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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃOMESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
PROJETO DE PESQUISA
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM L-ARGININA NA INTEGRIDADE DO DNA E RNA DE Rattus novergicus LINHAGEM WISTAR SUBMETIDOS À QUIMIOTERAPIA
COM 5-FLUOROURACIL
Equipe de trabalho:Eloisa Ortega Nazário de Araújo – Mestranda em Ciência Animal
Bianca Depieri Balmant – Mestranda emCiência Animal
Sandra Genaro – Doutoranda em Fisiopatologia e SaúdeAnimal
Caroline Gil Dundi – aluna de graduação em Medicina Veterinária
Andresa Aparecida de Oliveira Cardoso – aluna de graduação em Zootecnia
Prof. Dr. Luis Souza Lima de Souza Reis – Orientador
Prof. Dr. Antonio Fluminhan Junior – Co-orientador
Prof. Dr. Marcelo George Mungai Chacur – Colaborador
Prof. Dra. Rosa Maria Barilli Nogueira – Colaboradora
Presidente Prudente – SP2015
SUMÁRIO
Resumo .................................................................................................................
....3
1
Introdução ..............................................................................................................4
2 Revisão da
literatura ..............................................................................................5
3 Justificativa do projeto de
pesquisa .......................................................................9
4
Objetivos ................................................................................................................9
5 Projeto
piloto ..........................................................................................................9
6 Materiais e métodos do projeto de
pesquisa .........................................................10
Referências
bibliográficas .........................................................................................16
2
RESUMO
EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM L-ARGININA NA INTEGRIDADE DO DNA E RNA DE RATTUS NOVERGICUS LINHAGEM WISTAR SUBMETIDOS À QUIMIOTERAPIA COM 5-
FLUOROURACIL
O câncer tem sido considerado um dos maiores problemas de saúde pública mundial. Apesar
dos recentes avanços na produção de drogas quimioterápicas a 5-fluorouracil (5-FU) tem sido
aplicada no tratamento de diversos tipos de câncer nos últimos 40 anos. Muitas investigações
têm sido realizadas na prevenção, tratamento e cura do câncer, com o objetivo de aumentar o
tempo de sobrevida e melhorar a qualidade de vida do paciente. Podem ser citados alguns
nutrientes com ação estimulante no sistema imunológico, dentre eles, tem se destacado a L-
arginina, onde seus efeitos benéficos ultrapassam o efeito nutricional. O objetivo deste projeto
é avaliar os efeitos da suplementação de diferentes doses de L-arginina na integridade do
DNA e RNA de Rattus novergicusda linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-
fluorouracil. Serão utilizados 72 Rattus novergicusda linhagem Wistar que serão divididos
aleatoriamente em 6 grupos (12 animais/grupo) a seguir: Grupo controle, Grupo controle 5-FU,
Grupo controle arginina 2%, Grupo controle arginina 4%, Grupo arginina 2%+5-FU e Grupo
arginina 4%+5-FU. O teste Ensaio do Cometa será utilizado para investigação de danos no
DNA e RNA, através de uma solução de agarose a 1,5% adicionado 5µl de sangue através de
eletroforese, com coloração de fluoresceína e observação em microscópio de fluorescência,
classificando em: a) sem cauda (0); b) < 1 (1); c) 1 – 2 (2); d) > 2 (3) e e) sem cabeça (4). O
teste de Análise de Cariótipo será utilizado para investigação de anormalidades
cromossômicas, através de culturas celulares de linfócitos com coloração por bandamento G:
a) bandamento G com Tripsina e b) bandamento G por Wrigth. Cada tipo de anormalidades
3
serão selecionadas e descritas em relação ao tipo de anormalidade cromossômica. Os dados
serão analisados por meio da Análise de Variância e teste de Tukey. Em todas as análises
será considerado significância de 5%.
Palavras-chave: L-arginina, 5-fluorouracil, DNA, RNA.
1 INTRODUÇÃO
O câncer tem sido considerado um dos maiores problemas de saúde pública
mundial devido ao elevado índice de mortalidade na população causada por esta doença
(BARUFFI, 2002; AZEVEDO e BOSCO, 2011).
No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer – INCA estimou que houve
aproximadamente 576 mil casos novos de câncer na população em 2014,sendo válida esta
estimativa de ocorrência de novos casos de câncer para 2015. Além disso, o INCA relata que os
tipos de câncer mais comuns que ocorrem na população são os de pele, próstata, mama
feminina, cólon e reto, pulmão, estômago e colo do útero.
Devido à elevada mortalidade e a incidência de novos casos de câncer na
população, a cancerologia vem desenvolvendo pesquisas objetivando compreender o
desenvolvimento da neoplasia no organismo e na busca de tratamentos adequados para cada
tipo de câncer (AZEVEDO e BOSCO, 2011).
O tratamento oncológico pode serde forma curativa ou paliativa e os tratamentos
mais frequentes são a cirurgia, a radioterapia ou quimioterapia, podendo ser de forma isolada ou
combinada, dependendo do tipo celular do órgão de origem e do grau de invasão do tumor.
