Fundamentos de Citogenética e Citologia Clínica - Mapeamento Gênico

CURSO DE FARMÁCIA E BIOQUÍMICAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FUNDAMENTOS DE CITOGENÉTICA E CITOLOGIA CLÍNICA(TRABALHO)

“MAPEAMENTO GÊNICO”

Alunos: R.A.:André Luis Barbosa Corte 743142 – 2Eduardo Henrique Cardin de Sousa 742805 – 7Henrique Martins Páros 742961 – 4Marilei Aparecida da Silva Guedes 743031 – 0Raoni da Silva Silos 742832 – 4Thaís Nímia da Silva 742771 – 9

ARAÇATUBA2009


Mapeamento Gênico

Introdução

Os genes são responsáveis por codificar proteínas com funções específicas num organismo. Se a função exercida pela proteína correspondente a um determinado gene não é realizada, ou é realizada de maneira incorreta, o resultado pode ser prejudicial ao organismo.

Considerando isso, percebe-se que o mapeamento gênico (ou seja, a representação gráfica linear das distâncias entre genes e de suas posições relativas em um cromossomo) é o foco central da genética humana / médica atualmente.

Isso porque ele proporciona o conhecimento sobre a posição de um gene e sua região adjacente, permitindo o entendimento de suas relações com o restante do genoma; o que abre margem para a descoberta e identificação de novas doenças genéticas, a inibição de síndromes, a detecção e reparação de anormalidades metabólicas, etc.

Entre as diversas aplicações das técnicas de mapeamento genético também podemos citar o melhoramento produtivo vegetal, o controle ambiental e a produção de drogas que, combinando o mapeamento e seqüenciamento gênico, poderão incorporar qualquer proteína humana (como ocorre com o tecido ativador de plasminogênio e os intérferons, ambos utilizados no combate a doenças relacionadas com a produção de proteínas).

Sendo assim, para a identificação dos genes ao longo dos cromossomos, podemos destacar a utilização de duas grandes abordagens: o mapeamento genético clássico e o mapeamento físico / posicional.

No mapeamento genético clássico, a freqüência de crossing-overs (do inglês, permutas genéticas) entre loci distintos é utilizada para determinar a distância relativa entre eles. Essa idéia é contrária ao princípio da segregação independente de Gregor Mendel, que postula que os “fatores” (genes) são transmitidos à geração seguinte independentemente uns dos outros. No entanto, Mendel não tinha conhecimento de que esses “fatores” responsáveis pelas características se localizam em cromossomos, e aqueles muito próximos, ditos ligados, não obedecem ao princípio da segregação independente.

Já o mapeamento físico / posicional é realizado utilizando uma biblioteca de pequenas seqüências nucleotídicas de DNA cuja ordenação nem sempre é conhecida – essas seqüências são obtidas após digestão do DNA genômico utilizando enzimas de restrição. A ordenação destes pequenos fragmentos é realizada por análise de sobreposição, após seqüenciamento do DNA. Os fragmentos são dispostos linearmente permitindo a criação de um mapa físico com as localizações específicas e a identificação de cromossomos inteiros.

Ainda podemos citar uma terceira abordagem utilizada para a identificação de genes: o mapeamento funcional. Nesse caso, são utilizados marcadores de seqüências expressas, obtidos a partir de clones de cDNA (a purificação do mRNA de um tecido específico, submetido à reação com a enzima transcriptase reversa, permite a síntese de uma seqüência de “DNA complementar”, o cDNA). A hibridação de um conjunto de diferentes cDNAs com o DNA genômico permite a localização das seqüências de alguns genes expressos.


Objetivos

Devido a grande extensão e complexidade do tema abordado, o presente trabalho detalhará apenas o mapeamento genético clássico; somente aplicado a organismos eucarióticos, mas contendo informações sobre a utilização de marcadores moleculares nos processos de mapeamento. Desse modo, apesar das menções às demais abordagens existentes na introdução, não serão acrescentadas informações a respeito dos mapeamentos genéticos físico / posicional ou funcional.


