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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Oncologia
ESTUDO DO GENE GBP2 NO CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS DO ESÔFAGO E A SUA
RELAÇÃO COM A PROTEÍNA P53
Cynthia Bangoim Marques
Rio de Janeiro
Março de 2009
ii
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Oncologia
ESTUDO DO GENE GBP2 NO CARCINOMA DE
CÉLULAS ESCAMOSAS DO ESÔFAGO E A SUA
RELAÇÃO COM A PROTEÍNA P53
Cynthia Bangoim Marques Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação Strictu Sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer para a obtenção do título de Mestre em Oncologia.
Orientadora: Drª. Denise Peixoto Guimarães
Co-orientador: Dr. Carlos Gil Moreira Ferreira
Rio de Janeiro
Março de 2009
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
M357e Marques, Cynthia Bangoim.
Estudo do gene GPB2 no carcinoma de células escamosas do esôfago e sua relação com a proteína P53 / Cynthia Bangoim Marques. - Rio de Janeiro: INCA, 2009.
118 f.
Dissertação (Mestrado) - Instituto Nacional de Câncer. Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer (INCA-RJ), 2009. Orientador: Denise Peixoto Guimarães. Co-Orientador: Carlos Gil Moreira Ferreira.
1. Neoplasias do Esôfago. 2. Carcinoma de Células Escamosas. 3. Biologia Computacional. 4. Imunoprecipitação da Cromatina. I. Guimarães, Denise Peixoto. II. Ferreira, Carlos Gil Moreira III. Título.
CDD 616.9943200724
iv
Estudo do gene GBP2 no carcinoma de células escamosas do
esôfago e a sua relação com a proteína p53
Cynthia Bangoim Marques
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação Strictu Sensu em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer para a obtenção do título de Mestre em Oncologia.
Aprovada em 24 de Março de 2009, pela banca examinadora:
Drª Kênia Balbi El-Jaick
Dr. José Cláudio Casali da Rocha
Prof. Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto
Drª. Patrícia Sávio de Araújo Souza
Dr. Milton Ozório Moraes
Rio de Janeiro
Março de 2009
v
Dedico esta dissertação àqueles através dos quais Deus me deu a vida:
Meus amados pais, Auremar e José Antonio.
vi
AGRADECIMENTOS
Sem dúvida, minha total gratidão é a Deus . Pelo Seu amor, salvação,
misericórdia, proteção, provisão, direcionamento e tudo mais durante esses 24 anos
de vida! E pela oportunidade que Ele me deu de conhecer pessoas tão maravilhosas
ao longo desta caminhada!
Aos meus pais Auremar Bangoim e José Antonio Marques . Por TUDO.
Pelo cuidado, compreensão, investimentos (fraldas, escola e até o dinheiro pra
gasolina) e até pelos puxões de orelha! Se hoje estou aqui é porque Deus me
abençoou através desse amor que vocês sempre me deram. Sou eternamente grata
e por isso lhes dedico mais esta vitória que conquistamos juntos! Amo muito vocês!
Sempre!!
Às minhas amadas irmãs Carolina e Deborah Marques por serem motivo
constante de alegria e grandes amigas!
Às tias Marzalene (in memorian) e Marlene que cuidaram de mim como a
filha que não tiveram. À tia Orchidéa por acompanhar cada passo da minha vida
acadêmica com muita atenção e interesse.
À minha querida orientadora, Drª. Denise Guimarães . Contextualizando,
cabe aqui o mesmo falado aos meus pais. Porque você, Denise, me ensina como
viver essa vida de pesquisa da melhor maneira possível: com responsabilidade,
profissionalismo, empenho e... Risadas! “RÁ”! Obrigada pela confiança e ajuda na
realização deste trabalho que começou em suas mãos! E também pelos
ensinamentos pessoais, claro! Obrigada por TUDO mesmo! Não esquecerei do
guaraná em pó milagroso!!
Ao meu co-orientador e chefe da Divisão de Pesquisa Clínica Aplicada, Dr.
Carlos Gil Ferreira . Por ter permitido o desenvolvimento deste trabalho no
laboratório do SPC e por suas críticas e sugestões para melhoria deste trabalho.
Aos meus colaboradores. Dr. Fabio Passetti e seu entusiasmo. Drª. Kênia
El-Jaick e seu incentivo sempre presente. Dr. Pierre Hainaut, Agnes Hautefeuille
e todos os demais do IARC (Sandra, Dominique, Priscila, Nathália, Amèlie, Aurélia,
Lynette, Magali, Emmanuelle) por terem me recebido de braços abertos em Lyon,
quebrado a cabeça comigo no ensaio de ChIP e pelas tentativas bem-sucedidas de
entender até mesmo o pior do meu inglês!! Ao Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto , Drª.
Tatiana Simão e Drª. Ana Rossini pela colaboração em uma das partes deste
vii
projeto, auxiliando nas técnicas e compartilhando biópsias minúsculas! À Isabele
Small pelas análises estatísticas feitas neste trabalho. À Drª Maria Aparecida
Ferreira e ao enfermeiro Paulo Moraes , do Setor de Endoscopia Digestiva do INCA,
pela coleta das biópsias de esôfago.
Aos meus queridos amigos que foram ou ainda são da Divisão de Pesquisa
Clínica Aplicada do INCA: Daniel Martins , Ana Carolina Dantas (Carol, aqui você
não foi a última, viu?? Fiz questão!), Mariana Duarte (minha companheira de todas
as jornadas), Dani (elle) Braggio , Fernanda Costas , Joyce Moraes , Luciene
Fontes , Vitor Hugo Almeida , João de Séllos (que me trouxe ao INCA! Valeu,
John!), Debora Meira , Isabel Nóbrega , Dr. Marcelo Mamede , Jânio Mororó ,
Marcus Valadão e Marcos Pinho . A todos vocês meu “muito obrigada” pelo
profissionalismo, aprendizado, paciência e diversão diários no laboratório e fora dele!
Aos grandes amigos Beatriz (amiga-irmã-amada Biazinha!) e Jacques Dias ,
Jacqueline Nunes , Vânia Lopes , Silvia Cardoso , Lathife Cordeiro , Fernanda
Zaganelli, Fernanda e Filipe Cantarino , Liza e Luiz Chiu , Genilson Simião ,
Felipe Câmara , Marcos Suzano, Juan de Paula e Dyenes Lima . A vocês, que
compartilham comigo muitos bons (e maus. Faz parte!) momentos e suas vidas!!
Obrigada, grupo VIP do meu coração!
Às maravilhosas amigas Priscila Marques e Rosana Guimarães por serem
companheiras para toda a vida! Pela amizade verdadeira que sempre demonstram
desde os tempos da faculdade, seja pelo suporte quase 24 horas por dia (internet,
torpedos, telefone), seja por encontros sempre animados com direito até a um
desvio de rota em Irajá ou simplesmente pela paciência (muito exercitada durante a
fase de “surtos pré-defesa”)! Meninas, amo vocês!
Aos membros da banca examinadora , por terem aceitado o convite em
contribuir com este trabalho.
Aos funcionários da Divisão de Pesquisa Clínica Aplicada que me ajudaram
na coleta dos prontuários dos pacientes, nas burocracias e em tudo o mais. Gilberto ,
Bruno , Leandro , Alexandre , Thaís , Sônia , obrigada! À Cecília Herculano e
Daniele Brito , da pós-graduação do INCA. Por toda paciência e ajuda fundamentais
nesses 2 anos do mestrado!
Aos pacientes , que concordaram em participar deste estudo.
Às agências de fomento , por financiarem este projeto.
viii
“O Senhor é minha força e meu escudo.
Nele confiou o meu coração e fui socorrido.
Pelo que o meu coração salta de prazer, e com o meu canto O louvarei!”
(Salmo 28:7)
ix
Este projeto teve o apoio das seguintes instituições:
x
RESUMO
O câncer de esôfago está entre os 10 tipos de câncer mais incidentes no
mundo e no Brasil. O carcinoma de células escamosas do esôfago (CCEE) é o tipo
histopatológico mais frequente e, em geral, é diagnosticado em estágios avançados,
impossibilitando o tratamento curativo. A sobrevida é de menos de 10% dos
pacientes após 5 anos do diagnóstico da doença. Para reverter esta situação é
fundamental o entendimento de como ocorre a carcinogênese molecular esofagiana.
Mutações no gene supressor de tumor TP53 são frequentes no CCEE, sendo
relatados na literatura 30-70% de casos mutados. Outra alteração, recentemente
descrita por nosso grupo, é o aumento da expressão da proteína ligadora de
guanilato-2, GBP2, no tecido tumoral em relação ao epitélio normal adjacente de
pacientes com CCEE. Dados de nosso grupo também demonstram a regulação de
GBP2 dependente de p53 em uma linhagem celular de CCEE. O presente estudo,
portanto, teve como objetivo geral investigar a relação entre GBP2 e p53 no CCEE
através de duas etapas: pré-clínica e clínica. O objetivo pré-clínico foi investigar a
possível ligação direta da proteína p53 selvagem à região promotora de GBP2 na
linhagem TE-1 (CCEE, p53Met272Val) através da bioinformática e do ensaio de
imunoprecipitação de cromatina. Foi identificada a ligação direta de p53 selvagem à
região promotora de GBP2. Na etapa clínica, foram analisadas amostras de RNA e
DNA dos tecidos tumoral e não-tumoral adjacente de pacientes com CCEE.
Utilizando a técnica de PCR quantitativa, foi visto em 69,3% (18/26) dos pacientes
um aumento da expressão de GBP2 no tecido tumoral em relação ao tecido não-
-tumoral adjacente. O rastreamento por alterações nos éxons 5 ao 9 do gene TP53
foi realizado pela técnica de cromatografia líquida desnaturante de alta performance
(dHPLC) e pela técnica de polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP)
seguido pelo sequenciamento automático. Em 56,1% (23/41) dos casos, a mutação
em TP53 foi encontrada e em 3 pacientes foram encontrados polimorfismos neste
gene. Não foi encontrada qualquer associação com significância estatística entre a
expressão de GBP2, o status mutacional de TP53 e os dados clínico-patológicos no
grupo de pacientes estudados. Os resultados deste trabalho sugerem que GBP2 é
um gene-alvo de p53, resultado esse inédito na literatura, e que GBP2 tem um papel
na carcinogênese do esôfago. Além disso, foi observada a ausência de associação
entre a expressão de GBP2 e o status mutacional da proteína p53 durante o
xi
desenvolvimento tumoral no esôfago. Estes dados encorajam a uma melhor
caracterização de GBP2 no CCEE para melhor entender sua participação no
desenvolvimento deste tipo de câncer.
Palavras-chave: carcinoma de células escamosas do esôfago; GBP2; TP53;
Bioinformática; Ensaio de Imunoprecipitação de Cromatina; dHPLC.
xii
ABSTRACT
Esophageal cancer is one of the 10 most common incident cancers in the
world and in Brazil. Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is the most
frequent histopathological type. In general, ESCC is diagnosed in advanced stages,
when curative treatment is not possible. After 5 years of diagnosis, overall survival is
less than 10% of patients. To change this situation, it is essential to understand how
esophageal molecular carcinogenesis occurs. Mutations in TP53 tumor suppressor
gene are frequent in ESCC, appearing in 30-70% of cases according to the literature.
Another alteration, recently described by our group, is the increase of guanylate
binding protein-2, GBP2, expression in tumoral tissue compared to adjacent normal
epithelium of patients with ESCC. Data from our group also show p53-dependent
GBP2 regulation on a ESCC cell line. The present study, therefore, had as general
objective investigate the relationship between GBP2 and p53 through two parts: pre-
clinical and clinical. The pre-clinical objective was to investigate a possible direct
binding of wild type p53 protein to GBP2 promoter region on TE-1 cell line (ESCC,
p53Met272Val) through bioinformatics and chromatin immunoprecipitation assay. In this
study, it was identified the direct binding of wild type p53 to GBP2 promoter region.
On the clinical part of the study, RNA and DNA samples of tumoral and adjacent non-
tumoral tissues from patients with ESCC were analysed. Through quantitative PCR
technique, an increase of GBP2 expression in tumoral tissue in relation to adjacent
non-tumoral tissue was seen in 69.3% (18/26) of patients. The screening of
alterations on exons 5 to 9 of TP53 gene was performed by denaturing high
performance liquid chromatography (dHPLC) and followed by automated sequencing.
In 56,09% (23/41) of cases, TP53 mutation was found and in 3 patients
polymorphisms were found. No statistically significant association was found between
GBP2 expression, TP53 mutational status and clinicopathological data on the studied
group. These results suggest that GBP2 is a p53 target-gene, an unpublished data
on the literature, and that GBP2 has a role on esophageal carcinogenesis. Also, it
was found no association between increased GBP2 gene expression and the
presence of wild type p53 during esophageal tumor development. These data
encourage a better characterization of GBP2 on ESCC to better understand its
participation on the development of this cancer.
xiii
Keywords: esophageal squamous cell carcinoma; GBP2; TP53; Bioinformatics;
Chromatin Immunoprecipitation Assay; dHPLC.
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Os 10 tipos de câncer mais incidentes na população mundial. O câncer de
esôfago é o 8º tipo mais incidente ............................................................................ 03
Figura 2. Tipos de câncer mais incidentes para o ano de 2008 na população
brasileira ................................................................................................................... 04
Figura 3. Representação espacial das taxas de incidência mundial do câncer de
esôfago ..................................................................................................................... 05
Figura 4 . Representação espacial das taxas brutas de incidência do câncer de
esôfago por 100 mil homens, estimadas para o ano de 2008, segundo a Unidade da
Federação Incidência no Brasil ................................................................................ 06
Figura 5 . Funções biológicas de proteínas desreguladas no CCEE e respectivas
porcentagens de ocorrência ..................................................................................... 11
Figura 6. Esquema da via da proteína p53. São esquematizadas as 3 classes de
estímulos que ativam p53, que por sua vez exerce diversas funções
biológicas .................................................................................................................. 14
Figura 7. Esquema dos domínios funcionais da proteína p53, destacando os códons
em que se encontra a maioria das mutações em tumores ....................................... 15
Figura 8. Imunohistoquímica para a marcação de GBP2 no CCEE e no epitélio
normal adjacente ao câncer ..................................................................................... 22
Figura 9. Etapas do ensaio de imunoprecipitação de cromatina ............................. 28
Figura 10. Foto da eletroforese do DNA de linhagem celular TE-1 fragmentado
através de pulsos de ultrassom ................................................................................ 30
xv
Figura 11. Fluxograma mostrando as etapas realizadas durante o estudo clínico
deste trabalho ........................................................................................................... 34
Figura 12. Esquema geral da PCR quantitativa (qPCR) ......................................... 39
Figura 13. Valores de expressão gênica de GBP2 em relação à GAPDH e β-actina
nos diferentes pontos de diluição do cDNA da linhagem TE-1 ................................ 41
Figura 14. Regressão linear feita para que o melhor controle endógeno da qPCR
fosse definido através do valor do coeficiente de linearidade .................................. 41
Figura 15. Eficiência da reação de qPCR utilizando-se sondas TaqMan® para os
genes GBP2 e GAPDH ........................................................................................... 42
Figura 16. Princípio da dHPLC ................................................................................ 47
Figura 17. Etapas da dHPLC ................................................................................... 48
Figura 18. Resultado da busca por sítios de ligação da proteína p53 à região
promotora de GBP2 utilizando o aplicativo Gene2Promoter .................................... 53
Figura 19. Resultado da busca, utilizando o aplicativo BLAT, pela localização no
genoma humano do elemento responsivo de p53 predito pelo aplicativo
Gene2Promoter ........................................................................................................ 54
Figura 20. Gráfico representativo da qPCR feita para quantificar a relação entre a
expressão gênica de GBP2 na linhagem celular TE-1 quando cultivada a 32ºC e a
37ºC ......................................................................................................................... 56
Figura 21. Ensaio de imunoprecipitação de cromatina. Foto representativa da
eletroforese da PCR utilizando o DNA imunoprecipitado com anticorpo anti-
p53 ............................................................................................................................ 56
xvi
Figura 22. Análise de expressão relativa T/N de GBP2 pela qPCR. Vinte e seis
pacientes tiveram suas amostras de cDNA amplificadas pela qPCR para a
quantificação da expressão de GBP2 no tecido tumoral (T) e no tecido não-tumoral
adjacente ao tumor (N) ............................................................................................. 61
Figura 23. Exemplos de perfis de eluição de duas amostras tumorais com alteração
em TP53 e o perfil de eluição da amostra utilizada como controle selvagem para
TP53 obtidos pela técnica de dHPLC ..................................................................... 64
Figura 24. Exemplos de cromatogramas resultantes do sequenciamento do DNA
tumoral de dois pacientes com alteração em TP53 rastreada pela dHPLC e
confirmada pelo sequenciamento ............................................................................. 65
Figura 25. Resultados em porcentagem do sequenciamento automático dos éxons 5
ao 9 do gene TP53. A) Localização das mutações. B) Efeitos das mutações. C)
Tipos de mutações encontradas .............................................................................. 66
Figura 26. Gráfico box-plot com os valores da mediana de expressão relativa T/N de
GBP2 no grupo de pacientes com TP53 selvagem (Wt) e no grupo de pacientes com
TP53 mutado (Mut) ................................................................................................... 75
Figura 27. Hipótese de como GBP2 é regulado em células não-tumorais e em
células tumorais ........................................................................................................ 85
xvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação clínica de acordo com os parâmetros TNM (tumor, linfonodo
e metástase) do carcinoma de células escamosas do esôfago ............................... 08
Tabela 2. Grupamento por estádios do carcinoma de células escamosas do esôfago
de acordo com a classificação TNM ......................................................................... 09
Tabela 3. Sobrevida em 5 anos de pacientes com CCEE nos quais é possível a
remoção completa do tumor ..................................................................................... 10
Tabela 4. Sítios de ligação de fatores de transcrição de GBP2 humano e suas
respectivas localizações na região promotora do gene, sendo a posição +1 o início
da transcrição .......................................................................................................... 21
Tabela 5. Oligonucleotídeos específicos para amplificação do DNA contendo o sítio
de ligação de p53 às regiões promotoras de GBP2 e p21WAF/CIP1 ............................ 33
Tabela 6. Reagentes, concentrações e volumes utilizados para a amplificação, pela
PCR, do DNA contendo o sítio de ligação de p53 às regiões promotoras de GBP2 e
p21WAF/CIP1 ................................................................................................................. 33
Tabela 7. Características dos oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos
éxons 5 ao 9 do gene TP53 ..................................................................................... 45
Tabela 8. Reagentes, concentrações e volumes utilizados para a amplificação, pela
PCR, dos éxons 5 ao 9 do gene TP53 ..................................................................... 45
Tabela 9. Dados demográficos, epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos dos
pacientes com CCEE incluídos neste estudo ........................................................... 58
Tabela 10. Resultados obtidos a partir do rastreamento de mutações por dHPLC e
sequenciamento dos éxons 5 ao 9 do gene TP53 ................................................... 63
xviii
Tabela 11. Mutações no gene TP53 identificadas nos pacientes com CCEE
analisados neste estudo ........................................................................................... 67
Tabela 12. Polimorfismos no gene TP53 identificados nos pacientes com CCEE
analisados neste estudo ........................................................................................... 68
Tabela 13. Associação entre os dados clínico-patológicos e a expressão de GBP2
no tecido tumoral (T) em relação ao tecido não-tumoral adjacente ao tumor (N) .... 70
Tabela 14. Associação entre os dados clínico-patológicos e o status mutacional do
gene TP53 ............................................................................................................... 71
Tabela 15. Associação entre a expressão relativa T/N de GBP2 e o status
mutacional do gene TP53 ........................................................................................ 71
xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN Acetonitrila
ADCE Adenocarcinoma de esôfago
Alt. Amostra com alteração no gene TP53
CCEE Carcinoma de células escamosas do esôfago
cDNA DNA complementar
ChIP Imunoprecipitação de cromatina
CpG Dinucleotídeo 5’-CpG-3’
Ct Cycle treshold
DEPC Dietilpirocarbonato
dHPLC Cromatografia líquida desnaturante de alta performance
DNAse Desoxirribonuclease
dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatado
GAPDH Gene que codifica a gliceraldeído desidrogenase
GBP2 Gene humano que codifica a proteína ligadora de guanilato-2
GBP2 Proteína ligadora de guanilato-2
GDP Difosfato de guanosina
GMP Monofostato de guanosina
GTP Trifosfato de guanosina
IARC International Agency for Research on Cancer
INCA Instituto Nacional de Câncer
Met Metionina
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
N.Alt. Amostra sem alteração no gene TP53
NCBI National Center for Biotechnology Information
p21WAF/CIP1 Gene que codifica a proteína p21
p53 Proteína supressora de tumor p53
pb Pares de base
PBS Solução salina de tampão de fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa
RNAse Ribonuclease
xx
RNAsin Inibidor de RNAse
SDS Dodecil sulfato de sódio
SSCP Polimorfismo de conformação de DNA fita simples
TE Tampão Tris, EDTA
TBE Tampão Tris, borato, EDTA
TEAA Acetato de trietilamônio
T/N Relação entre a expressão de GBP2 no tecido tumoral e no tecido não-
tumoral adjacente
TNM Sistema de classificação de tumores de acordo com características de
tumor, linfonodo e metástase
TP53 Gene supressor de tumor que codifica a proteína p53
UCSC Universidade Califórnia Santa Cruz
UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro
UICC International Union Against Cancer
Val Valina
χ2 Qui-quadrado
xxi
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................... x
ABSTRACT .............................................................................................................. xii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ xiv
LISTA DE TABELAS .............................................................................................. xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................. xix
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 01
1.1. Racional do estudo ..................................................................................... 02
1.2. Câncer de esôfago ...................................................................................... 03
1.2.1. Carcinoma de células escamosas do esôfago (CCEE) ...................... 04
1.2.1.1. Epidemiologia ............................................................................. 04
1.2.1.2. Clínica, diagnóstico e estadiamento ........................................... 07
1.2.1.3. Tratamento e prognóstico ........................................................... 09
1.3. Alterações moleculares no CCEE ............................................................... 10
1.3.1. A proteína p53 .................................................................................... 12
1.3.1.1. Gene e proteína p53 ................................................................... 12
1.3.1.2. Funções de p53 e regulação transcricional de genes-alvo ........ 13
1.3.1.3. Alterações no gene TP53 e câncer ............................................ 14
1.3.1.4. Alterações no gene TP53 no CCEE ........................................... 16
1.3.2. GBP2, membro da família das proteínas ligadoras de guanilato
(GBPs) ................................................................................................ 17
1.3.2.1. Gene e proteína GBP2 ............................................................... 18
1.3.2.2. Funções biológicas das GBPs .................................................... 18
1.3.2.3. Regulação de GBP2 ................................................................... 19
1.3.2.4. Alterações em GBP2 no CCEE .................................................. 21
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 23
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 25
3.1. Estudo pré-clínico ....................................................................................... 26
3.1.1. Cultura de células ............................................................................... 26
3.1.2. Investigação por bioinformática de possíveis sítios de ligação da
proteína p53 ao promotor do gene GBP2 ........................................... 27
3.1.3. Ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) ............................. 28
3.1.4. PCR para amplificação da região predita por bioinformática .............. 32
xxii
3.1.5. Isolamento de RNA e PCR quantitativa (qPCR) ................................. 33
3.2. Estudo clínico .............................................................................................. 34
3.2.1. Desenho do estudo ............................................................................. 34
3.2.2. Pacientes ............................................................................................ 34
3.2.3. Análise de expressão do gene GBP2 ................................................. 36
3.2.3.1. Isolamento de RNA ..................................................................... 36
3.2.3.2. Quantificação de RNA ................................................................ 36
3.2.3.3. Purificação de RNA .................................................................... 37
3.2.3.4. Reação de transcrição reversa ................................................... 38
3.2.3.5. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) utilizando
sondas TaqMan® ........................................................................ 38
3.2.4. Análise de mutação no gene TP53 ..................................................... 43
3.2.4.1. Extração de DNA genômico de tecido esofágico ....................... 43
3.2.4.2. Quantificação de DNA ................................................................ 44
3.2.4.3. PCR para amplificação dos éxons 5 ao 9 do gene TP53 ........... 44
3.2.4.4. Cromatografia líquida desnaturante de alta-performance
(dHLC) ........................................................................................ 46
3.2.4.5. Sequenciamento automático ...................................................... 49
3.2.4.6. Análise de alterações no gene TP53 .......................................... 50
3.2.5. Análises estatísticas ........................................................................... 50
4. RESULTADOS ................................................................................................... 51
4.1. Estudo pré-clínico ........................................................................................ 52
4.1.1. Identificação de um sítio putativo de ligação da proteína p53 à região
promotora do gene GBP2 pela bioinformática ............................................... 52
4.1.2. GBP-2 como alvo direto da proteína p53 ............................................ 55
4.2. Estudo clínico ............................................................................................... 57
4.2.1. Dados clínicos, demográficos, epidemiológicos dos pacientes com
CCEE ............................................................................................................. 57
4.2.2. Expressão de GBP2 no CCEE relativa ao tecido não-tumoral
adjacente ....................................................................................................... 60
4.2.3. Alterações genéticas em TP53 no CCEE ........................................... 62
4.2.4. Associação entre dados clínico-patológicos e moleculares ............... 69
xxiii
5. DISCUSSÃO E PERSPECTIVAS ..................................................................... 73
5.1. Identificação de GBP2 como um possível novo alvo de p53 ................ 74
5.2. Perfil dos pacientes com CCEE tratados no INCA ................................ 75
5.3. GBP2 como um possível biomarcador de CCEE .................................. 77
5.4. Análises de alterações em TP53 ........................................................... 79
5.5. Ausência de associação entre o status mutacional de TP53 e a expressão
gênica de GBP2 ............................................................................................ 81
6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 85
8. ANEXOS ............................................................................................................ 96
Anexo I: termo de consentimento livre e esclarecido assinado pelos pacientes
que aceitaram participar deste estudo ............................................................... 97
Anexo II: aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA .... 99
Anexo III: questionário epidemiológico respondido pelos pacientes com CCEE
incluídos no estudo ........................................................................................... 100
Anexo IV: Ficha clínica elaborada para a coleta de dados dos prontuários dos
pacientes com CCEE ........................................................................................ 106
1
1. INTRODUÇÃO
2
1.1. Racional do estudo
O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento desordenado de células,
que adquirem a capacidade de invadir tecidos e órgãos, podendo se disseminar para
diferentes regiões do organismo. Este processo ocorre através do acúmulo de
alterações genéticas e epigenéticas e transformação das células normais em células
tumorais. A fisiologia das células tumorais difere da fisiologia das células dos tecidos
normais em diversos aspectos importantes como a auto-suficiência em fatores de
crescimento, insensibilidade a fatores inibitórios de crescimento, evasão à apoptose,
potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada e metástase (HANAHAN &
WEINBERG, 2000). A busca e o melhor conhecimento das moléculas envolvidas nesta
transformação é um constante alvo da pesquisa do câncer. Estes biomarcadores
podem auxiliar no diagnóstico precoce, tratamento e prognóstico dos pacientes
acometidos por esta doença.
