Frequência do alelo UGT1A1*28 (Síndrome de Gilbert) em

MARCELO MOREIRA TAVARES DE SOUZA

Frequncia do alelo UGT1A1*28 (Sndrome de Gilbert)

em pacientes portadores de hepatite crnica C e em

controles sadios

Dissertao apresentada Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Mestre em Cincias

rea de concentrao: Gastroenterologia Clnica

Orientadora: Profa. Dra. Suzane Kioko Ono-Nita

So Paulo 2009

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Souza, Marcelo Moreira Tavares de Frequncia do alelo UGT1A1*28 (Sndrome de Gilbert) em pacientes portadores de hepatite crnica C e em controles sadios / Marcelo Moreira Tavares de Souza. -- So Paulo, 2009.

Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Departamento de Gastroenterologia.

rea de concentrao: Gastroenterologia Clnica. Orientadora: Suzane Kioko Ono-Nita.

Descritores: 1.Bilirrubina 2.Ictercia 3.Doena de Gilbert 4.Hepatite C 5.Polimorfismo gentico 6.Hiperbilirrubinemia

USP/FM/SBD-321/09

Errata

Marcelo Moreira Tavares de Souza. Frequncia do alelo UGT1A1*28

(Sndrome de Gilbert) em pacientes portadores de hepatite crnica C e em

controles sadios (dissertao). So Paulo. FMUSP. 10 de setembro de 2009.

Pgina tabela/figura/grfico Linha Onde se l Leia-se

10 20 sobretudopor sobretudo por

10 22 dirria diarria

14 4 50 5

22 2 6.000 rpm 3,3 g

22 17 8.000 rpm 5,9 g

22 20 8.000 rpm 5,9 g

23 1 14,000 rpm 16,1 g

25 12 pmolar pmoles

25 13 pmolar pmoles

27 18 13.000 rpm 11,3 g

27 21 13.000 rpm 11,3 g

28 5 13.000 rpm 11,3 g

29 22 3.700 rpm 10,2 g

31 Figura 7 letroferogramas eletroferogramas

39 Tabela 2 219/494 (45) 219/494 (44)

40 6 freqncia frequncia

40 7 freqncia frequncia

40 9 13% 13,5%

47 8 mair maior

48 7 45% 44%

49 Grfico 4 freqncia frequncia

50 4 freqncia frequncia

54 12 tabela 3 tabela 5

54 14 tabela 5 tabela 3

60 5

influenciar, embora

de maneira no

estatisticamente

significante,

influenciar de

maneira

estatisticamente

significante,

DEDICATRIA

A meus pais, Roberto (in memorium) e Cida,

pelo incondicional amor, incentivo e pacincia.

A meus irmos, Marcos e Marcio,

pela amizade ao longo desses anos.

A minha famlia.

AGRADECIMENTOS

A Deus por essa etapa cumprida.

A meus pais, Roberto e Cida, pelo amor, carinho e apoio. Mesmo sem

entenderem a metodologia ou o trabalho no laboratrio, sempre se

mostraram interessados e participativos ao longo desta jornada.

famlia, minha av Delza, tios, tias, primos e primas, pelas festas nas

frias de final de ano em Juiz de Fora (MG).

Ao professor Doutor Flair Jos Carrilho, pelo incentivo pesquisa cientfica

que sempre o acompanha, um exemplo de liderana.

professora Doutora Suzane Kioko Ono-Nita, pela valiosa orientao,

pacincia e apoio no laboratrio. Sempre aberta a novas ideias, desafios e

empenhada em melhorar cada vez mais nosso grupo de pesquisa.

Ao Doutor Marcelo Eidi Nita, pela amizade, ajuda estatstica e entusiasmo

pesquisa.

Ao professor Doutor Venncio Avancini Ferreira Alves, pelo incentivo e

entusiasmo nas reunies cientficas.

Aos Doutores Alberto Queiroz Farias, Dulce Reis Guarita e Wanda Regina

Caly, pelas valiosas sugestes no exame de qualificao.

Aos amigos dos laboratrios LIM-07 e LIM-14, Helena Scavone Paschoale,

Eliane P. do Carmo, Jeronimo de Alencar Nogueira, Camila da Silva

Ferreira, Paulo D. Nasser, Cinthia Zanini, Fernanda R. Barbosa, Carolina

Aguilar, Fbio Payo, Marianges Z. Gouva, Maria Luiza da Nova, Dra. Sueli

Nakatami, Dra. Alda Wakamatsu, Rodrigo Rssio e Cinthya Cirqueira. Sem

eles, esta dissertao no poderia ser concluda.