Mapas de Ligação

Desenvolvidos inicialmente entre 1910 e 1911 por Thomas Morgan e Alfred Sturtevant, e depois refinados pela contribuição de vários outros geneticistas, os mapas de ligação correspondem à primeira tentativa efetiva de mapeamento gênico (sendo aplicados até hoje).

Sua elaboração deriva de três conceitos básicos, sendo: a vinculação gênica, a recombinação por crossing-overs e o cruzamento de três pontos.

A vinculação gênica ou linkage representa o ponto inicial da pesquisa de mapeamento, pois define que, quando genes estão localizados no mesmo cromossomo, durante a formação de gametas, os mesmos tendem a “viajar” juntos na separação de material genético durante a meiose.

Esse fato, uma vez que contraria o princípio da segregação independente de Gregor Mendel, nos permite dar os primeiros passos no mapa. Isso porque torna possível avaliar se dois ou mais genes se encontram no mesmo cromossomo (o que já corresponde à primeira peça de suas localizações).

A recombinação genética por crossing-overs (também conhecidos como permutações genéticas) cede as informações necessárias para calcular as distâncias entre os genes de um mesmo cromossomo, e nos permite continuar a construção do mapa.

Estas permutações são trocas de fragmentos de cromossomos homólogos, que ocorrem geralmente na prófase I da meiose, e que resultam na produção de gametas recombinantes; ou seja, gametas compostos de cromossomos constituídos de partes trocadas entre as duas metades do cromossomo homólogo original.

Com isso, quando se executa um cruzamento de três pontos (explicado a seguir), é possível identificar a ocorrência de crossing-overs na geração da prole e, através de tratamento estatístico, estimar sua freqüência (denominada taxa de recombinação).

Uma vez que, quanto mais afastados dois genes situados num mesmo cromossomo estiverem, mais espaço existe entre eles (o que favorece a ocorrência de crossing-overs); pode-se interpretar a taxa de recombinação como um indicativo indireto da distância real entre dois genes. Interpretação esta na qual cada 1% de taxa de recombinação corresponde a 1 unidade de mapa (m. u.) ou a 1 morganídeo (nome dado em homenagem a Thomas Morgan).

O cruzamento de três pontos é a chave do mapeamento genético de ligação, pois combina as informações obtidas com os demais conceitos básicos e permite traçar o mapa, inclusive com a dedução da ordem correta dos genes no cromossomo.

A técnica pode ser definida como a análise das características herdadas por uma prole gerada a partir do cruzamento de um indivíduo triíbrido (ou seja, heterozigoto para três caracteres genéticos) com um testador triplo recessivo (homozigoto recessivo para três caracteres genéticos).

De modo a explicar o cruzamento de três pontos e sua aplicação na construção de mapas de ligação, será apresentado um exemplo envolvendo a Drosophila melanogaster (comumente conhecida por mosca das frutas); no qual os alelos mutantes (ou seja, diferentes da variedade selvagem) são v (olhos vermilion), cv (crossveinless, ou ausência de vênulas nas asas) e ct (bordas da asa cortada).


1º Cruzamento:

Pais v+/v+ · cv/cv · ct/ct x v/v · cv+/cv+ · ct+/ct+

Gametas v+ · cv · ct v · cv+ · ct+

Triíbrido de 1ª Geração v/v+ · cv/cv+ · ct/ct+

2º Cruzamento:

v/v+ · cv/cv+ · ct/ct+ (♀) x v/v · cv/cv · ct/ct (♂)Fêmea Triíbrida de 1ª Geração Macho Testador Triplo Heterozigoto

Análise da Prole:

Recombinantes para os lociGametas v e cv v e ct cv e ctv · cv+ · ct+ 580v+ · cv · ct 592v · cv · ct+ 45 R Rv+ · cv+ · ct 40 R Rv · cv · ct 89 R Rv+ · cv+ · ct+ 94 R Rv · cv+ · ct 3 R Rv+ · cv · ct+ 5 R R

1448 268 191 93

Observando os resultados apresentados acima, identificando as recombinações (marcadas como R), e examinando os alelos e seus loci dois de cada vez, podemos agora calcular as distâncias entre os genes pela determinação das taxas de recombinação.