Dentre estas alternativas de tratamentos oncológicos, cerca de 90% dos tumores podem ser
tratados com a drogas quimioterápicas, o que faz ser a modalidade mais utilizada dos
tratamentos oncológicos (AZEVEDO, 2004; VILAR, MARTINS, CRISANTO, 2012).
Apesar dos recentes avanços na produção de drogas quimioterápicas que inibe o
desenvolvimento e crescimento de células cancerígenas, (WEISBERG et al., 2007) a 5-
fluorouracil (5-FU) tem sido aplicada no tratamento de diversos tipos de câncer nos últimos 40
anos (ZHANG; SUN; LU, 2013) e que continua sendo frequentemente utilizada no tratamento dos
tumores (WEISBERG et al., 2007) de mama, cabeça e pescoço, pâncreas, estômago, cólon, reto
e da pele, (NETO, 2013) devido a sua significativa variabilidade na resposta terapêutica e na
ocorrência de toxicidade associada à sua farmacocinética variável, além de combater as
4
populações de células malignas resistentes à outros fármacos (WEISBERG et al., 2007;
MARTINS et al., 2013).
A 5-FU é um quimioterápico que tem baixa especificidade e seletividade somente
para as células tumorais, ela também pode acometer as células sadias do organismo e, assim,
comprometer o pleno funcionamento dos órgãos, resultando em efeitos colaterais tóxicos que são
indesejáveis e pode comprometer a saúde do paciente em tratamento (DIAS et al., 2006;
SMIDERLE e GALLON, 2012; ZHANG; SUN; LU, 2013).
Muitas investigações têm sido realizadas na prevenção, tratamento e cura do
câncer, com o objetivo de aumentar o tempo de sobrevida e melhorar a qualidade de vida do
paciente. A busca desses objetivos tem estimulado a pesquisa de terapias alternativas e
farmacológicas, coadjuvantes ou não às tradicionais. Através dessa busca, podem ser citados
alguns nutrientes com ação estimulante no sistema imunológico, dentre eles, tem se destacado a
L-arginina, onde seus efeitos benéficos ultrapassam o efeito nutricional(NOVAES 1999; NOVAES
et al., 2000; NOVAES e BEAL 2004; NOVAES E PANTALEÃO 2012).
A 5-FU pertence à classe de antimetabólitos, um grupo de diversos fármacos que
inibem a função do DNA e do RNA de diversas maneiras, consequentemente levando a danos
para os mesmos, (GOODMAN e GILMAN, 2010), no entanto já a L-arginina confere diversos
benefícios (NOVAES e PANTALEÃO, 2012). Neste caso o presente estudo avaliará os efeitos
metabólicos da L-arginina na função da recuperação dos danos causados pela 5-FU.
2 REVISÃO DA LITERATURA
O câncer colorretal abrange tumores que acometem um segmento do intestino
grosso (o cólon) e o reto. É tratável e, na maioria dos casos, curável, ao ser detectado
precocemente, quando ainda não se espalhou para outros órgãos. Grande parte desses tumores
se inicia a partir de pólipos, lesões benignas que podem crescer na parede interna do intestino
grosso. Uma maneira de prevenir o aparecimento dos tumores seria a detecção e a remoção dos
pólipos antes de eles se tornarem malignos (INCA, 2015).
Possui alta incidência populacional e alto índice de mortalidade, com diferenças
pouco relevantes entre os povos de diversas nações, como atestam os estudos epidemiológicos
dessa doença (SANTOS et al., 2008). Sua etiologia é complexa, porém a sua ocorrência tem
grande correlação com fatores nutricionais (MOREIRA et al., 2006).
O quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU) trata-se de uma pirimidina flourada (Figura
1) que é submetida no metabolismo intracelular ao monofosfato de deóxi-5-fluorouracil, um
inibidor da enzima timidilatosintetase, precursora essencial do DNA, interferindo no metabolismo
de DNA e RNA (BRAUNWALD et al., 2003; WYATT e WILSON, 2009; GOODMAN e GILMAN
2010). Essa ação ocorre devido ao flúor de menor tamanho na posição 5 permite a molécula
5
imitar bioquimicamente a uracila, entretanto, a ligação flúor-carbono é muito firme e impede a
metilação da posição 5 da 5-FU pela timidilatosintetase, a fluoropirimidina mantém a enzima em
inibição e impede a síntese de timidilato, um percussor necessário do DNA. Para isso acontecer e
a 5-fluorouracil requer sua conversão enzimática no nucleotídeo (ribosilação e fosforilação) para
poder assim, exercer sua atividade citotóxica, entrando na célula através de um sistema
facilitador transmembranar (EL-HAJJ et al., 1992; GOODMAN e GILMAN, 2010).
Figura 1. Estrutura química do análogo das pirimidinas (5-fluorouracil).
A 5-FU também pode incorporar ao DNA e RNA. Em células tratadas com 5-FU, o
substrato que se acumula antes da reação bloqueada de timidilatosintetase incorpora-se ao DNA
em vez do timidilato, que sofreu depleção fisiológica. O significado da incorporação desses
substratos da 5-FU no DNA ainda não foi esclarecido, mas presumivelmente, essa incorporação
desencadeia o processo de excisão-reparo, que pode resultar em quebras dos filamentos de
DNA, visto que o reparo de DNA necessita de timidilato, entretanto está ausente em
conseqüência da inibição da timidilatosintetase. A incorporação de 5-FU no RNA também provoca
toxicidade devido aos efeitos importantes sobre o processamento e as funções do RNA
(GOODMAN e GILMAN, 2010).