O câncer de esôfago é a sexta causa mundial de mortes por câncer e é
considerado um desafio na prática clínica oncológica pelo péssimo prognóstico e
ausência de tratamento curativo nos estágios avançados, quando geralmente é
diagnosticado. Dessa forma, a busca e o melhor conhecimento das moléculas
envolvidas na carcinogênese esofagiana são fundamentais.
Neste contexto, este estudo teve como objetivo investigar o perfil de expressão
gênica de um possível biomarcador molecular para o carcinoma de células escamosas
do esôfago, GBP2, e sua relação com o gene supressor de tumor TP53.
3
Pulmão (12,4%)
Mama (10,6%)
Cólon e reto (9,4%)
Estômago (8,6%)
Próstata (6,3%)
Fígado (5,8%)
Colo do útero (4,5%)
Esôfago (4,3%)
Bexiga (3,3%)
Outros tipos (34,8%)
1º
2º3º4º5º6º
7º8º9º
10º
Pulmão (12,4%)
Mama (10,6%)
Cólon e reto (9,4%)
Estômago (8,6%)
Próstata (6,3%)
Fígado (5,8%)
Colo do útero (4,5%)
Esôfago (4,3%)
Bexiga (3,3%)
Outros tipos (34,8%)
1º
2º3º4º5º6º
7º8º9º
10º
Pulmão (12,4%)
Mama (10,6%)
Cólon e reto (9,4%)
Estômago (8,6%)
Próstata (6,3%)
Fígado (5,8%)
Colo do útero (4,5%)
Esôfago (4,3%)
Bexiga (3,3%)
Outros tipos (34,8%)
1º
2º3º4º5º6º
7º8º9º
10º
1.2. Câncer de Esôfago
O câncer de esôfago situa-se entre os dez cânceres mais incidentes na
população mundial (Figura 1). Entre os homens este é o 6º tipo mais incidente e o 5º
mais letal e entre as mulheres o câncer de esôfago é o 9º tipo mais incidente e o 8º
mais letal (PARKIN et al., 2005). No Brasil, estimativas do Instituto Nacional de Câncer
para o ano de 2008 apontaram esta neoplasia como a 6ª mais incidente entre homens
e a 9ª entre mulheres (Figura 2), sendo responsável por 10.550 novos casos (BRASIL,
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Os dois principais subtipos histopatológicos da doença são o carcinoma de
células escamosas do esôfago (CCEE) e o adenocarcinoma de esôfago (ADCE). Além
da histologia, estes dois subtipos diferem no que diz respeito aos fatores de risco,
prognóstico e evolução clínica. Embora a literatura relate que desde o início da década
de 90 o ADCE tenha se tornado o subtipo mais incidente em homens brancos dos
Estados Unidos (BLOT & MCLAUGHLIN, 1999), o CCEE continua sendo o subtipo
histopatológico mais frequente no mundo, correspondendo a 93% de todos os casos
relatados (RIBEIRO PINTO et al., 2003). No Brasil, este subtipo corresponde a 96%
dos casos (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
Figura 1. Os 10 tipos de câncer mais incidentes na população mundial. O câncer de esôfago é o 8º tipo mais incidente (adaptado de FERLAY et al., 2004).
4
Figura 2. Tipos de câncer mais incidentes para o ano de 2008 na população brasileira. Não foi considerado o câncer de pele do tipo não melanoma. A seta preta indica a incidência do câncer de esôfago em homens (barra amarela) e mulheres (barra azul) (adaptado de BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
1.2.1. Carcinoma de células escamosas do esôfago
1.2.1.1. Epidemiologia
A incidência do carcinoma de células escamosas do esôfago varia enormemente
de acordo com a localização geográfica (CASTELLSAGUE & MUNOZ, 1997), variando
muito, mesmo entre regiões próximas (Figura 3). Segundo Messmann, não existe outro
câncer cuja incidência varie tanto entre países e mesmo entre regiões de um mesmo
país (MESSMANN, 2001). Em áreas de alto risco, a população pode ter até 500 vezes
mais chances de desenvolvimento desta doença quando comparada à população de
áreas de baixo risco (MESSMANN, 2001).
5
Figura 3. Representação espacial das taxas de incidência mundial do câncer de esôfago. As taxas foram ajustadas pela idade e são expressas em relação a 100 mil habitantes (FERLAY et al., 2004).
No Brasil é possível observar que taxas de incidência do CCEE são maiores nas
regiões Sul e Sudeste e menores na região Norte (Figura 4). Segundo estimativas do
Instituto Nacional de Câncer (INCA) para 2008, Rio Grande do Sul e Maranhão são,
respectivamente, os estados brasileiros com a maior e a menor taxa de incidência de
câncer de esôfago. No primeiro, a estimativa para 2008 foi de 19,73 casos para cada
100 mil homens, enquanto no Maranhão a estimativa foi de 1,04 para cada 100 mil
homens. No Rio de Janeiro a taxa de incidência de CCEE estimada para 2008 foi de
9,72 casos para cada 100 mil homens (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
A grande variação nas taxas de incidência do CCEE possivelmente está
relacionada a fatores de risco ambientais. Em áreas de média incidência, estudos
epidemiológicos indicam que o tabagismo e o etilismo são os principais fatores de risco
para o desenvolvimento do CCEE (CASTELLSAGUE et al., 1999; LAUNOY et al.,
1997b). A combinação destes dois fatores produz efeito sinérgico, aumentando ainda
mais o risco de desenvolver o CCEE (LEE et al., 2007). Nas regiões de maior
incidência, outros fatores são importantes. No sul do Brasil, norte da Argentina, Uruguai
e norte da França, o consumo de bebidas em temperatura elevada é um fator de risco
(CASTELLSAGUE et al., 2000; LAUNOY et al., 1997a). A dieta pobre em vitaminas é
outro fator de risco, presente no sul, sudeste e leste da África (RIBEIRO et al., 1996).
Na região de maior incidência mundial do câncer de esôfago, o chamado “cinturão
6
asiático do câncer de esôfago”, a dieta rica em alimentos contendo nitrosaminas é o
principal fator de risco associado ao desenvolvimento da doença. O “cinturão asiático
do câncer de esôfago” é composto por Turquia, Irã, Iraque, norte e oeste da China,
Hong Kong, Japão, Cingapura, Afeganistão, onde as incidências podem superar os 100
casos por 100 mil habitantes por ano (LAMBERT & HAINAUT, 2007).
Figura 4 . Representação espacial das taxas brutas de incidência do câncer de esôfago por 100 mil homens, estimadas para o ano de 2008, segundo a Unidade da Federação Incidência no Brasil (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
As taxas de incidência e mortalidade são muito similares no CCEE (PISANI et al.,
1993). Em áreas de alta mortalidade por câncer de esôfago, a incidência da doença é
bem similar entre homens e mulheres. Há, porém, um predomínio significativo de casos
diagnosticados em homens em regiões de baixa incidência (BLOT, 1994). A taxa de
incidência em homens é maior, de 3 a 10 vezes mais do que a taxa observada entre as
mulheres, provavelmente por uma maior prevalência de fatores de risco como
tabagismo e etilismo entre pacientes do sexo masculino (RIBEIRO PINTO et al., 2003).
7
1.2.1.2. Clínica, diagnóstico e estadiamento
O diagnóstico do CCEE geralmente é feito tardiamente, quando o tratamento
paliativo é a única opção na maioria dos casos. A sobrevida dos pacientes com esta
doença, portanto, é baixa. Setenta e cinco por cento destes pacientes morrem até o fim
do primeiro ano após o diagnóstico e a sobrevida em 5 anos é de apenas 5-10% dos
casos (XING et al., 2003).
Em geral, o CCEE é uma doença assintomática até atingir estádios já avançados
da doença. A maioria (74%) dos pacientes relata dificuldade de engolir, denominada
disfagia, devido à redução da luz do esôfago por invasão neoplásica, ou em menor
frequência (17%) queixam-se de dor ao engolir líquidos e sólidos, denominada
odinofagia (DALY et al., 2000). A perda de peso, decorrente da desordem nutricional,
também é frequente, sendo um indicador independente de pior prognóstico quando há
mais que 10% de perda de massa (DALY et al., 2000). Nesse momento, os pacientes
procuram auxílio médico e o diagnóstico é feito através da endoscopia digestiva alta.
Por este procedimento, biópsias são retiradas para confirmação histopatológica da
doença.
O estadiamento clínico dos pacientes com CCEE é feito de acordo com o
sistema TNM (tumor, linfonodo, metástase) estabelecido pela União Internacional
Contra o Câncer (UICC) para a classificação clínica dos tumores malignos. Este
sistema foi desenvolvido pelo francês Pierre Denoix entre os anos de 1943 e 1952
(DENOIX et al., 1944) e baseia-se na extensão da invasão do tumor primário (T),
presença ou ausência de metástase em linfonodo regional (N) e presença ou ausência
de metástase à distância (M) (Tabela 1). A investigação destes parâmetros é feita
através do exame clínico, de exames complementares (como endoscopia digestiva alta,
ultrassonografia e tomografia computadorizada) e/ou exploração cirúrgica. O estádio da
doença na ocasião do diagnóstico é um reflexo da taxa de crescimento e da extensão
da neoplasia e é uma informação relevante no planejamento do tratamento e na
predição do prognóstico (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). De acordo com a
classificação TNM, os pacientes com CCEE são agrupados em 8 estádios que vão
desde o estádio 0 (não há evidência de tumor primário) até o estádio IVB (CCEE com
metástase em linfonodo não-regional ou outra metástase à distância) (Tabela 2).
8
Tabela 1. Classificação clínica de acordo com os parâmetros TNM (tumor, linfonodo e metástase) do carcinoma de células escamosas do esôfago (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
Tumor primário
TX O tumor primário não pode ser avaliado
T0 Não há evidência de tumor primário
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor que invade a lâmina própria ou a camada submucosa
T2 Tumor que invade a camada muscular própria
T3 Tumor que invade a camada adventícia
T4 Tumor que invade as estruturas adjacentes
Linfonodos regionais
NX Os linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 Ausência de metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em linfonodos regionais
Metástase
MX A presença de metástase à distância não pode ser avaliada
M0 Ausência de metástase à distância
M1 Metástase à distância
Para os tumores do esôfago torácico inferior
M1a Metástase em linfonodos celíacos
M1b Outra metástase à distância
Para os tumores do esôfago torácico superior
M1a Metástase em linfonodos cervicais
M1b Outra metástase à distância
Para os tumores do esôfago torácico médio
M1a Não aplicável
M1b Metástase à distância incluindo linfonodos não-regionais
9
Tabela 2. Grupamento por estádios do carcinoma de células escamosas do esôfago de acordo com a classificação TNM (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
1.2.1.3. Tratamento e prognóstico
O tratamento para o carcinoma de células escamosas do esôfago depende da
extensão da doença e das condições clínicas do paciente. Mais de 50% dos pacientes
apresentam doença irressecável ou metastática no momento do diagnóstico, sendo
feito o tratamento paliativo utilizando quimioterapia com regime de cisplatina e 5-
fluoracil e/ou radioterapia. Casos localmente avançados são potencialmente curáveis e,
portanto, a cirurgia de ressecção total ou parcial do esôfago (esofagectomia)
geralmente é o tratamento mais indicado. Dentre os pacientes que apresentam
condições clínicas para serem submetidos à esofagectomia, de 13 a 20% apresentam
a doença no estádio I, de 14 a 27% no estádio IIA, de 7 a 16% dos pacientes
apresentam o CCEE no estádio IIB e 40 a 54% no estádio III (ENZINGER & MAYER,
2003). Nos casos onde a cirurgia é contra-indicada por condições clínicas, a opção
alternativa é a quimioterapia com os compostos cisplatina e 5-fluoracil e/ou radioterapia
com intenção curativa.
Devido à frequente falha na resposta ao tratamento com intenção curativa no
carcinoma de células escamosas do esôfago, o prognóstico desse câncer permanece
ruim. Apesar de ter sido visto um discreto aumento desde a década de 70 até os dias
atuais, a sobrevida em 5 anos dos pacientes com CCEE permanece muito baixa, em
torno de 10% (ENZINGER & MAYER, 2003). Quanto mais avançado o estádio do
Estádio T N M
Estádio 0 Tis N0 M0
Estádio I T1 N0 M0
Estádio IIA T2,T3 N0 M0
Estádio IIB T1,T2 N1 M0
Estádio III T3 N1 M0
T4 Qualquer N M0
Estádio IV Qualquer T Qualquer N M1
Estádio IVA Qualquer T Qualquer N M1a
Estádio IVB Qualquer T Qualquer N M1b
10
tumor, pior o prognóstico da doença. A sobrevida está diretamente relacionada ao
estádio do tumor no momento do diagnóstico. Em casos onde é possível a remoção
completa do tumor, a sobrevida dos pacientes em 5 anos é maior do que 95% em
tumores em estádio 0, de 50 a 80% para pacientes com tumores em estádio I, de 30 a
40% para CCEE em estádio IIA, de 10 a 30% para pacientes com tumor em estádio IIB
e de 10 a 15% para pacientes com tumor em estádio III. Pacientes com doença
metastática (estádio IVB), apresentam uma sobrevida mediana de menos de um ano
(ENZINGER et al., 1999) (Tabela 3).
Tabela 3. Sobrevida em 5 anos de pacientes com CCEE nos quais é possível a remoção completa do tumor (adaptada de ENZINGER et al., 1999).
Estádio Sobrevida em 5 anos (%)
0 > 95
I 50-80
IIA 30-40
IIB 10-30
III 10-15
IVA < 5
IVB < 1
Para reverter este cenário e aumentar a expectativa de vida dos pacientes com
esta doença, é preciso entender como ocorre a carcinogênese molecular do esôfago
para tratar com maior eficácia estes pacientes, diagnosticar em estádios precoces e
idealmente, preveni-lo. Diversas alterações moleculares no CCEE já foram descritas
como importantes na sua carcinogênese e serão discutidas a seguir, tendo como foco
os genes TP53 e GBP2.
1.3. Alterações moleculares no CCEE
A carcinogênese molecular do esôfago ainda é pouco compreendida e há uma
intensa busca por alterações moleculares que sejam determinantes para a evolução
do epitélio normal do esôfago ao câncer.
11
Na literatura, várias alterações moleculares já foram descritas. A Figura 5
mostra dados de uma revisão feita de 187 estudos selecionados por Lin e
colaboradores através de uma busca na literatura por estudos que confirmaram
alterações protéicas no CCEE ou no soro de pacientes com a doença pelas técnicas
de western blotting, imunohistoquímica ou ELISA (enzime-linked immunosobent assay)
(LIN et al., 2009). Nesta revisão, foram identificadas 214 proteínas alteradas no CCEE
que foram classificadas de acordo com sua função biológica. Mais de 50% das
proteínas estavam envolvidas com a transdução de sinais, regulação da transcrição,
ciclo celular e apoptose, indicando que estas alterações são importantes para o
desenvolvimento do CCEE (LIN et al., 2009). Além destes dados de proteínas
alteradas, outros estudos confirmam que nas células tumorais do CCEE existe uma
alta frequência de alterações em genes envolvidos na regulação do ciclo celular. Os
eventos moleculares mais comuns no CCEE são inativação de genes supressores de
tumor (mutações e perda de heterozigosidade – LOH - do gene TP53; LOH do gene da
tilose relacionada ao câncer de esôfago TOC), perda de controle do ciclo celular na
fase G1 por diversos mecanismos (metilação do promotor de p16MTS1; amplificação
de CICLINA D1; LOH do gene do retinoblastoma, RB) e ativação de oncogenes
(amplificações de EGFR e cMYC) (MANDARD et al., 2000).
Figura 5. Funções biológicas de proteínas desreguladas no CCEE e respectivas porcentagens de ocorrência. (Adaptado de LIN et al., 2008).
Apoptose11,20%
Angiogênese3,73%
Regulação de transcrição
12,45%
Regulação de tradução 1,24%
Ciclo celular11,62%
Desconhecida 10,37%
Transdução de sinais
19,09%
Diferenciação celular6,22%
Adesão celular8,30%
Proliferação celular8,71%
Migração celular 1,24%
Metabolismo 5,81%
12
Apesar destes dados moleculares investigados por diversos estudos, não há
evidências que relacionem diretamente um gene específico ao desenvolvimento do
câncer de esôfago (SCHULER & GREEN, 2001). Ou seja, as alterações moleculares já
descritas no CCEE ainda não são utilizadas como biomarcadores e na prática clínica.
Um biomarcador é qualquer característica que possa ser mensurada
objetivamente e avaliada como um indicador de um processo fisiológico (normal) ou
patológico. Para se distinguir um célula tumoral de uma célula normal, os
biomarcadores podem ser moléculas específicas (como DNA, mRNA, proteína),
processos fisiológicos (como proliferação celular e angiogênese) e até mesmo tipos
celulares (DALTON & FRIEND, 2006). Estes marcadores, os quais podem ser
encontrados em fluidos, tecidos e células, são produzidos pelas células tumorais ou
outros tecidos em resposta à presença do tumor. Mutações, amplificações ou
translocações gênicas, alterações de expressão gênica e protéica são exemplos de
biomarcadores.
Para a identificação de um biomarcador tumoral, o primeiro passo é a busca de
diferenças entre células tumorais e não-tumorais. Essa busca pode ser feita de duas
maneiras: direcionada, pela procura de alterações em vias metabólicas relevantes
para o desenvolvimento do câncer, ou não direcionada, pela investigação de
alterações moleculares possivelmente relevantes para o desenvolvimento do câncer
através de técnicas como o arranjo de genes e espectrometria de massa em
combinação com vários testes estatísticos e matemáticos (BRINKMAN, 2004).
Nesse contexto e com a finalidade de identificar um possível biomarcador, dois
eventos moleculares no CCEE serão explorados e discutidos neste estudo: alterações
genéticas no gene TP53, que são bem descritas na literatura, e alteração na
expressão gênica do gene GBP2 humano, uma alteração recentemente relatada
(GUIMARÃES et al., 2009).
1.3.1. A proteína p53
1.3.1.1. Gene e proteína p53
O gene TP53 (número de acesso NC_000017.9 no GenBank, NCBI:
www.ncbi.nlm.nih.gov) em humanos está localizado na posição 13.1 do braço curto do
cromossomo 17 (17p13.1) e possui 11 éxons, sendo o primeiro não-codificante
13
(GUIMARÃES & HAINAUT, 2002; HOLLSTEIN et al., 1991). A proteína nuclear p53,
codificada por este gene, possui 53 kDa e é composta por 393 aminoácidos. Esta
proteína pode ser dividida em 5 regiões funcionais: 1) domínio de ativação
transcricional (resíduos 20 a 60); 2) domínio rico em prolina (resíduos 60 a 90); 3)
domínio de ligação ao DNA (resíduos 100-300), formado por duas folhas-beta ligadas
por α-hélices e um átomo de zinco; 4) domínio de tetramerização (resíduos 320 a 360);
5) domínio de regulação de ligação não-específica ao DNA (resíduos 363 a 393) (CHO
et al., 1994; HAINAUT & HOLLSTEIN, 2000; MEPLAN et al., 2000).
