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16/7/2012
1
Espectrometria de massa & análise de biomoléculas
Curso de Inverno 16/07/2012
Sayuri Miyamoto
Tópicos
I. Breve Introdução
II. Espectrômetros de Massa
III. Aplicações em Análise de Biomoléculas
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Os primeiros espectrômetros de massa
Joseph John Thomson
United Kingdom
University of Cambridge
1906
1897 Descobre o elétron e
determina seu m/z
1912 Constroi o primeiro
espectrômetro de massa e obtem o
espectro de O2, N2, CO, CO2
1922
Francis William Aston
United Kingdom
University of Cambridge
1989
Wolfgang Paul
Federal Republic of Germany
University of Bonn
1919 Espectro de Massa
de Isótopos de Elementos
1930:Estabelecimento
da técnica de
espectrometria de
massa.
1948-52: TOF
1955: Quadrupole
1983: Ion Trap
1968: MS/MS
Nobel Prize in Chemistry 2002
John B. Fenn is the chemist who
invented the ELECTROSPRAY
method (1988). Professor of
Chemistry at Yale University, USA,
and at Virginia Commonwealth
University, USA
Koichi Tanaka research engineer who
developed the MALDI technique (1987).
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.
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Electrospray Wings for
Molecular Elephants
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html
NOBEL LECTURE John B. Fenn
Espectrometria de Massas
• Espectrometria de massas é uma técnica que
permite a pesagem de moléculas.
• Obviamente a pesagem não é feita através de uma
balança e sim através de um equipamento chamado
de espectrômetro de massa.
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Tabela Periódica
MASSA ATÔMICA: é dado pelo número de prótons e neutrôns de um átomo e a sua unidade é unidade de massa atômica ou simplesmente u (1u=1Da).
Importante: a massa atômica = massa média dos isótopos
Massa: Conceitos Importantes
• Massa nomimal: massa calculada a partir da massa do isótopo natural mais abundante de cada elemento, arredondada para o valor inteiro
• Massa média: massa calculada usando-se a massa atômica média de cada elemento, a qual é obtida ponderando-se a massa dos isótopos naturais
• Massa exata (massa teórica): massa calculada usando-se a massa de um isótopo específico.
• Isóbaros: átomos ou moléculas com a mesma massa nominal, porém com massas exatas diferentes.
Vessecchi et al 2011 Nomenclaturas de espectrometria de massas em língua portuguesa.
Química Nova vol. 34, pag 1875-.
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Isótopos e suas Massas
Elemento Massa Nominal
Massa Exata Abundância Relativa
Massa Média
H 1 2
1.0078225 2.0141000
99.985 % 0.015 %
1.00794
C 12 13
12.000000 13.003355
98.90% 1.10%
12.011
N 14 15
14.003074 15.000108
99.64% 0.36 %
14.007
O 16 17 18
15.994915 16.999133 17.999162
99.76% 0.04% 0.20%
15.999
P 31 30.973762 100% 30.973
S 32 33 34
31.972070 32.971456 33.967866
95.03% 0.75% 4.22%
32.066
Exemplo de Massas de Compostos Orgânicos
Ácido Linoleico Ubiquitina
Molecular formula: C18H32O2 C378H630N105O118S
Massa Nominal 280 8566
Massa Média: 280.438219 8565.764735
Monoisotopic mass: 280.2324052406 8560.6245369044
m/z
Ab
un
dâ
ncia
Rela
tiva
(%
)
Pico monoisotópico
Pesticide Mix
274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287m/z0
100
%
280.2397
281.2431
282.2461
Picos isotópicos
279.24
280.24
281.24
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Resolução Expressa o grau de separação entre dois picos
Determina a precisão da massa determinada
m=FWHM
m
R = m/m
FWHM = Full Width of the Peak at Half its Maximum
Largura Total do Pico na Metade de sua Altura
m/z 1060.5692 (monoisotopic mass of
the protonated bradykinin ion)
Maior ResoluçãoMaior Precisão
http://msr.dom.wustl.edu/Research/MALDI_TOF_Mass_Spec_and_Proteomics/
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Tópicos
I. Breve Introdução
II. Espectrômetros de Massa
III. Aplicações em Análise de Biomoléculas
Ion-Trap
Q-TOF (Micro-TOF)
Q-TOF de Alta Resolução (Maxis)
MALDI-TOF
Equipamentos disponíveis na Central Analítica (IQ-USP)
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Espectrômetro de massa
A medida é baseada na movimentação de uma partícula carregada, chamada ÍON, em um campo elétrico ou magnético. Essa movimentação ocorre em FASE GASOSA e no VÁCUO e é afetada pela razão massa/carga (m/z).