Estudos experimentais demonstraram que a deficiência de aminoácidos isolados
interfere de maneira mais acentuada sobre a imunidade humoral quando comparada à imunidade
celular, devido à redução da síntese de anticorpos. Os aminoácidos arginina, triptofano,
metionina, cisteína, valina, treonina, tirosina e fenilalanina, parecem ser vitais para a manutenção
da produção normal de anticorpos e a deficiência de leucina resulta na redução da resposta
tumoral citotóxica (MAIONOUS e DEITCH, 1994).
A L-arginina é o ácido (L)-2-amino-5-guanidinovalérico (Figura 2), é um aminoácido
semi-essencial produzido no organismo, porém em quantidade insuficiente para todas as
necessidades, pois todos os tecidos utilizam arginina no citoplasma e na biossíntese proteica
nuclear (NOVAES e PANTALEÃO, 2012). É encontrada no chocolate, germe de trigo, granola,
derivados do leite (queijo cottage, ricota, iogurte), castanhas (coco, nozes, amêndoas,
amendoim), sementes (abóbora, girassol), carnes (frango, boi, porco e peru), frutos do mar
(lagosta, salmão, camarão, atum) e soja cozida (BARBUL et al., 1990).
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Figura 2. Estrutura química da L-arginina.
Além de utilizada no ciclo da uréia, a arginina é utilizada na síntese de creatinina e
fornece ornitina para a síntese de poliaminas. Possui múltipla e potente atividade secretadora
sobre várias glândulas endócrinas, é importante secretadora do hormônio do crescimento,
prolactina e insulina. Estimula a liberação de glucagon, polipeptídeo pancreático e catecolaminas
adrenais. Além de estimular o metabolismo do nitrogênio e efeitos benéficos na cicatrização, pois
fornece metabólitos que são indispensáveis para a formação de colágeno, proliferação celular, e
angiogênese.E também no mecanismo das defesas anti-tumorais(GOKMAN et al., 2001; SINGH
et al., 2001; NOVAES e PANTALEÃO, 2012; ELLINGER, 2013).
É descrita como estimuladora do hormônio hipofisário, e tem sido relacionada ao
aumento da atividade das células killer e células T-helper e ao estímulo da produção das
citocinas: interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), receptor IL-2, interleucina-6 (IL-6), e o fator
alfa de necrose do tumor (TNF-alfa).
Estudos clínicos com L-arginina mostram resultados satisfatórios como: redução na
infecção e complicações na cicatrização; diminuição das complicações pós-operatórias, de sepse,
aumento nas proteínas viscerais e diminuição da IL-6; maior percentagem de células CD16+ e
CD56+ no tumor e maior concentração plasmática de pré-albumina (NOVAES e PANTALEÃO,
2012).
O efeito da arginina sobre o crescimento tumoral tem sido investigado há mais de
60 anos (BEARD, 1943; MILNER e STEPANOVICH, 1979). Vários estudos clínicos foram
realizados sobre a utilização da arginina
A utilização de doses farmacológicas de arginina em modelos experimentais com
câncer tem sugerido que este aminoácido apresenta efeitos imunoestimulatórios específicos, que
podem ser benéficos ao paciente (KIRK e BARBU, 1990).Suplementação de arginina a curto
prazo pode ajudar na manutenção da função imunitária durante a quimioterapia, 30 g de
arginina/dia durante três dias reduz a supressão das células NK induzida por quimioterapia, além
de reduzir a citotoxicidade celular e mitogênese de linfócitos reativos em pacientes com câncer
local avançado (BRITTERNDEN et al., 1994).
Em outro estudo, a suplementação de arginina três dias antes da cirurgia,
aumentou significativamente a atividade de linfócitos infiltrantes de câncer de colorretal in vivo
(HEYS et al., 1997).
7
Segundo Barbulet al. (1981) a administração de 30 mg de arginina HCl por sete
dias, demonstra que a L-arginina tem um papel fundamental na reabilitação metabólica e
imunológica de seres humanos gravemente feridos. Efeitos colaterais mínimos foram observados,
como náuseas e diarréia, os quais foram corrigidos através da redução da dosagem ingerida. A
suplementação dietética de L-arginina estimulou fortemente a reatividade dos linfócitos in vitro,
estimulando sua aplicação em pacientes com imunossupressão devido ao câncer, trauma
cirúrgico, desnutrição ou sepse.
Já Van Bokhors et al. (2001), estudaram o efeito da nutrição enteral suplementada
com L-arginina no estado nutricional, resposta imunológica, complicações pós-operatórias e
sobrevida de 49 pacientes com câncer de cabeça e pescoço submetidos a cirurgia. Constatou-se
que houve aumento do tempo de sobrevida dos pacientes que receberam nutrição enteral
suplementada com L-arginina.
