ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO- HISTOQUÍMICA DAS … · disponibilidade e em especial pela simplicidade em compartilhar o seu saber. Aos meus colegas da turma de Doutorado com quem sempre

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VALÉRIA SOUZA FREITAS

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-

HISTOQUÍMICA DAS MMPs -2, -7, -9

E -26 E DOS TIMPs -1 E -2 EM

ADENOMAS PLEOMÓRFICOS E

CARCINOMAS ADENÓIDES

CÍSTICOS DE GLÂNDULAS

SALIVARES MENORES

Natal - RN2011

VALÉRIA SOUZA FREITAS

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-

HISTOQUÍMICA DAS MMPs -2, -7, -9 E -26

E DOS TIMPs -1 E -2 EM ADENOMAS

PLEOMÓRFICOS E CARCINOMAS

ADENÓIDES CÍSTICOS DE GLÂNDULAS

SALIVARES MENORES

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Patologia Oral.

Orientadora: Profª Drª Lélia Batista de Souza

NATAL - RN

2011

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “ProfºăAlbertoăMoreiraăCampos”.

Freitas, Valéria Souza. Estudo da expressão imuno-histoquímica das MMPs -2, -7, -9 e -26 e TIMPs -1 e -2 em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores / Valéria Souza Freitas. – Natal, RN, 2011.

156 f. : il.

Orientador: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza. Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.

1. Adenoma pleomórfico – Tese. 2. Carcinoma adenóide cístico – Tese. 3.

Metaloproteinases da matriz – Tese. 4. Inibidores teciduais de metaloproteinases –Tese. 5. Imuno-histoquímica – Tese. I. Souza, Lélia Batista de. II. Título.

RN/UF/BSO Black D65

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Reginaldo (in memoriam) e Lila, pelo exemplo de amor e dedicação a família,

e com quem aprendi os principais valores da vida: o amor, o desprendimento, a generosidade

e a simplicidade.

Ao meu querido amor Roberto e a Deus que com a sua imensa bondade permitiu este

encontro que transformou a minha vida. Obrigada pelo seu amor, apoio incondicional,

sabedoria, simplicidade e especialmente pelas incontáveis vezes que entendeu as minhas

ausências, compartilhou as minhas angústias e celebrou as minhas conquistas.

Aos meus irmãos, César, Bel e Eliene, pelo amor, carinho e pela alegria de viver juntos esta

experiência terrena, em especial por cuidar da nossa mãe durante a minha ausência.

A minha sobrinha Larissa e as minhas afilhadas Érica e Geane pela oportunidade de aprender,

mesmo sem a maternidade, sobre a pureza e os doces sentimentos da infância e adolescência.

As minhas mães de coração Tide e Zelita, pelo imenso carinho, generosidade e cuidado que

sempre demonstraram, tornando a minha vida mais leve e alegre.

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, pelo exemplo de dedicação a vida

acadêmica e ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (UFRN). O meu agradecimento especial pelos ensinamentos, atenção e

orientação dedicada durante todo o Curso de Doutorado.

Ao professor Dr. Leão Pereira Pinto pela dedicação ao Programa de Pós-Graduação em

Patologia Oral. O meu agradecimento pelos ensinamentos, gentileza e

palavras de incentivo.

A Coordenação do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, em especial a professora

Dra. Roseana de Almeida Freitas, o meu agradecimento pelo carinho, sensatez,

disponibilidade e ensinamentos.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, em especial a Dra. Lélia

Maria Guedes Queiroz, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão,

Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira e Dra. Ana

Myrian Costa de Medeiros pela amizade e importante contribuição para a minha formação

acadêmica e profissional.

Aos professores Dr. Angelo Giuseppe Roncalli e Dr. Kenio Costa Lima pelos ensinamentos,

colaboração na análise estatística durante os trabalhos das disciplinas e em especial por tornar

mais interessante a estatística.

Ao professor Dr. Jean Nunes dos Santos, pelo tão presente apoio e em especial pela amizade

sincera, incentivo e pelos ensinamentos. O meu agradecimento por contar sempre com a sua

colaboração, especialmente na criação do nosso desejado Laboratório de Patologia Oral da

Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).

A minha orientadora do Mestrado, professora Dra. Eneida de Moraes Marcílio Cerqueira.

O meu muito obrigado pela sua contribuição na minha formação acadêmica e por

proporcionar-me um encantamento especial pela Genética, na sempre gentil e agradável

convivência.

Ao professor Dr. Benedicto Alves de Castro Silva pela gentileza, sabedoria e ensinamentos

proporcionados durante todos estes anos de tão agradável convívio. Em especial, por ser o

mentor e colaborar no nosso sonho em fundar o Núcleo de Câncer Oral (NUCAO) da UEFS.

Em todos estes anos de voluntariado no Hospital Aristides Maltez, o senhor sempre foi um

exemplo de dedicação a profissão e amor ao próximo. Ao senhor a nossa eterna gratidão.

As minhas amigas irmãs Cristina Ruan e Betânia Fachetti pela amizade, cuidado zeloso,

carinho, disponibilidade e incentivo de todas as horas.

Ao meu irmão de orientação Pedro, pela amizade, ajuda despretenciosa durante todo o Curso,

disponibilidade e em especial pela simplicidade em compartilhar o seu saber.

Aos meus colegas da turma de Doutorado com quem sempre pude contar em todos os

momentos do Curso. Ao carinho e delicadeza de Bruna Amaral. A Bruna Rafaela com quem

compartilhei muitos dos seminários das disciplinas, pelas doces palavras de incentivo que

sempre acalmaram o meu coração. A Alexandre pelos agradáveis momentos de convivência e

alegria. A Cassiano pelo aprendizado com a troca de experiências.

Aos meus colegas das turmas de Mestrado e Doutorado, Felipe, Thais, Maiara, Emeline,

Joabe, Cyntia, Dimitri, Domingos, Marta, Marcelo, Adriana, Deborah, Ruth, Alessandra, Ana

Rafaela, Pollianna, Karuza, George e Janaína, pelo acolhimento, carinho, disponibilidade e

amizade. Um agradecimento carinhoso e saudoso a Marianne pelos inesquecíveis momentos

de amizade e alegria compartilhados durante parte do Curso. A Águida pela amizade, atenção

e delicada companhia. A Keila pela atenção, carinho e agradável convivência.

Ao colega professor Dr. Manoel Antonio Gordón Núñez pela tão presente gentileza, atenção e

carinho de todos os momentos.

Aos funcionários do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Gracinha, Idelzuíte,

Sandrinha, Lourdinha, Hévio e Canindé pela dedicação ao trabalho, colaboração constante e

carinho.

As bibliotecárias da Biblioteca Setorial de Odontologia da UFRN, Cecília Isabel dos Santos e

Mônica Karina Santos Reis pela elaboração da ficha catalográfica e revisão das referências.

As bolsistas de Iniciação Científica da Base de Pesquisa em Patologia Oral da UFRN,

Andrea Barros, Carla Samily, Mila Fontes, Marcel Costa e Marília Queiroga pela colaboração

nos trabalhos científicos durante o Curso.

Aos meus colegas professores da UEFS e colaboradores do NUCAO, Márcio Campos, Nilton

César Nogueira, Maria Emília Ramos, Fernando Bastos, Arlei Cerqueira, Michelle Miranda,

Maria do Carmo Nagahama, Tarsila Ramos, Bruno Cantharino e Gabriela Botelho pela

substituição nas atividades de ensino, pesquisa e extensão que permitiram a conclusão deste

Curso.

A todos os meus colegas da Área de Odontologia Preventiva e Social e em especial a Joildo

Guimarães e Técia Daltro pela amizade e carinho de todos os momentos.

As funcionárias da clínica da UEFS Rita Jeane e Zoraide pelo cuidado e carinho dispensado

aos nossos pacientes. As funcionárias do Departamento de Saúde e do Colegiado do Curso de

Odontologia, Jailda Barreto, Jocely Almeida, Daniela Porto e Viviane Simas pela gentileza,

disponibilidade e atenção dispensada durante o período de afastamento para o Doutorado.

Aos meus pacientes do NUCAO, pela oportunidade de aprender sobre a trasitoriedade de

todas as coisas e a singeleza da vida. Neste convívio singular foi possível refletir sobre o

mais básico dos ensinamentos do Mestre Jesus, que não estamos aqui para sermos servidos,

mas apenas para servir. Espero sempre ser digna da confiança e puder serví-los com

simplicidade e amor. Para vocês um agradecimento muito especial.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

financiamento desta pesquisa.

SUMÁRIO

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

RESUMO

SUMMARY

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 24

2 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................. 27

2.1 Adenoma pleomórfico............................................................................................ 27

2.2 Carcinoma adenóide cístico.................................................................................... 31

2.3 Invasão, metástase tumoral e matriz extracelular .................................................. 36

2.4 Metaloproteinases da matriz................................................................................... 38

2.4.1 MMPs -2 e -9 (gelatinases A e B) ......................................................................... 40

2.4.2 MMPs -7 e -26 (matrilisinas 1 e 2) ....................................................................... 45

2.4.3 Regulação das metaloproteinases da matriz e seus inibidores teciduais................ 50

2.4.4 Metaloproteinases da matriz e inibidores teciduais de metaloproteinases em

tumores de glândulas salivares............................................................................... 53

3 PROPOSIÇÃO....................................................................................................... 61

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 63

4.1 Implicações éticas.................................................................................................. 63

4.2 Caracterização do estudo........................................................................................ 63

4.3 População................................................................................................................ 63

4.4 Amostra.................................................................................................................. 63

4.5 Estudo morfológico................................................................................................ 63

4.6 Estudo imuno-histoquímico.................................................................................... 64

4.7 Análise do perfil imuno-histoquímico.................................................................... 67

4.8 Análise estatística................................................................................................... 68

5 RESULTADOS...................................................................................................... 70

5.1 Caracterização da amostra...................................................................................... 70

5.2 Análise morfológica............................................................................................... 73

5.2.1 Adenomas pleomórficos......................................................................................... 73

5.2.2 Carcinomas adenóides císticos............................................................................... 80

5.3 Análise imuno-histoquímica................................................................................... 84

5.3.1 Análise da imunoexpressão das gelatinases........................................................... 84

5.3.2 Análise da imunoexpressão das matrilisinas.......................................................... 95

5.3.3 Análise da imunoexpressão dos inibidores teciduais das

metaloproteinases............................................................................................... 101

6 DISCUSSÃO......................................................................................................... 109

7 CONCLUSÕES..................................................................................................... 125

REFERÊNCIAS.................................................................................................... 127

ANEXO................................................................................................................. 155



QUADROS

Quadro 1. Clone, especificidade, diluição, fonte, recuperação antigênica e

tempo de incubação dos anticorpos utilizados....................................................... 66

Quadro 2. Análise da imunoexpressão nos espécimes de adenoma pleomórfico

e carcinoma adenóide cístico, baseado no percentual de células

imunopositivas....................................................................................................... 67

Quadro 3. Análise da imunoexpressão nos espécimes de adenoma pleomórfico e

carcinoma adenóide cístico, baseado na intensidade de

coloração................................................................................................................. 68

TABELAS

Tabela 1. Dados clínicos referentes a sexo, idade e localização anatômica dos

casos de adenoma pleomórfico de glândulas salivares menores, Natal, RN.

2011....................................................................................................................... 71

Tabela 2. Dados clínicos referentes a sexo, idade e localização anatômica dos

casos de carcinoma adenóide cístico de glândulas salivares menores, Natal,

RN. 2011................................................................................................................ 72

Tabela 3. Número e percentual de características histopatológicas evidenciadas

nos adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores, Natal,

RN.2011................................................................................................................ 78

Tabela 4. Número e percentual de características histopatológicas encontradas

nos carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores, Natal,

RN.2011.................................................................................................................. 82

Tabela 5. Imunoescores de intensidade de marcação obtidos para as gelatinases

(MMPs -2 e -9) de acordo com o tipo de tumor, Natal, RN.

2011........................................................................................................................ 86

Tabela 6. Teste de Mann-Whitney para a diferença entre os imunoescores de

intensidade de marcação para as metaloproteinases da matriz (MMPs -2, -7, -9

e -26) e os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs -1 e -2) por tipo de

tumor, Natal, RN. 2011.......................................................................................... 90

Tabela 7. Teste de Kruskal-Wallis para a diferença entre os imunoescores de

intensidade de marcação para as metaloproteinases da matriz (MMPs -2, -7, -9 e

-26) por subtipo e padrão histológico do tumor, Natal, RN.

2011....................................................................................................................... 92

Tabela 8. Coeficiente de Correlação de Spearman para a análise de correlação

entre a intensidade de expressão das gelatinases (MMPs-2 e -9) e variáveis

clínicopatológicas em adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores,

Natal, RN. 2011..................................................................................................... 93


entre a intensidade de expressão das gelatinases (MMPs-2 e -9) e variáveis

clínicopatológicas em carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares

menores, Natal, RN. 2011...................................................................................... 94

Tabela 10. Imunoescores de intensidade de marcação obtidos para as

matrilisinas (MMPs -7 e -26) de acordo com o tipo de tumor, Natal, RN.

2011....................................................................................................................... 96


entre a intensidade de expressão das matrilisinas (MMPs-7 e -26) e variáveis

clínicopatológicas em adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores,

Natal, RN. 2011..................................................................................................... 99


entre a intensidade de expressão das matrilisinas (MMPs-7 e -26) e variáveis

clínicopatológicas em carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares

menores, Natal, RN. 2011..................................................................................... 100

Tabela 13. Imunoescores de intensidade de marcação obtidos para os inibidores

teciduais das metaloproteinases (TIMPs -1 e -2) de acordo com o tipo de tumor,

Natal, RN. 2011...................................................................................... 102

Tabela 14. Teste de Kruskal-Wallis para a diferença entre os imunoescores de

intensidade de marcação para os inibidores teciduais das metaloproteinases

(TIMPs -1 e -2) por subtipo e padrão histológico do tumor, Natal, RN.

2011........................................................................................................................ 105


entre a intensidade de expressão dos inibidores teciduais das metaloproteinases

(TIMPs-1 e -2) e variáveis clínicopatológicas em adenomas pleomórficos de

glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011...................................................... 106


entre a intensidade de expressão dos inibidores teciduais das metaloproteinases

(TIMPs-1 e -2) e características clínicopatológicas em carcinomas adenóides

císticos de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011..................................... 107

FIGURAS

Figura 1. Aspectos microscópicos dos adenomas pleómórficos de glândulas

salivares menores. (a) Células epiteliais neoplásicas benignas, dispostas em

ninhos, cordões e estruturas ductiformes em meio a um estroma hialinofibroso,

(b) cápsula fibrosa delimitando o tumor (H/E, 200X)....................................... 75

Figura 2. Estroma hialino em adenoma pleómórfico de glândulas salivares

menores (H/E, 200X).................................................................................... 76

Figura 3. Estroma predominantemente fibroso em adenoma pleómórfico de

glândulas salivares menores (H/E, 200X)........................................................... 76

Figura 4. Estroma mixóide em adenoma pleómórfico de glândulas salivares

menores (H/E, 200X)................................................................................... 77

Figura 5. Estroma mixocondróide em adenoma pleómórfico de glândulas

salivares menores, entremeado por cordões epiteliais (H/E, 200X)....................... 77

Figura 6. Subtipos histológicos apresentados pelos adenomas pleomórficos de

glândulas salivares menores. (a) clássico, (b) mixóide e (c) celular. (H/E,

200X)........................................................................................................... 79

Figura 7. Padrões histológicos apresentados pelos carcinomas adenóides

císticos de glândulas salivares menores. (a) tubular, (b) cribriforme e (c) sólido

(H/E, 200X)................................................................................................. 81

Figura 8. Aspectos microscópicos dos tipos de invasão apresentados pelos

carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores. (a) acinar, (b)

muscular, (c) perineural e (d) intravascular (H/E, 400X)..................................... 83

Figura 9. Forte expressão citoplasmática da MMP-2 em células tumorais e estromais

de adenoma pleomórfico de glândulas salivares menores

(ENVISION,400X)......................................................................................................... 87

Figura 10. Forte expressão citoplasmática da MMP-9 em células tumorais e

estromais de adenoma pleomórfico de glândulas salivares menores

(ENVISION,400X)......................................................................................................... 87

Figura 11. Expressão imuno-histoquímica das gelatinases (MMPs -2 e -9) em áreas

de diferenciação e fragmentos de tecido glandular presentes em adenomas

pleomórficos de glândulas salivares menores. (a) Forte expressão da MMP-2 em

áreas de diferenciação escamosa (b) Forte expressão da MMP-9 em células presentes

no interior das lacunas das áreas condróides. (c) Ausência de expressão da MMP-9

em células acinares (ENVISION,400X)................................................................... 88


estromais de carcinoma adenóide cístico de glândulas salivares menores

(ENVISION,400X)......................................................................................................... 89



(ENVISION,400X)......................................................................................................... 89

Figura 14. Box-Plot de intensidade de marcação para a MMP-9 de acordo com o tipo

de tumor, Natal, RN. 2011.................................................................................... 91



(ENVISION,400X)......................................................................................................... 97



(ENVISION,400X)......................................................................................................... 97



(ENVISION,400X)......................................................................................................... 98

Figura 18. Moderada expressão citoplasmática da MMP-26 em células tumorais e


(ENVISION,400X)......................................................................................................... 98

Figura 19. Forte expressão citoplasmática do TIMP-1 em células tumorais e


(ENVISION,400X)......................................................................................................... 103



(ENVISION,400X)......................................................................................................... 103



(ENVISION,400X)......................................................................................................... 104

Figura 22. Moderada expressão citoplasmática do TIMP-2 em células tumorais e


(ENVISION,400X)......................................................................................................... 104

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Lista de abreviaturas e siglas ADAM-28 - adamalisina-28

AP - adenoma pleomórfico

AP-1 - do inglês, activating protein 1

AP-2 - do inglês, activating protein 2

Apo-CII - apoliproteína CII

Arg81 - aminoácido arginina

CAC - carcinoma adenóide cístico

CCND1 - gene da ciclina D1

CTNNB1 - do inglês, catenin, cadherin-associated protein, beta 1

EGF - do inglês, human epidermal growth factor

EGFR - do inglês, human epidermal growth factor receptor

EGFR2 - do inglês, human epidermal growth factor receptor 2

EMMPRIN - do inglês, extracellular matrix metalloproteinase inducer

FasL - Fas-ligante

FZ-7 - do inglês, frizzled-7

H/E - hematoxilina/eosina

HER-2/neu - receptor do fator de crescimento epidérmico humano do tipo 2

His81 – aminoácido histidina

HMGA2 - do inglês, high mobility group AT-hook 2

HMGIC do inglês, high-mobility group nonhistone chromosomal - protein isoform I-C

ICAM-1 - do inglês, intercellular adhesion molecule 1

IGFBP-1 - do inglês, insulin-like growth factor-binding protein 1

LEF - do inglês, lymphoid enhancer-binding factor

LIFR - do inglês, leukemia inhibitory factor receptor

LOH - do inglês, loss of heterozygosity

MEC - matriz extracelular

MB - membrana basal

MMP - metaloproteinases da matriz

NF-B - do inglês, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NGF - do inglês, nerve growth factor

p53 - proteína p53

PCNA - antígeno nuclear de proliferação celular

PEA3 - do inglês, activator enhancer polyoma 3

PLAG 1 - do inglês, pleiomorphic adenoma gene 1

pRb - proteína retinoblastoma

pró-HB-EGF - do inglês, heparin-binding EGF-like growth factor

RT-PCR - do inglês real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain

reaction

SISH - do inglês, silver enhanced in situ hybridization

SOX-4 - do inglês, transcription factor SOX-4

SP-1, ISRE - do inglês, interferon stimulated response element

Tcf4 - do inglês, transcription factor 4

TGF-く - do inglês, transforming growth factor-beta

TNF-g - do inglês, tumor necrosis factor-alpha

TGS - tumores de glândulas salivares

TIE - do inglês, tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains

TIMP - inibidores teciduais de metaloproteinases

TrkA - receptor neurotrofina tirosina cinase A

VEGF - do inglês, vascular endothelial growth factor

VCAM-1 - do inglês, vascular cell adhesion protein 1

YB-1 - do inglês, Y box binding protein 1

g-1PI - do inglês, alpha1-proteinase inhibitor

RESUMO

O balanço entre a expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores

teciduais (TIMPs) tem sido relacionado a vários processos fisiológicos e patológicos,

incluindo a morfogênese de glândulas salivares e os processos de invasão e metástase

tumoral. O adenoma pleomórfico (AP) e o carcinoma adenóide cístico (CAC) representam,

respectivamente, neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares que, embora

compartilhem a mesma origem celular, apresentam comportamentos biológicos distintos. O

propósito deste estudo foi comparar a expressão imuno-histoquímica das MMPs -2, -7, -9 e -

26 e dos TIMPs -1 e -2 em casos de AP e CAC de glândulas salivares menores. Vinte casos

de AP e vinte casos de CAC foram avaliados quanto à presença, intensidade e localização das

MMPs e TIMPs no parênquima tumoral. A maioria dos APs e CACs apresentaram alta

expressão das MMPs e dos TIMPs, predominantemente localizada nas células tumorais. Não

houve diferença estatisticamente significativa na expressão das MMPs -2 (p=0,359), -7

(p=0,081) e -26 (p=0,553), bem como dos TIMPs -1 (p=0,657) e -2 (p=0,248), entre o

parênquima dos APs e CACs. A MMP-9 demonstrou uma diferença significativa de expressão

entre os dois tumores, apresentando o CAC uma marcação mais intensa para esta gelatinase

(p=0,041). A forte expressão da MMP-9 observada no parênquima dos CACs sugere que esta

gelatinase possa desempenhar um papel importante no comportamento biológico destes

tumores. Por outro lado, apesar de não ocorrer uma diferença significativa entre as médias das

MMPs -2, 7 e 26 nos tumores estudados, os dados quando analisados em conjunto sugerem

que estas proteases podem estar participando de processos de remodelação tecidual em ambos

os tumores, mas não apresentam uma relação direta com o padrão de agressividade do CAC.

Entretanto, as matrilisinas poderiam influenciar indiretamente o comportamento deste tumor

devido a sua capacidade de ativar a MMP-9, fortemente expressa no parênquima destes

tumores.

Palavras-chave: Adenoma pleomórfico, carcinoma adenóide cístico, metaloproteinases da

matriz, inibidores teciduais de metaloproteinases, imuno-histoquímica.

SUMMARY

The balance between the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and their

tissue inhibitors (TIMPs) has been related to various physiological and pathological

processes, including salivary gland morphogenesis and tumor invasion and metastasis

processes. Pleomorphic adenoma (PA) and adenoid cystic carcinoma (ACC) respectively

represent benign and malignant neoplasias of salivary glands. Although they share the same

cell origin, they present distinct biological behavior. The aim of this study was to compare the

immunohistochemical expression of MMPs -2, -7, -9 and -26, and of TIMPs -1 and -2, in

cases of PA and ACC of minor salivary glands. Twenty cases of PA and twenty cases of ACC

were assessed according to the presence, intensity and location of MMPs and TIMPs in the

tumor parenchyma. Most of the PAs and ACCs presented a high expression of MMP -2, -7, -9

and -26 and of TIMP -1 and -2, predominantly located in tumor cells. There was no

significant difference in the expression of MMPs -2 (p=0.359), -7 (p=0.081) and -26

(p=0.553), as well as of TIMPs -1 (p=0.657) and -2 (p=0.248), between the parenchyma of

PAs and ACCs. However, MMP-9 showed a significant difference of expression between the

two tumors, with the ACC showing more intense marking for this gelatinase (p=0.041). The

strong expression of MMP-9 observed in the parenchyma suggests that this gelatinase may

play an important role in the biological behavior of these tumors. On the other hand, although

there was no significant difference between the marking of MMP -2, 7 and 26 in the studied

tumors, the data, when analyzed as a whole, suggest that these proteases may take part in the

process of tissue remodeling in both tumors, but do not present a direct relation with the

pattern of aggressiveness of ACC. Nonetheless, matrilisins may indirectly influence the

behavior of this tumor due to their capacity of activating MMP-9, strongly expressed in the

parenchyma of ACC.

Keywords: pleomorphic adenoma, adenoid cystic carcinoma, matrix metalloproteinases,

tissue inhibitors of metalloproteinases, immunohistochemistry.

INTRODUÇÃO

24

1 INTRODUÇÃO

Os tumores de glândulas salivares (TGS) ainda que incomuns, compreendem uma

importante área da Patologia Oral. A ampla variedade de comportamento biológico e a grande

diversidade morfológica que estes tumores apresentam, suscitam, muitas vezes, dificuldades

de diagnóstico, classificação e tratamento (SPEIGHT, BARRETT, 2002; SPEIGHT, 2007).

O adenoma pleomórfico (AP) é o tumor benigno de maior incidência em glândulas

salivares, representando cerca de 60% das neoplasias desta localização (EVESON et al.,

2005). Estes tumores destacam-se ainda pelo risco de transformação maligna, que pode variar

entre 6 a 13% dos casos (GNEPP, 1993; ELLIS, AUCLAIR, 1996). Sua etiologia e

patogênese ainda permanecem incertas. Análises citogenéticas têm identificado translocações

cromossômicas recorrentes, com pontos de quebra principalmente no 8q12, 3p21 e 12q13-15,

envolvendo respectivamente, o PLAG 1 (do inglês, pleiomorphic adenoma gene 1), CTNNB1

(do inglês, catenin, cadherin-associated protein, beta 1) e HMGA2 (do inglês, high mobility

group AT-hook 2) (CHEUK, CHAN, 2007; VAN DICK et al., 2007).

O carcinoma adenóide cístico (CAC) constitui uma neoplasia de ocorrência rara,

correspondendo a menos de 1% de todos os tumores malignos da região de cabeça e pescoço

(DODD, SLEVIN, 2006) e aproximadamente 4% a 14,5% dos tumores de glândulas salivares

em geral (ELLIS, AUCLAIR, 1996; LIMA et al., 2005). É caracterizado por crescimento

indolente, porém, persistente, podendo evoluir para metástase tardia à distância (JIA et al.,

2004).

As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem uma grande família de

endoproteinases dependentes de zinco secretadas por vários tipos celulares e responsáveis por

uma variedade de eventos proteolíticos. Dentre os mecanismos de controle das atividades

proteolíticas das MMPs destaca-se a ação dos inibidores teciduais de metaloproteinases

(TIMPs). Sob condições fisiológicas, as MMPs estão envolvidas em muitas funções incluindo

migração celular, crescimento neural, cicatrização de feridas e morfogênese de órgãos

epiteliais, sendo também consideradas como fatores cruciais na invasão e metástase de muitos

cânceres humanos (NAGEL et al., 2004; MONAGHAN et al., 2007). Além disto, elas

desempenham importantes funções na regulação da comunicação celular e processamento de

moléculas bioativas, como receptores de superfície celular, citocinas, hormônios, moléculas

de adesão e fatores de crescimento (UITTO et al., 2003; SORSA et al., 2004).

Segundo Patel et al. (2006) sob condições fisiológicas, as MMPs estão envolvidas na

morfogênese de órgãos epiteliais ramificados como as glândulas salivares. Algumas pesquisas

25

também têm sido desenvolvidas buscando compreender o papel destas MMPs em lesões de

origem em glândulas salivares. O papel das MMPs -2 e -9 foi pesquisado na patogênese da

Síndrome de Sjögren (AZUMA et al., 1997; AZUMA et al., 2000; PEREZ et al., 2005). Além

disso, outros estudos foram realizados em neoplasias benignas e/ou malignas de glândula

salivar (KAYANO et al., 2004; NAGEL et al., 2004; CHEN et al., 2005; HU et al., 2005;

TIAN et al., 2005; WANG et al., 2005; WESTERNOFF et al., 2005; NASCIMENTO, 2006;

DE VICENTE et al., 2008; LUUKKAA et al., 2008; LUUKKAA et al., 2009; ZHANG et

al., 2009; LUUKKAA et al., 2010), na tentativa de melhor compreender o papel destas

endoproteinases em processos neoplásicos devido ao atual conhecimento sobre a sua

participação na angiogênese, invasão e metástase tumoral.

Tendo em vista o pouco conhecimento sobre as MMPs e TIMPs em tumores de

glândula salivar, pretende-se com este estudo, contribuir para o melhor entendimento do papel

que estes exercem nos APs e CACs, procurando estabelecer uma correlação entre a expressão

imuno-histoquímica destes marcadores com o comportamento biológico destes tumores.

REVISÃO DA LITERATURA

27

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Adenoma pleomórfico

O AP é a neoplasia mais freqüente das glândulas salivares maiores e menores

(EVESON et al., 2005; ITO et al., 2005; LIMA et al., 2005; WEI-YUNG et al. 2005;

JABER et al., 2006; AL-KHATEEB, LABABNEH, 2007; ANSARI, 2007; BUCHNER

et al., 2007; PIRES et al., 2007; JONES, 2008; SUBHASHRAJ, 2008; WANG et al.,

2008). Segundo Pires et al. (2007) estes tumores correspondem a 33% de todas as

neoplasias benignas e malignas, 30% das neoplasias em parótidas e 33% de todas as

neoplasias de glândulas salivares menores. De acordo com Eveson et al. (2005), este

tumor representa em torno de 60% de todas as neoplasias de glândula salivar, sendo

relatada uma incidência anual de 2,4-3,05 por 100.000 pessoas.

A neoplasia ocorre geralmente entre a quarta e a sexta décadas de vida, em

indivíduos com idade média de 46 anos, tendo uma leve predileção pelo sexo feminino,

apresentando-se tipicamente como uma massa firme de crescimento lento e indolor. A

maioria dos casos ocorre na glândula parótida e quando acomete as glândulas salivares

menores, o palato é a localização mais freqüente, seguido pelo lábio superior e mucosa

jugal (EVESON et al., 2005; AL-KHATEEB, LABABNEH, 2007; BUCHNER et al.,

2007; PIRES et al., 2007).

O AP é composto de células epiteliais e mioepiteliais que se arranjam em

ninhos, cordões, lençóis celulares e estruturas ductiformes que se organizam em

diversos padrões conferindo ao tumor uma ampla diversidade citomorfológica e

arquitetural (DARDICK, 1996; ELLIS, AUCLAIR, 1996; EVESON et al., 2005).

O componente epitelial do AP demonstra uma variedade de tipos celulares

incluindo células cuboidais, basalóides, escamosas, fusiformes, plasmocitóides e células

claras. Raramente células mucosas e sebáceas são evidenciadas. Este componente forma

ninhos, estruturas tipo ductos e áreas hipercelularizadas que podem compor o maior

volume tumoral (EVESON et al., 2005). Ito et al.(2009) analisando as características

histopatológicas de 189 casos de AP, concluíram que as células plasmocitóides eram o

tipo celular mais freqüente nestes tumores seguido das células fusiformes e cuboidais.

As células mioepiteliais apresentam o citoplasma claro e o núcleo

hipercromático e angular. Estas células podem ainda formar um fino padrão reticular ou

28

ninhos de células fusiformes que quando organizadas de forma em paliçada podem

lembrar o Schwannoma (EVESON et al., 2005).

O componente estromal do AP é bastante variável podendo apresentar áreas

mixóides, hialinas, fibrosas, condróides, condromixóides e mais raramente tecido

ósseo e adiposo. Em meio à proliferação de células tumorais mioepiteliais podem ser

evidenciadas áreas de diferenciação escamosa e mais raramente adiposa e óssea. As

zonas cartilaginosas resultam do acúmulo de material mixo-hialino em torno de

células individuais e apenas raramente se assemelham à cartilagem hialina madura.

Geralmente, as lacunas presentes em áreas condróides apresentam um ou dois

núcleos. Segundo alguns autores, nestas áreas apenas as células lacunares não podem

ser distinguidas como condrócitos verdadeiros pelo método da imuno-histoquímica

(MORINGA et al. 1987; TAKAI et al. 1994). Eventualmente, o material condróide

pode representar a maior área do tumor. A presença de epitélio escamoso também

pode ser evidenciada nos APs, podendo ser difuso e com formação de espaços

císticos preenchidos por ceratina. Além disso, ainda podem ser observados em alguns

tumores depósitos de material homogêneo, hialino e eosinofílico entre as células

tumorais e no estroma, bem como a presença de material cristalóide (ELLIS,

AUCLAIR, 1996; EVESON et al., 2005; M;RG;RITESCUăet al., 2005).

Os APs foram classificados histologicamente por Seifert et al. (1976) em 4

tipos com base na diferenciação das células epiteliais, na quantidade e natureza do

estroma. O tipo I, conhecido como clássico, apresenta uma quantidade equilibrada

entre as células epiteliais e o componente estromal, contendo 30-50% de estroma. No

tipo II, o mixóide (rico em estroma), 80% do tumor corresponde a estroma. O tipo

III, chamado de celular (rico em células), apresenta uma quantidade menor ou igual a

20-50% de estroma. O tipo IV contém um estroma em proporções semelhantes ao

tipo III, mas apresenta uma diferenciação monomórfica focal no componente

epitelial.

Alguns estudos têm demonstrado que o AP tipo mixóide é o mais

freqüentemente encontrado, seguido do celular e do clássico (SEIFERT et al., 1976;

STENNERT et al., 2001; ITO et al., 2009). Embora os tipos histológicos não

apresentem relação com o prognóstico, a classificação proposta por Seifert et al. (1976),

enfatiza o amplo espectro morfológico destas neoplasiasă (M;RG;RITESCUă et al.,

29

2005). Além disso, o AP mixóide geralmente apresenta ausência focal de cápsula,

aumentando o risco de recorrência neste tipo histológico (STENNERT et al., 2001).

Normalmente, o AP é circunscrito e encapsulado. No entanto, essa cápsula pode

ser incompleta ou mostrar infiltração pelas células tumorais, principalmente nos TGS

menor (EVESON et al., 2005). A presença de extensões focais do tumor para a cápsula

é muito comum nos APs, sendo um dos seus critérios diagnósticos (DARDICK 1996;

EVESON et al., 2005). Infiltração capsular focal por células tumorais também foi

observada em 80% dos 218 casos de APs de glândula parótida estudados por Zbären e

Stauffer (2007).

