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Estratégias para expressão de um anticorpo anti-CD3 humanizado em células de mamífero
Maryani Andressa Gomes Bezerra
Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido
Co-orientadora: Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão
Brasília – DF
2009
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR
ii
Estratégias para expressão de um anticorpo anti-CD3 humanizado em células de mamífero
Maryani Andressa Gomes Bezerra
Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido
Co-orientadora: Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão
Brasília – DF
2009
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR
Dissertação apresentada ao Departamento de Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Biologia Molecular
iii
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Spartaco Astolfi Filho (UFAM – Membro Externo)
Profª. Dra. Ildinete Silva Pereira (UnB – Membro Interno)
Prof. Dr. Márcio José Poças Fonseca (UnB – Suplente)
Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido (UnB – orientador)
Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão (UnB – co-orientadora)
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília, sob a orientação do Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido
iv
Dedico este trabalho aos meus pais, Antônio e Osita, por sempre me darem
força para lutar e seguir os meus sonhos...
Amo vocês!
v
“Deus nos fez perfeitos e não escolhe os
capacitados, capacita os escolhidos. Fazer ou não fazer algo, só depende da
nossa vontade e perseverança.”
Albert Einstein
vi
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, pela força e determinação concedidas na hora certa.
E também pela paciência de continuar tentando quando tudo dava errado.
A minha família, meus pais Antônio e Osita, minhas irmãs Dayanna e Claudenice,
pelo carinho, paciência e apoio nos momentos de dificuldade e constante estresse. E mãe,
obrigado pelos lanchinhos da tarde enquanto eu escrevia essa dissertação, eles davam uma
grande renovada nas forças, até na hora de fazer a lista de abreviaturas! Aff...
Agradeço profundamente aos meus orientadores e amigos Andréa Maranhão e
Marcelo Brígido por terem me acolhido no grupo e terem feito desses 5 anos que passei no
laboratório momentos maravilhosos e cheios de aprendizado. E podem se preparar porque
vem mais 4 anos no doutorado, com muito tudão!
Aos meus amigos do coração, Juliana, Priscilla, Renan e Geraldo. Por participarem da
minha vida cada um de um jeito e me lembrarem que amizade verdadeira ajuda no
crescimento pessoal. Juliana, em todos os momentos da minha vida, desde os choros até as
gargalhadas. Amo você demais amiga!; Priscilla, nas farras, viagens, dias de tédio, mas
também uma amiga com quem eu posso contar pra tudo. Nós temos nossas diferenças, mas no
fundo a gente se ama, né amiga!; Geraldinho, um amigo de longa data que só briga comigo,
mas que eu amo demais da conta! E Renan, uma pessoa que a cada dia se torna mais especial
na minha vida e com quem eu posso contar pra tudo. Amo, amo e amo para sempre!
A minha grande amiga Gláucia, que mesmo estando longe de mim, sempre acreditou
no meu potencial, enchendo a minha bola “seu futuro é brilhante, amiga”. Amo muito você
bacaninha! Obrigada mesmo! Agradeço também aos amigos, não menos importantes, Vanessa
e Vinícius, por sempre estarem perto de mim, me dando força pra seguir em frente e
agüentando minhas reclamações! Amo demais da conta!
Aos grandes amigos do Lab1:
Barbarela, minha grande amiga que alegra o meu dia no lab! Sempre pronta pra
escutar: “Não desiste de mim não!”, você não desistiu e hoje sou uma pessoa melhor! Kkkk
Você é muito especial na minha vida e terá lugar cativo para sempre no meu coração! “Me
esfregar em você e descer até o chão não tem preço”!
Fê, minha companheira da Biomedicina e é claro do Ceubão, eu nem preciso dizer o
quanto eu te adoro né! O tudão vai ser nossa música para sempre! Manga, não desista de me
ligar de madrugada, quem sabe um dia eu atenda... kkkkk
vii
Kelly Simi, com sua paciência infinita é a única pessoa que não perde a paciência
comigo! Simi, adoro você muitão! Quem sabe se não viro uma pessoa melhor convivendo
com você!
Mari, apesar de não estar mais no lab 1, ainda faz parte da minha vida. Obrigada pela
paciência, ajuda nos experimentos e é claro pela amizade. Te adoro até mesmo com sua
curiosidade infinita e quando você não escuta nada.
Isa, com um jeitinho todo peculiar conquistou meu coração e vai ficar pra sempre!
Adoro você amiga! E que para sempre tenha picanhas nos restaurantes para a gente se
esbaldar!
Lu, a minha amiga mais saudável e corredora de maratonas, obrigada por estar sempre
pronta a me ajudar e por seus conselhos de vida! Você sabe o quanto é especial pra mim né!
Ao Yuri, “meu melhor amigo”, por que mesmo brigando com você a cada segundo
você sabe que eu te adoro né! E tinha que agradecer senão você iria jogar isso na minha cara
daqui a uns 10 anos!
Ao Rafa por sua alegria e prontidão com suas idéias mirabulosas, dando um jeito pra
tudo. É muito bom conviver com você! Victor, que apesar de me estressar bastante torna o
meu dia mais agradável com suas besteiras! A Flavinha, por estar sempre pronta a ajudar e ser
essa pessoa toda especial, sempre com uma resposta na língua. Obrigada por tudo! A Janaína,
tu é uma figura, nunca irei esquecer de seus comentários na hora certa. Gosto muito de você!
Ao Leo, Thaíssa, Paulo, Izabel, Vanessa e Guto por fazerem parte da minha vida diariamente
e me agüentar nos dias em que estou mais atacada!
E logicamente que não poderia me esquecer do Hernandez, mesmo com o Yuri tendo
tomado o seu lugar no quesito briga diária, saiba que você é muito especial pra mim e me
ensinou muita coisa nessa vida! Que você tenha muito sucesso na sua vida acadêmica porque
você merece e muito! Agradeço também a Carol, porque mesmo estando lá na Austrália tem
um lugar no meu coração pra sempre. Outra que tem o futuro brilhante! Te adoro Carolzinha!
Aos professores do Laboratório de Biologia Molecular: Ildinete, Márcio Poças, Lídia
Pepe, Fernando Araripe, Sueli, Élida, pelas dicas e matérias ultra proveitosas.
A todos os amigos da Biomol! Resolvi não citar nomes porque iria esquecer de alguém
com certeza, é gente demais!
Agradeço também a Dona Fátima e Dona Ivonildes por cuidarem do laboratório, dos nossos reagentes e materiais. Dona Fátima, você briga comigo todo dia, mas se eu ficar sem ir para o laboratório uma semana duvido se não sente minha falta!
À Ana e Sandra da Secretaria, obrigada por sempre estarem à nossa disposição!
viii
E obrigada a todos que porventura eu tenha deixado de mencionar, mas que de alguma forma me ajudaram na realização deste trabalho!
ix
Sumário
Índice de Figuras....................................................................................................................xiii
Índice de Tabelas....................................................................................................................xv
Lista de abreviaturas.............................................................................................................xvi
Resumo....................................................................................................................................xix
Abstract....................................................................................................................................xx
Introdução.................................................................................................................................1
1.1 Anticorpos.................................................................................................................2
1.2 Anticorpos na clínica.................................................................................................4
1.3 Anticorpo anti-CD3..................................................................................................6
1.4 Produção de proteínas recombinantes em células de mamíferos............................13
1.4.1 Promotor CMV e o Íntron.....................................................................14
1.4.2 IRES......................................................................................................16
1.4.3 Furina.....................................................................................................18
Objetivos..................................................................................................................................21
2.1 Objetivo geral..........................................................................................................21
2.2 Etapas metodológicas..............................................................................................21
Materiais e Métodos................................................................................................................23
3.1 Materiais..................................................................................................................24
3.1.1 Células......................................................................................................24
3.1.2 Plasmídios utilizados................................................................................24
3.1.3 Oligonucleotídeos utilizados para seqüenciamento, clonagem e reações de
PCR...................................................................................................................26
3.1.4 Soluções estoques de Inibidores de Proteases..........................................28
3.1.5 Meios de Cultura e soluções para bactérias..............................................28
3.1.6 Antibióticos..............................................................................................29
3.1.7 Meios de cultura e soluções para cultura de células de mamíferos..........30
3.1.8 Soluções e tampões de uso geral..............................................................32
3.1.9 Soluções e material para preparo de células competentes e transformação
bacteriana...........................................................................................................33
3.1.10 Soluções para extração de DNA plasmidial...........................................34
3.1.11 Tampões de Endonucleases de Restrição...............................................35
x
3.1.12 Tampões de outras reações.....................................................................37
3.1.13 Endonucleases de restrição.....................................................................38
3.1.14 Outras enzimas.......................................................................................39
3.1.15 Soluções e reagentes para eletroforese em gel de agarose e de
poliacrilamida....................................................................................................40
3.1.16 Soluções e materiais para os ensaios imunológicos (ELISA, Western e
Dot blot).............................................................................................................42
3.1.17 Coluna de cromatografia de afinidade....................................................43
3.1.18 Soluções para cromatografia de afinidade..............................................43
3.1.19 Materiais utilizados para concentração de sobrenadantes de cultura e
proteínas purificadas.........................................................................................43
3.1.20 Marcadores moleculares para DNA e proteína......................................44
3.1.21 Kits comerciais.......................................................................................44
3.1.22 Anticorpos utilizados nos ensaios de ELISA, Western Blot e Dot
Blot....................................................................................................................45
3.2 Métodos...................................................................................................................46
3.2.1 Preparação de DNA plasmidial................................................................46
3.2.2 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição..........................48
3.2.3 Análise de DNA plasmidial por eletroforese em gel de agarose..............48
3.2.4 Eluição de fragmentos de DNA de gel de agarose...................................48
3.2.5 Reação de Desfosforilação com a fosfatase alcalina de camarão (SAP). 49
3.2.6 Reação de polimerização de extremidades de DNA utilizando o
fragmento Klenow da DNA polimerase I..........................................................49
3.2.7 Reação de anelamento de oligonucleotídeos............................................49
3.2.8 Amplificação dos fragmentos Fc e Cκ para inserção da seqüência
codificadora de um sítio clivável por furina – PCR..........................................50
3.2.9 Ligação de fragmentos de DNA...............................................................51
3.2.10 Preparação de células competentes e transformação bacteriana............52
3.2.11 Seqüenciamento automático de DNA e análise de seqüências..............53
3.2.12 Cultura de células de mamíferos............................................................54
3.2.13 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)……………………….59
3.2.14 Purificação das proteínas recombinantes por cromatografia
de afinidade.......................................................................................................60
3.2.15 Análise de proteínas por Dot Blot..........................................................60
xi
3.2.16 Análise de proteínas por eletroforese em gel de SDS............................61
3.2.17 Coloração do gel de SDS-PAGE............................................................62
3.2.18 Análise de proteínas por Western Blot...................................................62
Resultados e Discussão............................................................................................................63
4.1 Etapas metodológicas..............................................................................................64
4.2 Construção do vetor de expressão bicistrônico pMACIA HIL anti-CD3...............65
4.2.1 Clonagem da cadeia leve inteira do anticorpo anti-CD3 no vetor de
expressão pMACIA IRES EV...........................................................................66
4.2.2 Clonagem da cadeia pesada inteira do anticorpo anti-CD3 no vetor de
expressão pMACIA L anti-CD3........................................................................69
4.3 Transfecção transiente da linhagem celular HEK293 utilizando o vetor bicistrônico
pMACIA HIL anti-CD3................................................................................................72
4.4 Purificação do anticorpo anti-CD3 a partir de transfectomas de pMACIA HIL anti-
CD3...............................................................................................................................74
4.5 Construção de vetores para expressão de duas versões monocistrônicas do
anticorpo anti-CD3........................................................................................................76
4.5.1 Construção do vetor de expressão monocistrônico pMACIA HL anti-
CD3...................................................................................................................77
4.5.2 Construção do vetor de expressão monocistrônico pMACIA LH anti-
CD3....................................................................................................................80
4.6 Transfecção transiente da linhagem celular HEK293 utilizando as construções
monocistrônicas e bicistrônica......................................................................................84
4.7 Transfecção transiente da linhagem celular BHK-21 utilizando as construções
monocistrônicas e bicistrônica......................................................................................86
4.8 Purificação e quantificação do anticorpo anti-CD3 obtido a partir de células de
BHK-21 transfectadas com os vetores pMACIA HIL, pMACIA HL e pMACIA
LH.................................................................................................................................88
4.9 Construção do vetor de expressão tricistrônico pMACIA HIL IRES neo
anti-CD3........................................................................................................................90
4.10 Transfecção estável da linhagem celular BHK-21 utilizando o vetor tricistrônico
pMACIA HIL IRES neo anti-CD3................................................................................92
4.10.1 Seleção das células transfectadas utilizando Geneticina® (G418).........92
4.11 Construção do vetor de expressão bicistrônico pMACIA HL IRES neo
anti-CD3........................................................................................................................95
xii
4.12 Transfecção estável da linhagem celular BHK-21 utilizando o vetor bicistrônico
pMACIA HL IRES neo anti-CD3 na............................................................................97
Conclusões e Perspectivas......................................................................................................98
Referências Bibliográficas....................................................................................................101
xiii
Índice de Figuras
Figura 1. Diagrama esquemático de uma molécula de IgG secretada.......................................3
Figura 2. Representação de uma molécula de imunoglobulina em comparação com
fragmentos gerados por técnicas do DNA recombinante............................................................4
Figura 3. Diagrama esquemático do complexo receptor de células T (TCR)............................7
Figura 4. Alinhamento das seqüências de resíduos de aminoácidos dos anticorpos anti-CD3.9
Figura 5. Análise de ligação direta dos scFvs recombinantes a linfócitos humanos...............11
Figura 6. Ensaio de bloqueio da ligação do anticorpo monoclonal murino OKT3-FITC.......12
Figura 7. Esquema do promotor completo de CMV...............................................................14
Figura 8. Mecanismo de ação do sítio de entrada ribossomal interno (IRES, do inglês,
Internal Ribosome Entry Site) em um processo de tradução....................................................17
Figura 9. Sobreposição dos domínios catalíticos de Kex2 e furina.........................................19
Figura 10. Esquema do vetor de expressão pMACIA IRES EV.............................................25
Figura 11. Representação esquemática das etapas metodológicas do trabalho.......................64
Figura 12. Representação esquemática do vetor de expressão bicistrônico pMACIA HIL anti-
CD3...........................................................................................................................................65
Figura 13. Estratégia para construção do vetor pMACPS VLCκ anti-CD3...........................67
Figura 14. Estratégia para construção do vetor pMACIA L anti-CD3....................................68
Figura 15. Estratégia para construção do vetor pMACPS VHCH123 anti-CD3.....................70
Figura 16. Estratégia para construção do vetor pMACIA HIL................................................71
Figura 17. Produção do anticorpo anti-CD3 humano em HEK293.........................................73
Figura 18. Análise do processo de purificação por Western Blot ...........................................75
Figura 19. Representação esquemática das construções monocistrônicas...............................76
Figura 20. Estratégia para clonagem da porção Fc Fur no vetor pMAC HIL anti-CD3.........78
Figura 21. Estratégia para construção do vetor pMACIA HL anti-CD3.................................79
Figura 22. Esquema dos sítios de clonagem criados após anelamento do Linker LH furina..80
Figura 23. Estratégia para clonagem da porção VL no vetor pMACIA H LHfur...................81
Figura 24. Estratégia para construção do vetor pMACIA LH anti-CD3.................................83
Figura 25. Comparação da produção do anticorpo anti-CD3 humano no sobrenadante de
transfectomas de HEK293 a partir dos três vetores..................................................................85
xiv
Figura 26. Comparação da produção do anticorpo anti-CD3 humano no sobrenadante de
transfectomas de BHK-21 a partir dos três vetores...................................................................87
Figura 27. Análise do anticorpo anti-CD3 purificado a partir de transfectomas de BHK-21..89
Figura 28. Estratégia para construção do vetor tricistrônico pMACIA HIL IRES neo anti-
CD3..........................................................................................................................................91
Figura 29. Níveis de produção do anticorpo anti-CD3 em transfectomas estáveis de BHK-
21...............................................................................................................................................94
Figura 30. Estratégia para construção do vetor tricistrônico pMACIA HIL IRES neo anti-
CD3...........................................................................................................................................96
xv
Índice de Tabelas Tabela 1. Anticorpos monoclonais aprovados nos EUA para uso terapêutico..........................5
Tabela 2. Oligonucleotídeos sintéticos utilizados....................................................................26
xvi
Lista de abreviaturas
ADCC Citotoxicidade celular mediada por anticorpos
AICD Morte celular induzida por ativação
AmpR Gene de resistência à ampicilina (β-lactamase)
APS Persulfato de amônio
BCIP 5-Bromo-4Cloro-indolil fosfato
BHK Células renais de hamster recém-nascidos oC Grau Celsius
CD Marcador de superfície celular (Cluster of diferentiation)
CDR Região determinante de complementariedade
CH Cadeia constante pesada de anticorpo
CHO Células de ovário de hamster chinês
Cκ Porção constante kappa da cadeia leve
CL Cadeia constante leve de anticorpo
CMV Citomegalovírus
dH2O Água destilada
dNTPs Mistura dos desoxirribonucleotídeos trifosfatados adenosina, citidina,
guanosina e timidina.
DNA Ácido desoxirribonucléico
dsDNA DNA de fita dupla
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA Ensaio de ligação imunoenzimático
Fab Fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
Fc Fragmento cristalizável de anticorpo (porção constante)
FDA Food and Drug Administration (EUA)
FITC Fluoresceína isotiocianato
FL Fluorescência
FR Arcabouço (Framework)
Fur Seqüência codificadora de um sítio clivável por furina
xvii
Fv Fragmento variável de anticorpo
g Grama
g Força gravitacional
h Hora
HEK Células embrionárias de rim humano
IA Íntron A
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
ITAM Motivos de ativação baseados no imunoreceptor tirosina
kb Kilobase
kDa Kilodalton
L Litro
M Molar
mA Miliampère
mAb Anticorpo monoclonal
mg Miligrama
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
μF Micro Faraday
min Minuto
μg Micrograma
mL Mililitro
μL Microlitro
mM Milimolar
μm Micrômetro
μM Micromolar
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
NBT Nitro Blue Tetrazole
ng Nanograma
OD Densidade óptica
OKT3 Anticorpo monoclonal anti-CD3 clone OKT3
ori Origem de replicação
pb Par de base
PBMC Células mononucleares de sangue periférico
xviii
PBS Tampão salina fosfato
PCR Reação em cadeia de polimerização
PDB Protein Data Bank
PEG Polietilenoglicol
pH Potencial hidrogeniônico
ρmol Picomol
PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonato
rpm Rotações por minuto
RNA Ácido ribonucléico
RNAse Ribonuclease
scFv Fragmento variável de anticorpo de cadeia única
SDS Sódio Duodecil Sulfato
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS
SFB Soro fetal bovino
TE Tampão Tris/EDTA
TCR Receptor de célula T
TEMED N,N,N’,N’-tetrametil etilenodimetilamina
Tris Tri (hidroximetil) aminometano
U Unidade enzimática
UTR Região não traduzida do gene
v Volume
VH Domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo
VL Domínio variável da cadeia leve de um anticorpo
xix
Resumo
O desenvolvimento de novos anticorpos recombinantes teve impacto significativo no
tratamento de diversas doenças. Contudo, devido a complexidade estrutural da molécula de
imunoglobulina, a produção desta em células de mamífero ainda é um desafio. Uma das
dificuldades é obter uma produção equimolar das cadeias pesada e leve para a prevenção do
acúmulo de cadeias não-montadas, seguido de apoptose por estresse. Em nosso grupo, vimos
trabalhando com um anticorpo com potencial imunoregulatório específico para o antígeno
CD3 humano. Anticorpos anti-CD3 têm sido utilizados como imunoterápicos na prevenção da
rejeição aguda de órgãos transplantados e é considerado um fármaco promissor para o
tratamento de doenças auto-imunes. A produção desse anticorpo em cultura de células
animais tem se mostrado limitante devido ao baixo rendimento de anticorpo recombinante. Na
tentativa de desenvolver estratégias alternativas para aprodução de anticorpo recombinante,
foram construídos vetores de expressão, onde o anticorpo inteiro é produzido a partir de
construções monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônica em células de mamíferos. As
versões monocistrônicas possuem uma seqüência codificadora de um sítio clivável por furina
entre as duas cadeias do anticorpo. A versão bicistrônica possui um elemento IRES sintético
entre as duas cadeias. Além disso, foi introduzida uma marca seletiva para o antibiótico
Geneticina associada ao mesmo cassete de expressão como um cístron extra guiado por outro
elemento IRES. Para produção do anticorpo anti-CD3 foram utilizadas as linhagens celulares
HEK293 e BHK-21, de forma transiente e estável. Os anticorpos produzidos foram
purificados por cromatografia de afinidade e analisados para a produção de imunoglobulina
intacta. Os resultados indicam que a construção bicistrônica pMACIA HIL e monocistrônica
pMACIA HL são capazes de garantir a expressão de ambas as cadeias de anticorpo. Já as
construções monocistrônica pMACIA LH e bicistrônica pMACIA HL IRES neo não foram
capazes de produzir o anticorpo recombinante. A construção tricistrônica pMACIA HIL IRES
neo foi a construção que se mostrou mais promissora, apresentando estabilidade de produção
do anticorpo em transfectomas estáveis.
Palavras-chave: anticorpo, anti-CD3, monocistrônicas e bicistrônica
xx
Abstract
The development of new pharmaceuticals derived from recombinant antibodies had a
significant impact in the treatment of various illnesses. However, due to the structural
complexity of the immunoglobulin molecule, the production of these molecules in mammal
cells is still challenging. One of the difficulties is the equimolar production of heavy and light
chains and the prevention of the stress induced by the accumulation of unassembled protein.
We are working with a potentially immunoregulatory recombinant humanized antibody
specific for the human CD3 antigen. Anti-CD3 antibodioes have been used in the prevention
of the acute graft rejection and are considered as a promising pharmaceutical for the treatment
of autoimmune diseases. The production of this antibody in culture of animal cells has shown
to be problematic due to the low yield of recombinant antibody recovery. In the attempt to
create alternative strategies for recombinant production of antibody, monocistronic,
bicistronic and tricistronic expression vectors were constructed to coordinate the expression of
a complete antibody in mammal cells. The monocistronic versions possess a furin cleavage
coding sequence between the both antibody chains. The bicistronic version possesses a
synthetic IRES element between the two chains. A selective mark for the Geneticin antibiotic
was introduced in the expression cassette as an extra cistron driven by another IRES element.
The cell lines HEK293 and BHK-21 were used for transient or stable production of the anti-
CD3 antibody. Recombinant antibodies were purified by affinity chromatography and
analyzed for the production of intact immuglobulin. The results indicate that the bicistronic
construction pMACIA HIL and the monocistronic construction pMACIA HL are capable to
express both antibody chains. On the other hand, the monocistronic construction pMACIA
LH or the bicistronic construction pMACIA HL IRES neo were not able to produce the
recombinant antibody. The tricistronic vector pMACIA HIL IRES neo was shown to be the
most promising construction to obtain the whole antibody production in stable transfectomes.