Assim, para determinarmos a distância entre v e cv, verificamos que em uma prole composta de 1448 moscas ocorreram 45 + 40 + 89 + 94 = 268 recombinações envolvendo estes genes; o que resulta em uma taxa de recombinação de (268 / 1448) x 100 = 18,5%.

Para os loci v e ct existem 89 + 94 + 3 + 5 = 191 recombinações, resultando em (191 / 1448) x 100 = 13,2% de taxa de recombinação.

E, por fim, para cv e ct temos 45 + 40 + 3 + 5 = 93 recombinações e uma taxa de recombinação de (93 / 1448) x 100 = 6,4%.

Agora, considerando que as taxas de recombinação são bem menores que 50% (o que confirma sua ligação no mesmo cromossomo) e que os loci v e cv possuem o maior valor de recombinação, podemos concluir que o locus ct se encontra entre eles e traçar o mapa a seguir.


Cabe salientar alguns pontos sobre o mapa traçado. Primeiro, embora possamos deduzir a ordem a ordem dos genes, sua representação com v à esquerda é meramente ilustrativa; uma vez que não existe uma “direção correta” do cromossomo, o mapa pode igualmente ser invertido.

Segundo, o mapa em questão nos mostra a distância e posição relativa dos genes testados entre si, mas não informa onde os loci estão no cromossomo ou mesmo qual é o cromossomo; de modo que seriam necessárias muitas análises subseqüentes para mapear os demais cromossomos em relação aos três identificados, para finalmente concluir o mapa de ligação.

Por fim, ao somarmos as duas distâncias exibidas no mapa, percebemos que seu valor (19,6 m. u.) é maior que 18,5 m. u. (a distância originalmente calculada para v e cv); de forma que parece ter havido algum erro nos cálculos ou na construção do mapa.

No entanto, o que na verdade ocorreu foi uma subestimativa da distância entre os loci v e cv; pois, durante o mapeamento, não foram consideradas as ocorrências de duplos crossing-overs nas classes mais raras da prole.

Assim, considerando que o cruzamento de três pontos nos permite perceber quando ocorrem duas permutas genéticas entre loci, podemos então recalcular a taxa de recombinação entre v e cv realizando novamente a soma das recombinações (desta vez considerando cada prole mais rara duas vezes). Então, temos na verdade 45 + 40 + 89 + 94 + 3 + 3 + 5 + 5 = 284 recombinações e uma taxa de recombinação de (284 / 1448) x 100 = 19,6%, o que é idêntico à soma dos dois valores componentes do mapa.


Mapeamento com Marcadores Moleculares

Apesar de importantes na análise de seu funcionamento, os genes somente possuem uma função de “marcador” nas técnicas de mapeamento. Ou seja, para fins de mapear um cromossomo os genes apenas são empregados como marcos na “rodovia genética”.

Como visto anteriormente, os genes são mapeados através da freqüência com que sofrem crossing-overs; e isso só é possível quando existem dois alelos do gene capazes de gerar um heterozigoto e que produzam também fenótipos diferentes detectáveis.

Dito isso, e considerando o avanço dos estudos com muitos organismos, chegou-se a um ponto em que, apesar da identificação de muitos alelos mutantes para mapeamento, ainda existem grandes extensões de DNA entre os genes já mapeados para os quais não se possui fenótipos associados e, portanto, para os quais o mapeamento não é mais possível.

A resposta encontrada para esse problema foi a utilização de marcadores moleculares; que podem ser entendidos como sítios no DNA onde pode se apresentar heterozigose sem que a mesma esteja relacionada a alguma mudança fenotípica mensurável (também conhecidas como mudanças silenciosas).

Tais sítios heterozigotos podem ser mapeados por análise de ligação do mesmo modo que um par de alelos heterozigoto convencional, uma vez que também sofrem crossing-overs e podem ser facilmente identificáveis através de alguns artifícios (mesmo que não gerem fenótipos detectáveis).

Atualmente existem dois tipos básicos de marcadores moleculares: os baseados em diferenças nos nucleotídeos e os baseados em diferenças na quantidade de DNA repetitivo (ambos explicados a seguir).