Cho-Chunget al. (1981) em um estudo in vitro, realizado no Instituto Nacional do
Câncer dos EUA, observaram que células cancerosas em cultura inibiram o seu crescimento
após receberem uma suplementação diária de 1 mg/ml de L-arginina.
O mesmo ocorreu com Tachibanaet al. (1985) e Hester e Fee (1995), onde
encontraram resultados semelhantes estudando tumores sólidos em ratos. Ambos os estudos
demonstraram diminuição no crescimento tumoral e incidência de metástases, utilizando
suplementações dietéticas com arginina variando entre 5.0 a 5.5% a concentração.
Wu et al. (2000), num estudo experimental, reportaram que uma pequena dose de
suplementação oral de L-arginina (50 mg/Kg de peso corporal/dia), durante o período de um ano,
provocou o decréscimo do número total de tumores e aumentou a sobrevida em ratos. Outros
estudos mostraram que a suplementação de L-arginina (1% em água potável) durante o estágio
inicial de carcinogênese provocou a diminuição da produção de tumor colorretal e da
hiperproliferação de células mortas.
Os critérios utilizados para avaliar a influência da arginina nestes sistemas são
geralmente a incidência, período de latência (tempo necessário para que o tumor se torne
clinicamente palpável), tempo de sobrevivência, alteração no crescimento tumoral e, em alguns
casos, alteração no peso dos animais.Os efeitos da suplementação dietética com arginina sobre
tumores induzidos por carcinógenos e observaram diminuição no crescimento tumoral (TAKEDA
et al., 1975; MA Q et al. 1996). Outros pesquisadores demonstraram que a administração
dietética enriquecida com arginina inibiu o crescimento de tumores ascíticos e diminuiu o
quantitativo de células malígnas na cavidade peritoneal nos ratos (MILNER e SREPANOVICH,
1979; PRYME, 1978).
Os efeitos imunológicos da arginina também têm sido estudados no câncer
experimental (BARBUL et al., 1980; REYNOLDS, 1990), sendo sugerido que a arginina é
responsável pelo aumento de peso do timo e da atividade das células natural-killer ativadas pelo
8
interferon, além da inibição do crescimento tumoral e aumento da sobrevida dos ratos, quando
comparados aos animais sem suplementação.
Embora nos trabalhos revistos haja controvérsias quanto ao efeito da arginina
sobre o câncer experimental, alguns autores sugerem que a suplementação com arginina na
ração pode reduzir o crescimento de tumores transplantáveis e a tumorigenicidade de
carcinógenos, possivelmente através de uma redução na síntese proteica, aumento na produção
de hormônios e síntese de poliaminas, liberação de citocinas ou através do ciclo metabólico do
óxido nítrico (GROSSIE 1996; TAKEDA et al., 1975; MILNER e STEPANOVICH, 1979). Alguns
dos resultados conflitantes podem ser devido a diferenças na metodologia, especialmente na
dose e via de administração da arginina, o tipo e imunogenicidade do tumor, como também do
estado nutricional do hospedeiro.
Em conclusão, os efeitos da suplementação de L-arginina na fisiologia humana
parecem ser multicausais e relacionado com a dose. As doses de 3-8 g / d parecem ser seguras
e não causam efeitos agudos farmacológicos em humanos (BOGER, 2007)
3 JUSTIFICATIVA DO PROJETO DE PESQUISA
Enquanto o metabolismo e a bioquímica da arginina são largamente
compreendidos, o mecanismo definitivo que explique as ações farmacológicas deste aminoácido
ainda não foi totalmente elucidado, principalmente suas ações no material genético em que a
arginina é parte integrante das histonas.
4 OBJETIVO
Avaliar os efeitos da suplementação de diferentes doses de L-arginina na
integridade do DNA e RNA de Rattus novergicus da linhagem Wistar submetidos a quimioterapia
com 5-fluorouracil.
5 PROJETO PILOTO
O projeto piloto será realizado de fevereiro de 2016 a Março de 2016.
Antes da realização do experimento será necessário a realização de um projeto
piloto para padronização da dose de 5-FU e da suplementação com L-arginina, tempo
experimental e das colheitas de materiais e as técnicas laboratoriais que serão empregadas no
experimento proposto.
Neste projeto piloto serão aplicadas as mesmas técnicas que serão empregadas
no projeto de pesquisa que estão descritas a seguir.
9
Para o projeto piloto será necessário a utilização de 30 Rattus novergicus da
linhagem Wistar que serão divididos aleatoriamente em 6 grupos que permanecerão em gaiolas
individuais contendo entre 4 a 5 ratos Wistar, sob as mesmas condições ambientais com padrão
de iluminação (ciclo claro/escuro de 12/12 horas) e com temperatura ambiente em torno de 23 °C
conforme a recomendação de Merusse e Lapichik (1996) que serão divididos aleatoriamente em
6 grupos a seguir:
- Grupo controle (Gc): será composto por 5 ratos Wistar e receberá a somente
ração basal (Supralab®) e água filtrada ad libitum. Estes animais serão utilizados do projeto de
pesquisa intitulado “O efeito da suplementação com L-arginina na fragmentação dos
cromossomos em Rattus novergicus linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-
fluorouracil”, protocolo na CCPQ nº 2918.