Key words: antibody, anti-CD3, monocistronics and bicistronic.
1
Introdução
2
1.1 Anticorpos
O sistema imune garante a integridade do organismo em resposta às injúrias sofridas
no seu convívio com o ambiente, como infecções, acúmulo de produtos metabólicos e a outras
intoxicações, mantendo a homeostase (revisto por Cohen, 2007). Essa homeostase é mantida
por dois tipos de resposta, a imunidade inata, sendo esta a primeira linha de defesa contra
infecções; e a imunidade adaptativa, que tem por característica responder com um alto grau de
especificidade à infecção por determinado antígeno. Essa última pode ser subdividida em dois
tipos: imunidade mediada por células, a qual envolve os linfócitos T e é responsável pela
resposta a microorganismos intracelulares; e a imunidade humoral, mediada por moléculas
presentes no sangue e mucosas, chamadas de anticorpos. Os anticorpos são produzidos por
células denominadas linfócitos B. Essas moléculas possuem a capacidade de reconhecer
antígenos, neutralizar microorganismos e marcá-los para eliminação por vários mecanismos
efetores (revisto por Abbas et al., 2003).
Os anticorpos (Ab) ou imunoglobulinas são glicoproteínas que possuem massa
molecular em torno de 150 kDa, compostos por dois tipos de cadeias polipeptídicas: pesada
(H) e leve (L) (revisto por Janeway et al., 2001). Cada cadeia pesada é unida covalentemente
a uma cadeia leve por uma ponte dissulfeto e, as duas cadeias pesadas, já ligadas às cadeias
leves, são mantidas unidas covalentemente, também por pontes dissulfeto, formando o
anticorpo (Abbas et al., 2003) (Figura 1).
As cadeias das imunoglobulinas podem ser diferenciadas pelos seus isotipos. A cadeia
leve é subdividida nos isotipos kappa (κ) e lambda (λ), enquanto que a cadeia pesada se
subdivide em cinco isotipos: α, δ, ε, γ e μ. Esses cinco isotipos de cadeia pesada são utilizados
para diferenciar as cinco classes de imunoglobulinas, sendo elas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM,
respectivamente. A classe mais comum e abundante de anticorpo no soro, dependendo do
organismo, é a IgG, sendo também a mais utilizada para fins terapêuticos.
3
.
Figura 1. Diagrama esquemático de uma molécula de IgG secretada. (Abbas et al., 2003).
As imunoglobulinas podem ser fragmentadas por proteólise. Uma molécula de IgG
quando submetida a clivagem por papaína na região da dobradiça gera duas moléculas. Uma
delas é chamada de fragmento de ligação ao antígeno (Fab, do inglês, Antigen Binding
Fragment), constituído da cadeia leve ligada ao fragmento VH-CH1 da cadeia pesada (revisto
por Holliger e Hudson, 2005). Já a outra é chamada de fragmento cristalizável (Fc), composto
pelas cadeias constantes CH2 e CH3. O fragmento Fc é responsável por interagir com outras
moléculas efetoras e células do sistema imune, mediando a maioria das funções biológicas de
um anticorpo. Os domínios VH e VL juntos, das cadeias pesada e leve respectivamente,
formam o fragmento variável (Fv) responsável pela ligação ao antígeno (revisto por Janeway
et al. 2001).
Além desses fragmentos gerados por proteólise, é possível por técnicas de DNA
recombinante, gerar novos fragmentos de anticorpos como alternativa para a utilização
clínica. Um dos fragmentos mais utilizados é o scFv, composto pelos domínios VH e VL
unidos por um conector polipeptídico flexível ((Gly4Ser)3, por exemplo), mimetizando a
região Fv do anticorpo com a mesma especificidade original. Uma outra opção é a união do
4
fragmento scFv à região Fc formando o fragmento FvFc que reúne as vantagens do scFv,
como maior penetrabilidade tecidual e a facilidade de manipulação gênica, às funções efetoras
do fragmento Fc (Figura 2).
Figura 2. Representação de uma molécula de imunoglobulina em comparação com fragmentos gerados por técnicas do DNA recombinante. (Holliger e Hudson, 2005).
As moléculas de imunoglobulinas são classificadas como glicoproteínas devido ao seu
processamento pós-traducional onde ocorre a adição de resíduos de açúcares na sua estrutura.
Todas as imunoglobulinas possuem carboidratos em posições conservadas nas regiões
constantes das cadeias pesadas, sendo que cada classe terá um arranjo específico de açúcares
N-ligados, influenciando no dobramento, secreção e função da proteína (revisto por Wright e
Morrison, 1997). A glicosilação da porção Fc do anticorpo possui papel fundamental no
desempenho das funções efetoras dessa molécula (Rudd et al., 2001), e sua manutenção em
moléculas recombinantes é essencial para o sucesso terapêutico de um novo biofármaco.
.
1.2 Anticorpos na clínica
Atualmente, a indústria biotecnológica tem aumentado seus investimentos em
engenharia de anticorpos, desenvolvendo anticorpos recombinantes de última geração, assim
como os fragmentos de anticorpos e imunoconjugados (Presta, 2006). Nesse sentido, o
desenvolvimento de novas imunoglobulinas recombinantes tornou-se a principal novidade no
tratamento de diversas doenças, como o câncer, e mais recentemente as doenças autoimunes.
Esse sucesso dos anticorpos recombinantes se dá em parte pela sua especificidade
característica, que faz com que atuem como “balas mágicas” em um alvo específico; mas
também por conta de novas tecnologias que tornam a molécula recombinante mais segura na
clínica médica.
5
A utilização clínica de anticorpos monoclonais data de vinte anos. O primeiro, um
anticorpo murino anti-CD3 humano, Orthoclone OKT3, aprovado pelo FDA (Food and Drug
Administration – EUA) em 1986, vem sendo utilizado até hoje no tratamento da rejeição
aguda de transplantes renais, cardíacos e hepáticos (Li et al., 2005). Desde então o mercado
de anticorpos monoclonais vem crescendo cada dia mais. Em 2004, existiam 18 anticorpos
aprovados pelo FDA no mercado (Tabela 1), variando entre anticorpos murinos, quiméricos,
humanizados e totalmente humanos. Nessa época, eram previstos que 16 novos anticorpos
entrariam no mercado até 2008 (Reichert e Pavolu, 2004), dos quais 5 se confirmaram, o
Certolizumab pegol (2008), o Eculizumab (2007), o Natalizumab (2004), o Panitumumab
(2006) e o Renibizumab (2006), sendo quatro humanizados e um totalmente humano
(http://en.wikipedia.org/wiki/Monoclonal_antibody_therapy). Entre os anos de 2001 e 2002, o
mercado de anticorpos monoclonais cresceu 37, 5%, chegando a um patamar de US$ 5,4
bilhões. Essa taxa de crescimento vem sendo mantida e estima-se que esse mercado atinja
US$ 30 bilhões em 2010 (Maggon, 2007).
Tabela 1. Anticorpos monoclonais aprovados nos EUA para uso terapêutico* Nome (Genérico)
Molécula Alvo
Tipo Doença indicada
Categoria Terapêutica
Empresa Data de Aprovação
OKT3 (Muromonab-CD3)
CD3 Murino Rejeição de Transplantes
Imunológica Johnson & Johnson
19.06.1986
ReoPro (Abciximab)
CA17-1A Quimérico PTCA Homeostase Centocor
22.12.1994
Panorex (edrecolomab)
GPIIb/IIIa Quimérico Câncer coloretal
Anti-Neoplástica
Centocor
1995
Rituxan (Rituximab)
CD20 Quimérico Linfoma Non-Hodgkins
Anti-Neoplástica
Biogen IDEC 26.11.1997
Zenapax (Daclizumab)
IL2R Humanizado Rejeição de Transplantes
Imunológica Protein Design Labs
10.12.1997
Simulect (Basiliximab)
IL2R Quimérico Rejeição de Transplantes
Imunológica Novartis
12.05.1998
Synagis (Palivizumab)
RSV F Humanizado Profilaxia de RSV
Anti-infectivo MedImmune
19.06.1998
Remicade (Infliximab)
TNF-α Quimérico Artrite reumatóide e doença de Crohn
Imunológica Centocor
24.08.1998
Herceptin (Trastuzumab)
Her2/neu Humanizado Metástase de câncer de mama
Anti-Neoplástica
Genentech
25.09.1998
Mylotarg (Gemtuzumab ozogamicin)
CD33 Humanizado Leucemia mielóide
Anti-Neoplástica
Wyeth
17.05.2000
Campath (Alemtuzumab)
CD52 Humanizado Leucemia linfocítica
Anti-Neoplástica
Millennium/ILEX 07.05.2001
6
Zevalin (Ibritumomab tiuxetan)
CD20 Murino Linfoma Non-Hodgkins
Anti-Neoplástica
Biogen IDEC
19.02.2002
Humira (Adalimumab)
TNF-α Humano Artrite reumatóide e doença de Crohn
Imunológica Abbott
31.12.2002
Xolair (Ornalizumab)
IgE Humanizado Asma Imunológica Genentech
20.06.2003
Bexxar (Tositumomab-I 131)
CD20 Murino Linfoma de Non-Hodgkins
Anti-Neoplástica
Corixa
27.06.2003
Raptiva (Efalizumab)
CD11a Humanizado Psoríase Imunológica Genentech
27.10.2003
Erbitux (Cetuximab)
EGFR Quimérico Câncer coloretal
Anti-Neoplástica
Imclone Systems 12.02.2004
Avastin (Bevacizumab)
VEGF Humanizado Câncer coloretal, renal.
Anti-Neoplástica
Genentech
26.02.2004
Tysabri (Natalizumab)
Integrina A4
Humanizado Doença de Crohn e esclerose múltipla
Imunológica Biogen IDEC 23.11.2004
Lucentis (Renibizumab)
VEGF-A Humanizado Degeneração macular
Anti-Neoplástica
Genentech
30.06.2006
Vectibix (Panitumumab)
EGFR Humano Câncer coloretal
Anti-Neoplástica
Amgen 27.09.2006
Soliris (Eculizumab) Cimzia (Certolizumab pegol)
C5 TNF-α
Humanizado Humanizado
Paroxysmal hemoglobinúria (PNH) Doença de Crohn
Imunológica Imunológica
Alexion Pharm UCB
16.03.2007 22.04.2008
*Adaptado de (Silva, 2008)
1.3 Anticorpo anti-CD3
O único anticorpo anti-CD3 aprovado pelo FDA para uso clínico é o OKT3. Sua
molécula alvo é o CD3, componente do complexo receptor de célula T (TCR, do inglês, T
Cell Receptor). Esse complexo, também formado pelas cadeias ζ e pelo próprio TCR, é
responsável pelo reconhecimento de peptídeos antigênicos apresentados pelo complexo
principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês, Major Histocompatibility Complex),
presente na superfície de todas as células humanas (Figura 3).
7
Figura 3. Diagrama esquemático do complexo receptor de células T (TCR). Este é constituído pelo TCR, cadeias ζ e pelo complexo CD3. As regiões carboxi-terminais das cadeias ζ e do CD3 apresentam uma seqüência comum chamada de ITAM (do inglês, Immunorecptor Tyrosine-based Activation Motif), indicada pelas setas amarelas, a qual irá agir no processo de transdução de sinal. Adaptado de (http://www.detectingdesign.com/immunesystem.html).
Após o reconhecimento do antígeno pelo TCR ocorre a fosforilação dos domínios
ITAMs presentes no CD3 e nas cadeias ζ. Essa fosforilação envolve a ação da quinases Lck e,
potencialmente, Fyn, induzindo uma variedade de vias de sinalização que ativam o influxo de
cálcio e fatores de transcrição como NF-κB, NF-AT e AP-1, estimulando a produção de IL-4
e IL-2, sendo esta última uma citocina envolvida na proliferação de linfócitos T. Já na ligação
de um anticorpo anti-CD3 ao TCR, ocorre uma fosforilação parcial das cadeias ζ, devido a um
recrutamento insuficiente de Lck. Assim, a ativação das vias de sinalização fica prejudicada,
resultando no bloqueio da expressão de IL-2, e com isso da citotoxicidade celular (Smith e
Bluestone, 1997).
A ligação de anticorpos anti-CD3 gera uma sinalização diferente daquela realizada via
complexo TCR e esta é responsável pelos efeitos observados durante o tratamento com esses
imunobiológicos. Esses efeitos podem ser: depleção de células T dependente do sistema
complemento ou uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); lise da célula
alvo, aproximando-a de uma célula T citotóxica (Wong e Colvin, 1991); indução de apoptose
por meio de uma transdução de sinal direta, particularmente em células T ativadas (Carpenter
et al., 2000); depleção de células T por morte celular induzida por ativação (AICD, do inglês,
CD3
8
Activated Induced Cell Death); ou ainda o desenvolvimento de um estado de irresponsividade
ao estímulo chamado de anergia clonal (Smith et al., 1997).
Relatos recentes mostram outros efeitos relacionados aos anticorpos monoclonais anti-
CD3, incluindo mecanismos imunorregulatórios (Chatenoud, 2003). Dados de anticorpos anti-
CD3 de última geração mostram que o tratamento em curto prazo pode induzir um estado de
tolerância a um determinado antígeno que é sustentado sem o uso de imunossupressores.
Como exemplo, pode-se citar o tratamento da diabetes Tipo 1 (Herold et al., 2005), psoríase e
diversas doenças inflamatórias e autoimunes (Utset et al., 2002).
O OKT3 é um anticorpo monoclonal murino e, como tal, tem o seu uso limitado
devido a sua capacidade de gerar uma resposta caracterizada pela presença de anticorpos
humanos anti-murinos (HAMA, do inglês, Human Anti-Mouse Antibody). Essa resposta
acarreta a produção de imunoglobulinas (principalmente IgM e IgG) contra anticorpos
produzidos em camundongo promovendo uma rápida remoção e neutralização do OKT3. Para
resolver este problema, a humanização desse anticorpo tem sido um instrumento valioso no
desenvolvimento de uma nova geração de anticorpos específicos anti-CD3.
Diante dos problemas relacionados à origem murina do OKT3, a utilização da
engenharia de anticorpos pode ser a chave para a solução desses entraves na utilização de
anticorpos originados de camundongos. Desde a década de 1980, estudos são feitos com o
objetivo de reduzir a imunogenicidade de anticorpos monoclonais de origem murina. A
humanização de anticorpos propõe que, por meio de técnicas de biologia molecular, possam
ser conferidas características de um anticorpo humano, tornando-os similares aos circulantes
no soro, diminuindo assim a resposta imune direcionada contra essas moléculas.
Com o desenvolvimento das técnicas de humanização, os anticorpos humanizados
tornaram-se uma realidade de sucesso na clínica, sendo que dos 22 anticorpos monoclonais
aprovados pelo FDA para uso terapêuticos 78% são humanizados, ou parcialmente
humanizados (quiméricos). Além disso, mais de 56 anticorpos humanizados já estão em fase
avançada de testes clínicos e devem chegar ao mercado nos próximos anos (Reichert e
Pavolu, 2004).
Nos últimos anos, tem-se procurado obter anticorpos humanizados com o mínimo de
aminoácidos murinos em toda seqüência do anticorpo. Com esse objetivo foi proposta a
técnica de transplante de CDR (CDR grafting) que consiste em transplantar os três CDRs da
seqüência codificadora do anticorpo murino para um arcabouço (framework) de um anticorpo
humano, por manipulação gênica (Maranhão e Brígido, 2001).
9
A humanização do anticorpo anti-CD3 desenvolvida pelo grupo de Imunologia
Molecular da Universidade de Brasília foi realizada de acordo com a técnica de CDR grafting
(citado por Maranhão e Brígido, 2001). Para tal, foram escolhidos arcabouços humanos para
cadeias variáveis pesada (VH) e leve (VL) que possuíam a maior similaridade com a
seqüência do anticorpo murino, visando, assim, reter a especificidade de ligação característica
do OKT3 (Figura 4).
Figura 4. Alinhamento das seqüências de resíduos de aminoácidos dos anticorpos anti-CD3. Seqüência codificadora do OKT3 (anti-CD3), versões humanizadas do anti-CD3 para as cadeias pesada (huVH T e R) e leve (huVL) e seqüências humanas utilizadas como arcabouço para as CDRs do anti-CD3 (HV1B e KV1R). A- Cadeia pesada. B- Cadeia Leve. São destacadas em vermelho as seqüências das CDRs 1, 2 e 3 de cada cadeia e em branco com fundo azul o resíduo 86 que diferencia as duas versões de VH humanizados (Fonseca, 2000).
Na humanização da cadeia variável pesada foi utilizada uma seqüência germinal
humana que possuía a maior similaridade com a VH do OKT3, a H1VB, tendo uma
identidade de 71,4% com a VH do OKT3. Para análise do impacto estrutural do transplante
das CDRs do OKT3 nessa seqüência germinal, foram realizadas análises a partir da estrutura
10
cristalográfica do anticorpo murino 1MRC depositada no banco de dados de proteína (PDB,
do inglês, Protein Data Bank). A partir dessa análise, o resíduo 86 (presente no arcabouço 3
[FR3, do inglês, framework 3]) da cadeia variável pesada foi considerado estruturalmente
importante, pois se situa na base das CDRs 2 e 3. Essa análise possibilitou a criação de duas
versões da cadeia variável pesada (Figura 4), uma com o resíduo murino treonina (hVHT86
) e
outra com o resíduo humano arginina (hVHR86
) (Fonseca, 2000).
Já para a humanização da cadeia variável leve foi adotada uma estratégia um pouco
diferente. Primeiro, cada fragmento do arcabouço da seqüência do VL murino foi utilizado
como base na procura de um anticorpo humano, ao contrário da cadeia pesada, na qual foi
utilizada toda a seqüência do anticorpo murino, incluindo-se as CDRs. Dentre as seqüências
escolhidas, a KV1R possui uma maior quantidade desses resíduos considerados importantes,
com 64,3% de identidade com o arcabouço murino. Logo, essa foi a seqüência escolhida para
o transplante de CDR (Fonseca, 2000).
Para verificação da manutenção da atividade ligante dos anticorpos humanizados,
foram construídas seis versões de scFvs recombinantes: duas humanizadas, uma com o
hVHT86
e outra com o hVHR86
; três versões hemi-humanizadas, duas compostas das
respectivas cadeias pesadas humanizadas em conjunto com a cadeia leve murina e outra
contendo a cadeia pesada murina e a cadeia leve humanizada; e por último, uma versão
totalmente murina, todas expressas de forma heteróloga na levedura metilotrófica Pichia
pastoris. Essas construções permitiriam verificar se o processo de humanização dos
fragmentos variáveis foi bem sucedido e, no caso de perda de afinidade da ligação ao
antígeno, seria possível visualizar qual cadeia sofreu com a perda de afinidade (Costa, 2004).
Em ensaios de ligação direta utilizando citometria de fluxo, observou-se que todas as
versões possuem capacidade de ligação ao antígeno, exceto a versão hemi-humanizada com o
VH murino e o VL humanizado (Figura 5), sugerindo que a humanização do VL não foi bem
sucedida. Além disso, foi possível visualizar que as versões hemi-humanizada com o hVHR86
e VL murino e a totalmente murina observar uma capacidade de ligação melhor que as outras
versões, indicando que a manutenção do resíduo arginina na posição 86 da cadeia pesada
favorece a manutenção do paratopo do anticorpo no processo de transplante da CDR (Costa,
2004).
11
Figura 5. Análise de ligação direta dos scFvs recombinantes a linfócitos humanos. O gráfico mostra a porcentagem de células marcadas pelos scFvs recombinantes. TVL e RVL, versões humanizadas com os hVH
T86 e hVH
R86, respectivamente. TM e RM,
versões hemi-humanizadas com os hVHT86
e hVHR86
, respectivamente. MVL, versão hemi-humanizada com o VH murino e o VL humanizado. MUR, versão murina. Z22, anticorpo anti-DNA na conformação Z utilizado como controle negativo (Costa, 2004).
Assim, foi realizada uma nova humanização da cadeia variável leve (hVL), adotando-
se como estratégia a técnica de transplante de CDR por melhor encaixe. Dessa forma, buscou-
se seqüências germinais humanas que possuíam maior similaridade com a seqüência do
anticorpo murino, visando a manutenção da especificidade de ligação característica do OKT3.
A procura resultou no anticorpo humano CAB37836 (L6), sendo este o escolhido para o
procedimento de transplante de CDR (Silva, 2008).
Com essa nova proposta em mãos, e com o intuito de verificar a eficácia desse novo
processo de humanização, foram construídas versões recombinantes humanizadas com as
cadeias variáveis pesadas hVHR86
e hVHT86
em conjunto com a nova cadeia leve (hVL) na
forma de FvFc (fragmento de anticorpo na forma de scFv conectado ao Fc de IgG1 humana),
gerando duas novas versões totalmente humanizadas, FvFc T e FvFc R, que foram produzidas
em células de mamífero (CHO) (Silva, 2008).
A especificidade ao antígeno desses FvFcs foi analisada por citometria de fluxo em
um ensaio de bloqueio de ligação utilizando o anticorpo monoclonal OKT3 conjugado a
FITC. Assim, se os FvFcs conseguissem bloquear eficientemente a ligação do OKT3-FITC à
12
superfície de linfócitos, seria observada uma diminuição da intensidade de fluorescência.
Essas versões humanizadas mostraram ligação ao CD3 humano, competindo com o anticorpo
comercial OKT3, porém com uma menor afinidade (Figura 6). Além disso, foi mostrado que a
versão R possui uma capacidade maior de ligação e bloqueio que a versão T, indicando que os
trabalhos anteriores realizados pelo grupo estavam corretos e que a cadeia pesada com a
arginina possui atividade ligante similar a da cadeia murina. (Silva, 2008).
Figura 6. Ensaio de bloqueio da ligação do anticorpo monoclonal murino OKT3-FITC. Os linfócitos foram incubados inicialmente com os FvFcs humanizados T e R ou com o OKT3 não conjugado e posteriormente com o OKT3-FITC. Seta azul indicando a fluorescência da reação do OKT3-FITC sem bloqueio. Seta verde indicando o deslocamento da intensidade de fluorescência provocada pelo bloqueio utilizando o OKT3 não marcado. FL1: Intensidade de fluorescência emitida por FITC (530 nm); Counts: número de células. (Silva, 2008)
Por outro lado, esses anticorpos foram capazes de induzir um perfil de citocinas
regulatórias em contraste ao perfil inflamatório induzido por OKT3 em experimentos in vitro
com células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, do inglês peripheral blood
mononuclear cells). Este perfil imunorregulatório é evidenciado pela comparação da produção
de IL-10 e IFN-γ. A razão IL-10/IFN-γ é bem maior nas células cultivadas na presença das
versões humanizadas do que naquelas cultivadas com o OKT3. Além disso, a presença dos
anticorpos humanizados foi capaz de induzir uma expressão tardia do gene FOXP3 (marcador
13
de células T regulatórias), sugerindo que os anticorpos anti-CD3 humanizados provavelmente
estimulam o desenvolvimento de células T com atividade regulatória (Silva, et al. 2009,
manuscrito em preparação).