1.3.1.2. Funções de p53 e regulação transcricional de genes-alvos
A proteína p53 é um fator de transcrição constitutivamente expresso em baixos
níveis em quase todos os tipos de células humanas. Sob diferentes estímulos, p53
sofre modificações pós-traducionais, tais como fosforilação, acetilação, e é acumulada
no núcleo da célula, exercendo suas funções de regulação do ciclo celular, apoptose,
senescência, diferenciação e/ou reparo de DNA. Os estímulos que ativam p53 são
originados a partir de estresse genotóxico (dano ao DNA por raios ultravioletas,
irradiação gama ou X, carcinógenos, drogas citotóxicas), estresse não-genotóxico
(hipóxia, depleção de nucleotídeos) ou estresse oncogênico (ativação de vias de
sinalização de crescimento celular) (GUIMARÃES & HAINAUT, 2002) (Figura 6). A p53
participa na regulação de diversos processos biológicos. Essa regulação é feita através
da ligação do domínio central da p53 a sequências específicas (elementos responsivos)
na região promotora de genes-alvo ou pela ligação direta a outras proteínas (OREN,
1999).
Os elementos responsivos a p53 são sequências específicas de DNA
encontradas nas regiões promotoras de genes-alvo da p53. Consistem em duas
repetições da sequência 5’-RRRCWWGYYY-3’ separadas por 0 a 13 pares de bases,
na qual R é uma base purínica, C uma citosina, W uma adenina ou timina, G uma
guanina e Y uma base pirimidínica. Nesta sequência a quarta citosina e a sétima
guanina são as bases menos variáveis (EL-DEIRY et al., 1992; FUNK et al., 1992).
Através da utilização da bioinformática e estudos de microarranjo, estudos sugerem a
existência de 300 a 1600 elementos responsivos a p53 em todo o genoma humano
(CAWLEY et al., 2004; HOH et al., 2002).
14
Um dos genes-alvo da p53, e seu principal repressor, é o gene que codifica a
proteína Hdm2. A Hdm2 é induzida pela p53, gerando uma alça de regulação negativa
que controla os níveis celulares de p53. Em condições fisiológicas, Hdm2 se liga a p53,
induz a adição de radicais ubiquitina (ubiquitinação) em p53, que é degradada pelo
proteassoma (ASHCROFT & VOUSDEN, 1999). Quando a célula recebe algum
estímulo que ative p53, as alterações pós-traducionais de p53 fazem com que Hdm2
não seja mais capaz de se ligar a p53 e induzir a sua degradação. Quando estabilizada,
p53 é capaz de ativar e inibir centenas de genes envolvidos no ciclo celular (como
p21WAF/CIP1, 14-3-3s, GADD45, PTEN), reparo do DNA (MSH2, PCNA), apoptose
(BAX, NOXA, PUMA), diferenciação e senescência celular.
Figura 6 . Esquema da via da proteína p53. São esquematizadas as 3 classes de estímulos que ativam p53, que por sua vez exerce diversas funções biológicas (adaptada de GUIMARÃES & HAINAUT, 2002).
1.3.1.3. Alterações no gene TP53 e câncer
O TP53 é um dos genes que mais se encontra mutado em todos os tipos de
câncer. Cerca de 97% das mutações descritas para este gene são encontradas na
região que codifica o domínio de ligação da proteína ao DNA (Figura 7) (HAINAUT &
Estresse genotóxico(Dano ao DNA)
Raios ultravioletas, X e γCarcinógenos
Drogas citotóxicas
Estresse oncogênico
Ativação de oncogenes
Estresse não-genotóxicoHipóxia
Depleção de nucleotídeos
Controle do ciclo celular
Reparo do DNA
Apoptose
Diferenciação
Estresse genotóxico(Dano ao DNA)
Raios ultravioletas, X e γCarcinógenos
Drogas citotóxicas
Estresse oncogênico
Ativação de oncogenes
Estresse não-genotóxicoHipóxia
Depleção de nucleotídeos
Controle do ciclo celular
Reparo do DNA
Apoptose
Diferenciação
15
HOLLSTEIN, 2000; OLIVIER et al., 2002). Além disso, 30% de todas as mutações na
proteína se concentram em seis códons: códons 175, 245, 248, 249, 273, 282
(hotspots). Destes, cinco possuem citosinas localizadas em sítios CpG, que geralmente
estão metilados no genoma humano. Ao sofrerem deaminação espontânea, a citosina
metilada é transformada em timina, sendo essa deaminação espontânea uma causa
comum das mutações em hotspots (EHRLICH et al., 1990).
Figura 7 . Esquema dos domínios funcionais da proteína p53, destacando os códons em que se encontra a maioria das mutações em tumores. Também estão indicados os 5 domínios da proteína p53: o domínio N-terminal de ativação transcricional (AD1, AD2), a região rica em prolina (PXXP), o domínio central de ligação ao DNA, o domínio de tetramerização (TETRA) e a região C-terminal de ligação não-específica ao DNA (BASIC) (retirada do sítio de internet da Agência Internacional de Pesquisa do Câncer, IARC, Outubro de 2003, http://www.iarc.fr/P53).
Além dos hotspots, sabe-se que determinados códons da proteína p53 podem
sofrer mutações específicas devido à exposição a carcinógenos específicos, sendo
possível correlacionar essas mutações com determinados fatores de risco para o
desenvolvimento do câncer (GUIMARÃES & HAINAUT, 2002; VOGELSTEIN &
KINZLER, 1992). Um exemplo é relatado no trabalho de Hainaut e Pfeifer, no qual foi
visto que a fumaça dos componentes do tabaco induzem transversões de guanina para
timina (G>T) nos códons 157, 158, 248 e 273 da p53 no câncer de pulmão associado
ao tabaco (HAINAUT & PFEIFER, 2001). Outro exemplo é a aflatoxina B1, uma
micotoxina carcinogênica, que é capaz de causar mutações G>T e G>A no códon 249
da p53 de pacientes com carcinoma hepatocelular (MONTESANO et al., 1997). Assim
DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO DNADOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO DNA
16
é possível estabelecer uma conexão entre a causa e a exposição dos pacientes a
carcinógenos que podem desencadear o processo de transformação das células.
Além de mutações, cerca de 85 alterações polimórficas no gene TP53 estão
relatadas na literatura. A maioria está localizada em íntrons, em regiões fora dos sítios
de splicing, não resultando em alteração na estrutura da proteína (PETITJEAN et al.,
2007). Dois dos polimorfismos mais estudados estão localizados no éxon 4 e consistem
em substituição de aminoácidos: um no códon 47, com os alelos prolina/serina e outro
no códon 72, com os alelos arginina/prolina. O alelo serina no códon 47 diminui a
habilidade de p53 transativar dois de seus genes-alvo (p53AIP1 e PUMA) e de induzir a
apoptose (LI et al., 2005). O polimorfismo do códon 72 é o mais frequente. Estudos
mostram que as variantes prolina e arginina possuem tempos de degradação e
propriedades transcricionais diferentes (THOMAS et al., 1999). Em algumas
populações foi vista a associação do alelo prolina e o aumento do risco de desenvolver
câncer do pulmão em fumantes (FAN et al., 2000; MURATA et al., 1998). Alguns
estudos demonstram que o alelo arginina pode estar correlacionado com uma maior
suscetibilidade de cânceres associados a infecções pelo HPV (STOREY et al., 1998).
No CCEE, essa maior susceptibilidade não foi vista em um estudo na população
Chinesa de uma área de alto risco para o câncer de esôfago (PEIXOTO et al., 2001).
1.3.1.4. Alterações no gene TP53 no CCEE
A prevalência de mutações em TP53 no CCEE varia entre 40 e 50% dos casos
(MONTESANO et al., 1996). Segundo o banco de dados de TP53 da Agência
Internacional de Pesquisa do Câncer (IARC), o efeito mais comum de mutação é o de
substituição de aminoácidos (missense, 69,1% dos casos), seguido por mutações que
levam à alteração da matriz de leitura (frameshift, 11,2%) e mutações que introduzem o
códon de parada (nonsense, 9,85%). Os códons de p53 mais mutados no CCEE são
175, 176, 179, 193, 220, 245, 248, 273 e 282. Com exceção dos códons 176, 179, 193
e 220, os demais são hotspots de TP53 observados em todos os tipos de câncer. O
padrão de mutação mais observado no CCEE é a transversão G:C para T:A, com
19,7% dos casos. Este tipo de mutação está relacionado a componentes da fumaça do
tabaco (HARRIS, 1991).
Dada a importância da mutação da p53 para a progressão do CCEE, foi
realizada uma busca por novos genes ou proteínas reguladas pela p53 em uma
17
linhagem proveniente do CCEE. Esta investigação gerou uma hipótese de uma
possível cooperação entre a via de ativação de p53 e a via de interferons, através da
observação da indução de GBP2 dependente de p53 (GUIMARÃES et al., 2009).
1.3.2. GBP2 , membro da família das proteínas ligad oras de guanilato
A proteína ligadora de guanilatos-2, GBP2, é membro da família das GTPases de
alto peso molecular de 67 kDa originalmente descobertas em fibroblastos humanos
no fim da década de 1970 (GUPTA et al., 1979). As proteínas ligadoras de guanilato,
GBPs, possuem esse nome por sua capacidade de ligação e clivagem de
nucleotídeos de guanina (CHENG et al., 1983; CHENG et al., 1985). As GBPs
conseguem se ligar e hidrolisar GTP em GDP e GMP, sendo esta uma
característica exclusiva desta família de proteínas (CHENG et al., 1991; NEUN et al.,
1996a).
Em 1984, Staeheli e colaboradores investigaram quais proteínas induzidas por
interferons em baços murinos se ligariam a GMP imobilizado em agarose. Este trabalho
revelou uma espécie principal de proteína, GBP1, e diversas outras espécies, sendo
esta a primeira sugestão de que as GBPs formam uma família multigênica (STAEHELI
et al., 1984). Atualmente, estão descritos na literatura 7 membros da família das GBPs
humanas: GBP1 a GBP7, que possuem de 67 a 73 kDa (NEUN et al., 1996a;
SCHWEMMLE & STAEHELI, 1994; TRIPAL et al., 2007). Membros desta família
também foram descritos em camundongos, ratos, galinhas e porcos (ASUNDI et al.,
1994; MA et al., 2008; SCHWEMMLE et al., 1996; WYNN et al., 1991).
As primeiras GBPs humanas a serem clonadas foram GBP1 e GBP2 (CHENG et
al., 1991). Embora possuam 75,5% de identidade na composição de aminoácidos
(VESTAL, 2005), as afinidades de GBP1 e GBP2 humanas por GDP e GMP variam. A
hidrólise do GTP catalisada por GBP1 humana gera principalmente GMP
(SCHWEMMLE et al., 1994), enquanto a hidrólise do GTP catalisada por GBP2 produz
predominantemente GDP, embora também sejam produzidos baixos níveis de GMP
(NEUN et al., 1996b).
A proteína GBP2 humana foi inicialmente identificada a partir de fibroblastos
tratados com interferons (CHENG et al., 1991) e a murina, a partir de macrófagos
derivados da medula óssea de camundongos tratados com interferon γ (VESTAL et al.,
1998).
18
1.3.2.1. Gene e proteína GBP2
O gene GBP2 (número de acesso NC_000001.9 no GenBank) em humanos está
localizado na posição 22.2 do braço curto do cromossomo 1 (1p22.2) orientado na
mesma direção que GBP1, GBP3, GBP4, GBP5 e GBP7 (OLSZEWSKI et al., 2006). A
proteína codificada por este gene possui 67 kDa, 591 aminoácidos e 11 éxons, sendo
o primeiro não codificante.
A estrutura tridimensional da proteína GBP2 ainda não foi descrita, apenas a de
GBP1 (PRAKASH et al., 2000b). Sabe-se, porém, que as GBPs, inclusive GBP2,
podem ser divididas em duas regiões estruturais e funcionais: a região N-terminal e a
região C-terminal. A primeira contém um domínio globular no qual se ligam GTP, GDP
e GMP, sendo a região responsável pela atividade de GTPase. A região C-terminal
contém uma série de α-hélices e é onde está localizado o motivo de isoprenilação
“CaaX”, no qual “C” corresponde a um resíduo cisteína, “a” corresponde a um
aminoácido alifático e “X” a um outro aminoácido não-específico. A adição de radicais
isoprenil (isoprenilação) na proteína GBP2 está relacionada à localização desta
proteína na célula (PRAKASH et al., 2000a; PRAKASH et al., 2000b). Vestal demonstra
em seu trabalho que Gbp2 murina está localizada em vesículas distribuídas
difusamente pelo citoplasma e que essa ligação exige a isoprenilação de Gbp2
(VESTAL et al., 2000). Em células humanas, Tripal e colaboradores observaram que
GBP2 pode se localizar no citoplasma, no complexo de Golgi e no núcleo (TRIPAL et
al., 2007).
1.3.2.2. Funções biológicas das GBPs
Pouco se sabe sobre as funções biológicas das GBPs. A proteína GBP1
humana é o membro mais estudado da família das GBPs e sua expressão é vista
predominantemente em células endoteliais de vasos sanguíneos sendo rara em outras
células (LUBESEDER-MARTELLATO et al., 2002). Embora GBP1 humana e Gbp2
murina possuam atividade antiviral contra os vírus da encefalomiocardite e da
estomatite vesicular (ANDERSON et al., 1999; CARTER et al., 2005a), esta atividade é
menor do que a atividade antiviral das proteínas Mx, que também formam uma família
GTPases de alto peso molecular. Isso indica que provavelmente a principal função das
19
GBPs não é a de proteger o organismo contra vírus e que esta inibição pode ser
secundária a outras mudanças fisiológicas causadas pelas GBPs (STAEHELI et al.,
1984; VESTAL, 2005).
Até o momento, em um número limitado de tipos celulares analisados, sabe-se
que GBP1 humana e Gbp2 murina possuem efeitos opostos na proliferação celular
(GORBACHEVA et al., 2002). GBP1 possui uma função antiproliferativa uma vez que
inibe a proliferação e a migração de células endoteliais em resposta a citocinas
inflamatórias (GUENZI et al., 2001; GUENZI et al., 2003). Recentemente, uma análise
multivariada apontou o aumento da expressão de GBP1 como um fator prognóstico
independente, indicando uma diminuição no risco relativo de morte em pacientes com
carcinoma colorretal (NASCHBERGER et al., 2005). Em contrapartida, foi demonstrado
que Gbp2 murina é capaz de induzir a proliferação de fibroblastos de camundongos
mesmo na ausência de outras proteínas induzidas por interferons, causar a perda
parcial da inibição do crescimento celular por contato, diminuir a dependência dos
fibroblastos a fatores de crescimento exógenos e induzir a formação de tumores em
camundongos atímicos (GORBACHEVA et al., 2002). Essas funções dependem do
domínio N-terminal da proteína, uma vez que foram abolidas com a expressão de Gbp2
apresentando uma mutação pontual neste domínio (serina para asparagina no códon
52, p.S52N). Estes dados sugerem que o domínio de ligação dos nucleotídeos de
guanina de Gbp2 pode ser importante na proliferação celular (GORBACHEVA et al.,
2002). Além disso, Gbp2 murina confere resistência à citotoxidade gerada pelo
quimioterápico paclitaxel, protegendo a maioria das células de entrarem em apoptose.
Essa função de Gbp2, porém, não é dependente de sua atividade enzimática,
provavelmente sendo dependente do domínio C-terminal (BALASUBRAMANIAN et al.,
2006). Gbp2 murina também é capaz de alterar o crescimento celular, o citoesqueleto
de actina, a adesão e a migração de fibroblastos (VESTAL, 2005).
1.3.2.3. Regulação de GBP2
Sabe-se que as GBPs são fortemente induzidas por interferons dos tipos I (α, β)
e II (γ) (ANDERSON et al., 1999; CARTER et al., 2005b), sendo maior a indução após o
estímulo com interferon γ (BOEHM et al., 1998). Elas também podem ser induzidas por
outras citocinas como interleucina-1α (IL−1α), IL-1β e fator de necrose tumoral-
20
α (TNF−α) (GUENZI et al., 2001; LUBESEDER-MARTELLATO et al., 2002; NGUYEN
et al., 2002).
Para a transcrição de GBP2 dependente de interferons em humanos e
camundongos, sua região promotora deve possuir a sequência de ligação para dímeros
das moléculas transdutoras de sinais e ativadoras de transcrição (STAT) e para os
fatores responsivos aos interferons (IRFs) (BRIKEN et al., 1995;LEW et al., 1991).
Células de camundongos nocaute para o gene Irf1 praticamente não apresentam
expressão de GBPs após o tratamento com interferon γ (KIMURA et al., 1994; KIMURA
et al., 1996). Além deste estudo, apenas outro estuda a região promotora de GBP2. Em
uma análise por bioinformática (in silico), foram identificados diferentes elementos
responsivos a fatores de transcrição, incluindo ISRE (elemento de resposta estimulada
por interferon), GAS (sítio de ativação por interferon γ), NFkB, AP-1, IRF2 (fator regulador
de interferon-2), XRE (elemento de resposta a xenobióticos), p53, C/EBP
(CCAAT/enhancer-binding protein), IRS (sequência de resposta a interferon) e GRE
(elemento responsivo a glicocorticóide) (Tabela 4) (OLSZEWSKI et al., 2006). Porém,
esses dados não foram validados experimentalmente.
Recentemente, foi descrito por nosso grupo a regulação de GBP2 dependente
de p53 na linhagem de CCEE TE-1 (GUIMARÃES et al., 2009). Esta linhagem expressa
a proteína p53 com uma mutação no códon 272 que substitui um aminoácido valina para
um metionina. Essa mutação é termossensível, fazendo com que a 32ºC em parte das
células TE-1, p53 readquira sua conformação selvagem e consiga se ligar ao DNA
regulando seus genes-alvo. Quando as células são cultivadas a 37ºC, p53 assume uma
conformação mutante, incapaz de ativar seus genes-alvo. Utilizando este modelo, foi
analisada a expressão de GBP2 nas duas condições de temperatura pela reação de
transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase semi-quantitativa (RT-
PCR). Foi visto um aumento dependente do tempo na expressão de GBP2 em células
cultivadas a 32ºC. A dependência da regulação de GBP2 por p53 foi confirmada após a
inibição de p53 pela técnica de RNA de interferência, que diminuiu os níveis gênicos e
protéicos de GBP2 (GUIMARÃES et al., 2009).
A investigação in silico, que identificou um sítio de ligação de p53 iniciando na
posição -476 da região promotora do gene GBP2 humano (OLSZEWSKI et al., 2006), e o
relato recente da indução de GBP2 humana dependente da p53 em linhagem de CCEE
(GUIMARÃES et al., 2009), indicam que p53 pode estar envolvida na regulação
21
transcricional de GBP2, podendo ser este um processo importante na carcinogênese
esofagiana. Até o presente estudo, porém, não havia sido estudada a ligação direta da
proteína p53 à região promotora do gene GBP-2.
Tabela 4 . Sítios de ligação de fatores de transcrição de GBP2 humano e suas respectivas localizações na região promotora do gene, sendo a posição +1 o início da transcrição.
ISRE GAS NFkB AP-1 IRF2
+152 -918 +129, -2348 +14, -745, -2484 -2641
XRE p53 C/EBP IRS GRE
-609, -1201, -2257, -2454
-476 -62, -432, -604, -2654
-448, -1374, -2597
+287, -388, -403, -704, -714, -880, -982, -1249,
-1468 ISRE: elemento de resposta estimulada por interferon; GAS: sítio de ativação por interferon γ; IRF2: fator regulador de interferon-2; XRE: elemento de resposta a xenobióticos; C/EBP: CCAAT/enhancer-binding protein; IRS: sequência de resposta a interferon; GRE: elemento responsivo a glicocorticóide (adaptada de OLSZEWSKI et al., 2006).
1.3.2.4. Alterações em GBP2 no CCEE
Além da dependência de p53, o trabalho publicado por nosso grupo investigou
em um estudo retrospectivo por imunohistoquímica a expressão da proteína GBP2
humana no epitélio normal e no tecido tumoral de pacientes com CCEE (GUIMARÃES
et al., 2009). Embora tenha sido vista a expressão de GBP2 tanto no epitélio normal
adjacente quanto no tumor, glândulas da submucosa e vasos sanguíneos, houve uma
predominância significativa da expressão de GBP2 nas células tumorais quando
comparadas às células do epitélio normal adjacente. Além disso, no epitélio normal, o
aumento da expressão de GBP2 foi visto nas células da camada basal (que possuem
alta taxa proliferativa) (Figura 8).
22
Figura 8. Imunohistoquímica para a marcação de GBP2 no CCEE e no epitélio normal adjacente ao câncer. A) Células tumorais marcadas com anticorpo anti-GBP2. B) Epitélio escamoso do esôfago histopatologicamente normal adjacente ao tumor mostrando a marcação de GBP2 nas células da camada basal. C) Marcação de GBP2 em células endoteliais de vasos sanguíneos. D) Marcação de GBP2 em glândulas submucosas de esôfago (extraída de GUIMARÃES et al., 2009).
23
2. OBJETIVOS
24
O conjunto de dados apresentados anteriormente sugere a relação de GBP2
com proliferação celular e com a carcinogênese do esôfago, sendo um potencial
candidato a biomarcador no CCEE, justificando assim sua melhor caracterização e a
confirmação do aumento da expressão durante o desenvolvimento do câncer de
esôfago em um estudo prospectivo. Ainda, levanta a pergunta sobre qual a relação
entre a proteína supressora de tumor p53 e GBP2, que pelos dados publicados,
apresenta uma atividade pró-carcinogênica.
Portanto, o objetivo geral deste estudo foi investigar a expressão de GBP2 no
carcinoma de células escamosas do esôfago (CCEE) e sua possível associação com a
proteína p53 nesta doença.
Os objetivos específicos foram divididos em fases pré-clínica e clínica. São estes:
• Objetivo pré-clínico:
o Investigar a ligação da proteína p53 na região promotora do gene GBP2
em linhagem celular de CCEE;
• Objetivos clínicos:
o Analisar a expressão gênica de GBP2 em amostras de pacientes com
CCEE e no tecido não-tumoral adjacente;
o Analisar a frequência e o espectro de mutação no gene TP53 nas
amostras acima citadas;
o Avaliar a possível associação entre a expressão de GBP2 com o status
de mutação no gene TP53 e com os dados clínico-patológicos das
amostras citadas anteriormente.