As variações citológicas e histomorfológicas no AP são inúmeras, a única

característica constante é a proliferação coordenada de células epiteliais e mioepiteliais,

sendo que estas últimas têm uma tendência a superar numericamente as epiteliais. O

desenvolvimento de estroma do tipo hialino e mixocondróide predominam em alguns

casos mas, encontra-se ausente em outros e esta diversidade histológica contribui para

confundir o AP com outros tumores de glândulas salivares benignos e malignos

(DARDICK, 1996; EVESON et al., 2005).

Embora o AP possua características clínicas e morfológicas bem definidas, a sua

patogênese não está totalmente esclarecida, bem como a influência de fatores que

podem estar relacionados à sua malignização.

Alguns estudos foram realizados buscando melhor compreender os complexos

mecanismos moleculares que envolvem a tumorigênese dos APs. Estudos citogenéticos

demonstraram que 30% dos casos destes tumores possuem o cariótipo normal enquanto

que 70% deles apresentam alguma aberração cromossômica. Alterações citogenéticas

foram identificadas em três padrões de rearranjos que envolviam o 8q12 (39% dos

casos), o 12q13-15 (8% dos casos) e aqueles esporádicos que não incluíam as regiões

8q12 ou 12q13-15 (23% dos casos) (CHEUK, CHAN, 2007; DECLERCQ et al., 2008).

O gene PLAG 1, localizado no cromossomo 8q12, é o gene mais freqüentemente

envolvido em alterações citogenéticas nos APs. Translocações recorrentes, envolvendo

principalmente o PLAG 1 e o CTNNB1, nas regiões t (3;8) (p21;q12), foram

observadas em 25% dos casos. Os genes localizados nos 12q13-15, membros de uma

família de proteínas de alta mobilidade (HMGA2), previamente conhecido como

HMGIC (do inglês, high-mobility group - nonhistone chromosomal - protein isoform I-

C), também foram alvos de translocações em APs. Outras três alternativas fusões foram

30

ainda identificadas e tem contribuído para a super-expressão do PLAG1 nestes tumores.

A fusão do gene LIFR (do inglês, leukemia inhibitory factor receptor) com este gene foi

encontrada em tumores com t(5;8) (p13;q12). Além desta, as fusões dos genes TCEA1-

PLAG1 (também conhecido como SII) e CHCHD7-PLAG-1 também foram observadas

como resultado de rearranjos crípticos em tumores com cariótipo normal (CHEUK,

CHAN, 2007; VAN DICK et al. 2007; ELLEDGE, 2009).

O risco de transformação maligna nos APs foi relacionado aos casos com longo

tempo de evolução e/ou aqueles submetidos a várias cirurgias e com história de

recorrências (LEWIS et al., 2001). A taxa total de transformação maligna do AP foi

estimada em cerca de 6 a 13% dos casos (GNEPP, 1993; ELLIS, AUCLAIR, 1996).

Johns e Goldsmith (1989) relataram uma incidência de 1,6% de transformação maligna

nos tumores com a duração de 5 anos, comparado com 9,4% naqueles que

permaneceram sem tratamento durante 15 anos, demonstrando desta forma a

necessidade de tratamento cirúrgico precoce. De acordo com a literatura, quando ocorre

a transformação maligna do AP o carcinoma ex-adenoma pleomórfico é a sua

contraparte maligna mais frequentemente encontrada. O tumor apresenta um

comportamento agressivo, que geralmente está associado a metástases regionais e a

distância em pulmões, ossos e vísceras que podem levar a um desfecho fatal

(AUCLAIR, ELLIS, 1996; EVESON et al., 2005).

Algumas características histológicas preditivas à transformação maligna dos APs

foram relatadas e incluíam atipias, aumento do número de mitoses, invasão da cápsula,

hipercelularidade, extensa hialinização estromal, necrose e calcificações focais (LEWIS

et al., 2001). Algumas dessas características como atipias, mitoses e invasão capsular

também são evidenciadas em APs típicos e algumas lesões localizadas no palato podem

apresentar hipercelularidade (WALDRON, 1991; EVESON, 2001). Para Auclair e Ellis

(1996) as únicas características histológicas preditivas à transformação maligna do AP

são a presença de estroma hialinizado e calcificações focais.

O tratamento indicado para os APs é a excisão cirúrgica, porém na glândula

parótida, essa remoção é complicada devido a presença do nervo facial. Assim, nos

tumores do lobo superficial recomenda-se a parotidectomia superficial com preservação

do nervo facial, enquanto que no lobo profundo, se faz necessária a excisão total da

glândula junto com o tumor (EVESON et al., 2005).

A neoplasia tem tendência a recorrência, especialmente em glândulas salivares

maiores (STENNERT et al., 2004). Até o final da década de setenta, o tratamento

31

utilizado para os APs era a enucleação cirúrgica e a taxa de recorrência nestes tumores

após este procedimento variava de 10 a 45%. Esta alta taxa levou a uma mudança na

modalidade de tratamento para parotidectomia superficial. Desde a introdução desta

técnica, a taxa de recorrência diminuiu para 2 a 5%. Alguns autores têm sugerido que a

recorrência dos APs está associada à remoção incompleta do tumor primário devido a

aspectos histopatológicos capsulares (cápsula incompleta, infiltração capsular, presença

de pseudopodia e nódulos satélites), que podem comprometer a ressecção completa do

tumor mesmo utilizando diferentes técnicas cirúrgicas (ZBÄREN, STAUFFER, 2007).

2.2 Carcinoma adenóide cístico

O CAC é um dos mais comuns tumores malignos de glândula salivar (AL-

KHATEEB, LABABNEH, 2007; WANG et al., 2007; COPELLI et al., 2008;

SUBHASHRAJ, 2008), compreendendo cerca de 20% de todas as neoplasias malignas

desta localização. O tumor merece destaque devido ao seu aspecto microscópico,

comportamento biológico, índice de recidiva e disseminação sistêmica (da CRUZ

PEREZ et al., 2006; BIANCHI et al.,2008).

O CAC acomete principalmente pacientes na quinta e sexta décadas de vida

(KIM et al., 1994; KOKEMUELLER et al., 2004) e raramente crianças e adolescentes

são afetados (KOKEMUELLER et al., 2004; da CRUZ PEREZ et al., 2006). Para

alguns autores não há predileção de ocorrência em relação ao sexo (KOKEMUELLER

et al., 2004), enquanto que para outros o tumor é mais comum em homens (da CRUZ

PEREZ et al., 2006). Alguns autores encontraram uma alta prevalência no sexo

feminino para os casos localizados na glândula submandibular (EL-NAGGAR,

HUVOS, 2005). A lesão ocorre em glândulas salivares especialmente no palato,

parótida, submandibular e sublingual (da CRUZ PEREZ et al., 2006), bem como, em

outros locais como as glândulas lacrimais, esôfago e árvore traqueobrônquica (SPIRO et

al., 1992; KUEL et al., 1995; RAPIDIS et al., 2005).

Do ponto de vista clínico, a maioria dos pacientes com CAC apresenta uma

massa assintomática que pode estar presente há meses ou anos antes do diagnóstico,

tendo uma história natural prolongada com crescimento lento até mesmo nos casos que

desenvolvem recorrência local ou metástases à distância (TAKAGI et al., 2001;

COHEN et al., 2004). O tumor tem um comportamento indolente (AN et al., 2004) mas,

freqüentemente, mostra crescimento invasivo, recorrência e metástase tardia à distância

32

(WAHLBERG et al., 2002; SHIRAI et al., 2003; FREITAS et al., 2004; JIA et al.,

2004; MISUMI et al., 2004; YASUMATSU et al., 2004; BOBBIO et al., 2008). O CAC

também tem tendência a apresentar invasão perineural em estágios precoces

(KOWALSKI, PAULINO, 2002) e disseminação hematogênica, que ocorre

freqüentemente durante o curso da doença, embora a invasão para linfonodos cervicais

seja bastante rara (KOKEMUELLER et al., 2004).

O CAC apresenta altas taxas de metástase à distância comprometendo

seriamente o tratamento destes tumores. Metástases tardias são comuns e podem ocorrer

mesmo depois de vários anos da ressecção do tumor primário (FRANÇA et al., 2001;

SUNG et al. 2003)

O CAC caracteriza-se histologicamente por dois tipos de células: ductal e célula

mioepitelial modificada que se apresentam tipicamente com núcleos angulares,

hipercromáticos e freqüentemente citoplasma claro, proliferando em forma de lençóis

ou ilhas em meio a um estroma hialino abundante (EL-NAGGAR, HUVOS, 2005).

Estas células organizam-se em três padrões histopatológicos: cribriforme, tubular e

sólido, os quais se relacionam com o prognóstico destes tumores (SHIBUYA et al.,

1999; PEREZ-ORDONEZ, 2003; JIA et al., 2004; EL-NAGGAR, HUVOS, 2005).

Devido aos parâmetros clínicopatológicos acima descritos não serem

inequivocamente preditores da atividade do CAC, estudos tem investigado vários

marcadores imuno-histoquímicos buscando melhor entender o comportamento

biológico desses tumores. Níveis de expressão do antígeno nuclear de proliferação

celular (PCNA) (CHO et al., 1999), do Ki-67 (CARLINFANTE et al., 2005), do

receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (VERED et al., 2002 ), do receptor

do fator de crescimento epidérmico humano do tipo 2 (HER-2/neu), do p53

(CARLINFANTE et al., 2005), da E-caderina (FRANCHI et al., 1999) e da ciclina D1

(YASUMATSU et al., 2004), foram avaliados mas, os resultados ainda não são

conclusivos. Apenas a p53 mostrou-se um consistente marcador de agressividade nos

CACs, sendo altamente expressa no padrão sólido (YAMAMOTO et al., 1998), com

elevadas taxas de LOH (do inglês, loss of heterozygosity) neste padrão (YAMAMOTO

et al., 1996) e correlacionando-se com evolução clínica desfavorável (ZHU et al., 1997;

da CRUZ PEREZ et al., 2006). Altas freqüências de hipermetilação no promotor da E-

caderina e p16 também têm sido observados nos CACs (NISHIMINE et al., 2003;

ZHANG et al., 2007).

33

Cavalcante (2008) estudando APs e CACs procurou identificar o polimorfismo -

160/CA da região promotora do gene CDH1 (E-caderina), na triagem de mutações no

gene CTNNB1, e ainda na análise da expressão imuno-histoquímica das proteínas E-

caderinaă eă く-caderina destes tumores. Este estudo também correlacionou os achados

imuno-histoquímicos com as possíveis mutações e polimorfismos. Os resultados do

estudo indicam que a expressão imuno-histoquímica do complexo E-caderina/く-

catenina pode estar relacionada com a quantidade e a diferenciação do componente

mioepitelial e não com o comportamento biológico dos tumores estudados. Os casos

que exibiram polimorfismo no gene da E-caderina apresentaram redução na expressão

protéica e as possíveis mutações nos genes CTNNB1 parecem não influenciar na

expressãoădaăproteínaăく-catenina.

Miguelă(2005)ăcomparouăaăexpressãoădasăintegrinasăg2く1,ăg3く1 e g5く1ăemăAPsă

e CACs e investigou a diferença de expressão destas integrinas entre os subtipos

histológicos do CAC. Os resultados do estudo indicam que a reduzida expressão da

integrinaăg2く1ăobservadaănosăCACsăpodeăestarărelacionadaăcomăaămenorădiferenciaçãoă

dasăcélulasădesteătumorăeăqueăaăaăreduzidaăexpressãoădaăg5く1ăpodeăestarăassociadaăcomă

o comportamento agressivo do CAC. Os resultados ainda sugerem que a ausência e/ou

redução da expressão das integrinas estudadas no CAC sólido pode desempenhar algum

papel na patogênese e no comportamento mais agressivo deste subtipo histológico.

Os estudos sobre tumorigênese do CAC foram também promissores quando

aberrações cromossômicas foram examinadas por meio de oligonucleotide array e

análise da LOH. O perfil de expressão gênica do CAC estudado por oligonucleotide

array indicou que os genes superexpressos codificavam para a membrana basal (MB) e

proteínas da matriz extracelular de diferenciação mioepitelial (laminina-く1,ă versican,ă

biglican e colágeno tipo IV-g1).ă Outrosă genesă superexpressosă incluíamă fatoresă deă

transcrição SOX-4 (do inglês, transcription factor SOX-4), família AP-2 (do inglês,

activating protein 2) eă membrosă daă viaă deă sinalizaçãoăWnt/くcateninaă comoă aă kinaseă

caseína 1, épsilon e FZ-7 (do inglês, frizzled-7). Os genes pouco expressos codificavam

para proteínas de diferenciação do tipo acinar (amilase, anidrase carbônica e proteínas

salivares ricas em prolina). A perda de heterozigosidade no cromossomo 6q23-25 foi

encontrada em 76% dos casos de CAC, sendo correlacionada com parâmetros

prognósticos (LEIVO, 2006; CHEUK, CHAN, 2007).

34

O tratamento de escolha para o CAC é a ressecção total e o valor de outras

modalidades de terapias adjuvantes permanece controverso (KOKEMUELLER et al.,

2004). O tipo de tratamento varia de acordo com o estágio do tumor, sendo a cirurgia e

radioterapia pós-cirúrgica os métodos mais freqüentemente utilizados seguido de apenas

cirurgia (MATSUBA et al., 1984; GARDEN et al., 1995; AVERY et al., 2000; SUNG

et al., 2003). Alguns estudos não encontraram diferença significativa entre os casos que

receberam radioterapia pós-operatória ou somente cirurgia (KHAN et al., 2001;

KOKEMUELLER et al., 2004). Entretanto, alguns autores demonstraram um melhor

controle local da doença com o uso combinado de cirurgia e radioterapia principalmente

nos casos com margens cirúrgicas positivas (MATSUBA et al., 1986; MIGLIANICO

et al., 1987; AVERY et al., 2000; MENDENHALL et al., 2004).

Para alguns autores, mesmo com o controle local da doença conseguido com a

terapia combinada, as metástases à distância são pobremente controladas e representam

a maior causa de insucesso no tratamento (FORDICE et al., 1999; SHIRAI et al., 2003).

A cirurgia eletiva do pescoço não tem sido recomendada uma vez que o risco de

metástase cervical é relativamente baixo (PROKOPAKIS et al., 1999; KHAN et al.,

2001; MENDENHALL et al., 2004), a não ser para aqueles casos com suspeita clínica

ou cirúrgica de envolvimento linfonodal (da CRUZ PEREZ et al., 2006). Mas, alguns

autores têm indicado o esvaziamento cervical no primeiro momento cirúrgico para os

tumores de base de língua e nasofaringe por estes locais apresentarem uma grande

quantidade de vasos linfáticos (MENDENHALL et al., 2004).

O comportamento clínico agressivo do CAC com recorrência local e metástase

tardia à distância indica a necessidade de realização de exames periódicos por toda a

vida do paciente (KOKEMUELLER et al., 2004). A taxa de sobrevida varia de 78 a

83,1% no período de 5 anos sendo reduzida para 57 a 65 % em 10 anos (TAKAGI et

al., 2001, COPELLI et al., 2008; CICCOLALLO et al., 2009).

Vários estudos têm buscado investigar o papel de fatores prognósticos como a

idade do paciente, a localização do tumor, o tipo e duração dos sintomas, o estágio

clínico, o subtipo histológico, as margens cirúrgicas, a invasão perineural e a presença

de metástase cervical na sobrevida dos pacientes. Alguns autores não confirmaram a

idade como fator prognóstico significativo relacionado à sobrevida dos pacientes com

CAC (KHAN et al., 2000; FRIEDRICH et al., 2003; KOKEMUELLER et al., 2004).

35

Para da CRUZ PEREZ et al. (2006) a idade acima de 45 anos foi considerada um

significativo fator prognóstico para a doença. Os CACs localizados na cavidade nasal,

faringe, laringe e brônquios apresentaram um pior prognóstico quando comparados aos

diagnosticados na cavidade oral (CICCOLALLO et al., 2009). As lesões que se

desenvolviam primariamente na glândula submandibular e no seio paranasal também

apresentaram um prognóstico desfavorável quando comparadas aquelas localizadas na

parótida ou palato (TAKAGI et al., 2001). Pacientes que apresentaram sinais e sintomas

da doença no período inferior a 18 meses do diagnóstico também possuíam uma menor

taxa de sobrevida (NASCIMENTO et al. 1986; da CRUZ PEREZ et al., 2006).

A parestesia, associada com os tumores da glândula parótida, seio maxilar e

cavidade nasal, também foi descrita como um significativo fator prognóstico (SPIRO et

al. 1974; da CRUZ PEREZ et al. 2006). O estágio tumoral tem sido relacionado como

um importante indicador de comportamento do CAC, mostrando que pacientes em

estágios avançados da doença têm apresentado um pior prognóstico (SPIRO et al.,

1992; TAKAGI et al., 2001; SUNG et al., 2003; da CRUZ PEREZ et al., 2006). A

maioria dos estudos revelou que pacientes diagnosticados com CAC com

predominância do padrão histológico sólido têm um pior prognóstico quando

comparados aos que apresentavam predominantemente os subtipos cribriforme e tubular

(MATSUBA et al. 1986; NASCIMENTO et al., 1986; CHUMMUN et al., 2001;

KHAN et al., 2001; CHHIENG, PAULINO, 2002; SUNG et al., 2003;

KOKEMUELLER et al., 2004; EL-NAGGAR, HUVOS, 2005). Altas taxas de

metástase à distância também têm sido observadas no padrão sólido (COPELLI et al.,

2008). As lesões com este padrão são consideradas de alto grau de malignidade com

taxas de recorrência de até 100% em comparação respectivamente com 50 e 80% para

as variantes tubular e cribriforme (TOMICH et al., 1991; STALLMACH et al., 2002).

Alguns autores destacam que o padrão tubular representa a forma mais diferenciada do

CAC, tendo o prognóstico mais favorável (YASUMATSU et al., 2004). Outros estudos

não confirmaram o subtipo sólido como fator prognóstico importante ao curso da

doença (PROKOPAKIS et al., 1999; FRIEDRICH et al., 2003). A presença de tumor

nas margens da ressecção, a invasão perineural e a presença de metástase cervical

também têm sido descritos como fatores prognósticos negativos (FORDICE et al. 1999;

PROKOPAKIS et al., 1999; TAKAGI et al., 2001; LICITRA et al., 2003; SUNG et al.,

2003; KOKEMUELLER et al., 2004; RAPIDIS et al., 2005; da CRUZ PEREZ et al.,

36

2006). Alguns estudos não encontraram uma correlação entre invasão perineural e um

pior prognóstico (SPIRO et al. 1974; MATSUBA et al. 1986; NASCIMENTO et al.,

1986) mas, outros autores demonstraram um decréscimo na taxa de controle local da

doença quando um maior número de fascículos nervosos estava envolvido pelas células

tumorais (GRADEN et al., 1995).

2.3 Invasão, metástase tumoral e matriz extracelular

Uma característica importante das células malignas é a sua capacidade de invadir

tecidos normais vizinhos e se espalharem através do sangue e do sistema linfático para

órgãos distantes através do processo de metástase. As células malignas têm várias

características que as distinguem das células normais com a auto-suficiência em sinais

de crescimento, insensibilidade a sinais de crescimento inibitório, evasão da morte

celular programada (apoptose), potencial replicativo ilimitado, angiogênese, invasão

tecidual e metástase (HANAHAN, WEINBERG, 2000).

O processo de invasividade descreve a habilidade dessas células de vencer

barreiras anatômicas como a MB e o estroma intersticial. A infiltração das células

tumorais através da MB é um passo crítico no crescimento tumoral e para que estas

células sejam capazes de se espalhar elas devem dissociar-se da ligação e controle das

células vizinhas e da matriz extracelular (MEC). A motilidade celular requerida para a

invasão tumoral é coordenada através de um balanço entre os receptores de adesão

celular e esta matriz (KALLURI, 2003).

A MEC é formada por uma rede complexa e intrincada de moléculas

precisamente organizadas. Esta rede determina a arquitetura específica dos tecidos,

fornece informações biológicas e substratos para a adesão e migração celular. Esta

matriz se situa sob o epitélio e circunda as células do tecido conjuntivo, sendo secretada

por fibroblastos e por algumas células especializadas como condrócitos e osteoblastos.

Além dessas, os mastócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos

também se encontram nesta matriz. As duas principais classes de macromoléculas que

compõem a MEC são: 1) proteínas fibrosas de dois tipos funcionais: estrutural

(colágeno e elastina) e adesiva (fibronectina, tenascina e laminina) e 2) proteoglicanos,

proteínas covalentemente ligadas às cadeias de polissacarídeos chamados

glicosaminoglicanos (GAGs) (ZIOBER et al., 2006).

37

Um estudo foi realizado por Raitz et al. (2003) para avaliar o papel da MEC na

morfogênese e diferenciação celular dos TGS originados do ducto intercalado. Foram

analisadas proteínas desta matriz usando a imuno-histoquímica em 34 casos de

neoplasias de glândula salivar (adenoma pleomórfico, mioepitelioma, adenoma de

células basais, adenocarcinoma polimorfo de baixo grau e carcinoma adenóide cístico).

Os resultados demonstraram que a laminina e o colágeno tipo IV foram expressos em

todos os tumores estudados, nas estruturas ductiformes, separando-as do estroma ou ao

redor de aglomerados de células. Além destas duas proteínas, a fibronectina também foi

evidenciada no estroma de todos os casos, especialmente no tipo mixóide dos APs, com

exceção dos espaços pseudocísticos dos CACs que foram apenas delimitados por

laminina e colágeno tipo IV. A tenascina foi evidenciada ao redor das estruturas

tubulares, células periféricas e entre as células plasmocitóides dos APs, enquanto que no

estroma esta proteína foi evidenciada principalmente no subtipo hialino. As proteínas da

MEC também foram evidenciadas nos variados padrões do CAC. No padrão tubular, a

laminina e o colágeno tipo IV foram expressos ao redor de estruturas tubulares e no

estroma. No padrão cribriforme, estas duas proteínas foram evidenciadas delimitando os

espaços pseudocísticos e difusamente no interior destes espaços. No padrão sólido todas

as proteínas foram imunomarcadas, especialmente a tenascina. Esta proteína foi

principalmente observada em tumores menos diferenciados e com alto grau de

malignidade como os CACs sólidos.

Félix et al. (2004) analisaram a expressão imuno-histoquímica da tenascina em

63 casos de APs, 23 casos de carcinomas ex-adenomas pleomórficos e 10 casos de

glândulas salivares normais usados como controles. A tenascina foi evidenciada ao

redor dos ductos excretórios das glândulas salivares normais mas, não foi expressa na

MB dos tumores benignos e malignos estudados. A expressão desta proteína foi

estatisticamente significante no estroma fibrohialino (p<0,001). Porém, apenas um

pequeno percentual de APs (25%) expressavam a tenascina em comparação com as

áreas de tumor maligno e benigno dos carcinomas ex-adenomas (75% e 90%,

respectivamente). Nos tumores malignos, diferença estatisticamente significante foi

encontrada (p<0,001) quando comparada a freqüência de tenascina em torno das células

neoplásicas de tumores com metástases (73%) e aqueles não metastatizantes (0%). Os

autores concluíram que estes resultados suportam fortemente a hipótese de que a

expressão da tenascina está envolvida nos mecanismos de transformação maligna dos

APs bem como na progressão clínica da doença.

38

Bento et al. (2006) analisaram a expressão imuno-histoquímica da tenascina e

fibronectina em 23 casos de AP de glândulas salivares. Todos os casos foram

imunoreativos para a fibronectina mostrando forte expressão desta proteína nos

estromas fibrosos e condróides. Uma fraca marcação foi evidenciada nos estromas

hialinos e mixóides. A tenascina também foi mais fortemente expressa nos estromas

fibrosos e condróides e moderadamente evidenciada nos estromas hialinos e mixóides.

Os autores concluíram ainda que não houve uma diferença na expressão destas proteínas

entre os TGS maior e menor.

A MEC é um compartimento dinâmico dessas moléculas e de vários fatores de

crescimento e enzimas latentes, que afetam a ativação de célula para célula e as

interações célula-matriz. A interação das células com a MEC é fundamental para o

desenvolvimento normal e funcional dos organismos. Os processos de crescimento e

migração celular são dependentes da remodelação da MEC que é regulada por um

delicado equilíbrio entre a síntese e degradação de proteínas presentes nesta matriz. A

degradação coordenada das macromoléculas da MEC é crucial para muitos processos

biológicos. No entanto, a degradação excessiva de componentes desta matriz ocorre em

processos patológicos como as feridas crônicas, arteriosclerose, artrite reumatóide, bem

como na invasão e metástase tumoral (NAGASE et al., 2006; GILL, PARKS, 2008;

NÖEL et al., 2008).

Compreender os mecanismos moleculares que envolvem a complexa interação

entre as células tumorais e o estroma circundante representa um dos principais desafios

na investigação do câncer. Evidências suportam a hipótese de que as MMPs mediam

importantes mudanças no microambiente tumoral durante o processo de progressão dos

tumores, assumindo um importante papel na comunicação molecular entre as células

tumorais e o estroma (KESSENBROCK et al., 2010).

2.4 Metaloproteinases da matriz

As primeiras descrições da ação de proteinases extracelulares foram

apresentadas por Gross e Lapiere (1962), os quais observaram que enzimas difusíveis,

produzidas por fragmentos de caudas de girinos em involução, eram capazes de

degradar géis compostos por colágeno fibrilar nativo (MURPHY, NAGASE, 2008).

39

Desde a observação destes autores, uma verdadeira família de compostos enzimáticos

relacionados tem sido identificada (RODRÍGUEZ et al., 2010).

As MMPs compreendem uma grande família de enzimas proteolíticas

dependentes de cálcio e zinco que além de degradar substratos da MEC também agem

em outros componentes desta matriz como citocinas, quimiocinas, fatores de

crescimento, receptores de superfície celular, proteases, sistema complemento e

moléculas de adesão. Mais de 20 diferentes membros são conhecidos e foram agrupadas

em seis subfamílias distintas de acordo com a organização do domínio e especificidade

do substrato: colagenases (MMP-1, -8, -13 e -18), gelatinases (MMP-2 e -9),

estromelisinas (MMP-3 e -10), matrilisinas (MMP-7, -26 e -11), MMPs tipo membrana

(MMP-14, -15, -16, -17, -24 e -25) e outras MMPs (MMP -12, -19, -20, -21, -23,-27,-

28) (NAGASE et al., 2006; FU et al., 2008; RODRÍGUEZ et al., 2010).

Estas enzimas são denominadas coletivamente de MMPs em razão de sua

dependência de íons metálicos para atividade catalítica, habilidade para degradar

proteínas estruturais da MEC e presença de seqüências evolutivas específicas que as

distinguem de outros compostos enzimáticos intimamente relacionados (RA, PARKS,

2007).

A maioria das MMPs estão organizadas ao redor de um domínio catalítico

conservado ao qual se incorpora um pró-peptídeo (Zn++), necessário à manutenção da

latência da enzima; um peptídeo sinalizador, responsável pelo direcionamento de

secreção do composto pela célula; e um domínio hemopexina C-terminal, o qual

contribui para a especificidade de substrato e interações com inibidores endógenos

(ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005; FU et al., 2008).

Folgueras et al. (2004) destacam que este arquétipo é observado no subgrupo de

proteases secretadas, composto pelas três colagenases humanas (MMP-1, -8 e -13), as

duas estromelisinas (MMP-3 e -10), e quatro MMPs com características peculiares

adicionais (MMP-12, -19, -20 e -27). Por sua vez, as matrilisinas (MMP-7 e -26) e a

MMP-23 não apresentam o domínio hemopexina (SEIKI, YANA, 2003) e as gelatinases

(MMP-2 e -9) incorporam três módulos de fibronectina tipo II, provendo um domínio

compacto de ligação ao colágeno (BJÖRKLUND, KOIVUNEN, 2005).

Em adição a estas formas secretadas de MMPs, Zucker et al. (2003) arrolam seis

tipos de MMPs localizadas na superfície celular, denominando-as de metaloproteinases

do tipo membrana (MT-MMPs). De acordo com estes autores, quatro dessas enzimas

40

(MT1-, MT2-, MT3- e MT5-MMP) associam-se à membrana celular através de

domínios C-terminais transmembrana, ao passo que os dois componentes enzimáticos

restantes (MT4- e MT6-MMP), integram-se à membrana plasmática por meio da

molécula de ancoragem glicosilfosfatidilinositol.

As MMPs, em condições fisiológicas, têm um papel central na regulação da

MEC durante o desenvolvimento embrionário e a remodelação tecidual (NAGASE et

al., 2006; PAGE-MCCAW et al.,2007). Estas proteinases estão envolvidas em muitas

funções incluindo a migração celular, crescimento neural, cicatrização e morfogênese de

órgãos epiteliais como as glândulas salivares. Em condições fisiológicas de

normalidade, elas são expressas em níveis muito baixos em tecidos adultos, exceto nos

tecidos em remodelação como endométrio ciclando, tecido de mama normal em

involução e na pele durante a cicatrização. Entretanto, as MMPs são também

consideradas fatores cruciais nos processos de invasão, metástase e angiogênese em

muitos cânceres humanos (BRAKEBUSH et al., 2002, MONAGHAN et al., 2007).

Apesar de estar claro que a associação entre as metaloproteinases e a progressão

neoplásica está diretamente relacionada com a sua capacidade de romper as barreiras

físicas representadas pela MB e MEC intersticial, as metaloproteinases também

participam de outros processos do desenvolvimento tumoral, como a regulação da

angiogênese através da modulação de fatores de crescimento e citocinas armazenadas na

MEC (FRANCHI et al., 2002).

2.4.1 MMPs -2 e -9 (gelatinases A e B)

As MMPs -2 e -9 (gelatinases A e B, respectivamente) são provavelmente os

membros mais estudados da família das MMPs. O interesse pelas gelatinases provém da

sua habilidade para clivar o colágeno tipo IV, encontrado na MB. Estas proteinases

desempenham um importante papel na angiogênese, bem como na remodelação

tecidual, invasão e metástase, além de freqüentemente estarem associadas a um pior

prognóstico tumoral (COUSSENS et al.,ă2000;ăEGEBLAD,ăWERBă2002;ăAM;LINEIă

et al., 2007).

A MMP-2 é uma protease de 72kDa, que degrada substratos como gelatina,

elastina, nidogênio, colágenos (I, II, III, IV, V, VII e X), laminina-5, fibronectina,

tenascina, fibrilina, fibrina, fibrinogênio, osteonectina, agrecana, vitronectina, decorina,

proteínaă mielínicaă básica,ă plasminogênio,ă g2-macroglobulina, IGFBP-1 (do inglês,

41

insulin-like growth factor-binding protein 1), precursor do TNF-g (do inglês, tumor

necrosis factor-alpha), forma inativa do TGF-くă(do inglês, transforming growth factor-

beta), g-1PI (do inglês, alpha1-proteinase inhibitor) e interleucina-1くă(STERNLICHT,ă

WERB, 2001; KERKELA, SAARIALHO-KERE, 2003; FOLGUERAS et al., 2004).

Apesar da gelatinase A possuir especificidades de substratos da MEC semelhantes à

MMP-9, esta metaloproteinase é regulada de forma diferente, tanto a nível

transcricional, quanto extracelular (KUMAMOTO et al., 2003).

Para Aimes e Quigley (1995) e Björklund e Koivunen (2005), a principal

diferença observada entre as MMPs-2 e -9, com relação ao substrato, constitui na

capacidade da primeira em degradar colágeno fibrilar tipo I.

Patterson et al. (2001) reportaram que o processo de degradação do colágeno

fibrilar tipo I pela MMP-2 depende apenas da ligação deste aos domínios hemopexina

C-terminal e ao domínio catalítico, diferentemente do constatado para a degradação das

gelatinas, processo que, além da interação com os domínios referenciados

anteriormente, depende da associação desta proteína aos três módulos de fibronectina

tipo II.

Enaltecendo o papel dos módulos de fibronectina tipo II, Hornebeck et al.

(2002) afirmam que apesar de se verificar certa especificidade de ligação ao substrato

de acordo com o módulo analisado, como evidenciado entre o primeiro destes e elastina,

o segundo e gelatinas, e o terceiro módulo e colágeno tipo IV, é provável haver

interação entre todos estes para uma associação efetiva entre componentes da MEC e

esta protease.

Mattu et al. (2000), Opdenakker et al. (2001) e Xu et al. (2005) descrevem,

ainda, que apesar desta sobreposição de substratos entre MMPs-2 e -9, a gelatinase A

diferencia-se por sua síntese constitutiva, evidenciada em fibroblastos, macrófagos,

células endoteliais e células epiteliais, ao passo que a MMP-9 apresenta expressão

altamente regulada, sendo observada, em células inflamatórias como macrófagos,

neutrófilos e eosinófilos.

Atualmente, a utilização de técnicas de seqüenciamento do DNA revelou a

presença de elementos regulatórios na região do promotor do gene da MMP-2. Dentre

estes, destacam-se sítios de ligação para a proteína p53, AP-1 (do inglês, activating

protein 1), AP-2 (do inglês, activating protein 2) e fator de transcrição YB-1 (do inglês,

Y box binding protein 1). Comumente, AP-2 atua em complexos com YB-1 e p53,

estimulando a expressão de MMP-2 (MOOK et al., 2004).

42

Strongin et al. (1995) denotam que, ao contrário das demais MMPs, a gelatinase

A é refratária à ativação através de serina proteases. Conforme estes pesquisadores, esta

MMP sofre ativação na superfície celular, em decorrência de uma cascata singular,

envolvendo MT1-MMP e TIMP-2. Para alguns autores, primeiramente, uma MT1-

MMP liga-se ao domínio N-terminal de TIMP-2, permitindo ao domínio C-terminal

deste inibidor de MMPs atuar como receptor do domínio hemopexina da MMP-2. Em

seguida, outra MT1-MMP adjacente cliva e ativa a MMP-2 associada ao TIMP-2, na

posição entre os aminoácidos Asn37-Leu38, gerando uma forma intermediária de 64kDa.

Seqüencialmente, após esta clivagem inicial, uma porção residual do pró-peptídeo, entre

os aminoácidos Asn80-Tyr81, é removida por outra molécula de MMP-2 ativada,

permitindo, finalmente, a apresentação da forma completamente ativa desta enzima

(DERYUGINA et al., 2001; SEIKI, 2003; HORNEBECK et al., 2005).