1.4 Produção de proteínas recombinantes em células de mamíferos
Uma das grandes limitações na utilização de anticorpos terapêuticos é o processo de
produção complexo. As limitações se encontram principalmente na quantidade reduzida de
proteína produzida e no alto custo, o que de certa forma dificulta o acesso ao medicamento
por boa parte dos pacientes. Atualmente, o estado da arte do processo de produção de
anticorpos monoclonais emprega células de mamíferos devido a sua capacidade de promover
dobramento e processamento pós-traducional corretos (revisto por Wurm, 2004).
Em 1986 foi produzida a primeira proteína recombinante com fins terapêuticos em
células de mamífero, a proteína ativadora de plasminogênio tissular humana (human tissue
plasminogen activator) (revisto por Wurm, 2004). Desde então, inúmeros estudos visando à
otimização da expressão de produtos biológicos comerciais vêm sendo realizados.
Atualmente, 60 a 70% de biofármacos e proteínas com interesse comercial são produzidos em
células de mamífero. Isso porque as células de mamífero têm características fisiológicas mais
similares às de humanos do que células de leveduras ou de Escherichia coli. Desse modo, a
existência de processos como glicosilação de proteínas, fosforilação, formação de pontes de
dissulfeto e outras modificações pós-traducionais tornam a produção de proteínas com
interesse comercial mais viável em células de mamífero do que em outros tipos celulares
(Wurm, 2004).
A linhagem de células mais utilizada é a linhagem de células de ovário de hamster
chinês (CHO). Essas células são epiteliais, têm a morfologia fibroblastóide e são aderentes ao
plástico onde são cultivadas. A sublinhagem CHO-K1 é derivada da linhagem celular parental
de CHO que foi estabelecida a partir do material da biópsia do ovário de um hamster chinês
adulto (Puck et al., 1958).
Atualmente, utilizam-se outros tipos celulares para a produção de proteínas
heterólogas com fins terapêuticos. Uma é a linhagem HEK293, derivada de células
embrionárias de rim humano transformadas com o DNA de adenovírus tipo 5 (Grahan et al.,
1977). Esta linhagem é utilizada principalmente para a expressão transiente de proteínas de
interesse, como a glicoproteína de membrana do retrovírus HTLV-1 (Penteado et al., 2006) e
14
anticorpos (Braren et al., 2007). Outra linhagem que vem sendo utilizada é a BHK-21,
derivada de células renais de hamster recém-nascidos (Stoker e MacPherson, 1964),
empregada na expressão do fator de coagulação VIII humano (Ishaque et al., 2008),
anticorpos (Cruz et al. 2002), entre outras proteínas recombinantes.
Entretanto, um dos principais obstáculos para a utilização das células de mamífero em
cultura é a baixa produção da proteína recombinante comparando-se com outros sistemas de
expressão, como leveduras e E. coli. Para isso, os cientistas estão estudando métodos para
melhorar os níveis de produção de biofármacos, de modo a se atingir um patamar de produção
industrial. Alguns métodos já descritos são: a mudança da temperatura de cultivo das células
(Shi et al., 2005), adição de compostos químicos no meio de cultura (Sung et al., 2005) e a
engenharia de vetores de expressão (Quilici, 2008).
1.4.1 Promotor CMV e o Íntron A
Um dos promotores mais comumente utilizados em construções de vetores de
expressão em células de mamífero é o promotor constitutivo do citomegalovírus (CMV). Este
promotor pode ser utilizado em diversas linhagens celulares de origens distintas, sendo,
portanto o mais utilizado nas construções do nosso grupo. O promotor dirige a expressão dos
genes Imediatamente Precoces de CMV, que apresenta diversas regiões regulatórias, como
sítios de ligação ao fator nuclear 1 (NF1) (Champman et al., 1991). Este gene é constituído
por 4 éxons e 3 íntrons, sendo que o maior dos íntrons, o íntron A, possui o sítio mais forte de
ligação a NF1 (Champman et al., 1991). Neste mesmo estudo, observou-se que o íntron A
possui ainda um sítio homólogo ao elemento regulador interno do gene da troponina I, um
elemento similar a um enhancer (Figura 7). Além disso, este sítio pode também funcionar
como sítio de ligação de fatores de transcrição (Champman et al., 1991).
Figura 7. Esquema do promotor completo de CMV. O enhancer com os 4 sítios de NF1 (*), o primeiro e o segundo éxon e o íntron A, o maior íntron deste gene, com aproximadamente 800 pb, podem ser observados na figura. O intron A possui ainda o sítio mais forte de ligação a NF1, representado por ( * ) (Quilici, 2008).
15
Os íntrons são seqüências genômicas removidas do transcrito de RNA correspondente
por meio de um processo conhecido como splicing. Um complexo que consiste em diversas
ribonucleoproteínas e pequenos RNAs nucleares (sRNA), denominado spliceossomo, é
responsável por cortar as junções íntron-éxon, remover os íntrons e por fim unir as
extremidades dos éxons, formando um mRNA maduro.
Atualmente, os cientistas perceberam que o splicing não é um evento estático,
correlacionando-se com outros processos do metabolismo do RNA, como a poliadenilação do
pré-mRNA e seu transporte do núcleo para o citoplasma, a tradução e o decaimento. Em
outras palavras, muitas proteínas que participam da maquinaria de um determinado processo
podem também fazer parte de outros, sendo que o efeito final desta interação é o aumento da
produção de uma proteína recombinante (Le Hir, Nott e Moore, 2003).
Sabe-se também que os íntrons podem modificar o nível de remodelamento da
cromatina, fazendo com que o DNA esteja mais acessível para a ligação da RNA polimerase
II e dos fatores de transcrição associados, conseqüentemente aumentando o nível de
transcrição do gene estudado. Corroborando tal observação, foi constatado que, tanto in vitro
quanto em camundongos transgênicos, os íntrons do gene do hormônio de crescimento de
camundongo promovem um remodelamento da cromatina, permitindo um aumento de até
quinze vezes da produção da proteína comparando-se com a versão sem íntron (Liu et al,
1995).
Mediante interação de proteínas do spliceossomo com fatores de transcrição, há um
melhoramento da processividade e atividade da RNA polimerase II. Estudos demonstraram
que um dos componentes do spliceossomo, o snRNA U1, interage com o fator de transcrição
geral TFIIH no estágio inicial da transcrição, estimulando a taxa de formação da primeira
ligação fosfodiéster pela RNA polimerase II (Kwek et al, 2002). A determinação da posição
do íntron também é importante para que a sua função de potencializador da expressão gênica
seja alcançada. Um estudo indicou que a posição do sítio de splicing 5’ em relação ao
promotor é proporcional à transcrição gênica, sendo que quanto maior a distância entre estes,
menor é a taxa de transcrição (Furger et al, 2002).
Diversos grupos de pesquisa, inclusive o grupo de Imunologia Molecular da
Universidade de Brasília, utilizaram o íntron A com sucesso em suas construções,
comparando níveis de expressão de diversas proteínas, como anticorpos (Xia et al, 2006),
fator VIII e gp120 do HIV (Campos-da-Paz et al., 2008 e Champman et al, 1991 e) e
proteínas repórter, como a luciferase (Xu et al, 2001 e Quilici, 2008).
16
1.4.2 IRES
A produção de anticorpos em células de mamíferos pode ser realizada utilizando-se
dois vetores de expressão independentes, cada um codificando uma das cadeias do anticorpo,
leve ou pesada, ou na forma policistrônica, onde as duas cadeias estão contidas no mesmo
vetor, contendo dois promotores, um para cada cadeia. Uma regulação fina da expressão das
duas cadeias de anticorpo é essencial para a otimização da produção de IgGs em células de
mamífero. A transfecção dessas células com duas construções independentes é o
procedimento menos eficiente para a obtenção de uma expressão balanceada das duas cadeias.
Isso porque geralmente o sítio de integração desses vetores no DNA da célula hospedeira tem
grande efeito na expressão do gene recombinante. Quando se utiliza dois vetores em uma
transfecção eles podem integrar em regiões com perfis transcricionais distintos. Assim, a
integração em regiões de heterocromatina resulta em pouca ou nenhuma expressão, enquanto
integração em eucromatina freqüentemente permite a expressão do gene (Wurm, 2004).
Um exemplo de construção que possibilita a expressão policistrônica é a utilização de
sítios de entrada ribossomais internos (IRES, do inglês, Internal Ribosome Entry Site). Os
IRES são seqüências localizadas na região 5’ UTR de alguns vírus de RNA, como por
exemplo os picornavírus. Ao ser adicionado entre as duas cadeias de anticorpos, o IRES
possibilita a tradução dos dois genes, devido à geração de um sítio interno para entrada de
ribossomos sem a necessidade de todo o aparato de iniciação da tradução presente em
eucariotos. Outro exemplo da utilização do IRES é entre um gene de interesse e uma marca
seletiva (Figura 8). A adição de uma marca seletiva no vetor durante uma transfecção é
importante quando se pretende selecionar um clone altamente produtor e estável. Esse é um
parâmetro essencial para a produção em larga escala de proteínas recombinantes.
17
Figura 8. Mecanismo de ação do sítio de entrada ribossomal interno (IRES, do inglês, Internal Ribosome Entry Site) em um processo de tradução. Pcmvie: promotor. Gene of interest: gene de interesse. Selection marker: marca seletiva. IVS: íntron sintético. Poly A: sinal de poliadenilação. Adaptado de (http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=10479&tabno=2).
A descoberta do elemento IRES gerou uma nova abordagem para a co-expressão de
múltiplas cadeias polipeptídicas por possibilitar uma razão definida de cadeias leve e pesada
de anticorpos (Houdebine e Attal, 1999). Usualmente, cístrons adicionados a jusante de IRES,
são traduzidos com menos eficiência do que nas construções monocistrônicas, onde há a
iniciação da tradução cap-dependente. Contudo, Li e colaboradores, em 2007, demonstraram
que uma construção bicistrônica contendo IRES entre as duas cadeias de um anticorpo,
comparada a construções monocistrônicas de cada cadeia co-transfectadas, produziram um
nível de expressão de anticorpo similar e estável a longo prazo na linhagem celular CHO.
Mielke e colaboradores, em 2000, demonstraram que uma construção tricistrônica para
expressão de anticorpos, com um elemento IRES entre as cadeias pesada e leve de um
anticorpo, e outro entre a cadeia leve e uma marca de resistência, apresentaram um nível de
expressão de anticorpo maior e mais estável na linhagem celular BHK-21, ao contrário das
construções monocistrônicas desse anticorpo co-transfectadas com um vetor com a marca de
resistência. Sistemas como esses permitem uma expressão duradoura de proteínas
recombinantes, até mesmo de proteínas complexas como anticorpos, com estabilidade a longo
prazo.
18
1.4.3 Furina
Polipeptídeos biologicamente ativos agem como mensageiros intracelulares de
informação (neuropeptídeos, peptídeos hormonais), dirigindo muitas atividades celulares
(fatores de crescimento, enzimas e receptores) e são envolvidos na patogenicidade de certos
vírus (glicoproteínas virais) e bactérias (toxinas). Para que sua função seja assegurada
temporal e espacialmente, muitos desses polipeptídeos são inicialmente sintetizados em
precursores, ou pró-proteínas, grandes e inativos. Em virtude disso, um mecanismo celular
funciona para a liberação do segmento bioativo da proteína. Esse mecanismo é a clivagem
proteolítica do precursor por endoproteases celulares, as quais reconhecem pares específicos
de aminoácidos, como por exemplo Arg-Arg ou Lys-Arg. Este processamento é encontrado
em bactérias, fungos, invertebrados e mamíferos e ocorre tanto na via exocítica quanto na
endocítica (processamento e degradação de proteínas) (Denault e Leduc, 1995).
Um exemplo é a furina, uma endoprotease dibásica responsável pelo processamento
proteolítico de uma ampla variedade de precursores de proteína da via secretória. A maioria
dos substratos da furina são precursores de proteína em rota para o espaço extracelular ou
membrana plasmática (Seidah et al., 1993). Esta é a primeira enzima caracterizada da família
das convertases similares a subtilisina. Análises por nothern blot demonstraram que a maior
parte do transcrito de 4,4 kb da enzima furina é ubiquamente distribuído em todos os tecidos
(Seidah, Chrétien e Day, 1994). Em humanos, esse RNA mensageiro dá origem a uma
proteína transmembrânica.
No final de 1989, foi observado por Fuller, Brake e Thorner, que a enzima kexina,
presente em levedura e caracterizada como uma serino protease cálcio-dependente, era capaz
de clivar o fator pro-α de levedura e a toxina “pro-killer” e possuía em seu sítio catalítico uma
alta similaridade de seqüência com a furina humana. As duas enzimas são marcantemente
similares, apresentando poucas diferenças em elementos estruturais na superfície das
proteínas. Os domínios catalíticos da kexina 2 (Kex2) da levedura Saccharomyces cerevisae e
da furina possuem o mesmo dobramento e topologia similar a subtilisina e a proteinase K
(Figura 9) (Rockwell e Thorner, 2004). Burtet e colaboradores, em 2007, desenvolveram um
sistema de expressão de um fragmento Fab em P. pastoris, onde as cadeias leve e pesada
eram produzidas em um único polipeptídeo contendo uma seqüência codificadora de um sítio
reconhecido por Kex2 entre as duas cadeias. Após a clivagem por Kex2, um fragmento Fab
corretamente montado era liberado.
19
Figura 9. Sobreposição dos domínios catalíticos de Kex2 e furina. (a) Sobreposição de Kex2 (verde) e furina (roxo) mostrando uma similaridade conformacional entre as duas estruturas, apesar de apenas 41% de identidade de seqüêcia primária entre elas. (b) Sobreposição de Kex2 (verde) e subtilisina (azul) mostrando conservação da estrutura secundária central do domínio catalítico. Adaptada de Rockwell e Thorner, 2004.
Desde a descoberta inicial da existência de furina em células de mamíferos, existe um
interesse considerável em determinar sua localização subcelular. Contudo, tentativas de
imunolocalização da furina endógena foram dificultadas pela baixa abundância da proteína na
maioria das células (van Duijnhoven et al., 1992). Evidentemente, uma pequena quantidade
de furina é suficiente para cumprir os muitos processos proteolíticos nos quais a enzima é
envolvida.
Shapiro e colaboradores, em 1997, revelaram a localização da furina dentro da célula
por imunocitolocalização. A proteína está predominantemente concentrada dentro da região
trans do Complexo do Golgi (TGN), em torno de 80%, embora uma significativa quantidade
da proteína tenha sido encontrada em estruturas vesiculares com características de
endossomos e lisossomos (Bosshart et al., 1994). A localização da furina endógena no TGN
tem uma implicação importante para a fisiologia da clivagem de precursores de proteína.
Sugere-se que a maioria das proteínas celulares e secretadas sofra clivagem no TGN quando
estão em trânsito para a membrana plasmática. Portanto, o processamento proteolítico pela
furina endógena não requer o desvio dos precursores de proteínas para longe da via secretória,
como ocorreria caso a furina estivesse localizada exclusivamente em vesículas endossomais e
lisossomais (Shapiro et al., 1997).
Existem alguns relatos da inserção de seqüências codificadoras de sítios cliváveis
reconhecidos por furina em construções policistrônicas, com o intuito de separar cada cístron
20
depois que estes forem traduzidos. Goyal e Batra, em 2000, incluíram um espaçador que
continha a seqüência codificadora de um sítio reconhecido por furina entre uma construção de
anti-receptor de transferrina humano, na forma de scFv, e a toxina restrictocina, uma toxina
ribonucleotídica. Essa construção possibilitaria uma melhor ação da ribotoxina em seu alvo, o
ribossomo. A incorporação do espaçador clivável aumentou a atividade citotóxica da
construção em 2 a 30 vezes, dependendo da célula alvo.
Fang e colaboradores, em 2007, desenvolveram um sistema de expressão de um
anticorpo monoclonal in vivo, onde as cadeias pesada e leve do anticorpo eram separadas por
uma seqüência codificadora de um sítio reconhecido por furina. O vetor de expressão era
injetado via peritônio em camundongos, o sítio entre as cadeias era reconhecido pela furina
intracelular, liberando as duas cadeias de anticorpo para serem montadas. O sistema
possibilitou uma razão definida das duas cadeias, otimizando a produção do anticorpo que
chegou a níveis de 1mg/mL no soro dos camundongos.
Diante de todos esses dados, o uso de engenharia de vetores para expressão e aumento
dos níveis de produção de anticorpos em células de mamíferos está sendo largamente
utilizado e é de especial interesse para o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de
Brasília. Assim, propomos nesse trabalho traçar estratégias para expressão de um anticorpo
anti-CD3 humanizado em células de mamíferos, utilizando construções monocistrônicas,
bicistrônicas e tricistrônica.
21
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Traçar estratégias para a expressão de um anticorpo anti-CD3 humanizado em células
de mamíferos por meio de construções monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônicas.
2.2 Etapas metodológicas
2.2.1 Clonagem das cadeias pesada e leve inteiras do anticorpo anti-CD3 humanizado no
vetor para expressão em células de mamífero pMACIA IRES EV, que contém o
promotor CMV, o íntron A, um íntron de imunoglobulina dentro do peptídeo sinal da
cadeia pesada e um elemento IRES sintético. Construção bicistrônica (HIL).
2.2.2 Retirada do IRES sintético entre as cadeias leve e pesada da construção do anti-CD3
humanizado no vetor pMACIA e inserção de uma seqüência codificadora de um sítio
clivável por furina entre as duas cadeias, construindo duas versões monocistrônicas:
cadeia pesada – sítio clivável por furina – cadeia leve (HL), e cadeia leve – sítio
clivável por furina – cadeia pesada (LH).
2.2.3 Transfecção transiente das três construções do anticorpo, monocistrônicas e
bicistrônica, nas linhagens celulares HEK-293 e BHK-21.
2.2.4 Comparação do nível de expressão do anticorpo anti-CD3 humano das construções
monocistrônicas e bicistrônica.
2.2.5 Construção da versão tricistrônica do anticorpo a partir da construção bicistrônica
HIL, com a adição de outro elemento IRES e uma marca de resistência a geneticina
(NEOR). Construção HIL IRES neo.
2.2.6 Transfecção estável da construção tricistrônica HIL IRES neo na linhagem celular
BHK-21.
22
2.2.7 Construção de outra versão bicistrônica do anticorpo a partir da construção
monocistrônica HL, com a adição de um elemento IRES e uma marca de resistência a
geneticina (NEOR). Construção HL Ires neo.
2.2.8 Transfecção estável da construção bicistrônica HL IRES neo na linhagem celular
BHK-21.
2.2.9 Comparação do nível de expressão do anticorpo anti-CD3 humano das construções
bicistrônica HL IRES neo e tricistrônica HIL IRES neo.
23
Materiais e Métodos
24
3.1 Materiais
3.1.1 Células
3.1.1.1 Linhagens Bacterianas
- XL1-Blue (Stratagene®) - recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´
proAB lacIqZ M15Tn10 (TetR)] (Sambrook e Russel, 2001).
- XL10-gold (Stratagene) - TetrD(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1
supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]. Os
genes listados indicam alelos mutantes. Esta linhagem de E. coli foi desenvolvida para a
transformação de moléculas de DNA grandes, e com alta eficiência.
- DH5α (Invitrogen®) – F- /endA1 hsdR17(r
K
-m
K
+) supE44 thi
-1 recA1 gyrA (Nal
r)
relA1 D(laclZYA-argF)U169 deoR (F80dlacD(lacZ)M15).
Essas linhagens foram utilizadas nos procedimentos de construção das versões do
anticorpo.
3.1.1.2 Linhagem de Células de Mamíferos
- HEK-293 (ATCC nºCRL-1573) – é uma linhagem derivada de células de rim
embrionário humano que contêm o genoma do adenovírus tipo 5. As células foram cultivadas
em meio DMEM (GIBCO) contendo SFB a uma concentração de 5% (v/v).
- BHK-21 (ATCC noCCL-10) – é uma linhagem derivada de células renais de
hamsters recém-nascidos (Mesocriterus auratus). As células foram cultivadas em meio
HAM-F12 (GIBCO) contendo SFB a uma concentração de 5% (v/v).
3.1.2 Plasmídios Utilizados
- pIg CD3 scFv R- 3,9 kb, contém o scFv do anticorpo anti-CD3 versão R
25
humanizado, hVHR86
hVL, múltiplos sítios de clonagem, ori ColE1, AmpR. Utilizado para a
construção da cadeia pesada inteira do anticorpo, como doador da porção VH.
- pMACPS VHCH123 anti-CD18 (Ruggiero, 2002): 5,7 kb, contém a cadeia pesada
inteira do anticorpo anti-CD18, AmpR, ori ColE1, múltiplos sítios de clonagem, promotor
pCMV, sinal de poliadenilação SV40 polyA. Utilizado para junção da porção VH do anti-
CD3 à porção constante CH123, formando a cadeia pesada inteira do anti-CD3.
- pUC57 hVL – 3,0 kb, contém o VL humanizado do anticorpo anti-CD3, AmpR, rep
(pMB1), múltiplos sítios de clonagem. Utilizado para a construção da cadeia leve inteira,
como doador da porção VL.
- pMACPS VLCκ anti-CD18 (Ruggiero, 2002) – 6,0 kb, contém a cadeia leve inteira
do anticorpo anti-CD18, AmpR, ori ColE1, múltiplos sítios de clonagem, promotor pCMV,
sinal de poliadenilação SV40polyA. Utilizado para junção da porção VL do anti-CD3 à
porção constante Cκ, formando a cadeia leve inteira do anti-CD3.
- pMACIA IRES EV – 6,4 kb, derivado do vetor pMAC com substituição do
promotor mínimo de CMV pelo promotor/enhancer de CMV com intron A, íntron de
imunoglobulina no interior da primeira seqüência líder codificadora do peptídio sinal, um
elemento IRES sintético, sinal de poliadenilação SV40 polyA, AmpR, ori ColE1 (Figura 10).
Utilizado para clonagem das cadeias pesada e leve inteiras do anticorpo anti-CD3
humanizado.
Figura 10. Esquema do vetor de expressão pMACIA IRES EV. Siglas – pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada; I Ig: íntron de imunoglobulina presente dentro da sequência de PS I; IRES EV: IRES sintético; PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve e SV40 polyA: sinal de poliadenilação Os sítios de restrição utilizados para a clonagem das cadeias pesada e leve do anticorpo anti-CD3 humanizado foram evidenciados.