- Grupo controle 5-FU (G5-FU): será composto por 5 ratos Wistar que receberão a
ração basal (Supralab®) e água ad libitum e uma dose do quimioterápico 5-Fluorouracil1 de 200
mg/Kg de peso vivo por via intraperitoneal conforme recomendação por Leocádio et al. (2015).
Estes animais serão utilizados do projeto de pesquisa intitulado “O efeito da suplementação com
L-arginina na fragmentação dos cromossomos em Rattus novergicus linhagem Wistar submetidos
à quimioterapia com 5-fluorouracil”, protocolo na CCPQ nº 2918.
- Grupo controle arginina 2% (Garg2): será composto por 5 ratos Wistar que
receberão a ração basal (Supralab®) e adição de 2% de L-arginina na água de bebida ad libitum
conforme recomendação por Leocádioet al. (2015).
- Grupo controle arginina 4% (Garg4): será composto por 5 ratos Wistar que
receberão a ração basal (Supralab®) e adição de 4% de L-arginina na água de bebida ad libitum
conforme recomendação por Leocádioet al. (2015).Estes animais serão utilizados do projeto de
pesquisa intitulado “O efeito da suplementação com L-arginina na fragmentação dos
cromossomos em Rattus novergicus linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-
fluorouracil”, protocolo na CCPQ nº 2918.
- Grupo arginina 2% + 5-FU (grupo Garg2%+5-FU): será composto por 5 ratos Wistar
que receberão a ração basal (Supralab®), adição 2% de L-arginina na água de bebida ad libitume
aplicação de uma dose do quimioterápico 5-Fluorouracil de 200 mg/Kg de peso vivo por via
intraperitoneal conforme recomendação por Leocádio et al. (2015) 5 dias após o início da
suplementação com L-arginina.
- Grupo arginina 4% + 5-FU (grupo Garg4%+5-FU): será composto por 5 ratos Wistar
que receberão a ração basal (Supralab®), adição de 4% de L-arginina na água de bebida ad
libitum e aplicação de uma dose do quimioterápico 5-Fluorouracil de 200 mg/Kg de peso vivo por
via intraperitoneal conforme recomendação por Leocádio et al. (2015) 5 dias após o início da
1Faldfluor®, Libbs.
10
suplementação com L-arginina.Estes animais serão utilizados do projeto de pesquisa intitulado “O
efeito da suplementação com L-arginina na fragmentação dos cromossomos em Rattus
novergicus linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-fluorouracil”, protocolo na CCPQ
nº 2918.
6 MATERIAL E MÉTODOS DO PROJETO DA PESQUISA6.1 Local que o experimento será desenvolvido
O experimento será realizado no Biotério da Universidade do Oeste Paulista
(Unoeste) e no Laboratório de Citogenômica e Bioinformática da Universidade do Oeste Paulista
(Unoeste), Presidente Prudente, SP.
6.2 Delineamento experimental
6.2.1 Os animais, formação dos grupos experimentais e os tratamentosO Rattus novergicus linhagem Wistar tem sido frequentemente utilizado como
modelo experimental para ensaios de nutrição (GIACOMELLI e NATALLI, 1999; LEOCÁDIO et
al., 2015).
Serão utilizados 72 Rattus novergicus (Wistar) com 120 a 150 gramas de peso
corporal do Biotério da Universidade do Oeste Paulista que serão divididos aleatoriamente em
quatro grupos experimentais, que permanecerão em gaiolas individuais contendo entre 4 a 5
ratos Wistar, sob as mesmas condições de padrão de iluminação (ciclo claro/escuro de 12/12
horas) e com temperatura em torno de 23 °C conforme a recomendação de Merusse&Lapichik
(1996).
Os 72 Rattus novergicus linhagem Wistar serão divididos aleatoriamente em 6
grupos (12 animais/grupo) a seguir:
- Grupo controle (Gc): será composto por 12 ratos Wistar e receberá a somente
ração basal (Supralab®) e água filtrada ad libitum. Estes animais serão utilizados do projeto de
pesquisa intitulado “O efeito da suplementação com L-arginina na fragmentação dos
cromossomos em Rattus novergicus linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-
fluorouracil”, protocolo na CCPQ nº 2817.
- Grupo controle 5-FU (G5-FU): será composto por 12 ratos Wistar que receberão a
ração basal (Supralab®) e água ad libitum e uma dose do quimioterápico 5-Fluorouracil2 de 200
mg/Kg de peso vivo por via intraperitoneal conforme recomendação por Leocádio et al. (2015).
Estes animais serão utilizados do projeto de pesquisa intitulado “O efeito da suplementação com
2Faldfluor®, Libbs.
11
L-arginina na fragmentação dos cromossomos em Rattus novergicus linhagem Wistar submetidos
à quimioterapia com 5-fluorouracil”, protocolo na CCPQ nº 2817.
- Grupo controle arginina 2% (Garg2): será composto por 12 ratos Wistar que
receberão a ração basal (Supralab®) e adição de 2% de L-arginina na água de bebida ad libitum
conforme recomendação por Leocádioet al. (2015).