Conforme afirmam Strongin et al. (1995), enquanto o domínio C-terminal do

TIMP-2 participa na ativação da MMP-2, seu domínio N-terminal atua como inibidor

desta MMP. Além disso, Hornebeck et al. (2002) e Björklund e Koivunen (2005)

reportam que as concentrações locais de TIMP-2 influenciam a ativação da MMP-2,

sugerindo que níveis moderados ou baixos deste componente promovem a ativação

desta MMP, ao passo que níveis maiores são capazes de inibir a ação da MMP-2 através

da saturação das MT1-MMPs livres, necessárias à remoção do pró-peptídeo desta

enzima.

Seiki (2003) corrobora quanto ao importante papel da ação conjunta de MT1-

MMP e MMP-2. Segundo o autor, apesar de algumas linhagens de células neoplásicas

epiteliais não revelarem expressão de gelatinase A, estes elementos celulares seriam

capazes de utilizar a MMP-2 sintetizada por fibroblastos estromais, através de MT1-

MMP expressa em suas superfícies celulares. Resumidamente, o autor sugere que o

sistema MT1-MMP/MMP-2 consistiria em um importante mecanismo de invasão

tumoral, degradando colágeno tipo IV, presente em MBs, bem como, colágeno I,

presente na MEC.

Reiterando a importância desta integração entre MT1-MMP e MMP-2, Seiki e

Yana (2003) descrevem que, em células epiteliais neoplásicas, a ativação deste sistema

permitiria a degradação da MB, preponderantemente através da ação sobre o colágeno

tipo IV, enquanto que no estroma, a ação destas proteases culminaria com a degradação

do colágeno tipo I, onde a primeira degradaria a estrutura principal desta molécula da

MEC e a segunda eliminaria seus fragmentos desnaturados.

43

A MMP-9 apresenta 82kDa em sua forma ativa e desempenha um papel

enzimático importante na progressão de tumores, promovendo a degradação de vários

substratos, participando de eventos necessários à migração das células tumorais e da

angiogênese tumor-induzida (MATTU et al., 2000; FRIDMAN et al., 2003). A

gelatinase B degrada substratos como gelatina, elastina, nidogênio, colágenos (I, IV, V,

VII, XI e XIV), laminina, fibronectina, fibrilina, osteonectina, agrecana, vitronectina,

decorina, proteínaămielínicaăbásica,ăplasminogênio,ăg2-macroglobulina, IGFBP-1, pré-

TNF-g,ăpróăTGF-く,ăg-1PI e interleucina-1くă(STERNLICHT,ăWERB,ă2001;ăKERKELA,ă

SAARIALHO-KERE, 2003; FOLGUERAS et al., 2004).

A região promotora do gene que codifica a MMP-9 exibe sítios de ligação para

diversos fatores de transcrição, sendo comumente descritos na literatura as APs-1 e -2,

NF-B (do inglês, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), SP-

1, ISRE (do inglês, interferon stimulated response element) TIE (do inglês, tyrosine

kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains) (MOOK et al., 2004).

Alguns autores descrevem a presença de um domínio adicional à estrutura da

MMP-9, não evidenciado na gelatinase A, denominado de domínio semelhante ao

colágeno tipo V. Este domínio, altamente glicolisado, situa-se entre o domínio de

ligação ao zinco e o domínio hemopexina C-terminal (MATTU et al. 2000;

BJÖRKLUND, KOIVUNEN, 2005). Apesar do significado biológico permanecer

incompletamente compreendido, sugere-se como possíveis funções a associação

colateral de diversas moléculas de gelatinases B, favorecendo ou prevenindo interações

específicas entre os domínios hemopexina C-terminais destas enzimas, bem como, a sua

ligação a moléculas da MEC (MATTU et al., 2000; OPDENAKKER et al., 2001).

Outra característica peculiarmente constatada na MMP-9 é a glicosilação,

observada ao longo da molécula desta protease, constituída por diversos

oligossacarídeos volumosos e altamente móveis. Funcionalmente, sugere-se que esta

glicosilação possa ser responsável pela proteção de áreas específicas contra degradação,

estabilização da molécula, impondo conformações específicas para determinados

domínios, bem como, pelo direcionamento da enzima através de interações com a MEC

ou receptores de superfície celular (MATTU et al., 2000; OPDENAKKER et al., 2001).

Como as demais MMPs, a MMP-9 é secretada em sua forma zimogênica

inativa. Dessa forma, para sua função enzimática, é necessária a alteração entre o

grupamento sulfidrila da cisteína, presente no domínio pró-peptídico e o íon zinco,

associado ao domínio catalítico, a qual pode ser desencadeada através de mecanismos

44

proteolíticos ou não-proteolíticos (STERNLICHT, WERB, 2001; BANNIKOV et al.,

2002; FRIDMAN et al., 2003).

Diversas proteases foram implicadas na ativação da MMP-9, dentre as quais

merecem destaque as MMPs-2, -3, -7 e -13. Dentre estas, a MMP-3, também

denominada de estromelisina 1, apresenta-se como uma das mais importantes ativadoras

efetivas da gelatinase B (FRIDMAN et al., 2003; BJÖRKLUND, KOIVUNEN, 2005).

Curran e Murray (2000) e Fridman et al. (2003) sugerem que a ativação da pró-

enzima MMP-9 também seria resultado da cascata iniciada na superfície celular através

de MT1-MMP, em decorrência desta forma de MMP associada à membrana celular

ativar MMP-2 e, estas duas proteases, serem capazes de ativar MMP-13.

Dentre os mecanismos não-proteolíticos de ativação da MMP-9, destaca-se a

modificação oxidativa das cadeias laterais dos resíduos de cisteína, o que resulta em

diminuição de sua habilidade em estabelecer ligações efetivas ao íon catalítico zinco

(BJÖRKLUND, KOIVUNEN, 2005), bem como, alterações conformacionais induzidas

por ligações ao substrato (BANNIKOV et al., 2002). Não obstante, Fridman et al.

(2003) enaltecem que, apesar das dúvidas a respeito da eficiência deste processo de

ativação não-proteolítico, se confirmado, este mecanismo explanará, ao menos

parcialmente, a presença de formas ativas de MMP-9 contendo o domínio pró-peptídico.

Conforme já descrito para outras MMPs, alguns estudos demonstram uma

possível associação funcional entre integrinas e gelatinase B (STERNLICHT, WERB,

2001; BJÖRKLUND, KOIVUNEN, 2005). Dentre estes, destaca-se a pesquisa realizada

por Björklund et al. (2004), os quais, utilizando linhagens celulares de fibrossarcoma

(HT-1080), verificaram co-imunoprecipitação da subunidade 5 de integrina e da forma

zimogênica de MMP-9, bem como, co-localização destas moléculas na borda anterior

da membrana plasmática, em relação ao sentido de migração na MEC, constatado

através de imunofluorescência. Sabendo-se da utilização da integrina v5, por esta

linhagem celular, no processo de adesão célula-matriz, estes autores sugerem uma

provável interação entre esta molécula de adesão e a MMP-9, para consubstanciar a

gelatinólise efetiva no espaço pericelular, favorecendo o processo de invasão local.

Acrescendo à diversidade de interações reportadas, entre MMP-9 e integrinas,

cita-se a pesquisa conduzida por Rolli et al. (2003). Utilizando linhagem de células de

carcinoma de mama (MDA-MB 435), estes autores constataram que o fenótipo

metastático destes elementos celulares encontrava-se na dependência de um estado

45

ativado da integrina v3, o qual, conseqüentemente, determinava a presença de MMP-

9 enzimaticamente competente, conforme observado através de análises com Western

Blot e zimografia. Coerentemente, o estudo das células de carcinoma de mama que não

apresentavam integrina v3, em estado ativado, resultou na constatação apenas de

formas pró-enzimáticas de gelatinase B.

Mook et al. (2004) e Turpeenniemi-Hujanen (2005) enfatizam o papel das

MMPs-2 e -9 na angiogênese e no crescimento de tumores. Conforme os autores, há um

acúmulo crescente de evidências que suportam a associação das MMPs, e em especial

as gelatinases, com comportamento biologicamente agressivo e cursos clínicos

imprevisíveis em alguns neoplasmas humanos.

As gelatinases A e B estão geralmente super-expressas em tecidos malignos, em

comparação com suas contrapartes benignas (SASAKI et al., 2002; ASHA NAIR et al.,

2003; MOOK et al., 2004; SORSA et al., 2004; MORÁN et al., 2005;

TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005). Valores séricos elevados destas

metaloproteinases estão também associados com a baixa sobrevida em muitos tipos de

cânceres, como o de mama (TALVENSAARI-MATTILA et al., 1998, LEPPÄ et al.,

2004), de próstata (TRUDEL et al., 2003), melanoma (VÄISÄNEN et al., 1998,

NIKKOLA et al., 2005), carcinomas epidermóides na região de cabeça e pescoço

(RIEDEL et al., 2000, RUOKOLAINEN et al., 2004) e pulmão (PASSLICK et al.,

2000; YLISIRNIÖ et al., 2000). Por outro lado, alguns autores não encontraram

nenhuma correlação entre a sobrevida de pacientes e a expressão das MMP-2 ou MMP-

9 em alguns tipos de câncer (VUORISTO et al., 2000; SASAKI et al., 2002, RAHKO et

al., 2004), a exemplo do câncer colorretal onde nenhum significado prognóstico foi

encontrado com a superexpresssão destas gelatinases (SIS et al., 2004; MORÁN et al.,

2005).

2.4.2 MMPs -7 e -26 (matrilisinas -1 e -2)

A MMP-7, também conhecida como matrilisina-1, distingue-se estruturalmente

das demais MMPs, estando constituída apenas pelos três domínios necessários à

atividade enzimática: o domínio catalítico com íon Zn++ incorporado, necessário à

manutenção da latência da MMP; um domínio pró-peptídico e um peptídeo sinalizador,

responsável pelo direcionamento de secreção do composto pela célula. Dessa forma, a

MMP-7 não possui o domínio hemopexina C-terminal, responsável pela especificidade

46

de substrato e interações com inibidores das MMPs (WILSON et al., 1995;

FOLGUERAS et al., 2004).

O gene que codifica a proteína MMP-7 está localizado no cromossomo 11q22.2-

22.3. Diversos sítios de ligação para fatores de transcrição foram identificados no

promotor do gene da matrilisina-1, dentre os quais destacam-se: sítio AP-1, sítio Tcf4

(do inglês, transcription factor 4), LEF (do inglês, lymphoid enhancer-binding factor ),

sítio TIE (do inglês, inhibitory element TGF-) e sítio PEA3 (do inglês, activator

enhancer polyoma 3) (BRABLETZ et al., 1999; STRONGIN, 2006).

Brabletz et al. (1999), Saeki et al. (2002) e Strongin (2006) enfatizam que dentre

os principais fatores implicados no aumento da expressão de MMP-7 em neoplasias,

merece destaque a -catenina. Sua atuação multifuncional, ora estabilizando complexos

de adesão em associação à E-caderina, em células epiteliais, ora funcionando como fator

de transcrição nuclear como ponto final da via -catenina/WNT, sugerem um papel

importante desta molécula na regulação da invasão local e metástase, em processos

neoplásicos.

Diferentemente das demais MMPs, cuja expressão decorre de estímulo em

resposta à injúria ou inflamação, a matrilisina-1 encontra-se expressa de forma

constitutiva em tecido epitelial exócrino, na maioria dos tecidos adultos.

Especificamente, a MMP-7 é sintetizada por glândulas salivares e glândulas anexas da

pele, bem como, pelo epitélio glandular ou ductal do pâncreas, fígado, mama, intestino e

trato urogenital (PARKS et al., 2001).

Outro aspecto importante da MMP-7 é o padrão de expressão desta protease em

neoplasias. De acordo com Zhang et al. (2005), ao contrário das demais MMPs, as quais

revelam expressão predominante em meio ao componente estromal, a MMP-7 localiza-

se primariamente no parênquima neoplásico, especialmente em neoplasias de origem

epitelial, conforme relatos descritos em carcinomas orais, esofágicos, colorretais,

gástricos e de mama (FINGLETON et al., 2001; KITOH et al., 2004; GRAESSLIN et

al., 2006).

A expressão de MMP-7 em epitélio normal sugere que esta enzima atue na

manutenção da homeostasia epitelial e, de fato, diversos relatos implicam um papel para

esta matrilisina na imunidade inata em tecido epitelial. Parks et al. (2001) afirmam que

a maioria dos tecidos nos quais MMP-7 é expressa de forma constitutiva, estão expostos

ao meio ambiente e a ação de diversos microrganismos.

47

Os principais substratos que sofrem proteólise por MMP-7 são: colágenos (I e

IV desnaturados), elastina, entactina, gelatina 1, fibulina, fibronectina, laminina,

vitronectina, agrecana, proteoglicanas, proteína ligante, mielina básica, endostatina,

osteonectina,ă g-1PI,ă g2-macroglobulina, caseína, FasL (Fas-ligante), integrina, E-

caderina, sindecana-1, fibrinogênio, plasminogênio, pró-HB-EGF (do inglês, heparin-

binding EGF-like growth factor), pró-g-defensina, TNF-g,ăApo-CII (apoliproteína CII)

e ADAM-28 (adamalisina-28). A MMP-7 tem sido relacionada à degradação de

componentes da MB que é um evento crucial no processo de invasão e metástase

(SIRES et al., 1994; CHAKRABORTI et al., 2003; FOLGUERAS et al., 2004;

NAGASE et al., 2006).

Fingleton et al. (2001) identificaram um papel peculiar da ação de matrilisina-1

sobre a apoptose em cultura de linhagem de células epiteliais de glândula mamária

humana (HBL 100). Estes autores verificaram que na presença crônica de MMP-7,

ocorre seleção de uma sub-população celular mais resistente a apoptose mediada pela

interação de Fas-L com seu receptor na membrana celular. Com seus resultados,

Fingleton et al. (2001) sugerem que a expressão de matrilisina-1, reportada em estágios

iniciais do desenvolvimento neoplásico, pode estar relacionada à seleção de células com

menor propensão à destruição pelo sistema imune, favorecendo o acúmulo de

modificações genéticas adicionais e, finalmente, o surgimento de tumores.

Goffin et al. (2003), em estudo utilizando RT-PCR, analisaram a expressão de

diversas MMPs ao longo do ciclo menstrual, constatando três padrões distintos de

expressão destas proteases, classificados em: MMPs restritas ao período menstrual,

MMPs expressas por todo o ciclo e MMPs expressas predominantemente durante a fase

proliferativa. A MMP-7, bem como uma protease intimamente relacionada, denominada

de matrilisina-2 (MMP-26), foi evidenciada nesta última fase. Para estes autores, a

expressão das matrilisinas-1 e -2 durante esta fase do ciclo menstrual sugere implicação

destas proteases em diversos processos, como proliferação celular, rápido crescimento

glandular, expansão estromal e angiogênese.

Achados similares foram identificados por Graesslin et al. (2006), em estudo

sobre a expressão de MMP-7 em endométrio humano normal, hiperplásico e neoplásico.

Estes pesquisadores relataram marcante expressão imuno-histoquímica de matrilisina-1

durante a fase proliferativa do ciclo menstrual, sugerindo um papel para esta protease na

degradação de debris luminais e remodelação da MEC. Adicionalmente, constatou-se

correlação entre a forte imunorreatividade para MMP-7 e o envolvimento de vasos

48

linfáticos e sangüíneos, no endométrio neoplásico, fato que enaltece o papel desta

protease na degradação do colágeno tipo IV, presente em MBs, bem como, na ativação

das formas zimogênicas de gelatinases A e B.

Alguns autores revelam uma correlação entre o grau de malignidade de

neoplasias e a expressão de MMP-7. Como exemplo, merece destaque o estudo imuno-

histoquímico realizado por Kitoh et al. (2004), em adenomas, carcinomas in situ e

carcinomas invasivos da mucosa gástrica. Estes pesquisadores constataram um

gradiente crescente na expressão de matrilisina-1 desde os adenomas aos carcinomas

invasivos. A imunorreatividade para MMP-7 apresentou-se de forma mais significativa

em áreas de invasão de vasos sangüíneos e linfáticos, enaltecendo o papel desta protease

sobre componentes da MB e sua associação com o desenvolvimento de metástases de

carcinomas gástricos.

A MMP-26, também denominada de matrilisina-2, constitui-se em um dos

membros da família das MMPs descoberto recentemente, tendo sua estrutura

incompletamente elucidada. O gene responsável pela codificação desta protease

encontra-se situado no lócus cromossômico 11p15.3, relativamente distante do cluster

11q21-q23, que envolve pelo menos 8 genes responsáveis pela codificação das MMPs-

1, -3, -7, -8, -10, -12, -13, -20 e -27 (AHOKAS et al., 2005; STRONGIN, 2006).

Dentre os principais substratos para MMP-26, destacam-se o colágeno tipo IV

desnaturado, fibronectina, fibrinogênio, vitronectina, gelatina 1, 2-macroglobulina e

1-antitripsina,ă g-1PI e IGFBP-1 (URIA, LÓPEZ-OTÍN, 2000; NABESHIMA et al.,

2002). Adicionalmente, a MMP-26 é capaz de ativar a pró-MMP-9 em um sítio que

determina a formação de uma forma ativa de gelatinase B mais estável do que quando

ativada por outras MMPs, como a MMP-7 (ZHAO et al., 2003; AHOKAS et al., 2005).

Bioquimicamente, a MMP-26 distingue-se das outras MMPs em diversos

aspectos. Dentre as características peculiares, destaca-se sua estrutura mínima, em

virtude da inexistência do domínio Hemopexina-C terminal, essencial para a regulação

da atividade e determinação da especificidade de substratos para esta protease

(FOLGUERAS et al., 2004; STRONGIN, 2006). Adicionalmente, apesar de seu peso

molecular semelhante ao da MMP-7, estas duas proteases compartilham apenas 40% de

homologia em suas cadeias polipeptídicas (STRONGIN, 2006).

Um achado único para a MMP-26 está localizado no domínio catalítico desta

enzima. A manutenção das MMPs como zimogênios depende da interação entre o íon

zinco e um resíduo de cisteína, impedindo a entrada de uma molécula de água,

49

necessária à ativação da protease. Exclusivamente para a matrilisina-2, observa-se uma

modificação constitutiva no sítio catalítico, caracterizada pela substituição do

aminoácido arginina (Arg81) por histidina (His81), culminando com o favorecimento da

ativação autocatalítica desta MMP (MARCHENKO et al., 2001).

Uría, López-Otín (2000) e Park et al. (2002) destacam que a MMP-26 encontra-

se expressa em diversas linhagens celulares neoplásicas, como adenocarcinomas de

mama, pulmão e próstata, com um nível significativo de expressão em tecidos normais

sendo evidenciado apenas em útero e placenta. Para estes autores, a expressão limitada

desta matrilisina em tecido normal sugere que a síntese desta protease deva estar

regulada para eventos estritamente específicos, como o processo de implantação no

útero.

Strongin (2006), detalhando a estrutura do gene da MMP-26, descreve que sua

estrutura de exons e introns apresenta-se semelhante ao do gene da MMP-7, bem como,

diferentemente de outros genes responsáveis pela codificação de outras MMPs, a região

do promotor do gene da MMP-26 apresenta apenas poucos sítios de ligação para fatores

de transcrição.

Diversos estudos descrevem a existência de uma estrutura extremamente simples

e bastante regulada, na região do promotor do gene da MMP-26 (MARCHENKO et al.,

2002; LI et al., 2004). Esta regulação está representada pela presença dos sítios de

ligação AP-1 (alvo da via de sinalização c-Jun/ c-Fos/ Ras), Tcf4 ou LEF

(respectivamente, alvo da via de sinalização -catenina/WNT) e Poly (A), situado

upstream ao promotor do gene (MARCHENKO et al., 2004; STRONGIN, 2006).

Marchenko et al. (2004) afirmam que a presença do sítio de ligação Tcf4 no promotor

do gene da MMP-26 implica sua expressão majoritária em células epiteliais normais ou

transformadas neoplasicamente, de forma semelhante ao descrito para a MMP-7.

Ahokas et al. (2005) enfatizam, ainda, que a expressão de MMP-26 está

relacionada ao processo de reparo. Em estudo de biologia molecular e imuno-

histoquímica, em culturas de células epiteliais normais e neoplásicas da epiderme, estes

autores evidenciaram aumento da expressão de matrilisina-2 quando da interrupção de

continuidade da MB, durante o processo de reparo e invasão neoplásica.

Adicionalmente, estes pesquisadores verificaram diminuição da expressão de MMP-26

em carcinomas epidermóides pouco diferenciados, sugerindo que a ausência de

imunorreatividade para matrilisina-2 poderia ser considerada como marcador para

lesões com crescimento agressivo.

50

2.4.3 Regulação das metaloproteinases da matriz e seus inibidores teciduais

Estudos mais recentes indicam que além de degradar os componentes da MEC

as MMPs podem agir em outros componentes desta matriz como citocinas, quimiocinas,

fatores de crescimento, receptores de superfície celular e moléculas de adesão

(CHAKRABORTI et al., 2003). Desta forma, as MMPs podem afetar o comportamento

celular de várias maneiras: a clivagem de produtos por estas proteinases sinalizam de

forma autócrina ou parácrina, elas clivam junções intercelulares ou a membrana celular

regulando a arquitetura do tecido epitelial e, além disso, ativam a ação latente e

desativam a ação de moléculas de sinalização ativa. Interações célula-matriz disparam a

sinalização celular que promove a diferenciação celular, migração e mobilização,

essencial para homeostase celular normal. Com exceção das MMP-2, -7, -19 e -28 que

são constitutivamente expressas no tecido normal, muitas MMPs são induzidas somente

em processos de reparação, remodelação ou em resposta a várias doenças ou inflamação

(RA, PARKS, 2007). Segundo relatam Souza e Line (2002) e Folgueras et al. (2004),

apesar da complexidade da regulação da atividade biológica das MMPs, três níveis

endógenos principais merecem destaque: transcrição gênica, ativação pró-enzimática e

inibição da atividade enzimática, os quais, em conjunto, são responsáveis pelo

confinamento da atividade das MMPs em sítios e situações biologicamente necessárias.

A migração celular é freqüentemente facilitada por uma destruição parcial da

MEC adjacente, catalizada por MMPs, cuja atividade é controlada por expressão

regulada, por ativação proteolítica de precursores inativos (zimogênio) e pela expressão

de uma família de inibidores (BRAKEBUSH et al., 2002).

Dentre os principais mecanismos de regulação da atividade biológica das

MMPs, destacam-se os inibidores endógenos, alguns dos quais se mostram como

inibidores de proteases em geral, como a 2-macroglobulina, responsável pela

inativação das MMPs no plasma e em outros fluidos tissulares, enquanto outros, como

os TIMPs, exibem maior especificidade (BREW et al., 2000; CURRAN, MURRAY,

2000; FOLGUERAS et al., 2004).

Os TIMPs consistem em uma família de quatro proteínas secretadas (TIMPs -1,

-2, -3 e -4), com peso molecular variando entre 20 - 29kDa, capazes de inibir

reversivelmente as MMPs. Estes inibidores enzimáticos compartilham uma estrutura

gênica conservada e 12 resíduos de cisteína separados de forma similar, associados por

51

pontes dissulfeto, responsáveis pela estrutura de seis alças e dois domínios observada

nestas moléculas. (STERNLICHT, WERB, 2001; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).

Estudos demonstram que os TIMPs diferem quanto a sua habilidade de inibição

das MMPs. Estes inibidores teciduais podem inibir todas as MMPs ativas, mas não com

a mesma eficácia. O TIMP-1, por exemplo, inibe preferencialmente as MMPs -1, -3 -7 e

-9. Porém, esta proteína tem-se mostrado um fraco inibidor de MT3-MMP e MMP-19,

formando complexos com formas pró-enzimáticas de MMP-9, de modo a inibir a

ativação desta gelatinase (SOUZA, LINE, 2002; STERNLICHT, WERB, 2001;

FRIDMAN et al., 2003; MOOK et al., 2004; BOURBOULIA, STETLER-

STEVENSON, 2010). O TIMP-2 é o único membro da família destes inibidores que

interage especificamente na superfície celular tanto com a MT1-MMP como com a pró-

MMP-2 de modo a facilitar a ativação desta gelatinase. Desta forma, o TIMP-2 é o

único que funciona como inibidor e ativador de MMP, além de ser o mais eficaz

inibidor da MMP-2. O TIMP-3 inibe as MMPs-2 e -9. O TIMP-4 inibe a atividade

catalítica das MT1-MMP e MMP-2 além de ser considerado um forte inibidor da MMP-

26 (BISTER et al., 2007; BOURBOULIA, STETLER-STEVENSON, 2010).

Brew et al. (2000) ressaltam que os estudos ultra-estruturais que se propõem a

esclarecer as características de alta afinidade e especificidade, evidenciadas nos

complexos MMPs/TIMPs, limitam-se principalmente à região do domínio catalítico,

com as interações no domínio hemopexina C-terminal e no pró-domínio permanecendo

obscuras. Dessa forma, os autores destacam que a compreensão das bases estruturais,

responsáveis pelas múltiplas ações dos TIMPs, somente serão devidamente esclarecidas

com a análise detalhada de todas as regiões dos complexos MMPs/TIMPs.

O equilíbrio entre a síntese de MMPs e TIMPs representa um ponto crítico na

manutenção da homeostasia da MEC, já que diversos processos patológicos revelam

taxas alteradas na síntese destes complexos enzimáticos e de seus respectivos

inibidores. Porém, além de regular as atividades proteolíticas mediadas pelas MMPs,

nos últimos anos, novas atividades biológicas foram atribuídas aos TIMPs. Estudos

revelaram que independentemente da sua ação inibitória sobre as MMPs, estas proteínas

estão envolvidas em processos de diferenciação celular, crescimento, migração, invasão,

angiogênese e apoptose (SEO et al., 2003; STETLER-STEVENSON, 2008; BREW,

NAGASE, 2010).

Neste contexto, o trabalho de Wingfield et al. (1999), ressalta o potencial destes

inibidores em estimular o crescimento celular. Os autores observaram que formas

52

recombinantes de TIMPs humanos, produzidos em Escherichia coli, nos quais se

eliminou a capacidade inibidora de MMPs, exibiam atividade mitogênica, sugerindo

que esta função biológica poderia ser desempenhada pela porção C-terminal.

Alguns estudos descrevem uma interação complementar entre os processos de

degradação da MEC, desempenhado pelas MMPs e adesão celular, necessários à

promoção da invasão tumoral. Evidências apontam para a existência de um processo

altamente complexo e coordenado entre estas proteases, os TIMPs e as moléculas de

adesão celulares, para que ocorra o deslocamento de células neoplásicas através da

MEC (CURRAN, MURRAY, 2000; BJÖRKLUND, KOIVUNEN, 2005;

BOURBOULIA, STETLER-STEVENSON, 2010)

Sobre este tópico, destacam-se as considerações realizadas por Sternlicht e Werb

(2001), os quais enfatizam o conceito de localização pericelular da atividade

proteolítica, caracterizado por diversos mecanismos que confinam ou concentram as

proteinases no microambiente pericelular, determinando aumento da ativação das

MMPs, limitação do acesso de inibidores das MMPs, concentração destas enzimas na

proximidade de seus alvos, bem como, limitação da proteólise. Dentre os mecanismos

de concentração de MMPs na superfície celular merecem destaque a presença de

receptores para enzimas que ativam MMPs, como trombina, elastase, plasmina,

uroquinase ativadora de plasminogênio e a ligação de MMPs a receptores de superfície

celular, como as integrinas.

Adicionalmente, conforme observaram Wolf et al. (2003), células neoplásicas

malignas, como as linhagens celulares de fibrossarcoma (HT-1080) e de carcinoma de

mama (MDA-MB-231), são capazes de realizar deslocamento através da MEC, por

meio de mecanismos independentes da interação integrinas/MMPs. Utilizando modelos

experimentais em matrizes artificiais de colágeno 3D e em ratos, com reconstrução

através de microscopia a laser confocal, estes autores verificaram que após inibição da

atividade proteolítica, exemplares destas linhagens celulares exibiram o que foi

denominado de transição mesenquimal-amebóide, caracterizado por alterações

conformacionais semelhantes à ameba, realizando movimentos de propulsão e

constrição através de fendas pré-existentes nas MECs, na ausência de degradação

proteolítica.

53

2.4.4 Metaloproteinases da matriz e inibidores teciduais de metaloproteinases em

tumores de glândulas salivares

Conforme já descrito anteriormente, as várias funções desempenhadas por

MMPs e TIMPs tanto em situações fisiológicas como em diversas condições

patológicas já são conhecidas, mas, pouco se sabe a respeito de sua participação em

tumores de glândulas salivares. No entanto, alguns estudos já foram realizados,

conforme descrito na literatura.

Kayano et al. (2004) avaliaram os níveis de produção de oito diferentes MMPs

(MMPs-1, -2, -3, -7, -8, -9, -13 e MT1-MMP) e dois TIMPs (-1 e -2) em homogenados

de carcinomas de glândulas salivares (carcinoma mucoepidermóide, carcinoma

adenóide cístico e adenocarcinoma) e tecido de glândula salivar normal como controle.

Os autores verificaram que os níveis de MMPs (-1, -2 , -13 e MT1-MMP) e TIMP-1

foram significativamente maiores nas lesões malignas do que nos controles (p0,05). O

exame de zimografia demonstrou que a taxa de ativação da Pro-MMP-2 era maior nos

carcinomas em comparação ao grupo controle (p0,05). Foi possível identificar que tal

taxa de ativação era significativamente mais elevada nos carcinomas

mucoepidermóides, em comparação aos CACs e adenocarcinomas (p0,01) e que estava

correlacionada com gradação histológica e metástase linfonodal nos carcinomas

mucoepidermóides (p0,05). Embora os níveis de produção de Pro-MMP-2 e MT1-

MMP tenham sido semelhantes entre os carcinomas, os níveis de TIMP-2 foram

significativamente maiores nos CACs e adenocarcinomas (p<0,01). A imuno-

histoquímica e a zimografia in situ demonstraram a localização da MMP-2, MT1-MMP

e TIMP-2 nas células dos carcinomas. Contudo, apenas nos carcinomas

mucoepidermóides as células epiteliais neoplásicas revelavam atividade gelatinolítica.

Estes resultados sugerem que a ativação aumentada da Pro-MMP-2 mediada por MT1-

MMP está implicada nos processos de invasão e metástases nos carcinomas

mucoepidermóides e que TIMP-2 pode regular a ativação de Pro-MMP-2 em

carcinomas de glândulas salivares.

Nagel et al. (2004) investigaram a expressão das MMPs -2 e -9 e dos TIMPs-1,

-2 e -3 em 20 tumores malignos (8 carcinomas mucoepidermóides, 5 carcinomas de

células acinares, 3 carcinomas ex-adenoma pleomórfico, 2 carcinomas adenóides

císticos, 1 adenocarcinoma de células basais e 1 adenocarcinoma polimorfo de baixo

54

grau) e 6 neoplasias benignas de glândulas salivares (4 adenomas pleomórficos e 2

mioepiteliomas), por meio da imuno-histoquímica e zimografia. Na análise imuno-

histoquímica foi evidenciada que o epitélio do ducto salivar normal, mas não as células

acinares, expressou de moderado a fortemente as MMPs -2 e -9 e os TIMPs -1 e -2. Em

contraste, neste mesmo epitélio, o TIMP-3 foi moderadamente ou fortemente expresso

nas células acinares normais. O exame de zimografia demonstrou que as MMPs -2 e -9

imunoexpressas nas células do ducto estavam ativas, porém, nenhuma atividade dessas

enzimas pode ser demonstrada em condições normais das células acinares. Nos

carcinomas mucoepidermóides o padrão de expressão das MMPs e TIMPs variou entre

os diferentes tipos de células tumorais. Enquanto as células produtoras de muco

mostraram negativa ou fraca imunomarcação, uma maior expressão para as MMP-2 e -9

foi evidenciada em células intermediárias e células epidermóides, achado este

confirmado pela zimografia in situ. Foi evidenciado também que a imunomarcação da

MMP-2 foi significativamente mais alta em tumores malignos que em adenomas

(p=0,0028). Os autores constataram, ainda, que em carcinomas de glândulas salivares,

os desequilíbrios na proporção entre MMPs e TIMPs são causados pela regulação

positiva de MMPs e não pela regulação negativa de TIMPs.

Chen et al. (2005) estudaram a expressão de MMPs e TIMPs em APs e a relação

entre esta expressão e o comportamento biológico destes tumores, dividindo-os em tipo

ativo e tipo comum de acordo com este comportamento. Realizaram imuno-

histoquímica para as MMPs -2 e -9, TIMPs -1 e -2 e análise zimográfica nos 23 casos

de AP além de 6 tumores malignos e 6 benignos. Os resultados demonstraram que a

imunorreatividade da proteína MMP-2 e a relação MMP-2/TIMPs-1 e -2 foi

significantemente alta quando comparados os APs ativos com os comuns

(respectivamente p=0,028, p=0,009, p=0,040). A expressão da MMP-2 ativa, proMMP-

9 e MMP-9 ativa foi significantemente alta nos APs ativos quando comparados aos

comuns (respectivamente p=0,034, p=0,021, p=0,001). Não foi demonstrado diferença

significativa na expressão de MMP-2, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2 entre os tumores

malignos de glândula salivar e AP ativo, bem como entre os tumores benignos e o AP

comum. Os autores concluíram que a expressão das MMPs e TIMPs em APs ativos é

semelhante aos carcinomas salivares. A expressão em APs comuns era semelhante a

apresentada pelos tumores benignos e ainda que a expressão da MMP-2,-9 e TIMP-1,-2

estão relacionadas com o comportamento biológico dos APs.

55

Hu et al. (2005) estudaram a expressão da MMP-2 e da E-caderina em

carcinoma mucoepidermóide salivar e sua relação com estágios clínicos, gradação

patológica, metástase em linfonodos e prognóstico utilizando espécimes deste tumor e

de tecido normal de glândula salivar. Verificaram que houve aumento de expressão da

MMP-2 e redução ou ausência de expressão de E-caderina nos tumores quando

comparados com o tecido normal. A expressão da MMP-2 e da E-caderina foi

fortemente correlacionada com metástase linfonodal. A MMP-2 foi correlacionada

positivamente com o prognóstico do carcinoma mucoepidermóide enquanto a E-

caderina foi negativamente correlacionada. Os autores concluíram que a expressão da

MMP-2 e da E-caderina, estão correlacionadas com metástase e ainda que a expressão

desta metaloproteinase apresenta relação com prognóstico do carcinoma

mucoepidermóide.