26
- pGEM-T Easy (Promega) – vetor comercial de 3,15 kb, constituído pelo promotor
T7 e SP6, múltiplos sítios de clonagem, gene αLacZ, gene da β-lactamase, origem de
replicação de fago (f1 ori) e origem de replicação plasmidial. Utilizado para a clonagem de
produtos de PCR.
- pLXIN (Clontech) - vetor comercial de 6,1 kb, possui um elemento IRES, NEOR,
sítio múltiplo de clonagem, os elementos virais 5' MoMuSV LTR e 3' MoMuLV LTR,
AmpR, ori ColE1. Utilizado como doador da porção IRES Neo para construção das versões
bicistrônicas e tricistrônicas do anticorpo.
- pGFP/NEO – 11,2 kb, Possui promotor de timidina quinase (pTK), NEOR, sítio
múltiplo de clonagem, sinal de poliadenilação TkpA, promotor pRSV-LTR, sinal de
poliadenilação SV40polyA, origem de replicação ORI e gene da β-lactamase (bla). Utilizado
para visualização da eficiência das transfecções por possuir o gene repórter que codifica a
proteína fluorescente verde (GFP, do inglês, Green Fluorescent Protein).
3.1.3 Oligonucleotídeos utilizados para seqüenciamento, clonagem e reações de PCR
Os oligonucleotídeos foram fornecidos pela IDT® e solubilizados em água Mili-Q
para concentração de uso de 10 ρmoles/µL. A tabela 2 mostra as seqüências de cada um dos
oligonucleotídeos.
Tabela 2. Oligonucleotídeos sintéticos utilizados.
Oligo Seqüência Utilização
M13 Universal
5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’ Sequenciamento de fragmentos de PCR clonados no vetor pGEM T- easy.
M13 Reverso
5’ CAGGAAACAGCTATGAAC 3’ Sequenciamento de fragmentos de PCR clonados no vetor pGEM T- easy.
CH22026
reverso
5’ GGGGGAAGAGGAAGACTGAC 3’ Seqüenciamento da cadeia pesada clonada no plasmídio pMACIA IRES EV. Anela na região Fc da cadeia.
CH22166
reverso 5’ CGGCTTTGTCTTGGCATTAT 3` Seqüenciamento da cadeia pesada
clonada no plasmídio pMACIA IRES EV. Anela na região Fc da cadeia.
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Cκ reverso 5’ GCGTTATCCACCTTCCACTG 3’ Seqüenciamento da porção VL da cadeia leve clonada no plasmídio pMACIA IRES EV. Anela na região Cκ da cadeia.
CH1 reverso 5’ GGGAAGTAGTCCTTGACCAG 3’ Seqüenciamento da porção VH da cadeia pesada clonada no plasmídio pMACIA IRES EV. Anela na região Fc da cadeia.
CMV 3’ reverso
5’ ATGGCGGTCATATTGCAGAT 3’ Seqüenciamento da cadeia leve clonada no plasmídio pMACIA IRES EV. Anela ao final do vetor.
CH123 509
5’ TAATGCCCAGACAAAGCCGCGGGAGGAG 3’ Utilizado para construção da versão monocistônica HL. Iniciador de PCR para a amplificação da porção Fc e inserção de seqüência codificadora do sítio clivável por furina. Anela na posição 509 da porção Fc da cadeia pesada.
CH123 reverso
5’CAGATCTCGACGGGCTCTAGGGG CTAGCGAGAGGCTCTTCTGCG 3’
Utilizado para construção da versão monocistônica HL. Iniciador de PCR para a amplificação da porção Fc e inserção de seqüência codificadora do sítio clivável por furina. Anela ao final da porção Fc da cadeia pesada e insere a seqüência do sítio clivável por furina ao final dela. Adiciona um sítio de Bgl II.
Linker LH fur
5’ CCGGCTAGATCTGCTTCTCGAGATATC 3’ Utilizado para construção da versão monocistônica LH Utilizado para a construção da versão monocistrônica LH. Anela-se ao Linker LH fur reverso
Linker LH fur reverso
5’ CCGGGATATCTCGAGAAGCAGATCTAG 3’ Utilizado para construção da versão monocistônica LH Quando anelado ao Linker LH fur gera sítios de Bgl II, Xho I e Xma I.
LH VL 5’ TTGTCAGCAGTATAGTAAGTTCCCATTCAG GTTCGGCTCGGG 3’
Utilizado para construção da versão monocistônica LH. Iniciador de PCR para a amplificação da porção Cκ e inserção de seqüência codificadora do sítio clivável por furina. Anela ao final da porção VL da cadeia leve.
LH CK fur 5’ CCCGGGGAGCTCTCTCCGAGCTCGGGATCC ACACTCTCCCCTGTT 3’
Utilizado para construção da versão monocistônica LH. Iniciador de PCR para a amplificação da porção Cκ e inserção de seqüência codificadora do sítio clivável por furina. Anela ao final da porção Cκ da cadeia leve e insere a seqüência do sítio clivável por furina ao final dela. Adiciona um sítio de Xma I.
28
3.1.4 Soluções estoques de Inibidores de Proteases
PMSF (Phenilmethylsulfonyl Fluoride) 0,1 M
Solubilizado em isopropanol e estocado a temperatura ambiente por até 1 ano. É um
inibidor de serino e tiol proteases como, por exemplo, tripsina, quimiotripsina, trombina,
papaína etc. Adicionar a uma concentração final de 1 mM.
EDTA (Ácido Tetracético Etilenodiamina) 0,5M
Solubilizado em água, pH 8-9, estocado a 4°C por até 6 meses. É um inibidor de
metaloproteases. Adicionar a uma concentração final de 5 mM.
3.1.5 Meios de Cultura e soluções para bactérias
Meio LB (Luria-Bertani)
Peptona de caseína 1,0% (p/v)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)
NaCl 1,0% (p/v)
pH 7,0.
Meio LB ágar
Meio LB adicionado de ágar bacteriológico a 1,4% (p/v).
Meio SB (Super Broth)
Peptona de caseína 3,0% (p/v)
Extrato de levedura 2,0% (p/v)
MOPS 1,0% (p/v)
pH 7,0.
Meio SOB
Bacto-triptona 2,0% (p/v)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)
NaCl 0,06% (p/v)
KCl 0,002% (p/v)
pH 7,0.
29
Meio SOC
Meio SOB 98 mL
Solução estoque de Mg2+
2 M 1 mL
Solução estoque de glicose 2 M 1 mL
Solução estoque de glicose 2 M
Esterilizada por filtração e estocada a 4ºC.
Solução estoque de Mg 2 M
MgCl2 1 M
MgSO4 1 M
Esterilizada por filtração e estocada a 4ºC.
Após dissolver os reagentes em água, todos os meios de cultura foram autoclavados a
120°C por 20 minutos.
3.1.6 Antibióticos
Ampicilina
A ampicilina liofilizada foi ressuspendida em água destilada na concentração de 20 a
50 mg/mL. Após a ressuspensão, ela foi esterilizada por filtração em membrana Millipore de
0,22 μm. Após a filtração, ela foi estocada a -20ºC e protegida da luz. Este antibiótico foi
utilizado como marca de seleção para plasmídios transformados em células de E. coli.
Tetraciclina
A tetraciclina liofilizada foi ressuspendida em água destilada na concentração de 50
mg/mL e esterilizada por filtração em membrana Millipore de 0,22 μm. Após a filtração, ela
foi estocada a -20ºC e protegida da luz. Este antibiótico foi utilizado para a semeadura e
manutenção de células E. coli das linhagens XL1-blue e XL10-gold, que possuem o gene de
resistência a esse antibiótico.
30
3.1.7 Meios de cultura e soluções para cultura de células de mamíferos
Meio HAM-F12 com L-glutamina a 2 mM (Invitrogen®
, no catálogo: 21700-075)
Meio Base 1 pacote
NaHCO3
1,176 g
dH2O q.s.p 1 L
pH 7,4
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Invitrogen®
, no catálogo: 12800-017)
Meio Base 1 pacote
NaHCO3
3,7 g
dH2O q.s.p 1 L
pH 7,4
Meio de Congelamento de Células
DMEM
Soro Fetal Bovino 20% (v/v)
DMSO 5% (v/v)
Solução salina balanceada sem Cálcio e Magnésio (BSS.CMF)
NaCl 8 g
KCl 0,4 g
Na2HPO
4 0,048 g
KH2PO
4 0,06 g
Glicose 1 g
Vermelho de fenol 0,01 g
dH2O q.s.p. 1 L
pH 7,4
31
Tripsina-EDTA (Invitrogen®
, no catálogo: 27250-018)
Tripsina 2,5 g
EDTA 0,38 g
BSS.CMF qsp 1 L
pH 8,0
Soro Fetal Bovino (Invitrogen®
, no catálogo: 10438-026)
Estocar de -5 a -20 oC.
Adicionado ao meio de cultura Ham-F12 com L-glutamina à concentração de 1,25%, 2,5%,
5% ou 10% (v/v).
Soro Fetal Bovino, Ultra low – IgG (Invitrogen®
, no catálogo: 16250-086)
Estocar de -5 a -20 oC.
Adicionado ao meio de cultura Ham-F12 com L-glutamina à concentração de 1,25% (v/v).
Antibiótico/Antimicótico 100X (GIBCO)
Penicilina 10.000U
Estreptomicina 10.000μg
Anfotericina B 25μg/mL
Preparada em 0,85% de salina
Solução utilizada como antibacteriano e antimicótico que foi adicionada aos meios de
cultura das células de mamífero, na concentração final 1X.
Geneticina – G418 (GIBCO)
A geneticina liofilizada foi ressuspendida em água Mili-Q na concentração de 50
mg/mL. Após a ressuspensão, ela foi esterilizada por filtração em membrana Millipore de
0,22 μm. Após a filtração, ela foi estocada a 4ºC e protegida da luz. Este antibiótico foi
utilizado como marca de seleção em transfecções estáveis para plasmídios que continham o
gene de resistência a geneticina (NEOR).
32
Azul de Tripan
Corante Azul de Tripan 400 mg
PBS pH 7,2 q.s.p. 100 mL
Reagente de transfecção PolyFect® (Qiagen, no de catálogo 301105)
Esse reagente de transfeção é um dendrímero ativado que possui uma carga positiva,
que permite sua ligação a receptores carregados negativamente na superfície de células
eucarióticas. Uma vez dentro da célula, o reagente PolyFect® tamponiza o pH do lisossomo e
assegura a estabilidade de o transporte do DNA intacto até o núcleo.
Reagente de transfecção Lipofectamine LTXTM (Invitrogen, no de catálogo 15338-100)
É um lipídio catiônico cuja formulação específica permite a transfecção de diversas
linhagens de células de mamífero, com uma grande eficiênia e baixa toxicidade.
3.1.8 Soluções e tampões de uso geral
Azida Sódica – Solução estoque 100X
Azida sódica 5% (p/v)
Esta solução era utilizada para a conservação dos tampões PBS e PBS-T e nas soluções
estoque dos anticorpos em concentração final de 0,05% (p/v).
Tampão TE
Tris-HCl pH 8,0 10 mM
EDTA pH 8,0 1 mM
Tampão Tris
Tris-HCl pH 8,0 10mM
Glicogênio
Glicogênio 20mg/mL
Glicerol – Solução estoque
Glicerol 50% (v/v)
33
Tampão PBS (Phosphate-Buffered Saline) 10X, pH 7,4
NaCl 1,5 M
Na2HPO
4 0,1 M
NaN3 0,02% (p/v)
Tampão PBST 1X, pH 7,4
PBS 1X acrescido de Tween 20 na concentração final de 0,1% (v/v)
3.1.9 Soluções e material para preparo de células competentes e transformação
bacteriana
Solução de CaCl2
CaCl2 50 mM
Esterilizada por filtração e estocada a 4ºC
Solução de CaCl2 + 15% de Glicerol (v/v)
CaCl2 50 mM
Glicerol 15%
Esterilizada por filtração e estocada a 4ºC
Solução de Glicerol
Glicerol 10% (v/v)
Solução de X-Gal
Solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo (X-Gal) dissolvido em N,N-
dimetilformamida em solução estoque de 2,5%. Solução armazenada a -20ºC e protegida da
luz. Usada no meio de cultura na proporção de 1:100.
Solução de IPTG
Solução de isopropil-tio-β-D-galactosídeo (IPTG) dissolvido em água em solução
estoque de 100 mM e esterilizado por filtração em membrana Millipore de 0,22 μm. Usada no
meio de cultura na proporção de 1:1000.
34
Cubetas de eletroporação (BioAgency®
, no catálogo: 165-2086N)
3.1.10 Soluções para extração de DNA plasmidial
Solução I
Tris-HCl pH 8,0 25 mM
EDTA pH 8,0 10 mM
Glicose 50 mM
Solução II
NaOH 0,2 M
SDS 1,0% (p/v)
Solução III
Acetato de potássio 3 M
Ácido Acético 2 M
pH ajustado para 4,8 - 5,0
RNAse A
RNAse A (Invitrogen®
, no de catálogo 12091-021).
Clorofane
Fenol equilibrado em pH 7,6 1 v
Clorofórmio 1 v
Β-hidroxiquinilona 0,05% (p/v)
Equilibrado com 0,1 v de Tris-HCl 100 mM pH 7,6
Clorofil
Clorofórmio 24 v
Álcool isoamílico 1 v
Equilibrado com 0,25 v de tampão TE
Etanol 100%
Etanol 100% (v/v)
35
Etanol 70%
Etanol 70% (v/v)
Isopropanol 100%
Isopropanol 100% (v/v)
Acetato de sódio 3 M, pH 4,8
Utilizada para precipitação de DNA em preparação de pequena escala.
Acetato de amônio 7,5 M
Utilizada para precipitação de DNA em preparação de larga escala.
3.1.11 Tampões de Endonucleases de Restrição
3.1.11.1 Fermentas®:
TangoTM (10X) Tris-Acetato pH 7,9 33 mM
Acetato de Magnésio 10 mM
Acetato de Potássio 66 mM
BSA 0,1 mg/mL
Fast Digest Buffer TM (10X) 3.1.11.2 New England Biolabs
®:
NEBuffer 1 (1X)
Bis-Tris-propano-HCl pH 7,0 10 mM
MgCl2 10 mM
DTT 1 mM
NEBuffer 2 (1X)
Tris-HCl pH 7,9 10 mM
MgCl2 10 mM
DTT 1 mM
36
NEBuffer 3 (1X)
Tris-HCl pH 7,9 150 mM
MgCl2 10 mM
NaCl 100 mM
DTT 1 mM
NEBuffer 4 (1X)
Tris-Acetato pH 7,9 20 mM
Acetato de Magnésio 10 mM
Acetato de Potássio 50 mM
DTT 1 mM
NEBuffer EcoRI (1X) Tris-HCl pH 7,5 100 mM
MgCl2 10 mM
NaCl 50 mM
Triton X-100 0,025% (v/v)
3.1.11.3 Promega®:
Buffer A (1X) Tris-HCl pH 7,5 6 mM
MgCl2 6 mM
NaCl 6 mM
DTT 1 mM
Buffer H (1X) Tris-HCl pH 7,5 90 mM
MgCl2 10 mM
NaCl 50 mM
37
3.1.12 Tampões de outras reações
Tampão da polinucleotídeo quinase 10X (New England Biolabs
®)
Tris-HCL pH 7,6 660 mM
MgCl2 100 mM
DTT 100 mM
BSA 2 mg/mL
Tampão SAP (Fosfatase alcalina de camarão) (Promega
®)
Tris-HCl pH 9,0 500 mM
MgCl2 100 mM
Tampão de Reação da Taq DNA Polimerase CENBIOT/RS 10X
Tris-HCl 0,1M
KCl 0,5M
BSA 0,1% (p/v)
Na PCR foi adicionado cloreto de magnésio para uma concentração final de 1mM e
uma mistura de dNTPs (dGTP, dATP, dCTP e dTTP) na concentração de 10 mM cada.
Tampão de Anelamento de Oligonucleotídeos
Tris-HCl 1M
MgCl2 100mM
pH 7,6
Tampão de Reação 5X da T4 DNA ligase (Invitrogen®
)
Tris-HCl 250 mM
MgCl2 50 mM
ATP 5 mM
DTT 5 mM
PEG-8000 25% (p/v)
pH 7,6
38
Tampão de Reação 10X da T4 DNA ligase (Biolabs®
)
Tris-HCl pH 7,5 500 mM
MgCl2 100 mM
DTT 100 mM
ATP 10 mM
Tampão de Reação 10X da T4 DNA ligase (Promega
®)
Tris-HCl pH 7,6 300mM
MgCl2 100mM
DTT 100mM
ATP 10mM
3.1.13 Endonucleases de restrição
3.1.13.1 Fermentas®:
Bcu I (2U/ μL)
Bgl II (5U/ μL)
Cfr9 I (1,5U/ μL)
EcoR I (5U/ μL)
Mlu I (1U/ μL)
Nhe I (1U/ μL)
Psi I (1,5U/ μL)
Sma I (1,2U/ μL)
Xba I (1,5U/ μL)
3.1.13.2 New England Biolabs®:
Ava I (10U/ μL)
Avr II (4U/ μL)
BamH I (20U/ μL)
Bgl II (10U/ μL)
EcoR I (20U/ μL)
Hind III (20U/ μL)
Kpn I (10U/ μL)
39
Nco I (10U/ μL)
Nde I (20U/ μL)
Nhe I (10U/ μL)
Not I (2,5U/ μL)
Pvu II (5U/ μL)
Sac I (20U/ μL)
Sac II (20U/ μL)
SnaB I (2,5U/ μL)
Sfi I (20U/ μL)
Spe I (10U/ μL)
Sma I (20U/ μL)
Stu I (10U/ μL)
Xba I (20U/ μL)
Xho I (20U/ μL)
Xma I (10U/ μL)
3.1.13.3 Promega®:
Apa I (10U/ μL)
Pst I (10U/ μL)
3.1.14 Outras enzimas
T4 DNA Ligase (1U/μL) (Invitrogen
®)
T4 DNA Ligase (1U/μL) (New England Biolabs®
)
T4 DNA Ligase (1U/μL) (Promega®
)
T4 Polinucleotídeo Quinase (1U/μL) (New England Biolabs®
)
Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP) (1U/μL) (Promega®
)
40
Fragmento Klenow da DNA polimerase (0,5U/μL) (Invitrogen®
)
Taq DNA polimerase (2U/μL) (Cenbiot/RS®
)
3.1.15 Soluções e reagentes para eletroforese em gel de agarose e de poliacrilamida
Tampão de corrida TEB 10X
Trizma base 0,89 M
Ácido Bórico 0,89 M
EDTA pH 8,0 0,02 M
dH2O q.s.p. 1 L
Tampão de corrida TAE 50X
Tampão Tris-Acetato 2 M
Trizma-base 242 g
Ácido Acético Glacial 57,10 mL
EDTA pH 8,0 0,05 M
dH2O q.s.p. 1 L
Tampão de amostra para gel de agarose 10X
Tampão de corrida TEB 20X 50% (v/v)
Glicerol 50% (v/v)
Azul de Bromofenol 0,1% (p/v)
Xileno Cianol 0,1% (p/v)
Solução de brometo de etídeo 20.000X
Brometo de etídeo 10 mg/mL
Tampão de corrida para SDS-PAGE 5X
Trizma base 125 M
Glicina 125 mM
SDS 0,5% (p/v)
41
Tampão de amostra 5X para SDS-PAGE
Tris-HCl pH 6,8 250 mM
SDS 10% (p/v)
Glicerol 50% (v/v)
ß-mercaptoetanol 10% (v/v)
Azul de bromofenol 0,5% (p/v)
Acrilamida 30% (29:1)
Acrilamida 145 g
Bis-acrilamida 5 g
dH2O q.s.p. 500 mL
Estocar a 4ºC ao abrigo da luz.
Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8
Tris 36,34 g
dH2O q.s.p. 200 mL
Tris-HCl 0,5M, pH 6,8
Tris 12,11 g
dH2O q.s.p. 200 mL
SDS 10%
SDS 10 g
dH2O q.s.p. 100 mL
APS 10% (p/v)
Persulfato de amônio 100 mg/mL de água
TEMED (N,N,N’,N’- tetrametil etilenodimetilamina)
42
Gel Concentrador SDS-PAGE
Solução Acrilamida/Bis-acrilamida (29:1) 4% (p/v)
Tris-HCl pH 6,8 125 mM
SDS 0,1% (p/v)
APS 0,1% (p/v)
TEMED 0,01% (p/v)
Gel Separador SDS-PAGE
Solução Acrilamida/Bis-acrilamida (29:1) 10% (p/v)
Tris-HCl pH 8,8 400 mM
SDS 0,1% (p/v)
APS 0,1% (p/v)
TEMED 0,01% (p/v)
3.1.16 Soluções e materiais para os ensaios imunológicos (ELISA, Western e Dot blot)
Tampão de Fosfatase Alcalina (APB)
Tris-HCl pH 9,5 100 mM
NaCl 100 mM
MgCl2 5 mM
Tampão para Transferência Semi-Seca de Proteínas
Trizma-base 48 mM
Glicina 39 mM
SDS 0,037% (p/v)
Metanol 20% (v/v)
Solução de Bloqueio
Leite em pó desnatado 5% (p/v)
Dissolvido em PBST 1X
Solução Reveladora para ELISA
pNPP (para-nitro-fenil-fosfato) 1 mg/mL
Dissolvido em APB
43
Solução Reveladora para Western e Dot blot
O NBT (Nitro Blue Tetrazole) e o BCIP (5-Bromo-4-Cloro-indolil fosfato) eram
preparados numa solução estoque de 50 mg/mL. O NBT solubilizado em N,N-dimetil
formamida e o BCIP , em água. Para preparar 10 mL da solução reveladora, 66 µL do estoque
de NBT eram adicionados em 10 mL de APB e em seguida 33 µL do estoque de BCIP. Esta
ordem deve ser respeitada para se evitar a precipitação dos reagentes.
Membrana de Nitrocelulose
Hybond-C Extra (Amersham®
Bioscience nº. catálogo. RPN 303E)
Placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços com fundo chato para ELISA
(Nunc®
Maxisorp, no catálogo: 456537)
3.1.17 Coluna de cromatografia de afinidade
HiTrapTM
Protein A HP 1mL (GE lifescience, nº. catálogo. 17-0402-01). Para purificação dos
anticorpos recombinantes.
3.1.18 Soluções para cromatografia de afinidade
Tampão de ligação HiTrap Protein A
Fosfato de Sódio 20 mM, pH 7,0
Filtrado em membrana com poros de 0,45 µm
Tampão de Eluição HiTrap Protein A
Ácido Cítrico 0,1 M, pH 3,5 para eluição das proteínas recombinantes e pH 2,0 para limpeza.
Filtrados em membrana com poros de 0,45 µm
3.1.19 Materiais utilizados para concentração de sobrenadantes de cultura e proteínas
purificadas
Concentradores Amicon®
Bioseparations:
- Centricon YM-50 (nº. catálogo 4225)
44
3.1.20 Marcadores moleculares para DNA e proteína
1 kb plus DNA Ladder – (Invitrogen®
nº. catálogo. 10787-026)
Fragmentos de DNA em pb: 100; 200; 300; 400; 500; 650; 850; 1.000; 1.650; 2.000; 3.000;
4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; 10.000; 11.000; 12.000.