25
3. MATERIAIS E MÉTODOS
26
3.1. Estudo Pré-clínico
3.1.1. Cultura de células
A linhagem celular utilizada neste estudo foi a linhagem TE-1, estabelecida a
partir de carcinoma de células escamosas de esôfago bem diferenciado e estádio II de
um paciente de sexo masculino com 58 anos de idade. Esta linhagem celular foi
caracterizada por não possuir alelo selvagem do gene TP53 (BARNAS et al., 1997),
possuindo uma mutação termossensível in vitro (ROLLEY et al., 1995) causada pela
substituição de base única no códon 272 do TP53 (valina para metionina, p53Val272Met).
Assim, quando cultivadas a 32ºC, em parte das células TE-1 a proteína p53 readquire
conformação selvagem e, portanto, torna-se capaz de se ligar ao DNA, regulando seus
genes-alvo. Existe, portanto, um acúmulo de células na fase G1 do ciclo celular, com
diminuição tanto da fase S quanto da fase G2. Quando as células TE-1 são cultivadas
a 37ºC, esta habilidade da p53 é interrompida e seus genes responsivos não são
ativados (GUIMARÃES et al., 2009).
Esta caracterização foi previamente feita no laboratório do Molecular
Carcinogenesis and Biomarkers Group chefiado pelo Dr. Pierre Hainaut da
Internacional Agency for Research on Cancer (IARC, Lyon, França), onde também foi
feito o ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP), este realizado durante este
projeto. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para avaliar a
expressão de GBP2 nas condições de cultivo da linhagem TE-1 a 32ºC e a 37ºC foi
feita no laboratório da Divisão de Pesquisa Clínica Aplicada do Instituto Nacional de
Câncer (INCA, Rio de Janeiro, Brasil).
As células TE-1 foram cultivadas em meio de cultura RPMI-1640 (Gibco®,
Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA) complementado com 10% de soro fetal bovino
termo-inativado (Gibco®) e 0,1% de penicilina 50 U/mL e mantidas a 37ºC ou 32ºC por
24 horas em atmosfera úmida, contendo 10% de CO2.
As células foram rotineiramente testadas para verificar a presença de diferentes
espécies de Mycoplasma. Este gênero é composto por microorganismos menores que
bactérias e que são capazes de reduzir a taxa de crescimento celular, alterar a
morfologia das células, causar aberrações cromossômicas, induzir ou suprimir a
expressão de citocinas, mudar a composição da membrana celular e alterar o
27
metabolismo de aminoácidos e ácidos nucléicos (MCGARRITY, 1992). Os resultados
foram negativos quanto à presença de Mycoplasma na linhagem TE-1 em todos os
testes realizados.
3.1.2. Investigação por bioinformática de possíveis sítios de ligação da
proteína p53 ao promotor do gene GBP2
As investigações por bioinformática deste trabalho foram feitas em colaboração
com o Dr. Fabio Passetti do Laboratório de Bioinformática e Biologia Computacional do
INCA.
Para identificar possíveis sítios de ligação da p53 na região promotora de GBP2
humano, foi utilizado o aplicativo Gene2Promoter do sítio de internet Genomatix
(http://www.genomatix.de, Genomatix Software GmbH, Munique, Alemanha) (QUANDT
et al., 1995). O Gene2Promoter disponibiliza as sequências dos possíveis sítios de
ligação de fatores de transcrição nas regiões promotoras de todos os genes humanos
anotados de acordo com a construção número 36 (Novembro de 2005) do genoma
humano disponível no sítio do National Center for Biotechnology Information (NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606).
A localização da sequência predita pelo aplicativo Gene2Promoter foi obtida pela
utilização do aplicativo BLAT do sítio da Universidade Califórnia Santa Cruz (UCSC,
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat).
O programa FastPCR versão 4.0 (Primer Digital Ltd.) foi usado para criar
oligonucleotídeos específicos para a amplificação da região promotora de GBP2
contendo o sítio da possível ligação da p53. O aplicativo BLAST do sítio de internet do
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) foi utilizado para confirmar que os
oligonucleotídeos criados possuíam 100% de complementaridade às bases que
flanqueavam a região de interesse. Essa verificação foi seguida pelo uso do aplicativo
In Silico PCR (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) do sítio da UCSC, que
demonstrou que estes oligonucleotídeos eram específicos para a amplificação da
região de interesse.
28
3.1.3. Ensaio de Imunoprecipitação de Cromatina (Ch IP)
O ensaio de imunoprecipitação de cromatina é utilizado para determinar se
existe a ligação direta de um dado fator de transcrição a uma região promotora de
interesse através da imunoprecipitação desta cromatina com anticorpo específico para
o fator de transcrição. A Figura 9 ilustra e resume as etapas realizadas durante este
ensaio, as quais serão detalhadas a seguir. O ensaio, já estabelecido pelo grupo do Dr.
Pierre Hainaut da IARC, foi realizado utilizando como modelo a linhagem celular TE-1
nas condições de cultivo a 32ºC e a 37ºC por 24 horas.
Figura 9 . Etapas do ensaio de imunoprecipitação de cromatina. O input é uma amostra utilizada na reação em cadeia da polimerase (PCR) como controle da quantidade inicial de DNA utilizado no ensaio de ChIP (adaptada a partir de http://www.activemotif.com/catalog/nuc_func/chipit).
Y
Y
Y Y
Imunoprecipitação da cromatina comanticorpo anti-p53
Extração, precipitação elavagem do DNAimunoprecipitado
Formação de ligações entre p53 e o promotorde GBP2 pelo cultivo
das células TE-1 /Fixação destas células
Eluiçãoda cromatina imunoprecipitada /Ruptura da ligação
p53-promotor de GBP2
Lise celular /Fragmentação da
cromatina por pulsosde ultrassom
Recuperação do complexo anticorpo-
cromatina / Lavagem da cromatina
imunoprecipitada
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y YY Y
Imunoprecipitação da cromatina comanticorpo anti-p53
Extração, precipitação elavagem do DNAimunoprecipitado
Formação de ligações entre p53 e o promotorde GBP2 pelo cultivo
das células TE-1 /Fixação destas células
Eluiçãoda cromatina imunoprecipitada /Ruptura da ligação
p53-promotor de GBP2
Lise celular /Fragmentação da
cromatina por pulsosde ultrassom
Recuperação do complexo anticorpo-
cromatina / Lavagem da cromatina
imunoprecipitada
Y YY Y
29
Para fixação das células, 2 placas de células TE-1 cultivadas a 32ºC e 2 placas
de células cultivadas a 37ºC por 24 horas foram incubadas por 10 minutos a
temperatura ambiente com 1% de formaldeído adicionado ao meio de cultura. Em
seguida, 125 mM de glicina foram também adicionados ao meio por mais 5 minutos a
temperatura ambiente. O meio foi então removido e as células, já fixadas, foram
lavadas 2 vezes com 4 mL de PBS 1X na temperatura de 4ºC contendo inibidores de
protease (fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM, aprotinina 1 µg/µL e pepstatina 1 µg/µL).
As células foram recuperadas da placa de cultivo, coletadas em microtubos e
centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado.
A lise das células foi feita pela incubação dos microtubos por 15 minutos a 4ºC
em 250 µL de tampão de lise celular (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 / EDTA 10 mM / SDS 1%)
contendo inibidores de protease nas mesmas concentrações descritas anteriormente.
A fragmentação da cromatina foi feita, em seguida, utilizando um sonicador
Branson 250 (Bioblock Scientific, VibraCell 75041, Illkirch, França). Foram feitas 2
repetições de 10 ciclos de pulsos de ultrassom em cada repetição. Cada ciclo consistia
em 5 segundos de ultrassom gerado a 22% da potência máxima do sonicador de 750
W, seguidos por 5 segundos sem ultrassom. Esta etapa de fragmentação da cromatina
foi realizada oito vezes até se obter fragmentos de DNA nos tamanhos entre 200 e
1000 pb, ideais para este ensaio (Figura 10). Em seguida, os restos celulares foram
precipitados por centrifugação a 13000 rpm por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante,
contendo o DNA fragmentado, foi dividido em duas alíquotas de 200 µL e uma alíquota
de 20 µL para cada condição de cultivo de TE-1 (32ºC e 37º). As 2 alíquotas de 20 µL
(input) foram armazenadas a -20ºC até a fase de ruptura da ligação do fator de
transcrição à cromatina (reverse cross-link) e utilizada na reação em cadeia da
polimerase (PCR) como controle da quantidade inicial de DNA utilizado no ensaio de
ChIP. As 4 alíquotas de 200 µL foram diluídas 10 vezes com o tampão de diluição
(SDS 0,01% / Triton X-100 1,1% / EDTA 1,2 mM / Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1 / cloreto de
sódio, NaCl2, 167 mM) contendo inibidores de protease nas concentrações já
mencionadas.
Para remoção de ligações inespecíficas de proteína A foram adicionados 100 µL
de proteína A agarose / DNA de esperma de salmão (Upstate, Millipore, Molsheim,
França) seguida por agitação dos microtubos por 1 hora a 4ºC. Os microtubos foram
30
centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi transferido para
novo microtubo.
Figura 10 . Foto da eletroforese do DNA de linhagem celular TE-1 fragmentado através de pulsos de ultrassom. Na raia 1 foi aplicado o padrão de peso molecular. Nas raias 2-4 foi aplicado o DNA fragmentado de TE-1 cultivada a 37ºC. Nas raias 5-7, os fragmentos de DNA de TE-1 cultivada a 32ºC. Com exceção das raias 4 e 5, os fragmentos obtidos tinham o tamanho ideal (200 a 1000 pb) para a realização do ensaio de ChIP.
A imunoprecipitação da cromatina na qual se liga a proteína p53 foi feita pela
adição de 3 µg de anticorpo policlonal anti-p53 humano CM1 (Novocastra, Newcastle,
Inglaterra) a uma alíquota do DNA das células TE-1 cultivadas a 32ºC e a uma alíquota
do DNA das células cultivadas a 37ºC. Dez microlitros de IgG de soro de coelho foram
adicionados às 2 alíquotas restantes para o controle negativo do ensaio. Todos os
microtubos foram incubados a 4ºC com agitação durante toda a noite.
Para a recuperação do complexo anticorpo-cromatina, foram adicionados 60 µL
de proteína A agarose / DNA de esperma de salmão a cada um dos 4 microtubos.
Estes foram incubados com agitação por 1 hora a 4ºC, seguida pela centrifugação a
1000 rpm por 2 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado.
31
A lavagem da cromatina imunoprecipitada foi realizada com 4 soluções salinas
de estringência crescente. Primeiramente, 1 mL de tampão com baixa concentração de
sal (Tris-HCl 20 mM, pH 8,1 / EDTA 2 mM / NaCl2 150 mM / SDS 0,1% / Triton 1%) foi
adicionado aos microtubos. As amostras foram incubadas com agitação por 5 minutos
em temperatura ambiente, centrifugadas a 1000 rpm por 2 minutos a 4ºC e o
sobrenadante foi removido. Em seguida, 1 mL de tampão de lavagem com alta
concentração de sal (Tris-HCl 20 mM, pH 8,1 / EDTA 2 mM / NaCl2 500 mM / SDS
0,1% / Triton 1%) foi adicionado. As amostras foram incubadas, centrifugadas e o
sobrenadante removido como descrito anteriormente. Um mililitro do terceiro tampão de
lavagem, a solução de cloreto de lítio (Tris-HCl 10 mM, pH 8,1 / LiCl 0,25 M / NP40 1%
/ deoxicolato 1% / EDTA 1 mM), foi adicionado e realizado o mesmo procedimento de
antes até a remoção do sobrenadante. Por último, foi feita a lavagem com 1 mL do
tampão TE (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0 / EDTA 1 mM) repetindo o processo de incubação,
centrifugação e remoção de sobrenadante. A lavagem com tampão TE foi feita duas
vezes.
A eluição da cromatina imunoprecipitada foi feita pela adição de 250 µL do
tampão de eluição (NaHCO3 0,1 M / SDS 1%) seguida por incubação com agitação por
15 minutos em temperatura ambiente e centrifugação a 5000 rpm por 5 minutos a 4ºC.
O sobrenadante foi recolhido a um novo microtubo e houve repetição da eluição.
A ruptura de ligação (reverse cross-link) entre o fator de transcrição e a região
promotora de interesse foi feita pela incubação das amostras contendo a cromatina
eluída e das amostras input com 200 mM de NaCl2 a 65ºC durante toda a noite.
Para a remoção de proteínas contaminantes, as amostras foram incubadas com
2 µL de Proteinase K 10 mg/mL, 10 µL de EDTA 0,5 M e 20 µL de Tris-HCl 1 M, pH 6,5
por 1 hora a 45ºC.
A extração de DNA foi feita pela adição de 500 µL de fenol às amostras,
centrifugação a 15000 rpm por 5 minutos a 4ºC e transferência da fase superior
contendo o DNA para um novo microtubo. Foram adicionados 500 µL de clorofórmio
seguido pela centrifugação feita como antes. A fase superior, onde se encontra o DNA,
foi transferida para novo microtubo. A precipitação do DNA foi feita em seguida pela
adição de 600 µL de acetato de sódio 0,3 M, pH 5,2, etanol a 4ºC, 20 µg de glicogênio
(Invitrogen) e incubação das amostras a -80ºC durante toda a noite. Após centrifugação
a 15000 rpm por 15 minutos a 4ºC, a lavagem do DNA foi feita pela adição de etanol a
32
75%. As amostras foram centrifugadas a 15000 rpm por 15 minutos a 4ºC e
ressuspensas em 10 µL de tampão TE.
Uma eletroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo foi
feita para avaliar a qualidade do DNA extraído. O DNA foi armazenado a 4ºC até a
utilização na PCR.
3.1.4. PCR para amplificação da região predita por bioinformática
Para a amplificação do DNA contendo o sítio de ligação de p53 às regiões
promotoras de GBP2 e p21WAF/CIP1 foram utilizados oligonucleotídeos específicos
(Tabela 5). O gene p21WAF/CIP1 foi utilizado como controle positivo, pois é um dos
genes-alvo de p53 induzidos nas células TE-1 cultivadas a 32ºC. Os oligonucleotídeos
utilizados para a amplificação da região promotora deste gene foram cedidos pelo
grupo do Dr. Pierre Hainaut, da IARC. Os oligonucleotídeos para a amplificação da
região promotora de GBP2 foram desenhados durante este projeto através do
programa FastPCR versão 4.0 (Primer Digital Ltd.) e validados experimentalmente
através de uma PCR com gradiente de temperatura de anelamento que variou entre
55ºC e 65ºC. A temperatura de 64,5ºC foi escolhida para o anelamento dos
oligonucleotídeos específicos para amplificação da região promotora de GBP2
contendo o elemento responsivo de p53.
A reação para amplificação das regiões promotoras de GBP2 e de p21WAF/CIP1 foi
feita de acordo com a Tabela 6. As amostras foram incubadas em termociclador
Applied Biosystems (Applied Biosystems, Austin, EUA) programado para 5 minutos a
94ºC para desnaturação inicial, 33 (p21WAF/CIP1) ou 35 (GBP2) ciclos de 30 segundos a
94 ºC para desnaturação, 30 segundos a 64ºC (p21WAF/CIP1) ou 64,5ºC (GBP2) para
anelamento dos oligonucleotídeos e 30 segundos a 72ºC para extensão. A extensão
final foi feita por 7 minutos a 72ºC. Como as temperaturas de anelamento dos
oligonucleotídeos são muito próximas, as amplificações de GBP2 e p21WAF/CIP1 podem
ser feitas ao mesmo tempo no termociclador.
Foi realizada uma eletroforese dos produtos da PCR em gel de agarose a 2%
corado com brometo de etídeo. Os fragmentos de DNA foram visualizados sob luz
ultravioleta.
33
Tabela 5 . Oligonucleotídeos específicos para amplificação do DNA contendo o sítio de ligação de p53 às regiões promotoras de GBP2 e p21WAF/CIP1.
Gene Seqüência (5’→3’) Tamanho do
fragmento amplificado
Senso: TCAGCACCTAACCCAGGTCCTGAC GBP2
Anti-senso: ACACACGCTGGTATGATGCCTC 304 pb
Senso : AGAAAGCCAATCAGAGCCACAG p21WAF/CIP1
Anti-senso : CATTGTTCCCAGCACTTCCTCTC 254 pb
Tabela 6 . Reagentes, concentrações e volumes utilizados para a amplificação, pela PCR, das regiões promotoras de GBP2 e p21WAF/CIP1 contendo o sítio de ligação de p53.
Reagentes e concentrações Promotor de GBP2 Promotor de
p21WAF/CIP1
Tampão 10x 2,5 µL 2,0 µL
dNTP 5 mM 0,4 µL 0,6 µL
MgCl2 50 mM 1,0 µL 0,6 µL
Oligonucleotídeo senso 10 mM 1,0 µL 0,8 µL
Oligonucleotídeo anti-senso 10 mM 1,0 µL 0,8 µL
Taq DNA polimerase Platinum 5 U/µL 0,25 µL 0,1 µL
DNA 1,0 µL 1,0 µL
Água Milli-Q Suficiente para 25 µL Suficiente para 20 µL
3.1.5. Isolamento de RNA e PCR quantitativo (qPCR)
Para quantificar a expressão de GBP2 na linhagem TE-1, o isolamento e
quantificação do mRNA desta linhagem, síntese de DNA complementar (cDNA) pela
reação de transcrição reversa e a qPCR foram feitos da mesma forma que foram feitos
durante a etapa clínica e serão discutidos mais adiante (itens 3.2.3.1, 3.2.3.2, 3.2.3.4 e
3.2.3.5, respectivamente).
34
3.2. Estudo clínico
3.2.1. Desenho do estudo
Um fluxograma detalhando as etapas realizadas durante o estudo clínico é
mostrado na Figura 11.
Figura 11 . Fluxograma mostrando as etapas realizadas durante o estudo clínico deste trabalho. T=tecido tumoral. N=tecido não-tumoral adjacente ao tumor.
3.2.2. Pacientes
Foram incluídos 43 pacientes com carcinoma de células escamosas de esôfago
submetidos à endoscopia digestiva no Setor de Endoscopia Digestiva do INCA
entre o período de Junho de 2005 a Dezembro de 2007.
Todos os pacientes incluídos concordaram com sua participação no presente
estudo após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO I).
Pacientes com CCEE
Análise de mutação em TP53 Análise de expressão gênica de GBP2
Sem alteração Com alteração
TP53 Selvagem
TP53 Selvagem
Sem alteração Com alteração
TP53 Mutado
T/N > 1,00 (Aumento de
expressão no T em relação ao N)
T/N < 1,00(Diminuição de
expressão no T em relação ao N)
N submetido a sequenciamento automático
dHPLC e SSCP (T e N)
Sequenciamentoautomático
PCR quantitativa (T e N)
Pacientes com CCEE
Análise de mutação em TP53 Análise de expressão gênica de GBP2
Sem alteração Com alteração
TP53 Selvagem
TP53 Selvagem
Sem alteração Com alteração
TP53 Mutado
T/N > 1,00 (Aumento de
expressão no T em relação ao N)
T/N < 1,00(Diminuição de
expressão no T em relação ao N)
N submetido a sequenciamento automático
dHPLC e SSCP (T e N)
Sequenciamentoautomático
PCR quantitativa (T e N)
35
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA (protocolo
137/04) (ANEXO II).
Os pacientes foram incluídos no estudo no momento do exame diagnóstico no
INCA e nenhum deles havia recebido tratamento prévio para o câncer de esôfago. No
momento da inclusão, todos responderam a um questionário epidemiológico com o
objetivo de caracterizar o grupo em relação aos hábitos de etilismo, tabagismo e
histórico familiar de câncer (ANEXO III). Foram considerados tabagistas aqueles que
fumaram mais de 100 cigarros durante toda a vida e ex-tabagistas aqueles que
pararam de fumar há um ano ou mais da data do diagnóstico do câncer de esôfago.
Um dos pacientes era fumante de cachimbo. Para o cálculo da carga tabágica deste
paciente, foi considerado que um cachimbo equivale a 3 cigarros (BOFFETTA et al.,
1999). O cálculo da carga tabágica de cada paciente foi feito através do produto do
número de maços fumados por dia pelo número de anos de tabagismo (maços/ano).
Foram considerados ex-etilistas aqueles que pararam de consumir bebidas alcoólicas
há um ano ou mais da data do diagnóstico do câncer de esôfago.
Durante o procedimento endoscópico, foram retirados, por biópsia, seis fragmentos
da área tumoral e seis da área não-tumoral adjacente ao tumor, de aspecto
macroscópico normal. Os procedimentos foram realizados pelas endoscopistas
Denise Peixoto Guimarães e Maria Aparecida Ferreira, ambas médicas do Serviço
de Endoscopia Digestiva do INCA. Três fragmentos de cada área foram
armazenados em 1 mL de TRIzol® (Invitrogen) a -20°C para posterior isolamento de
RNA e os três restantes, imediatamente congelados em nitrogênio líquido para
isolamento de DNA.
Os dados clínicos e patológicos foram coletados a partir da revisão dos prontuários
médicos, através de uma ficha clínica (ANEXO IV), e armazenados em um banco
de dados elaborado e gerenciado por Isabele Ávila Small, do setor de Análise de
Informação em Pesquisa do INCA. O estadiamento clínico dos pacientes foi feito de
acordo com a classificação TNM (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004) através
dos resultados obtidos nos exames feitos (endoscopia propriamente dita,
ultrassonografia abdominal e tomografia computadorizada abdominal e torácica) e
do exame clínico no período da endoscopia digestiva diagnóstica de cada paciente
realizada no INCA.
36
3.2.3. Análise de expressão do gene GBP2
3.2.3.1. Isolamento de RNA
As amostras de pacientes foram trituradas manualmente na presença do
reagente TRIzol® (Invitrogen) e o isolamento do RNA realizado de acordo com
instruções do fabricante. As amostras foram incubadas a temperatura ambiente por 5
minutos e a cada 1 mL de TRIzol® foram adicionados 200 µL de clorofórmio seguido
por homogeneização durante 15 segundos. Após centrifugação a 15000 rpm por 15
minutos a 4ºC, a fase aquosa, contendo o RNA, foi transferida para novo microtubo e a
esta foram adicionados 500 µL de isopropanol para a precipitação do RNA. Em seguida,
as amostras foram incubadas por 10 minutos em temperatura ambiente, 10 minutos a
4ºC e centrifugadas a 12000 rpm por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado
e o RNA lavado com 500µL de etanol a 75%, seguido por centrifugação a 7500 rpm por
5 minutos a 4ºC. Após descarte do sobrenadante, as amostras foram ressuspensas em
água tratada com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC) (Sigma Chemical CO, St. Louis,
EUA), para inativação de RNAses, e armazenadas a –80ºC até o seu uso.