Espectrômetro de massa NÃO MEDE MASSA.
Espectrômetro mede a Relação MASSA/CARGA (m/z).
Como ele mede?
O que ele mede?
Espectrômetros de massa
Componentes básicos: 1. Fonte de íons
2. Analisador de massas
3. Detector
1.Fonte de íons 2.Analisador de Massas íons íons 3.Detector
de Íons
Entrada
da
Amostra
Gas (GC-MS)
Líquido (LC-MS)
Sólido (MALDI)
Espectro de massa
Vácuo
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EI/CI
ESI
MALDI
Fonte de Íons (Ion Source)
Ionização por Elétrons
Ionização Química
Ionização por Electrospray
Ionização/Dessorção a Laser assistida por Matriz
a
Electrospray Ionization (ESI)
Formação de gotículas carregadas
Dessolvatação
Formação de íons com múltiplas cargas
www.csd.uwo.ca/~bma/CS661/ms-1.ppt
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Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Amostra é co-cristalizada
juntamente com uma MATRIZ.
A matriz absorve a energia, a qual
é utilizada para a vaporização e
transferência da molécula para a
fase gasosa.
(337 nm)
Koichi Tanaka,
Nobel Prize 2002
Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.
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ESI MALDI
Análise de Citocromo c
+16
+15
+14
+13
+12
+11
+17 +18
+19
+20
Íons com Cargas Múltiplas
Transformation
Maximum Entropy
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EI/CI
ESI
MALDI
Fonte de Íons (Ion Source)
Técnica de ionização mais antiga ainda muito utilizada em GC-MS. A amostra na fase gasosa é bombardeada com um feixe de elétrons (entre 10 -150 eV). Muitos fragmentos!!
Técnica bastante branda de ionização. Permite análise de ampla gama de compostos. Analitos com múltiplas cargas. Acoplamento com LC (LC-MS), eletroforese capilar, etc.
Análise direta de analitos em sólidos. Ionização produz íons monocarregados. Espectros de fácil interpretação.
Quadrupole
TOF
Ion Trap
Orbitrap
Mag. Sector
FTMS
Analisadores de Massa
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QUADRUPOLE
A dinâmica de movimentação do íon através das barras depende
de uma radiofrequência (RF).
O valor da massa é resultado dos valores de radiofrequência (RF)
e de correntes (DC) aplicados.
Amplamente utilizado.
Íons são acelerados através da aplicação de uma diferença
de potencial.
Ion-Trap: Aprisionamento de Íons
Enquanto no Quadrupolo a campo aplicado é bidimensional no
Ion-Trap o campo é tridimensional. Aprisionamento de ions.
Permite acúmulo de íons: Ganho de sensibilidade.
Vantagem: MSn !!
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Separação das massas por Tempo de Vôo.
Íons são acelerados através da aplicação de uma diferença
de potencial.
Íons percorrem uma distância fixa.
Vantagem: Massas com alta resolução.
TOF (Linear)
TOF (Refletor)
íons são “refletidos”
No Refletor após os íons percorrerem uma distância eles entram em um
campo eletrostático que funciona como um espelho.
Os íons são “refletidos”.
O Refletor corrige pequenas diferenças na migração de massas com a
mesma massa e essa correção aumenta bastante a resolução do sinal.
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Quadrupole
TOF
Ion Trap
Orbitrap
Mag. Sector
FTMS
Analisadores de Massa
Altíssima Resolução e
Precisão!!