- Grupo controle arginina 4% (Garg4): será composto por 12 ratos Wistar que
receberão a ração basal (Supralab®) e adição de 4% de L-arginina na água de bebida ad libitum
conforme recomendação por Leocádioet al. (2015).Estes animais serão utilizados do projeto de
pesquisa intitulado “O efeito da suplementação com L-arginina na fragmentação dos
cromossomos em Rattus novergicus linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-
fluorouracil”, protocolo na CCPQ nº 2817.
- Grupo arginina 2% + 5-FU (grupo Garg2%+5-FU): será composto por 12 ratos Wistar
que receberão a ração basal (Supralab®), adição 2% de L-arginina na água de bebida ad libitume
aplicação de uma dose do quimioterápico 5-Fluorouracil de 200 mg/Kg de peso vivo por via
intraperitoneal conforme recomendação por Leocádio et al. (2015) 5 dias após o início da
suplementação com L-arginina.
- Grupo arginina 4% + 5-FU (grupo Garg4%+5-FU): será composto por 12 ratos Wistar
que receberão a ração basal (Supralab®), adição de 4% de L-arginina na água de bebida ad
libitum e aplicação de uma dose do quimioterápico 5-Fluorouracil de 200 mg/Kg de peso vivo por
via intraperitoneal conforme recomendação por Leocádio et al. (2015) 5 dias após o início da
suplementação com L-arginina.Estes animais serão utilizados do projeto de pesquisa intitulado “O
efeito da suplementação com L-arginina na fragmentação dos cromossomos em Rattus
novergicus linhagem Wistar submetidos à quimioterapia com 5-fluorouracil”, protocolo na CCPQ
nº 2817.
O consumo da L-arginina pelos ratos Wistar de todos os grupos experimentais
(grupos Gc, G5-FU, Garg2%, Garg4%, Garg2%+5-FU, Garg4%+5-FU) serão determinados diariamente durante
todo o experimento por meio do consumo diário de água. Para isto, será medida o volume de
água antes de ser colocada no bebedouro dos ratos e, após 24 horas, será medida o volume da
sobra da água no bebedouro. Subtraindo-se o segundo volume de água do primeiro volume, será
o consumo médio diário de água de cada grupo experimental de ratos Wistar, que será dividido
pelo número de ratos Wistar de cada grupo experimental, e assim, será determinado o consumo
diário médio de ração por rato Wistar de cada grupo experimental.
6.3 Dieta Basal e o controle do consumo dos ratos Wistar durante o período experimental
12
A ração basal dos ratos Wistar de todos os grupos experimentais será uma ração
comercial3 que atende todas exigências nutricionais desses animais e será composta por (níveis
de garantia/Kg de ração): 22,0% de proteína bruta; 2,5% de extrato etéreo; 6,0% de matéria
fibrosa; 10% de matéria mineral; 1,2% de cálcio; 0,7% de fósforo; 3.000 mg de metionina; 7.000
UI de vitamina A; 50 mg de vitamina C; 2.000 UI de vitamina D3; 15 UI de vitamina E; 1,0 mg de
vitamina K3; 2,0 mg de vitamina B1; 6,0 mg de vitamina B2; 3,0 mg de vitamina B6; 9,0 mg de
vitamina B12; 1,0 mg de ácido fólico; 12,0 mg de ácido pantotênico; 0,5 mg de biotina; 500,0 mg
de colina; 20,0 mg de niacina; 9,0 mg de cobre; 40,0 mg de ferro; 0,7 mg de iodo; 90,0 mg de
manganês; 0,4 mg de selênio; 50,0 mg de zinco.
O consumo da ração pelos ratos Wistar de todos os grupos experimentais (grupos
Gc, G5-FU, Garg2%, Garg4%, Garg2%+5-FU, Garg4%+5-FU) serão determinados diariamente durante todo o
experimento. Para isto, a ração será pesada antes de ser colocada no comedouro dos ratos e,
após 24 horas, será pesado a sobra da ração no comedouro. Subtraindo-se o segundo peso do
primeiro peso, será o consumo médio diário de ração de cada grupo experimental de ratos
Wistar, que será dividido pelo número de ratos Wistar de cada grupo experimental, e assim, será
determinado o consumo diário médio de ração por rato Wistar de cada grupo experimental.
6.4 O quimioterápico
Será utilizado o quimioterápico 5-Fluorouracil (5-FU) por ser indicada para
tratamentos de vários tumores, dentre eles, estão os tumores de mama, cabeça e pescoço, anal,
estômago, cólon retal e alguns tipos de câncer de pele (LEOCÁDIO et al., 2015).
6.5 Colheita de sangue, eutanásia e colheita de tecido dos animais
As amostras de sangue dos ratos Wistar serão colhidas no final do período
experimental. Neste dia os ratos serão anestesiados por inalação de isofluorano até 1,5 V% por
meio de máscaras (MASSONE, 2008), e logo após, serão colhidas as amostras de sangue (0,5 a
1,0 mL) de todos os ratos por punção intracardíaca (PAIVA; MAFFILI; SANTOS, 2005) em tubos
à vácuo com heparina para posterior determinação do Ensaio do Cometa e Análise de Cariótipo.