3.2.3.2. Quantificação de RNA
A concentração de RNA das amostras foi obtida pela quantificação de
absorbância no comprimento de onda de 260 nm em espectrofotômetro NanoDrop
ND-1000 (ThermoFisher Scientific, Delaware, EUA). Neste comprimento de onda uma
unidade de densidade ótica corresponde a 40 µg RNA por µL (SAMBROOK &
RUSSELL, 2001). Foi utilizado 1 µL concentrado do volume total do RNA isolado para a
leitura da absorbância. A leitura no comprimento de onda de 280 nm foi realizada para
o cálculo da razão A260/A280 para determinar a pureza da amostra de RNA. Os
valores ideais estão compreendidos entre 1,6 e 1,8.
37
3.2.3.3. Purificação de RNA
Para garantir a qualidade e pureza do RNA, todas as amostras (01 a 45) foram
tratadas com DNAse e parte delas (22 a 45) foi purificada pela utilização do RNeasy
mini kit (Qiagen, Maryland, EUA).
As amostras 01 a 21 foram tratadas com DNAse RQ1 livre de RNAses (Promega,
Massachusetts, EUA) seguindo o protocolo determinado pelo fabricante. A todo o
volume de RNA, foram adicionados 2 U de DNAse I, 5 µL de tampão 10x da enzima
(Tris-HCl 400 mM, pH 8,0; MgSO4 100 mM; CaCI2 10 mM) e água livre de RNAse em
um volume suficiente para atingir o volume final de 50 µL. Os microtubos foram então
incubados a 37ºC por 30 minutos para ativação da enzima. A inativação da mesma foi
feita pela incubação por 10 minutos a 65ºC. O RNA foi novamente isolado através do
uso do reagente TRIzol® (Invitrogen), como descrito no item 3.2.3.1.
As amostras 22 a 45 foram purificadas pela utilização do RNeasy mini kit
segundo instruções do fabricante. As colunas e os tampões utilizados foram providos
pelo kit. Primeiramente, toda a ressuspensão contendo o RNA foi misturada com água
livre de RNAse até o volume final de 100 µL. A esta mistura foram adicionados 350 µL
de tampão RLT (que contém tiocianato de guanidina, um sal capaz de inativar RNAses),
3,5 µL de β-mercaptoetanol (Sigma) e 250 µL de etanol a 100% (que permite que o
RNA se ligue à coluna). Todo o volume foi aplicado em uma coluna que contém
membrana de sílica capaz de reter o RNA. As amostras foram centrifugadas a 10000
rpm por 15 segundos a temperatura ambiente. Após descarte do filtrado, foram
adicionados à coluna 350 µL de tampão RW1 (composto por tiocianato de guanidina e
álcool), seguida por nova centrifugação. O eluído foi descartado mais uma vez e o RNA
foi tratado com DNAse pela adição de 70 µL de tampão RDD da enzima (otimizado
para digestão por DNAse em coluna) (Qiagen) e 10 µL de DNAse I (Qiagen). Depois de
incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos, foram adicionados 350 µL de
tampão RW1 à coluna e esta foi centrifugada a 10000 rpm por 15 segundos. Por duas
vezes, foi feita a adição de 500 µL do tampão de lavagem RPE (composto por álcool) e
centrifugação a 10000 rpm por 15 segundos na primeira vez e 2 minutos na segunda.
Em seguida, foi feita centrifugação a 10000 rpm por um minuto para a remoção do
38
excesso de tampão. Cada coluna foi, então, transferida para microtubo com 1,5 mL de
capacidade e o RNA eluído pela adição de 30 µL de água livre de DNAse ao centro da
coluna, incubação a temperatura ambiente por 1 minuto e centrifugação a 10000 rpm
por 1 minuto.
As amostras foram quantificadas por espectrofotometria como descrito
anteriormente e armazenadas a -80ºC até o seu uso.
3.2.3.4. Reação de Transcrição Reversa
Após quantificação do RNA, a síntese de DNA complementar (cDNA) foi
realizada pela reação de transcrição reversa. Para isto, foram utilizados de 500 ng a 4
µg de RNA. A cada 1 µg, foram adicionados 0,4 µL de oligonucleotídeos randômicos a
250 ng/mL (GE Healthcare) e água tratada com DEPC (Sigma) suficiente para um
volume final de 11 µL. As amostras foram incubadas a 65ºC por 5 minutos seguidos por
10 minutos a 4ºC. Em seguida, a cada microtubo foram adicionados 4 µL de tampão 5X
(Invitrogen), 2 µL de DTT 0,1 M (Invitrogen), 2 µL de dNTP 10 mM (GE Healthcare), 1
µL de RNAsin (Promega) e 0,5 µL de Superscript II 200 U/ µL (Invitrogen) e 0,5 µL de
água tratada com DEPC (Sigma) totalizando um volume final de 21 µL. No
termociclador Peltier Termo Cycler 200 (MJ Research, Massachusetts, EUA), as
amostras foram incubadas a 25ºC por 10 minutos, 42ºC por 1 hora, 70ºC por 15
minutos e 15ºC por 10 minutos. Os cDNAs foram armazenados a –20ºC até o seu uso.
3.2.3.5. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativ a (qPCR) utilizando
sondas TaqMan®
A qPCR possibilita a monitoração da reação de PCR em tempo real,
revolucionando a quantificação da expressão gênica. A partir desta técnica pode ser
inferida a quantidade inicial de um determinado produto como DNA e cDNA. A
tecnologia TaqMan® consiste em uma sonda marcada com fluoróforo que se liga à
região complementar do DNA ou cDNA alvo. Esta região está compreendida entre os
sítios de ligação dos oligonucleotídeos específicos para a amplificação da região de
interesse. A sonda possui um fluoróforo denominado reporter na extremidade 5’ e uma
molécula não-fluorescente denominada quencher na extremidade 3’. Quando a sonda
39
está intacta, a proximidade das extremidades da sonda faz com que o quencher
impeça a emissão de fluorescência pela molécula reporter. Quando a PCR é iniciada, a
atividade 5’-3’ exonucleásica da Taq DNA Polimerase cliva a sonda a partir da
extremidade 5’, liberando a molécula reporter e consequentemente há a emissão de
fluorescência. A emissão da fluorescência gera um sinal que aumenta em função do
número de cópias que estão sendo amplificadas (Figura 12). A quantificação da
expressão é dada baseada no número de ciclos em um ponto (Ct = threshold cycle) da
fase exponencial da reação de PCR.
Figura 12 . Esquema geral da PCR quantitativa (qPCR). 1) Início da polimerização com a ligação dos oligonucleotídeos e da sonda TaqMan® intacta na sequência de interesse. 2) Clivagem da sonda pela atividade exonucleásica da Taq DNA Polimerase, liberando o fluoróforo e assim emitindo fluorescência. 3) Duplicação completa da sequência-alvo.
Para determinar o melhor controle endógeno da qPCR, foi feita uma diluição
seriada (10x, 100x, 1000x e 10000x e amostra com cDNA não-diluído) de 4 µg de
cDNA de linhagem celular TE-1 a 37ºC. Quatro microlitros de cada diluição foram
1) Início da polimerização
2) Clivagem da sonda
3) Término da polimerização
SondaIniciador
senso
Iniciador anti-senso
ReporterR = ReporterQ = Quencher
1) Início da polimerização
2) Clivagem da sonda
3) Término da polimerização
SondaIniciador
senso
Iniciador anti-senso
ReporterR = ReporterQ = Quencher
40
misturados com 7,5 µL do TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied
Biosystems), que contém Taq DNA Polimerase AmpliTaq Gold®, tampão de reação e
MgCl2, 0,75 µL da mistura que contém 250 nM da sonda TaqMan® para amplificação
de GAPDH, β-actina ou GBP2 (Assays-on-Demand, Applied Biosystems) e
oligonucleotídeos senso e anti-senso a 900 nM para a amplificação da região de
interesse. O volume final da reação foi de 15 µL, completados com água tratada com
DEPC (Sigma).
As amostras foram colocadas numa placa com 96 poços e submetidas ao
equipamento ABI Prism® 7500 (Applied Biosystems) sob as seguintes condições: 1
ciclo de 95ºC por 20 segundos, 40 ciclos de 95ºC por 3 segundos e 1 ciclo de 60ºC por
30 segundos. A aquisição dos dados foi feita através do programa 7000 System SOS
Software (Applied Biosystems) e o método de 2-∆∆Ct (WINER et al., 1999) foi utilizado
para quantificar a expressão de GBP2 em relação à GAPDH e a expressão de GBP2
em relação à β-actina nos diferentes pontos de diluição (Figura 13). Foi feita uma
regressão linear com os valores obtidos. Para que o melhor controle endógeno fosse
definido, foi avaliado o valor do coeficiente de linearidade desta regressão linear.
Quanto mais próximo de zero este valor, melhor é o controle endógeno pois é menor a
variação entre sua expressão e a expressão gênica de GBP2 (Figura 14). Neste estudo,
o gene GAPDH foi escolhido como controle endógeno (valor do coeficiente de
linearidade: 0,22).
A partir da diluição seriada descrita anteriormente, foram também definidos os
valores de eficiência da qPCR para amplificação de GAPDH e GBP2 e os limites
aceitos de Ct. O programa 7000 System SOS Software faz o cálculo da eficiência de
amplificação e dá uma margem entre as quais deve se situar o Ct.. Para ser
considerada satisfatória a eficiência da reação deve oscilar entre 100 e 110%. Na
Figura 15 é demonstrado que as eficiências de amplificação de GAPDH e GBP2 foram
de 103% e 107%, respectivamente, e os limites aceitos de Ct foram de 19,94 a 32,86
para a amplificação de GAPDH e de 30,41 a 39,10 para a amplificação de GBP2.
41
Figura 13 . Valores de expressão gênica de GBP2 em relação à GAPDH e β-actina nos diferentes pontos de diluição do cDNA da linhagem TE-1. Os valores foram calculados pelo método de 2-∆∆Ct (WINER et al., 1999).
Figura 14 . Regressão linear feita para que o melhor controle endógeno da qPCR fosse definido através do valor do coeficiente de linearidade (sublinhado na figura). Quanto mais próximo de zero este valor, melhor é o controle endógeno pois é menor a variação entre sua expressão e a expressão gênica de GBP2. Neste estudo, o gene GAPDH foi escolhido como normalizador (controle endógeno) da expressão gênica de GBP2.
y = 0,553x + 5,6675R2 = 0,8163
y = 0,22x + 9,66R2 = 0,2399
0
2
4
6
8
10
12
Dil. 10x Dil. 100X Dil. 1000X Dil. 10000X
Del
ta C
t
B-Actina GAPDH Linear (B-Actina) Linear (GAPDH)
y = 0,553x + 5,6675R2 = 0,8163
y = 0,22x + 9,66R2 = 0,2399
0
2
4
6
8
10
12
Dil. 10x Dil. 100X Dil. 1000X Dil. 10000X
Del
ta C
t
B-Actina GAPDH Linear (B-Actina) Linear (GAPDH)
7,005 7,675
5,95
7,57
9,4510,52 10,78 10,10
0
2
4
6
8
10
12
Dil. 10x Dil. 100X Dil. 1000X Dil. 10000X
Del
ta C
t
B-Actina GAPDH
42
Para a quantificação da expressão de GBP2 e do controle endógeno GAPDH
nas amostras de CCEE, o cDNA do tecido tumoral e o cDNA do tecido não-tumoral
adjacente ao tumor dos pacientes com CCEE foram diluídos 10 vezes em água tratada
com DEPC (Sigma). As reações foram feitas como descritas anteriormente na etapa da
diluição seriada. A aquisição dos dados foi feita através do programa 7000 System
SOS Software (Applied Biosystems) e o método de 2-∆∆Ct foi utilizado para quantificar a
expressão de GBP2 em relação à GAPDH.
Figura 15 . Eficiência da reação de qPCR utilizando-se sondas TaqMan® para amplificação dos genes GBP2 e GAPDH utilizando amostras de cDNA de linhagem celular TE-1.
GBP-2Eficiência: 107%Limite de Ct: 30,41 a 39,10
GAPDHEficiência: 103%Limite de Ct: 19,94 a 32,86
39.102
37.000
33.000
29.000
25.000
21.000
19.8141000 2000 3000 4000 5000
Log C0
Ct
GBP2Eficiência 107%Limites aceitos de Ct: 30,41 a 39,10
GAPDHEficiência 103%Limites aceitos de Ct: 19,94 a 32,86
GBP-2Eficiência: 107%Limite de Ct: 30,41 a 39,10
GAPDHEficiência: 103%Limite de Ct: 19,94 a 32,86
39.102
37.000
33.000
29.000
25.000
21.000
19.8141000 2000 3000 4000 5000
Log C0
Ct
GBP-2Eficiência: 107%Limite de Ct: 30,41 a 39,10
GAPDHEficiência: 103%Limite de Ct: 19,94 a 32,86
39.102
37.000
33.000
29.000
25.000
21.000
19.8141000 2000 3000 4000 5000
Log C0
Ct
GBP2Eficiência 107%Limites aceitos de Ct: 30,41 a 39,10
GAPDHEficiência 103%Limites aceitos de Ct: 19,94 a 32,86
43
3.2.4. Análise de mutação no gene TP53
Para as análises de mutação no gene TP53, primeiramente foram realizados dois
métodos de rastreamento de alterações neste gene: a técnica de cromatografia
desnaturante de alta performance (dHPLC) e a técnica de polimorfismo de
conformação de DNA fita simples (SSCP). A dHPLC foi feita por nosso grupo, a
Divisão de Pesquisa Clínica Aplicada do INCA, em colaboração com a Drª Kenia
Balbi El-Jaick, e a SSCP pelo grupo do Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto, do
Departamento de Bioquímica da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)
e da Coordenação de Pesquisa do INCA. Neste trabalho, portanto, apenas será
discutida a técnica de dHPLC.
Após os resultados do rastreamento tanto por dHPLC quanto por SSCP, as
amostras com alteração em TP53 foram submetidas ao sequenciamento automático.
A partir da amostra 34, o sequenciamento foi feito sem método de rastreamento
prévio.
3.2.4.1. Extração de DNA genômico de tecido esofági co
Inicialmente foi feita a digestão dos tecidos. As amostras foram trituradas e
incubadas a 37ºC durante 15 horas em solução contendo 10 µL de proteinase XIV 20
mg/mL (Sigma) e 600 µL de tampão de lise celular (NaCl2 100 mM / Tris-Cl 10 mM, pH
8,0, / EDTA 25 mM / SDS 0,5%, pH 8,0). Após digestão completa do tecido, as
amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 13000 rpm em temperatura ambiente.
Os sobrenadantes foram transferidos para novos microtubos e aos mesmos foram
adicionados 125 µL de NaCl2 6 M. Após centrifugar a 12000 rpm por 5 minutos em
temperatura ambiente, o sobrenadante contendo o DNA foi transferido para um novo
microtubo. Para a precipitação do DNA, foram adicionados 1,5 mL de etanol a 100% e
os microtubos foram centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm a 4°C. O sobrenadante
foi desprezado e para a lavagem do DNA, foram utilizados 500 µL de etanol a 70%. As
amostras foram centrifugadas mais uma vez por 5 minutos a 1200 rpm a 4°C. O
sobrenadante foi desprezado e o DNA foi ressuspenso em tampão TE. Para a completa
diluição do DNA, as amostras foram colocadas a 37°C por toda a noite. Foram
posteriormente armazenadas a -20°C até o seu uso.
44
3.2.4.2. Quantificação de DNA
A concentração de DNA das amostras foi obtida pela quantificação de
absorbância no comprimento de onda de 260 nm em espectrofotômetro NanoDrop
ND-1000 (ThermoFisher Scientific). Neste comprimento de onda uma unidade de
densidade ótica corresponde a 50 µg RNA por µL (SAMBROOK & RUSSELL, 2001).
Foi utilizado 1 µL concentrado do volume total do DNA isolado para a leitura da
absorbância. A leitura no comprimento de onda de 280 nm foi realizada para o cálculo
da razão A260/A280, para determinar a pureza da amostra de DNA. Os valores ideais
estão compreendidos entre 1,8 e 2,0.
3.2.4.3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificação dos
éxons 5 ao 9 do gene TP53
A reação em cadeia da polimerase (PCR) pelo método de touchdown foi feita
para aumentar a especificidade na amplificação da região genômica correspondentes
aos éxons 5 ao 9 do gene TP53. Esta metodologia foi utilizada para as amplificações
de TP53 necessárias para a dHPLC e para o sequenciamento automático (LE CALVEZ
et al., 2005).
Os éxons 5 e 6 foram amplificados em um único fragmento, sendo, portanto,
mantida toda a região intrônica entre eles (amplicon 5-6). O mesmo ocorreu com os
éxons 8 e 9 (amplicon 8-9). A Tabela 7 mostra as sequências dos oligonucleotídeos
utilizados na PCR, obtidas a partir do trabalho de (LE CALVEZ et al., 2005).
A reação para amplificação dos amplicons 5-6, 7 e 8-9 foi feita de acordo com a
Tabela 8. As amostras foram incubadas em termociclador Peltier Termo Cycler 200 (MJ
Research) sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 3 minutos, 30
ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos, anel amento dos oligonucleotídeos a
63°C por 45 segundos, com diminuição de 1°C por cic lo, e extensão a 72°C por 45
segundos. Em seguida, mais vinte ciclos de 95°C por 30 segundos, 60°C por 45
segundos e 72ºC por 45 segundos. Por último foi feita a extensão final a 72ºC por 7
minutos.
45
Tabela 7 . Características dos oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 5 ao 9 do gene TP53 (LE CALVEZ et al., 2005).
Éxon (s) Anelamento
do primer Sequência (5’→3’)
Tamanho do
amplicon
amplificado
Íntron 4 Senso : TGTTCACTTGTGCCCTGACT 5 e 6
Íntron 6 Anti-senso : TTAACCCCTCCTCCCAGAGA 467 pb
Íntron 6 Senso : CTTGCCACAGGTCTCCCCAA 7
Íntron 7 Anti-senso : AGGGGTCAGAGGCAAGCAGA 237 pb
Íntron 7 Senso : TTGGGAGTAGATGGAGCCT 8 e 9
Íntron 9 Anti-senso : AGTGTTAGACTGGAAACTTT 445 pb
Tabela 8 . Reagentes, concentrações e volumes utilizados para a amplificação, pela PCR, dos éxons 5 ao 9 do gene TP53.
Reagentes e concentrações Amplicons 5-6 e 8-9 Amplicon 7
Tampão 10x 5,0 µL 5,0 µL
dNTP 2mM 5,0 µL 5,0 µL
MgCl2 50mM 2,0 µL 1,5 µL
Oligonucleotídeo senso 10mM 2,0 µL 1,0 µL
Oligonucleotídeo anti-senso 10 mM 2,0 µL 1,0 µL
Taq DNA polimerase Platinum 5 U/µL 0,4 µL 0,4 µL
DNA 200ng 100ng
Água Milli-Q Suficiente para 50 µL Suficiente para 50 µL
Foi realizada uma eletroforese dos produtos da PCR em gel de agarose a 2%
corado com brometo de etídeo. Os fragmentos de DNA foram visualizados sob luz
ultravioleta e fotografados através do equipamento de fotodocumentação Geldoc
(BioRad, Richmond, CA, EUA). Os produtos da PCR foram armazenados a 4ºC até o
seu uso.
46
3.2.4.4. Cromatografia Líquida Desnaturante de Alt a Performance (dHPLC)
A Cromatografia Líquida Desnaturante de Alta Performance é um tipo de
cromatografia descrito por Oefner e Underhill (UNDERHILL et al., 1997) e utilizada para
o rastreamento de mutações e polimorfismos. Seu princípio é a separação de
homoduplexes (fragmentos de DNA pareados corretamente) e heteroduplexes
(fragmentos de DNA pareados incorretamente) através da desnaturação parcial dos
fragmentos de DNA. A Figura 16 exemplifica este princípio com amostras de diferentes
status mutacionais de um determinado gene.
Primeiramente, foi feita uma PCR para amplificação dos amplicons 5-6, 7, 8-9 de
TP53 com as condições descritas anteriormente. Para que houvesse a formação de
heteroduplexes em amostras mutadas em homozigose (Figura 16), todos os produtos
da PCR do DNA dos pacientes foram misturados com os produtos da PCR de uma
amostra selvagem na proporção 1:1.
A segunda etapa da dHPLC foi a desnaturação e a renaturação dos produtos de
PCR feitas no termociclador Peltier Termo Cycler 200 (MJ Research). A desnaturação
dos produtos de PCR foi feita pela incubação a 96ºC por 1 minuto e 95ºC por 1 minuto,
seguida pela renaturação feita pela diminuição de 1ºC por ciclo durante 40 ciclos.
Após a renaturação, 10 µL os amplicons foram submetidos ao sistema de
dHPLC Transgenomic WaveTM (Transgenomic). Este sistema possui uma matriz de
copolímeros de poliestireno-divinilbenzeno eletricamente neutros e hidrofóbicos (coluna
DNASep), que não é capaz de reter o DNA. Para que houvesse essa retenção, foi
necessário um fluxo de acetato de trietilamônio (TEAA). O TEAA é hidrofóbico
(interagindo com a coluna) e carregado positivamente (interagindo com o DNA), agindo,
portanto, como uma molécula mediadora da ligação entre o DNA e a matriz. Após a
ligação do DNA à matriz pelo fluxo de TEAA, foi feita a desnaturação parcial dos
amplicons através de temperaturas previamente estabelecidas para que ocorresse a
quebra diferencial da ligação entre hetero e homoduplexes e a matriz.
47
Figura 16 . Princípio da dHPLC. Primeiramente, é feita uma PCR para amplificar a sequência de interesse. Em seguida são feitas a desnaturação e renaturação dos amplicons. A próxima etapa consiste na injeção no sistema de dHPLC, no qual ocorre a desnaturação parcial dos amplicons. Na figura são vistos exemplos da análise em amostras de diferentes status mutacionais de um determinado gene: dois alelos selvagens (homozigota), dois alelos mutantes (homozigota) e uma amostra heterozigota.
Faixas de temperatura de desnaturação parcial dos amplicons 5-6, 7 e 8-9 de
TP53 foram preditas pelo programa Transgenomic Navigator (Transgenomic, Cheshire,
Reino Unido) e basearam-se nas sequências e tamanho de cada amplicon. Um mapa
de temperatura, utilizando uma amostra sabidamente selvagem (controle), foi feito a
partir desta predição. Para o amplicon 5-6 foram testadas as temperaturas de 61ºC a
65ºC, sendo escolhidas para a desnaturação parcial 62ºC e 63ºC. Para o amplicon 7,
as temperaturas entre 62ºC e 69ºC foram testadas, sendo escolhida a temperatura de
63ºC. O amplicon 8-9 de TP53 foi submetido às temperaturas de 57ºC a 66ºC, sendo
escolhida a temperatura de 59ºC para sua desnaturação parcial.