Tian et al. (2005) investigaram a expressão das MMPs e TIMPs por meio da

imuno-histoquímica e zimografia em várias neoplasias de glândulas salivares e seu

papel na invasão e metástase de tumores malignos, analisando as MMPs (-2, -9 e Mti-

MMP), TIMPs (-1 e -2) em 26 casos de lesões malignas e 28 benignas. Verificaram que

a expressão das MMPs-2 e -9 foi significantemente mais alta em carcinomas do que em

adenomas (p0,05). As relações MMP-2/TIMP-1 e MMP-2/TIMP-2 também foram

altamente significantes nos tumores malignos quando comparados com os benignos.

Concluíram que as MMPs -2 e -9 têm um importante papel na invasão de tumores

malignos de glândula salivar sendo detectado distúrbios no balanço entre estas

gelatinases e os TIMPs -1 e -2 em tumores malignos de glândula salivar induzido pelo

aumento absoluto destas duas metaloproteinases.

Wang et al. (2005) avaliaram a expressão do mRNA e dos TIMPs -1 e -2 em

diferentes padrões histológicos de 04 casos de CAC, utilizando microdissecção por

laser, RT-PCR (do inglês real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain

reaction) e imuno-histoquímica. A análise imuno-histoquímica evidenciou uma

marcação positiva para os TIMPs -1 e -2 tanto no padrão cribriforme como no tubular.

Os dois TIMPs foram expressos em quase todas as células do padrão tubular.

Entretanto, no padrão cribriforme algumas células em áreas periféricas dos pseudocistos

foram negativas ou fracamente expressas para os referidos TIMPs. Além disso, muitas

células mioepiteliais modificadas, do padrão cribriforme, foram positivas para os TIMP-

1 e -2. A expressão dos TIMPs no padrão tubular foi maior do que no padrão

cribriforme (p<0,05). Os resultados do estudo indicaram que existe uma estreita relação

56

entre a expressão dos TIMPs -1 e -2 e os padrões de crescimento dos CACs, e que estes

podem desempenhar papéis importantes na morfogênese e no comportamento biológico

desses tumores.

Westernoff et al. (2005) avaliaram a expressão imuno-histoquímica da integrina

-6, tenascina-C e MMP-1 em 19 casos de CAC, 18 casos de adenocarcinoma

polimorfo de baixo grau e 18 casos de AP. Os resultados mostraram que os tumores

malignos apresentaram uma maior expressão da integrina -6 quando comparados aos

tumores benignos. Os CACs apresentaram uma expressão significativamente mais

elevada de integrina -6 quando comparado aos APs (p=0,04). Não houve diferença

significativa na expressão desta proteína entre os casos de CACs e adenocarcinomas

polimorfos de baixo grau. Os APs apresentavam uma elevada expressão da tenascina-C

e uma diferença significativa em relação aos CACs (p=0,03). A maioria dos casos, nos

três tipos de tumores avaliados, apresentaram uma alta expressão da MMP-1, entretanto,

esta expressão foi significativamente maior nos APs quando comparados com os CACs

(p=0,008). Os autores concluíram que os CACs e os adenocarcinomas polimorfos de

baixo grau expressaram integrina -6, tenascina-C e MMP-1, mas os padrões de

expressão nestes tumores não são significativamente diferentes. A integrina -6 parece

ser mais estreitamente associada aos tumores malignos, enquanto a MMP-1 mais

relacionada aos tumores benignos. Os autores sugerem ainda que a integrina -6, a

tenascina-C e a MMP-1 são parte do repertório molecular utilizado pelos tumores

malignos salivares para a invasão e pelos benignos para a sua expansão.

Nascimento (2006) analisou a expressão imuno-histoquímica das MMPs-7 e -26

em 12 casos de APs de glândulas salivares menores, e em 11 amostras de tecido

glandular salivar menor em desenvolvimento e adulto. Nas glândulas primitivas (GPs),

a expressão das MMPs ocorreu, preferencialmente, nos ductos em formação e MB

adjacente e, nas glândulas adultas (GAs), apenas nos ductos. Entre as GPs e GAs, a

expressão destas matrilisinas foi similar (p=0,867), embora, percentualmente, a MMP-7

tenha sido mais expressa nas GPs e a MMP-26 nas GAs. Quando comparadas as GPs e

GAs, os APs exibiram marcação mais intensa para as MMPs (p<0,001),

independentemente do tipo estromal, sendo a MMP-7 mais imunomarcada que a MMP-

26 (p=0,045). A expressão destas duas matrilinas não foi correlacionada ao se analisar,

individualmente, o tecido glandular normal (GPs e GAs) e os APs (p=0,50), porém, foi

observada uma correlação dos imunoescores da MMP-7 (p<0,001) e MMP-26

57

(p<0,001) entre os tecidos estudados. Assim, o autor concluiu que a expressão imuno-

histoquímica das MMPs -7 e -26 encontra-se implicada no desenvolvimento do tecido

glandular salivar normal e na sua transformação neoplásica em AP.

De Vicente et al. (2008) analisaram a expressão imuno-histoquímica da MMP-9

e o seu papel como marcador de prognóstico em 27 casos de tumores malignos de alto

grau de glândula salivar (12 carcinomas adenóides císticos, 8 carcinomas

indiferenciados e 7 tumores mistos malignos). Os resultados indicaram que a

imunomarcação para MMP-9 foi observada em 17 casos, localizadas

predominantemente nas células tumorais e, ocasionalmente, nas células inflamatórias do

estroma. Nos CACs a imunomarcação citoplasmática para a MMP-9 foi evidenciada de

forma mais proeminente em áreas de padrão sólido do que nas áreas de padrão

cribriforme. A expressão da MMP-9 foi correlacionada com os componentes do sistema

TNM, com o N (p = 0,04), M (p = 0,02), e os estágios TNM (p=0,03). A expressão da

MMP-9 foi também relacionada com a redução da sobrevida (p=0,01). Os autores

concluíram que a invasão tumoral e o prognóstico nos casos de cânceres de glândula

salivar de alto grau podem depender do perfil de expressão da MMP-9.

Luukkaa et al. (2008) analisaram a expressão imuno-histoquímica das MMPs-1,

-9 e -13 em 103 casos de TGS (48 casos de carcinoma adenóide cístico, 22 casos de

carcinoma de células acinares, 21 casos de carcinoma mucoepidermóide e 12 casos de

carcinoma do ducto salivar) e correlacionaram os achados com os dados clínicos e a

taxa de sobrevida de 10 anos dos pacientes. Os resultados indicaram que a elevada

expressão da MMP-13 (p=0,05) foi preditiva para uma pior sobrevida dos pacientes,

especialmente naqueles com diagnóstico de carcinoma de células acinares. A elevada

expressão da MMP-9 nos CACs bem como nos carcinomas do ducto salivar também foi

relacionada com a menor sobrevida (respectivamente, p=0,06 e p=0,05). A alta

expressão da MMP-1 (p=0,06) nos TGS estudados, incluindo o CAC, foi associada a

uma maior sobrevida global dos pacientes. Para estes autores, embora as MMP-13 e

MMP-1 possam clivar o colágeno fibrilar, a primeira apresenta uma maior

especificidade do substrato quando comparada a MMP-1. Os resultados indicaram que

assim como a MMP-9, a MMP-13 também pode efetivamente decompor componentes

da MB. Com base nesses resultados, os autores sugerem que tanto a MMP-13 como

MMP-9 podem promover a invasão das células tumorais em TGS através da clivagem

58

de componentes da MB em contraste com a MMP-1 que cliva principalmente o

colágeno tipo I.

Zhang et al. (2009) estudaram a expressão do mRNA, das MMPs (-2 e -9) e

TIMPs (-1 e -2) no epitélio e estroma de seis casos de AP, utilizando microdissecção

por laser, RT-PCR e imuno-histoquímica. A análise imuno-histoquímica evidenciou

uma forte expressão citoplasmática das MMPs (-2 e -9) e TIMPs (-1 e -2)

principalmente nas células epiteliais, de forma proeminente nas estruturas ductiformes,

cordões, pequenos ninhos e em áreas de metaplasia escamosa. Nas estruturas

ductiformes, a MMP-9 foi fracamente expressa na membrana das células luminais e

altamente expressa na MB. Na glândula salivar normal, as células ductais expressaram

fortemente as MMPs (-2 e -9) e TIMPs (-1 e -2). Diferentemente das células ductais, as

células acinares não expressam estas gelatinases e TIMPs. Segundo os autores, as

principais conclusões deste estudo são que os níveis de expressão de RNAm e das

MMPs (-2 e -9) foram significativamente maiores nas células mioepiteliais incluídas no

estroma tumoral quando comparado ao epitélio ductal, o que os levou a especular que

estas gelatinases são produzidas principalmente pelas células mioepiteliais localizadas

no estroma tumoral. Desta forma, os resultados deste estudo sugerem ser estas células

mioepiteliais uma fonte primária de produção de gelatinases nos APs, bem como que o

estroma talvez tenha um papel crítico no desenvolvimento e/ou progressão destes

tumores.

Luukkaa et al. (2010) estudaram a expressão imuno-histoquímica das MMPs -1,

-7, -9, -13, do Ki-67 e HER-2, bem como a amplificação gênica do HER-2 por SISH

(do inglês, silver enhanced in situ hybridization) em uma série de 12 casos de

carcinoma epitelial/mioepitelial e os achados relacionados com a taxa de sobrevida dos

pacientes. Os resultados do estudo indicaram que apesar da expressão destas MMPs ser

alta tanto nas células epiteliais quanto mioepiteliais, apenas a expressão da MMP-9 foi

estaticamente relacionada à taxa de sobrevida específica a doença (p=0,0327). Além

disso, a expressão do Ki-67 também pode ser correlacionada com o prognóstico,

diferentemente do HER-2 que não ofereceu informações adicionais como fator

prognóstico para os tumores estudados.

Luukkaa et al. (2010) estudaram a expressão imuno-histoquímica da MMP -7

em 107 casos de TGS (47 carcinomas adenóides císticos, 23 carcinomas

mucoepidermóides, 24 carcinomas de células acinares e 13 carcinomas do ducto

salivar), e os achados relacionados a taxa de sobrevida dos pacientes. Os resultados

59

indicaram que a intensidade de imunomarcação foi fraca no carcinoma do ducto salivar

e alta nos CACs, enquanto que o percentual de células imunomarcadas foi baixo no

carcinoma de células acinares e alta no carcinoma do ducto salivar. Os pacientes com

CAC apresentaram uma pior taxa total de sobrevida quando comparados aqueles com

carcinoma de células acinares. Além disso, a baixa intensidade de marcação da MMP-7

foi associada com a pior taxa de sobrevida total dos pacientes com carcinoma de células

acinares e mucoepidermóide, sugerindo que esta matrilisina pode ser usada como fator

prognóstico para avaliação dos pacientes com TGS.

PROPOSIÇÃO

61

3 PROPOSIÇÃO

Embora pesquisas tenham sido realizadas analisando a expressão das MMPs e

TIMPs em diversos processos fisiológicos e patológicos, incluindo estudos envolvendo a

morfogênese de glândulas salivares e processos de invasão e metástase em diversos tipos

de tumores, poucos se têm pesquisado sobre as MMPs e TIMPs em neoplasias de

glândulas salivares.

Sendo assim, o propósito desta pesquisa foi analisar a expressão imuno-histoquimica

das MMPs -2, -7, -9 e -26 e dos TIMPs-1 e -2, em casos de adenoma pleomórfico e

carcinoma adenóide cístico de glândula salivar menor com o objetivo de melhor

compreender o papel que estas proteínas exercem no comportamento biológico destes

tumores.

MATERIAL E MÉTODOS

63

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Implicações éticas

O projeto de pesquisa referente a este trabalho de tese foi enviado para apreciação do

Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e aprovado

segundo o protocolo 064/08-CEP-UFRN e parecer de número 203/2008 (Anexo).

4.2 Caracterização do estudo

O presente estudo consistiu em uma análise descritiva, semi-quantitativa e

comparativa da expressão imuno-histoquímica das MMPs -2, -7, -9 e -26 e TIMPs-1 e -2

em espécimes de APs e CACs de glândulas salivares.

4.3 População

A população objeto do presente estudo foi constituída por todos os casos de APs e

CACs de glândulas salivares arquivados e diagnosticados no Laboratório do Serviço de

Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

4.4 Amostra

A amostra foi constituída por 20 casos de AP e 20 casos de CAC de glândulas

salivares, todos emblocados em parafina, obtidos nos arquivos do laboratório do Serviço

acima citado. Os critérios determinados para inclusão de casos na amostra foram à

quantidade de material arquivado suficiente para o estudo e as condições adequadas de

armazenamento dos espécimes.

4.5 Estudo morfológico

Para o estudo morfológico foram utilizadas lâminas contendo cortes de 5m de espessura do

material incluído em parafina, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina (H/E) e,

posteriormente, examinados à microscopia de luz. Foi realizada uma análise descritiva dos

aspectos histopatológicos observados nos APs, observando-se aspectos como arranjo

arquitetural das células epiteliais e mioepiteliais no parênquima tumoral, o tipo de célula

neoplásica proliferante e estroma (hialino, fibroso, mixóide ou condróide) predominantes, os

tipos de diferenciação, bem como a presença ou ausência de cápsula fibrosa e infiltração focal

64

de células neoplásicas em sua parede (EVESON et al., 2005). Além disso, os APs foram

classificados histologicamente, conforme metodologia adaptada do estudo de Seifert et al.

(1976), com base na diferenciação das células epiteliais e na quantidade e natureza do estroma

nos subtipos clássico, mixóide e celular. No subtipo clássico havia uma quantidade

equilibrada entre as células epiteliais e o componente estromal, com a presença de 30-50% de

estroma. No subtipo mixóide (rico em estroma) o componente estromal consistia em cerca de

80% do tumor. No subtipo celular (rico em células) o estroma correspondia a uma quantidade

menor ou igual a 20-30% do tumor.

Nos casos dos CACs foi avaliado o padrão histológico predominante, ou seja, cribriforme,

tubular ou sólido e a presença de invasão perineural e das estruturas adjacentes (EL-

NAGGAR, HUVOS, 2005).

4.6 Estudo imuno-histoquímico

Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3m de espessura e estendidos

em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de Organosilano (3-

aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Posteriormente, o

material foi submetido à técnica da imunoperoxidase sendo utilizados os anticorpos

monoclonais anti-MMPs-2, -7, -9, e anti-TIMPs-1 e -2, e anticorpo policlonal anti-MMP-26

(Quadro 1).

Como controles positivos para os anticorpos anti-MMPs-7 e anti-TIMPs-1 e -2, foram

empregados espécimes de carcinoma ovariano. Para MMP-26, foram empregados espécimes

de carcinoma endometrial. Com relação aos anticorpos anti-MMPs-2 e -9, foram utilizados

como controle positivo, espécimes de intestino grosso inflamado. O controle negativo

consistiu na substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino a 1 % (BSA –

Bovine Serum Albumin) em solução tampão. Os demais passos foram semelhantes a técnica a

seguir descrita:

A desparafinização dos cortes foi realizada por meio de dois banhos em xilol durante

10 minutos cada em temperatura ambiente;

Reidratação dos cortes em banhos de etanóis em concentrações decrescentes: álcool

etílico absoluto I (5 minutos); álcool etílico absoluto II (5 minutos); álcool etílico absoluto III

(5 minutos); álcool etílico 95° GL (5 minutos); e álcool etílico 80° GL (5 minutos);

65

Imersão em solução de hidróxido de amônia a 10% por 10 minutos, com a finalidade

de remoção do pigmento formólico;

Lavagem dos cortes em água corrente por 10 minutos e duas passagens por água

destilada deionizada;

Recuperação antigênica (Quadro 1);

Lavagem em água corrente por 10 minutos;

Imersão dos cortes em água destilada por duas vezes, com tempo de 5 minutos cada;

Duas incubações dos cortes, durante 10 minutos cada, em solução de peróxido de

hidrogênio a 10 volumes, com a finalidade de remover a peroxidase endógena e assim reduzir

a marcação de fundo;

Lavagem em água corrente durante 10 minutos;

Duas imersões em água destilada, com tempo de 5 minutos cada;

Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl [0,0499 mol/l] (tris-hidroximetil-

aminometano, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) com NaCl [0,1454 mol/l] pH 7,4 por 5

minutos cada;

Incubação dos cortes com os anticorpos primários (Quadro 1) diluídos em solução

diluente Dako (Antibody diluent with background reducing components; Dako, A/S, Glostrup,

Dinamarca);

Duas passagens em solução Tween 20 a 1% em TRIS-HCl (pH 7.4) por 5 minutos

cada;

Incubação por 30 minutos no reagente do sistema Envision + Dual Link System-HRP

(Dako Cytomation, Code: K4061-Carpinteria – CA-USA) durante 30 minutos à temperatura

ambiente;

Duas passagens em solução Tween 20 a 1% em TRIS-HCl (pH 7.4) por 5 minutos

cada;

Incubação em duas trocas de TRIS-HCl (pH 7.4) por 5 minutos cada;

Diluição de 0.025 a .0.30 mg de diaminobenzidina (3,3-diaminobenzidina, Sigma

Chemical Co, St. Louis, MO, USA) em 100 ml de TRIS-HCl (pH 7.4), com posterior ativação

66

pelo peróxido de hidrogênio a 10 volumes (120 µl) e aplicação imediata nos cortes por 2

minutos em câmara escura;

Lavagem em água corrente por 10 minutos, seguido por duas passagens em água

destilada;

Contracoloração através de banho em hematoxilina de Mayer por 10 minutos em

temperatura ambiente;

Desidratação em série de etanóis em concentrações ascendentes: álcool etílico 80° GL

(3 minutos); álcool etílico 95° GL (3 minutos); álcool etílico absoluto I (3 minutos); álcool

etílico absoluto II (3 minutos); e álcool etílico absoluto III (3 minutos);

Imersão dos cortes em dois banhos de xilol por 2 minutos cada;

Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) e lamínula

para observação ao microscópio de luz.

Quadro 1. Clone, especificidade, diluição, fonte, recuperação antigênica e tempo de incubação

dos anticorpos utilizados.

Clone Especificidade Diluição Fonte Recuperação Antigênica

Tempo de

Incubação

42-5D11 MMP-2 1:100 Chemicon,

Temecula,CA

EDTA (pH 8.0) em steamer por 30

minutos

60 minutos

ID-2 MMP-7 1:200 Chemicon,

Temecula,CA

Pepsina pH 1,8 a 0,5%, em estufa a

37ºC por 30 minutos

60 minutos

56-2A4 MMP-9 1:20 Chemicon,

Temecula,CA

Citrato (pH 6.0) em steamer por 30

minutos

Overnight

(18 horas)

AHP756 MMP-26 1:250 Serotec,

Oxford, UK

Pepsina pH 1,8 a 0,5%, em estufa a

37ºC por 30 minutos

60 minutos

102D1

TIMP-1 1:50 Chemicon,

Temecula,CA EDTA (pH 8.0)

Pascal 60 minutos

3A4

TIMP-2 1:50

Diagnostic Biosystems Pleasanton,

CA

EDTA (pH 8.0) Pascal

60 minutos

67

4.7 Análise do perfil imuno-histoquímico

Após o processamento histológico e tratamento imuno-histoquímico, foram avaliadas

as características do padrão de expressão das MMPs e TIMPs estudados, no parênquima dos

APs e CACs, quanto a presença ou ausência, intensidade e localização. A marcação positiva

foi considerada quando presente uma coloração distinta em marrom (castanho), em sítio de

expressão citoplasmático, característico destes marcadores, em contraposição ao azul violeta

da contra-coloração.

Para análise dos marcadores estudados, sob um aumento total de 400X foram

capturadas imagens em 5 campos histológicos de maior intensidade de marcação de cada um

dos espécimes, por meio de máquina fotográfica digital OLYMPUS E-330 (Olympus

Corporation – Tokyo, Japan), acoplada ao microscópio OLYMPUS CX41 (Olympus

Corporation – Tokyo, Japan). As imagens obtidas foram analisadas por um único observador,

em momentos distintos, utilizando o software ImageJ (Image and Processing Analysis in Java

– Rasband, W.S., Image J, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA). A

intensidade de marcação foi obtida para cada espécime utilizando um escore semi-quantitativo

baseado no percentual de células positivas e na intensidade de coloração. O percentual de

células positivas permitiu gerar um escore de 0 a 3 pontos (Quadro 2) e a intensidade de

coloração, um outro escore, também de 0 a 3 pontos (Quadro 3). O produto destes escores

resultou no imunoescore final, variando entre 0 e 9 pontos, sendo 0 marcação negativa e 9 o

maior escore, conforme metodologia adaptada dos estudos de Nagel et al. (2004) e Luukkaa

et al. (2010).

Quadro 2. Análise da imunoexpressão nos espécimes de adenoma pleomórfico e carcinoma

adenóide cístico, baseado no percentual de células imunopositivas.

Escore Percentual de células positivas

0 0

1 五ă10ă%

2 10 a 50 %

3 互ă50ă%

68

Quadro 3. Análise da imunoexpressão nos espécimes de adenoma pleomórfico e carcinoma

adenóide cístico, baseado na intensidade de coloração.

Escore Intensidade de marcação

0 negativa

1 fraca

2 moderada

3 forte

4.8 Análise estatística

Uma vez realizadas as análises morfológicas e imuno-histoquímicas, os dados obtidos

foram lançados em um banco de dados utilizando o software SPSS 17.0 for Windows

(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, EUA) para a análise estatística.

A análise das diferenças entre as médias de idade observadas nos APs e CACs foi

realizada com o emprego do teste t de Student. A análise de associação entre o tipo de tumor e

a localização anatômica foi realizada através do Teste da Razão de Verossimilhança.

Considerando que a intensidade de marcação, avaliada mediante escores, é uma variável

ordinal, foi realizada uma análise não paramétrica. Para comparar a diferença da intensidade

de marcação (escores) para cada MMP e TIMP entre os tumores estudados foi utilizado o

teste de Mann-Whitney. O teste de Kruskal-Wallis foi usado para comparar a diferença

entre estes escores nos diferentes subtipos histológicos do APs e nos padrões histológicos dos

CACs. Para analisar a correlação entre os escores obtidos e variáveis clínicopatológicas nestes

tumores foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Spearman. O nível de significância foi

estabelecidoăemă95%ă(g=0,05).

RESULTADOS

70

5 RESULTADOS

5.1 Caracterização da amostra

Na presente amostra constituída de 20 casos de AP e 20 de CAC a maioria dos casos

de AP (60%) e CAC (70% ) ocorreu no sexo feminino, sendo que em 2 casos de AP e 3 casos

de CAC não foi possível obter informações sobre o sexo dos indivíduos. A relação

feminino/masculino nos APs foi de 2:1, enquanto que nos CACs esta relação foi de 4,6:1

(Tabelas 1 e 2).

A idade mínima e máxima dos indivíduos diagnosticados com AP variou de 16 a 84

anos, enquanto que nos portadores de CAC esta variação foi de 22 a 76 anos, sendo que em 4

casos de AP e em 4 casos de CAC não foi possível obter informações a respeito desta variável

(Tabelas 1 e 2). A média de idade dos indivíduos acometidos por estas neoplasias no

momento do diagnóstico era de, respectivamente, 38,69 e 52,56 anos. A análise das

diferenças entre as médias de idade observadas nos tumores estudados, com o emprego do

teste t Student (t), não revelou significância (t = -1,931, G.L = 30, p = 0,063).

Todos os casos da amostra estavam localizados em glândulas salivares menores, tendo

como sítio de predileção o palato. A localização dos casos de APs estava distribuída entre o

palato (65%), lábio superior (10%), mucosa jugal (5%) e mucosa alveolar (5%). Nos CACs,

os sítios anatômicos acometidos foram o palato (30%), assoalho bucal (20%), língua (10%),

trígono retromolar (10%), mucosa jugal (5%) e comissura labial (5%). Os dados não estavam

disponíveis quanto a localização anatômica em 3 casos de AP e 3 casos de CAC (Tabelas 1 e

2). A análise destas variáveis, através do Teste da Razão de Verossimilhança, revelou uma

associaçãoă significativaă entreă aă localizaçãoă anatômicaă eă oă tipoă deă tumoră (Lぬ2=16,843,

p=0,018).

71

Tabela 1. Dados clínicos referentes a sexo, idade e localização anatômica dos casos de

adenoma pleomórfico de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011.

Caso Sexo Idade Localização anatômica

1 M 42 Mucosa jugal

2 F 19 Palato

3 F 18 Palato

4 ND ND ND

5 ND ND ND

6 F 46 Palato

7 F 34 ND

8 F 47 Palato

9 M 35 Palato

10 F ND Palato

11 M 70 Palato

12 F 16 Palato

13 M ND Palato

14 F 22 Lábio superior

15 F 16 Mucosa alveolar

16 M 32 Palato

17 F 20 Palato

18 M 55 Palato

19 F 84 Palato

20 F 63 Lábio superior

M – masculino F – feminino ND – dado não disponível

72

Tabela 2. Dados clínicos referentes a sexo, idade e localização anatômica dos casos de

carcinoma adenóide cístico de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011.

Caso Sexo Idade Localização anatômica

1 F 35 Comissura labial

2 F 47 Língua

3 F 66 Palato

4 F 73 Língua

5 ND ND ND

6 M 74 Trígono retromolar

7 F 22 Assoalho bucal

8 F 23 Palato

9 F ND Assoalho bucal

10 F 50 Mucosa jugal

11 F 55 Palato

12 ND ND ND

13 F 76 Palato


15 F 63 Trígono retromolar

16 M 73 Palato

17 M 54 Lábio superior

18 F 37 Palato

19 ND ND ND


M – masculino F – feminino ND – dado não disponível

73

5.2 Análise morfológica

5.2.1 Adenomas pleomórficos

O estudo microscópico dos APs revelou aspecto histológico característico para estas

neoplasias, onde o parênquima exibia intensa proliferação de células epiteliais e mioepiteliais,

dispostas em lençóis sólidos, cordões e ninhos, com quantidade variável de estruturas

ductiformes, revestidas por duas ou mais camadas de células, as quais revelavam

freqüentemente material eosinofílico amorfo em sua porção luminal (Figura 1a). O

componente epitelial apresentava uma variedade de tipos celulares incluindo células

plasmocitóides, basalóides, fusiformes, poligonais, cuboidais e escamosas, tendo como tipo

celular predominante o plamocitóide.

A maioria dos tumores apresentava-se delimitado perifericamente por uma cápsula

fibrosa (Figura 1b), por vezes delgada e incompleta em 75% dos casos analisados (Tabela 3).

Normalmente era possível observar a infiltração da cápsula por células tumorais, distribuídas

de forma dispersa ou organizadas principalmente sob a forma de ninhos e cordões.

O estroma nestes tumores apresentou-se bastante variável, incluindo os tipos hialino,

fibroso, mixóide e condróide (Figuras 2, 3, 4 e 5). Normalmente foi evidenciado em um

mesmo tumor diferentes proporções de mais de um tipo estromal. Uma combinação do

estroma hialino e mixóide, com predominância do primeiro, foi encontrado em 12 casos

(60%). Nos casos com apenas um tipo estromal o mais freqüentemente observado foi o

hialino em 3 casos (15%). Dispersas em meio ao estroma foi possível identificar áreas focais

de diferenciação escamosa presentes em 8 casos, que por vezes exibia pérolas de ceratina.

Os APs foram classificados histologicamente de acordo com Seifert et al. (1976) com

base na diferenciação das células epiteliais e na quantidade e natureza do estroma nos

subtipos clássico, mixóide e celular (Figura 6). Dezessete dos casos estudados (85%)

correspondiam ao subtipo clássico, onde havia uma quantidade equilibrada entre as células

epiteliais, mioepiteliais e o componente estromal. Dois dos casos avaliados (10%) foram

classificados como mixóides, onde se evidenciavam células com morfologia variável,

predominantemente fusiformes e estreladas organizadas de forma isolada ou formando

pequenos agrupamentos celulares, dispersas em um rico estroma que correspondia a mais de

80% do tumor. Apenas um dos casos (5%) foi classificado como celular (rico em células),

caracterizado por uma proliferação de células epiteliais arranjadas em cordões sólidos,

74

eventualmente formando pequenas estruturas ductiformes em meio a um escasso estroma

mixóide (Tabela 3).

75

Figura 1. Aspectos microscópicos dos adenomas pleómórficos de glândulas salivaresmenores. (a) Células epiteliais neoplásicas benignas, dispostas em estruturas ductiformes, ninhos e cordões em meio a um estroma hialinofibroso, (b) cápsula fibrosa delimitando o tumor (H/E, 200X).

76

77

78

Tabela 3. Número e percentual de características histopatológicas evidenciadas nos adenomas

pleomórficos de glândulas salivares menores, Natal, RN.2011.

CARACTERÍSTICA

HISTOPATOLÓGICA no %

Tipo (s) de estroma (s)

Hialino/Mixóide 12 60

Hialino 3 15

Mixóide/condróide 2 10

Hialino/fibroso/mixóide 1 5

Hialino/fibroso 1 5

Mixóide 1 5

Cápsula

Delgada e incompleta 15 75

Completa e delgada 4 20

Ausente 1 5

Subtipo histológico

Clássico 17 85

Mixóide 2 10

Celular 1 5

79

Figura 6. Subtipos histológicos apresentados pelos adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores. (a) clássico, (b) mixóide e (c) celular.(H/E, 200X).

80

5.2.2 Carcinomas adenóides císticos

Os CACs avaliados apresentavam um arranjo arquitetural característico com

proliferação de células epiteliais redondas e cuboidais com núcleos ovais, hipercromáticos e

citoplasma frequentemente escasso. As células proliferantes apresentavam-se organizadas em

espaços pseudocísticos, estruturas tubulares, trabeculares, ninhos e cordões, originando os

três padrões histológicos: cribriforme, tubular e sólido (Figura 7). Os casos analisados ora

exibiam um exclusivo padrão histológico ora se intercalavam em uma mistura com variadas

proporções de mais de um padrão de crescimento. Dos espécimes analisados, 9 casos (40%)

apresentavam um padrão predominantemente tubular, 8 (40%) o padrão cribriforme e apenas

3 (15%) o padrão sólido (Tabela 4).

Nos casos apresentando o padrão tubular, as células proliferantes se organizavam em

ductos de calibres diversos formando estruturas tubulares que se apresentavam ora isoladas

ora conectadas, produzindo um intricado padrão de crescimento em meio a um estroma

predominantemente hialinizado. Estas estruturas tubulares eram geralmente compostas por

uma dupla camada de células, onde a camada interna (luminal) era constituída geralmente por

células com morfologia variando de cuboidal a colunar com moderado citoplasma eosinofílico

enquanto que a camada externa era normalmente formada por células de morfologia variada.

Individualmente as células proliferantes exibiam núcleos pequenos e hipercromáticos. Nos

casos classificados como padrão cribriforme, as células tumorais organizavam-se formando

estruturas pseudocísticas de tamanho e formas variáveis que eventualmente apresentavam

material basofílico e amorfo em seu interior. Nos casos classificados como padrão sólido, as

células proliferantes eram geralmente basalóides de aspecto uniforme e se arranjavam em

ninhos e grandes ilhas com pouca tendência a formação de estruturas ductiformes e,

eventualmente, com áreas focais de necrose no centro dos ninhos tumorais.

Na maioria dos CACs analisados (65%), foi evidenciado algum tipo de invasão das

células tumorais a estruturas adjacentes (Figura 8), onde as mais frequentemente observadas

foram a invasão intravascular (20%) e muscular (15%) (Tabela 4). Dos casos classificados

como padrão cribriforme, 7 deles apresentavam alguma invasão do tipo muscular,

intravascular, perineural e/ou acinar.

81

Figura 7. Padrões histológicos apresentados pelos carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores. (a) tubular, (b) cribriforme e (c) sólido (H/E, 200X).

82

Tabela 4. Número e percentual de características histopatológicas encontradas nos carcinomas

adenóides císticos de glândulas salivares menores, Natal, RN.2011

CARACTERÍSTICA

HISTOPATOLÓGICA no %

Padrão histológico predominante

Tubular 9 45

Cribriforme 8 40

Sólido 3 15

Tipo de invasão

Intravascular 4 20

Muscular 3 15

Perineural 1 5

Acinar 1 5

Muscular e intravascular 1 5

Muscular e acinar 1 5

Perineural e intravascular 1 5

Perineural, muscular e acinar 1 5

Sem Invasão 7 35

83

Figura 8. Aspectos microscópicos dos tipos de invasão apresentados pelos carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores. (a) acinar, (b) muscular, (c) perineural e (d) intravascular (H/E, 400X).

84

5.3 Análise imuno-histoquímica

5.3.1 Análise da imunoexpressão das gelatinases

A análise imuno-histoquímica das MMPs -2 e -9 nos casos de APs revelou que

respectivamente, 17 (85%) e 20 (100%) destes tumores apresentavam-se imunomarcados para

estas gelatinases (Tabela 5). Os três casos que apresentaram marcação negativa para a MMP-2

correspondiam ao padrão histológico classificado como clássico.

O padrão de distribuição da imunomarcação foi similar para estas duas gelatinases nos

três padrões histológicos dos APs (clássico, mixóide e sólido). Uma marcação citoplasmática

e de intensidade variável foi evidenciada em células epiteliais e mioepiteliais presentes nas

estruturas ductiformes, lençóis sólidos, cordões, ninhos e ilhas tumorais (Figuras 9 e 10).

Nas áreas de metaplasia escamosa foi evidenciada uma forte expressão para estas duas

gelatinases, bem como nos núcleos presentes no interior das lacunas condróides (Figura 11a e

11b). Nos fragmentos de glândula salivar presentes nos espécimes, o epitélio ductal mostrava-

se de moderado a fortemente imunomarcado, diferentemente das células acinares que não

expressaram estas gelatinases (Figura 11c).

Quanto a intensidade de expressão para estas gelatinases no parênquima tumoral dos

APs, os imunoescores para a MMP-2 variaram de 0 a 9, enquanto que para a MMP-9 a

variação foi de 3 a 9 (Tabela 5).

Os CACs exibiam uma expressão similar aos APs com respectivamente 17 (85%) e 20

(100%) dos casos imunomarcados, respectivamente, para as MMPs -2 e -9 (Tabela 5). Os três

casos que apresentaram marcação negativa para a MMP-2 um, correspondia ao padrão

histológico predominantemente cribriforme e os outros dois, ao padrão tubular.