Logo após a colheita de sangue dos ratos Wistar, o plano anestésico será
aprofundado e, esses animais serão eutanasiados por exsanguinação conforme preconizado por
Paiva et al. (2005). Logo após a eutanásia, realizará uma incisão na parede abdominal e colherá
os rins (direito e esquerdo), bexiga, fígado, estômago, intestino, pâncreas, pulmão, fêmur,
testículos, glândulas anexa do aparelho reprodutor, baço e timo dos ratos para serem analisados
em outros projetos de pesquisa.
3Supralab® produzido por Alisul, Rio Grande do Sul, Brasil.
13
6.6 Ensaio do Cometa
O ensaio de cometa permite a detecção de diferenças intercelulares no dano e
reparo de DNA, em qualquer população de célula eucariótica que pode ser obtida por uma
suspensão celular simples (SASAKI et al.,1997; KOSZ-VNENCHAK & ROKOSZ, 1997;
MITCHELMORE & CHIPMAN, 1998). A técnica requer pequenas amostras celulares (1-10.000
células) e os resultados podem ser obtidos em um único dia. Ostling & Johanson (1984) e
Olive et al. (1990) têm mostrado que a sensibilidade do ensaio de cometa em detectar danos
em células simples é comparável a outros métodos de avaliação, sendo usado na investigação
da genotoxicidade de vários agentes (SINGH et al., 1988, 1991; TICE et al., 1990; OLIVE et al.
1991, 1992; BETTI et al., 1993).
Preparo das lâminas
A solução agarose 1,5 % será fervida em frasco onde caiba a lâmina. As lâminas
serão mergulhadas, deixando a extremidade fosca de fora. Onde posteriormente serão escorridas
e deixadas secar à temperatura ambiente. A solução agarose “lowmelting” será fervida e
colocada em banho 37°C. Serão misturados 5 µl de sangue (coletado com heparina - liquemine)
com 75 µl de agarose “lowmelting”. Deixado na geladeira até solidificar. As lâminas serão
dispostas em cubeta de vidro vertical, já com a solução de lise gelada e protegida da luz (pelo
menos 1 h em sol. delise). Em seguida colocadas em cuba horizontal de eletroforese,o tampão de
eletroforese vertido sobre as lâminas, onde descansará por 20 min. Será iniciado a eletroforese:
25V e 300 mA por 15 min. As lâminas serão retiradas e neutralizadas com o tampão TRIS,
cobrindo as lâminas com este tampão. Lavadas2 vezes com água destilada. Secadas durante
1h30 a 2h00, a 37°C(ou Over Night). Em seguida, 10 min em solução fixadora. Lavadas3 vezes
com água destilada. Secadas durante 1h30 a 2h00, a 37°C (ou Over Night). As lâminas serão
hidratadas por 5 min com água destilada. Coradas por, aproximadamente, 15 min na solução de
coloração de fluoresceína a 37°C. Lavadas3 vezes com água destilada. Deixadas por 5 min em
solução “stop”. Novamente lavadas 3 vezes com água destilada e secadas à temperatura
ambiente. Serão observadas ao microscópio de fluorescência – e a classificação será aplicada de
acordo com a forma e tamanho da cauda. Figura 4. (DA SILVA, 2007)
14
Figura 4. Tabela para classificação das imagens das “células cometa” observadas (Adaptado de
Villela et al., 2006).
6.7 Análise de Cariótipo (metodologia do bandamento G)
Procedimentos
Culturas celulares: as culturas serão iniciadas a partir de amostras de linfócitos
de sangue periférico coletadas no momento da eutanásia,com a utilização de seringas
descartáveis heparinizadas. No fluxo laminar,cerca de 1 ml de cada amostra de sangue total será
utilizado para cultivo em 5 mL de meio de cultura (Earle 199), acrescidos de 1mL de soro fetal
bovino, 0,2 ml de fitohemaglutinina, sendo colocados em um frasco de cultura, que serão
mantidos em estufa a 37ºC por 72 horas. Ao completar 71 horas será adicionada1 gota de
colchicina 0,016%, sendo o frasco de cultura retornado para a estufa por 1 hora adicional.
Preparo citológico: as células cultivadas nos frascos serão transferidas para
um tubo de vidro e centrifugadas por 08 minutos a 1.200 rpm. Em seguida, será desprezado o
sobrenadante, deixando-se de 1,0 mL a 1,5 ml de material no tubo graduado. Após o
tratamento com solução hipotônica (KCl a 0,075M), serão realizados os tratamentos de rotina
no laboratório, e o pellet deverá ser utilizado no preparo das lâminas e o restante armazenado
em freezer para uso posterior.
Preparo e Coloração das Lâminas: As lâminas serão preparadas com 3 - 5
gotas do material depositadas sobre as lâminas; previamente limpas, desengorduradas e
mantidas em refrigerador. Após secagem ao ar livre, serão identificadas e armazenadas em
geladeira até a coloração.
Coloração por Bandamento G: serão utilizadas duas metodologias para
realização desta coloração:
a) Bandamento G com utilização da Tripsina:em que as lâminas previamente preparadas
serão tratadas em solução de tripsina 0,025% e rinse PBS a 37ºC de acordo com o tempo
de preparo das lâminas,seguido de desidratação em série de Etanol. Após secagem ao ar
livre, as lâminas serão coradas em solução Giemsa a 3% (diluída em PBS).