Quantificação
Caracterização/Identificação
Quadrupole
TOF
Ion Trap
Orbitrap
Mag. Sector
FTMS
Analisadores de Massa
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Espectrômetro de Massa em Tandem
MS/MS
Tandem Mass Spectrometry
• Diferentes configurações de MS-MS:
– Quadrupole-quadrupole: Triple-quadrupole
– Quadrupole-time-of-flight: Q-TOF
– Time-of-flight-time-of-flight: TOF-TOF
• É possível realizar fragmentações em equipamentos com um único analisador.
Ex: Ion trap e TOF com post-source decay
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Triplo-Quadrupolo
Q1 Q2 Q3
Voet Biochemistry 3e
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Page 174
Caracterização/Identificação
Análise de classes de compostos
Análise de classes de compostos
Análise de alta especificidade
Ganho de sensibilidade
Quantificação
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Tópicos
I. Breve Introdução
II. Espectrômetros de Massa
III. Aplicações em Análise de Biomoléculas
Carboidratos
Proteínas
Lipídeos
Ácidos Nucleicos
Espectrometria de Massas
Proteômica
Lipidômica
METABOLÔMICA
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Aplicações em Análise de Proteínas
• Identificação e confirmação de proteínas
• Detecção de modificações pós-traducionais.
• Sequenciamento de novo de peptídeos
• Monitoramento de complexos de Proteínas-Ligantes.
Extrato Bruto
Armengaud et al. BMC Structural Biology 2005 5:3 doi:10.1186/1472-6807-5-3
SDS-PAGE (4–12% gradiente)
Fração de Proteínas Solúveis Fracionamento
Salino
Cromatografia de
Filtração em Gel
Cromatografia de
Afinidade
Determinação da pureza de proteínas/Confirmação da Identidade
M 5 3 2 1
150
100 75
37
25
15
kDa
50
A
4 M 5 3 2 1
150
100 75
37
25
15
kDa
50
MALDI-TOF mass spectrometry
m/z
10000 15000 20000 25000 30000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
Abso
lute
Inte
nsi
ty
19198 B
m/z
10000 15000 20000 25000 30000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
Abso
lute
Inte
nsi
ty
19198
m/z
10000 15000 20000 25000 30000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
Abso
lute
Inte
nsi
ty
19198 B A
4
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http://www.natureprotocols.com/2008/06/16/analysis_protein_complexes_by.php
Identificação de Proteínas
Sequenciamento de Peptídeos
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Published in: Carlos A. O. Sigolo; Paolo Di Mascio; Marisa H. G. Medeiros; Chem. Res. Toxicol. 2007, 20, 1099-1110.
DOI: 10.1021/tx700111v
Copyright © 2007 American Chemical Society
Análise de Modificações em Proteínas
MALDI-TOF mass spectra showing protein modification of
270 µM cytochrome c incubated for different time periods
with 18 mM DDE at 37 °C and pH 7.4. (A) Cytochrome c
(control, without DDE) and cytochrome c incubated with
DDE for (B) initial time, (C) 1 h, (D) 2 h, and (E) 4 h.
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Aplicações em Análise de Lipídeos
• Análise Lipidômica
• Análise de Lipídeos modificados
• Estudos mecanísticos
• Identificação/quantificação de marcadores de peroxidação lipídica (Biomarcadores )
LC-ESI-MS/MS
MS1 CID MS2
LC
Análise Lipidômica
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Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 593-598 (August 2010)
Análise do Perfil de Fosfolipídeos de cérebro de rato por ESI-MS no modo negativo
Fosfolipídeos
MS1- Scan
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Fosfatidil-Inositol
18:0-20:4
Fragmentos de m/z 885
Resumo
Espectrometria de massas é uma técnica
poderosa que permite:
Determinar a massa molecular
Caracterizar a estrutura de compostos
desconhecidos
Verificar a identidade e a pureza de substâncias
Quantificar de forma específica e sensível
diversos compostos
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REFERENCES
Introduction to Mass Spectrometry:
Instrumentation, Applications, and
Strategies for Data Interpretation.
4th Edition (2007)
J. Throck Watson, O. David Sparkman
Mass Spectrometry: Principles and Applications
3rd Edition (2007)
Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant
Obrigada pela Atenção
Laboratório de Pesquisa de Lipídeos Modificados