in human epileptic cortex, but sufficient enough to maintain glutathione in the reduced state (GSH).

The finding of an increase in catalase and a concurrent decrease in GPx gives support to the idea that the balance between SOD and catalase on one hand, and GPx on the other, is more important than the absolute amount of single antioxidant enzymes, as far as sensitivity to free radicals is concerned.

Regarding lipid peroxidation, similar TBARS levels were found in epileptic samples and controls. In kainic acid and pilocarpine models, increased TBARS were reported 12—14 h posttreatment, which later decreased or reached basal levels. This ‘‘normalization’’ may suggest hypometabolism, neuronal loss and/or compensatory mechanisms that may be actively modulating enzymes related to ROS catabolism.

Concerning DNA oxidation, we found a highly significant increase in the levels of 8-oxo-dG in epilepsy patients when compared to controls. Parallel results have been observed in acute and chronic models of epilepsy. High levels of H2O2 and O2

− may trigger the production of highly reactive species hydroxyl radical (OH•). This radical has a great affinity towards guanine in DNA and in the nucleotide pool, increasing the formation of 8-oxo-dG.

Acute status epilepticus caused increased oxidative mtDNA damage, together with mitochondrial H2O2 production, activation of mtBER pathway to attempt to repair mtDNA lesions, and a transient decrease in mtDNA repair capacity.

Recurrent seizures associated with chronic epilepsy coincided with mitochondrial ROS production which is expressed by elevated mitochondrial oxidative stress, as demonstrated by increased H2O2 and O2

− levels, accumulation of mtDNA damage, a complete failure of mtBER response, and impaired mtDNA repair capacity. Our results support the association between DNA oxidation and chronic seizures in human epilepsy.

In summary, the presented findings agree with those found in animal experimental models, and strongly suggest that oxidative stress may be a key phenomenon also in human epilepsy. The increase in catalase and decrease in GPx, together with the unchanging SOD levels, suggest that catalase is the main enzymatic antioxidant in human epileptic neocortex, while GPx and SOD do not appear to be major free radical scavenger systems in epilepsy. Besides, the substantial increase in the levels of O2 − and 8-oxo-dG in epileptic patients, give support to the connection between chronic seizures and ROS-mediated neural damage. Modulation of the oxidative balance might be considered as a potential therapeutic approach in epilepsy.

11.7 CONCLUSIONS

1. The imbalance between harmful Eicosanoids “protectors” and “toxic” is significantly altered in the samples of epileptic brain than in the control. The epileptic brain is in a neuroinflammation state.

2. The levels of markers of oxidative stress measured in the epileptic brain tissue are significantly higher than in the control samples.

3. These results agree with those obtained in an experimental animal models, contributing their mutual validation.

4. Oxidative stress and neuroinflammation may contribute to the pathophysiology of chronic epilepsy in humans. If they are cause or consequence of seizures, or both, is yet to be elucidated.

Finally, it may be of interest to consider the potential therapeutic implications of these conclusions. At present, the vast majority of so-called “anti-epileptic drugs” have as therapeutic target to control neuronal hyperexcitability and hypersynchrony, by means of modulating ionic channels and neurotransmitters. Therefore, its main action is “anticonvulsant”. This strategy, while quite effective in controlling seizures, does not directly address the problem of maintenance and progression of pathological changes related to epilepsy.

136

MIN

D M

AP

12. MIND MAP

Schematic mind map of the basic ideas in the present doctoral thesis.

Epilepsy is a group of diseases causing a devastating impact on patients, their caregivers and on society, since it is highly prevalent, it seriously impairs quality of life and may cause brain damage. This burden is even worse in patients with uncontrolled seizures due to drug-resistant epilepsy.

The mechanisms underlying the genesis of the epilepsies is not completely understood, which leads to “symptomatic”, quire effective anti-convulsant therapies but not disease modifying.

A considerable body of evidence has been gathered from experimental animal models of epilepsy. Its main findings support the important role of neuroinflammation and oxidative stress in the consolidation and progression of the epileptic disease.

Epilepsy surgery, when possible, is one of the best therapeutic options for controlling drug-resistant seizures. Moreover, epilepsy surgery may provide crucial information on the pathophysiology in human epileptic brain.

If the neural damage caused by seizures in humans is linked to oxidative stress and neuroinflammation, it could be inferred that treatments aimed at modulating these phenomena not only could limit the damage caused by the seizures, but, applied et early stages, would be potentially able to curb the consolidation or progression of the epileptic disease.

138

INTR

OD

UC

CIÓ

N