Uma imunomarcação citoplasmática e de intensidade variável foi observada em

células tumorais dos padrões histológicos dos CACs para as duas gelatinases (Figuras 12 e

13). Quanto a intensidade de expressão para estas MMPs no parênquima tumoral destes

tumores, os imunoescores para a MMP-2 variaram de 0 a 9, enquanto que para a MMP-9 a


Além disso, foi observada expressão em células estromais de ambos os tumores. A

expressão nestas células para a MMP-9 foi evidenciada principalmente em células

inflamatórias, especialmente nas localizados ao redor das ilhas tumorais. Além disso,

fibroblastos e células endoteliais também apresentavam-se imunomarcadas pela MMP-2.

85

Testes estatísticos foram utilizados para testar as hipóteses de igualdade ou não dos

escores obtidos para a expressão das MMPs -2 e -9 entre APs e CACs. Inicialmente foram

comparados os dois tumores. Considerando que a análise envolvia 2 grupos independentes

(tumores) foi utilizado o teste de Mann-Whitney. Verificou-se que não houve diferença

significativa na expressão da MMP-2 nestes tumores (p=0,359). Entretanto, a análise indicou

uma diferença significativa na expressão da MMP-9 entre os dois tumores, apresentando o

CAC uma marcação mais intensa para esta gelatinase (p=0,041) (Tabela 6 e Figura 14).

Em seguida, testes estatísticos foram utilizados para testar as hipóteses de igualdade

ou não dos escores obtidos para a expressão das MMPs -2 e -9 entre os diferentes subtipos e

padrões histológicos respectivamente, dos APs e CACs. Considerando que a análise envolvia

3 grupos independentes (subtipos ou padrões histológicos) foi utilizado o teste de Kruskal-

Wallis.Verificou-se que não houve uma diferença significativa na expressão da MMP-2 entre

os subtipos histológicos do AP (p=0,459) e padrões histológicos dos CACs (p=0,207). A

análise também não revelou diferença significativa na expressão da MMP-9 entre os subtipos

dos APs (p=0,140) e padrões histológicos dos CACs (p=0,445) (Tabela 7).

Posteriormente, testes estatísticos foram utilizados para testar as hipóteses de

existência ou não de correlação entre a expressão das gelatinases e variáveis

clinicopatológicas nos APs e CACs. Considerando que a análise envolvia dados ordinais

(escores) foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Spearman. A análise demonstrou que

não houve uma correlação significativa entre a expressão destas duas gelatinases e as

características clínicopatológicas dos APs (Tabela 8). Verificou-se apenas que houve uma

correlação significativa entre a expressão da MMP-2 e a variável sexo dos CACs (p=0,044)

(Tabela 9).

86

Tabela 5. Imunoescores de intensidade de marcação obtidos para as gelatinases (MMPs -2

e -9) de acordo com o tipo de tumor, Natal, RN. 2011.

GELATINASES TIPO DE TUMOR N %

IMUNOESCORES

MMP-2

AP 20 100 0 3 15

2 2 10

3 5 25

6 4 20

9 6 30

CAC 20 100 0 3 15

2 1 5

3 4 20

6 2 10

9 10 50

MMP-9

AP 20 100 3 1 5

4 1 5

6 9 45

9 9 45

CAC 20 100 6 5 25

9 15 75

AP – adenoma pleomórfico CAC – carcinoma adenóide cístico

87

88

Figura 11. Expressão imuno-histoquímica das gelatinases (MMPs -2 e -9) em áreas de diferenciação e fragmentos de tecido glandular presentes em adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores. (a) Forte expressão da MMP-2 em áreas de diferenciação escamosa (b) Forte expressão da MMP-9 em células presentes no interior das lacunas das áreas condróides. (c) Ausência de expressão da MMP-9 em células acinares (ENVISION, 400X).

89

90

Tabela 6. Teste de Mann-Whitney para a diferença entre os imunoescores de intensidade de

marcação para as metaloproteinases da matriz (MMPs -2, -7, -9 e -26) e os inibidores

teciduais de metaloproteinases (TIMPs -1 e -2) por tipo de tumor, Natal, RN. 2011.

MMPs TIPO DE

TUMOR N

Soma dos

postos

Média dos

postos P-valor*

Gelatinases

MMP-2

AP 20 377,50 18,88 0,359

CAC 20 442,50 22,13

MMP-9

AP 20 345,00 17,25 0,041

CAC 20 475,00 23,75

Matrilisinas

MMP-7

AP 20 457,00 22,85 0,081

CAC 20 363,00 18,15

MMP-26

AP 20 400,00 20 0,553

CAC 20 420,00 21

Inibidores

teciduais de

metaloproteinases

TIMP-1

AP 20 396,00 19,80 0,657

CAC 20 424,00 21,20

TIMP-2

AP 20 375,00 18,75 0,248

CAC 20 445,00 22,25

AP – adenoma pleomórfico CAC – carcinoma adenóide cístico * Teste de Mann-Whitney

91

Figura 14. Box-Plot de intensidade de marcação para a MMP-9 de acordo com o tipo de tumor, Natal, RN. 2011.

92

Tabela 7. Teste de Kruskal-Wallis para a diferença entre os imunoescores de intensidade de

marcação para as metaloproteinases da matriz (MMPs -2, -7, -9 e -26) por subtipo e padrão

histológico do tumor, Natal, RN. 2011.

MMPs SUBTIPO/PADRÃO

HISTOLÓGICO n

Média dos

postos P-valor*

MMP-2

AP 20 Clássico 17 9,85

0,459 Mixóide 2 15,00 Celular 1 12,50

CAC 20 Cribriforme 8 8,94

0,207 Tubular 9 10,22 Sólido 3 15,50 MMP-9


0,140 Mixóide 2 4,00 Celular 1 7,00




0,189 Mixóide 2 6,75 Celular 1 11,50




0,830 Mixóide 2 11,50 Celular 1 11,50


0,472 Tubular 9 11,00 Sólido 3 11,00

AP – adenoma pleomórfico CAC – carcinoma adenóide cístico * Teste de Kruskal-Wallis

93

Tabela 8. Coeficiente de Correlação de Spearman para a análise de correlação entre a

intensidade de expressão das gelatinases (MMPs-2 e -9) e variáveis clínicopatológicas em

adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011.

VARIÁVEIS CLÍNICOPATOLÓGICAS

GELATINASES

P-valor

MMP-2

P-valor

MMP-9

ESCORES rs ESCORES rs

0 2 3 6 9 3 4 6 9

Sexo

Masculino 1 1 2 1 1 0,247 0,324

0 1 2 3 -0,037 0,883

Feminino 2 0 3 2 5 1 0 6 5

Idade

≤ă50ăăăăăăăăăăăăă 3 1 2 2 4 0,260 0,332

1 1 5 5 0,137 0,613

>50 0 0 1 1 2 0 0 2 2

Localização anatômica Palato 1 1 3 3 5

-0,511 0,036

1 0 6 6

-0,183 0,482 Lábio superior 1 0 1 0 0 0 0 2 0

Mucosa jugal 1 0 0 0 0 0 1 0 0

Mucosa alveolar 0 0 1 0 0 0 0 0 1

Estroma

Hialino/Mixóide 3 2 2 2 3

0,377 0,102

0 1 6 5

0,063 0,792

Hialino 0 0 2 0 1 0 0 1 2

Mixóide/condróide 0 0 1 1 0 1 0 0 1

Hialino/fibroso/mixóide 0 0 0 1 0 0 0 1 0

Hialino/fibroso 0 0 0 0 1 0 0 0 1

Mixóide 0 0 0 0 1 0 0 1 0

* rs - Coeficiente de Correlação de Spearman

94


intensidade de expressão das gelatinases (MMPs-2 e -9) e variáveis clínicopatológicas em

carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011.

VARIÁVEIS CLÍNICO

PATOLÓGICAS

GELATINASES

P-valor

MMP-2

P-valor

MMP-9

ESCORES rs ESCORES rs

0 2 3 6 9 6 9

Sexo Masculino 0 0 0 0 3

-0,494 0,044 0 3

-0,257 0,320 Feminino 3 1 4 2 4 4 10

Idade ≤ă50ăăăăăăăăăăăăă 0 1 3 1 2

0,086 0,751 1 6

-0,101 0,710 >50 3 0 0 1 5 2 7

Localização anatômica

Palato 1 1 0 0 4

-0,297 0,248

1 5

-0,117 0,656

Lábio superior 0 0 0 0 1 0 1

Trígono retromolar

1 0 0 0 1 1 1

Mucosa jugal 0 0 0 0 1 0 1

Assoalho bucal 1 0 3 0 0 1 3

Língua 0 0 0 2 0 1 1

Comissura labial 0 0 1 0 0 0 1

Invasão Perineural Positiva 0 0 1 1 1

0,000 1,000 0 3

-0,243 0,303 Negativa 3 1 3 1 9 5 12

Intravascular Positiva 0 0 0 2 3

-0,280 0,232 1 4

-0,067 0,780 Negativa 3 1 4 0 7 4 11


95

5.3.2 Análise da imunoexpressão das matrilisinas

A análise imuno-histoquímica da expressão das MMPs -7 e -26 revelou que todos os

casos de AP mostravam-se imunomarcados para estas matrilisinas (Tabela 10). Uma

marcação predominantemente citoplasmática e de intensidade variável foi evidenciada para as

duas matrilisinas nos três padrões histológicos dos APs. A imunomarcação foi observada em

células proliferantes das estruturas ductiformes, lençóis sólidos, cordões, ninhos e ilhas

tumorais (Figuras 15 e 16). Áreas de metaplasia escamosa, bem como os núcleos presentes no

interior das lacunas condróides também apresentavam-se imunomarcados.

Quanto a intensidade de expressão para estas matrilisinas no parênquima tumoral dos

APs, os imunoescores para a MMP-7 variaram de 2 a 9 enquanto que para a MMP-26 a


Nos CACs também foi evidenciada uma significativa expressão destas matrilisinas

com todos os casos imunomarcados (Figuras 17 e 18). Quanto a intensidade de expressão para

estas matrilisinas no parênquima tumoral dos CACs, os imunoescores para a MMP-7 variaram

de 4 a 9, enquanto que para a MMP-26 a variação foi de 6 a 9, similar a apresentada pelos

APs (Tabela 10).

O epitélio de revestimento presente em alguns tumores também expressava a MMP-7,

bem como células endoteliais estromais. As células epiteliais ductais e algumas células

acinares dos fragmentos de glândula salivar próximos de alguns tumores também se

mostravam fracamente imunomarcadas pela matrilisina-1. Algumas células inflamatórias ao

redor das ilhas tumorais ocasionalmente apresentavam-se imunomarcadas pela MMP-26.


escores obtidos para a expressão das MMPs -7 e -26 entre os dois tumores. Inicialmente

foram comparados os APs e CACs. Considerando que a análise envolvia 2 grupos

independentes (tumores) foi utilizado o teste de Mann-Whitney. Verificou-se que não houve

diferença significativa na expressão da MMP-7 (p=0,081) e MMP-26 (p=0,553) entre os dois

tumores (Tabela 6).


ou não dos escores obtidos para a expressão destas matrilisinas entre os diferentes subtipos e

padrões histológicos respectivamente, dos APs e CACs. Considerando que a análise envolvia

3 grupos independentes (subtipos ou padrões histológicos) foi utilizado o teste de Kruskal-

Wallis. A análise com o emprego deste teste não revelou diferença significativa na expressão

da MMP-7 entre os subtipos e padrões histolólgicos respectivamente, dos APs (p=0,189) e

96

CACs (p=0,438). Os dados também não demonstraram uma diferença significativa na

expressão da MMP-26 entre os subtipos histológicos de AP (p=0,830) e os padrões

histológicos do CAC (p=0,472) (Tabela 7).


existência ou não de correlação entre a a expressão das MMPs -7 e -26 e variáveis

clínicopatológicas nos APs e CACs. Considerando que a análise envolvia dados ordinais


não houve uma correlação significativa entre a expressão das matrilisinas e as características

clinicopatológicas dos tumores estudados (Tabelas 11 e 12).

Tabela 10. Imunoescores de intensidade de marcação obtidos para as matrilisinas (MMPs -7

e -26) de acordo com o tipo de tumor, Natal, RN. 2011.

MATRILISINAS TIPO DE TUMOR n %

IMUNOESCORES

MMP-7

AP 20 100 2 1 5

6 1 5

9 18 90

CAC 20 100 4 1 5

6 6 30

9 13 65

MMP-26

AP 20 100 6 2 10

9 18 90

CAC 20 100 6 1 5

9 19 95


97

98

99


intensidade de expressão das matrilisinas (MMPs-7 e -26) e variáveis clínicopatológicas em

adenomas pleomórficos de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011.

VARIÁVEIS

CLÍNICOPATOLÓGICAS

MATRILISINAS MMP-7

P-valor

MMP-26

ESCORES rs* ESCORES rs* P-valor

2 6 9 6 9

Sexo Masculino 1 0 5

0,146 0,564

0 6

-0,250

0,317 Feminino 0 1 11

2 10

Idade

≤ă50ăăăăăăăăăăăăă 1 1 10 0,218 0,418

1 11 0,149 0,582

>50 0 0 4 0 4


Palato 0 1 12

-0,277 0,282

2 11

0,201 0,440 Lábio superior 0 0 2 0 2

Mucosa jugal 1 0 0 0 1

Mucosa alveolar 0 0 1 0 1

Estroma

Hialino/Mixóide 1 0 11

0,044 0,854

2 10

0,262 0,265

Hialino 0 0 3 0 3

Mixóide/condróide 0 1 1 0 2

Hialino/fibroso/mixóide 0 0 1 0 1

Hialino/fibroso 0 0 1 0 1

Mixóide 0 0 1 0 1


100


intensidade de expressão das matrilisinas (MMPs-7 e -26) e variáveis clínicopatológicas em

carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores, Natal, RN. 2011.

VARIÁVEIS


MATRILISINAS MMP-7

P-valor

MMP-26


4 6 9 6 9

Sexo Masculino 0 0 3 -0,337 0,185 0 3 -0,116 0,658

Feminino 1 5 8 1 13

Idade

≤ă50ăăăăăăăăăăăăă 0 2 5 -0,084 0,757 0 7 -0,228 0,396

>50 1 2 6 1 8


Palato 0 1 5

-,0,260 0,314

0 6

0,920

Lábio superior 0 0 1 0 1

Trígono retromolar 1 0 1 1 1

Mucosa jugal 0 0 1 0 1 0,026

Assoalho bucal 0 3 1 0 4

Língua 0 1 1 0 2

Comissura labial 0 0 1 0 1

Invasão

Perineural Positiva 0 1 2

-0,029 0,903 0 3

-0,096 0,686 Negativa 1 5 11 1 16

Intravascular

Positiva 0 1 4 -0,191 0,419

0 5 -0,132 0,578

Negativa 1 5 9 1 14


101

5.3.3 Análise da imunoexpressão dos inibidores teciduais das metaloproteinases

A análise imuno-histoquímica da expressão dos TIMPs mostrou que 18 casos (90%)

dos APs exibiram uma marcação positiva tanto para o TIMP-1 como para o TIMP-2 (Tabela

13). O padrão de distribuição da imunoexpressão foi semelhante aquele apresentado para as

gelatinases onde uma expressão geralmente citoplasmática foi evidenciada nas células

epiteliais, especialmente nas estruturas ductiformes, em lençóis sólidos, cordões, ninhos e

ilhas tumorais (Figuras 19 e 20). Nos fragmentos de glândula salivar presentes nos espécimes,

o epitélio ductal mostrava-se de uma imunomarcação de intensidade variável, diferentemente

das células acinares que não expressaram estes inibidores. Nos tumores era ainda possível

evidenciar uma marcação positiva para células inflamatórias, fibroblastos, bem como em

áreas de metaplasia escamosa e nos núcleos presentes nas lacunas condróides.

Os CACs apresentaram uma forte expressão para os TIMPs-1 e -2, onde os 20 casos

(100%) exibiram uma marcação positiva para ambos os marcadores (Tabela 13). Uma

marcação citoplasmática e de intensidade variável foi evidenciada nas células neoplásicas dos

três padrões histológicos do CAC (Figuras 21 e 22). Quanto a distribuição do padrão de

marcação, estes tumores apresentaram uma distinta expressão nos diferentes padrões de

crescimento. No padrão sólido foi evidenciada uma imunomarcação mais proeminente e

uniforme quando comparado aos padrões tubular e cribriforme para estes inibidores teciduais.

Nestes dois últimos padrões histológicos eventualmente algumas células tumorais

perifericamente dispostas apresentam-se imunonegativas.


escores obtidos para a expressão dos TIMPs estudados entre APs e CACs. Inicialmente foram

comparados os dois tumores. Considerando que a análise envolvia 2 grupos independentes

(tumores) foi utilizado o teste de Mann-Whitney. Verificou-se que não houve diferença

significativa na expressão do TIMP-1 (p=0,657) e TIMP-2 (p=0,248) entre respectivamente,

APs e CACs (Tabela 6).


ou não dos escores obtidos para a expressão dos TIMPs estudados entre os diferentes subtipos

e padrões histológicos respectivamente, dos APs e CACs. Considerando que a análise

envolvia 3 grupos independentes (subtipos ou padrões histológicos) foi utilizado o teste de

Kruskal-Wallis.Verificou-se que não houve uma diferença significativa na expressão dos

TIMPs 1 e -2 respectivamente, entre os subtipos dos APs (p=0,441) e padrões histológicos

dos CACs (p=0,291) (Tabela 14).

102


existência ou não de correlação entre a a expressão destes inibidores teciduais e variáveis

clínicopatológicas nos APs e CACs. Considerando que a análise envolvia dados ordinais


não houve uma correlação significativa entre a expressão dos TIMPs 1-e -2 e características

clínicopatológicas dos tumores estudados (Tabelas 15 e 16).

Tabela 13. Imunoescores de intensidade de marcação obtidos para os inibidores teciduais das

metaloproteinases (TIMPs -1 e -2) de acordo com o tipo de tumor, Natal, RN. 2011.

INIBIDORES TECIDUAIS DE

METALOPROTEINASES TIPO DE TUMOR N %

IMUNOESCORES

TIMP-1

AP 20 100 0 2 10

6 6 30

9 12 60

CAC 20 100 2 1 5

6 6 30

9 13 65

TIMP-2

AP 20 100 0 2 10

6 6 30

9 12 60

CAC 20 100 6 5 25

9 15 75


103

104

105

Tabela 14. Teste de Kruskal-Wallis para a diferença entre os imunoescores de intensidade de

marcação para os inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMPs -1 e -2) por subtipo e

padrão histológico do tumor, Natal, RN. 2011.

INIBIDORES

TECIDUAIS DAS

METALOPROTEINASES

SUBTIPO

HISTOLÓGICO n

Média dos

postos P-valor*

TIMP-1

AP 20

Clássico 17 11,09

0,441 Mixóide 2 8,00

Celular 1 5,50

CAC 20

Cribriforme 8 8,81

0,291 Tubular 9 10,83

Sólido 3 14,00

TIMP-2

AP 20

Clássico 17 10,32

0,725 Mixóide 2 10,00

Celular 1 14,50

CAC 20

Cribriforme 8 9,25

0,445 Tubular 9 10,78

Sólido 3 13,00

AP – adenoma pleomórfico CAC – carcinoma adenóide cístico * Teste de Kruskal-Wallis

106

Tabela 15. Correlação entre a expressão dos inibidores teciduais das metaloproteinases

(TIMPs-1 e -2) e variáveis clínicopatológicas em adenomas pleomórficos, Natal, RN. 2011.

VARIÁVEIS

CLÍNICOPATOLOGICAS

INIBIDORES TECIDUAIS DAS METALOPROTEINASES

TIMP-1 P-valor

TIMP-2


0 6 9 0 6 9

Sexo

Masculino 1 0 5 -0,191 0,448

1 2 3 0,102 0,687

Feminino 1 4 7 1 4 7

Idade

≤ă50ăăăăăăăăăăăăă 2 4 6 0,436 0,091

2 4 6 0,436 0,091

>50 0 0 4 0 0 4

Localização anatômica Palato 1 3 9

-0,190 0,466

0 5 8

-0,472 0,056 Lábio superior 0 1 1 1 0 1

Mucosa jugal 1 0 0 1 0 0

Mucosa alveolar 0 0 1 0 1 0

Estroma

Hialino/Mixóide 1 4 7

-0,010 0,967

2 2 8

-0,008 0,974

Hialino 0 0 3 0 1 2

Mixóide/condróide 1 0 1 0 2 0

Hialino/fibroso/mixóide 0 1 0 0 1 0

Hialino/fibroso 0 1 0 0 0 1


107


intensidade de expressão dos inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMPs-1 e -2) e

características clínicopatológicas em carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares

menores, Natal, RN. 2011.

VARIÁVEIS


INIBIDORES TECIDUAIS DAS METALOPROTEINASES

TIMP-1 P-valor

TIMP-2


2 6 9 6 9

Sexo

Masculino 0 0 3 -0,381 0,132

0 3 -0,299

0,244

Feminino 1 6 7 5 9

Idade

≤ă50ăăăăăăăăăăăăă 0 3 4 -0,062 0,819

2 5 0,073 0,789

>50 1 3 5 2 7


Palato 0 1 5

-0,437 0,080

2 4

0,122 0,640

Lábio superior 0 0 1 0 1

Trígono retromolar 1 0 1 1 1

Mucosa jugal 0 0 1 0 1

Assoalho bucal 0 3 1 2 2

Língua 0 1 1 0 2

Comissura labial 0 1 0 0 1

Invasão Perineural

Positiva 0 2 1 0,247 0,294

1 2 0,081 0,735

Negativa 1 4 12 4 13

Intravascular

Positiva 0 1 4 -0,191 0,419

0 5 -0,333 0,151

Negativa 1 5 9 5 10


DISCUSSÃO

109

6 DISCUSSÃO

Os TGS compreendem um grupo morfológico e clinicamente diverso de neoplasias.

Estes tumores são raros, especialmente quando afetam as glândulas salivares menores, onde

eles representam de 9 a 23% de todas as neoplasias de glândulas salivares (EVESON,

CAWSON, 1985; WALDRON et al., 1988; ITO et al., 2005; TOIDA et al., 2005; PIRES et

al., 2007). A maioria dos tumores de glândulas salivares menores apresentam um

comportamento bastante variável, muitas vezes caracterizado por recorrências e metástases

tardias (SPEIGHT, BARRETT, 2002; BOBBIO et al., 2008; COPELLI et al., 2008).

No presente estudo envolvendo 20 casos de AP e 20 casos de CAC, todos os tumores

estavam localizados em glândulas salivares menores. Estudos envolvendo neoplasias com esta

localização indicam que o AP é o tumor benigno mais comum (LOYOLA et al., 1995;

LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; BUCHNER et al.,

2007; PIRES et al., 2007; WANG et al., 2007; BARROS et al., 2010; NÓBREGA et al.,

2010), com uma taxa de incidência variando de 30,6 a 53% para todos os tumores de

glândulas salivares menores e de 59,3 a 95,6% para os tumores benignos desta localização

(LOYOLA et al., 1995; LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; TOIDA et al., 2005; JABER,

2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007; WANG et al., 2007). Estudos tem

reportado o CAC (EVESON, CAWSON, 1985; TAKAHASHI et al., 1990; TOIDA et al.,

2005; WANG et al., 2007; COPELLI et al., 2008; BARROS et al., 2010) e o carcinoma

mucoepidermóide (LOYOLA et al., 1995; LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; JABER,

2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007; NÓBREGA et al., 2010) como os tumores

malignos mais frequentes de glândulas salivares menores. A taxa de incidência para os CACs

nestes estudos tem variado de 6,4 a 19,4% para todos os tumores de glândulas salivares

menores e de 14,5 a 36% para os tumores malignos desta localização (LOYOLA et al., 1995;

LOPES et al., 1999; YIH et al., 2005; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; PIRES et al., 2007;

WANG et al., 2007).

Os resultados do presente estudo demonstraram uma predileção dos casos APs e CACs

pelo sexo feminino. Os indivíduos com CAC apresentavam uma tendência a desenvolver a

doença em idades mais avançadas quanto comparado aqueles com AP. A média de idade dos

pacientes com estes tumores no momento de diagnóstico foi de respectivamente 52,56 e 38,69

anos, estando estes achados de acordo com outros estudos (LOYOLA et al., 1995; TOIDA et

al., 2005; YIH et al., 2005; JABER, 2006; BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007;

WANG et al., 2007; BIANCHI et al., 2008; NÓBREGA et al., 2010).

110

O palato foi a localização mais comum tanto para os APs como para os CACs, com

uma alta frequência de envolvimento especialmente para os APs (65%). Estes achados estão

de acordo com relatos prévios da literatura que indicam o palato como principal sítio

anatômico para ambos os tumores em estudos envolvendo neoplasias de glândulas salivares

menores (LOPES et al., 1999; TOIDA et al., 2005; JABER, 2006; YIH et al., 2005;

BUCHNER et al., 2007; PIRES et al., 2007, BIANCHI et al., 2008; WANG et al., 2007).

Para Toida et al. (2005), devido ao AP representar majoritariamente os tumores benignos

envolvendo glândulas salivares menores, características clínicas encontradas nos tumores

benignos nas séries de estudos de casos, incluindo a predileção pelo palato e sexo feminino,

são devido a presença marcante deste tumor.

Os tumores do presente estudo exibiram aspectos histológicos característicos para

estas lesões. Os APs demonstraram uma grande diversidade morfológica, peculiar a estas

neoplasias, com um padrão bastante variável dos componentes epitelial e estromal. As células

epiteliais e mioepiteliais estavam tipicamente dispostas em lençóis sólidos, cordões, ninhos e

estruturas ductiformes. O componente epitelial incluia uma variedade de tipos celulares,

incluindo o fenótipo plasmocitóide. O estroma de aspecto diverso assumia os padrões hialino,

fibroso, mixóide e condróide. Áreas de diferenciação escamosa e lipomatosa também foram

visíveis. Além disso, estes tumores frequentemente apresentavam-se delimitados

perifericamente por uma cápsula fibrosa, geralmente delgada e incompleta.

Os CACs também apresentaram um arranjo arquitetural característico com as células

proliferantes organizadas formando os três padrões histológicos: cribriforme, tubular e sólido.

Nestes tumores também foram evidenciadas invasões das células tumorais a estruturas

adjacentes dos tipos muscular, intravascular, perineural e acinar. Estes achados estão de

acordo com outros relatos da literatura (DARDICK, 1996; ELLIS, AUCLAIR, 1996;

EVESON et al., 2005; SPEIGHT, 2007; ITO et al., 2009).

Para Souza, Araújo (1994), a multiplicidade de aspectos histológicos exibidos pelos

TGS tem sido atribuída à presença da célula mioepitelial nas glândulas salivares, pois as

neoplasias de pâncreas, glândula que não apresenta este tipo de célula, não demonstram tais

variações morfológicas. Embora não seja considerada a célula básica de origem de todos os

TGS, acredita-se ser considerável o papel da célula mioepitelial na constituição e crescimento

de vários tumores epiteliais salivares (TAKAI et al., 1995; ALOS et al., 1996; DA

SILVEIRA et al., 2006).

Nos últimos anos, alguns estudos também têm investigado o papel das células

mioepiteliais como supressoras naturais de tumores (STERNLICHT, BARSKY, 1997;

111

LAKHANI, O'HARE, 2001; BARSKY, 2003). Alguns experimentos in vitro e in vivo

revelaram que as células mioepiteliais secretam baixos níveis de proteinases que degradam a

MEC e níveis relativamente altos de maspin e diversos outros inibidores de proteinases

(STERNLICHT et al., 1996; STERNLICHT, BARSKY, 1997). O maspin é um inibidor de

serina proteinase que funciona como um supressor tumoral (BAILEY et al., 2006). Nas

glândulas salivares normais o maspin é seletivamente expresso no núcleo e citoplasma de

células mioepiteliais (NAVARRO et al., 2004). Nos TGS com diferenciação de células

ductais e mioepiteliais como o AP, o adenoma de células basais, o CAC e o carcinoma

epitelial-mioepitelial o componente mioepitelial ou mioepitelial modificado geralmente

expressa fortemente o maspin, enquanto as células ductais não expressam ou demonstram

fraca imunoreatividade focal a este marcador (CHEUK, CHAN, 2007). Variados níveis de

expressão do maspin também têm sido evidenciados nos diferentes padrões histológicos do

CAC. O padrão tubular apresenta uma alta expressão deste marcador, diferentemente do

cribriforme onde apenas algumas células luminais foram positivas e do padrão sólido onde

raras células mostraram imunoreatividade para o maspin (NAVARRO et al., 2004). As

células mioepiteliais também têm sido associadas à indução da morfogênese epitelial,

diferenciação, inibição da invasão tumoral e angiogênese. Desta forma, as propriedades anti-

tumorais deste componente celular podem contribuir para a uma tendência a resistência à

transformação neoplásica (NGUYEN et al., 2000).

Apesar do AP e CAC compartilharem a mesma origem celular e uma marcante

presença de MEC, estes tumores apresentam comportamentos biológicos distintos. O AP é

um tumor benigno de glândula salivar enquanto que o CAC é um tumor maligno, com

comportamento agressivo e tendência a frequentes recorrências e metástases tardias a

distância (BIANCHI et al., 2008; BOBBIO et al., 2008).

Diversos fatores têm sido estudados na tentativa de melhor compreender a patogênese

e o comportamento agressivo dos CACs incluindo alterações na expressão de oncogenes, dos

genes supressores tumorais e seus produtos protéicos, bem como, nos genes envolvidos nos

processos de reparo do DNA. Os fatores reguladores do ciclo celular, as moléculas de adesão,

os fatores angiogênicos e a expressão de MMPs e TIMPs também foram investigados.

Os oncogenes são genes que contribuem para a transformação neoplásica e secretam

produtos identificados como fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento,

tirosina cinases, proteínas transdutoras de sinal e fatores de transcrição. Esse fatores estão

relacionados a proliferação e diferenciação celular (KUMAMOTO et al., 2006). Os produtos

resultantes da ativação destes genes atuam de forma dominante, isto é, a mutação de um único

112

alelo poderá ser suficiente para conferir à célula uma vantagem em termos de crescimento ou

transformação, podendo esta mutação levar a neoplasia em uma série de tecidos humanos

(WARD, 2002). Um estudo revelou que a maioria dos CACs analisados apresentavam uma

expressão alterada do oncogene c-erbB-2, também conhecido com EGFR2 (do inglês, human

epidermal growth factor receptor 2) (KARJA et al., 1994).

Os genes supressores tumorais codificam proteínas responsáveis pelo controle negativo do

ciclo celular. Estes genes são mais freqüentemente inativados por pontos de mutação,

deleções e rearranjos em ambos os alelos (WILLIAMS, 2000). Alterações na proteína

retinoblastoma (pRb) são freqüentes em muitos tipos de tumores (PANDE et al., 1988;

TSANTOULIS et al., 2007). Quando o Rb está em seu estado hipofosforilado ele funciona

inibindo a entrada das células na fase S do ciclo celular, unindo-se e inativando o fator de

transcrição E2F (TSANTOULIS et al., 2007). O gene supressor de tumor p16 é um dos

responsáveis por regular o ciclo celular e inibir a divisão celular. Esse gene codifica uma

proteína que inibe as ciclinas dependentes de quinase, que são necessárias para a fosforilação

dos produtos do Rb (SERRANO et al., 1995). Perdas funcionais do p16 e desregulação da

pRb foram freqüentes nos CACs em estudos envolvendo TGS (LIGGETT, SIDRANSKY,

1988; ETGES et al., 2004; ZHANG et al., 2005). A expressão do p16 foi reduzida em CACs

de alto grau quando comparado aos de baixo grau, estando esta alteração relacionada a

progressão destes tumores (ETGES et al., 2004; ZHANG et al., 2005). O gene p53 é um gene

supressor de tumor que codifica a proteína P53 e está envolvido na detecção de danos ao

DNA, podendo parar o ciclo celular enquanto o dano é reparado ou induzir a apoptose. Para

alguns estudos, alterações no gene p53 são pouco freqüentes em CACs, sugerindo que este

gene não desempenha um papel importante na tumorigênese desses tumores (KIYOSHIMA et

al., 2001; ALVES et al., 2004). Controversamente, um outro estudo observou uma maior

freqüência da expressão do p53 em CACs, principalmente no padrão sólido, seguido do

cribriforme e tubular (JIA et al., 2004). Um alta frequência de mutações no p53 também foi

observada em CACs de alto grau, principalmente no subtipo sólido, quando comparados aos

de baixo grau (YAMAMOTO et al., 1998). As alterações no gene p53 quando presentes

podem estar relacionadas a um maior número de recorrências ou metástases, indicando um

pior prognóstico nestes tumores (PAPADAKI et al., 1996; KIYOSHIMA et al., 2001).

Pesquisas ainda sugerem uma relação na expressão do p63 e o desenvolvimento de CACs.

Um estudo indicou que a isoforma do p63ăconhecidaăcomoă∆N63ăestavaăexpressaăemă80%ă

dos CACs estudados enquanto a isoforma TA63 estava presente em apenas 40% destes

tumores (MARUYA et al., 2005). Uma maior expressão do p63 também foi observada em

113

CACs do padrão sólido (EDWARDS et al., 2004), possivelmente devido a maior presença de

células com diferenciação mioepitelial neste padrão, as quais se mostravam fortemente

reativas para a p63 (BILAL et al., 2003).

O DNA humano tem mecanismos de reparo constituídos por pelo menos seis genes

conhecidos como o hMSH2, hMLH1, hMSH3, hPMS1, hPMS2 e GTBP/hMSH6. Defeitos

em alguns destes genes podem estar relacionados a tumorigênese dos TGS. Um estudo

revelou que alterações nos genes hMSH2 e hMLH1 podem estar associadas a patogênese do

CAC (CASTRILLI et al., 2002).