PCR para amplificar a sequência de
interesse
Desnaturação eRenaturação dosprodutos da PCR
(95ºC a 55ºC)
Desnaturação parcial(dHPLC)
Homoduplex selvagem
Homoduplex mutante
Heteroduplex / HomoduplexSelvagem Mutante
A T G C
A T
Selvagem
G C
Mutante
A T
Selvagem
G C
Mutante
A T
G C
A C G T A T G C
Ligação instável Ligação estável
Ligação estável
Ligação estável
PCR para amplificar a sequência de
interesse
Desnaturação eRenaturação dosprodutos da PCR
(95ºC a 55ºC)
Desnaturação parcial(dHPLC)
Homoduplex selvagem
Homoduplex mutante
Heteroduplex / HomoduplexSelvagem Mutante
A T G C
A T
Selvagem
A T A T
Selvagem
G C
Mutante
G CG C
Mutante
A T A T
Selvagem
G C
Mutante
G CG C
Mutante
A T
G C
A C G T A T G C
Ligação instável Ligação estável
Ligação estável
Ligação estável
A T A T
G CG C
A C G TA C G T A T A T G CG C
Ligação instável Ligação estável
Ligação estável
Ligação estável
48
Para a eluição do DNA parcialmente desnaturado da matriz, foi usado o tampão
B (TEAA, 0.1 M / acetonitrila – ACN - 25%). À medida que a acetonitrila passou pela
matriz, a interação hidrofóbica entre a matriz e o TEAA foi rompida e, assim, o DNA foi
eluído. Os heteroduplexes eluíram primeiro, pois estão ligados mais instavelmente à
matriz pelo TEAA. Durante a eluição, um detector ultravioleta mediu a absorbância de
cada amostra e o perfil de eluição de cada uma foi visualizado através do programa
Transgenomic Wavemaker 4.0 e comparado ao perfil de eluição de amostra controle
(Figura 17).
Figura 17 . Etapas da dHPLC. Após a renaturação dos amplicons, estes são injetados no sistema de dHPLC. 1) Os amplicons são ligados à uma matriz eletricamente neutra e hidrofóbica (coluna DNASep) pelo acetato de trietilamônio (TEAA), que é hidrofóbico e carregado positivamente. 2) As amostras são desnaturadas parcialmente através de temperaturas previamente estabelecidas. 3) Os amplicons são eluídos com gradientes crescentes de acetonitrila (ACN). 4) A ligação dos heteroduplexes à matriz é mais instável por serem resultado de um pareamento incorreto de bases e, por isso, eluem primeiro que os homoduplexes.
Temperatura de desnaturação parcial
TEAA + ACN
Coluna DNASep Heteroduplex Homoduplex
Tempo
Temperatura de desnaturação parcial
TEAA
1) Ligação dos amplicons àcoluna DNASep pelo fluxo de
TEAA
2) Desnaturação parcial dos amplicons
3) Eluição dos amplicons pelofluxo de ACN
4) Perfil de eluição dehetero e homoduplexes
++
Coluna DNASep
TEAA
--
Homoduplex
TEAA
Heteroduplex
Temperatura de desnaturação parcial
TEAA + ACN
Coluna DNASep
Temperatura de desnaturação parcial
TEAA + ACN
Coluna DNASep Heteroduplex Homoduplex
Tempo
Heteroduplex Homoduplex
Tempo
Temperatura de desnaturação parcial
TEAA
1) Ligação dos amplicons àcoluna DNASep pelo fluxo de
TEAA
2) Desnaturação parcial dos amplicons
3) Eluição dos amplicons pelofluxo de ACN
4) Perfil de eluição dehetero e homoduplexes
++++
Coluna DNASep
TEAA
----
Homoduplex
TEAA
Heteroduplex
49
3.2.4.5. Sequenciamento automático
As amostras que se mostraram alteradas pelas duas técnicas de rastreamento
de alterações no gene TP53 foram submetidas ao sequenciamento automático.
Para eliminar qualquer reagente que pudesse inibir a reação de sequenciamento,
todos os produtos de PCR foram purificados pelo kit illustra GFX™ PCR DNA and Gel
Band Purification (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. As
colunas e os tampões utilizados foram providos pelo kit. Aos produtos da PCR foram
adicionados 600 µL do tampão de captura. Esta mistura foi colocada em colunas
contendo uma matriz de fibra de vidro capaz de reter o DNA. Após centrifugação por a
13000 rpm por 30 segundos em temperatura ambiente, o eluído foi descartado e 500
µL de tampão de lavagem foram adicionados. Nova centrifugação a 13000 rpm por 30
segundos foi feita em temperatura ambiente e em seguida as colunas foram
transferidas para novos microtubos de 1,5 mL de volume. No centro da coluna foram
aplicados de 15-25 µL de tampão de eluição. Após 1 minuto de incubação em
temperatura ambiente, os microtubos foram centrifugados por 1 minuto a 13000 rpm
em temperatura ambiente. A coluna foi descartada e a eluição contendo o DNA foi
armazenada a 4ºC até o seu uso.
Os produtos de PCR purificados foram submetidos à reação de sequenciamento
utilizando o kit Big-Dye Terminator (Applied Biosystems). Os produtos foram
sequenciados nas direções senso e anti-senso (OTTO et al., 2008).
O preparo das amostras a serem sequenciadas consistiu em uma primeira
reação de amplificação na qual dNTPs marcados com corantes fluorescentes foram
incorporados às fitas de DNA. Em cada poço de uma placa com 96 poços foram
adicionados de 4 a 6,5 µL do produto da PCR purificado, 1 µL de oligonucleotídeo
(senso ou antisenso) 5 mM, 1 µL da mistura BigDye (que contém os dNTPs marcados
com corantes fluorescentes), 1,5 µL de tampão de sequenciamento 5X e o volume da
reação foi ajustado para 10 µL com água tratada com DEPC (Sigma) quando
necessário. A placa foi levada ao termociclador Applied Biosystems e submetida a 40
ciclos de 94°C durante 10 segundos, 50° por 5 segun dos e 60° por 4 minutos.
Para a precipitação do DNA, foram adicionados 30 µL de isopropanol a 75% a
cada poço da placa. Em seguida, a placa contendo as amostras foi agitada
manualmente por 10 segundos e incubada por 15 minutos a temperatura ambiente e ao
50
abrigo de luz. Após a centrifugação por 45 minutos a 4000 rpm, o sobrenadante foi
descartado e a cada amostra foram adicionados 50 µL de etanol a 75%. Houve nova
centrifugação por 15 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi removido e a placa foi
aquecida a 60°C por 10 minutos, permanecendo ao abr igo da luz. A desnaturação das
amostras, para a leitura pelo sequenciador, foi feita pela adição de 10 µL de formamida
em cada poço e a placa foi centrifugada e aquecida a 95°C durante 3 minutos. Em
seguida, foi incubada a 4ºC por 5 a 10 minutos. O sequenciamento automático foi
realizado pelo sequenciador 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) do Laboratório
de Genômica Funcional e Bioinformática da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ, Rio
de Janeiro, Brasil).
3.2.4.6. Análise de alterações no gene TP53
As análises de mutações foram feitas através da utilização do programa
Sequencher™ versão 4.1.1 (Gene Codes Corporation, http://www.genecodes.com/). A
sequência selvagem usada como referência de TP53 foi obtida a partir do genoma
humano presente no banco de dados do NCBI (NC_000017.9). A descrição das
mutações foi feita de acordo com a numeração de bases da p53 (TP53-201 – ENST
00000269305) obtida no banco de dados Ensembl Genome Browser
(http://www.ensembl.org).
3.2.5. Análises estatísticas
As análises estatísticas foram feitas através do programa SPSS versão 13.0
(SPSS Inc., Chicago, EUA) com auxílio de Isabele Ávila Small do Setor de Análise de
Informação em Pesquisa do INCA. Foi considerado significativo o valor de P menor que
0,05.
Para verificar a significância da associação entre os dados clínico-patológicos
dos pacientes e o status mutacional de TP53 e da associação entre os dados clínico-
patológicos e a expressão gênica de GBP2 foi feito o teste exato de Fisher ou o teste
de χ2 de Pearson. O teste exato de Fisher foi utilizado quando 2 ou mais caselas da
tabela 2x2 possuíam menos do que 5 casos. A relação entre a expressão de GBP2 e o
status mutacional de TP53 foi avaliada pelo teste de Mann-Whitney.
51
4. RESULTADOS
52
4.1. Estudo pré-clínico
4.1.1. Identificação de um sítio putativo de ligaçã o da proteína p53 à
região promotora do gene GBP2 pela bioinformática .
Para entender melhor a indução de GBP2 dependente de p53, observada
anteriormente na linhagem TE-1 cultivada a 32ºC (GUIMARÃES et al., 2009), a
primeira etapa desse estudo foi verificar se existe ligação direta de p53 à região
promotora de GBP2.
Através de uma análise por bioinformática foi identificada por Olszewski e
colaboradores uma sequência de ligação de p53 à região promotora de GBP2
(OLSZEWSKI et al., 2006). Entretanto, este dado não foi validado experimentalmente.
Um dos objetivos deste trabalho foi, portanto, confirmar a existência de um sítio
putativo de ligação da proteína p53 à região promotora do gene GBP2 através da
bioinformática e, em seguida, validá-lo experimentalmente através do ensaio de
imunoprecipitação de cromatina.
Primeiramente, foi utilizado o aplicativo Gene2Promoter para investigar a região
promotora de GBP2. Através deste aplicativo foi identificado, no promotor de GBP2, um
sítio de ligação da p53 composto por 23 bases com a seguinte sequência:
TTTATTTTTTAGAGACAAGTTCT. As bases sublinhadas na sequência são aquelas
que possuem 100% de identidade com os elementos responsivos de p53 (p53
response-elements) descritos no banco de dados de mutação de TP53 da IARC (IARC
TP53 Mutation Database, R13, November 2008): RRRCWWGYYY(N)RRRCWWGYYY,
sendo R = A ou G; W = A ou T; Y = C ou T; N = 0 a 13 nucleotídeos (PETITJEAN et al.,
2007) (Figura 18).
Em seguida, para localizar no genoma humano a sequência obtida através do
Gene2Promoter, foi utilizado um segundo aplicativo de bioinformática, o BLAT, do sítio
de internet da UCSC. A busca pela sequência predita resultou nas coordenadas entre
as bases 89.364.870 a 89.364.892 do cromossomo 1 (Figura 19A), localizada a 482
nucleotídeos do início da sequência do mRNA de GBP2 (NM_004120) (Figura 19B).
53
Figura 18 . Resultado da busca por sítios de ligação da proteína p53 à região promotora de GBP2 utilizando o aplicativo Gene2Promoter. A linha tracejada representa o promotor de GBP2 depositado na construção número 36 (Novembro de 2005) do genoma humano disponível no sítio do National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606). A seqüência de p53 (V$P53F - destacada pelo retângulo preto e detalhada no promotor de GBP-2) aparece dentre todas as sequências de fatores de transcrição analisadas por esse aplicativo. Na sequência predita, estão sublinhadas as bases que possuem 100% de identidade com a sequência consenso descrita no banco de dados de mutação de TP53 do IARC (IARC TP53 Mutation Database, R13, November 2008) (PETITJEAN et al., 2007). Os números ao lado da sequência de ligação de p53 detalhada no promotor de GBP2 indicam a posição de início (-504) e término (-482) da mesma, tendo como referência o início de transcrição (posição 3132).
54
Figura 19 . Resultado da busca, utilizando o aplicativo BLAT, pela localização no genoma humano do elemento responsivo de p53 predito pelo aplicativo Gene2Promoter. A) O elemento responsivo de p53 (TTTATTTTTTAGAGACAAGTTCT) na região promotora de GBP2 está localizado entre as bases de número 89.364.870 e 89.364.892 do cromossomo 1. B) O elemento responsivo de p53 está localizado a 482 bases do início (chr1:89364387) da sequência do mRNA de GBP2 (NM_004120).
B)
A)
55
4.1.2. GBP2 como alvo direto da proteína p53
A próxima etapa desse estudo foi a validação experimental, pelo ensaio de
ChIP, do elemento responsivo de p53 encontrado na região promotora de GBP2 por
bioinformática. Este ensaio foi realizado a partir da cromatina das células TE-1
cultivadas a 32ºC e a 37ºC por 24 horas imunoprecipitada com anticorpo específico
para p53. Após 24 horas, é visto um aumento relativo de 2,19 vezes na expressão
gênica de GBP2 nas células cultivadas a 32ºC em relação às células cultivadas a
37ºC (Figura 20).
O DNA das células TE-1 imunoprecipitado com anticorpo anti-p53 foi utilizado
na PCR para a amplificação da região promotora de GBP2 contendo o elemento
responsivo de p53. Para a condição de cultivo das células a 32ºC, a eletroforese dos
produtos da PCR revelou um fragmento de 304 pb na amostra input e na amostra do
DNA imunoprecipitado com anticorpo anti-p53. Como esperado, este fragmento não
foi amplificado na amostra imunoprecipitada com IgG de coelho (controle negativo).
Nas células TE-1 cultivadas a 37ºC, o fragmento de 304 pb só foi visto na amostra
input (Figura 21A). Este resultado foi confirmado por mais 2 experimentos
independentes (dados não mostrados).
O gene p21WAF/CIP1 foi utilizado como controle positivo do ensaio. Como
esperado, um fragmento de 254 pb da região promotora deste gene foi amplificado
nas amostras input e na amostra contendo o DNA imunoprecipitado com anticorpo
anti-p53 nas células TE-1 cultivadas a 32ºC. Nas células TE-1 cultivadas a 37ºC, este
fragmento somente foi visto na amostra input (Figura 21B).
Esses resultados sugerem que o gene GBP2 possui um elemento responsivo
de p53 funcional e que a proteína p53 é capaz de se ligar diretamente à região
promotora de GBP2 nas células TE-1 após sua reativação a 32ºC, mas não é capaz
de se ligar quando as células TE-1 são cultivadas a 37ºC, quando p53 encontra-se na
conformação mutada e não é capaz de se ligar ao DNA.
56
Figura 20 . Gráfico representativo da qPCR feita para quantificar a relação entre a expressão gênica de GBP2 na linhagem celular TE-1 quando cultivada a 32ºC e a 37ºC. O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno e normalizador da quantificação.
Figura 21. Ensaio de imunoprecipitação de cromatina. Foto representativa da eletroforese da PCR utilizando o DNA imunoprecipitado com anticorpo anti-p53 (CM-1). A) Produto de PCR com tamanho esperado utiizando par de oligonucleotídeos espcíficos para a amplificação da região promotora de GBP2 contendo o elemento responsivo de p53 predito por bioinformática (304 pb). B) Produto de PCR com tamanho esperado utiizando par de oligonucleotídeos espcíficos para a amplificação da região promotora de p21WAF/CIP1 contendo o elemento responsivo de p53 (254 pb), utilizado como controle positivo do ChIP.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
37ºC / 24h 32ºC / 24h
Temperatura e tempo de cultivo da linhagem TE-1
Qua
ntifi
caçã
o re
lativ
a d
e G
BP
2 (
unid
ades
arb
itrá
rias)
Inp
ut
p53
CTL
Inp
ut
p53
CTL
37ºC 32ºC
GBP-2 prom
P21WAF1 prom
37ºC 32ºC
Promotor de GBP-2
Promotor de P21WAF/CIP1
TE-1 - TP53 Val272Met
304 pb
254 pb
Con
trole
ne
gativ
o
P53In
put
Inpu
t
P53 Con
trole
ne
gativ
oA)
B)
Inp
ut
p53
CTL
Inp
ut
p53
CTL
37ºC 32ºC
GBP-2 prom
P21WAF1 prom
37ºC 32ºC
Promotor de GBP-2
Promotor de P21WAF/CIP1
TE-1 - TP53 Val272Met
304 pb
254 pb
Con
trole
ne
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o
P53In
put
Inpu
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P53 Con
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o
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p53
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Inp
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p53
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37ºC 32ºC
GBP-2 prom
P21WAF1 prom
Inp
ut
p53
CTL
Inp
ut
p53
CTL
37ºC 32ºC
GBP-2 prom
P21WAF1 prom
37ºC 32ºC
Promotor de GBP-2
Promotor de P21WAF/CIP1
TE-1 - TP53 Val272Met
304 pb
254 pb
Con
trole
ne
gativ
o
P53In
put
Inpu
t
P53 Con
trole
ne
gativ
oA)
B)
57
4.2. Estudo clínico
Uma vez confirmada a ligação da proteína p53 à região promotora de GBP2 na
linhagem celular de carcinoma de células escamosas do esôfago TE-1 cultivada a
32ºC, quando existe um aumento na expressão gênica de GBP2 dependente de p53,
a próxima etapa deste projeto foi investigar a associação entre o status mutacional de
TP53 e a expressão de GBP2 em amostras de esôfago de pacientes com CCEE.
4.2.1. Dados clínicos, demográficos, epidemiológico s dos pacientes com
CCEE
Ao todo, foram incluídos 43 pacientes com CCEE neste estudo. Os dados
demográficos, epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos são mostrados na
Tabela 9. Alguns dados não foram acessíveis para todos os pacientes, explicando,
assim, as diferenças de tamanho da amostra descrita na Tabela.
Oitenta e um por cento (35/43) dos pacientes eram do sexo masculino e 18,6%
(8/43) do sexo feminino. A idade destes pacientes, no momento do diagnóstico,
variou entre 41 e 74 anos, sendo a mediana de 56 anos.
O histórico familiar de câncer foi relatado por 16 (38,0%) pacientes. Apenas um
paciente (nº 17) tinha histórico de câncer de esôfago na família, com mãe e tio
acometidos pela doença. Este paciente, do sexo masculino, foi diagnosticado aos 55
anos com o câncer de esôfago. O tumor foi classificado como moderadamente
diferenciado (G2) e o paciente agrupado no estádio IIA da classificação TNM. Ele
relatou o consumo de 1 maço de cigarros por dia durante 40 anos (40 maços-ano) e
250 mL de bebida destilada por dia durante 30 anos, sendo, no momento do
diagnóstico, fumante e ex-etilista. Este paciente foi tratado por radio- e braquiterapia,
tendo recorrência loco-regional 8 meses após o diagnóstico e óbito 9,5 meses depois
do diagnóstico da doença. Nos demais casos com histórico familiar foram relatados
os seguintes tipos de câncer: próstata, útero, mama, pulmão, estômago, fígado,
vesícula biliar, bexiga, cabeça e pescoço, orofaringe, ossos e leucemia.
58
Tabela 9. Dados demográficos, epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos dos pacientes com CCEE incluídos neste estudo.
Características N (%) Sexo (N=43) Masculino 35 (81,4) Feminino 8 (18,6) Idade mediana em anos (min-máx) (N=43) 56 (41-74) Histórico familiar de câncer (N=42) Não 26 (62,0) Sim 16 (38,0) Câncer de esôfago 1 (2,3) Outros tipos de câncer 15 (35,7) Histórico de tabagismo (N=42) Tabagista 24 (57,2) Ex-tabagista 16 (38,1) Não-tabagista 2 (4,7) Histórico de etilismo (N=42) Etilista 20 (47,6) Ex-etilista 19 (45,2) Não etilista 3 (7,1) Grau de diferenciação do tumor (N=41) Bem diferenciado (G1) 1 (2,4) Moderadamente diferenciado (G2) 31 (75,6) Pouco diferenciado (G3) 9 (22,0) Estadiamento clínico (N=38) I 2 (5,3) IIA 14 (36,9) IIB 1 (2,6) III 10 (26,3) IVA 1 (2,6) IVB 10 (26,3) Invasão do tumor no diagnóstico (N=35) Lâmina própria ou submucosa (T1) 2 (5,7) Muscular própria (T2) 1 (2,9) Adventícia (T3) 25 (71,4) Estruturas adjacentes (T4) 7 (20,0) Linfonodos comprometidos no diagnóstico (N=36) Não 25 (69,4) Sim 11 (30,6) Metástase no diagnóstico (N=38) Não 27 (71,1) Sim 11 (28,9) Regional 1 (2,6) À distância 10 (26,3) Tratamento (N=42) Cirurgia 4 (9,5) Quimioterapia (QT) 2 (4,8) Radioterapia (RT) 9 (21,4) Radio- e braquiterapia 3 (7,1) Quimiorradioterapia 13 (31,0) Quimiorradio- e braquiterapia 1 (2,4) Tratamento paliativo (QT ou RT) 2 (4,8) Cuidados paliativos 8 (19,0) Seguimento mediano em meses (mínimo-máximo) 8 (0-34)
59
O histórico de tabagismo foi relatado por 40 (95,3%) de 42 pacientes, sendo 24
(57,2%) tabagistas e 16 (38,1%) ex-tabagistas no momento do diagnóstico. A
mediana da carga tabágica foi de 41 maços-ano. Os relatos de não-tabagismo foram
de 2 pacientes (nº 22 e 25) do sexo feminino, que não relataram histórico de etilismo
e nem histórico familiar de câncer.
O consumo de bebidas alcoólicas, na sua maior parte de destilados, foi
relatado por 39 (92,8%) de 42 pacientes, sendo 20 (47,6%) etilistas e 19 (45,2%) ex-
etilistas no momento do diagnóstico. Os relatos de não-etilismo foram de 3 pacientes
(nº 10, 22 e 25). Dois dos 3 pacientes (nº 22 e 25) foram apresentadas no parágrafo
anterior. O terceiro paciente (nº 10) era do sexo feminino, não possuía histórico
familiar de câncer, mas possuía histórico de tabagismo de 24,4 maços-ano.
O grau de diferenciação do tumor foi avaliado em 41 casos, resultando em 1
(2,4%) tumor bem diferenciado, 31 (75,6%) tumores moderadamente diferenciados e
9 (22,0%) pouco diferenciados. Em dois casos, não foi possível a avaliação do grau
de diferenciação pelo patologista.
O estadiamento clínico, feito no momento do diagnóstico, foi possível em 38
pacientes. Destes, 2 (5,3%) pacientes foram agrupados no estádio I, 14 (36,9%)
pacientes agrupados no estádio IIA, 1 (2,6%) paciente no estádio IIB, 10 (26,3%) no
estádio III, 1 (2,6%) paciente no estádio IVA e 10 (26,3%) pacientes agrupados no
estádio IVB. Portanto, dos 38 pacientes estadiados clinicamente, 16 (42,2%)
apresentaram tumor localmente avançado (estádios I e IIA) e 22 (57,8%) pacientes
apresentaram tumor avançado (≥ estádio IIB).
