IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCÍPIOS ATIVOS PRESENTES NO … · pela constante contribuição no tratamento e manutenção do bem estar dos animais. À “equipe do Mandacaru” - Cássio,

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCÍPIOS ATIVOS PRESENTES

NO EXTRATO ETANÓLICO DE Cereus jamacaru E

AVALIAÇÃO EM RATOS DOS POSSÍVEIS EFEITOS

TÓXICOS E/OU COMPORTAMENTAIS DA EXPOSIÇÃO

PROLONGADA

IRIS UCELLA DE MEDEIROS

NATAL

2011

1

IRIS UCELLA DE MEDEIROS

IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCÍPIOS ATIVOS PRESENTES NO

EXTRATO ETANÓLICO DO Cereus jamacaru E AVALIAÇÃO EM

RATOS DOS POSSÍVEIS EFEITOS TÓXICOS E/OU

COMPORTAMENTAIS DA EXPOSIÇÃO PROLONGADA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da UFRN, para obtenção

do título de MESTRE

Orientadora:

Profª. Drª. Aline Schwarz

NATAL

2011

2

CATALOGAÇÃO NA FONTE

M488i Medeiros, Iris Ucella de.

Identificação dos princípios ativos presentes no extrato

etanólico de cereus jamacaru e avaliação em ratos dos possíveis

efeitos tóxicos e/ou comportamentais da exposição prolongada /

Iris Ucella de Medeiros. – Natal, 2011.

124f.: Il.

Orientadora: Profª. Drª. Aline Schwarz.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Cereus jamacaru DC – Dissertação. 2. Cactaceae –

Dissertação. 3. Alcalóides – Dissertação. 4. Toxicidade –

Dissertação. I. Schwarz, Aline. II. Título.

RN-UF/BS-CCS CDU: 582.661.56(043.3)