A regulação do ciclo celular está sob controle de estímulos extrínsecos e intrínsecos,

coordenados principalmente pelos fatores de crescimento e pelas ciclinas dependentes de

quinases. A expressão do EGFR (do inglês, epidermal growth factor receptor) em TGS varia

de 37 a 85% (GIBBONS et al., 2001; VERED et al., 2002; KATOPODI et al., 2003;

SORENSEN et al., 2006), com altas expressões em CACs (VERED et al., 2002;

SORENSEN et al., 2006) e carcinomas mucoepidermóides (GIBBONS et al., 2001; VERED

et al., 2002). Uma expressão alterada do c-kit, um receptor transmembrana tirosina cinase tipo

III, também tem sido observada em diversos estudos envolvendo TGS, incluindo CACs

(HOLST et al., 1999; PENNER et al., 2002; MINO et al., 2003; FREIER et al., 2005;

ANDREADIS et al., 2006; ETTL et al., 2008; NEGRI et al., 2008). O NGF (do inglês, nerve

growth factor) é um polipeptídeo neurotrópico que promove a sobrevivência e

desenvolvimento de muitos tipos celulares neuronais no sistema nervoso central e periférico.

O NGF é preferencialmente unido ao receptor neurotrofina tirosina cinase A (TrkA) por uma

ligação de alta afinidade. Uma superexpressão de c-kit e TrkA, bem como, a presença de seus

ligantes também foi observada em CACs (NEGRI et al., 2008). A superexpressão de NGF e

TrkA em células neoplásicas do CAC sugere que este receptor pode funcionar com um fator

quimiotático selecionando as células responsáveis pela invasão perineural nestes tumores

(WANG et al., 2006). A expressão anormal do TGFく, nas suas isoformas TGFく1 e TGFくRI,

também parece ter um papel importante no desenvolvimento do CAC. A superexpressão do

TGFく1 e a baixa expressão de TGFくRI podem ainda estar relacionadas com o pior

comportamento biológico deste tumor (GUO et al., 2002). Alguns estudos encontraram uma

superexpressão da proteína ciclina D1 em CACs (ZHOU, GAO, 2006; GREER et al., 2007).

Entretanto, não foi detectado um aumento significativo na expressão do gene da ciclina D1

(CCND1), responsável pela codificação desta proteína nestes tumores. Tal achado sugere que

o CAC utiliza um ou mais mecanismos alternativos para produzir o aumento na expressão da

proteína ciclina D1 (GREER et al., 2007). Outros genes inibidores das ciclinas dependentes de

114

quinases além do p16, como os genes p15, p18, p19, p21 e p27 também parecem estar

envolvidos na tumorigênese dos CACs (TAKATA et al., 1999; KEIKHAEE et al., 2007;

DAA et al., 2008). Estudos sugeriram que a diminuição da expressão da proteína p27 foi

relacionada ao desenvolvimento e a ocorrência de metástases nestes tumores (TAKATA et

al., 1999; KEIKHAEE et al., 2007). A expressão do Bcl-2, uma oncoproteína inibitória de

apoptose é ligeiramente maior nos padrões sólido e cribriforme do CAC. Considerando que o

Bcl-2 desempenha um papel importante na regulação da apoptose, esta proteína pode

funcionar como um marcador de prognóstico nos CACs (JIA et al,. 2004).

Moléculas de adesão celular são encontradas na superfície de todas as células e têm um

importante papel nas interações célula-célula e célula-MEC (LYONS et al., 2005). Várias

famílias de moléculas de adesão têm sido identificadas como a superfamília das

imunoglobulinas (CAMs), caderinas, integrinas, CD44 e selectinas. Estas moléculas estão

envolvidas em processos como crescimento, proliferação, organização espacial e migração,

tanto em condições fisiológicas como patológicas incluindo inflamação, invasão tumoral e

metástases (LYONS, JONES, 2007). Estudos indicam que uma redução na expressão da

proteína ICAM-1 (do inglês, intercellular adhesion molecule 1, conhecida como CD54), está

associada com o aumento de metástases a distância e a um pior prognóstico em CACs

(SHIRAI et al.,2003; LYONS et al., 2005; XUE et al., 2005). O aumento da expressão da

proteína VCAM-1 (do inglês, vascular cell adhesion protein 1, conhecida como CD106) em

CACs também tem sido associada com o nível de metástases nestes tumores (XUE et al.,

2005). Uma associação entre metilação do gene da E-caderina e uma redução da expressão

desta molécula também foi encontrada nestes tumores (MARUYA et al., 2002; ZHANG et

al., 2007).

A angiogênese é essencial em processos fisiológicos e patológicos, incluindo

embriogênese, cicatrização, inflamação e progressão tumoral (KUMAMOTO, 2006). O

VEGF (do inglês, vascular endothelial growth factor) é uma proteína que exerce uma

atividade mitogênica específica em células endoteliais, estando diretamente relacionada com o

processo de angiogênese. A expressão do VEGF têm sido associada ao prognóstico dos TGS.

Linhagens de células de CAC com alto potencial de metástase expressaram maiores níveis de

VEGF quando comparadas com as linhagens com menor potencial metastático (LIM et al.,

2002). As MMPs apresentam um importante papel em vários processos fisiológicos e

patológicos (POLETTE et al., 2004; PATEL et al., 2006; DE VICENTE et al., 2007, TANG

et al., 2008). Vários estudos avaliaram a expressão das MMPs em diversos tipos de neoplasias

115

(SCHMALFELDT et al., 2001; FRANCHI et al., 2002; RAHKO et al., 2004; TANG et al.,

2008; SOUZA FREITAS et al. 2009), incluindo os TGS (KAYANO et al., 2004; NAGEL et

al., 2004; CHEN et al., 2005; HU et al., 2005; TIAN et al., 2005; WANG et al., 2005;

WESTERNOFF et al., 2005; NASCIMENTO, 2006; DE VICENTE et al., 2008;

LUUKKAA et al., 2008; LUUKKAA et al., 2009; ZHANG et al., 2009; LUUKKAA et al.,

2010). Em condições fisiológicas, estas metaloproteinases geralmente são pouco expressas

pelos tecidos enquanto que em processos patológicos, geralmente há superexpressão destas

devido especialmente a um desequilíbrio na atividade das MMPs e TIMPs (PEREIRA et al.,

2005; NAGASE et al., 2006).

O presente estudo avaliou a expressão imuno-histoquímica das MMPs (-2,-7,-9 e -26) e

dos TIMPs (-1 e -2) em APs e CACs de glândulas salivares menores. A técnica da imuno-

histoquímica permite o estudo da presença de MMPs no parênquima e estroma tumoral,

combinando os aspectos histológicos aos imuno-histoquímicos. Entretanto, este método não

permite avaliar a atividade enzimática das MMPs, discriminando as suas formas latentes e

ativas. Devido a atividade enzimática ser mais informativa do que a antigenicidade, alguns

autores tem utilizado a zimografia em seus estudos (KAYANO et al., 2004; NAGEL et al.,

2004; CHEN et al., 2005; TIAN et al., 2005). No entanto, Ikebe et al. (1999) demonstraram

que a atividade gelatinolítica das MMPs -2 e -9 detectada pela zimografia foi

significativamente correlacionada com o grau de marcação imuno-histoquímica detectada em

cortes congelados dos mesmos espécimes de biópsia. A imuno-histoquímica apresenta

vantagens porque permite a correlação direta dos seus achados com a morfologia, além de

poder ser realizada em espécimes parafinados tornando o método mais prático para estudos

envolvendo MMPs e TIMPs.

Dentre as MMPs, em especial as gelatinases (MMPs -2 e -9), parecem assumir um

papel importante no desenvolvimento e no comportamento dos TGS, participando ativamente

das interações entre as células epiteliais e os componentes mesenquimais (KAYANO et al.,

2004; NAGEL et al., 2004; CHEN et al., 2005; HU et al., 2005; TIAN et al., 2005; DE

VICENTE et al., 2008; LUUKKAA et al., 2008; LUUKKAA et al., 2009; ZHANG et al.,

2009).

No presente estudo, ao se avaliar a expressão imuno-histoquímica das MMP-2 e -9 em

APs e CACs, observou-se que a maioria dos APs exibiu uma forte expressão destas duas

gelatinases no parênquima tumoral, assim como os CACs. Entretanto, apenas a MMP-9

demonstrou uma diferença significativa de expressão entre os dois tipos de tumores,

apresentando o CAC uma marcação mais intensa para esta gelatinase (p=0,041).

116

A MMP-9 é capaz de degradar várias proteínas da MEC incluindo a laminina, o

colágeno IV e a fibronectina. A MMP-2 além destas proteínas, também é capaz de clivar a

tenascina (STERNLICHT, WERB, 2001; KERKELA, SAARIALHO-KERE, 2003;

FOLGUERAS et al., 2004). Alguns estudos revelaram a expressão destas proteínas em APs e

CACs (RAITZ et al., 2003; FELIX et al., 2004; BENTO et al., 2006), sugerindo que a

expressão destas gelatinases nos tumores do presente estudo pode estar relacionada ao

processo de remodelação tecidual em ambos os tumores. Porém, apenas a MMP-9,

significativamente expressa nos CACs, parece estar envolvida no comportamento mais

agressivo destes tumores. Estes achados estão de acordo com o estudo de Vicente et al.

(2008), que encontraram uma alta expressão da MMP-9 em tumores malignos de glândula

salivar, incluindo os CACs.

Por outro lado, outros estudos revelaram uma alta expressão tanto da MMP-2 como da

MMP-9 em tumores malignos e benignos de glândulas salivares. Nagel et al., (2004)

evidenciaram uma elevada expressão da MMP-2 em tumores malignos (carcinomas

mucoepidermóides, carcinomas de células basais e adenocarcinoma polimorfo de baixo grau)

quando comparados aos APs (p=0,0028). Tian et al. (2005), encontrou uma expressão

significativamente mais alta das MMPs-2 e -9 em carcinomas quando comparados aos APs

(p<0,05). Zhang et al., (2009), encontraram uma expressão mais alta das MMPs -2 e -9 em

células mioepiteliais do estroma tumoral dos APs, sugerindo que estas células poderiam ter

um papel importante no desenvolvimento e progressão destes tumores.

No presente estudo, além de expressas no parênquima tumoral, as MMPs-2 e -9

também foram imunoreativas em células estromais. A expressão da MMP-2 foi evidenciada

em fibroblastos e células endoteliais enquanto a MMP-9 foi expressa principalmente em

células inflamatórias presentes no estroma tumoral. Estudos na literatura demonstraram a

expressão da MMP-2 em vários tipos celulares, incluindo fibroblastos, macrófagos,

ceratinócitos, células endoteliais, células epiteliais, condrócitos, osteoblastos e monócitos. A

expressão da MMP-9 foi descrita em macrofágos, neutrófilos, eosinófilos, leucócitos,

osteoclastos e ceratinócitos (MATTU et al., 2000; OPDENAKKER et al., 2001; XU et al.,

2005; AM;LINEIăet al., 2007; NÖEL et al., 2008).

Segundo alguns autores, no processo de invasão tumoral tanto é importante a

degradação da MEC através da proteólise, como a interação das células tumorais com os

componentes celulares e estruturais ao redor do tumor (KESSENBROCK et al., 2010;

RODRÍGUEZ et al., 2010). A literatura é concordante quanto ao papel do microambiente

estromal na progressão tumoral em vários experimentos, tornando-se evidente a cooperação

117

ou sinergismo entre as células neoplásicas e estromais na produção de MMPs (FRANCHI et

al., 2002; DE VICENTE et al., 2005; ZIGRINO et al., 2005). Para Lynch e Matrisian

(2002), as MMPs de origem tumoral ou estromal podem processar moléculas da superfície

celular, proteínas, fatores de crescimento e citocinas armazenadas na MEC, causando

alterações no microambiente, favorecendo assim o crescimento tumoral, migração, invasão,

angiogênese e seleção de clones celulares resistentes a apoptose. Desta forma, estes autores

acreditam que as MMPs podem ser utilizadas como um meio de comunicação entre as células

tumorais e estromais.

Alguns estudos sobre a expressão da MMP-9 em TGS malignos sugerem que estes

tumores são heterogêneos no seu potencial de produzir a gelatinase B. Devido a produção de

MMPs por células normais ser regulada por fatores de crescimento e citocinas (KERR et al.,

1998), a heterogeneidade na expressão de MMP-9 em células dos TGS pode ser causada por

diferentes propriedades das células individuais relacionadas a expressão de receptores

específicos (HONG et al., 2000).

O padrão de expressão da MMP-9 em células do parênquima tumoral ou estromais pode

ser dependente do tipo de tumor. Esta protease foi encontrada em células tumorais e estromais

de APs, carcinomas de glândulas salivares de alto grau e carcinomas espinocelulares de

pulmão, diferentemente do câncer gástrico, onde a gelatinase B foi expressa apenas em

células estromais (TORII et al.,1997; VICENTE et al., 2008; ZHANG et al., 2009).

Independentemente do tipo de tumor, no presente estudo, encontramos a expressão da

gelatinase B em células estromais e tumorais, o que pode sugerir que as células estromais

possam também estar envolvidas nos processos de remodelação e proteólise da MEC,

inclusive potencializando a ação das células tumorais significativamente expressas nos CACs

durante o processo de invasão destes tumores. Para SHIMAJIRI et al. (1999), estas diferenças

fenotípicas de expressão entre as células tumorais e estromais pode ser parcialmente causada

por diferenças na região promotora do gene que codifica a MMP-9. A região promotora deste

gene exibe sítios de ligação para diversos fatores de transcrição incluindo o NF-B. O

aumento na expressão deste fator de transcrição, assim como do VEGF, tem sido associado a

promoção da angiogênese tumoral. Linhagens de células de CAC com alto potencial de

metástase expressaram maiores níveis de atividade do NF-せBă quandoă comparadasă comă asă

linhagens com menor potencial metastático (LIM et al., 2002).

No presente estudo as MMPs-2 e -9 também foram expressas em células ductais e não

demostraram imunoreatividade nas células acinares dos fragmentos de glândulas salivares

presentes nestes tumores. As áreas de diferenciação escamosa e condróide também

118

evidenciaram uma forte imunomarcação para estas gelatinases, estando estes achados de

acordo com outros estudos (NAGEL et al., 2004; ZHANG et al., 2009).

Estudos envolvendo as MMPs -7 e -26 em TGS são raros. Até o momento, apenas um

estudo avaliou a expressão destas matrilisinas em APs (NASCIMENTO, 2006) e a expressão

da MMP-7 em tumores malignos de glândulas salivares (LUUKKA et al., 2010). Sendo

assim, até o presente momento, este é o primeiro estudo que compara a expressão destas duas

matrilisinas em APs e CACs.

No presente estudo ao se avaliar a expressão imuno-histoquímica das MMP-7 e -26

em APs e CACs, observou-se que a maioria dos APs exibiu uma forte expressão destas duas

matrilisinas no parênquima tumoral similar aos CACs, entretanto, não foi observada uma

diferença significativa na expressão da MMP-7 (p=0,081) e MMP-26 (p=0,553) entre os dois

tumores.

Luukka et al. (2010), encontraram uma alta expressão da MMP-7 em CACs quando

comparado ao carcinoma do ducto salivar, sendo esta expressão associada com a pior taxa de

sobrevida global em pacientes com CACs.

Estudos prévios envolvendo pacientes com outros tumores sólidos, como o

adenocarcinoma pancreático e carcinoma espinocelular de esôfago revelaram que o aumento

da expressão das MMPs-7 e -26 esteve associado com o pior prognóstico destes tumores

(YAMASHITA et al., 2000; YAMAMOTO et al., 2001; BISTER et al., 2007). A expressão

da MMP-7 também foi relacionada com o aumento de recorrências no câncer hepatocelular

(YAMAMOTO et al., 1999).

Para Ala-aho e Kähäri (2005), a expressão da MMP-7 em células tumorais pode ser

causada por uma incompleta diferenciação celular, desde que o tecido salivar saudável

também expresse a MMP-7. No presente estudo, as células epiteliais ductais e algumas células

acinares dos fragmentos de glândula salivar próximos de alguns tumores mostravam-se

fracamente imunomarcados pela MMP-7, estando estes achados de acordo com outros relatos

(SAARIALHO-KERE et al., 1999; LUUKKA et al., 2010). Nascimento (2006), analisou a

expressão das MMPs-7 e -26 em glândulas salivares em desenvolvimento, adultas e em APs.

Foi evidenciado uma alta expressão destas matrilisinas nestes tumores quando comparados ao

tecido glandular saudável (p<0,001), independente do tipo estromal dos APs. O estudo

observou ainda que a MMP-7 foi mais expressa nestes tumores do que a MMP-26 (p=0,045).

As matrilisinas 1 e 2 assim como as gelatinases também são capazes de degradar

proteínas da MEC expressas em APs e CACs. Estas proteinases também atuam em outros

119

substratos como o TNF-g, a proteína básica da mielina, o FasL, a E-caderina, a osteopontina e

os fatores de crescimento, fibrinogênio e serpin inativo (SIRES et al.,1994; PARK et al.,

2002; ZHAO et al., 2003; NAGASE et al., 2006).

Adicionalmente, a MMP-7 ativa formas latentes de outras MMPs (proMMP-1, -2 e -

9) e a MMP-26 também ativa a MMP-9 (WILSON, MATRISIAN, 1996; KUULA et al.,

2008). Como as gelatinases estão envolvidas em processos de invasão e metástases

(FRANCHI et al., 2002; PINHEIRO et al., 2004) e considerando que a MMP-9 foi

significativamente expressa nos CACs do presente estudo, nossos achados sugerem a

participação indireta destas matrilisinas influenciando o comportamento dos CACs, uma vez

que a forte expressão destas proteinases pode estar relacionada com a ativação da MMP-9

nestes tumores.

No presente estudo ao se avaliar a expressão imuno-histoquímica dos TIMPs-1 e -2

em APs e CACs, observou-se que a maioria dos APs exibiu uma forte expressão destes

inibores no parênquima tumoral, similar aos CACs. Os dados não revelaram uma diferença

significativa na expressão dos TIMPs -1 (p=0,657) e -2 (p=0,248) entre estes dois tumores.

Estes achados foram semelhantes aos encontrados por outros autores (NAGEL et al., 2004;

ZHANG et al., 2009).

Estudos têm descrito os TIMPs como proteínas multifuncionais envolvidos em

processos de diferenciação celular, crescimento, migração, invasão, angiogênese e apoptose,

não limitando a sua função apenas a inibição das MMPs (SEO et al., 2003; STETLER-

STEVENSON, 2008; BREW, NAGASE, 2010).

Os TIMPs são produzidos em vários tecidos, apesar de todos eles não expressarem os

quatro tipos de TIMPs descritos na literatura. A maioria das células mesenquimais e

epidérmicas é capaz de produzir estes inibidores (ROWE et al., 1997). O equilíbrio entre

MMPs e TIMPs é variável, tanto em processos fisiológicos como em condições patológicas,

incluindo o câncer (KERKELÄ, SAARIALHO KERE, 2003; LAMBERT et al., 2004). Para

Nagel et al. (2004), o distúrbio no balanço entre MMPs e TIMPs encontrado em TGS

malignos é devido a super-regulação das MMPs e não a baixa regulação dos TIMPs.

Os CACs avaliados neste estudo apresentaram uma expressão distinta dos TIMPs -1 e

-2 nos diferentes padrões de crescimento, onde no padrão sólido foi evidenciada uma

imunomarcação mais proeminente quando comparado aos padrões tubular e cribriforme,

estando estes achados de acordo com relatos prévios (WANG et al., 2005; VICENTE et al.,

2008)

120

Nos fragmentos de glândula salivar presentes nos espécimes, o epitélio ductal

mostrava-se também imunomarcado pelos TIMPs, diferentemente das células acinares que

não expressaram estes inibidores, achados estes de acordo com de outros estudos (NAGEL et

al., 2004; ZHANG et al., 2009).

Os resultados do presente estudo não revelaram uma correlação significativa entre a

expressão das MMPs e TIMPs estudados e variáveis clínicopatológicas nos APs (sexo, idade,

localização anatômica e tipo de estroma) e CACs (sexo, idade, localização anatômica e padrão

de invasão) com exceção da expressão da MMP-2, que apresentou uma correlação

significativa com a variável sexo nos CACs (p= 0,044). Para M<rg<ritescuăet al. (2005), os

subtipos histológicos dos APs não apresentam relação com o prognóstico destes tumores.

Entretanto, algumas características clinicopatológicas tem sido descritas como desfavoráveis

ao prognóstico de CACs incluindo idade, localização anatômica, estágio avançado da doença,

padrão histológico sólido, invasão perineural e vascular, margem cirúrgica positiva, doença

recorrente e metástase (MATSUBA et al. 1986; NASCIMENTO et al., 1986; SPIRO et al.,

1992; CHUMMUN et al., 2001; KHAN et al., 2001; TAKAGI et al., 2001; CHHIENG,

PAULINO, 2002; LICITRA et al., 2003; SUNG et al., 2003; KOKEMUELLER et al., 2004;

EL-NAGGAR, HUVOS, 2005; RAPIDIS et al., 2005; DA CRUZ PEREZ et al., 2006;

CICCOLALLO et al., 2009).

Para alguns autores, as características histológicas per se, não têm conseguido prever

o comportamento biológico dos tumores mioepiteliais. A maioria dos tumores exibindo

invasão perineural, atipia celular, alta taxa mitótica e necrose se comportam de forma

agressiva mas, estas mesmas características também foram descritas em tumores com

comportamento indolente (DARDICK, 1985; NAGAO et al., 1988).

De Vicente et al. (2008), em seu estudo envolvendo carcinomas de glândulas salivares

de alto grau (carcinomas adenóides císticos, tumores mistos malignos e carcinomas

indiferenciados), não encontraram nenhuma associação entre a expressão da MMP-9 e

variáveis como idade, sexo, consumo de tabaco e bebidas alcóolicas, localização anatômica,

tipo de tumor, tamanho ou recorrência tumoral. Entretanto, a imunoreatividade desta

gelatinase foi significativamente correlacionada com os componententes do sistema TNM,

especialmente o N (p=0,04) e os estágios do TNM (p=0,03).

Como as MMPs degradam as proteínas da MEC, a sua função primária tem sido

presumida como de remodelação tecidual. Entretanto, além de degradar os componentes da

MEC, estas endoproteinases também são capazes de regular várias outras funções, incluindo

crescimento celular, apoptose, angiogênese, invasão, metástase e resposta imune, através da

121

ação sob fatores de crescimento, moléculas de adesão celular e outras proteínas bioativas

(SIRES et al., 1994; EGEBLAD, WERB, 2002; KERKELA, SAARIALHO-KERE, 2003;

PINHEIRO et al., 2004; NAGASE et al., 2006).

A MEC é uma malha complexa de moléculas estruturais e sinalizadoras que fornecem

um suporte dinâmico para as células e tecidos, bem como abrigam informações que modulam

o comportamento celular (MOTT, WERB, 2004). Embora seja mais abrangente a

compreensão em relação as MMPs, descobertas recentes ainda tem analisado as

especificidades do substrato, geralmente indicando que todos os componentes da MEC podem

ser clivados por um ou mais dos 23 membros da família das MMPs humanas e seus ortólogos

(NAGASE, WOESSNER, 1999; MOTT, WERB, 2004; PAGE-McCAW et al., 2007).

Para Rodríguez et al. (2010) a restrição funcional das MMPs a enzimas puramente

degradativas da MEC tem frustrado a análise imparcial das atividades das MMPs in vivo para

outras funções biológicas potencialmente mais importantes. Vários relatos têm mostrado que

as MMPs estão diretamente implicadas em quase todos os processos biológicos que envolvem

a remodelação da matriz em todo o ciclo de vida dos mamíferos, da implantação do embrião

(ALEXANDER et al., 1996) à morte celular ou necrose (EGEBLAND, WERB, 2002;

CURRIE et al., 2007). A proteólise dirigida pelas MMPs também tem sido associada a vários

eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento, incluindo ramificação ductal das

glândulas mamárias e salivares, a ossificação e a remodelação dos vasos sanguíneos (VU,

WERB, 2000; PATEL et al., 2006; PAGE-McCAW, 2007). As MMPs desempenham um

papel primordial na manutenção das funções do tecido normal, incluindo a cicatrização,

reparação, menstruação, reprodução e defesa imune inata (PARKS et al., 2004; CURRIE et

al., 2007). Assim, como conseqüência, a expressão alterada e/ou desregulada da atividade das

MMPs in vivo tem sido associada ao desenvolvimento de uma grande variedade de patologias,

incluindo doenças inflamatórias crônicas e câncer.

Das diversas funções desempenhadas pelas MMPs, o dogma tradicional ainda insiste que

estas proteinases participam nestas funções pleiotrópicas principalmente através da

degradação da MEC, apesar de tais declarações terem sido suavizadas com a evidência de que

a perda de moléculas de sustentação da MEC pode levar à conseqüente liberação de um

pequeno número de fatores de crescimento levando a exposição de novas proteínas como a

endostatina e a angiostatina para regular a função celular (DONG et al., 1997; FERRERAS et

al., 2000).

Estudos recentes tem revelado papéis mais complexos para MMPs na regulação direta de

moléculas de sinalização do hospedeiro, incluindo a maioria ou quase todas as 54 quimiocinas

122

no homem e também a sua função em células estromais e no sistema imune inato

(OVERALL, 2004; OVERALL, KLEIFELD, 2006; KESSENBROCK et al., 2010). Um

importante tema também emergente é o papel chave das MMPs na mobilização de fatores de

crescimento e imunoglobulinas (DEAN et al., 2007; BUTLER et al., 2008, SIQUEIRA et al.,

2010; YANG et al., 2010).

Um estudo avaliou a expressão imuno-histoquímica das MMPs (-1, -2 e -9), TIMPs (-1 e

-2), fatores de crescimento como o EGF (do inglês, human epidermal growth factor) e TGF-g,

EGFR e do marcador de sinalização celular fosfo-ERK em 13 casos de ameloblastomas

sólidos, tendo como controles 4 casos de tumores odontogênicos císticos calcificantes

(TOCCs). Os resultados demonstraram que os ameloblastomas expressaram as MMPs,

TIMPs, EGF, TGF-gă eă EGFRă tantoă emă célulasă tumoraisă comoă estromais.ăA expressão dos

fatores de crescimento, da MMP-9 e do TIMP-2 foi significativamente alta nos

ameloblastomas quando comparados aos TOCCs. O estudo encontrou uma correlação direta

entre a intensidade de expressão do EGF, TGF-g e TIMPs com o ameloblastoma,

especialmente demonstrada no estroma deste tumor, onde também foi evidenciada uma alta

expressão do fosfo-ERK. Os autores sugerem que a forte interação entre os fatores de

crescimento, MMPs e TIMPs pode contribuir para o comportamento mais agressivo dos

ameloblastomas (SIQUEIRA et al., 2010).

Um outro estudo avaliou a expressão imuno-histoquímica do EMMPRIN (do inglês,

extracellular matrix metalloproteinase inducer), das MMPs (-2 e -9), do VEGF, do Ki-67 e

do CD31 em 72 casos de CACs e 20 casos de glândula salivar normal. O EMMPRIN

desempenha um papel crítico na progressão tumoral por estimular a expressão de MMPs e

VEGF em células estromais. A intensidade de expressão do EMMPRIN foi significativamente

mais alta nos CACs quando comparado aos casos de glândula salivar normal. Esta expressão

também foi positivamente correlacionada com o tamanho do tumor, padrão histológico,

estadiamento clínico, invasão perineural, invasão vascular, metástases e com a expressão das

MMPs-2 e -9, do VEGF, do índice do Ki-67 e do CD31 (P<0,05). A análise também

demonstrou que as expressões do EMMPRIN, do Ki-67 e do padrão histológico sólido

apresentavam um efeito prognóstico independente na sobrevida global dos pacientes com

CACs (P<0,05). De acordo com estes resultados os autores sugerem que o EMMPRIN pode

estar ativamente envolvido no crescimento, angiogênese, invasão e metástase nestes tumores.

Para estes autores, o estudo da expressão deste marcador pode ser importante para melhor

compreender o comportamento dos CACs e predizer o prognóstico nestes tumores (YANG et

al., 2010).

123

A literatura consultada e os resultados do presente estudo sugerem que as MMPs e

TIMPs analisados além da degradação da MEC e inibição das proteinases, podem apresentar

funções mais complexas relacionadas a patogênese e comportamento dos tumores de

glândulas salivares estudados.

Destacamos também que de acordo com o presente estudo, a forte expressão da MMP-9

observada no parênquima tumoral dos CACs sugere que esta gelatinase, envolvida em

processos de invasão tumoral, pode desempenhar um papel importante no comportamento

biológico destes tumores.

Diante dos achados, é possível ainda concluir que apesar de não ocorrer uma diferença

significativa entre as médias das MMPs -2, 7 e 26 nos tumores estudados, os dados quando

analisados em conjunto sugerem que estas proteases podem estar participando de processos de

remodelação tecidual em ambos os tumores. Além disso, as matrilisinas poderiam influenciar

indiretamente o comportamento dos CACs devido a sua capacidade de ativar a MMP-9,

fortemente expressa no parênquima destes tumores.

As células estromais de ambas as neoplasias também se mostraram capazes de expressar

as MMPs e TIMPs, sugerindo que o componente estromal pode ter um papel importante na

patogênese e no comportamento biológico destas lesões.

Desta forma, reafirmamos a necessidade de continuidade na investigação da expressão

de MMPs e TIMPs e sua relação com componentes estromais, bem como, com outros fatores

envolvidos na patogênese e no comportamento dos CACs, em especial os fatores de

crescimento, na tentativa de melhor compreender a atuação e influência dessas proteinases e

seus inibidores teciduais no comportamento biológico dos tumores ora estudados.

CONCLUSÕES

125

7 CONCLUSÕES

Diante dos resultados, é possível concluir que:

1. A maioria dos casos de APs e de CACs exibiu uma forte expressão das MMPs-2 e -9 no

parênquima tumoral. Entretanto, apenas a MMP-9 demonstrou uma diferença significativa

de expressão entre os dois tumores, apresentando o CAC uma marcação mais intensa para

esta gelatinase. Estes dados sugerem que apesar destas gelatinases estarem participando

do processo de remodelação tecidual em ambos os tumores, apenas a gelatinase B parece

estar envolvida no processo de invasividade e ao comportamento mais agressivo dos

CACs.

2. Foi evidenciada uma forte expressão das MMPs-7 e -26 em APs e CACs, embora não

tenha sido observada uma diferença significativa na expressão das mesmas no parênquima

tumoral destes tumores, sugerindo a participação destas matrilisinas no processo de

remodelação tecidual dos dois tumores. Além disso, estas proteases poderiam estar

influenciando indiretamente o comportamento do CAC devido a sua capacidade de ativar

a MMP-9, fortemente expressa nestes tumores.

3. A maioria dos APs e CACs exibiu uma forte expressão dos TIMPs -1 e -2 no parênquima

tumoral, não havendo diferença significativa na expressão destes entre os tumores

estudados de modo a justificar o padrão de agressividade dos CACs à expressão destes

dois marcadores.

4. Os resultados não demostraram uma associação significativa na expressão das MMPs e

TIMPs estudados e os tipos/padrões histológicos respectivamente, dos APs e CACs, de

modo a correlacionar positivamente a expressão destes marcadores e estas variáveis a

patogênese destes tumores ou ao comportamento mais agressivo dos CACs.

REFERÊNCIAS

127

9 REFERÊNCIAS

AHOKAS, K. et al. Matrilysin-2 (Matrix metalloproteinase-26) is upregulated in keratinocytes during wound repair and early skin carcinogenesis. J. Invest. Dermatol., v. 124, p. 849-856, 2005. AIMES, R. T.; QUIGLEY, J. Q. Matrix metalloproteinase-2 is an interstitial collagenase. J. Biol. Chem., v. 270, p. 5872-5876, 1995. ALA-AHO, R.; KÄHÄRI, V. Collagenases in cancer. Biochimie, v. 87, p. 273-286, 2005. ALEXANDER, C. M. et al. Expression and function of matrix metalloproteinases and their inhibitors at the maternal-embryonic boundary during mouse embryo implantation, Development, v. 122, p. 1723-1736, 1996. ALOS, L. et al. Myoepithelial tumors of salivary glands: a clinicopathologic, immunohistochemical, ultrastructural, and flow-cytometric study. Semin. Diagn. Pathol., v. 13, n. 2, p. 138-147, 1996. AL-KHATEEB, T. H; LABABNEH, K.T. Salivary tumors in north Jordanians: a descriptive study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 103, p. e53-e59, 2007. ALVES, F. A et al. PCNA, Ki-67 and p53 expressions in submandibular salivary gland tumours. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 33, p. 593-597, 2004. AM;LINEI,ă C.;ă C;RUNTU,ă I.;ă B;LAN,ă R.ă Biology of metalloproteinases. Rom. J. Morphol. Embryol., v. 48, n. 4, p. 323-334, 2007. AN, J. et al. Proteomics analysis of differentially expressed metastasis-associated proteins in adenoid cystic carcinoma cell lines of human salivary gland. Oral Oncol., v. 40, p. 400-408, 2004. ANDREADIS, D. et al. Detection of C-KIT (CD117) molecule in benign and malignant salivary gland tumours. Oral Oncol., v. 42, p. 57-65, 2006. ANSARI, M. H. Salivary Gland tumors in an Iranian population: a retrospective study of 130 cases. J. Oral Maxillo. Fac. Surg., v. 65, p . 2187-2194, 2007. ARAÚJO, N. S.; ARAÚJO, V. C. Patologia das glândulas salivares. In: ____. Patologia Bucal. São Paulo: Artes Médicas, 1984. cap. 9, p. 169-188. ASHA NAIR, S. et al. Changes in matrix metalloproteinases and their endogenous inhibitors during tumor progression in the uterine cervix. J. Cancer Res. Clin. Oncol., v. 129, n. 2, p. 123-131, 2003. ATTIE, J. N.; SCIUBBA, J. J. Tumors of major and minor salivary glands: clinical and pathologic features. In: ____. Current Problems in Surgery. Chicago: Year Book Medical Publishers Inc, 1981. v. 18, p. 80-81.