Uso de Polimorfismos de Nucleotídeos no Mapeamento

Algumas posições no DNA são ocupadas por um nucleotídeo diferente em cromossomos homólogos diferentes. Estas diferenças são chamadas de polimorfismos de um único nucleotídeo ou SNPs e, embora na maior parte das vezes sejam silenciosas, fornecem marcadores para o mapeamento gênico.

Existem vários modos para detectar esses polimorfismos, entre os quais o mais simples de visualizar é pela análise de enzimas de restrição.

Estas enzimas de origem bacteriana cortam o DNA em seqüências alvo específicas definidas ao acaso, mas que se repetem na mesma posição no DNA de indivíduos diferentes em uma mesma população.

Ou seja, uma enzima de restrição qualquer cortará o DNA contido nos cromossomos homólogos de uma determinada espécie em uma posição específica, e essa posição será a mesma no DNA de qualquer outro representante da mesma espécie.

No entanto, não raramente, ocorrem mutações no DNA de determinados indivíduos; o que pode resultar na perda ou alteração de um sítio de corte para uma enzima de restrição. Estas mutações, que podem ocorrer no interior de um gene ou em uma área não codificante, passam então a representar uma condição de heterozigose para presença ou ausência de um sítio de restrição; de modo que, como para os genes em geral, pode ser usada como um marco de mapeamento.


Assim, aplicando técnicas como a análise de Southern (que emprega uma sonda derivada do DNA da região que se pretende mapear) é possível identificar variações no comprimento dos trechos que seriam cortados pelas enzimas de restrição. Variações estas baseadas nos SNPs ocorridos na área e denominadas de polimorfismos de comprimentos de fragmentos de restrição ou RFLPs.

Os RFLPs heterozigotos podem estar ligados a um gene heterozigoto para o qual não se possui um fenótipo relacionado, possibilitando um mapeamento do gene por “aproximação”.

Por exemplo, como ilustrado na figura abaixo, podemos ter dois genes heterozigotos quaisquer (aqui definidos arbitrariamente como d e D); sendo os mesmos ligados a regiões onde existem RFLPs para uma enzima de restrição qualquer.

Os crossing-overs entre estes sítios produziriam produtos recombinantes detectáveis como D-3 e d-2-1, que poderiam ter suas taxas de recombinação determinadas como explicado anteriormente e, conseqüentemente, resultar no mapeamento dos genes a eles relacionados.

Uso de Seqüências Repetidas em Tandem no Mapeamento

Em muitos organismos alguns seguimentos do DNA são repetidos em tandem em locais precisos. Entretanto o número de unidades repetidas em tal disposição pode ser variável, e assim eles são chamados de VNTR (número variável de repetições em tandem).

Assim, de modo semelhante ao que ocorre com os RFLPs, os indivíduos podem ser heterozigotos em relação aos VNTRs. Por exemplo, o sítio em um homólogo pode ter oito unidades repetidas e o sítio no outro homólogo pode ter apenas cinco.

Desta forma, esta heterozigose pode ser detectada e os sítios utilizados como marcadores de mapeamento por análise de ligação.

No caso é necessária uma sonda que se ligue ao DNA repetitivo e, através de enzimas de restrição, podem ser retirados dois blocos contendo as regiões de VNTR. Esses locus contendo VNTR são então analisados e, através de um auto-radiograma de hibridização de Southern, formam duas bandas de tamanhos diferentes.


Então, ao se realizar cruzamentos para análise de ligação e identificação dos locus contendo VNTRs através da técnica descrita acima, pode-se mapear genes por “aproximação” (da mesma forma que ocorre para locus de RFLP).


Exemplo de Mapa de Ligação

O mapa de ligação exibido a seguir é um exemplo do resultado da aplicação das técnicas de análise de ligação e várias outras não mencionadas neste trabalho.

Trata-se do mapeamento dos genes conhecidos para o tomate em 1952, e cada locus é representado por dois alelos usados nas experiências originais de mapeamento.

À medida que mais loci se tornaram conhecidos, foram mapeados em relação aos loci mostrados na figura abaixo. Assim, atualmente o mapa mostra centenas de loci, mas ainda é possível compreender a extensão do trabalho realizado e a complexidade do mapeamento gênico.


Bibliografia

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Fundamentos de Citogenética e Citologia Clínica - Mapeamento Gênico