Dentre 42 pacientes, 32 foram tratados com intenção curativa. Dentre estes, 4
(9,5%) foram tratados por cirurgia exclusiva, 2 (4,8%) por quimioterapia exclusiva, 9
(21,4%) foram tratados por radioterapia exclusiva, 3 (7,1%) por radioterapia e
braquiterapia, 13 (31,0%) por quimiorradioterapia e 1 (2,4%) por quimiorradio- e
braquiterapia. Dois pacientes (4,8%) receberam apenas radioterapia como tratamento
paliativo enquanto 8 (19,0%) não receberam nenhuma modalidade de tratamento,
apenas cuidados paliativos, devido ao estágio avançado da doença no momento do
diagnóstico.
O seguimento mediano de 40 pacientes foi de 8 meses, variando entre 0 e 34
meses. Houve perda do seguimento de 3 pacientes. Vinte e seis (65,0%) dos 40
pacientes faleceram até o último seguimento feito, em Setembro de 2008. A
recorrência, loco-regional ou à distância, foi relatada em 15 (51,7%) de 29 pacientes
60
avaliados quanto à recorrência. O tempo mediano de recorrência foi de 7,25 meses e
os locais de metástase foram: pulmão, mediastino, fígado, traquéia, sistema nervoso
central, massa retrocardíaca, linfonodos cervical e perigástricos, tronco celíaco.
4.2.2. Expressão de GBP2 no CCEE relativa ao tecido não-tumoral
adjacente
O primeiro passo das análises moleculares da fase clínica deste estudo foi
quantificar a expressão de GBP2 nas amostras de cDNA do tecido tumoral de CCEE
(T) e do respectivo tecido não-tumoral adjacente ao tumor (N) e calcular a razão (T/N)
entre os dois valores obtidos. Para valores da razão T/N maiores que 1, foi
considerado um aumento da expressão de GBP2 no tumor quando comparado ao
tecido não-tumoral adjacente.
Primeiramente, foi feita a qPCR das amostras T e N de todos os pacientes. Em
seguida, os resultados foram individualmente analisados quanto à eficiência da
amplificação de GBP2. Nem todas as amostras tiveram eficiência de amplificação
satisfatória, com valores de Ct fora dos limites aceitáveis, sendo possível a análise da
expressão gênica de GBP2 em apenas 26 pacientes dos 43 pacientes incluídos no
estudo.
Em 18 (69,3%) dos 26 casos analisados, foi visto um aumento da expressão de
GBP2 no tecido tumoral quando este foi comparado ao tecido não–tumoral adjacente
(Figura 22). A mediana dos valores T/N foi de 1,80. Em uma das pacientes (nº 04) foi
observada uma razão T/N de expressão de GBP2 de 160 vezes. Esta paciente foi
diagnosticada aos 56 anos com o câncer de esôfago. O tumor foi classificado como
moderadamente diferenciado (G2) e a paciente agrupada no estádio IIA da
classificação TNM. Ela relatou o consumo de 1 maço de cigarros por dia durante 23
anos (23 maços-ano) e 600 mL de bebida destilada por dia durante 17 anos, sendo,
no momento do diagnóstico, ex-fumante e ex-etilista. Esta paciente foi tratada por
quimiorradioterapia e até Setembro de 2008 (seguimento de 38 meses), data do
último seguimento feito, encontrava-se viva e sem doença.
61
Figura 22 . Análise de expressão relativa T/N de GBP2 por qPCR. Vinte e seis pacientes tiveram suas amostras de cDNA amplificadas por qPCR para a quantificação da expressão de GBP2 no tecido tumoral (T) e no tecido não-tumoral adjacente ao tumor (N). Para valores da razão T/N maiores que 1, foi considerado um aumento da expressão de GBP2 no tumor quando comparado ao tecido não-tumoral adjacente.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
36 28 37 18 42 26 43 38 24 31 33 08 41 29 03 22 12 32 30 25 34 35 27 23 39 04
Nº do paciente
Qua
ntifi
caçã
o re
lativ
a T
/N d
e G
BP
2 (u
nida
des
arbi
trária
s)
Tecido não-tumoral adjacente ao tumor Tecido tumoral
160
0
1
2
3
4
5
6
7
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36 28 37 18 42 26 43 38 24 31 33 08 41 29 03 22 12 32 30 25 34 35 27 23 39 04
Nº do paciente
Qua
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o re
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a T
/N d
e G
BP
2 (u
nida
des
arbi
trária
s)
Tecido não-tumoral adjacente ao tumor Tecido tumoral
160
62
Embora a expressão de GBP2 tenha sido observada tanto nas amostras
tumorais quanto nas não-tumorais adjacentes ao tumor, o aumento desta expressão,
considerando um valor acima de 1, observado no tumor quando comparado ao tecido
não-tumoral adjacente em quase 70% dos casos analisados, sugere que o gene
GBP2 possa estar envolvido no processo de carcinogênese esofagiana e corrobora os
dados de análise da sua proteína vistos por nosso grupo previamente (GUIMARÃES
et al., 2009).
4.2.3. Alterações genéticas em TP53 no CCEE
O próximo passo no estudo, foi avaliar o status mutacional do gene TP53.
Dentre os 43 pacientes incluídos no estudo, a análise de alterações genéticas em
TP53 foi possível em 41 casos.
Primeiramente foi feito o rastreamento de alterações neste gene através da
técnica de dHPLC. A técnica de SSCP também foi realizada nas mesmas amostras,
mas os resultados obtidos através da utilização desta técnica não serão
detalhadamente discutidos neste trabalho. A Tabela 10 mostra os resultados obtidos
através da utilização da dHPLC e a Figura 23 ilustra os perfis de eluição de duas
amostras tumorais com alteração em TP53 e o perfil de eluição da amostra utilizada
como controle selvagem para TP53.
A análise do amplicon 5-6 de TP53 (que contém parte do íntron 4, todo o éxon
5, íntron 5, éxon 6 e parte do íntron 6) foi feita em duas temperaturas de desnaturação
parcial na dHPLC, 62ºC e 63ºC, sendo encontradas alterações em 13 pacientes. Pelo
rastreamento no amplicon 7 foram observadas alterações em 8 pacientes, enquanto
que no amplicon 8-9 (que contém parte do íntron 7, todo o éxon 8, íntron 8, éxon 9 e
parte do íntron 9) foram vistas alterações em 5 pacientes. Ao todo, foram vistas, por
dHPLC, 20 amostras com alterações em TP53 dentre as 31 amostras de DNA tumoral
de pacientes com CCEE analisadas. Destas, quatro amostras apresentaram
alterações em 2 amplicons distintos e 1 amostra apresentou alteração nos 3
amplicons analisados.
63
Tabela 10 . Resultados obtidos a partir do rastreamento por mutações nos éxons 5 ao 9 do gene
TP53 utilizando a técnica de dHPLC e resultados do sequenciamento.
Alt. = amostra com perfil de eluição alterado em relação ao controle sabidamente selvagem. N. Alt. = amostra com perfil de eluição igual ao controle sabidamente selvagem para TP53. NR = rastreamento não realizado.
Éxon 7 Éxons 8-9 Resumo Sequenciamento62ºC 63ºC 63ºC 59ºC (Éxons 5-9) (Éxons 5-9)
01 Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 6)02 Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Mutado (íntron 5)03 N.Alt. N.Alt. Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 7)04 N.Alt. N.Alt. Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 7)06 Alt. Alt. N.Alt. Alt. Alt. Mutado (éxon 5)07 N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Alt. N.Alt.08 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.09 Alt. Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. N.Alt.10 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.11 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.12 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.13 Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Mutado (íntron 6)14 N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Alt. N.Alt.15 Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 6)17 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. Mutado (éxon 5)18 Alt. N.Alt. Alt. Alt. Alt. Mutado (éxons 7 e 9)19 Alt. N.Alt. N.Alt. NR Alt. Mutado (éxon 5)20 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.21 Alt. Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 6)22 N.Alt. N.Alt. Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 7)23 Alt. N.Alt. Alt. N.Alt. Alt. Polimorfismo (íntron 6)24 NR NR NR NR NR Mutado (éxon 8)25 N.Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Alt. Polimorfismo (íntron 9)26 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.27 Alt. N.Alt. Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 7)28 Alt. Alt. N.Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 6)29 N.Alt. N.Alt. Alt. N.Alt. Alt. N.Alt.30 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.31 N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt. N.Alt.32 N.Alt. N.Alt. NR NR N.Alt. N.Alt.33 N.Alt. Alt. Alt. N.Alt. Alt. Mutado (éxon 7)
Nº do pacienteÉxons 5 e 6
Amplicon TP53 - DNA tumoral
64
Figura 23 . Exemplos de perfis de eluição de duas amostras tumorais com alteração em TP53 e o perfil de eluição da amostra utilizada como controle selvagem para TP53 obtidos pela técnica de dHPLC.
Todas as amostras que se encontraram alteradas segundo as análises por
dHPLC e SSCP foram submetidas ao sequenciamento automático. Dentre os 20
pacientes cujas amostras se mostraram alteradas pela dHPLC, em 16 (80%) a
alteração (mutação ou polimorfismo) foi confirmada pelo sequenciamento. Em um
caso (paciente 17), a dHPLC não detectou a alteração vista pela SSCP e pelo
sequenciamento e 9 alterações detectadas pela dHPLC não foram confirmadas pelo
sequenciamento (Tabela 10). As amostras 34 a 45 não foram submetidas à dHPLC e
foram sequenciadas diretamente.
No total, pelo sequenciamento, a mutação em TP53 foi detectada em 23 de 41
(56,1%) pacientes incluídos no estudo. A Figura 24 mostra exemplos de
cromatogramas resultantes do sequenciamento do DNA tumoral em dois pacientes
com TP53 mutado. Em dois pacientes, a amostra de DNA tumoral apresentou duas
mutações distintas cada, totalizando 25 mutações identificadas no grupo analisado
(Tabela 11). As amostras não-tumorais adjacentes ao tumor onde foi detectada
mutação também foram analisadas e não foi detectada qualquer mutação.
Dentre as 25 mutações detectadas, foram identificadas sete mutações (28%)
no éxon 5, cinco (20%) no éxon 6, sete (28%) no éxon 7, uma (4%) no éxon 8 e uma
(4%) no éxon 9. Além disto, foram identificadas quatro mutações intrônicas, duas (8%)
no íntron 5, uma (4%) no íntron 6 e uma (4%) no íntron 8 (Figura 25A). Dentre estas
25 mutações, foram identificadas 13 (52%) mutações com troca de aminoácidos
(missense), 5 (20%) mutações que introduziram o códon de parada (nonsense), 3
(12%) em regiões de splicing, 3 (12%) deleções e 1 (4%) duplicação (Figura 25B).
Tempo de retenção (min)
4 53
Tecido tumoral (02T)
Amostra selvagem
Inte
nsid
ade
(mV
)
7
6
5
4
3
2
1
Tempo de retenção (min)
4 53
Tecido tumoral (18T)
Amostra selvagem
Inte
nsid
ade
(mV
)
6
5
4
3
2
1
Tempo de retenção (min)
4 53
Tecido tumoral (02T)
Amostra selvagem
Inte
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Tempo de retenção (min)
4 53
Tecido tumoral (02T)
Amostra selvagem
Tecido tumoral (02T)
Amostra selvagem
Inte
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1
7
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Tempo de retenção (min)
4 53
Tecido tumoral (18T)
Amostra selvagem
Inte
nsid
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(mV
)
6
5
4
3
2
1
Tempo de retenção (min)
4 53
Tecido tumoral (18T)
Amostra selvagem
Tecido tumoral (18T)
Amostra selvagem
Inte
nsid
ade
(mV
)
6
5
4
3
2
1
65
Quatro mutações foram encontradas em hotspots de TP53, sendo uma no códon 245,
duas mutações no códon 248 e uma no códon 273. O tipo de mutação predominante
foi a troca de G:C>A:T, com 38,10% (8/21) dos casos, seguida pelas trocas A:T>G:C,
A:T>T:A, G:C>A:T em CpG e G:C>T:A, com 14,29% (3/21) dos casos cada. A troca
A:T>C:G foi vista em menor proporção, em 4,76% (1/21) dos casos (Figura 25C).
Figura 24 . Exemplos de cromatogramas resultantes do sequenciamento do DNA tumoral de dois pacientes com alteração em TP53 rastreada pela dHPLC e confirmada pelo sequenciamento. À esquerda, a sequência do DNA tumoral do paciente 02, contendo uma substituição de G para A no íntron 5. À direita, a sequência do DNA tumoral do paciente 18, contendo uma substituição de A para T no éxon 7. Em ambos os casos, a base mutada é destacada e é mostrada também a sequência selvagem de TP53.
Além destas mutações, foram identificados 3 polimorfismos do gene TP53 em 3
pacientes com CCEE. Dois destes polimorfismos foram intrônicos, enquanto um deles
foi encontrado no éxon 6 e sem troca de aminoácido. A Tabela 12 descreve os
polimorfismos encontrados.
66
Figura 25 . Resultados em porcentagem do sequenciamento automático dos éxons 5 ao 9 do gene TP53. A) Localização das mutações. B) Efeitos das mutações. C) Tipos de mutações. encontradas.
Missense - 52%
Nonsense - 20%
Regiões de splicing - 12%
Duplicação - 4%
Deleção -12%
A:T>G:C; 14,29%
A:T>T:A; 14,29%
G:C>A:T; 38,10%
G:C>A:T em CpG; 14,29%
G:C>T:A; 14,29%
A:T>C:G; 4,76%
Íntron 8; 4%Éxon 8; 4%
Éxon 7; 28%
Íntron 6; 4%Éxon 6; 20%
Íntron 5; 8%
Éxon 5; 28%
Éxon 9; 4%A)
C)
B)
67
Tabela 11 . Mutações no gene TP53 identificadas nos pacientes com CCEE analisados neste estudo.
Nº do Éxon Posição da mudança Mudança de paciente (Íntron) no mRNA aminoácido
1 6 g.13419 c.659 A>G; TAT>TGT Tyr-Cys p.Y220C Troca de aminoácido2 (5) g.13319 c.560-1 G>A NA NA Splicing3 7 g.14014 c.687 T>A; TGT>TGA Cys-Stop p.C229X Códon de parada4 7 g.14079_14093 c.752_766 dupTCCTCACCATCATCA (15pb) NA 15-pbdup Duplicação6 5 g.13077 c.398 T>A: ATG>AAG Met-Lys p.M133K Troca de aminoácido13 (6) g.13433 c.672+1 G>T NA NA Splicing15 6 g.13338 c.578 A>G; CAT>CGT His-Arg p.H193R Troca de aminoácido17 5 g.13193 c.514 G>T; GTT>TTT Val-Phe p.V172F Troca de aminoácido18 7 g.14090 c.763 A>T; ATC>TTC Ile-Phe p.I255F Troca de aminoácido
9 g.14752 c.991 C>T; CAG>TAG Gln-Stop p.Q331X Códon de parada19 5 g.13178 c.499 C>T;CAG>TAG Gln-Stop p.Q167X Códon de parada21 6 g.13341 c.581 C>T; CTT>CCT Leu-Pro p.L194P Troca de aminoácido22 7 g.14060 c.733 G>A; GGC>AGC Gly-Ser p.G245S Troca de aminoácido24 8 g.14486 c.817 C>T em CpG; CGT>TGT Arg-Cys p.R273C Troca de aminoácido27 7 g.14070 c.743 G>A em CpG; CGG>CAG Arg-Gln p.R248Q Troca de aminoácido28 6 g.13334 c.574 C>T; CAG>TAG Gln-Stop p.Q192X Códon de parada33 7 g.14093 c.766 A>C; ACA>CCA Thr-Pro p.T256P Troca de aminoácido35 6 g.13419 c.659 A>G;TAT>TGT Tyr-Cys p.Y220C Troca de aminoácido36 (8) g.14597_14621 c.919+9_33 delGCAGGACAAGAAGCGGTGGAGGAGA (25pb) NA 25-pbdel Deleção37 5 g.13200_13217 c.521_538 delGGCGCTGCCCCCACCATG (18pb) NA 18-pbdel Deleção38 5 g.13206 c.527 G>T; TGC>TTC Cys-Phe p.C176F Troca de aminoácido40 5 g.13164_13173 c.485_494 delTCTACAAGCA (10pb) NA 10-pbdel Deleção41 5 g.13172 c.493 C>T: CAG>TAG Gln-Stop p.Q165X Códon de parada
(5) g.13239 c.559+1 G>A NA NA Splicing43 7 g.14070 c.743 G>A em CpG; CGG>CAG Arg-Gln p.R248Q Troca de aminoácido
EfeitoNomeMudança de nucleotídeo e códonPosição genômica
68
Tabela 12 . Polimorfismos no gene TP53 identificados nos pacientes com CCEE analisados neste estudo.
Nº do paciente Éxon (Íntron) Posição genômica Posição da mudança no
mRNA Mudança de nucleotídeo e códon Mudança de aminoácido
Mudança na proteína Efeito
23 (6) g.13964 c.673-36 G>C em CpG NA NA Intrônico 25 (9) g.14766 c.993+12 T>C NA NA Intrônico 35 6 g.13399 c.639 A>G, CGA>CGG Arg-Arg p.R213R Silencioso
69
4.2.4. Associação entre dados clínico-patológicos e moleculares
Uma vez analisados o perfil de mutação em TP53 e a expressão de GBP2
nos pacientes com CCEE incluídos neste estudo, a última etapa deste trabalho foi
investigar a associação entre essas variáveis moleculares entre si e a associação de
cada uma delas com os dados clínico-patológicos.
Nas análises de associação entre os dados moleculares e clínico-patológicos
foram incluídas as seguintes váriáveis clinicopatológicas: grau de diferenciação do
tumor, estadiamento clínico, invasão do tumor, linfonodos comprometidos e
ocorrência de metástase no momento do diagnóstico. Na variável de estadimanento
clinico o grupo de pacientes foi estratificado em dois grupos de acordo com o
prognóstico: localmente avançado (estádios I e IIA) e avançado (≥ estádio IIB).
Na análise de associação entre os dados clínico-patológicos e o aumento ou
diminuição da expressão de GBP2 no tecido tumoral em relação ao tecido não-
tumoral adjacente (relação T/N) não houve significância estatística entre nenhuma das
variáveis analisadas (Tabela 13).Também não foi vista significância estatística entre
os dados clínico-patológicos e o status mutacional do gene TP53 no tecido tumoral
(mutado ou não) (Tabela 14).
A Tabela 15 mostra os dados de associação entre a expressão de GBP2 e o
status mutacional de TP53. Em 26 pacientes foi possível a análise da expressão de
GBP2 e da mutação em TP53. Dentre os 18 pacientes que tiveram o aumento de
GBP2 no tecido tumoral em comparação ao tecido não-tumoral adjacente, 10 (55,6%)
apresentaram gene TP53 selvagem no tumor, enquanto 8 (44,4%) apresentaram
TP53 mutado. Entre os 8 pacientes onde não houve aumento da expressão de GBP2
no tumor quando comparada ao tecido não-tumoral adjacente, a maioria, 6/8 (42,9%),
apresentou mutação no gene TP53 no tecido tumoral. Apesar desta aparente
diferença, não foi vista qualquer significância estatística (P = 0,155) entre a relação
T/N da expressão de GBP2 e o status mutacional de TP53.
A associação entre a expressão de GBP2 e o status mutacional de TP53
também foi analisada pelos dados de mediana da relação T/N de expressão através
do teste de Mann-Whitney. O valor da mediana da expressão T/N de GBP2 em
pacientes onde o tumor apresentava TP53 selvagem foi de 3,3122. Em contraste, a
70
mediana desta expressão no grupo com TP53 mutado no tumor foi de 1,0911. Apesar
dessa diferença não foi vista qualquer significância estatística (P = 0,085) (Figura 26).
Em conclusão, não foi vista associação com significância estatística entre
nenhum dos parâmetros analisados.
Tabela 13 . Associação entre os dados clínico-patológicos e a expressão de GBP2 no tecido tumoral (T) em relação ao tecido não-tumoral adjacente ao tumor (N).
Expressão de GBP2
Nº de casos T>N (%) N>T (%)
Valor de P
Grau de diferenciação do tumor Moderadamente diferenciado 19 12 (63,1) 7 (36,9) Pouco diferenciado 5 4 (80,0) 1 (20,0)
0,445
Estadiamento clínico Até IIA 10 7 (70,0) 3 (30,0) ≥ IIB 15 10 (66,7) 5 (33,3)
0,607
Invasão do tumor Lâmina própria ou submucosa (T1) 2 1 (50,0) 1 (50,0) Muscular própria (T2) 1 1 (100,0) 0 Adventícia (T3) 14 9 (64,3) 5 (35,7) Estruturas adjacentes (T4) 4 4 (100) 0
0,423
Linfonodos comprometidos Não 17 12 (70,6) 5 (29,4) Sim 6 4 (66,7) 2 (33,3)
0,618
Metástase Não 19 13 (68,4) 6 (31,6) Sim 6 4 (66,7) 2 (33,3)
0,6505
71
Tabela 14 . Associação entre os dados clínico-patológicos e status mutacional do gene TP53.
Mutação
Nº de casos Presente (%) Ausente (%)
Valor de P
Grau de diferenciação do tumor Bem diferenciado 1 0 1 (100,0) Moderadamente diferenciado 30 18 (60,0) 12 (40,0) Pouco diferenciado 8 4 (50,0) 4 (50,0)
0,453
Estadiamento clínico Até IIA 15 8 (53,4) 7 (46,6) ≥ IIB 21 13 (61,9) 8 (38,1)
0,607
Invasão do tumor Lâmina própria ou submucosa (T1) 2 0 2 (100,0) Muscular própria (T2) 1 1 (100,0) 0 Adventícia (T3) 23 14 (60,9) 9 (39,1) Estruturas adjacentes (T4) 7 3 (42,8) 4 (57,2)
0,263
Linfonodos comprometidos Não 24 15 (62,5) 9 (37,5) Sim 10 5 (50,0) 5 (50,0)
0,382
Metástase Não 25 15 (60,0) 10 (40,0) 0.759 Sim 11 6 (54,5) 5 (45,5)
Tabela 15 . Associação entre a expressão relativa T/N de GBP2 e o status mutacional do gene TP53.
Expressão relativa T/N de GBP2 P
Status mutacional de TP53 T>N (%)
(N = 18)
N>T (%)
(N = 8)
Mutado 8 (44,4) 6 (42,9) 0,155
Selvagem 10 (55,6) 2 (16,6)
72
Figura 26. Gráfico box-plot com os valores da mediana de expressão relativa T/N de GBP2 no grupo de pacientes com TP53 selvagem (Wt) e no grupo de pacientes com TP53 mutado (Mut). Apesar de a mediana da expressão de GBP2 ser maior no grupo sem mutação em TP53, não foi vista significância estatística neste resultado (P = 0,085).