Ao servio de sequenciamento multiusurio do LIM-56, Professor Doutor

Alberto Duarte, Fbio Silva, Doutora Erika Fujihara e Doutora Karen

Brunialti, pela ajuda nos sequencimentos e anlises de fragmentos.

Ao Departamento de Gastroenterologia, Renato, Claudia, D. Ftima, Nalva e

Fabiana, pela ajuda e ateno.

Aos Doutores Carlos Eduardo Winter e Itamar R. Garcia Ruiz, pelos

primeiros estgios em biologia molecular.

Aos amigos Augusto Ferraiol, Bruno Souza, Vinicius Silva, Alexandre

Machado, Denis Quental, Fabio Aniello, Fabio Lanzelotti, Rodrigo Ramalho,

Guilherme Francisco e amigos do Limobonera.

A, Jos Ferreira Neto, Ronaldo Giovanelli e Marcelo P. Surcin.

Aos pacientes e doadores que participaram desta pesquisa.

A todos que participaram diretamente ou indiretamente deste trabalho.

A FAPESP, CNPq e Fundao Famlia Alves de Queirs pelo apoio

financeiro.

Esta dissertao est de acordo com as seguintes normas, em vigor no

momento da publicao:

Referncias: Adaptado de International Committee of Medical Journals

Editors (Vancouver).

Universidade de So Paulo, Faculdade de Medicina, Servio de Biblioteca e

Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias

da FMUSP. Elaborado por Annelise Carneiro da Cunha, Maria Julia A.L.

Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de S. Arago, Sueli C. Cardoso, Valria

Vilhena. 2a ed. So Paulo: Servio de Biblioteca e Documentao; 2005.

Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals

Indexed in Index Medicus.

Esta dissertao est conforme as regras do Acordo Ortogrfico da Lngua

Portuguesa, de janeiro de 2009.

SUMRIO

Lista de figuras

Lista de tabelas e grficos

Lista de abreviaturas e siglas

Resumo

Summary

1. INTRODUO .......................................................................................... 1 1.1 Metabolismo da Bilirrubina ................................................................ 3

1.2 Sndrome de Gilbert .......................................................................... 6

1.3 Glicuronidao................................................................................... 9

1.4 Nomenclatura a organizao genmica das famlias UGTs............ 11

1.5 Distribuio das UGTs em diferentes tecidos.................................. 12

1.6 Hepatite Crnica C .......................................................................... 13

2. OBJETIVOS ............................................................................................ 17 3. CASUSTICA E MTODOS .................................................................... 19

3.1 Seleo dos pacientes .................................................................... 20

3.2 Preparo do creme leucocitrio......................................................... 22

3.3 Extrao de DNA genmico ............................................................ 22

3.4 Avaliao da extrao de DNA genmico (DNAg) .......................... 23

3.5 Desenho dos primers ...................................................................... 24

3.6 Amplificao por PCR ..................................................................... 25

3.7 Eletroforese ..................................................................................... 27

3.8 Purificao de fragmentos de PCR ................................................. 27

3.9 Padronizao da reao de PCR .................................................... 28

3.10 Sequenciamento de DNA ............................................................. 29

3.11 Anlise de fragmentos .................................................................. 31

3.12 Padronizao da Tcnica de Anlise de Fragmentos................... 33

3.13 Anlise estatstica......................................................................... 35

3.13.1 Clculo da equao de Hardy e Weinberg e frequncia gnica ................................................................................36

4. RESULTADOS........................................................................................ 37 4.1 Casos genotipados (Grupo A) ...................................................... 38

4.2 Distribuio entre os grupos raciais .............................................. 40

4.3 Grupos controles sadios (Grupo B). ............................................. 41

4.4 Anlise da dosagem de bilirrubina total no Grupo A (dados

laboratoriais) ................................................................................. 44

4.5 Comparao entre os gentipos UGT1A1 encontrados nos

Grupos A e B .................................................................................48

4.6 Comparaes entre os alelos encontrados nos Grupos A e B...... 49

5. DISCUSSO ........................................................................................... 52 6. CONCLUSES ....................................................................................... 59 7. ANEXOS ................................................................................................. 61

ANEXO A................................................................................................. 62

ANEXO B...............................................................................