3

RESUMO

O cacto Cereus jamacaru Mill. (Cactaceae) é uma espécie típica da vegetação

da caatinga. Sabe-se que os seus cladódios contém os alcalóides tiramina e 2-

hidroxifeniletilamina, compostos ativos que podem atuar no sistema nervoso

central, mimetizando a ação da dopamina. Como essa espécie vegetal é

bastante utilizada na medicina popular, e não há na literatura científica

nenhuma informação sobre os seus efeitos em espécies animais, maiores

estudos são relevantes e necessários. No presente trabalho a análise

fitoquímica (LC-MS/MS) identificou os alcalóides D-tiramina (m/z 137,2),

hordenina (m/z 165,2), N-metiltiramina (m/z 151) e ainda o aminoácido D-

tirosina (m/z 181.2), precursor de diversos alcalóides nos extratos etanólico e

aquoso obtidos de cladódios de C. jamacaru. Os efeitos tóxicos e/ou

comportamentais do extrato etanólico nas doses de 210 e 420 mg/kg/dia,

correspondentes respectivamente a 14 g e 28 g do pó da planta seca/kg/dia,

foram investigados, em ratos. Os animais foram tratados durante trinta dias,

por gavagem, quando então foram submetidos a testes para avaliação da

atividade geral (campo aberto), do aprendizado e memória (labirinto em cruz

elevado modificado), do comportamento estereotipado induzido pelo

femproporex e da catatonia induzida pelo haloperidol. Além disso, os

parâmetros de toxicidade (ganho de peso, consumo de ração e ingestão

hídrica), enzimas hepáticas (ALT e AST), ureia e creatinina e histopatologia da

adrenal, baço, coração, fígado, pâncreas e rim foram analisados. Os

resultados mostraram diferenças no consumo de ração e ingestão hídrica

pelos ratos machos e fêmeas experimentais, com conseqüente diminuição do

ganho de peso. O tratamento por 30 dias com a dose de 420 mg/kg/dia

provocou aumento nas concentrações de uréia e ALT dos machos e

diminuição na concentração do AST das fêmeas, porém a razão AST/ALT

desses animais não foi estatisticamente diferente da razão dos animais do

grupo controle, sugerindo ausência de hepatotoxicidade. O estudo

histopatológico não revelou nenhuma alteração digna de nota nos diversos

órgãos analisados. No campo aberto, tanto os machos como as fêmeas

experimentais, apresentaram atividade geral diminuída em relação ao grupo

4

controle. No labirinto em cruz elevado modificado observou-se uma tendência

(dados não significantes estatisticamente) de melhoria da

memória/aprendizado nos grupos experimentais de machos e fêmeas em

relação aos animais controle. No teste da catatonia, os machos experimentais

tratados com a dose de 210 mg/kg/dia foram mais resistentes à ação do

haloperidol, mostrando-se menos catatônicos que os demais grupos. Nenhuma

alteração foi observada nas fêmeas experimentais. Não foi observada

alteração alguma no comportamento estereotipado dos animais experimentais

machos e fêmeas. Esses resultados sugerem que a exposição de ratos ao

extrato etanólico de C. jamacaru produz efeitos tóxicos e afeta os parâmetros

comportamentais avaliados em ratos machos e fêmeas de maneiras diferentes.

Possível proteção estrogênica e/ou diferenças na ação de enzimas

biotransformadoras podem explicar tais resultados.

Palavras-chaves: Cereus jamacaru DC, Cactaceae, alcalóides, toxicidade.

5

Podia ser um dia qualquer da rotina de uma graduanda. Porém, aquele

dia do primeiro semestre de 2006 guardava algo mais precioso do que

qualquer evento do cotidiano.

Estava voltando para a faculdade, depois de ter o meu primeiro filho. A

aula era de Toxicologia e a professora era novata: Aline Schwarz. Lembro uma

espécie de alvoroço entre os colegas para entrar no grupo de pesquisa dela e,

por isso, me interessei em procurá-la. Naquele semestre, ela já estava ocupada

demais para acolher outro aluno. Contudo, sempre muito atenciosa, me pediu

para que a procurasse num outro momento.

No primeiro semestre de 2007, começou a me orientar no

desenvolvimento do meu Trabalho de Conclusão de Curso (TCC). Aline foi

sempre muito prestativa em todas as etapas que envolveram o trabalho,

fazendo com que eu me sentisse acolhida.

Em outubro de 2008, antes mesmo de ter defendido o TCC, ela me

convidou para ser sua aluna de mestrado. Tentar a seleção do mestrado

naquele momento não estava nos meus planos, mas a oferta era muito

tentadora.

Consegui a aprovação na seleção e iniciei os experimentos em 2009. No

meio do ano descobri que estava grávida. Com paciência e dedicação, fui

muito bem orientada por Aline, que sempre estava me encorajando e

elogiando, e também apontando minhas falhas, quando necessário.

O ano de 2010 chegou com um bebê na minha casa. Novamente recebi

todo o apoio da Professora, que permitiu que eu exercesse a maternidade da

forma como deve ser, e, com toda sutileza e firmeza, conseguiu me puxar de

volta. A conversa que tivemos está marcada, da forma mais genuína possível,

em meu coração.

Essa dissertação ficaria sem propósito se eu não dedicasse ela a você,

querida Professora Aline Schwarz. Ela sequer existiria sem o seu voto de

confiança! Espero, de coração, ter sido merecedora. Saiba que você é um

grande exemplo de mulher, mãe, profissional e amiga. Todos que a rodeiam

são privilegiados pela sua companhia, alegria e positivismo.

Para você, Aline, toda a minha gratidão e... Vamos ao Doutorado!

6

And in the end, the love you take

Is equal to the love you make

John Lennon e Paul McCartney

7

Agradecimentos

Aos meus Pais e irmãos, pelo apoio em todas as etapas da minha vida.

Pelo amor dado sem cobrar nada em troca.

Ao meu marido Thiago, por todo o incentivo, encorajamento e força. Parte

de tudo o que aconteceu nesses dois anos é mérito seu!

Aos meus filhos Yuri e Caio, que sempre me confortam com um sorriso

sincero e me dão forças para seguir em frente, dando sempre o melhor de mim.

Amo vocês!

À Professora Tereza Dantas, Aparecida, Alexandro, João Felipe, Raul,

Fernando, Paulo, Caio e Ciro, pela ajuda valiosa em etapas importantes deste

trabalho.