Low Mass DNA Ladder (Invitrogen
® nº. catálogo. 10068-013)
Mistura equimolar de fragmentos de DNA em pb de 2.000; 1.200; 800; 400; 200 e 100.
Utilizando 2 µL do marcador, corresponde a massa de 100; 60; 40; 20; 10 e 5 ng,
respectivamente.
High Mass DNA Ladder (Invitrogen®
nº. catálogo 10496-016)
Mistura equimolar de fragmentos de DNA em pb de 10.000; 6.000; 4.000; 3.000; 2.000 e
1.000. Utilizando 2 µL do marcador, corresponde a massa de 100; 60; 40; 30; 20 e 10 ng,
respectivamente.
Page RulerTM
Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas®
nº. catálogo SM1811)
Fragmentos de proteínas em kDa: 250; 130; 100; 70; 55; 35; 27; 15 e 10.
Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas®
nº. catálogo SM0431)
Fragmentos de pretaínas em kDa: 116; 66,2; 45; 35; 25; 18,4; 14,4.
3.1.21 Kits comerciais
QIAGEN Plasmid Midi Kit 100 – Para preparação plasmidial em escala intermediária
(Qiagen®
, nº. catálogo 12145).
QIAGEN Plasmid Maxi Kit 25 – Para preparação plasmidial em larga escala (Qiagen
®, nº.
catálogo 12163).
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) - Para preparação plasmidial em pequena escala
(Qiagen®
, nº. catálogo 27106).
45
Qiaquick Gel Extraction kit 50 – Para extração de DNA de gel de agarose (Qiagen®
, nº.
catálogo 28704).
Invisorb Fragment CleanUp - Para extração de DNA de gel de agarose (Invitek®
, nº.
catálogo 10203002).
Qiaquick PCR purification kit 50 – Para purificação de DNA para seqüenciamento
(Qiagen®
, nº. catálogo 28104).
Colunas para extração de DNA de gel de agarose por Freeze Squeeze – Ultrafree DA
Centrifugal Unit (Millipore®
, nº. catálogo 42600).
PlusOne Silver Staining kit Protein. Para coloração de géis de poliacrilamida com prata.
(GE lifescience, nº. catálogo. 17-1150-01).
Kit BCA Ácido Bicincrônico - para quantificação de proteínas. Pierce®
(nº. catálogo 23225)
3.1.22 Anticorpos utilizados nos ensaios de ELISA, Western Blot e Dot Blot.
Anti – IgG humana (H + L) feito em cabra (Pierce®
no catálogo: 31119)
Concentração: 1,8 mg/mL
Titulação de uso: 1:1000 (ELISA)
Anti – IgG humana (Fc específico) feito em cabra conjugado com fosfatase alcalina
(Sigma®
no catálogo: A9544)
Concentração: 1 mg/mL
Titulação de uso: 1:5000 (ELISA) e 1:2500 (Western blot e Dot blot)
IgG Humana (Sigma®
no catálogo: K9001)
Concentração: 1 mg/mL
Utilizado à 80, 100 ou 160 ng/mL como padrão nos experimentos de ELISA.
46
Anti – IgG humana (Cκ específico) feito em cabra (Pierce®
no catálogo: A9544)
Concentração: 1 mg/mL
Titulação de uso: 1:2500 (Western Blot e Dot Blot)
Anti – IgG de cabra feito em coelho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma®
no
catálogo: A-4187)
Concentração: 1 mg/mL
Titulação de uso: 1:2500 (Western Blot e Dot Blot)
3.2 Métodos
3.2.1 Preparação de DNA plasmidial
3.2.1.1 Em pequena escala (adaptado de Sambrook e Russel, 2001).
1- Três mL de cultura de células de E. coli, transformadas com o plasmídio de interesse,
crescidas em meio LB/Amp (150 µg/mL) durante 16 horas a 37ºC, eram coletados por meio
de duas centrifugações de 5 min a 5.000 rpm em microtubos de 1,5 mL, sendo o sobrenadante
desprezado a cada centrifugação.
2- O sedimento era ressuspendido em 200 µL de Solução I. Incubava-se as amostras no gelo
por 5 min.
3- Eram adicionados 400 µL de Solução II e as amostras eram homogeneizadas, por meio de
inversão do tubo várias vezes, e estas eram incubadas à temperatura ambiente por 5 min.
4- Eram adicionados 300 µL de Solução III, o mesmo procedimento de homogeneização era
repetido, e as amostras eram incubadas no gelo por 10 min.
5- As amostras eram centrifugadas a 12.000 rpm por 15 min a 4°C.
6- Ao sobrenadante eram adicionados 5 µL de RNAse A e incubava-se por 1 hora a 37ºC.
7- Eram adicionados 300 µL de clorofane e, após forte homogeneização, as amostras eram
centrifugadas por 5 min a 5.000 g à temperatura ambiente, a fase aquosa era coletada para
outro tubo.
8- Eram adicionados 300 µL de clorofil e o mesmo procedimento anterior de
homogeneização, centrifugação e coleta eram repetidos.
9- Eram adicionados 2v de etanol absoluto gelado e as amostras eram incubadas a -20ºC por
47
no mínimo 2 horas.
10- As amostras eram centrifugadas a 12.000 rpm por 45 min a 4ºC. O sobrenadante era
desprezado.
11- Era adicionado 1 mL de etanol 70% gelado e as amostras eram novamente centrifugadas a
12.000 rpm por 15 min a 4ºC. O sobrenadante era desprezado.
12- O sedimento era seco a vácuo ou por simples exposição ao ar.
13- O sedimento era ressuspendido em 50 µL de TE e as amostras conservadas a -20ºC.
3.2.1.2 Em larga escala (adaptado de Sambrook e Russel, 2001).
1- Duzentos mL de cultura de células de E. coli, transformadas com o plasmídio de interesse,
crescidas em meio LB/Amp (150 µg/mL) durante 16 horas a 37ºC, eram coletados por meio
de centrifugação de 15 min a 3.000 x g, desprezando-se o sobrenadante.
2- O sedimento era ressuspendido em 5 mL de Solução I sob forte agitação. As amostras eram
incubadas no gelo por 10 min.
3- Eram adicionados 10 mL de Solução II e as amostras eram homogeneizadas, por meio de
inversão do tubo várias vezes. Estas eram incubadas à temperatura ambiente por 5 min.
4- Eram adicionados 7,5 mL de Solução III, o mesmo procedimento de homogeneização era
repetido, e as amostras eram incubadas no gelo por 10 min.
5- As amostras eram centrifugadas a 10.000 x g por 30 min a 4°C.
6- O sobrenadante era filtrado em papel de filtro e ao sobrenadante eram adicionados 0,6v de
isopropanol. Após uma incubação de 5 min à temperatura ambiente, as amostras eram
centrifugadas a 12.000 x g por 20 min a temperatura ambiente.
7- O sobrenadante era descartado e, após a secagem por exposição ao ar, o sedimento era
ressuspendido em 500 µL de TE ao qual eram adicionados 10 µL de RNAse A. As amostras
eram incubadas por 1 hora a 37ºC.
8- Era adicionado 1v de clorofane e, após forte homogeneização e centrifugação de 5 min a
5.000 x g à temperatura ambiente, a fase aquosa era coletada para outro tubo.
9- O passo anterior era repetido mais uma vez.
10- Era adicionado então 1v de clorofil e o mesmo procedimento anterior de homogeneização,
centrifugação e coleta eram repetidos.
11- Eram adicionados 0,5v de acetato de amônio 7,5M e 2,0v de etanol 100% gelado e as
amostras eram incubadas por, no mínimo 2 horas a -20ºC.
11- As amostras eram centrifugadas a 12.000 rpm por 45 min a 4ºC. O sobrenadante era
48
desprezado.
12- Era adiconado 1 mL de etanol 70% gelado e as amostras eram novamente centrifugadas a
12.000 rpm por 15 min a 4ºC. O sobrenadante era desprezado.
13- O sedimento era seco a vácuo ou por simples exposição ao ar.
14- O sedimento era ressuspendido em 200 µL de TE. E as amostras conservadas a -20ºC.
3.2.2 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição.
As digestões dos plasmídios utilizados com enzimas de restrição eram realizadas
conforme instruções dos fabricantes. O tempo de incubação e a quantidade de material a ser
digerido variavam de acordo com o interesse do experimento realizado.
3.2.3 Análise de DNA plasmidial em gel de agarose (Sambrook e Russel, 2001).
A agarose era preparada numa concentração de 0,7 a 1,0% em tampão TEB 1X ou
TAE 1X com 0,5 µg/mL de brometo de etídeo. As amostras de DNA eram aplicadas com
tampão de amostra para gel de agarose no gel e eram submetidas à eletroforese em tampão
TEB ou TAE 0,5X, como descrito por (Sambrook e Russel, 2001). Para visualização do DNA
luz ultravioleta eram incididas no gel utilizando um transluminador (Pharmacia-LKB®
) e a
imagem era digitalizada em aparato de fotodocumentação.
3.2.4 Eluição de fragmentos de DNA de gel de agarose
Após eletroforese os fragmentos de DNA a serem eluídos eram cortados do gel de
agarose. A eluição do DNA do gel era feita de acordo com as instruções do fabricante do kit
utilizado (Qiaquick Gel Extraction kit, Qiagen®
ou Invisorb Fragment CleanUp, Invitek®
) ou
submetido ao Freeze-Squeze:
1 – A banda do gel contendo o DNA era cortada e transferida para uma bolsa feita utilizando
um pedaço de Parafilm®
. As duas extremidades da bolsa eram reunidas e seladas com o
auxílio da parte cônica de um microtubo de 1,5 mL. A banda era inserida dentro da bolsa pela
parte não selada.
2 – A bolsa contendo o fragmento era congelada a -40oC.
3 - Após o total congelamento, a porção plana da tampa de um microtubo de 1,5 mL era
49
utilizada para macerar o fragmento até se liquefazer.
4 – O líquido e o gel eram transferidos para colunas Ultrafree DA Centrifugal Unit
(Millipore®
).
5 – O material era centrifugado por 5 minutos a 12.000 x g a temperatura ambiente.
6 - Após a centrifugação o material era precipitado com a adição de 0,1 v de acetato de sódio
3M, 60 µg de glicogênio e 2,5v etanol 100% gelado. As amostras eram incubadas a -20ºC
durante a noite para um melhor rendimento da precipitação.
3.2.5 Reação de Desfosforilação com a fosfatase alcalina de camarão (SAP)
Essa enzima tem a capacidade de remover o grupo fosfato presente nas extremidades
5` de dsDNA digeridos com enzimas de restrição. Dessa forma, ela impede uma auto-ligação
do DNA plasmidial digerido sem a inserção do inserto.
1 – Dois a quatro µg de dsDNA eram incubados com 5 µL da fosfatase alcalina e tampão
apropriado da enzima em 1X para um volume final de 50 µL por 1h a 37oC.
2 – O sistema era inativado por 15 minutos a 65oC. A partir desse ponto, o sistema era
utilizado em sistema de ligação para posterior transformação de células competentes E. coli.
3.2.6 Reação de polimerização de extremidades de DNA utilizando o fragmento Klenow
da DNA polimerase I (Invitrogen®)
Para a extensão das extremidades coesivas geradas por meio de digestão com enzima
de restrição, uma mistura de dNTP era utilizada na concentração final da reação de 1mM e
0,5U de enzima para cada 100 ng de material utilizado na digestão. O tampão utilizado foi o
tampão da própria enzima de restrição utilizada para a digestão do DNA, visto que o
fragmento Klenow tem atividade ótima em qualquer tampão. A reação ocorreu a 37ºC durante
40 minutos e depois a enzima foi inativada a 65º C por 20 minutos.
3.2.7 Reação de anelamento de oligonucleotídeos
Cem ρmoles de cada oligonucleotídeo eram colocados em um microtubo de 1,5mL,
juntamente com 6,6 μL de tampão de anelamento e água MiliQ para um volume final de 50
μL. Essa mistura era fervida durante 10 minutos, e depois a temperatura do banho caía
50
lentamente, até que fosse atingida a temperatura ambiente. Esse processo durou cerca de 3
horas. A partir daí, os oligonucleotídeos anelados já estavam prontos para a reação de ligação
aos vetores plasmidiais.
3.2.8 Amplificação dos fragmentos Fc e Cκ para inserção da seqüência codificadora de
um sítio clivável por furina – PCR
As reações de PCR eram feitas da seguinte forma:
3.2.8.1 Amplificação do fragmento Fc fur
DNA molde (pMACIA HIL anti-CD3) 50ηg
Primer 5’ 10μM
Primer 3’ 10μM
Tampão de reação da enzima 10X 1X
MgCl2 2mM
dNTPs 0,25mM de cada
Taq DNA polimerase 2U/μL
O volume final de reação era de 50μL e a reação era feita no termociclador Eppendorf
nas seguintes condições:
1) 94ºC 3 min
2) 30 ciclos: 68 ºC 1 min
72 ºC 2 min 30seg
94 ºC 1 min
3) 72ºC 10 min
51
3.2.8.2 Amplificação do fragmento Cκ fur
DNA molde (pMACPS VLCκ anti-CD3) 50ηg
Primer 5’ 10μM
Primer 3’ 10μM
Tampão de reação da enzima 10X 1X
MgCl2 2mM
dNTPs 0,25mM de cada
Taq DNA polimerase 2U/μL
O volume final de reação era de 50μL e a reação era feita no termociclador Eppendorf
nas seguintes condições:
1) 94ºC 3 min
2) 30 ciclos: 65 ºC 1 min
72 ºC 2 min 30seg
94 ºC 1 min
3) 72ºC 10 min
3.2.9 Ligação de fragmentos de DNA
As concentrações de DNA (vetor e inserto) utilizadas nos sistemas de ligação variaram
de acordo com o experimento, sendo normalmente uma razão molar que variou de 1:1,5 a 1:5,
aplicando-se a seguinte fórmula:
ηg vetor x tamanho do inserto em pb x razão inserto = ηg de inserto
tamanho do vetor em pb vetor
As reações de ligação eram preparadas em tampão de ligase 1X contendo 1U de T4
DNA ligase. Os sistemas possuíam 10 a 20 μL de volume final, sendo incubados por 16 horas
a 16ºC ou 4ºC, dependendo do tipo de extremidade do DNA. Após este período, o sistema era
transformado em células competentes de E. coli.
52
3.2.10 Preparação de células competentes e transformação bacteriana
3.2.10.1 Por choque térmico-CaCl2 (adaptado de Maranhão, 2003).
1- Eram inoculados 500 µL de um pré-inóculo, feito a partir de uma colônia isolada da célula
de interesse, em 50 mL de meio LB. O inóculo era incubado a 37ºC a 220 rpm até a cultura
atingir uma densidade óptica a 600nm (OD600nm
) de 0,1 a 0,3.
2- O inóculo era centrifugado a 3.000 x g por 15 min a 4ºC, o sobrenadante era desprezado.
(Após essa etapa é importante que em todas as etapas subseqüentes as células sejam mantidas
resfriadas para evitar uma perda de eficiência).
3- O sedimento era ressuspendido em 10 mL de solução de CaCl2 50mM estéril gelada, com
movimentos suaves.
4- Era feita uma centrifugação a 3.000 x g por 15 min a 4ºC, o sobrenadante era desprezado.
5- O sedimento era ressuspendido em 1 mL de solução de CaCl2 50mM estéril gelada, com
movimentos suaves.
6- Após incubação de 1 hora em banho de água/gelo, as células eram aliquotadas e estas
podiam ser utilizadas por um período máximo de 24 horas.
7- Eram incubados de 100 a 200 µL de célula competente com o plasmídio de interesse a ser
transformado em banho de água/gelo por 30 min.
8- O choque térmico era realizado por meio de incubação do sistema de transformação em
banho a 42ºC por 3 min.
9- Era adicionado imediatamente 1 mL de meio LB e o sistema era incubado por 1 h a 37ºC.
10- Eram semeadas quantidades variáveis do sistema de transformação em placas contendo
meio LB-ágar contendo ampicilina a 150 µg/mL. As placas eram mantidas na estufa a 37ºC
por 16 horas.
3.2.10.2 Por eletroporação (adaptado de Maranhão, 2003).
1- Uma colônia isolada da célula de interesse era inoculada em 10 mL de meio SB contendo o
antibiótico de interesse. Esse pré-inóculo era mantido a 37º sob agitação de 220 rpm por 16
horas.
2- Era inoculado 1 mL do pré-inóculo em 500 mL de meio SB contendo 2,5 mL da solução
estoque de glicose 2M e 2,5 mL da solução estoque de Mg 2M. O inoculo era incubado a
53
37ºC a 220 rpm até a cultura atingir uma OD600nm
de 0,7 a 0,9.
2- O inóculo era centrifugado a 3.000 x g por 20 min a 4ºC, o sobrenadante era desprezado e
a célula era mantida sempre gelada a partir desse momento.
3- O sedimento era ressuspendido em 25 mL de glicerol 10% estéril gelado e a seguir eram
adicionados mais 75 mL de glicerol 10% gelado.
4- Era feita outra centrifugação a 3.000 x g por 20 min a 4ºC, repetindo a etapa anterior.
5- O sedimento era ressuspendido em 25 mL de Gilcerol 10% estéril gelado e submetido a
última centrifugação a 3.000 x g por 20 min a 4ºC.
6- O sedimento final era ressuspendido em 1 a 2 mL de glicerol 10% e as células eram
aliquotadas, congeladas em banho de gelo seco com etanol e armazenadas imediatamente a
-80ºC.
7- Para a transformação, o plasmídio era adicionado, já em um tubo resfriado previamente, à
célula competente e imediatamente colocado na cubeta de eletroporação (BioAgency®
)
também já resfriada.
8- A eletroporação era feita seguindo os seguintes parâmetros elétricos: 2,5 kV, 25 µF e 200
Ω, no aparelho Gene Pulser com Pulser Controller da BioRad. O τ esperado nessa condições é
de 4,0 a 5,0 milisegundos.
9- Imediatamente após o choque a cubeta era lavada com 3 mL de meio SOC e o meio era
recolhido para um tubo de centrifugação de 50 mL.
10- Após uma incubação de 1 h a 37ºC e 220 rpm, diluições da transformação eram semeadas
em placas contendo ampicilina a 200 µg/mL. As placas eram mantidas na estufa a 37ºC por
16 horas.
3.2.11 Seqüenciamento automático de DNA e análise de seqüências.
Após ter sido realizada uma análise de restrição, os plasmídios eram seqüenciados
utilizando o seqüenciador automático MegaBACE 500Plus (Molecular Dinamics®
). Eram
utilizadas de 150 a 200 ng do vetor, 5 picomoles do oligonucleotídeo apropriado e o kit
“DyeEnamic ET DYE Terminator Cycle Sequencing”.
As seqüências obtidas por meio do seqüenciamento automático eram analisadas
utilizando ferramentas de bioinformática: Phred e CAP3 disponíveis na página:
www.biomol.unb.br. Depois da análise de qualidade, as seqüências eram submetidas à
ferramenta de procura de alinhamentos básicos locais (BLAST, do inglês, Basic Local
54
Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) para análise de identidade com
seqüências já depositadas no GenBank. As seqüências também eram manipuladas e analisadas
com seqüências, depositas em um banco de dados pessoal, utilizando o programa BioEdit
Sequence Aligment Editor (Hall, 2007).
3.2.12 Cultura de células de mamíferos
Durante toda a manutenção da cultura, as células eram observadas em microscópio
invertido Leica DMIL e incubava-se em estufa a 37oC, 5% de CO
2 E 70% de umidade.
3.2.12.1 Congelamento de células de mamíferos – Criopreservação (Ruggiero, 2002).
1 – As células em cultura aderente eram lavadas 3 vezes com BSS.CMF. Após esse
procedimento, eram adicionados 5 mL de tripsina para que as células se soltassem da garrafa
de cultura.
2 – A suspensão celular era então transferida para um tubo de centrifuga de 50 mL, ao qual
eram acionados 5 mL de meio Ham-F12 acrescido de 10% de Soro fetal bovino (SFB), para a
inativação da tripsina que é nociva as células.
3 – As células eram centrifugadas a 130 x g por 8 minutos.
4 – O sobrenadante era descartado e o sedimento era ressuspendido no meio de cultura
remanescente do tubo.
5 – As célulaseram distribuídas em alíquotas de 500 µL em criotubos, onde 500µL de meio de
congelamento eram adicionados.
6 – Os criotubos eram incubados a 4ºC por 30 minutos, depois a – 20ºC por 30 minutos e
depois a – 80ºC durante a noite. As células poderiam permanecer estocadas a esta temperatura
ou ser transferidas para a estocagem em nitrogênio líquido.
3.2.12.2 Descongelamento de células de mamíferos (Ruggiero, 2002).
1 – Os criotubos eram transferidos para um banho de 37ºC até o total descongelamento das
células.
2 – As células eram plaqueadas em densidade de 2 x 102 células por garrafa de 25cm
2 em
meio Ham-F12 acrescido de 10% SFB.
55
3.2.12.3 Tripsinização, passagem das células e formação de monocamada celular
(Ruggiero, 2002).
Quando as células atingiam a confluência total e cobrem 100% de toda superfície da
placa de cultura, elas deveriam ser repicadas.
1 – O meio de cultura da garrafa era descartado.
2 – Eram adicionados à garrafa 5 mL de tripsina numa concentração de 1:250.
3 – Após 3 minutos, as células começaram a se descolar da superfície da garrafa. O
descolamento das células era acompanhado por visualização a olho nu.
4 – A tripsina era neutralizada com cerca de 5 mL de meio acrescido de 10% de SFB.
5 – A suspensão celular era transferida para tubos falcon de 50 mL, e centrifugados a 130 x g
por 8 minutos.
6 – O sobrenadante era descartado e o sedimento ressuspenso em 3 mL de meio acrescido de
SFB.
7 – Era transferida toda a população células por garrafas de 75 cm2 ou 150 cm
2 contendo 10
mL ou 30 mL de meio acrescido de SFB.
3.2.12.4 Estimativa do número de células por meio de contagem em câmara de Neubauer
(adaptado de Spector et al., 1998).
1 – As células eram tripsinizadas e ressuspensas em 1mL de meio de cultura.
2 – A câmara de Neubauer era coberta com a lamínula e eram aplicados 10µL de suspensão
de células em cada compartimento da Câmara. Caso alguma diluição tivesse sido necessária, o
número de células contado era multiplicado por esse fator de diluição.
3 – As células eram observadas em microscópio óptico (na objetiva com aumento de 40
vezes) e contadas nos quadrantes. Em seguida, era utilizada a fórmula:
número de células contadas X fator de diluição X 104 = nº de células / mL
número de quadrantes contados
56
3.2.12.5 Determinação Viabilidade celular (adaptado de Spector et al., 1998).
1 – As células eram tripsinizadas e transferidas para um tubo falcon de 15mL, ao qual se
adicionou 5 mL de meio com SFB.