3,3122
1,0911
P=0,085
73
5. DISCUSSÃO E PERSPECTIVAS
74
O câncer de esôfago é um desafio na prática oncológica por ser diagnosticado
tardiamente e, portanto, por ter um péssimo prognóstico. Além disso, as terapias
normalmente utilizadas são pouco eficazes. Uma das formas de mudar este cenário
seria a elucidação do seu processo de carcinogênese molecular e identificação de
biomarcadores para o desenvolvimento de drogas, diagnóstico precoce, determinação
do prognóstico e predição da resposta ao tratamento.
Neste trabalho, tendo como foco o carcinoma de células escamosas do esôfago
(CCEE) e os genes TP53 e GBP2, duas etapas foram realizadas com o objetivo de
entender melhor o papel destes genes no CCEE. Na etapa pré-clínica, através do
ensaio de imunoprecipitação de cromatina em um modelo de linhagem celular de
CCEE, TE-1, foi demonstrado que o gene GBP2 é um possível gene-alvo da proteína
supressora de tumor p53 uma vez que foi observada a ligação direta da p53 selvagem
à região promotora de GBP2. Este resultado é inédito na literatura. Em contrapartida,
ao contrário do esperado, não foi observada na etapa clínica, em amostras de
tumores de CCEE a associação entre o aumento relativo T/N de GBP2 e a presença
de TP53 selvagem. Entretanto, um aumento da expressão de GBP2 no tumor quando
comparada ao tecido não-tumoral adjacente foi observado na maioria (quase 70%)
dos pacientes durante a etapa clínica. Em conjunto, esses resultados sugerem um
papel de GBP2 na carcinogênese esofagiana e o envolvimento da proteína p53 em
sua regulação, mas deixa em aberto qual a relação entre p53 e GBP2 durante o
desenvolvimento do CCEE.
5.1. Identificação de GBP2 como um possível gene-alvo de p53
Uma das importâncias deste estudo é a descrição, inédita, de GBP2 como um
possível gene-alvo da proteína supressora de tumor p53. Diante da importância da
proteína p53 em diferentes funções celulares tais como apoptose e parada do ciclo
celular e da importância de seus genes-alvo em cada uma destas funções, como
abordado na introdução desse trabalho, identificar um novo gene-alvo de p53 é
compreender ainda mais a diversidade de funções desta proteína. Além disso, a
análise da região promotora de um gene e a identificação de fatores de transcrição
que atuam na regulação do mesmo é um passo fundamental para se identificar a via
celular a que pertence um gene e, consequentemente, entender melhor a sua função
(CARTHARIUS et al., 2005).
75
Neste contexto, a bioinformática surge como uma ferramenta fundamental.
Atualmente, existem diversos aplicativos para a busca de fatores de transcrição de um
determinado gene, tais como o Gene2Promoter (CARTHARIUS et al., 2005),
TRANSFAC (MATYS et al., 2003) e P-Match (CHEKMENEV et al., 2005). O
Gene2Promoter, utilizado neste trabalho, permitiu a identificação de um sítio putativo
do fator de transcrição p53 na região promotora de GBP2 e o direcionamento da
validação experimental. Através do mesmo, foi possível a condução do ensaio de
imunoprecipitação de cromatina, através da determinação da sequência da região
promotora de GBP2 não publicada previamente, e a confirmação de que p53 se liga
diretamente à região promotora de GBP2. Este dado valida experimentalmente as
análises in silico feitas por Olszewski e colaboradores e aquelas realizadas neste
estudo (OLSZEWSKI et al., 2006).
Segundo Riley e colaboradores, quatro critérios têm sido descritos para que um
gene seja considerado regulado por p53: 1) a presença da sequência consenso
(elemento responsivo) de ligação de p53 próxima ou no próprio gene, 2) a ligação
direta da proteína p53 em seu elemento responsivo confirmada pelo ensaio de
imunoprecipitação de cromatina utilizando anticorpo específico para p53, 3) a
demonstração que a expressão gênica e protéica do gene aumenta ou diminui na
presença de p53 selvagem ativada, 4) a regulação do gene por p53 confirmada pelo
ensaio de luciferase (RILEY et al., 2008). Dentre os 4 critérios citados por Riley
(RILEY et al., 2008), os 3 primeiros foram determinados para GBP2 neste trabalho e
no trabalho de Guimarães e colaboradores (GUIMARÃES et al., 2009). Fica faltando,
no entanto, a demonstração de que p53 é capaz de ativar a transcrição de GBP2 pelo
ensaio de luciferase, que é uma das perspectivas, a curto prazo, deste trabalho. Neste
ensaio, será utilizado o modelo de linhagem celular TE-1, no qual foi descrita a ligação
direta da p53 selvagem à região promotora de GBP2.
5.2. Perfil dos pacientes com CCEE atendidos no INC A no contexto de um
estudo translacional
Uma vez sugerida uma ligação direta de p53 na regulação de GBP2 em um
estudo pré-clínico, o próximo passo desse estudo foi transpor esse dado para um
estudo clínico através da análise de associação entre a expressão de GBP2 e o status
76
mutacional do gene TP53 em amostras de pacientes com CCEE caracterizando,
assim, um estudo translacional.
Nesta etapa, através da revisão de prontuários e de um questionário
epidemiológico foi possível traçar o perfil clínico e epidemiológico dos pacientes com
CCEE atendidos no INCA e a abordagem terapêutica dos mesmos.
Em concordância com a literatura, a maioria dos pacientes incluídos neste
estudo foi do sexo masculino (DALY et al., 2000). Entretanto, a idade mediana no
momento do diagnóstico foi de 56 anos, menor do que a mediana de 67 anos relatada
por Daly e colaboradores (DALY et al., 2000). Em relação aos fatores de risco
tabagismo e etilismo, praticamente todos os pacientes incluídos fumaram (95,3%) em
algum momento da vida e/ou fizeram uso de bebidas alcoólicas (92,8%), corroborando
também os dados da literatura de que estes são os principais fatores de risco em
populações que vivem em áreas onde o CCEE é menos incidente (CASTELLSAGUE
et al., 1999;LAUNOY et al., 1997b). Curiosamente, duas pacientes do sexo feminino
não tinham o relato nem de tabagismo nem de etilismo. Nestas pacientes, outros
fatores de risco e doenças associadas poderiam explicar o surgimento de CCEE, tais
como a síndrome de Plummer-Vinson, a ingestão de substâncias cáusticas, a acalásia
e a infecção pelo papiloma vírus humano (HPV) (SCHRUMP et al., 2001;ENZINGER
& MAYER, 2003). A síndrome de Plummer-Vinson está relacionada à deficiência de
ferro prolongada e à formação de membranas no esôfago e a acalásia está associada
ao acúmulo de resíduo alimentar e inflamação crônica no terço inferior do órgão
devido a um distúrbio motor. No Brasil, a acalásia decorre principalmente da doença
de Chagas (OLIVEIRA et al., 1998). Como perspectiva, seria interessante uma
investigação detalhada e direcionada para a procura desses possíveis fatores de risco
e condições clínicas associadas nestas pacientes.
A maioria dos pacientes incluídos no estudo, 62%, não possuía histórico
familiar de câncer. Entretanto, a história de algum tipo de câncer na família em 38%
dos pacientes incluídos não pode deixar de ser considerada. Embora o agrupamento
familiar de câncer de esôfago tenha sido relatado em vários países, somente a
hiperqueratose palmoplantar (tilose) é reconhecida como uma síndrome familiar que
predispõe pacientes a este câncer (ENZINGER & MAYER, 2003). A tilose é uma
doença hereditária rara em que ocorre hiperqueratose palmoplantar e papilomatose
do esôfago e que aumenta em 90% o risco de desenvolver o CCEE em pacientes com
idade igual ou superior a 65 anos (IWAYA et al., 1998;MARGER & MARGER, 1993).
77
Esta síndrome é caracterizada por uma alteração genética na região 25 do braço
longo do cromossomo 17 humano (17q25). Dentre os pacientes incluídos neste
estudo, em 1, onde foi relatado o histórico familiar (mãe e tio) de CCEE, a tilose
poderia ser considerada como fator de risco e predisposição genética para o
desenvolvimento do CCEE. Entretanto, esse mesmo paciente apresentava história de
tabagismo e etilismo, podendo ser estes os prováveis fatores de risco neste caso. O
relato de história familiar para outros tipos de tumor nos outros 15 pacientes levanta
também a possibilidade de ocorrência de outras síndromes familiares.
Quanto ao tratamento feito nos pacientes com CCEE incluídos nesse estudo,
foi observada uma grande variedade de modalidades terapêuticas. Estas diferentes
formas no tratamento podem refletir as diferentes condições clínicas nas quais os
pacientes chegam ao INCA e também a ausência de um protocolo de consenso no
tratamento deste câncer.
5.3. GBP2 como um possível biomarcador no CCEE
O terceiro resultado relevante obtido a partir deste estudo foi a observação do
aumento da expressão de GBP2 no tumor quando comparado ao tecido não-tumoral
adjacente na maioria dos pacientes, sugerindo um papel determinante de GBP2
durante o desenvolvimento do CCEE.
Atualmente, existem poucos dados sobre a função biológica de GBP2. Os
relatos existentes na literatura tratam, em sua grande parte, da Gbp2 murina e
sugerem um possível papel desta proteína na indução da proliferação
(GORBACHEVA et al., 2002;VESTAL, 2005;BALASUBRAMANIAN et al., 2006). O
estudo retrospectivo de Guimarães e colaboradores no CCEE (GUIMARÃES et al.,
2009) é o único na literatura que relaciona GBP2 humana com o desenvolvimento do
câncer, mostrando um aumento da proteína GBP2 no CCEE em relação ao epitélio
normal adjacente e a marcação de GBP2 por imunohistoquímica nas células da
camada basal do epitélio adjacente ao tumor, onde existe uma alta capacidade de
proliferação. Dessa forma, o presente estudo seguiu a mesma linha de raciocínio do
estudo retrospectivo de Guimarães e colaboradores (GUIMARÃES et al., 2009),
tentando estabelecer e confirmar a relação entre GBP2 e o CCEE, dessa vez em um
estudo prospectivo e com análise da expressão gênica. O aumento da expressão
gênica de GBP2 nas amostras tumorais quando comparada ao tecido não-tumoral
adjacente visto na maioria dos pacientes (69,3%) durante este estudo prospectivo,
78
corrobora os resultados das análises do estudo retrospectivo (GUIMARÃES et al.,
2009) e aponta o possível uso de GBP2 como um biomarcador no CCEE. Entretanto,
três fatos podem estar interferindo e confundindo esses resultados e a conclusão de
GBP2 como um biomarcador neste câncer.
Primeiramente, o número de amostras analisadas nesse estudo foi pequeno.
Uma das dificuldades encontradas neste estudo foi a qualidade do RNA extraído das
biópsias de tumor e tecido não-tumoral. Dentre os 43 pacientes incluídos, apenas em
26 o RNA isolado das biópsias apresentava a qualidade necessária para ser analisado
na reação de qPCR. Como descrito no capítulo de materiais e métodos, as amostras
de 01 a 21 foram tratadas com DNAse e as amostras de 22 a 45 foram purificadas e
tratadas com DNAse em colunas comercialmente disponíveis. Esta mudança na
metodologia foi visivelmente acompanhada na mudança de qualidade do RNA
extraído, sendo maior a qualidade das amostras purificadas pelas colunas. A baixa
qualidade do RNA em parte das amostras também interferiu na quantificação absoluta
da expressão gênica de GBP2 no tecido tumoral e no tecido não-tumoral adjacente.
Devido à variabilidade na qualidade do RNA entre as diferentes amostras, foram
utilizadas diferentes quantidades de RNA para a síntese de cDNA pela reação de
transcrição reversa. Assim, só foi possível a comparação da expressão de GBP2 entre
amostra tumoral e não-tumoral adjacente de um mesmo paciente, onde a síntese de
cDNA foi feita a partir da mesma quantidade de RNA, e não entre as amostras dos
diferentes pacientes. Uma das perspectivas é a continuação deste estudo com análise
de um maior número de casos.
Segundo, a expressão da proteína não foi analisada no presente estudo, sendo
investigada somente a expressão gênica de GBP2. Seria fundamental a análise da
proteína nas mesmas amostras analisadas para a expressão gênica de GBP2 para
determinar se o aumento do RNA estaria acompanhado pelo aumento de síntese da
proteína. Nessa linha de pensamento, uma das perspectivas desse estudo é a análise
de GBP2 por imunohistoquímica nestas amostras.
Terceiro, as amostras coletadas não foram microdissecadas não excluindo,
assim, a possibilidade de contaminação das mesmas com outros tipos celulares. Essa
seria outra justificativa para a realização de imunohistoquímica para a marcação de
GBP2 em amostras de pacientes com CCEE. Como descrito por Guimarães e
colaboradores, foi detectada a presença de GBP2 em células endoteliais
(GUIMARÃES et al., 2009). Assim, a imunohistoquímica permitiria observar se a
79
quantificação da expressão gênica de GBP2 no tecido tumoral e no tecido não-tumoral
adjacente é acompanhada pela marcação da proteína, confirmando, assim, o dado
obtido através da análise do RNA.
Diante do resultado de expressão gênica e de proteína no estudo anterior, outra
perspectiva deste trabalho é a investigação de GBP2 como biomarcador de
diagnóstico precoce através da análise do RNA e da proteína em lesões pré-malignas
do CCEE.
Em relação à determinação do impacto de GBP2 no prognóstico do CCEE,
apesar do seguimento mediano do nosso grupo ter sido de 8 meses, discretamente
superior à sobrevida do CCEE relatada na literatura (MADROSZYK et al., 2001), os
diferentes tipos de tratamentos adotados não permitiram uma análise da sobrevida
dos pacientes incluídos nesse estudo. Portanto, para avaliar se esta proteína, além do
seu papel na carcinogênese do CCEE, possui algum valor prognóstico neste câncer, o
ideal seria que essa análise fosse feita no contexto de um ensaio clínico.
5.4. Análises de alterações em TP53
Durante a investigação das alterações em TP53 foram utilizadas duas técnicas
de rastreamento, a dHPLC e a SSCP.
O uso da dHPLC para o rastreamento de alterações genéticas é descrito na
literatura como tendo quase 100% de especificidade e de sensibilidade (XIAO &
OEFNER, 2001). Keller e colaboradores relatam um limiar baixo de detecção de um
polimorfismo no éxon 6 no gene TP53, demonstrando que 10% de um alelo são
suficientes para gerar um sinal positivo na dHPLC (KELLER et al., 2001). Sabe-se que
a sensibilidade da dHPLC depende muito da temperatura de desnaturação parcial
utilizada para as análises da cromatografia. Em alguns casos, é necessário analisar
um mesmo amplicon em diferentes temperaturas de desnaturação parcial (GROSS et
al., 2001), como foi o caso para um dos amplicons analisados neste estudo.
Apenas uma mutação no gene TP53 detectada no sequenciamento automático
não foi detectada pela dHPLC. Por outro lado, foram vistas 9 (34,6%) alterações pela
dHPLC que não foram confirmadas pelo sequenciamento. Até o momento, é relatada
uma baixa frequência de falsos-positivos para a dHPLC (0-1,2%) (MARSH et al., 2001;
CRÉPIN et al., 2006). Essa alta frequência de alterações falso-positivas detectadas
pela dHPLC no nosso estudo e a alta frequência de mutação em TP53 no CCEE
80
descrita na literatura foi determinante para que a análise de mutação no gene TP53
fosse seguida apenas pelo sequenciamento automático, sem um rastreamento prévio,
em parte das amostras.
Em 56,1% dos 41 casos de CCEE analisados foram encontradas mutações no
gene TP53. Essa porcentagem é menor que os 77% de casos mutados relatados na
população Chinesa (HU et al., 2001) e 65% nos casos no nordeste do Irã
(BIRAMIJAMAL et al., 2001), ambas de regiões de alta incidência para o CCEE.
Curiosamente, a porcentagem de mutação encontrada neste estudo é maior que a
relatada no sul do Brasil de 35% (PUTZ et al., 2002), onde a incidência de CCEE é a
maior do Brasil. Entretanto no estudo de Putz, apenas os casos positivos para p53 por
imunohistoquímica foram analisados para mutação, podendo assim justificar esta
baixa freqüência.
Dentre todas as mutações descritas neste estudo, apenas uma mutação, não
foi relatada no CCEE, de acordo com o banco de dados da IARC (PETITJEAN et al.,
2007). Esta mutação levou à inserção do códon de parada no códon 229 de TP53
(p.C229X).
A identificação das assinaturas deixadas por carcinógenos no gene TP53 tem
sido possível em vários tipos de câncer tais como pulmão e hepatocarcinoma
(HAINAUT & HOLLSTEIN, 2000). Pelo banco de dados de TP53 da IARC o tipo de
mutação mais comum no CCEE é a transversão G:C>T:A. Este tipo de mutação é o
que mais ocorre no câncer de pulmão associado ao tabaco. Ao contrário do esperado,
neste estudo, este tipo de mutação ocorreu em apenas 3 (14,29%) casos. Por outro
lado, o tipo de mutação mais frequentemente encontrada foi a substituição de
G:C>A:T, ocorrendo em 38,10%, também encontrada em alta frequência no estudo de
Putz, em torno de 26%. A alta freqüência da transição G:C>A:T é vista no câncer de
bexiga. Além do tabagismo, este câncer pode estar associado à exposição industrial a
carcinógenos químicos, tais como aminas aromáticas, incluindo β-naftilamina (VINEIS
& PIRASTU, 1997). O mapeamento de locais de adutos da β-naftilamina ao longo do
gene TP53, análises de possíveis mutações induzidas por este agente em modelos
experimentais e estudos epidemiológicos mostrando associação de β-naftilamina ao
risco de desenvolver CCEE poderiam indicar o papel de carcinógenos químicos
industrais como um possível fator de risco para este câncer.
81
5.5. Ausência de associação entre o status mutacional de TP53 e a
expressão gênica de GBP2
Uma vez sugerida uma ligação direta de p53 na regulação de GBP2 na etapa
pré-clínica, duas perguntas principais surgiram. Uma delas é qual seria o impacto do
status mutacional do gene TP53 na expressão gênica de GBP2 durante o
desenvolvimento do CCEE e a outra seria por que uma proteína supressora de tumor
induziria a transcrição de GBP2, um gene que codifica uma proteína que parece ter
um papel pró-oncogênico.
Ao contrário do que seria esperado a partir dos resultados pré-clínicos, não foi
vista uma significância estatística na associação entre a presença de p53 selvagem
no tumor e o aumento da razão T/N de expressão de GBP2. Mais uma vez, este dado
pode não ser real devido ao número reduzido de pacientes analisados neste estudo.
Outro fato que poderia estar interferindo nesse resultado seria a ocorrência de
diferentes tipos de mutação detectados em TP53. Essas mutações poderiam conferir
perda apenas parcial da função de transcrição da p53 e, assim, a proteína mutada
ainda ser capaz de induzir a transcrição de GBP2. Ainda, o fato da análise da
associação ter sido feita entre a expressão de GBP2 e o status mutacional de TP53
usando a razão T/N e não os valores absolutos de expressão de GBP2 no tumor.
Por outro lado, se for considerada a ausência de associação entre o status
mutacional de TP53 e a expressão gênica de GBP2, uma hipótese pode ser levantada
para explicar essa ausência de associação. Segundo esta hipótese, a indução de
GBP2 dependente de p53 seria importante apenas nas células normais como uma
forma de sobrevivência das mesmas à exposição a carcinógenos e a ação pró-
apoptótica de p53. Nas células tumorais, quando p53 estaria inativada pela mutação
no seu gene, a indução de GBP2 ocorreria independente de p53 e dependente de
outros fatores de transcrição.
Claramente a função de p53 é fundamentalmente a de indução de apoptose.
Paradoxalmente, alguns poucos estudos também descrevem a indução de
sobrevivência celular pela p53 (JANICKE et al., 2008;VOUSDEN, 2006). Este
aumento na sobrevivência é devido à indução dependente de p53 de genes que
codificam proteínas de sobrevivência, tais como SLUG (WU et al, 2005) e Myosin IV
(JUNG et al, 2006). Esses dados poderiam explicar a indução de uma proteína de
sobrevivência como a GBP2 pela p53 nas células normais expostas ao carcinógenos.
82
Nas células tumorais, pró-oncogenes poderiam estar atuando na indução de
GBP2 independentemente de p53, tais como NFkB. Naschberger e colaboradores
demonstraram que NFkB é capaz de ativar o promotor de GBP1 (NASCHBERGER et
al., 2004), um membro da mesma família a que pertence GBP2. Suportando a
hipótese de que outros fatores de transcrição podem participar da regulação de GBP2,
um sitio putativo para NFkB na região promotora de GBP2 foi previamente relatado
por Olszewski e colaboradores. Além de NFkB, outros sítios putativos de fatores de
transcrição foram demonstrados nesta análise, incluindo ISRE (elemento de resposta
estimulada por interferon), GAS (sítio de ativação por interferon γ), GRE (elemento
responsivo a glicocorticóide), C/EBP, IRF2, AP-1, XRE (elemento de resposta a
xenobióticos), indicando que GBP2 pode ser induzido em diferentes vias celulares
provavelmente dependente de diferentes estímulos (OLSZEWSKI et al., 2006).
A Figura 27 esquematiza a hipótese descrita anteriormente de como e quando
GBP2 poderia estar sendo regulada pela p53 e por outros fatores de transcrição
durante o desenvolvimento do CCEE.
Figura 27. Hipótese de como GBP2 é regulado em células pré-
malignas e em células tumorais.
83
6. CONCLUSÕES
84
Tendo em vista os objetivos deste trabalho e os resultados obtidos, as
conclusões deste estudo são:
• Etapa pré-clínica:
o Identificação, através da bioinformática, de um sítio putativo de ligação
da proteína supressora de tumor p53 à região promotora de GBP2.
o Confirmação da ligação direta da proteína p53 selvagem à região
promotora do gene GBP-2 em linhagem celular de CCEE;
• Etapa clínica:
o Aumento da expressão gênica de GBP2 no CCEE quando comparada
ao tecido não-tumoral adjacente ao tumor na maioria (69,3%) dos
pacientes analisados.
o Frequência de 56,1% de amostras tumorais de CCEE com mutação no
gene TP53, com predomínio (56,0%) de mutações missense. Os éxons
5 e 7 concentraram a maior parte das mutações, com 28% cada. O tipo
de mutação mais frequente foi a transição G:C>A:T (38,10% dos casos).
o Ausência de associação com significância estatística entre a expressão
de GBP2 e o status mutacional de TP53 e entre estes dados e os dados
clínico-patológicos dos pacientes com CCEE.
85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
86
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96
8. ANEXOS
97
ANEXO I Termo de consentimento livre e esclarecido assinado pelos
pacientes que aceitaram participar deste estudo
98
99
ANEXO II Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA
100
ANEXO III Questionário epidemiológico respondido pelos pacientes
com CCEE incluídos no estudo
101
102
103
104
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106
ANEXO IV Ficha clínica elaborada para a coleta de dados dos
prontuários dos pacientes com CCEE
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