À Ana e Washington do Biotério Central do Centro de Ciências da Saúde,

pela constante contribuição no tratamento e manutenção do bem estar dos

animais.

À “equipe do Mandacaru” - Cássio, Mourão, Priscila, Andressa e Luís -

pelo precioso auxílio durante todos os experimentos.

Ao meu amigo Léo, pela atenção fraternal, suporte e disposição em todos

os momentos desse mestrado. Você é muito especial!

Ao Professor Sócrates e à equipe do Laboratório de Sistemas Dispersos,

especialmente ao Henrique, pela ajuda na liofilização dos extratos.

Aos companheiros pós-graduandos, por dividirem com bom humor a

rotina cansativa de experimentos e disciplinas.

A todos os meus familiares, em especial à minha cunhada Clarissa, pela

inspiração em seguir em frente na carreira acadêmica.

Ao CNPQ, pelo apoio financeiro que permitiu a realização deste trabalho.

A todos que participaram de alguma forma desta inesquecível etapa da

minha vida.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ---------------------------------------------------------------- 17 2. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 25

2.1 Objetivo geral ------------------------------------------------------------- 25 2.2 Objetivos específicos --------------------------------------------------- 25

3. MATERIAIS -------------------------------------------------------------------- 26 3.1 Equipamentos ------------------------------------------------------------ 26 3.2 Reagentes ----------------------------------------------------------------- 27 3.3 Fármacos ------------------------------------------------------------------ 27 3.4 Vidrarias ------------------------------------------------------------------- 28 3.5 Materiais diversos ------------------------------------------------------- 28

4. PROCEDIMENTOS ---------------------------------------------------------- 30

4.1 Material vegetal ---------------------------------------------------------- 30 4.2 Obtenção do extrato etanólico de Cereus jamacaru ----------- 30 4.3 Análise fitoquímica ------------------------------------------------------ 33 4.3.1 Preparação dos extratos para a análise ------------------------ 33 4.3.2 Estudo fitoquímico ---------------------------------------------------- 33 4.4 Animais --------------------------------------------------------------------- 34 4.5 Administração do extrato etanólico de Cereus jamacaru em

ratos ---------------------------------------------------------------------------------

35 4.6 Coleta de sangue para as dosagens bioquímicas -------------- 37 4.7 Coleta de material para estudo histopatológico ----------------- 37 4.8 Avaliação neurocomportamental ------------------------------------ 37

4.8.1 Medida da atividade geral em campo aberto ------------- 37 4.8.2 Estudo da capacidade de aprendizado e memória ----- 39 4.8.3 Medida do comportamento estereotipado (C.E.) -------- 40 4.8.4 Medida da catatonia induzida por haloperidol ------------ 42

4.9 Análise estatística ------------------------------------------------------- 43

5. RESULTADOS ---------------------------------------------------------------- 44 5.1 Análise fitoquímica ------------------------------------------------------ 44 5.2 Avaliação da toxicidade nos ratos machos ----------------------- 49 5.3 Avaliação da toxicidade nas ratas fêmeas ------------------------ 56 5.4 Análise das dosagens bioquímicas dos machos ---------------- 63 5.5 Análise das dosagens bioquímicas das fêmeas ----------------- 66 5.6 Cálculo das razões peso órgão/peso corporal dos ratos

machos e fêmeas ----------------------------------------------------------------

69 5.7 Estudo histopatológico ------------------------------------------------- 72 5.8 Avaliação neurocomportamental dos machos ------------------- 76 5.9 Avaliação neurocomportamental das fêmeas -------------------- 89

6. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------- 101 7. CONCLUSÃO ----------------------------------------------------------------- 111 8. REFERÊNCIAS ---------------------------------------------------------------

112

9. APÊNDICES ------------------------------------------------------------------- 122

LISTA DE TABELAS Página

Tabela 1 - Protocolo experimental para a avaliação em ratos dos possíveis efeitos tóxicos e/ou comportamentais da exposição prolongada do extrato etanólico de C. jamacaru