2 – As células eram centrifugadas a 130 x g por 8 minutos.
3 – O sobrenadante era descartado e as células ressuspensas em 3mL de meio de cultura
remanescente.
4 – Vinte microlitros da suspensão celular eram incubados com 80µL da solução de Azul de
Tripan (diluição de 5 vezes da cultura).
5 – A câmara de Neubauer era montada, e nela aplicou-se um volume de 10µL da mistura.
6 – Eram contadas 200 células, entre viáveis (transparentes) e não-viáveis (azuis). A célula
não-viável tem a membrana celular mais permeável, e por isso, o corante entra na célula,
tornando-a azul. Após a contagem, era estabelecida a porcentagem de células viáveis.
3.2.12.6 Transfecção de Células HEK-293 utilizando o reagente PolyFect® Transfection
Reagent (Qiagen, nº de catálogo 301105)
1 – Em uma placa de cultura de 6 poços eram semeadas cerca de 3 x 105 células por poço, e
em seguida eram adicionados 3 mL de meio contendo SFB.
2 – As células eram incubadas em estufa a 37ºC, 5% de CO2 e 70% de umidade durante a
noite, até que se atingisse a confluência de 40%.
3 – No dia seguinte, o DNA a ser transfectado era diluído em meio de cultura sem soro. Para
placas de 6 poços, a quantidade a ser utilizada é: 2 μg de DNA por poço, para um volume
final de 100μL, completado com meio sem soro.
4 – Era adicionado o reagente PolyFect® à solução de DNA. Para placas de 6 poços, a
quantidade do reagente a ser utilizada é 20μL.
5 – A solução era incubada por 5 a 10 minutos à temperatura ambiente.
6 – Enquanto o complexo era formado, o meio dos poços do dia anterior era trocado por
1,5mL de meio com soro com antibiótico/antimicótico 1X (tópico 3.1.7).
7- Eram adicionados 500μL de meio com soro com antibiótico/antimicótico e a solução era
imediatamente transferida aos poços em movimentos cruciformes.
8 – As células eram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 e 70% de umidade.
9 – No tempo de 48 e 72 horas pós-transfecção, o meio de cultura era coletado e verificava-se
a presença dos anticorpos recombinantes.
57
3.2.12.7 Transfecção de células BHK-21 utilizando o reagente Lipofectamine LTXTM
(Invitrogen, no de catálogo 15338-100)
1 – Em uma placa de cultura de 6 poços eram semeadas cerca de 4,2 x 105 células por poço, e
em seguida eram adicionados 2mL de meio contendo SFB.
2 – As células eram incubadas em estufa a 37ºC, 5% de CO2 e 70% de umidade durante a
noite, até que se atingisse a confluência de 90%.
3 – No dia seguinte, o DNA a ser transfectado era diluído em meio de cultura sem soro. Para
placas de 6 poços, a quantidade a ser utilizada é: 2,5μg de DNA por poço, para um volume
final de 500μL, completado com meio sem soro.
4 – Era adicionado o reagente Lipofectamine LTXTM à solução de DNA. Para placas de 6
poços, a quantidade do reagente a ser utilizada é 6,25μL.
5 – A solução era incubada por 30 minutos à temperatura ambiente.
6 – Enquanto o complexo era formado, o meio dos poços do dia anterior era trocado por 2mL
de meio sem soro.
7 – Após este período, a mistura era adicionada lentamente sobre o poço em movimentos
cruciformes (no total, foram adicionados 500μL da mistura por poço).
8 – As células eram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 e 70% de umidade.
9 – Transcorridas de 4 a 6 horas após a transfecção, o meio de cultura sem soro era trocado
para um meio de cultura com soro. Em seguida, a placa era incubada durante a noite nas
mesmas condições descritas no passo 7.
10 – No tempo de 48 e 72 horas pós-transfecção, o meio de cultura era coletado e verificava-
se a presença dos anticorpos recombinantes.
3.2.12.8 Seleção de células transfectadas utilizando Geneticina® (G418-Sulfato)
Como as construções bicistrônica (HL IRES Neo) e tricistrônica (HIL Ires neo)
utilizadas para expressão dos anticorpos recombinantes apresentam o gene de resistência a
geneticina (NEOR), após o processo de transfecção os vetores possibilitaram que fosse feita a
seleção das células transfectadas e eliminação daquelas que não estavam produzindo as
proteínas recombinantes.
1 - Após 72h da transfecção o sobrenadante de cultura era coletado para verificação da
expressão de proteínas recombinantes e o meio era reposto adicionado de geneticina a uma
58
concentração final de 600 µg/mL em todos os poços transfectados com o plasmídio e também
no poço com as células não transfectadas, utilizadas como controle.
2 - O meio de cultura a partir de então era trocado a cada 48h nas mesmas condições descritas
anteriormente e visualizava-se, ao microscópio ótico, a morte celular no poço controle de
células não transfectadas.
3- Quando era constatado que houve a morte das células não transfectadas (elas mudam sua
morfologia de elípticas para esféricas e perdem a aderência à placa de cultura) permanecia-se
mais uma semana com o procedimento descrito acima e a partir de então as células eram
consideradas selecionadas e somente células transfectadas estavam presentes no poço.
3.2.12.9 Propagação das células transfectadas selecionadas para aumento da expressão.
Quando as células transfectadas selecionadas atingiam a confluência máxima no poço
era então procedido à propagação das células para aumento da cultura e conseqüentemente da
quantidade de proteína recombinante expressa.
1 – O meio de cultura do poço era descartado.
2 – Eram adicionados 500 µL de tripsina ao poço.
4 – Após 3 minutos, as células começaram a se descolar da superfície da garrafa. O
descolamento das células era acompanhado por visualização a olho nu.
5 – A tripsina era neutralizada com cerca de 1 mL de meio acrescido de 10% SFB.
6 – A suspensão celular era transferida para tubos falcon de 15 mL, e centrifugados a 130 x g
por 8 minutos.
7 – O sobrenadante era descartado e o sedimento ressuspenso em 3 mL de meio Ham-F12
acrecido de SFB.
8 – Transferia-se toda a população células para garrafas de 75 cm2 contendo 10 mL de meio
Ham-F12 acrescido de 10% SFB e geneticina na concentração já citada.
9 – Quando as células chegavam novamente a uma confluência máxima as células eram então
passadas para garrafas de 150 cm2 contendo 30 mL de meio Ham-F12 acrescido de 10% SFB
e geneticina. A partir de então, as células transfectadas eram mantidas nessas condições,
trocando-se o meio a cada 48h nas mesmas condições e coletando-se o sobrenadante para
acumulo de quantidade suficiente para purificação dos anticorpos recombinantes e realização
dos ensaios biológicos.
59
3.2.13 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Eram realizados ensaios do tipo ELISA sanduíche para detecção e quantificação das
proteínas recombinantes. Após cada lavagem as placas de microtitulação (Nunc®
) eram
invertidas sobre uma pilha de papel toalha e batidas vigorosamente até a retirada completa das
soluções presentes. Durante as incubações as placas permaneciam fechadas para evitar a
evaporação das soluções. Os anticorpos utilizados estão detalhados no tópico 3.1.22 dos
Materiais.
1- Os poços de interesse na placa eram sensibilizados com 150 µL por poço com o anticorpo
anti-IgG humana H+L feito em cabra, diluído em PBS 1X 1:1.000, e eram incubados durante
1 hora a temperatura ambiente.
2- Os poços eram lavados 3X com PBST 1X, 200 µL por poço.
3- Os poços eram bloqueados com 180 µL por poço de solução de bloqueio, e eram incubados
durante 1 hora a temperatura ambiente ou durante a noite a 4ºC.
4- Estes eram lavados 3X com PBST 1X e o sobrenadante de cultura das células transfectadas
eram adicionados. Eram feitas diluições seriadas de fator comum 3 dos anticprpos em PBS,
onde o volume final era de 100 µL por poço e títulos de 1:1; 1:3; 1:9; 1:27; 1:81 e 1:243. A
mesma diluição era realizada para todas as amostras. Como padrão utilizava-se IgG humana
purificada na concentração especificada nos materiais (diluída na mesma solução/meio que as
proteínas recombinantes). As reações eram feitas em triplicatas e eram incubadas por 1 hora a
temperatura ambiente.
5- Os poços eram lavados novamente 3X com PBST 1X e 150 µL por poço do anticorpo anti-
Fc humano conjugado a fosfatase alcalina feito em cabra na diluição de 1:5.000 eram
incubados por 1 hora a temperatura ambiente.
6- Os poços eram lavados 3X com PBST 1X e uma vez com tampão para fosfatase alcalina
(APB).
7- O ensaio era revelado com 100 µL por poço de pNPP (para-nitro-fenil-fosfato) 1 mg/mL
dissolvido em APB. Este era incubado por 20 a 30 min a temperaturta ambiente. A partir daí a
absorbância era lida no leitor de ELISA “Microplate Reader BioRad®
” modelo 450 a um
comprimento de onda de 405 nm.
Os cálculos de concentração eram feitos baseados na curva padrão de IgG humana.
60
3.2.14 Purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade
A purificação dos FvFcs recombinantes era realizada na coluna HiTrapTM
Protein A
HP 1mL (GE lifescience®
).
1 – Os microtubos de coleta da eluição eram preparados adicionando 200 µL de Tris-HCl 1M
pH9,0 por mL de fração a ser coletado.
2 – Era preparada a bomba peristáltica preenchendo-a de tampão de ligação. A tampa da parte
superior da coluna era retirada e a mangueira da bomba peristáltica era conectada à coluna
cromatográfica gota a gota.
3 - A coluna era lavada com 10 volumes de tampão de ligação mantendo uma taxa de
passagem do tampão pela coluna em 1 mL/min.
4 – O sobrenadante de cultura filtrado e concentrado era aplicado.
5 – A coluna era lavada com 10 volumes de tampão de ligação.
6 – Os anticorpos recombinantes ligados eram eluidos com 8 volumes de tampão de eluição
pH 3,5 sempre coletando as amostras nos microtubos de coleta preparados com Tris-HCl.
7 – Eram passados 3 volumes de tampão de eluição a pH 2,0 para retirada das IgGs bovinas
ligadas a resina e limpeza da coluna. O material também era coletado.
8 – A coluna era lavada com mais 10 volumes de tampão de ligação.
9 – Eram aplicados etanol 20% a coluna, no qual se estocava novamente a resina a 4ºC.
Imediatamente após o fim da coleta, 5µL de cada amostra eram aplicados em uma
membrana de nitrocelulose para análise por Dot Blot, seguindo o protocolo do item 3.2.14 de
métodos. As amostras onde se detectavam proteínas eram passadas na coluna Centricon YM-
50 (Amicon®
), com membrana de exclusão para proteínas maiores que 50 kDa para diálise e
concentração.
3.2.15 Análise de proteínas por Dot Blot (adaptado de Sambrook e Russel, 2001).
1 - 5 µL das frações obtidas durante o processo de purificação eram adicionadas diretamente a
uma membrana de nitrocelulose.
2 - Com a membrana seca, contendo os anticorpos recombinantes ligados, era procedido o
bloqueio utilizando solução de bloqueio por 1h a temperatura ambiente ou durante a noite a
61
4oC. 3 - Após essa etapa a membrana era lavada 3X com PBST 1X.
4 – A membrana era incubada com o anticorpo anti-Fc humano conjugado a fosfatase alcalina
ou com o anticorpo anti-Cκ humano na diluição de 1:2.500 por 1 hora a temperatura
ambiente. (Quando utilizado o anticorpo anti-Cκ humano, após essa etapa a membrana era
lavada 3X com PBST 1X e incubada com o anticorpo anti-IgG de cabra conjugado a fosfatase
alcalina).
5 - Após essa etapa a membrana era lavada 3X com PBS – T 1X e uma vez com APB.
6 – A solução reveladora (NBT/BCIP) era então adicionada. O aparecimento de pontos
coloridos era controlado visualmente. Após a reação, a membrana era lavada com água
destilada até retirar o excesso da solução reveladora e interromper a reação da enzima. A
membrana seca era preservada sobre papel filtro.
3.2.16 Análise de proteínas em gel de SDS-PAGE (adaptado de Sambrook e Russel,
2001).
Após a purificação dos anticorpos recombinantes era procedida a análise em gel
desnaturante de poliacrilamida.
1 – Inicialmente o gel separador era preparado em concentração de 10% (p/v), sendo a
polimerização catalisada pela adição de 0,045% (p/v) de APS e 0,2% (v/v) de TEMED.
2 – Uma vez polimerizado o gel separador, o pente era introduzido para permitir a formação
dos poços.
3 – A partir daí, o gel concentrador preparado em concentração de 4% (p/v) era vertido, tendo
a sua polimerização catalisada por 0,12% (p/v) de APS e 0,2% (v/v) de TEMED.
4 – Uma vez polimerizado o gel ele era acoplado ao aparato de eletroforese. Antes da
aplicação das amostras os poços eram lavados com tampão de corrida.
5 – Imediatamente antes da aplicação das amostras (já preparadas com o tampão de amostra),
estas eram fervidas em banho-maria a 100°C por 10 minutos.
5 – Era procedida a aplicação das amostras e iniciada a corrida do gel a 20 mA por gel.
6- Após a corrida do gel, este era submetido à coloração com prata ou transferência para
membrana de nitrocelulose para realização do Western Blot, especificada no item 3.2.17 de
métodos.
62
3.2.17 Coloração do gel de SDS-PAGE
A coloração com prata era feita com o kit PlusOne Silver Staining kit Protein (GE Healthcare) segundo instruções do fabricante.
3.2.18 Análise de proteínas por Western Blot (adaptado de Sambrook e Russel, 2001).
Após a corrida, o gel de poliacrilamida era transferido para a membrana de
nitrocelulose utilizando-se o sistema de transferência semi-seca com eletrodos de grafite
(Pharmacia-LKB®
).
1 – Conforme instruções do fabricante, era feito um "sanduíche" de papéis de filtro,
previamente embebidos em tampão de transferência contendo, nessa ordem, 5 papéis de filtro,
a membrana, o gel e mais 5 papéis de filtro.
2 – O "sanduíche" era colocado entre os eletrodos de grafite e submetido a uma corrente
elétrica de 0,8 mA/cm2 de membrana por 1h 45 min.
3 – Após este procedimento, a membrana, contendo as proteínas transferidas, era embebida
em solução de bloqueio e incubada por 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
4 – A solução de bloqueio era removida e a membrana era lavada 3X com PBST 1X a
temperatura ambiente.
5- A membrana era incubada com o anticorpo anti-Fc humano conjugado a fosfatase alcalina
ou com o anticorpo anti-Cκ humano na diluição de 1:2.500 por 1 hora a temperatura
ambiente. (Quando utilizado o anticorpo anti-Cκ humano, após essa etapa a membrana era
lavada 3X com PBST 1X e incubada com o anticorpo anti-IgG de cabra conjugado a fosfatase
alcalina).
6 – Após essa etapa a membrana era lavada 3X com PBS – T 1X e uma vez com APB.
7 – A solução reveladora (NBT/BCIP) era então adicionada. O aparecimento das bandas
coloridas era controlado visualmente. Após a reação, a membrana era lavada com água
destilada até retirar o excesso da solução reveladora e interromper a reação da enzima. A
membrana seca era preservada sobre papel filtro.
63
Resultados e
Discussão
64
4.1 Etapas metodológicas
Seguem abaixo as etapas metológicas adotadas neste trabalho (Figura 11).
Figura 11. Representação esquemática das etapas metodológicas do trabalho.
65
4.2 Construção do vetor de expressão bicistrônico pMACIA HIL anti-CD3
Tendo em vista os resultados promissores das versões FvFcs humanizadas do
anticorpo anti-CD3 humano (Silva, 2008 e Silva, et al. 2009, manuscrito em preparação) foi
proposta a construção de versões de anticorpo inteiro para expressão em células de mamífero,
a partir da versão FvFc R.
A primeira versão proposta foi uma construção bicistrônica utilizando o vetor
pMACIA IRES EV. Este vetor contém um IRES que foi sintetizado a partir da seqüência
gênica do isolado 71 de enterovírus (Shih et al., 2000), um íntron de imunoglobulina presente
no peptídeo sinal da cadeia pesada advindo da família VH10.2 (Whitcomb et al., 1999) e a
região codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve proveniente da região V-J do mieloma
MPC11 (Kelley, Coleclough e Perry, 1982). Assim, entre as duas cadeias inteiras do
anticorpo, pesada e leve, haveria o elemento IRES sintético, formando o vetor de expressão
pMACIA HIL anti-CD3 (Figura 12).
Figura 12. Representação esquemática do vetor de expressão bicistrônico pMACIA HIL anti-CD3. Este vetor é composto, respectivamente, por um promotor de citomegalovírus (Pcmv); íntron A; seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada, com seu íntron original; cadeia pesada inteira(VHCH1CH2CH3); IRES sintético; seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve; cadeia leve inteira (VLCκ) e sinal de poliadenilação.
66
4.2.1 Clonagem da cadeia leve inteira do anticorpo anti-CD3 no vetor de expressão
pMACIA IRES EV
Com o vetor de expressão estabelecido, direcionamos as estratégias de clonagem e
montagem das seqüências codificadoras do anticorpo recombinante para inseri-las nesse vetor
e possibilitar a futura expressão em células de mamíferos.
Para clonagem do fragmento gênico codificador da cadeia leve inteira do anticorpo
anti-CD3 no vetor pMACIA IRES EV, tivemos que montá-la inicialmente num outro vetor, o
pMACPS VLCκ anti-CD18. Esse vetor foi utilizado como doador da porção Cκ, e o vetor
pUC57 hVL como doador da porção VL humanizada. Dessa forma, esses dois últimos vetores
foram digeridos com as enzimas de restrição Bgl II e Xho I, proporcionando a liberação do VL
humanizado anti-CD3 e VL do anti-CD18 (Figura 13). Após a clonagem, os clones obtidos
foram analisados utilizando a enzima de restrição Kpn I e o perfil originado estava de acordo
com o esperado, dando indício de que a clonagem foi bem sucedida, originando o vetor
pMACPS VLCκ anti-CD3.
A partir disso, a cadeia leve inteira foi transferida do vetor pMACPS VLCκ anti-CD3
para o vetor de expressão pMACIA IRES EV por meio de digestão com as enzimas de
restrição Bgl II e BamH I. Essa digestão proporcionou a liberação da cadeia leve inteira e a
geração dos sítios para clonagem no vetor pMACIA IRES EV (Figura 14). Após a clonagem,
os clones obtidos foram analisados utilizando a enzima de restrição Kpn I e o perfil originado
estava de acordo com o esperado, originando o vetor pMACIA L anti-CD3.
67
Figura 13. Estratégia para construção do vetor pMACPS VLCκ anti-CD3. Para obtenção do vetor contendo a cadeia leve inteira do anticorpo anti-CD3 humano, os plasmídios pUC hVL e pMACPS VLCκ anti-CD18 foram digeridos com as enzimas Bgl II e Xho I para liberação do fragmento gênico codificador da cadeia variável leve e do vetor, respectivamente. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase, dando origem ao vetor pMACPS VLCκ anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase e pCMV: promotor de citomegalovírus.
68
Figura 14. Estratégia para construção do vetor pMACIA L anti-CD3. Para clonagem da cadeia leve inteira do anticorpo anti-CD3 humano no vetor pMACIA IRES EV, este e o plasmídio pMACPS VLCK anti-CD3 foram digeridos com as enzimas Bgl II e Bam HI para liberação do fragmento gênico codificador da cadeia leve e do vetor. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem ao vetor pMACIAI L anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; IRES EV: IRES sintético; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada e PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve.
69
4.2.2 Clonagem da cadeia pesada inteira do anticorpo anti-CD3 no vetor de expressão
pMACIA L anti-CD3
Para clonagem do fragmento gênico codificador da cadeia pesada inteira do anticorpo
anti-CD3 no vetor pMACIA L anti-CD3, tivemos que montá-la primeiramente num outro
vetor, o pMACPS VHCH123 anti-CD18. Esse vetor foi utilizado como doador da porção
constante de IgG1 contendo os três domínios constantes (CH123), e o vetor pIg CD3 scFv R
como doador da porção VH humanizada, hVHR86
. Dessa forma, esses dois últimos vetores
foram digeridos com as enzimas de restrição Xma I e Xba I, proporcionando a liberação do
VH humanizado anti-CD3 e VH do anti-CD18 e a geração dos sítios para clonagem no vetor
pMACPS VHCH123 anti-CD18 (Figura 15). Após a clonagem, os clones obtidos foram
analisados utilizando as enzimas de restrição Kpn I e Pvu II e o perfil originado estava de
acordo com o esperado, sugerindo que a clonagem foi bem sucedida, originando o vetor
pMACPS VHCH123 anti-CD3.
A partir disso, a cadeia pesada inteira foi transferida do vetor pMACPS VHCH123
anti-CD3 para o vetor de expressão pMACIA L anti-CD3 por meio de digestão com as
enzimas de restrição Xma I e Spe I para o primeiro vetor , e Xma I e Avr II para o segundo
vetor. Essa digestão proporcionou a liberação da cadeia pesada inteira e a geração dos sítios
para clonagem no vetor pMACIA L anti-CD3 (Figura 16). As enzimas de restrição Spe I e Avr
II são compatíveis e com a ligação dos fragmentos há a perda dos sítios de restrição das duas
enzimas. Após a clonagem, os clones obtidos foram analisados utilizando as enzimas de
restrição Kpn I e Xba I e o perfil originado estava de acordo com o esperado, dando indício de
que a clonagem foi bem sucedida, originando a construção bicistrônica denominada pMACIA
HIL anti-CD3.
70
Figura 15. Estratégia para construção do vetor pMACPS VHCH123 anti-CD3. Para obtenção do vetor contendo a cadeia pesada inteira do anticorpo anti-CD3 humano, os plasmídios pIG CD3 scFv R e pMACPS VHCH123 anti-CD18 foram digeridos com as enzimas Xba I e Xma I para liberação do fragmento gênico codificador da cadeia variável pesada e do vetor, respectivamente. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem ao vetor pMACPS VHCH123 anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; poly A: sinal de poliadenilação; pCMV: promotor de citomegalovírus.
71
Figura 16. Estratégia para construção do vetor pMACIA HIL anti-CD3. Para clonagem da cadeia pesada inteira do anticorpo anti-CD3 humano no vetor pMACIA L, o plasmídio pMACPS VHCH123 anti-CD3 foi digerido com as enzimas Xma I e Spe I para liberação do fragmento gênico codificador da cadeia pesada; já o plasmídio pMACIA L foi digerido com as enzimas Xma I e Avr II para liberação do vetor. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem ao vetor capaz de expressar a construção bicistrônica pMACIA HIL anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada e PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve.