128

AUCLAIR, P. L.; ELLIS G. L. Atypical features in salivary gland mixed tumors: their relationship to malignant transformation. Mod. Pathol., v. 9, p. 652-657, 1996. AVERY, C. M. Combined treatment of adenoid cystic carcinoma of the salivary glands. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 29, n. 4, p. 277-279, 2000. AZUMA, M. et al. Suppression of tumor necrosis factor -induced matrix metalloproteinase 9 production by the introduction of a super-repressor form of inhibitor of nuclear factor kB complementary DNA into immortalized human salivary gland acinar cells. Arthritis Rheum, v. 43, p. 1756-1767, 2000. AZUMA, M. et al.ă Roleă ofă cytokinesă ină theă destructionă ofă acinară structureă ină Sjögren’săsíndrome salivary glands. Lab. Invest., v. 77, p. 269-280, 1997. BAILEY, C. M. et al. Biological functions of maspin. J. Cell. Physiol., v. 209, n. 3, p. 617-624, 2006. BANNIKOV, G. A. et al. Substrate binding of gelatinase B induces its enzymatic activity in the presence of intact propeptide. J. Biol. Chem., v. 227, p. 16022-16027, 2002. BARSKY, S. H. Myoepithelial mRNA expression profiling reveals a common tumor-suppressor phenotype. Exp. Mol. Pathol., v. 74, n. 2, p. 113-122, 2003. BATSAKIS, J. G. et al. Adenocarcinomas of the oral cavity: a clinicopathologic study of terminal duct carcinomas. J. Laryngol. Otol., v. 97, p. 825-835, 1983. BATSAKIS, J. G. Salivary gland neoplasia: an outcome of modified morphogenesis and cytodifferentiation. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., v. 49, n. 3, p. 229-232, 1980. BATSAKIS, J. G. et al. Histogenesis of salivary gland neoplasms: a postulate with prognostic implications. J. Laryngol. Otol., v. 103, n. 10, p. 939-944, 1989. BAILEY, C. M. et al. Biological functions of maspin. J. Cell. Physiol., v. 209, n. 3, p. 617-624, 2006. BARROS, A. C. et al. Minor salivary gland tumors in a south american population. Archive of Oncology, v. 18, p. 56-59, 2010. BENTO, P. A. e al. Tenascin and fibronectin in pleomorphic adenoma of salivary gland. J. Appl. Oral Sci., v. 14, n. 3, p. 198-202, 2006. BERNFIELD, M. R.; BANERJEE, S. D. Acid mucopolysaccharide (glycosaminoglycan) at the epithelial-mesenchymal interface of mouse embryo salivary glands. J. Cell. Biol., v. 52, n. 3, p. 664-673, 1972. BIANCHI, B. et al. Adenoid cystic carcinoma of intraoral minor salivary gland. Oral Oncol., v. 44, n. 11, p. 1026-1031, 2008. BILAL, H. et al. p63 is expressed in basal and myoepithelial cells of human normal and tumor salivary gland tissues. J. Histochem. Cytochem., v. 51, n. 2, p. 133-139, 2003.

129

BIRKEDAL-HANSEN, H. et al. Matrix metalloproteinases: a review. Crit. Rev. Oral Biol. Med., v. 4, n. 2, p. 197-250, 1993. BISTER, V. Increased expression of matrix metalloproteinases-21 and -26 and TIMP-4 in pancreatic adenocarcinoma. Mod. Pathol., v. 20, p. 1128-1140, 2007. BJÖRKLUND, M.; HEIKKILÄ, P.; KOIVUNEN, E. Peptide inhibition of catalytic and noncatalytic activities of matrix metalloproteinase-9 blocks tumor cell migration and invasion. J. Biol. Chem., v. 279, p. 29589-97, 2004. BJÖRKLUND, M.; KOIVUNEN, E. Gelatinase-mediated migration and invasion of cancer cells. Biochim. Biophys. Acta, v. 1755, p. 37-69, 2005. BOBBIO, A. et al. Lung metastasis resection of adenoid cystic carcinoma of salivary glands. Eur. J. Cardiothorac. Surg., v. 33, n. 5, p. 790-793, 2008. BRABLETZ, T. et al. -catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinase-7 in human colorectal cancer. Am. J. Pathol., v. 155, p. 1033-8, 1999. BRAKEBUSCH, C. et al. Integrins in invasive growth. J. Clin. Invest., v. 109, n. 8, p. 999-1006, 2002. BREW, K.; DINAKARPANDIAN, D.; NAGASE, H. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim. Biophys. Acta, v. 1477, p. 267-83, 2000. BUCHNER, A.; MERRELL, P. W.; CARPENTER, W. M. Relative frequency of intra-oral minor salivary gland tumors: a study of 380 cases from Northern Califórnia and comparison to reports from other parts of the world. J. Oral Pathol. Med., v. 36, p. 207-214, 2007. BULLERDIEK, J. et al. Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet. Cytogenet., v. 65, p. 27-31, 1993. BUTLER, G. S. et al. Pharmacoproteomics of a metalloproteinase hydroxamate inhibitor in breast cancer cells: dynamics of membrane type 1 matrix metalloproteinase-mediated membrane protein shedding. Mol. Cell. Biol., v. 28, v. 4896-4914, 2008. CARLINFANTE, G. et al. P53, bcl-2 and Ki-67 expression in adenoid cystic carcinoma of the palate: a clinico-pathologic study of 21 cases with long-term follow-up. Pathol. Res. Pract., v. 200, n. 11-12, p. 791-799, 2005. CASTRILLI, G. et al. Expression of hMSH2 and hMLH1 proteins of the human DNA mismatch repair system in salivary gland tumors. J. Oral Pathol. Med., v. 31, p. 234-238, 2002. CAVALCANTE, R. B. Alterações nos genes da E-caderina e く-catenina em adenoma pleomórfico e carcinoma adenóide cístico: estudo molecular e imuno-histoquímico. 2008. 145 f. Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2008.

130

CHAKRABORTI, S. et al. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Mol. Cell. Biochem., v. 253, p. 269-85, 2003. CHEN, Y. et al. The expression of matrix metalloproteinases and theirs tissue inhibitors in pleomorphic adenoma. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, v. 40, p. 58-61, 2005. CHEUK, W.; CHAN, J. K. Advances in salivary gland pathology. Histopathology. v. 51, n. 1, p. 1-20, 2007. CHHIENG, D. C.; PAULINO, A. F. Basaloid tumors of the salivary glands. Ann. Diagn. Pathol., v. 6, p. 364-372, 2002. CHILLA, R.; SCHNEIDER, K.; DROESE, M. Recurrence tendency and malignant transformation of pleomorphic adenomas. HNO, v. 34, p. 467-469, 1986. CHO, K.J.; LEE, S.S.; LEE, Y. S. Proliferating cell nuclear antigen and c-erbB-2 oncoprotein expression in adenoid cystic carcinomas of the salivary glands. Head Neck, v. 21, n. 5, p. 414-419, 1999. CHRISTOFORI, G.; SEMB, H. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene. Trends Biochem. Sci., v. 24, n. 2, p. 73-76, 1999. CHUMMUN, S. et al. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Br. J. Plast. Surg., v. 54, p. 476-480, 2001. CICCOLALLO, L. Survival from salivary glands adenoid cystic carcinoma in European populations. Oral Oncol., v. 45, n. 8, p. 669-674, 2009. COHEN, A. N. et al. Adenoid cystic carcinoma of the submandibular gland: a 35-year review. Otolaryngol. Head Neck Surg., v. 131, p. 994-1000, 2004.

CONLEY, J.; DINGMAN, D. L. Adenoid cystic carcinoma in the head and neck (cylindroma). Arch. Otolaryngol., v. 100, p. 81-90, 1974.

COPELLI, C. et al. Malignant tumors of intraoral minor salivary glands. Oral Oncol., v. 44, n. 7, p. 658-663, 2008. CURRIE, J. C. et al. MT1-MMP downregulates the glucose 6-phosphate transporter expression in marrow stromal cells: a molecular link between pro-MMP-2 activation, chemotaxis, and cell survival. J. Biol. Chem., v. 282, p. 8142-8149, 2007. CURRAN, S.; MURRAY, G. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. J. Pathol., v. 189, p. 300, 2000. DAA, T. et al. Aberrant methylation in promoter regions of cyclin-dependent kinase inhibitor genes in adenoid cystic carcinoma of the salivary gland. APMIS, v. 116, p. 21-26, 2008. DA CRUZ PEREZ, D. E. et al. Prognostic factors in head and neck adenoid cystic carcinoma. Oral Oncol., v. 42, n. 2, p. 139-146, 2006.

131

DA SILVEIRA, E. J. et al. Myoepithelioma of minor salivary gland-an immunohistochemical analysis of four cases. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 72, n. 4, p. 528-532, 2006. DARDICK, I. Malignant myoepithelioma of parotid salivary gland. Ultrastruct. Pathol., v. 9, p. 163-168, 1985. DARDICK, I. Color atlas/text of salivary gland pathology. New York: Igaku-Shoin Medical Publishers, 1996. 274p. DARDICK, I. et al. The pathobiology of salivary gland II: morphological evaluation of acinic cell carcinomas in the parotid gland of male transgenic (MMTV/v-Ha-ras) mice as a model for human tumours. Virchows Arch. A Pathol. Anat., v. 421, p. 105-13, 1992. DARDICK, I.; BURFORD-MASON, A. P. Current status of histogenetic and morphogenetic concepts of salivary gland tumorigenesis. Crit. Rev. Oral. Biol. Med., v. 4, n. 5, p. 639-677, 1993. DARDICK, I.; BYARD, R. W.; CARNEGIE, J. A. A review of the proliferative capacity of major salivary glands and the relationship to current concepts of neoplasia in salivary glands. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., v. 69, n. 1, p. 53-67, 1990. DARDICK, I.; VAN NOSTRAND, A. W. Morphogenesis of salivary gland tumors. A prerequisite to improving classification. Pathol. Annu., v. 22, p. 11-53, 1987. DEAN, R. A. et al. Identification of candidate angiogenic inhibitors processed by matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in cell-based proteomic screens: disruption of vascular endothelial growth factor (VEGF)/heparin affin regulatory peptide (pleiotrophin) and VEGF/Connective tissue growth factor angiogenic inhibitory complexes by MMP-2 proteolysis. Mol. Cell. Biol., v. 27, p. 8454-8465, 2007. DECLERCQ, J. et al. Upregulation of Igf and Wnt signalling associated genes in pleomorphic adenomas of the salivary glands in PLAG1 transgenic mice. Int. J. Oncol., v. 32, p. 1041-1047, 2008. DERYUGINA, E. I. et al. MT1-MMP initiates activation of pro-MMP-2 and integrin v3 promotes maturation of MMP-2 in breast carcinoma cells. Exp. Cell. Res., v. 263, p. 209-23, 2001. DE VICENTE, J. C. et al. Expression and clinical significance of matrix metalloproteinases-2 and matrix metalloproteinases-9 in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 41, p. 283-293, 2005. DE VICENTE, J. C. et al. Expression of MMP-7 and MT1-MMP in oral squamous cell carcinoma as predictive indicator for tumor invasion and prognosis. J. Oral Pathol. Med., v. 36, n. 7, p. 415-424, 2007. DE VICENTE, J. C. et al. Expression of matrix metalloproteinase-9 in high-grade salivary gland carcinomas is associated with their metastatic potential. Laryngoscope, v. 118, n. 2, p. 247-51, 2008.

132

DIAZ, N. M.; MCDIVITT, R. W.; WICK, M. R. Pleomorphic adenoma of the breast: a clinicopathologic and immunohistochemical study of 10 cases. Hum. Pathol., v. 22, p. 1206-1214, 1991. DODD, R. L.; SLEVIN, N. J. Salivary gland adenoid cystic carcinoma: a review of chemotherapy and molecular therapies. Oral Oncol., v. 42, p. 759-769, 2006. DONG, Z. et al. Macrophage-derived metalloelastase is responsible for the generation of angiostatin in Lewis lung carcinoma. Cell., v. 88, p. 801-810, 1997. EBY, L. S.; JOHNSON, D. S.; BAKER, H. W. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Cancer, v. 29, n. 5, p. 1160-1168, 1972. EDWARDS, P. C; BHUIYA, T.; KELSCH, R. D. Assessment of p63 expression in the salivary gland neoplasms adenoid cystic carcinoma, polymorphous low-grade adenocarcinoma and basal cell and canalicular adenomas. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. v. 97, p. 613-619, 2004. EGEBLAD, M.; WERB, Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev. Cancer, v. 2, n. 3, p. 161-174, 2002. ELLEDGE, R. Current concepts in research related to oncogenes implicated in salivary gland tumourigenesis: a review of the literature. Oral Dis., v. 15, p. 249-254, 2009. ELLIS, G. L.; AUCLAIR, P. L. Benign epithelial neoplasms. In: ____. Tumors of the salivary glands: atlas of tumor pathology. 3. ed. Washington, D. C.: Armed Forces Institute of Pathology, 1996. cap. 4, p. 39-136. ELLIS G. L.; AUCLAIR P. L.; GNEPP, D. R. Surgical pathology of the salivary glands. Philadelphia: Saunders, 1991. p. 135-146. EL-NAGGAR, H; HUVOS, A. G. Adenoide cystic carcinoma. In: Barnes, L. et al. (Eds) Pathology and genetics of head and neck tumours. Lyon: IARC Press, 2005. p. 221-222. EL RIFAI, W. et al. Novel DNA copy number losses in chromosome 12q12--q13 in adenoid cystic carcinoma. Neoplasia, v. 3, n. 3, p. 173-178, 2001. ENEROTH, C. M. Salivary gland tumors in the parotid gland, submandibular gland, and the palate region. Cancer, v. 27, n. 6, p. 1415-1418, 1971. ETGES, A. et al. Immunohistochemical expression of retinoblastoma pathway proteins in normal salivary glands and in salivary gland tumours. Oral Oncol., v. 40, p. 326-331, 2004. ETTL, T. et al. Overexpression of EGFR and absence of C-KIT expression correlate with poor prognosis in salivary gland carcinomas. Histopathology, v. 53, p. 567-577, 2008. EVERSOLE, L. R. Histogenic classification of salivary tumors. Arch. Pathol., v. 92, n. 6, p. 433-443, 1971.

133

EVESON, J. W. et al. Pleomorphic adenoma. In: Barnes, L. et al. (Eds) Pathology and genetics of head and neck tumours. Lyon: IARC Press, 2005. p. 254-258. EVESON, J. W. et al. Tumours of the salivary glands: Introduction. In: Barnes, L. et al. (Eds) Pathology and genetics of head and neck tumours. Lyon: IARC Press, 2005. p. 212-215. EVESON, J. W.; CAWSON, R. A. Tumors of the minor (oropharyngeal) salivary glands: a demographic study of 336 cases. J. Oral Pathol., v. 14, n. 6, p. 500-9, 1985. EVESON, J. W. Difficult differential diagnoses in salivary gland tumours. CPD Cell. Pathol., v. 3, p. 9-12, 2001. FATA, J. E. et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev. Biol., v. 306, n. 1, p. 193-207, 2007. FÉLIX, A. et al. Pleomorphic adenoma and carcinoma ex pleomorphic adenoma: immunohistochemical demonstration of the association between tenascin expression and malignancy. Histopathology, v. 45, n. 2, p. 187-192, 2004. FERRERAS, M. et al. Generation and degradation of human endostatin proteins by various proteinases. FEBS Lett, v. 486, p. 247-251, 2000. FIGUEIREDO, C. R. L. V. et al. Estudo epidemiológico de tumores benignos e malignos de glândula salivar - análise de 196 casos em Natal (RN). Rev. ABO Nac., v. 8, n, 6, p. 343-348, 2000/2001. FINGLETON, B. Matrilysin [MMP-7] expression selects for cells with reduced sensitivity to apoptosis. Neoplasia, v. 3, p. 459-68, 2001. FOLGUERAS, A. R. et al. Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies. Int. J. Dev. Biol., v. 48, p. 411-24, 2004. FORDICE, J. et al. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck: predictors of morbidity and mortality. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., v. 125, p. 149-152, 1999. FRANÇA, C. M. et al. The role of basement membrane proteins on the expression of neural cell adhesion molecule (N-CAM) in adenoid cystic carcinoma cell line. Oral Oncol., v. 36, p. 248-252, 2000. FRANÇA, C. M. et al. Effect of N- CAM on in vitro invasion of human adenoid cystic carcinoma cells. Oral Oncol., v. 37, p. 638-642, 2001.

FRANCHI, A. et al. Expression of matrix metalloproteinase 1, matrix metalloproteinase 2, and matrix metalloproteinase 9 in carcinoma of head and neck. Cancer, v. 95, p. 1902-1910, 2002.

134

FRANCHI, A. et al. Reduced E-cadherin expression correlates with unfavorable prognosis in adenoid cystic carcinoma of salivary glands of the oral cavity. Am. J. Clin. Pathol., v. 111, n. 1, p. 43-50, 1999. FREEDMAN, P. D.; LUMERMAN, H. Lobular carcinoma of intraoral minor salivary gland origin: report of twelve cases. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., v. 56, p. 157-166, 1983.

FREITAS, V. M. et al. Laminin-1 and SIRKAV a laminin-1-derived peptide, regulate the morphology and protease activity of a human salivary gland adenoid cystic carcinoma cell line. Oral Oncol., v. 40, p. 483-489, 2004. FREIER, K. et al. Copy number gains on 22q13 in adenoid cystic carcinoma of the salivary gland revealed by comparative genomic hybridization and tissue microarray analysis. Cancer Genet. Cytogenet., v. 159, n. 1, p. 89-95, 2005. FREIER, K. et al. Differential KIT expression in histological subtypes of adenoid cystic carcinoma (ACC) of the salivary gland. Oral Oncol., v. 41, p. 934-939, 2005. FRIDMAN, R. et al. Cell surface association of matrix metalloproteinase-9 (Gelatinase B). Cancer Metastasis Rev., v. 22, p. 153-66, 2003. FRIEDRICH, R. E.; BLECKMANN, V. Adenoid cystic carcinoma of salivary and lacrimal gland origin: localization, classification, clinical pathological correlation, treatment results and long-term follow-up control in 84 patients. Anticancer Res., v. 23, n. 2A, p. 931-940, 2003. FRIERSON JR, H. F. et al. Large scale molecular analysis identifies genes with altered expression in salivary adenoid cystic carcinoma. Am. J. Pathol., v. 161, n. 4, p.1315-1323, 2002. FUKUDA, Y. et al. The role of interstitial collagens in cleft formation of mouse embryonic submandibular gland during initial branching. Development, v. 103, n. 2, p. 259-267, 1988. GARDEN, A. S. et al. The influence of positive margins and nerve invasion in adenoid cystic carcinoma of the head and neck treated with surgery and radiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., v. 32, n. 3, p. 619-626, 1995. GATES G. A. Malignant neoplasms of the minor salivary glands. N. Engl. Med., v. 306, p. 718-722, 1982. GIBBONS, M. D. et al. Molecular differences in mucoepidermoid carcinoma and adenoid cystic carcinoma of the major salivary glands. Laryngoscope, v. 111, p. 1373-1378, 2001. GILL, S. E.; PARKS, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 40, p. 1334-1347, 2008. GNEPP, D. R. Malignant mixed tumors of the salivary glands: a review. Pathol. Annu., v. 28, p. 279-328, 1993.

135

GOFFIN, F. et al. Expression pattern of metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix-metalloproteinases in cycling human endometrium. Biol. Reprod., v. 69, p. 976-84, 2003. GRAESSLIN, O. et al. Metalloproteinase-2, -7 and -9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 expression in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium: a clinical-pathological correlation study. Ann. Oncol., v. 17, p. 637-45, 2006. GREER, R. O. J. et al. Overexpression of cyclin D1 and cortactin is primarily independent of gene amplification in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncol., v. 43, p. 735-741, 2007. GROSS, J.; LAPIERE, C. M. Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 48, p. 1014-22, 1962. GUELSTEIN, V. I. et al. Myoepithelial and basement membrane antigens in benign and malignant human breast tumors. Int. J. Cancer, v. 53, n. 2, p. 269-277, 1993. GUO, F.; JIAN, X. C.; CHENG, R. X. Expression of TGF beta 1 and TGF beta RI proteins in tissues of salivary adenoid cystic carcinoma. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, v. 27, n. 3, p. 229-232, 2002. HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. The hallmarks of cancer. Cell., v. 100, n. 1, p. 57-70, 2000. HAYAKAWA, T.; KISHI, J.; NAKANISHI, Y. Salivary gland morphogenesis: possible involvement of collagenase. Matrix Suppl., v. 1, p. 344-351, 1992. HOFFMAN, M. P. et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development, v. 129, n. 24, p. 5767-5778, 2002. HOLMBECK, K. et al. MT1-MMP-deficient mice develop dwarfism, osteopenia, arthritis, and connective tissue disease due to inadequate collagen turnover. Cell., v. 99, n. 1, p. 81-92, 1999. HOLST, V. A. et al. KIT protein expression and analysis of c-kit gene mutation in adenoid cystic carcinoma. Mod. Pathol., v. 12, p. 956-960, 1999. HONG, S. D. et al. Expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 in oral squamous cell carcinomas with regard to the metastatic potential. Oral Oncol., v. 36, p. 207-213, 2000. HORNEBECK, W. et al. Matrix-directed regulation of pericellular proteolysis and tumor progression. Semin. Cancer Biol., v. 12, p. 231-41, 2002. HORNEBECK, W.; BELLON, G.; EMONARD, H. Fibronectin Type II (FnII)-like modules regulate gelatinase A activity. Pathol. Biol., v. 53, p. 405-10, 2005. HU, J. A. et al. Expression of MMP-2 and E-CD in salivary mucoepidermoid carcinoma and its correlation with infiltration, metastasis and prognosis. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, v. 34, p. 421-426, 2005.

136

II, M. et al. Role of matrix metalloproteinase-7 (Matrilysin) in human cancer invasion, apoptosis, growth, and angiogenesis. Exp. Biol. Med., v. 231, p. 20-7, 2006. IKEBE, T. et al. Gelatinolytic activity of matrix metalloproteinase in tumor tissues correlates with the invasiveness of oral cancer. Clin. Exp. Metastasis, v. 17, p. 315-323, 1999. ITO, F. A. Salivary gland tumors in a Brazilian population: a retrospective study of 496 cases. Int. J. Oral Maxillo. Fac. Surg., v. 34, p. 533-536, 2005. ITO, F. A. et al. Histopathological findings of pleomorphic adenomas of the salivary glands. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal, v. 14, n. 2, p. E57-61, 2009.

IURLARO, M. et al. Angiogenesis extent and expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 correlate with upgrading and myometrial invasion in endometrial carcinoma. Eur. J. Clin. Invest., v. 29, n. 9, p. 793-801, 1999.

JABER, M. A. Intraoral minor salivary gland tumors: a review of 75 cases in a Libyan population. Int. J. Oral Maxillo. Fac. Surg.. v. 35, p. 150-154, 2006. JANSISYANONT, P.; BLANCHAERT JR, R. H.; ORD, R. A. Intraoral minor salivary gland neoplasm: a single institution experience of 80 cases. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 31, p. 257-61, 2002. JASKOLL, T.; MELNICK, M. Submandibular gland morphogenesis: stage-specific expression of TGFalpha/ EGF, IGF, TGF-beta, TNF, and IL-6 signal transduction in normal embryonic mice and the phenotypic effects of TGF-beta2, TGF-beta3, and EGF-r null mutations. Anat. Rec., v. 256, p. 252-68, 1999. JIA, L. et al. Prognostic value of apoptosis and apoptosis-associated proteins in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Pathol. Int., v. 54, p. 217-223, 2004.

JOHN, A.; TUSZYNSKI, G. The role of matrix metalloproteinases in tumor angiogenesis and tumor metastasis. Pathol. Oncol. Res., v. 7, p. 14-23, 2001. JOHNS, M.; GOLDSMITH, M. Incidence, diagnosis and classification of salivary gland tumors. Oncology, v. 3, n. 2, p. 47-56, 1989. JONES, A. V. The range and demographics of salivary gland tumours diagnosed in a UK population. Oral Oncol., v. 44, p. 407-417, 2008.

JUNQUEIRA, L. C; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004, 540 p.

KADOYA, Y. et al. Role for laminin-alpha5 chain LG4 module in epithelial branching morphogenesis. Dev. Biol., v. 263, n. 1, p. 153-164, 2003. KÄHÄRI, V. M.; SAARIALHO-KERE, U. Matrix metalloproteinases in skin. Exp. Dermatol., v. 6, n. 5, p. 199-213, 1997.

137

KALLURI, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumor angiogenesis. Nat. Rev. Cancer, v. 3, p. 422-433, 2003.

KATOPODI, E. et al. Immunohistochemical detection of epidermal growth factor and its receptor in salivary gland carcinomas. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 95, p. 266-268, 2003. KARJA, V. et al. C-erbB-2 oncogene expression in salivary gland tumours. ORL J. Otorhinolaryngol Relat. Spec., v. 56, p. 206-212, 1994. KAS, K. Molecular techniques lead to the first insights into the pathophysiology of salivary gland adenomas. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg., v. 63, n. 1, p. 35-40, 2001. KASAMATSU, A. et al. Identification of candidate genes associated with salivary adenoid cystic carcinomas using combined comparative genomic hybridization and oligonucleotide microarray analyses. Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 37, n. 9, p. 1869-1880, 2005. KASHIMATA, M. W.; SAKAGAMI, H. W.; GRESIK, E. W. Intracellular signalling cascades activated by the EGF receptor and/or by integrins, with potential relevance for branching morphogenesis of the fetal mouse submandibular gland. Eur. J. Morphol., v. 38, n. 4, p. 269-275, 2000.

KATCHBURIAN, E.; ARANA, V. Glândulas salivares. In: ______Histologia e embriologia oral: texto-atlas-correlações clínicas. 2. ed. São Paulo: Panamericana, Guanabara Koogan, 2004. cap. 5, p. 115-145.

KAYANO, K. et al. Activation of pro-MMP-2 mediated by MT1-MMP in human salivary gland carcinomas: possible regulation of pro-MMP-2 activation by TIMP-2. J. Pathol., v. 202, p. 403-411, 2004. KAYEMBE, M. K.; KALENGAYI, M. M. Salivary gland tumors in Congo (Zaire). Odontostomatol. Trop., v. 25, p. 19-22, 2002. KERR, L. D.; HOLT, J. T.; MATRISIAN, L. M. Growth factors regulate transin gene expression by c-fos-dependent and c-fosindependent pathways. Science, v. 242, p. 1424-1427, 1988. KEIKHAEE, M. R. et al. Skp2 expression is associated with down-regulation of p27 protein and cell proliferation in salivary adenoid cystic carcinoma. Virchows Arch., v. 450, p. 567-574, 2007. KERKELA, E.; SAARIALHO-KERE, U. Matrix metalloproteinases in tumor progression: focus on basal and squamous cell skin cancer. Exp. Dermatol., v. 12, n. 2, p. 109-125, 2003.

KESSENBROCK, K.; PLAKS, V.; WERB, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell., v. 141, n. 1, p. 52-67, 2010.

138

KHAN, A. J. et al. Adenoid cystic carcinoma: a retrospective clinical review. Int. J. Cancer, v. 96, n. 3, p. 149-158, 2001. KIM, K. H. The manifestation of proliferating cell nuclear antigen in adenoid cystic carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., v. 120, n. 11, p. 1221-1225, 1994. KITOH, M. et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-7 in invasive early gastric cancer. J. Gastroenterol., v. 39, p. 434-40, 2004. KIYOSHIMA, T. et al. Expression of p53 tumor suppressor gene in adenoid cystic and mucoepidermoid carcinomas of the salivary glands. Oral Oncol., v. 37, p. 315-322, 2001. KLEINER, D. E; STETLER-STEVENSON, W. G. Matrix metalloproteinases and metastasis. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 43, p. 42-51, 1999. KOKEMUELLER, H. et al. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck-a 20 years experience. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 33, p. 25-31, 2004. KOTRA, L. P. et al. Insight into the complex and dynamic process of activation of matrix metalloproteinases. J. Am. Chem. Soc., v. 123, p. 3108-13, 2001. KOYAMA, N. et al. EGF-stimulated signaling by means of PI3K, PLCgamma1, and PKC isozymes regulates branching morphogenesis of the fetal mouse submandibular gland. Dev. Dyn., v. 227, n. 2, p. 216-226, 2003. KOWALSKI, P. J.; PAULINO, A. F. Perineural invasion in adenoid cystic carcinoma: its causation/promotion by brain-derived neurotrophic factor. Hum. Pathol., v. 33, n. 9, p. 933-936, 2002. KUMAMOTO, H. et al. Immunohistochemical detection of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in ameloblastomas. J. Oral Pathol. Med., v. 32, p. 114-20, 2003. KUMAMOTO H. Molecular pathology of odontogenic tumors. J. Oral Pathol. Med., v. 35, p. 65-74, 2006. KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Robbins e Cotran patologia: bases patológicas das doenças. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. 1592 p. KUSAMA, K. et al. Intraoral minor salivary gland tumors: a retrospective study of 129 cases. J. Nihon Univ. Sch. Dent., v. 39, p. 128-132, 1997. LAKHANI, S. R.; O'HARE, M. J. The mammary myoepithelial cell-cinderella or ugly sister? Breast Cancer Res., v. 3, n. 1-4, 2001. LAMBERT, E. et al. TIMPs as multifacial proteins. Crit. Rev. Oncol. Hematol., v. 49, p. 187-198, 2004.

139

LATHORP, C. A; STEWART, J. S.; HOFFMAN, M. P. FGF7, FGF10, and MMPs regulate mouse submandibular gland branching morphogenesis. J. Dent. Res., v. 84, n. Spec Iss A, p. 2194, 2005. LEIVO, I. Insights into a complex group of neoplasic disease: advances in histopathologic classification and molecular pathology of salivary gland cancer. Acta Oncol., v. 45, p. 662-668, 2006. LEPPÄ, S. et al. Clodronate treatment influences MMP-2 associated outcome in node positive breast cancer. Breast Cancer Res. Treat., v. 90, n. 2, p. 117-125, 2005. LEWIS, J. E.; OLSEN, K. D.; SEBO, T. J. Carcinoma ex pleomorphic adenoma: pathologic analysis of 73 cases. Hum. Pathol., v. 32, p. 596-604, 2001. LI, W. et al. MMP-26 is associated with estrogen-dependent malignancies and targets 1-anti-trypsin serpin. Cancer Res., v. 64, p. 8657-65, 2004. LI, L. J. et al. Clinical analysis of salivary gland tumor cases in West China in past 50 years. Oral Oncol., v. 44, n. 2, p. 187-192, 2008. LICITRA, L. et al. Major and minor salivary glands tumours. Crit. Rev. Oncol. Hematol., v. 45, p. 215-225, 2003. LIGGETT, W. H; SIDRANSKY, D. Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer. J. Clin. Oncol., v. 16, p. 1197-1206, 1988. LIMA, S. S. et al. Epidemiologic profile of salivary gland neoplasms: analysis of 245 cases. Rev. Bras. Otorrinolaringol, v. 71, p. 335-340, 2005. LIM, J. J. et al. Expression of vascular endothelial growth factor in salivary gland carcinomas and its relation to p53, Ki-67 and prognosis. J. Oral Pathol. Med., v. 32, p. 552-561, 2002. LYNCH, C. C; MATRISIAN, L. M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation, v. 70, p. 561-573, 2002. LIOTTA, L. A.; KOHN, E. C. The microenvironment of the tumour-host interface. Nature, v. 411, p. 375-379, 2001. LOPES, M. A. et al. A clinicopathologic study of 196 intraoral minor salivary gland tumours. J. Oral Pathol. Med., v. 28, p. 264-267, 1999. LOYOLA, A. M. et al. Minor salivary gland tumours: a retrospective study of 164 cases in a Brazilian population.Oral Oncol. Eur. J. Cancer, v. 31B, p. 197-201, 1995. LU, Y. G. et al. The expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in transplanted tumor of salivary adenoid cystic carcinoma cell lines. Shanghai Kou Qiang Yi Xue, v. 15, p. 526-530, 2006. LUUKKAA, H. et al. Matrix metalloproteinase (MMP)-1, -9 and -13 as prognostic factors in salivary gland cancer. Acta Otolaryngol., v. 128, n. 4, p. 482-490, 2008.

140

LUUKKAA, H. et al. Expression of matrix metalloproteinase-1, -7, -9, -13, Ki-67, and HER-2 in epithelial-myoepithelial salivary gland cancer. Head Neck, v. 32, n. 8, p. 1019-1027, 2010. LUUKKAA, H. et al. Matrix metalloproteinase (MMP)-7 in salivary gland cancer. Acta Oncol., v. 49, n. 1, p. 85-90, 2010. LYONS A. J.; JONES J.; Xie, T. Integrins in metastatic adenoid cystic carcinoma. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 34, p. 912-914, 2005. LYONS A. J.; JONES J. Cell adhesion molecules, the extracellular matrix and oral squamous carcinoma. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 36, p. 671–679, 2007. MARCHENKO, G. N. et al. Characterization of matrix metalloproteinase-26, a novel metalloproteinase widely expressed in cancer cells of epithelial origin. Biochem. J., v. 356, p. 705-18, 2001. MARCHENKO, G. N. et al. Promoter characterization of the novel human matrix metalloproteinase-26 gene: regulation by the T-cell Factor-4 implies especific expression of the gene in cancer cells of epithelial origin. Biochem. J., v. 363, p. 253-62, 2002. MARCHENKO, N. D. et al. く-Catenin regulates the gene of MMP-26, a novel matrix metalloproteinase expressed both in carcinomas and normal epithelial cells. Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 36, p. 942-956, 2004. M;RG;RITESCU,ă C. et al. Tumoral stroma of salivary pleomorphic adenoma – histopathological, histochemical and immunohistochemical study. Rom. J. Morphol. Embryol., v. 46, n. 3, p. 211-223, 2005. MARUYA, S. I. et al. Promoter methylation and protein expression of the E-cadherin gene in the clinicopathologic assessment of adenoid cystic carcinoma. Mod. Pathol., v. 17, p. 637-645, 2002. MARUYA, S. I. et al. Differentialăexpressionăofăp63ăisotypesă(∆NăandăTA)ăinăsalivaryăglandăneoplasms: biological and diagnostic implications. Hum. Pathol., v. 36, p. 821-827, 2005. MATSUBA, H. M. et al. Adenoid cystic carcinoma of major and minor salivary gland origin. Laryngoscope, v. 94, n. 10, p. 1316-1318, 1984. MATSUBA, H. M. et al. Adenoid cystic salivary gland carcinoma. A histopathologic review of treatment failure patterns. Cancer, v. 57, n. 3, p. 519-524, 1986. MATTU, T. S. et al. O-glycan analysis of natural human neutrophil gelatinase B using a combination of normal phase-HPLC and online tandem mass spectrometry: implications for the domain organization of the enzyme. Biochemistry, v. 39, p. 15695-704, 2000. MELNICK, M. et al. Embryonic mouse submandibular salivary gland morphogenesis and the TNF/TNF-R1 signal transduction pathway. Anat. Rec., v. 262, n. 3, p. 318-330, 2001.