36

Tabela 2 - Escores atribuídos por SETLER et al (1976) para mensurar o comportamento estereotipado

41

Tabela 3 - Constituintes químicos detectados por LC-MS/MS nos extratos etanólico e aquoso de C. jamacaru

47

Tabela 4 - Consumo de ração (g) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

50

Tabela 5 - Ingestão hídrica (mL) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

52

Tabela 6 - Ganho de peso (g) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

54

Tabela 7 - Consumo de ração (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

57

Tabela 8 - Ingestão hídrica (mL) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

59

Tabela 9 - Ganho de peso (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

61

Tabela 10 - Parâmetros bioquímicos mensurados no soro dos ratos machos tratados ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

64

Tabela 11 - Parâmetros bioquímicos mensurados no soro das ratas fêmeas tratadas ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

67

Tabela 12 - Razão peso órgão / peso corporal dos órgãos coletados para o estudo histopatológico dos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

70

Tabela 13 - Razão peso órgão / peso corporal dos órgãos coletados para o estudo histopatológico das ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

71

Tabela 14 - Parâmetros analisados no teste do campo aberto nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

78

Tabela 15 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as sessões treino e teste

80

Tabela 16 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante a sessão teste para a avaliação da memória e do aprendizado

82

Tabela 17 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de cloridrato de femproporex de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

83

Tabela 18 - Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

86

Tabela 19 - Parâmetros analisados no teste do campo aberto nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

91

Tabela 20 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as sessões treino e teste

93

Tabela 21 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante a sessão teste para a avaliação da memória e do aprendizado

95

Tabela 22 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de cloridrato de femproporex de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

96

Tabela 23 - Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

99

LISTA DE FIGURAS Página

Figura 1 - Cereus jamacaru De Candolle com detalhe do fruto em corte transversal

19

Figura 2 - Múltiplos usos de Cereus jamacaru na medicina popular 21 Figura 3 - Alcalóides feniletilamínicos encontrados em cactos 22 Figura 4 - Esquema da biossíntese dos alcalóides derivados da tirosina

23

Figura 5 - Marcha analítica para a obtenção do extrato etanólico de Cereus jamacaru

31

Figura 6 - Campo aberto utilizado para a observação da atividade geral individual por 5 minutos de ratos

39

Figura 7 - Comportamento estereotipado induzido por femproporex 41 Figura 8 - Catatonia induzida por haloperidol 42 Figura 9 - Cromatogramas obtidos por LC-MS/MS após análise do extrato etanólico de C. jamacaru

45

Figura 10 - Cromatogramas obtidos por LC-MS/MS após análise do extrato aquoso de C. jamacaru

46

Figura 11 - Consumo de ração (g) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

51

Figura 12 - Ingestão hídrica (mL) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

53

Figura 13 - Ganho de peso (g) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

55

Figura 14 - Consumo de ração (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

58

Figura 15 - Ingestão hídrica (mL) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

60

Figura 16 - Ganho de peso (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

62

Figura 17 - Parâmetros bioquímicos mensurados no soro dos ratos machos tratados ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

65

Figura 18 - Parâmetros bioquímicos mensurados no soro das ratas fêmeas tratadas ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

68

Figura 19 - Corte histológico (20x) de adrenal e baço de rato controle e ratos experimentais tratados com extrato etanólico de C. jamacaru, nas concentrações de 210 e 420 mg/kg/dia

73

Figura 20 - Corte histológico (40x) de coração e fígado de rato controle e ratos experimentais tratados com extrato etanólico de C. jamacaru, nas concentrações de 210 e 420 mg/kg/dia

74

Figura 21 - Corte histológico (20x) de pâncreas e rim de rato controle e ratos experimentais tratados com extrato etanólico de C. jamacaru, nas concentrações de 210 e 420 mg/kg/dia

75

Figura 22 – Parâmetros analisados no teste do campo aberto nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

79

Figura 23 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as sessões treino e teste para avaliação da memória e aprendizado

81

Figura 24 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de cloridrato de cloridrato de femproporex de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

85

Figura 25 - Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

88

Figura 26 - Parâmetros analisados no teste do campo aberto nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