72
4.3 Transfecção transiente da linhagem celular HEK293 utilizando o vetor
bicistrônico pMACIA HIL anti-CD3 na
Atualmente, no âmbito da produção heteróloga de proteínas recombinantes para fins
farmacêuticos as células de mamífero se destacam. Cerca de 60 a 70% dessas proteínas já
disponíveis no mercado são produzidas em células de mamíferos (Wurm, 2004). E dentro
desse cenário a linhagem celular HEK293 vem se destacando na expressão transiente de
anticorpos (Braren et al., 2007). Dessa forma, com a seqüência da construção bicistrônica
pMACIA HIL anti-CD3 já analisada e correta, partimos para a produção desse anticorpo na
linhagem celular HEK293. Para tal foi realizada transfecção transiente (tópico 3.2.12.6) e esta
foi realizada em triplicata. Além desse vetor, também foi transfectado separadamente o vetor
pGFP/NEO para controle da eficiência de transfecção, pois ele expressa o gene da proteína
fluorescente verde recombinante, e a fluorescência pode ser observada quando a célula é
excitada com luz ultravioleta.
Após 48h e 72h da transfecção os sobrenadantes de cultura foram coletados para
ensaios imunoenzimáticos (ELISA), sendo que na última coleta, a de 72h pós-transfecção,
tínhamos o acúmulo de proteína de 24h apenas. Esse ensaio foi realizado com o intuito de
verificar a expressão do anticorpo recombinante (tópico 3.2.13). O experimento de ELISA foi
desenvolvido de forma a quantificar a presença da porção Fc. Os anticorpos eram
quantificados a partir de comparações com uma curva padrão realizada com IgG humana em
concentrações conhecidas obtidas por meio de diluições seriadas (Figura 17). O ensaio foi
realizado para cada poço transfectado e os resultados referentes ao anticorpo recombinante
agrupados, assim foram agrupadas três medidas.
Os resultados revelaram que a construção bicistrônica conseguiu promover a
expressão do anticorpo recombinante (Figura 17). Entretanto, a eficiência de transfecção,
revelada pela contagem de células fluorescentes quando transfectadas com o vetor
pGFP/NEO, foi bastante baixa diante dos níveis expressos, aproximadamente 5%, mesmo
com as células estando numa confluência em torno de 40%, recomendada pelo fabricante do
reagente de transfecção. A partir dos dados da curva padrão com IgG humana a 100 ng/mL,
pode-se inferir que a quantidade de anticorpo recombinante presente no sobrenadante de
cultura era de 20ng/mL em 48h pós-transfecção e 11ng/mL em 72h pós-transfecção.
73
(A)
(B)
Figura 17. Produção do anticorpo anti-CD3 humano em HEK293. Imunodetecção da expressão de anticorpos nos sobrenadantes de culturas de células transfectadas com o vetor pMACIA HIL anti-CD3 coletados 48h e 72h após a transfecção. Todas as células foram transfectadas utilizando o reagente PolyFect® Transfection Reagent (Qiagen). (A) 48h pós-transfecção. (B) 72h pós-transfecção. HIL: pMACIA HIL anti-CD3; NT: sobrenadante de células não transfectadas; IgG: IgG humana a uma concentração inicial de 100 ng/mL; PBS: Controle negativo.
74
4.4 Purificação do anticorpo anti-CD3 a partir de transfectomas de
pMACIA HIL anti-CD3
Os sobrenadantes foram submetidos à purificação por cromatografia de afinidade
(tópico 3.2.14) utilizando a coluna Hitrap protein A HP 1mL (GE Healthcare®
) e as frações
coletadas foram analisadas quanto à presença do anticorpo recombinante por imunoensaios do
tipo Dot Blot (tópico 3.2.15). Uma estratégia adotada durante a purificação para redução da
contaminação com IgGs bovinas, presentes no SFB, foi a adoção de pHs distintos para eluição
dos anticorpos recombinantes (Silva, 2008). As IgGs bovinas possuem como característica
um pH de eluição ideal da resina de proteína A em torno de 2,0 enquanto que as IgGs
humanas são facilmente eluídas dessa resina em pHs variando entre 3,5 e 4,5. Dessa forma,
procedia-se uma eluição com o tampão em pH 3,5 para minimizar a contaminação dos
anticorpos recombinantes com IgG bovina e depois se realizava a eluição com pH 2,0 para
limpeza da coluna.
Para uma melhor caracterização dos anticorpos purificados, frações do processo de
purificação foram submetidas a um SDS-PAGE (tópico 3.2.16) seguido de Western Blot a fim
de verificar a presença do anticorpo recombinante (tópico 3.2.18). As bandas correspondentes
às cadeias pesada e leve do anticorpo recombinante podem ser observadas em torno de 55
kDa e 27 kDa, respectivamente (Figura 18).
A banda correspondente à cadeia pesada aparece mais nitidamente na segunda fração
da eluição em ambos pHs, enquanto a banda correspondente à cadeia leve aparece muito
discretamente nessa fração. É interessante ressaltar a presença da cadeia leve do anticorpo,
quando revelado com o anticorpo anti-Cκ humano, nas frações de lavagem do processo de
purificação, sugerindo que havia no sobrenadante cadeias leves não associadas à cadeias
pesadas. Uma razão para este resultado poderia ser devido a um desbalanço na síntese das
duas cadeias de anticorpo, havendo um maior acúmulo da cadeia leve em relação à cadeia
pesada. Isso pode ser devido a força do elemento IRES utilizado, que estaria dirigirindo a
expressão da cadeia leve em maior quantidade que a cadeia pesada, cuja expressão é cap-
dependente. Cadeias pesadas somente são secretadas quando combinadas a cadeias leves,
formando moléculas de anticorpo inteiras (Leitzgen, Knittler e Haas, 1997), já a cadeia leve
pode ser secretada como monômeros ou homodímeros livres (Dul et al., 1996). Um outro
motivo para tal verificação poderia ser devido ao fato de se utilizar dois anticorpos (primário e
secundário) para a detecção da cadeia leve em contrapartida a apenas um para a detecção da
75
cadeia pesada. Tal fato leva a uma amplificação do sinal e aporta ao método uma maior
sensibilidade de detecção da cadeia leve em relação à cadeia pesada.
(A)
(B)
Figura 18. Análise do processo de purificação por Western Blot. Foi realizada uma eletroforese em gel SDS 10% para separação das frações purificadas as quais eram posteriormente transferidas para uma membrana de nitrocelulose para realização do ensaio. (A) Immunodetecção utilizando anti-Fc humano conjugado a fosfatase alcalina. (B) Immunodetecção utilizando anti- Cκ humano feito em cabra e anti-IgG de cabra conjugado a fosfatase alcalina. 1 – 3: primeira, segunda e terceira frações da lavagem do processo de purificação. 4 – 6: primeira, segunda e terceira frações da eluição com tampão pH 3,5. 7 e 8: primeira e segunda frações da eluição com tampão pH 2,0. 9: 500 ng de IgG humana. M: Marcador Page Ruler Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas®). Setas pretas destacando as bandas correspondentes às cadeias pesada e leve nas segundas frações das eluições, respectivamente.
76
4.5 Construção de vetores para expressão de duas versões monocistrônicas
do anticorpo anti-CD3
Com a confirmação da expressão do anticorpo anti-CD3 a partir da construção
bicistrônica, partimos para a construção de duas versões monocistrônicas deste anticorpo.
Nessas construções foi retirado o elemento IRES sintético entre as cadeias pesada e leve, e em
seu lugar foi inserida uma seqüência codificadora de um sítio clivável pela enzima furina
(Fur). A construção monocistrônica HL possui o cassete de expressão na seguinte ordem:
cadeia pesada inteira – Fur – cadeia leve inteira, além de todos os elementos advindos da
construção bicistrônica pMACIA HIL anti-CD3. Já a construção monocistrônica LH possui o
cassete de expressão invertido: cadeia leve inteira – Fur – cadeia pesada inteira (Figura 19). A
seqüência codificadora para este sítio clivável por furina foi idêntica àquela previamente
utilizada para o processamento do fator VIII humano (Campos-da-Paz et al., 2008).
Figura 19. Representação esquemática das construções monocistrônicas. Composição em comum dos dois vetores pMACIA HL anti-CD3 (A) e pMACIA LH anti-CD3 (B): promotor de citomegalovírus (Pcmv); íntron A e sinal de poliadenilação. (A) cassete de expressão da construção monocistrônica HL: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada, com um íntron de imunoglobulina no interior dessa seqüência; cadeia pesada inteira (VHCH1CH2CH3); seqüência codificadora de um sítio de clivável por furina e cadeia leve inteira (VLCκ). (B) cassete de expressão da construção monocistrônica LH: cadeia leve inteira (VLCκ); seqüência codificadora de um sítio clivável por furina e cadeia pesada inteira (VHCH1CH2CH3).
77
4.5.1 Construção do vetor de expressão monocistrônico pMACIA HL anti-CD3
Para a construção da versão monocistrônica HL foram sintetizados dois
oligonucleotídeos, CH123 509 e CH123 reverso, que amplificam a porção Fc da cadeia
pesada a partir da posição 509, e inserem uma seqüência codificadora de um sítio clivável por
furina (Fur) e um sítio de restrição para a enzima Bgl II, ao final desta cadeia (Tabela 2). Essa
porção foi amplificada do vetor pMACIA HIL anti-CD3 por PCR (tópico 3.2.8.1) e clonada
no vetor pGEM-T easy (Promega) gerando o vetor pGEM-T easy Fc Fur.
Como o vetor pMACIA HIL anti-CD3 possui um sítio de restrição da enzima Sac II
dentro do promotor CMV, este foi manipulado para perder esse sítio. Portanto, este vetor foi
digerido com as enzimas de restrição Hind III e SnaB I, seguido de tratamento com o
fragmento Klenow da DNA polimerase I, e ligado com T4 DNA ligase. A perda do sítio de
restrição da enzima Sac II foi confirmada pela digestão dos clones obtidos com esta mesma
enzima e o perfil originado estava de acordo com o esperado, dando origem ao vetor pMAC
HIL anti-CD3.
Este último vetor e o vetor pGEM-T easy Fc Fur foram então digeridos com as
enzimas de restrição Sac II e Bgl II. No vetor pGEM-T easy Fc Fur essa digestão promoveu a
liberação do fragmento Fc Fur. Já no vetor pMAC HIL anti-CD3 proporcionou a perda da
cadeia pesada a partir da posição 509, do elemento IRES e da seqüência líder codificadora do
peptídeo sinal da cadeia leve, gerando os sítios para clonagem neste vetor. Após a clonagem,
os clones obtidos foram analisados utilizando as enzimas de restrição Sac I e Sac II e o perfil
originado estava de acordo com o esperado, dando indício de que a clonagem foi bem
sucedida, dando origem ao vetor pMAC HL anti-CD3, um vetor intermediário que não
possuía o íntron A no promotor e ao invés do elemento IRES possuía Fur (Figura 20).
Logo em seguida, os vetores pMAC HL anti-CD3 e pMACIA HIL anti-CD3 foram
digeridos com as enzimas de restrição Xba I e Bgl II. No vetor pMAC HL anti-CD3 essa
digestão proporcionou a liberação da porção constante da cadeia pesada juntamente com Fur.
Já no vetor pMACIA HIL anti-CD3 promoveu a perda da porção constante da cadeia pesada,
do elemento IRES e da seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve, gerando
os sítios para clonagem neste vetor. Após a clonagem, os clones obtidos foram analisados
utilizando as enzimas de restrição Nhe I, Xba I e Bgl II e o perfil originado estava de acordo
com o esperado, dando indício de que a clonagem foi bem sucedida e originando a construção
monocistrônica pMACIA HL anti-CD3 (Figura 21).
78
Figura 20. Estratégia para clonagem da porção Fc Fur no vetor pMAC HIL anti-CD3. Para clonagem da porção Fc Fur no vetor pMAC HIL anti-CD3, os plasmídios pGEM-T easy Fc Fur e pMAC HIL anti-CD3 foram digeridos com as enzimas Bgl II e Sac II para liberação do fragmento gênico Fc Fur e para liberação do vetor, respectivamente. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem ao vetor intermediário pMAC HL anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV: promotor de citomegalovírus; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada; PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve; Fc: porção constante da cadeia pesada e Fur: seqüência codificadora de um sítio clivável por furina.
79
Figura 21. Estratégia para construção do vetor pMACIA HL anti-CD3. Para clonagem da porção Fc Fur no vetor pMACIA HIL anti-CD3, os plasmídios pMAC HIL anti-CD3 e pMACIA HIL anti-CD3 foram digeridos com as enzimas Bgl II e Xba I para liberação do fragmento gênico CH123 Fur e para liberação do vetor, respectivamente. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem a construção monocistrônica pMACIA HL anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada; PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve e Fur: seqüência codificadora de um sítio clivável por furina.
80
4.5.2 Construção do vetor de expressão monocistrônico pMACIA LH anti-CD3
Como a versão monocistrônica LH contém o cassete de expressão invertido, cadeia
pesada inteira- Fur- cadeia leve, o primeiro passo sua construção foi eliminar as porções IRES
e cadeia leve inteira. Para isso o vetor pMACIA HIL anti-CD3 foi digerido com as enzimas de
restrição Not I e Bam HI, seguido de tratamento com o fragmento Klenow da DNA
polimerase I, e ligado com T4 DNA ligase. A perda destas porções foi confirmada pela
digestão dos clones obtidos com a enzima de restrição Kpn I e o perfil originado estava de
acordo com o esperado, dando origem ao vetor pMACIA H.
Este vetor foi então digerido com a enzima de restrição Xma I, que está presente no
início da porção VH da cadeia pesada, e nele foi introduzido o linker LH furina, para
posicionamento da cadeia leve antes da cadeia pesada com Fur entre elas. O linker LH furina
foi gerado pela junção dos oligonucleotídeos Linker LH furina e Linker LH furina reverso
(Tabela 2) de acordo com o tópico 3.2.7. Os sítios de clonagem obtidos com a união dos
oligonucleotídeos podem ser visualizados na Figura 22. A inserção do Linker LH furina foi
confirmada pela digestão dos clones obtidos com as enzimas de restrição Kpn I, Bgl II e Xho
I, e o perfil originado estava de acordo com o esperado, dando origem ao vetor pMACIA H
LHfur.
CCGGCTAGATCTGCTTCTCGAGATATC - - - -
- - - - GATCTAGACGAAGAGCTCTATAGGGCC
*∆ Xma I Bgl II Xho I Xma I
Figura 22. Esquema dos sítios de clonagem criados após anelamento do Linker LH furina. * Seqüência que altera o sítio original de Xma I.
Com o Linker LH furina introduzido, partimos para a clonagem da porção VL no vetor
pMACIA H LHfur. Este último vetor e o vetor pMACIA HIL anti-CD3, foram digeridos com
as enzimas de restrição Bgl II e Xho I. No vetor pMACIA HIL anti-CD3 essa digestão
promoveu a liberação da porção VL, enquanto no vetor pMACIA H LHFur gerou os sítios
para clonagem neste vetor, presentes no Linker LH furina. Após a clonagem, os clones
obtidos foram analisados utilizando as enzimas de restrição Kpn I, Bgl II e Xho I, e o perfil
originado estava de acordo com o esperado, dando origem ao vetor pMACIA VL H (Figura
23).
81
Figura 23. Estratégia para clonagem da porção VL no vetor pMACIA H LHfur. Para clonagem da porção VL no vetor pMACIA H LHfur, os plasmídios pMACIA HIL anti-CD3 e pMACIA H LHfur foram digeridos com as enzimas Bgl II e Xho I para liberação do fragmento gênico VL e para liberação do vetor, respectivamente. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem ao vetor pMACIA VL H. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada; PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve e Fur: seqüência codificadora de um sítio clivável por furina.
82
Para a finalização da construção faltava a inserção da porção Cκ no vetor juntamente
com a seqüência codificadora para o sítio clivável por furina (Fur). Foram então sintetizados
dois oligonucleotídeos, LH VL e LH Cκ fur, que anelam ao final da porção VL, amplificam a
porção Cκ inteira, e inserem Fur e um sítio de restrição para a enzima Xma I, ao final desta
cadeia (Tabela 2). Essa porção foi amplificada do vetor pMACPS VLCκ anti-CD3 por PCR e
clonada no vetor pGEM-T easy (Promega) gerando o vetor pGEM-T easy Cκ Fur.
Assim os vetores pGEM-T easy Cκ Fur e pMACIA VL H foram digeridos com as
enzimas de restrição Xho I e Xma I. No vetor pGEM-T easy Cκ Fur essa digestão promoveu a
liberação do fragmento Cκ Fur, enquanto vetor pMACIA VL H gerou os sítios para
clonagem neste vetor. Após a clonagem, os clones obtidos foram analisados utilizando as
enzimas de restrição Nhe I, Xba I e Bgl II e o perfil originado estava de acordo com o
esperado, dando indício de que a clonagem foi bem sucedida e originando a construção
monocistrônica pMACIA LH anti-CD3 (Figura 24).
83
Figura 24. Estratégia para construção do vetor pMACIA LH anti-CD3. Para clonagem da porção Fc Fur no vetor pMACIA VL H, este e o vetor pGEM-T easy Cκ fur foram digeridos com as enzimas Xho I e Xma I para liberação do vetor e do fragmento gênico Cκ Fur, respectivamente. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem a construção monocistrônica pMACIA LH anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada e Fur: seqüência codificadora de um sítio clivável por furina.
84
4.6 Transfecção transiente da linhagem celular HEK293 utilizando as
construções monocistrônicas e bicistrônica
Com os dois tipos de construções em mãos, partimos para a produção do anticorpo
anti-CD3 humanizado na linhagem celular HEK293, já avaliada com sucesso para a
construção bicistrônica pMACIA HIL anti-CD3. Para tal, foi realizada transfecção transiente
(tópico 3.2.12.6) com os três vetores em triplicata. Além desses três vetores, também foi
transfectado separadamente o vetor pGFP/NEO para controle da eficiência de transfecção.
Após 48h e 72h da transfecção os sobrenadantes de cultura foram coletados para
ensaios imunoenzimáticos (ELISA) com o intuito de verificar a expressão do anticorpo
recombinante. O experimento de ELISA também foi desenvolvido de forma a quantificar a
presença da porção Fc. Os anticorpos eram quantificados a partir de comparações com uma
curva padrão realizada com IgG humana em concentrações conhecidas obtidas por meio de
diluições seriadas (Figura 25). O ensaio era realizado para cada poço transfectado e os
resultados referentes ao anticorpo recombinante agrupados, assim foram agrupadas três
medidas.
Como era esperado, a construção bicistrônica conseguiu promover a expressão do
anticorpo recombinante. A partir dos dados da referência de IgG humana em concentração
inicial de 100 ng/mL, pode-se inferir que a quantidade de anticorpo recombinante presente no
sobrenadante de cultura dessa construção foi de 38ng/mL em 48h pós-transfecção e de
19ng/mL em 72h pós- transfecção (Figura 25).
Já para as construções monocistrônicas, não foi observada a expressão do anticorpo
recombinante (Figura 25), mesmo com uma alta eficiência de transfecção revelada pela
fluorescência de células transfectadas com o vetor pGFP/NEO, aproximadamente 60%.
Delineamos então duas hipóteses: a linhagem celular HEK293 não estava produzindo
suficientemente a enzima furina, requerida por essas construções, ou as construções não
estavam funcionando. Para solucionar o problema teríamos que proceder a transfecção dessas
construções em uma linhagem celular que sabidamente produziria a enzima furina. Shapiro e
colaboradores, em 1997, estudaram a localização celular da enzima furina em diversas
linhagens celulares de mamíferos e a encontraram, entre outras linhagens, na linhagem celular
BHK-21. Essa linhagem é derivada de células renais de hamster recém-nascidos e vêm sendo
largamente utilizada tanto em transfecções transientes como em estáveis (Cruz et al. 2002).
85
(A)
(B)
Figura 25. Comparação da produção do anticorpo anti-CD3 humano no sobrenadante de transfectomas de HEK293 a partir dos três vetores. Imunodetecção da expressão de anticorpos no sobrenadante de cultura coletado 48h e 72h após a transfecção. Todas as células foram transfectadas utilizando o reagente PolyFect® Transfection Reagent (Qiagen). (A) 48h pós-transfecção. (B) 72h pós-transfecção. As siglas HIL, HL e LH referem-se ao: sobrenadante de cultura de células transfectadas com o vetor pMACIA HIL anti-CD3, pMACIA HL anti-CD3 e pMACIA LH anti-CD3, respectivamente; NT: sobrenadante de células não transfectadas; IgG: IgG humana a uma concentração inicial de 100 ng/mL para obtenção de uma curva-padrão para estimativa da concentração dos sobrenadantes; PBS: Controle negativo.
86
4.7 Transfecção transiente da linhagem celular BHK-21 utilizando as
construções monocistrônicas e bicistrônica
Partimos então para a produção do anticorpo anti-CD3 humanizado na linhagem
celular BHK-21, a partir das três construções. Para tal, foi realizada transfecção transiente
(tópico 3.2.12.7) e esta foi realizada em triplicata. Além desses três vetores, também foi
transfectado separadamente o vetor pGFP/NEO para controle da eficiência de transfecção.
Após 48h e 72h da transfecção os sobrenadantes de cultura foram coletados para
ensaios imunoenzimáticos (ELISA) com o intuito de verificar a expressão do anticorpo
recombinante. O experimento de ELISA também foi desenvolvido de forma a quantificar a
presença da porção Fc. Os anticorpos eram quantificados a partir de comparações com uma
curva padrão realizada com IgG humana em concentrações conhecidas obtidas por meio de
diluições seriadas (Figura 26). O ensaio era realizado para cada poço transfectado e os
resultados referentes ao anticorpo recombinante agrupados, assim foram agrupadas três
medidas.
A construção bicistrônica HIL conseguiu promover a expressão do anticorpo
recombinante, mas em menor quantidade que na linhagem celular HEK293. Foi possível
também detectar a presença de anticorpos no sobrenadante de células transfectadas com a
construção monocistrônica HL, em uma quantidade bem menor que a construção HIL (Figura
26). Assim descartamos a hipótese de que essa construção não estaria funcionando, e
propomos a de que a linhagem celular HEK293 não estaria produzindo a enzima furina em
quantidade suficiente para promover a clivagem e liberação do anticorpo recombinante.
Já para o vetor contendo a construção monocistrônica LH foi possível observar a
presença da proteína recombinante (Figura 26), mesmo com uma alta eficiência de
transfecção revelada pela fluorescência de células transfectadas com o vetor pGFP/NEO,
aproximadamente 50%. Como a construção monocistrônica HL, que também possui Fur,
conseguiu produzir o anticorpo recombinante, mesmo em uma quantidade ínfima, considera-
se a hipótese de o plasmídio pMACIA LH anti-CD3 deve apresentar algum problema, não
detectado pelas análises realizadas, devendo este ser melhor seqüenciado a fim de se verificar
a integridade da região codificadora para a proteína recombinante.