15
b) Bandamento G por coloração de Wrigth: as lâminas deverão ser coradas com o corante
Wrigth a 0,25% em Metanol diluído 1:2 em solução tampão fosfato pH 6,8, por cerca 5
minutos.
As lâminas serão submetidas à montagem com Permount (Baxter) para
observação posterior com o emprego de objetivas de imersão.
Análise de imagens: Deverão ser observadas 50 metáfases por grupos de
estudo. Será realizado um levantamento do tipo e frequência das anormalidades
cromossômicas observadas. As metáfases mais representativas para cada tipo de
anormalidade observada serão selecionadas, descritas em relação ao tipo de anormalidade
cromossômica e capturadas as suas imagens com a câmera digital acoplada ao M.O (VERMA
e BABU, 1995).
6.8 Destino dos resíduosGrupo A2
Carcaças, peças anatômicas, vísceras e outros resíduos provenientes de
animais submetidos a processos de experimentação com inoculação de
microrganismos, bem como suas forrações, e os cadáveres de animais suspeitos de
serem portadores de microrganismos de relevância epidemiológica e com risco de
disseminação, que foram submetidos ou não a estudo anátomo-patológico ou
confirmação diagnóstica.
Resíduos sólidosOs resíduos do grupo A2 são submetidos à incineração em forno crematório
e suas cinzas são enviadas a aterro sanitário.
Grupo BProdutos hormonais e produtos antimicrobianos, citostáticos,
antineoplásicos, imunossupressores, digitálicos, imunomoduladores, anti-retrovirais
(quando descartados por serviços de saúde), farmácias, drogarias e distribuidores de
medicamentos ou apreendidos e os resíduos e insumos farmacêuticos dos
medicamentos controlados pela Portaria MS 344/98 e suas atualizações.
Métodos de segregação e condicionamento dos resíduos do grupo B
16
A coleta dos resíduos químicos é feita mediante agendamento na Central de
Resíduos Campus II da Unoeste. O setor gerador deverá encaminhar juntamente com
os resíduos a “Ficha para Inventário de Resíduos” (portaria P4.262/2003 – CETESB).
Contudo, o processo de coleta deve começar nos laboratórios, com a
correta segregação, identificação e acondicionamento dos matérias e produtos a
serem descartados, conforme as orientações que seguem.
Os resíduos químicos são destinados a empresas de terceirização.
6.8 Análise estatística
Os dados serão avaliados quanto a distribuição normal pelo teste de Shapiro-
Wilk. Variáveis com distribuição paramétrica serão submetidas ao teste de Levene para
verificação do pressuposto de homocedasticidade e submetidas a Análise de Variância
(ANOVA) com contrastes pelo método de Tukey. Alternativamente, a comparação entre
grupos, para variáveis com distribuição não paramétrica, será realizada com o uso do teste de
Kruskall-Wallis, com contrastes pelo método de Dunn. Outras análises poderão ser
conduzidas, na dependência do comportamento dos dados. Será adotado 5% de valor de
significância para todas as comparações (FIELD, 2012).
O cálculo do número de animais (n) a serem empregados no projeto de
pesquisa foi baseado nas recomendações de Eng (2003) conforme descrito abaixo:
n= 1 + [2C*(s/d)2], onde
C é dependente dos valores escolhidos para a força ou poder do teste (1-β; chance de
encontrar uma diferença existente) e nível de significância (α; a chance de considerar
dois grupos diferentes quando eles não o são) considerando p<0,05, sendo o valor de
α é 0,05. s é o desvio padrão aceitável de acordo com a projeção do pesquisador e d é
a diferença esperada entre os grupos.
Para calcular o C, deve-se aplicar a fórmula:
C = (zα + zβ)2
Onde z corresponde a valores encontrados em livros de estatística que transcrevemos
na Tabela 1. É importante lembrar que para determinar o valor de zα deve-se dividir o
valor do intervalo de confiança por 2, por exemplo, para um intervalo de 0,95 o valor a
se procurar na tabela é 0,475 e a soma dos valores da linha (1,9) com o topo da
17
coluna (0,06) lhe fornecem um valor de z=1,96. Em experimentos na área da Ciência
Animal e Saúde, o poder do teste é comumente 90% para o qual o valor de zβ é 1,282
com nível de significância 0,05. Logo, o valor de C será de (1,96 + 1,282)2 = 10,51.
Considerando ainda um desvio máximo (s) de 0,2 (20%) e uma diferença
esperada entre os grupos (d) de 0,32 (32%), ao aplicarmos a fórmula
n = 1+[2*10,51*(0,2/0,32)2]
Resolvendo a equação acima, obtivemos um n de 9,21 animais, o que
arredondando-se para o próximo número inteiro será 10 animais por grupo. No
entanto, conforme os resultados que obtivemos em outros experimentos, que alguns
animais podem morrer após a quimioterapia, colocamos mais 2 animais, totalizando 12
Rattus novergicus linhagem Wistar/grupo experimental.
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