141

MENDENHALL, W. M. et al. Radiotherapy alone or combined with surgery for adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Head Neck, v. 26, n. 2, p. 154-162, 2004. MENKO, A. S. et al. Regulation of cadherin junctions during mouse submandibular gland development. Dev. Dyn., v. 224, n. 3, p. 321-333, 2002. MIGLIANICO, L. et al. Cervico-facial adenoid cystic carcinoma: study of 102 cases. influence of radiation therapy. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., v. 13, n. 5, p. 673-678, 1987. MIGNATTI, P.; RIFKIN, D. B. Biology and biochemistry of proteinases in tumour invasion. Physiol. Rev., v. 73, n. 1, 161-195. MIGUEL, M. C. C. Expressão das integrinas g2く1, g3く1 e g5く1 em adenoma pleomórfico de glândula salivar menor e maior e carcinoma adenóide cístico. 2005. 167 f. Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2005. MINO, M.; PILCH, B. Z.; FAQUIN, W. C. Expression of KIT (CD117) in neoplasms of the head and neck: an ancillary marker for adenoid cystic carcinoma. Mod. Pathol., v. 16, p. 1224-1231, 2003.

MISUMI, S. et al. Differential expression of basement membrane type-IV collagen 1, 2, 5 and 6 chains among the histological subtypes of adenoid cystic carcinoma. Virchows Arch., v. 68, p. 205-213, 2004. MONAGHAN, H.; MAcWHINNIE, N.; WILLIANS, A. R. W. The role of matrix metalloproteinases-2,-7 and –9 and -catenin in high grade endometrial carcinoma. Histopathology, v. 50, p. 348-357, 2007. MOOK, O. R. F.; FREDERIKS, W. M.; VAN NOORDEN, C. J. F. The role of gelatinases in colorectal cancer progression and metastasis. Biochim. Biophys. Acta, v. 1705, p. 69-89, 2004. MOTT, J. D.; WERB, Z. Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr. Opin. Cell. Biol., v. 16, p. 558-564, 2004. MORÁN, A. et al. Clinical relevance of MMP-9, MMP-2, TIMP-1 and TIMP-2 in colorectal cancer. Oncol. Rep., v. 13, n. 1, p. 115-120, 2005. MORINAGA, S.; NAKAJIMA, T.; SHIMOSATO, Y. Normal and neoplastic myoepithelial cells in salivary glands: an immunohistochemical study. Hum. Pathol., v. 18, p. 1218-1226, 1987. MORITA, K.; NOGAWA, H. EGF-dependent lobule formation and FGF7-dependent stalk elongation in branching morphogenesis of mouse salivary epithelium in vitro. Dev. Dyn., v. 215, n. 2, p. 148-154, 1999. MURPHY, G.; NAGASE, H. Progress in matrix metalloproteinase research. Mol. Aspects Med., v. 29, n. 5, p. 290-308, 2008.

142

NABESHIMA, K. et al. Matrix metalloproteinases in tumor invasion: role for cell migration. Pathol. Int., v. 52, p. 255-64, 2002. NAGAO, T. et al. Salivary gland malignant myoepithelioma: a clinicopathologic and immunohistochemical study of ten cases. Cancer, v. 83, p. 1292-1299, 1998. NAGASE, H.; VISSE, R.; MURPHY, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovasc. Res., v. 69, n. 3, p. 562-573, 2006. NAGASE, H.; WOESSNER, J. F. J. Matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem, v. 274, p. 21491-21494, 1999.

NAGEL, H. et al. Expresión of matriz metalloproteinases MMP-2,MMP-9 and their tissue inhibitors TIMP-1 ,-2, and –3 in benign and malignant tumours of the salivary gland. Histopathol., v. 44, p. 222-231, 2004. NAKANISHI, Y.; MORITA, T.; NOGAWA, H. Cell proliferation is not required for the initiation of early cleft formation in mouse embryonic submandibular epithelium in vitro. Development, v. 99, n. 3, p.429-437, 1987. NAKANISHI, Y. et al. Collagenase inhibitor stimulates cleft formation during early morphogenesis of mouse salivary gland. Dev. Biol., v. 113, n. 1, p 201-206, 1986. NAKANISHI, Y. et al. Accumulation of collagen III at the cleft points of developing mouse submandibular epithelium. Development, v. 104, p. 51-59, 1988. NASCIMENTO, A. G. et al. Adenoid cystic carcinoma of salivary glands. A study of 61 cases with clinicopathologic correlation. Cancer, v. 57, n. 2, p. 312-319, 1986. NASCIMENTO, G. J. F. Matrilisinas em adenoma pleomórfico de glândula salivar menor e em glândulas salivares humanas em desenvolvimento e adultas: estudo imuno-histoquímico. 2006. 125 f. Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2006. NAVARRO, R. L.; MARTINS, M. T.; ARAÚJO, V. C. Maspin expression in normal and neoplastic salivary gland. J. Oral Pathol. Med., v. 33, n. 7, p. 435-440, 2004. NEGRI, T. et al. TrkA, HER-2/neu and kit expression/activation Profiles in Salivary Gland Carcinoma.Translational. Oncol., v. 1, p.121-128, 2008.

NEVILLE, B. W. et al. Patologia das glândulas salivares. In: ____. Patologia oral & maxilofacial. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. cap. 11, p. 373-417. NGUYEN, M.; ARKELL, J.; JACKSON, C. J. Human endothelial gelatinases and angiogenesis. IJBCB, v. 33, p. 960-70, 2001. NGUYEN, M. et al. The human myoepithelial cell displays a multifaceted anti-angiogenic phenotype. Oncogene, v. 19, n. 31, p. 3449-3459, 2000.

143

NIKKOLA, J. et al. High serum levels of matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-1 are associated with rapid progression in patients with metastatic melanoma. Clin. Cancer Res., v. 11, n. 14, p. 5158-5166, 2005. NISHIMINE, M. et al. Alterations of p14ARF and p16INK4a genes in salivary gland carcinomas. Oncol. Rep., v. 10, n. 3, p. 555-560, 2003. NÓBREGA, M. Q. R. et al. Neoplasias de glândulas salivares menores: estudo retrospectivo de 83 casos, RGO, v. 58, n. 3, p. 357-362, 2010. NÖEL, A.; JOST, M.; MAQUOI, E. Matrix metalloproteinase at cancer tumor-host interface. Cell. Dev. Biol., v. 19, p. 52-60, 2008. NOGAWA, H.; TAKAHASHI, Y. Substitution for mesenchyme by basement-membrane-like substratum and epidermal growth factor in inducing branching morphogenesis of mouse salivary epithelium. Development, v. 112, n. 3, p 855-861, 1991. NORDKVIST, A. et al. Non-random chromosome rearrangements in adenoid cystic carcinoma of the salivary glands. Genes Chromosomes Cancer, v. 10, n. 2, p. 115-121, 1994. OBLANDER, S. A. et al. Distinctive functions of membrane type 1 matrix-metalloprotease (MT1-MMP or MMP-14) in lung and submandibular gland development are independent of its role in pro-MMP-2 activation. Dev. Biol., v. 277, n. 1, p. 255-269, 2005. OH, J. Tissue inhibitors of metalloproteinase 2 inhibits endothelial cell migration through increased expression of RECK. Cancer Res., v. 64, n. 24, p. 9062-9069, 2004. OLSEN, K. D.; LEWIS, J. E. Carcinoma ex pleomorphic adenoma: a clinicopathologic review. Head Neck, v. 23, p. 705-712, 2001. OPDENAKKER, G.; VAN DEN STEEN, P. E.; VAN DAMME, J. Gelatinase B: a tuner and amplifier of immune functions. TRENDS Immunol., v. 22, n. 10, p. 571-9, 2001. OVERALL, C. M. Dilating the degradome: matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) cuts to the heart of the matter. Biochem. J., v. 383, p. e5-e7, 2004. OVERALL, C. M.; KLEIFELD, O. Tumour microenvironment-opinion: validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer, v. 6, p. 227-239, 2006. PAGE-MCCAW, A.; EWALD, A. J.; WERB Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., v. 8, n. 3, p.221-233, 2007. PANDE, P. et al. Prb and p16 protein alterations in human oral tumorigenesis. Oral Oncol., v. 34, p. 396-403, 1998. PAPADAKI, H. et al. The role of P53 mutation and protein expression in primary and recurrent adenoid cystic carcinoma. Hum. Pathol., v. 27, p. 567-572, 1996.

144

PARK, H. I. et al. Peptide substrate specificities and protein cleavage sites of human endometase/matrilysin-2/matrix metalloproteinase-26. J. Biol. Chem., v. 277, p. 35168-75, 2002. PARKS, W. C.; LÓPEZ-BOADO, Y. S.; WILSON, C. L. Matrilysin in epithelial repair and defense. Chest, v. 120, p. 36-41, 2001. PARKS, W. C.; WILSON, C. L.; LOPEZ-BOADO, Y. S. Matrix metalloproteinases asmodulators of inflammation and innate immunity. Nat. Rev. Immunol., v. 4, p. 617-629, 2004. PASTORE, A; CARINCI, F; PELUCCHI, S. Genetic expression profiling of parotid neoplasms by cDNA microarrays. Acta Otorhinolaryngol Ital, v. 25, p. 156-160, 2005. PASSLICK, B. et al. Overexpression of matrix metalloproteinase 2 predicts unfavorable outcome in early-stage non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res., v. 6, n. 10, p. 3944-3948, 2000. PATEL, V. N.; REBUSTINI, I. T.; HOFFMAN, M. P. Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation, v. 74, n. 7, p. 349-64, 2006. PATTERSON, M. L. et al. Specific collagenolysis by gelatinase A, MMP-2, is determined by the hemopexin domain and not the fibronectin-like domain. FEBS Lett, v. 503, p. 158-62, 2001. PENNER, C. R.; FOLPE, A. L.; BUDNICK, S. D. C-kit expression distinguishes salivary gland adenoid cystic carcinoma from polymorphous low-grade adenocarcinoma. Mod. Pathol., v. 15, p. 687-691, 2002. PEREIRA, A. L. A. et al. O papel das proteínas da matriz extracelular e das metaloproteinases em carcinomas de cabeça e pescoço: uma atualização bibliográfica. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 71, n. 1, p. 81-86, 2005. PÉREZ, P. et al. Increased acinar damage of salivary glands of patientsă withă Sjogren’săsíndrome is paralleled by simultaneous imbalance of matrix metalloproteinase 3/tissue inhibitor of metalloproteinases 1 and matrix metalloproteinase 9/tissue inhibitor of metalloproteinases 1 ratios. Arthritis Rheum., v. 52, p. 2751-2760, 2005. PEREZ-ORDONEZ, B. Selected topics in salivary gland tumour pathology. Curr. Diagn. Pathol., v. 9, p. 355-365, 2003. PINHEIRO, J. J. et al. Local invasiveness of ameloblastoma: role played by matrix metalloproteinases and proliferative activity. Histopathology, v. 45, p. 65-72, 2004. PIRES, F. R. et al. Intra-oral minor salivary gland tumors: a clinicopathological study of 546 cases. Oral Oncol., v. 43, n. 5, p. 463-470, 2007. POLETTE, M. et al. Tumour invasion and matrix metalloproteinases. Crit. Rev. Oncol. Hematol., v. 49, n. 3, p. 179-186, 2004

145

PRESS, M. F. et al. Amplification and overexpression of HER-2/neu in carcinomas of the salivary gland: correlation with poor prognosis. Cancer Res., v. 54, n. 21, p. 5675-5682, 1994. PROKOPAKIS, E. P. et al. Risk factors for local recurrence of adenoid cystic carcinoma: the role of postoperative radiation therapy. Am. J. Otolaryngol., v. 20, n. 5, p. 281-286, 1999. PYKE, C. et al. Messenger RNA for two type IV collagenases is located in stromal cells in human colon cancer. Am. J. Pathol., v. 142, p. 359-365, 1993. QUEIMADO, L. et al. A refined localization of two deleted regions in chromosome 6q associated with salivary gland carcinomas. Oncogene, v. 16, n. 1, p. 83-88, 1998. RAITZ, R.; MARTINS, M. D.; ARAÚJO, V. C. A study of the extracellular matrix in salivary gland tumors. J. Oral Pathol. Med., v. 32, n. 5, p. 290-296, 2003. RAHKO, E. et al. Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) immunoreactive protein has modest prognostic value in locally advanced breast carcinoma patients treated with an adjuvant antiestrogen therapy. Anticancer Res., v. 24, n. 6, p. 4247-4253, 2004. RAPIDIS, A. D. et al. Adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Clinicopathological analysis of 23 patients and review of the literature. Oral Oncol., v. 41, n. 3, p. 328-35, 2005. RAVANTI, L.; KÄHÄRI, V. M. Matrix metalloproteinases in wound repair (review). Int. J. Mol. Med., v. 6, n. 4, p. 391-407, 2000. REGEZI, J. A.; SCIUBBA, J. J. Doenças das glândulas salivares. In: ____. Patologia bucal: correlações clinicopatológicas. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. cap. 8, p. 195-243. REGEZI, J. A.; BATSAKIS, J. G. Histogenesis of salivary gland neoplasms. Otolaryngol. Clin. North Am., v. 10, n. 2, p. 297-307, 1977. RIEDEL, F. et al. Serum levels of matrix metalloproteinase-2 and -9 in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Anticancer Res., v. 20, n. 5A, p. 3045-3049, 2000. RIVERA-BASTIDAS, H.; OCANTO, R. A; ACEVEDO, A. M. Intraoral minor salivary gland tumors: a retrospective study of 62 cases in a Venezuelan population. J. Oral Pathol. Med., v. 25, p. 1-4, 1996. RODRÍGUEZ, D.; MORRISON, C. J; OVERALL, C. M. Matrix metalloproteinases: what do they not do? new substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta, v. 1803, p. 39-54, 2010. ROIJER, E. et al. Observations by chromosome banding, FISH and immunohistochemistry in an adenoid cystic carcinoma with del(17)(p13) as the sole deviation. Virchows Arch., v. 430, n. 4, p. 339-342, 1997.

146

ROLLI, M. et al. Activated integrin v3 cooperates with metalloproteinase MMP-9 in regulating migration of metastatic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 100, p. 9482-7, 2003. RUOKOLAINEN, H.; PÄÄKKÖ, P.; TURPEENNIEMI-HUJANEN, T. Expression of matrix metalloproteinase-9 in head and neck squamous cell carcinoma: a potential marker for prognosis. Clin. Cancer Res., v. 10, n. 9, p. 3110-3116, 2004. SAARIALHO-KERE, U. K.; CROUCH, E. C.; PARKS, W. C. Matrix metalloproteinase matrilysin is constitutively expressed in adult human exocrine epithelium. J. Invest. Dermatol., v. 105, p. 190-196, 1995. SAEKI, H. et al. Interrelation between expression of matrix metalloproteinase 7 and -catenin in esophageal cancer. Dig. Dis. Sci., v. 47, p. 2738-42, 2002. SAKAI, T.; LARSEN, M.; YAMADA, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature, v. 423, n. 6942, p. 876-881, 2003. SANDROS, J.; STENMAN, G.; MARK, J. Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumors. Cancer Genet. Cytogenet., v. 44, p. 153-167, 1990. SANTOS, G. C. et al. Neoplasias de glândulas salivares: estudo de 119 casos. J. Bras. Patol. Med. Lab., v. 39, n. 4, p. 371-375, 2003. SASAKI, H. et al. Elevated serum pro-mMP2 levels in patients with advanced lung cancer are not suitable as a prognostic marker. Surg. Today, v. 32, n. 1, p. 93-95, 2002. SCHMALFELDT, B. et al. Increased expression of matrix metalloproteinases (MMP)-2, MMP-9, and the urokinase-type plasminogen activator is associated with progression from benign to advanced ovarian cancer. Clin. Cancer Res., v. 7, n. 8, p. 2396-2404, 2001. SEIFER, T. G; SOBIN, L. H. World health organization international histological classification of tumours: histological typing of salivary gland tumours. 2. ed. Berlin: Springer-Verlag, 1991. SEIFERT, G.; LANGROCK, I.; DONATH K. A pathological classification of pleomorphic adenomaăofătheăsalivaryăglandsă[author’stransl].ăHNO, v. 24, n. 415-426, 1976. SEIKI, M. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase: a key enzyme for tumor invasion. Cancer Lett., v. 194, p. 1-11, 2003. SEIKI, M.; YANA, I. Roles of pericellular proteolysis by membrane type-1 matrix metalloproteinase in cancer invasion and angiogenesis. Cancer Sci., v. 94, p. 569-74, 2003. SERRANO, M. et al. Inhibition of ras-induced proliferation and cellular transformation by p16INK4. Science, v. 267, p. 249-252, 1995. SHIBUYA, Y. et al. Ultrastructural localization of E-cadherin and -/-catenin in adenoid cystic carcinoma. Histopathol., v. 35, p. 423-431,1999.

147

SHIMAJIRI, S. et al. Shortened microsatellite d(CA)21 sequence down-regulates promoter activity of matrix metalloproteinase 9 gene. FEBS Lett., v. 455, p. 70-74, 1999. SHIRAI, A.; FURUKAWA, M.; YOSHIZAKI, T. Expression of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 in adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Laryngoscope, v. 113, p. 1955-1960, 2003. SIMIAN, M. et al. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development, v. 128, n. 16, p. 3117-3131, 2001. SIMPSON, R. H. W. Classification of tumours of the salivary glands. Histopathol, v. 24,p. 187-191,1994. SIQUEIRA, A. S. et al. Matrix metalloproteinases, TIMPs and growth factors regulating ameloblastoma behavior. Histopathology, v. 57, p. 128-137, 2010. SIRES, U. I. et al. Matrilysin is much more efficient than other matrix metalloproteinases in the proteolytic inactivation of a1-antitrypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 204, n. 2, p. 613-620, 1994. SIS,ăB.;ăSAĞOL,ăO.;ăKÜPELIOĞLU,ăA.ăPrognosticăsignificanceăofămatrixămetalloproteinase-2, cathepsin D, and tenascin-C expression in colorectal carcinoma. Pathol. Res. Pract., v. 200, n. 5, p. 379-387, 2004. SORENSEN, K. B. et al. Parotid carcinoma: expression of kit protein and epidermal growth factor receptor. J. Oral Pathol. Med, v. 35, p. 286-291, 2006. SORSA, T.; TJÄDERHANE, L.; SALO, T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral Dis., v. 10, p. 311-8, 2004. SOUSA, S. O. M.; ARAÚJO, V. C. Estudo morfológico e imuno-histoquímico do adenoma pleomórfico de glândula salivar menor. RPG, v. 1, n. 2, p. 22-26, 1994. SOUZA, A. P.; LINE, S. R. P. The biology of matrix metalloproteinases. Rev. FOB, v. 10, n. 1, p. 1-6, 2002. SOUZA FREITAS, V. et al. Immunohistochemical expression of matrilysins (MMP-7 and MMP-26) in ameloblastomas and adenomatoid odontogenic tumors. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 108, n. 3, p. 417-424, 2009. SPEIGHT, P. M. Update on diagnostic difficulties in lesions of the minor salivary glands. Head and Neck Pathol., v. 1, p. 55-60, 2007. SPEIGHT, P. M.; BARRETT, A. W. Salivary gland tumours. Oral Dis., v. 8, p. 229-240, 2002. SPIRO, R. H. Salivary neoplasms: overview of a 35-year experience with 2,807 patients. Head Neck Surg., v. 8, p. 177-84, 1986.

148

SPIRO, R. H. et al. Adenoid cystic carcinoma of salivary origin: a clinicopathologic study of 242 cases. Am. J. Surg., v. 128, n. 4, p. 512-520, 1974. SPIRO, R. H.; HUVOS, A. G. Stage means more than grade in adenoid cystic carcinoma. Am. J. Surg., v. 164, n. 6, p. 623-628, 1992. SPOONER, B. S. et al. Extracellular matrix involvement in epithelial branching morphogenesis. Dev. Biol., v. 3, p. 225-260, 1986. STALLMACH, I. et al. Loss of heterozygosity at chromosome 6q23-25 correlates with clinical and histologic parameters in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Virchows Arch., v. 440, p. 77-84, 2002. STENNERT, E. et al. Histopathology of pleomorphic adenoma in the parotid gland: A prospective unselected series of 100 cases. Laryngoscope, v. 111, p. 2195-2200, 2001. STENNERT, E. et al. Recurrent pleomorphic adenoma of the parotid gland: A prospective histopathological and immunohistochemical study. Laryngoscope, v. 114, p. 158-163, 2004. STERNLICHT, M. D. et al. Establishment and characterization of a novel human myoepithelial cell line and matrix-producing xenograft from a parotid basal cell adenocarcinoma. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., v. 32, n. 9, p. 550-563, 1996. STERNLICHT, M. D.; BARSKY, S. H. The myoepithelial defense: a host defense against cancer. Med. Hypotheses, v. 48, n. 1, p. 37-46, 1997. STERNLICHT, M. D.; WERB, Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Rev. Cell. Dev. Biol., v. 17, p. 463-516, 2001. STRICK, M. J et al. Malignant tumours of the minor salivary glands--a 20 year review. Br. J. Plast. Surg., v. 57, n. 7, p. 624-631, 2004. STRONGIN, A. Y. et al. Mechanism of cell surface activation of 72-kDa type IV collagenase: isolation of the activated form of the membrane metalloprotease. J. Biol. Chem., v. 270, p. 5331-38, 1995. STRONGIN, A. Y. Mislocalization and unconventional functions of cellular MMPs in cancer. Cancer Metastasis Rev., v. 25, p. 87-98, 2006. SUBHASHRAJ, K. Salivary gland tumors: a single institution experience in India. Br. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 46, n. 8, p. 635-638, 2008. SUNG, M. W. et al. Clinicopathologic predictors and impact of distant metastasis from adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., v. 129, p. 1193-1197, 2003. TAKAGI, D. et al. Clinical study of adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Auris Nasus Larynx, v. 28, p. 99-102, 2001.

149

TAKAI, Y. A. et al. Myofilament localization and immunoelectron microscopic detection of muscle-specifi c actin in neoplastic myoepithelial cells in pleomorphic adenomas and myoepitheliomas. Ultrastruct. Pathol., v. 18, p. 575-591, 1994. TAKAI, Y. A et al. Diagnostic criteria for neoplastic myoepithelial cells in pleomorphic adenomas and myoepitheliomas. Immunocytochemical detection of muscle-specific actin, cytokeratin 14, vimentin, and glial fibrillary acidic protein. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 79, n. 3, p. 330-341, 1995. TAKAHASHI, H. et al. Intraoral minor salivary gland tumors: a demographic and histologic study of 200 cases. Tohoku J. Exp. Med., v. 161, p. 111-128, 1990. TALVENSAARI-MATTILA, A. et al. Matrix metalloproteinase-2 immunoreactive protein: a marker of aggressiveness in breast carcinoma. Cancer, v. 83, n. 6, p. 1153-1162, 1998. TANG, C. et al.. Involvement of matrix metalloproteinase-9 in stromal cell-derived factor-1/CXCR4 pathway of lung cancer metástasis. Carcinogenesis, v. 29, n. 1, p. 35-43, 2008. TAKATA, T. et al. Reduced expression of p27 Kip1 protein in relation to salivary adenoid cystic carcinoma metastasis. Cancer, v. 86, p. 928-935, 1999.

TOIDA, M. et al. Intraoral minor salivary gland tumors: a clinicopathological study of 82 cases. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 34, p. 528-532, 2005. TOMICH, C.E. Adenoid cystic carcinoma. In: Ellis, G.L. et al. (Eds) Surgical Pathology of the Salivary Glands. Philadelphia: Saunders, 1991. p. 333-349. TORII, A. et al. Plasma concentration of matrix metalloproteinase 9 in gastric cancer. Br. J. Surg., v. 84, p. 133-136, 1997. TIAN, K. et al. Relationship of the disturbed balance between matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors and the invasion of malignant salivary gland tumours. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, v. 23, p. 273-276, 2005. TRUDEL, D. et al. Significance of MMP-2 expression in prostate cancer: an immunohistochemical study. Cancer Res., v. 63, n. 23, p. 8511-8515, 2003. TSANTOULIS, P. K. et al. Advances in the biology of oral cancer. Oral Oncol., v. 43, p. 523-534, 2007. TURPEENNIEMI-HUJANEN, T. Gelatinases (MMP-2 and -9) and their natural inhibitors as prognostic indicators in solid cancers. Biochimie, v. 87, p. 287-97, 2005. UITTO, V. J.; OVERALL, C. M.; McCULLOCH, C. Proteolytic host enzymes in gingival crevice fluid. Periodontol. 2000, v. 31, p. 77-104, 2003.

URÍA, J. A.; LÓPEZ-OTÍN, C. Matrilysin-2, a new matrix metalloproteinase expressed in human tumors and showig the minimal domain organization required for secretion, latency, and activity. Cancer Res., v. 60, p. 4745-51, 2000.

150

VAN DER WAL, J. E.; SNOW, G. B;ăVANăDERăWAAL,ăI.ăHistologicalăreclassificationăofă101ă intraorală salivaryă glandă tumoursă (newăWHOă classification).ă J. Clin. Pathol., v. 45, p. 834-835, 1992. VAN DICK, F. et al. PLAG1, the prototype of the PLAG gene family: versatility in tumour development (review). Int. J. Oncol., v. 30, p. 765-774, 2007. VÄISÄNEN, A. et al. Prognostic value of MMP-2 immunoreactive protein (72 kD type IV collagenase) in primary skin melanoma. J. Pathol., v. 186, n. 1, p. 51-58, 1998. VARNER, J. A; CHERESH, D. A. Integrins and cancer. Curr. Opin. Cell. Biol., v. 8, n. 5, p. 724-730, 1996. VÉKONY, H. et al. DNA Copy number gains at loci of growth factors and their receptors in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 13, n. 11, p. 3133-3139, 2007. VERED, M.; BRAUNSTEIN, E.; BUCHNER, A. Immunohistochemical study of epidermal growth factor receptor in adenoid cystic carcinoma of salivary gland origin. Head Neck, v. 24, n.7, p. 632-636, 2002. VU, T. H.; WERB, Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology. Genes Dev., v. 14, v. 2123-2133, 2000. VUORISTO, M. S. et al. Serum matrix metalloproteinase-2 as a prognostic marker in advanced cutaneous melanoma. Acta Oncol., v. 39, n. 7, p. 877-879, 2000. WAHLBERG, P. et al. Carcinoma of the parotid and submandibular glands- a study of survival in 2465 patients. Oral Oncol., v. 8, p. 706-713, 2002. WALDRON, C. A. Mixed tumour (pleomorphic adenoma) and myoepithelioma. In: ELLIS, G. L.; AUCLAIR, P. L.; GNEPP, D. R. (Eds). Surgical pathology of the salivary glands. Philadelphia: W. B. Sauders, 1991. p. 165-186. WALDRON, C. A; EL-MOFTY, S. K; GNEPP, D. R. Tumors of the intraoral minor salivary glands: a demographic and histologic study of 426 cases. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., v. 66, p. 323-333, 1988. WANG, D. et al. Intraoral minor salivary gland tumors in a chinese population: a retrospective study on 737 cases. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 104, n. 1, p. 94-100, 2007. WANG, L. et al. Nerve growth factor and tyrosine kinase A in human salivary adenoid cystic carcinoma: Expression patterns and effects in vitroi behavior. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 64, p. 636-641, 2006. WANG, Y. et al. Expression of TIMP-1 and -2 indifferent growth patterns of adenoid cystic carcinoma. Oral Oncol., v. 41, p. 821-827, 2005. WEAVER, V. M.; ROSKELLEY, C. D. Extracellular matrix: the central regulator of cell and tissue homeostasis. Trends Cell. Biol., v. 7, n. 1, p. 40-42, 1997.

151

WERNERT, N. The multiple roles of tumor stroma. Virchows Arch., v. 430, p. 433-443, 1997. WESTERNOFF, T. H. et al. Beta-6 Integrin, tenascin-C, and MMP-1 expression in salivary gland neoplasms. Oral Oncol., v. 41, n. 2, p. 170-174, 2005. WILLIAMS, H. K. Molecular pathogenesis of oral squamous carcinoma. J. Clin. Mol. Pathol., v. 53, p. 165-172, 2000.

WILSON, C. L. et al. The metalloproteinase matrilysin is preferentially expressed by epithelial cells in a tissue-restricted pattern in mouse. Mol. Biol. Cell., v. 6, p. 851-69, 1995. WILSON, C. L.; MATRISIAN, L. M. Matrilysin: an epithelial matrix metalloproteinase with potentially novel functions. Int. J. Biochem. Cell. Biol., v. 28, p. 123-136, 1996 . WINGFIELD, P. T. et al. Biophysical and functional characterization of full-length, recombinant human tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2) produced in Escherichia coli: comparison of wild type and amino-terminal alanine appended variant with implications for the mechanism of TIMP functions. J. Biol. Chem., v. 274, p. 21362-8, 1999. WOLF, K. et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J. Cell. Biol., v. 160, p. 267-77, 2003. YASUMATSU, R. et al. Cyclin D1 expression does not effect cell proliferation in adenoid cystic carcinoma of the salivary gland. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., v. 261, n. 10, p. 526-530, 2004. YAMAMOTO, Y. et al. DNA analysis at p53 locus in adenoid cystic carcinoma: comparison of molecular study and p53 immunostaining. Pathol. Int., v. 48, n. 4, p. 273-280, 1998. YAMAMOTO, Y. et al. Loss of heterozygosity and microsatellite alterations in p53 and RB genes in adenoid cystic carcinoma of the salivary glands. Hum. Pathol., v. 27, n. 11, p. 1204-1210, 1996. YAMAMOTO, H. et al. Messenger RNA expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human hepatocellular carcinoma. Jpn. J. Clin. Oncol., v. 29, p. 58-62, 1999. YAMAMOTO, H. et al. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human pancreatic adenocarcinomas: clinicopathologic and prognostic significance of matrilysin expression. J. Clin. Oncol., v. 19, p. 1118-1127, 2001. YAMASHITA, K. et al. Clinical significance of matrix metalloproteinase-7 expression in esophageal carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 6, p.1169-1174, 2000. YANG, X. et al. Expression of EMMPRIN in adenoid cystic carcinoma of salivary glands: correlationăwithă tumorăprogressionăandăpatients’ăprognosis.ăOral Oncol., v. 46, p. 755-760, 2010.

152

YIH, W.; KRATOCHVIL, J.; STEWART, J. C. B. Intraoral minor salivary gland neoplasms: review of 213 cases. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 63, p. 805-810, 2005. YLISIRNIÖ, S.; HÖYHTYÄ, M.; TURPEENNIEMI-HUJANEN, T. Serum matrix metalloproteinases -2, -9 and tissue inhibitors of metalloproteinases -1, -2 in lung cancer-TIMP-1 as a prognostic marker. Anticancer Res., v. 20, n. 2B, p. 1311-1316, 2000. YOSHIHARA, T. et al. Carcinoma ex pleomorphic adenoma of the soft palate. J. Laryngol. Otol., v. 109, p. 240-243, 1995. XU, X. et al. Functional basis for the overlap in ligand interactions and substrate specificities of matrix metalloproteinases-9 and -2 (MMP-9 and -2). Biochem. J., v. 392, p. 127-34, 2005. YASUMATSU, R. et al. Cyclin D1 expression does not effect cell proliferation in adenoid cystic carcinoma of the salivary gland. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., v. 4, p. 123-130, 2004. XUE, F. et al. Expression of IgSF in salivary adenoid cystic carcinoma and its relationship with invasion and metastasis. J. Oral Pathol. Med., v. 34, p. 295-297, 2005. ZBÄREN, P.; STAUFFER, E. Pleomorphic adenoma of the parotid gland: histopathologic analysis of the capsular characteristics of 218 tumors. Head Neck, v. 29, p. 751-757, 2007. ZHANG, J. et al. The functional polymorphism in the matrix metalloproteinase-7 promoter increases susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma, gastric cardiac adenocarcinoma and non-small cell lung carcinoma. Carcinogenesis, v. 26, p. 1748-53, 2005. ZHANG, C. Y. et al. p16 tumor suppressor therapy in salivary adenoid cystic carcinoma cell line SACC83. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 100, p. 70-74, 2005. ZHANG, C. Y. et al. Promoter methylation as a common mechanism for inactivating E-cadherin in human salivary gland adenoid cystic carcinoma. Cancer, v. 110, n. 1, p. 87-95, 2007. ZHANG, X. et al. Expression of matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-9 and their tissue inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 in the epithelium and stroma of salivary gland pleomorphic adenomas. Histopathology, v. 55, p. 250-260, 2009. ZHAO, Y. G. et al. Activation of pro-gelatinase B by endometase/matrilysin-2 promotes invasion of human prostate cancer cells. J. Biol. Chem., v. 278, p. 15056-15064, 2003. ZHOU, C. X; GAO, Y. Aberrant expression of ß-catenin, Pin1 and cylin D1 in salivary adenoid cystic carcinoma: relation to tumor proliferation and metastasis. Oncol. Rep., v. 16, p. 505-511, 2006. ZIGRINO, P.; LÖFFEK, S.; MAUCH, C. Tumor-stroma interactions: their role in the control of tumor cell invasion. Biochimie, v. 87, p. 321-328, 2005.

153

ZIOBER, A. F; FALLS, E. M.; ZIOBER, B. L. The extracellular matrix in oral squamous cell carcinoma: friend or foe. Head Neck, v. 28, p. 740-749, 2006. ZHU, Q. R.; WHITE, F. H.; TIPOE, G. L. p53 oncoprotein accumulation in adenoid cystic carcinoma of parotid and palatine salivary glands. Pathology, v. 29, n. 2, p. 154-158, 1997. ZUCKER, S. et al. Membrane type-matrix metalloproteinases (MT-MMP). Curr. Top. Dev. Biol., v. 54, p. 1-74, 2003.

ANEXO

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ANEXO - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa – CEP - UFRN

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ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO- HISTOQUÍMICA DAS … · disponibilidade e em especial pela simplicidade em compartilhar o seu saber. Aos meus colegas da turma de Doutorado com quem sempre