I-3 - Espectroscopia de FTIR e Fluorescencia_Grupo1_PL2

Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1:

Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Professor: Rodrigo Almeida

Objectivos

2 DQB-Licenciatura em Bioquímica

•Introdução à espectroscopia vibracional no infravermelho com

transformada de Fourier (FTIR):

•Aplicação à análise estrutural de proteínas.

•Introdução às medidas fluorimétricas:

•Espectros de excitação e emissão;

•Introdução à fluorescência de proteínas:

•O triptofano como composto modelo;

•Aplicação ao estudo da estrutura e dinâmica de proteínas em

solução;

FTIR (I)


• É um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a região

do infravermelho do espectro electromagnético da radiação emitida

pelas substâncias;

• Baseia-se no facto das ligações químicas dos compostos possuírem

frequências de vibração específicas, as quais correspondem a níveis

de energia da molécula (níveis vibracionais).

• As frequências de vibração dependem:

• da geometria molecular;

• das massas dos átomos.

FTIR (II)


• As ligações podem vibrar de seis modos:

• Se a molécula receber radiação eletromagnética com a mesma energia

de uma dessas vibrações, então a luz será absorvida.

Estiramento

Simétrico

Estiramento

Assimétrico

Tesoura Torção

Balanço Rotação

Procedimento (FTIR)


Pastilha com

mioglobina em KBr

Pastilha com

γ-globulina em KBr

Pastilha com KBr Branco

Espectros de FTIR – Análise

conformacional


KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

Determinação da

estrutura

secundária das

proteínas

Espectros de FTIR - Mioglobina


Banda Amida II

1542,78 cm-1 – 84,9% T

Banda Amida I

1656,56 cm-1 – 82,12% T

Banda Amida A

3301,55 cm-1 – 87,46% T

3311,19 cm-1 – 87,53% T

CO2

(interferente)

Análise estrutural - Mioglobina


KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary

Structures

Banda Amida I

1656,56 cm-1 – 82,12% T

Estrutura secundária

predominante: hélice α

Comparação com a literatura -

Mioglobina



Espectros de FTIR – γ-Globulina


Banda Amida I

1643,06 cm-1 – 21,89% T Banda Amida III

1238,08 cm-1 – 54,81% T

Banda Amida A

3288,05 cm-1 – 26,03% T

Banda Amida B

3085,56 cm-1 – 39,12% T

Banda Amida II

1536,99 cm-1 – 27,16% T

Análise estrutural - γ-Globulina


KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary

Structures

Banda Amida I

1643,06 cm-1 – 21,89% T

Estrutura secundária

predominante: folha β

Comparação com a literatura

- γ-Globulina



Espectroscopia de Fluorescência


Espectroscopia de Fluorescência: tipo de espectroscopia electromagnética

que analisa a fluorescência de uma amostra.

Ocorre devido à presença de moléculas aromáticas.

Moléculas no

estado excitado

Moléculas no

estado fundamental

Emissão de fotão

Principal fluoróforo das proteínas: indole dos resíduos de Trp

Aparelhos: Espectrofluorímetros

Trp

Indole

Procedimento (Fluorescência)


Triptofano em tampão

Triptofano em etanol

λ = 350 nm

λ = 295 nm

Triptofano - Emissão


0

10 000 000

20 000 000

30 000 000

40 000 000

50 000 000

310 330 350 370 390 410 430 450Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

Comprimento de onda (nm)

Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

310 330 350 370 390 410 430 450

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(no

rmalizad

o)


Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol

(Normalizado)

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

Triptofano - Excitação


-3E+08

-2E+08

-1E+08

0

100000000

200000000

250 260 270 280 290 300 310 320

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia


Espectro de Excitação do Triptofano em Tampão e em

Etanol

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

-3

-2

-1

0

1

250 260 270 280 290 300 310 320

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(no

rmalizad

o)


Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol

(Normalizado)

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

Pico de

Raman

Excitação VS Emissão do Triptofano


-3

-2

-1

0

1

250 260 270 280 290 300 310 320

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(no

rmalizad

o)


Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol

(Normalizado)

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

310 330 350 370 390 410 430 450

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(no

rmalizad

o)


Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol

(Normalizado)

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

Procedimento (Fluorescência)


Mioglobina comercial (nativa)

Mioglobina em hidrocloreto de

guanidina (desnaturada)

λ = 330 nm

λ = 295 nm

Mioglobina - Emissão


-10000000

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

310 330 350 370 390 410 430 450

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

Comprimento de Onda (nm)

Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)

Mio Desnaturada

Mio

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

310 330 350 370 390 410 430 450

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(No

rmalizad

a)



– Normalizado

Mio Desnaturada

Mio

Mioglobina - Excitação


-5 000 000

0

5 000 000

10 000 000

15 000 000

20 000 000

25 000 000

30 000 000

250 260 270 280 290 300 310 320

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia


Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada)

Mio Desnaturada

Mio

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

250 260 270 280 290 300 310

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(No

rmalizad

a)



– Normalizado

Mio Desnaturada

Mio

Excitação VS Emissão Mioglobina


-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

250 260 270 280 290 300 310

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(No

rmalizad

a)



– Normalizado

Mio Desnaturada

Mio

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

310 330 350 370 390 410 430 450Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(No

rmalizad

a)



– Normalizado

Mio Desnaturada

Mio

Emissão Mioglobina VS Triptofano


-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

310 330 350 370 390 410 430 450

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(No

rmalizad

a)



– Normalizado

Mio Desnaturada

Mio

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

250 260 270 280 290 300 310 320

Inte

nsi

dad

e d

e F

luo

resc

ên

cia

(no

rmalizad

o)


Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol

(Normalizado)

Trp. Em Tampão

Trp. Em Etanol

Procedimento (Intensidade de

Fluorescência em função do pH)


Soluções de mioglobina

(pH 3 – 8)

Medição da intensidade de

fluorescência

λem = 330 nm

λext = 295 nm

Medição do pH


Intensidade de Fluorescência

em função do pH

Proteína: Mb comercial



em função do pH



em função do pH

Trp

His



em função do pH

Trp

His

Gráfico fornecido pela PL 3, cuja solução de Mb comercial foi filtrada.



em função do pH

Trp

His

Irace G, Balestrieri C, Parlato G, Servillo L, Colonna G. Biochemistry. 1981; 792-799



em função do pH

Espectro de emissão da Mb de coração de cavalo a pH 7,2

(curva de baixo) e a pH 4,5 (curva de cima).

Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-19237

Conclusão


Fluorescência

espectros de excitação e de emissão das amostras

intensidade de fluorescência da amostra

FTIR

espectro infravermelho da amostra

estrutura secundária da proteína

Espectroscopia de Fluorescência vs FTIR

Referências


• Atkins PW, de Paula J. “Physical Chemistry for the Life Sciences”. 2006.

Freeman/Oxford;

• Jilie KONG et al.” Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis

of Protein Secondary Structures”. Institute of Biochemistry and Cell Biology,

SIBS, CAS. China, 2007;

• Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-

19237;

• Warren Gallagher. “FTIR Analysis of Protein Structure”;

• Lakowicz JR. “Principles of Fluorescence Spectroscopy.” 2006. 3rd edition.

Springer, NY.

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I-3 - Espectroscopia de FTIR e Fluorescencia_Grupo1_PL2