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Danielle Lima Corrêa de Carvalho, Flávia Cristina Prado Rosin, Mariana Henriques Ferreira, Fernanda de Paula Eduardo, Letícia Mello Bezinelli, Nelson Hamerschlak, Luciana Corrêa
Estresse oxidativo e dano ao DNA em queratinócitos tratados com bussulfano
veiculado em saliva artificial
INTRODUÇÃO
QUIMIOTERÁPICOS:
• Agentes terapêuticos contra neoplasias malignas;
• Atingir doses plasmáticas destruição das células neoplásicas;
• Podem estar presentes na saliva, com doses iguais ou abaixo da terapêutica plasmática;
• 5-FU, MTX, ciclofosfamida e bussulfano.
Jansman et al. 2002, Rodin et al. 2013, Ritschel et al. 1981, Bezinelli et al. 2017
INTRODUÇÃO
BUSSULFANO
• Agente alquilante doenças hematológicas/TCTH;
• Gera toxicidade intensa mucosite, danos hepáticos e renais e distúrbios no SNC;
• Induz estresse oxidativo, levando a danos do DNA e produção de EROs;
• Níveis salivares próximos aos séricos.
Palmer et al. 2016, McCune & Holmberg, 2009, Mangerich et al. 2016, Rauh et al. 2016; Bezinelli et al., 2017
OBJETIVO
Analisar o estresse oxidativo e o possível dano ao DNA em queratinócitos expostos ao bussulfano encontrado em doses
salivares.
MATERIAIS E MÉTODOS
• Cultura celular HaCat (comercial);
• Saliva Aritficial (Malpass et al., 2013);
• Bussulfano: 4.0, 4.5, 5.0 e 5.5µg/mL (Bezinelli et al, 2017);
• Grupos: Viabilidade celular; TUNEL; DPPH; SOD; CAT; Peroxidação Lipídica/TBARS; Ensaio Cometa.
• ControleC
• Controle Saliva
CS
• BussulfanoBU
RESULTADOS – Viabilidade Celular
Figura 1 – Média (±desvio-padrão) da viabilidade celular (normalizada pela da do controle (A) e controle saliva(B)) após tratamento com bussulfano em diferentes concentrações, inserido no meio sem saliva (A) e com saliva (B). Teste de Tukey, *p<0.05; **p<0.01
Efeito dose-dependente; 5.5µg/ml sem saliva 76%
viabilidade celular; Todas as doses de BU com saliva menor viabilidade;
Optamos por utilizar BU 5.5µg/ml;
RESULTADOS - TUNEL
Figura 2 - Box-plot para a porcentagem de células positivas para TUNEL em cada grupo. Traço horizontal espesso - mediana; Altura do box -intervalo interquartis; whiskers - valores mínimo e máximo; - outliers. * p<0.05 (Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn)
Maior fragmentação de DNA no grupo BU, quando comparado com os grupos controles (p<0.05).
Figura 3 – Exemplos de padrões de marcação no ensaio TUNEL, dos grupos Controle Saliva (CS) e Bussulfano (BU). Aumento de 400X
RESULTADOS - TUNEL
Figura 4 - Box-plot para a porcentagem de sequestro do radical livre DPPH em cada grupo. Traço horizontal espesso - mediana; Altura do box -intervalo interquartis; whiskers - valores mínimo e máximo. (Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn)
RESULTADOS - DPPH
Grupo BU apresentou menor potencial de sequestro do radical DPPH.
Figura 5 - Média (±desvio-padrão) da atividade da catalase, normalizada pela quantidade de proteínas em cada grupo e expressa em U/mg proteína. **p<0.01 (análise de variância Anova seguida do teste de Tukey)
RESULTADOS - CAT
**
**
Atividade da CAT foi maior no grupo BU.
Figura 6 - Média (±desvio-padrão) da quantidade de malondialdeído (MDA) em cada grupo. **p<0.01 (análise de variância Anova seguida do teste de Tukey)
RESULTADOS – TBARS**
**
Quantificação de malondialdeído (MDA);
Grupo BU maior quantidade de MDA.
RESULTADOS – SOD
Figura 7 – Média (± desvio-padrão) da densidade de banda obtida na técnica de Western-blotting para análise da superóxido dismutase. Foi realizada normalização com a densidade de banda da actina em todos os grupos. Sem diferenças significativas (teste de variância Anova)
Western Blot;Densidade do BU ligeiramente
maior;Manutenção nos níveis da SOD
(Gonçalves et al., 2009).
Figura 8 - Imagens representativas do espalhamento de fragmentos de DNA no ensaio cometa (DAPI, aumento original 400X). C: Ausência de cometas no grupo Controle. CS: Presença de cometas no grupo Controle Saliva, porém com caudas discretas. BU: Grande quantidade de cometas, com caudas nítidas
RESULTADOS – Ensaio Cometa
Figura 9 - Box-plot para a porcentagem de DNA na cauda do cometa. Traço horizontal espesso - mediana; Altura do box - intervalo interquartis; whiskers - valores mínimo e máximo; - outliers. * p<0.05 (Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn)
RESULTADOS – Ensaio Cometa
*
Grupo BU maior % de fragmentação de DNA.
A concentração salivar de bussulfano é tóxica para queratinócitos, induzindo estresse oxidativo e maior dano no
DNA.
CONCLUSÃO