87
(A)
(B)
Figura 26. Comparação da produção do anticorpo anti-CD3 humano no sobrenadante de transfectomas de BHK-21 a partir dos três vetores. Imunodetecção da expressão de anticorpos no sobrenadante de cultura coletado 48h e 72h após a transfecção. Todas as células foram transfectadas utilizando o reagente Lipofectamine LTXTM (Invitrogen). (A) 48h pós-transfecção. (B) 72h pós-transfecção. As siglas HIL, HL e LH referem-se ao: sobrenadante de cultura de células transfectadas com o vetor pMACIA HIL anti-CD3, pMACIA HL anti-CD3 e pMACIA LH anti-CD3, respectivamente; NT: sobrenadante de células não transfectadas; IgG: IgG humana a uma concentração inicial de 160 ng/ml para obtenção de uma curva-padrão para estimativa da concentração dos sobrenadantes; PBS: Controle negativo.
88
A partir dos dados da curva padrão com IgG humana a uma concentração inicial de
160 ng/mL, pode-se inferir que a quantidade de anticorpo recombinante presente no
sobrenadante de cultura era de 12ng/mL em 48h pós-transfecção e 1,2ng/mL em 72h pós
transfecção para a construção bicistrônica HIL, e de 4,7ng/mL em 48h pós-transfecção para a
construção monocistrônica HL (Figura 26).
4.8 Purificação e quantificação do anticorpo anti-CD3 obtido a partir de
células de BHK-21 transfectadas com os vetores pMACIA HIL, pMACIA
HL e pMACIA LH
Os sobrenadantes das três construções obtidos na transfecção transiente em BHK-21
foram submetidos à purificação por cromatografia de afinidade utilizando a coluna Hitrap
protein A HP 1mL (GE Healthcare®
) e as frações coletadas foram analisadas quanto à
presença do anticorpo recombinante por imunoensaios do tipo Dot Blot. Resolvemos também
purificar o sobrenadante da construção LH mesmo com a falta de produção constatada nos
ensaios ELISA. A quantidade produzida por essa construção poderia ser tão pouca que não
fosse detectada pelo ensaio. Novamente foi utilizada a estratégia de pHs distintos durante a
purificação (tópico 3.2.14).
O pico de liberação do anticorpo recombinante da coluna estava presente na quarta
fração da eluição para as construções HIL e HL. Já na construção LH novamente não foi
detectada a presença do anticorpo, mesmo assim continuamos o processo de purificação. As
frações onde se encontravam as proteínas de interesse determinadas, foram passadas para uma
coluna Centricon YM-50 (Amicon®
), com limite de exclusão de 50 kDa, para concentração e
troca do tampão de eluição por PBS que propicia condições melhores de armazenamento para
as proteínas.
Para uma melhor caracterização e avaliação das amostras, elas foram submetidas à
análise por SDS-PAGE, de forma reduzida e não-reduzida, seguida de coloração com prata
(Figura 27), kit PlusOne Silver Staining Protein (GE Lifescience). Na coloração com prata
observou-se claramente as bandas correspondentes às cadeias pesada e leve do anticorpo
recombinante, expressas pelas construções monocistrônica pMACIA HL anti-CD3 e
bicistrônica pMACIA HIL anti-CD3, nas formas reduzida em torno de 55 kDa e 27 kDa, e
não-reduzida em torno de 250 kDa (Figura 27).
89
Figura 27. Análise do anticorpo anti-CD3 purificado a partir de transfectomas de BHK-21. Foi realizada uma eletroforese em gel SDS 10%, de forma reduzida e não-reduzida, para separação dos anticorpos purificados e concentrados. Foi feita coloração com prata utilizando o kit Plus One Silver Staining Protein (GE Lifescience). 1: 400 ng de IgG humana não- reduzida. 2: Construção HIL não-reduzida. 3: Construção HL não-reduzida. 4: Construção LH não-reduzida. 5: 400 ng de IgG humana reduzida. 6: Construção HIL reduzida. 7: Construção HL reduzida. 8: Construção LH reduzida. M: Marcador Page Ruler Unstained Protein Molecular Weight (Fermentas®). Setas vermelhas destacando a forma não-reduzida. Setas pretas destacando as bandas correspondentes às cadeias pesada e leve reduzidas, respectivamente.
A forma dimérica, não reduzida, foi observada em uma banda com tamanho bem
acima de 116 kDa. Isso pode ter acontecido por uma possível agregação dos anticorpos ou
ainda devido a sua estrutura terciária que, sob condições não-redutoras, pode impactar na
migração do gel SDS-PAGE quando comparada com o polipeptídeo desnaturado. Em artigo
recente foi mostrado que IgGs submetidas à migração em SDS-PAGE sob condições não
redutoras apresentaram uma massa molecular aparente de 300 kDa, entretanto, quando
submetidas a uma cromatografia analítica de gel filtração as IgGs se apresentaram em
monômeros, não sendo observado agregados (Li et al., 2007).
90
Já a construção monocistrônica pMACIA LH anti-CD3 realmente não mostrou
nenhuma produção. Portanto, essa construção será melhor analisada, com um seqüenciamento
completo do cassete de expressão, para avaliar se houve alguma mutação durante a
manipulação para a construção deste vetor. Contudo, mesmo sem expressar o anticorpo, ela
serviu como um controle da purificação mostrando que as amostras das construções
monocistrônica HL e bicistrônica HIL não apresentavam contaminação com IgGs bovinas,
presente no meio de cultura onde foram cultivadas as células.
As amostras de anticorpos purificadas e concentradas foram quantificadas por análise
de proteína total pelo kit BCA (Pierce®). As análises geraram uma estimativa em torno de
4,6μg/mL para a construção bicistrônica HIL e 3,7μg/mL para a construção monocistrônica
HL. Como essas concentrações estavam muito abaixo do esperado, partimos para a
construção de vetores para transfecção estável dessas duas construções. Com isso haveria a
possibilidade de se obter transfectomas estáveis, expandir essa população e ter uma expressão
continuada do anticorpo recombinante, possibilitando análises de função efetora deste no
futuro.
4.9 Construção do vetor de expressão tricistrônico pMACIA HIL IRES neo
anti-CD3
Com o intuito de aumentar a produção do anticorpo recombinante pela construção
bicistrônica HIL, resolvemos adicionar a essa construção uma marca de seleção para expansão
de clones estáveis. Assim um novo IRES seria interposto entre o final da região codificadora
do anticorpo recombinante e o início da marca de resistência ao antibiótico G418, seqüências
estas obtidas a partir do vetor comercial pLXIN (Clontech). O interessante dessa construção é
que gera de um transcrito tricistrônico, contendo a marca de resistência a G418 (NEOR),
garantindo que durante o processo de seleção das células transfectadas somente aquelas
produtoras do anticorpo recombinante vão ser selecionadas. Isso se dá porque a célula só
adquire resistência ao antibiótico G418 se estiver produzindo o transcrito que contém tanto a
marca de resistência como o gene da proteína de interesse.
Para a construção do vetor tricistrônico, o vetor pLXIN (Clontech) foi digerido com as
enzimas de restrição Xba I e BamH I, liberando a porção IRES NEOR. Já o vetor pMACIA
HIL anti-CD3 foi digerido apenas com a enzima de restrição Bam HI, promovendo a
linearização do vetor. As digestões dos dois vetores foram seguidas de tratamento com o
91
fragmento Klenow da DNA polimerase I, e estes foram ligados com T4 DNA ligase. Após a
clonagem, os clones obtidos foram analisados utilizando as enzimas de restrição Kpn I, Nhe I
e EcoR I. Essa clonagem pode gera dois perfis, pois o fragmento pode entrar na orientação
correta IRES – neo, ou na forma incorreta neo – IRES. Foram analisados 15 clones, sendo 1
positivo e o perfil originado estava de acordo com o esperado na orientação IRES - neo,
dando origem a construção tricistrônica pMACIA HIL IRES neo (Figura 28).
Figura 28. Estratégia para construção do vetor tricistrônico pMACIA HIL IRES neo anti-CD3. Para clonagem da porção IRES NEOR no vetor bicistrônico pMACIA HIL anti-CD3, o vetor pLXIN (Clontech) foi digerido com as enzimas Xba I e BamH I para liberação do do fragmento gênico IRES NEOR. Já o vetor pMACIA HIL anti-CD3 foi digerido apenas com a enzima BamH I. Após as digestões, ambos foram tratados com o fragmento Klenow da DNA polimerase I e ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase, dando origem a construção tricistrônica pMACIA HIL IRES neo anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada; PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve; 5’ LTR: porção 5’ UTR do fragmento gênico IRES NEOR e 3’ LTR: porção 5’ UTR do fragmento gênico IRES NEOR.
92
4.10 Transfecção estável da linhagem celular BHK-21 utilizando o vetor
tricistrônico pMACIA HIL IRES neo anti-CD3
Seguimos então para a produção do anticorpo anti-CD3 humanizado a partir do vetor
tricistrônico pMACIA HIL IRES neo anti-CD3 na linhagem celular BHK-21. Para tal foi
realizada primeiramente uma transfecção transiente (tópico 3.2.12.7) e esta foi realizada em
duplicata. Além desse vetor, também foi transfectado separadamente o vetor pGFP/NEO para
controle da eficiência de transfecção.
Após 48h e 72h da transfecção os sobrenadantes de cultura foram coletados para
ensaios imunoenzimáticos (ELISA) com o intuito de verificar a expressão do anticorpo
recombinante. Esse experimento de ELISA também foi desenvolvido de forma a quantificar a
presença da porção Fc. Os anticorpos eram quantificados a partir de comparações com uma
curva padrão realizada com IgG humana em concentrações conhecidas obtidas por meio de
diluições seriadas. O ensaio era realizado duplicata para cada poço transfectado e os
resultados referentes ao anticorpo recombinante agrupados, assim foram agrupadas quatro
medidas.
Os resultados revelaram que o vetor contendo a construção tricistrônica conseguiu
promover a expressão do anticorpo recombinante. A partir dos dados da curva padrão com
IgG humana a uma concentração inicial de 160 ng/mL, pode-se inferir que a quantidade de
anticorpo recombinante presente no sobrenadante de cultura era de 14,3 ng/mL em 48h pós-
transfecção e 1,75 ng/mL em 72h pós-transfecção (Figura 29). É interessante ressaltar que
essa construção produziu uma maior quantidade de anticorpo do que a construção bicistrônica
pMACIA HIL, mesmo com mesma eficiência de transfecção, revelada por análise em
microscópio de fluorescência das células transfectadas com o vetor pGFP/NEO, sendo de
aproximadamente 50%. Visto isso, partimos para a seleção de clones estáveis a partir dessa
construção.
4.10.1 Seleção das células transfectadas utilizando Geneticina® (G418)
Com intuito de obtermos quantidades de proteínas suficientes para a realização dos
ensaios biológicos, partiu-se para seleção das células transfectadas utilizando o antibiótico
Geneticina® (G418) (tópico 3.2.12.8). A adição de agente seletivo promove a morte celular
das células não transfectadas e permite a sobrevivência das células produtoras de proteína
93
recombinante, visto que, os plasmídios utilizados possuíam a marca de resistência ao agente
seletivo citado. Além disso, após a morte celular das células não transfectadas, as células
resistentes passam a ter a capacidade de se proliferar até atingir a confluência máxima do
poço. Assim, após a seleção somente células expressando a proteína recombinante estariam
presentes nos poços transfectados.
Após a coleta do sobrenadante de 72h depois da transfecção, o meio de cultura foi
reposto por meio adicionado do antibiótico Geneticina a uma concentração de 600 µg/mL.
Além disso, o meio com o antibiótico foi adicionado aos poços controles contendo as células
não-transfectadas. Essas por sua vez seriam utilizadas como controle da morte celular. A
partir da adição do meio com o agente seletivo, o sobrenadante de cultura foi coletado a cada
48h e trocado por meio novo acrescido de Geneticina. As células foram sempre
acompanhadas pela visualização no microscópio óptico onde era observada a sua morfologia
e a aderência à placa.
As células da linhagem BHK-21 possuem como característica o crescimento em meio
de cultura contendo soro fetal bovino de forma aderida e apresentando uma morfologia
elíptica. Quando essas células entram no processo de morte celular elas começam a perder a
aderência pela placa e mudam sua morfologia para a forma esférica.
Dessa forma as células foram acompanhadas da maneira citada e quando foi
constatado que aquelas presentes nos poços não-transfectados tinham morrido, era assumido
que a partir daquele ponto as células estavam selecionadas.
Durante a seleção das células transfectadas, os sobrenadantes das culturas foram
coletados para acompanhamento por ELISA dos níveis de proteínas recombinantes expressos.
Os resultados mostraram entre os tempos de 240h a 408h houve uma total perda da produção
do anticorpo (Figura 29). Após 480h o anticorpo volta a ser produzido, mas sua produção fica
oscilante além de ser muito baixa. Esse mesmo processo de queda de expressão foi observado
por Silva, em 2008, no entanto com a expansão da cultura mista de clones estáveis para
garrafas de cultura de 75 e 150 cm2, houve um aumento considerável na produção do
anticorpo recombinante.
Essa etapa é um momento crucial para o estabelecimento das células resistentes ao
antibiótico. Provavelmente, além de provocar a morte celular daquelas não-transfectadas, as
células que integraram no seu genoma poucas cópias do vetor tricistrônico durante a
transfecção podem ter sido eliminadas. A quantidade do gene resistência expressa
provavelmente era consideravelmente inferior àquelas células que internalizaram e integraram
diversas cópias dos vetores contendo a marca de resistência.
94
Nesse sentido, essa queda de expressão provavelmente se deve a morte dessas células
transfectadas com poucas cópias dos vetores que de certa forma estavam contribuindo para as
quantidades de proteínas expressas. Outra hipótese é que essa pequena variação seja um
artefato intrínseco do experimento visto que a composição inconsistente do meio, devido à
presença de soro fetal bovino, pode gerar variações dos níveis de produção das proteínas
recombinantes. Esse experimento está em continuidade e os dados aqui contidos são até a
presente data.
Figura 28. Níveis de produção do anticorpo anti-CD3 em transfectomas estáveis de BHK-21. O sobrenadante de cultura foi coletado após 72h da transfecção e o meio reposto adicionado do referido antibiótico a cada 48h ou 72h. As células foram observadas quanto a sua morfologia para determinação da morte das células não transfectadas e o sobrenadante de cultura coletado para acompanhamento dos níveis de anticorpos produzidos. Os níveis de produção do anticorpo anti-CD3 foram determinados por ELISA, a partir da comparação com uma curva-padrão de IgG humana.
95
4.11 Construção do vetor de expressão bicistrônico pMACIA HL IRES neo
anti-CD3
Para o aumento a produção do anticorpo recombinante pela construção monocistrônica
HL, resolvemos também adicionar a essa construção uma marca de seleção para expansão de
clones estáveis. Assim um elemento IRES seria interposto entre o final da região codificadora
do anticorpo recombinante e o início da marca de resistência ao antibiótico G418, seqüências
também obtidas a partir do vetor comercial pLXIN (Clontech).
Para essa construção, o vetor monocistrônico pMACIA HL anti-CD3 e o vetor
tricistrônico pMACIA HIL IRES neo foram digeridos com as enzimas de restrição Xma I e
Xho I, liberando as porções cadeia pesada inteira – Fur – VL e e a geração dos sítios para
clonagem, respectivamente. Após a clonagem, os clones obtidos foram analisados utilizando
as enzimas de restrição Kpn I, Nhe I e EcoR I, e o perfil originado estava de acordo com o
esperado, dando origem a nova construção bicistrônica, pMACIA HL IRES neo (Figura 30).
96
Figura 30. Estratégia para construção do vetor tricistrônico pMACIA HL IRES neo anti-CD3. Para clonagem das porções cadeia pesada inteira – Fur – VL no vetor tricistrônico pMACIA HIL IRES neo anti-CD3, o vetor monocistrônico pMACIA HL anti-CD3 foi digerido com as enzimas Xma I e Xho I para liberação das porções cadeia pesada inteira – Fur – VL e liberação do vetor pMACIA HIL anti-CD3 IRES neo. Esses por sua vez foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase dando origem a construção bicistrônica pMACIA HL IRES neo anti-CD3. Siglas – bla: gene da enzima β-lactamase; pCMV/IA: promotor de citomegalovírus contendo o íntron A; SV40 polyA: sinal de poliadenilação; PS I: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia pesada e PS II: seqüência líder codificadora do peptídeo sinal da cadeia leve.
97
4.12 Transfecção estável da linhagem celular BHK-21 utilizando o vetor
bicistrônico pMACIA HL IRES neo anti-CD3
Partimos para a produção do anticorpo anti-CD3 humanizado a partir do vetor
bicistrônico pMACIA HL IRES neo anti-CD3 na linhagem celular BHK-21. Para tal foi
realizada primeiramente uma transfecção transiente (tópico 3.2.12.7) e esta foi realizada em
duplicata. Além desse vetor, também foi transfectado separadamente o vetor pGFP/NEO para
controle da eficiência de transfecção.
Após 48h e 72h da transfecção os sobrenadantes de cultura foram coletados para
ensaios imunoenzimáticos (ELISA) com o intuito de verificar a expressão do anticorpo
recombinante. Esse experimento de ELISA também foi desenvolvido de forma a quantificar a
presença da porção Fc. Os anticorpos eram quantificados a partir de comparações com uma
curva padrão realizada com IgG humana em concentrações conhecidas obtidas por meio de
diluições seriadas. O ensaio era realizado para cada poço transfectado e os resultados
referentes ao anticorpo recombinante agrupados, assim foram agrupadas duas medidas.
Não foi detectada nenhuma produção de anticorpo a partir dessa construção. No
entanto, resolvemos partir para a seleção dessa construção com Geneticina, pois poderia haver
produção do anticorpo por poucas células, não sendo detectada pelo ensaio de ELISA. Com a
seleção essas células produtoras seriam expandidas, podendo assim detectarmos a presença do
anticorpo. Contudo, com a seleção houve morte celular tanto das células não-transfectadas,
utilizadas como controle como no tópico 4.2.9, como nas células transfectadas com a
construção bicistrônica pMACIA HL IRE neo.
A concentração de Geneticina utilizada, 600 µg/mL, foi obtida a partir de uma curva
de sobrevivência feita previamente na linhagem celular CHO-K1 (Silva, 2008). Isso pode ter
interferido na produção dos anticorpos recombinantes, produzidos na linhagem BHK-21,
tanto na construção tricistrônica quanto na bicistrônica. Essa linhagem celular pode ser mais
sensível a esse agente seletivo, eliminando conseqüentemente os clones produtores. Uma
curva de sobrevivência para a linhagem BHK-21 será feita e serão repetidas as transfeções
estáveis a partir das construções tricistrônica pMACIA HIL IRES neo anti-CD3 e bicistrônica
pMACIA HL IRES neo anti-CD3.
Com essas barreiras ultrapassadas será possível chegar a uma produção do anticorpo
anti-CD3 humanizado suficiente para análises de sua função efetora e futuro uso clínico.
98
Conclusões e
Perspectivas
99
No presente trabalho foram traçadas estratégias inovadoras para a expressão de um
anticorpo anti-CD3 humanizado em células de mamíferos. Para isso foram construídas
versões monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônicas desse anticorpo no sentido de otimizar
sua produção.
Os resultados aqui apresentados mostram que a expressão de anticorpos recombinantes
em células de mamíferos utilizando o vetor de expressão bicistrônico pMACIA HIL, com o
elemento IRES entre as duas cadeias do anticorpo, é bastante promissora, se mostrando a
construção mais satisfatória em termos de produção em transfecções transiente e estável até o
momento. A adição de uma marca seletiva a essa construção, gerando o vetor de expressão
tricistrônico pMACIA HIL IRES neo, apresentou um certo nível de estabilidade de produção
ao longo do tempo, sendo que a este experimento está sendo dada continuidade.
O vetor de expressão monocistrônico pMACIA HL, com uma seqüência codificadora
de um sítio clivável por furina entre as duas cadeias do anticorpo, se mostrou factível,
produzindo o anticorpo recombinante de forma efetiva. Esse resultado é interessante, pois
essa construção gera um polipeptídeo bastante grande que somente é hipoteticamente clivado
no Complexo de Golgi, liberando as duas cadeias do anticorpo para montagem. Contudo, a
adição da marca seletiva a essa construção, gerando o vetor de expressão bicistrônico
pMACIA HL IRES neo, teve um efeito negativo nessa construção, ocasionando nenhuma
produção por parte desta.
Já o vetor de expressão monocistrônico pMACIA LH não conseguiu produzir o
anticorpo recombinante. Este vetor foi bastante manipulado durante a sua construção, pelo
fato de que além da inserção uma seqüência codificadora de um sítio clivável por furina entre
as duas cadeias do anticorpo, houve a inversão da posição das cadeias em relação as outras
construções. Essa manipulação pode ter gerado algum problema nessa seqüência,
impossibilitando a produção do anticorpo.
Como perspectivas para este trabalho temos em primeiro lugar a análise massiva da
seqüência da construção monocistrônica pMACIA LH, para tentar entender o porque da não
produção do anticorpo recombinante. Com a resolução do problema, será feita a repetição da
transfecção transiente das três construções, monocistrônicas e bicistrônicas em BHK-21, para
uma melhor comparação da produção do anticorpo recombinante entre elas. Será feita,
paralelamente, uma curva de sobrevivência de BHK-21 com o Geneticina, estabelecendo-se
uma concentração ideal desse antibótico para ser utilizada na seleção de clones estáveis a
partir das construções tricistrônica pMACIA HIL IRES neo e bicistrônica pMACIA HL IRES
100
neo. Com essa concentração estabelecida, a transfecção dessas construções será refeita e suas
produções serão comparadas para o estabelecimento da melhor construção.
Será feita também transfecção estável da construção tricistrônica pMACIA HIL IRES
neo na linhagem celular CHO-K1, pela sua estabilidade de produção do anticorpo mostrada
por Silva, em 2008. Outra perspectiva é suprir linhagens celulares que não possuem
quantidades suficientes da enzima furina, como HEK293 e CHO-K1 (Shapiro et al.,1997),
através de co-transfecção de um vetor contendo uma seqüência codificadora da enzima furina,
possibilitando a expressão das construções monocistrônicas nessas linhagens. Com essas
questões solucionadas, em conjunto com os dados experimentais, será possível avaliar o
potencial dessas moléculas recombinantes como futuros imunoterápicos.
Ao estabelecer-se a melhor construção, esta e as versões do mesmo anticorpo na forma
de FvFc, , FvFc T e FvFc R (Silva, 2008), serão utilizadas durante meu projeto de Doutorado.
Este tem como objetivos analisar o efeito dos anticorpos anti-CD3 humanizados, versões
FvFcs e anticorpo inteiro, na indução de proliferação, produção de citocinas e expressão de
fatores de transcrição imunorreguladores, bem como analisar o efeito desses anticorpos na
geração de células T com atividade supressora, in vitro.
101
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