92

Figura 27 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado realizado nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as sessões treino e teste para avaliação da memória e aprendizado

94

Figura 28 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de cloridrato de cloridrato de femproporex das ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

98

Figura 29 - Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias

100

LISTA DE QUADROS Página

Quadro 1 - Diluição do extrato bruto de C. jamacaru 32 Quadro 2 - Condições da corrida cromatográfica: Sistema solvente, modo gradiente

34

Quadro 3 - Parâmetros do espectrômetro de massas 34

17

1. INTRODUÇÃO

As Cactáceas são dicotiledôneas suculentas de diversos hábitos, podendo ser

árvores, arbustos, trepadeiras, epífitas ou geófitas. Possuem cladódios (talos) que

variam dos tipos colunares, roliços, globulares, tuberculados, em forma de

costeletas, asas ou achatados, geralmente segmentados sem folhas e com

espinhos. A família é composta de cem gêneros e 1500 espécies, distribuídas quase

exclusivamente nas regiões secas das Américas (BARTHLOTT; HUNT, 1993).

Essa família é comumente encontrada na caatinga, predominante do semi-

árido, de clima quente e seco que, junto ao relevo e ao embasamento geológico,

determina a configuração da cobertura vegetal (ALVES; PINHEIRO, 2007) e,

constitui juntamente com as famílias Fabaceae, Convolvulaceae, Euphorbiaceae e

Malvaceae, as mais representativas em número de espécies nas áreas de caatinga

espinhosa (SANTOS; MELO, 2010).

As cactáceas são vegetais amplamente utilizados na medicina tradicional por

curandeiros e tribos indígenas no México, como analgésicos, antibióticos, diuréticos,

para tratar problemas intestinais, tosses, afecções cardíacas e nervosas; curar

alguns tipos de úlceras e para controlar o diabetes e o colesterol (HOLLIS;

SHEINVAR, 1995; ANDRADE et al., 2006).

A família Cactaceae está dividida em três subfamílias: Opuntioideae – que

apresenta espécies do tipo árvore ou arbusto, com folhas, divididas em cinco

gêneros; Pereskioideae – representada pelos gêneros Pereskia e Maihuenia;

Cactoideae – a mais numerosa com 91 gêneros, geralmente árvores sem folhas ou

com vestígios de folhas. As espécies da subfamília Pereskioideae apresentam

hastes não suculentas, folhas grandes, aréolas axilares com espinhos. Na subfamília

Opuntioideae há hastes e folhas suculentas e aréolas axilares com espinhos. As

Cactoideae não têm folhas, possuem hastes suculentas com aréolas bem

desenvolvidas (BARTHLOTT; HUNT, 1993).

18

O Gênero Cereus sp. pertence à subfamília Cactoideae e grupo Cereoideae.

Compreende plantas tipo árvore ou arbusto de cladódios (talos) eretos e significa,

tanto em grego quanto em latim, “tocha”, provavelmente devido ao formato de

candelabro do primeiro cacto conhecido. O Gênero Cereus foi primeiramente

descrito por Hermann, em 1698 e depois por Miller em 1754, e inclui novecentas

espécies publicadas. Em 1909, Riccobono dividiu o gênero e criou a denominação

Piptanthocereus, hoje com 24 espécies. Estas espécies possuem flores, frutos e

espinhos semelhantes e estão presentes desde as Índias até a América do Sul

(BRITTON; ROSE, 1920).

O cacto Cereus jamacaru De Candolle (Figura 1) é uma espécie típica da

vegetação da Caatinga, que possui duas subespécies: jamacaru, que possui larga

distribuição no território brasileiro, principalmente nos estados da região nordeste, e

calcirupicola, que ocorre somente no estado de Minas Gerais (ANDERSON, 2001;

MEIADO et al., 2010). Possui os seguintes sinônimos científicos: Cereus glaucus

Salm-Dyck, Cereus laetevirens Salm-Dick, Cereus lividus Pfeiffer, Cactus jamacaru

Kosteletzky, Cereus horribarbis Otto in Salm-Dick, Cereus cauchinii Rebut in

Schumann, Piptanthocereus jamacaru Riccobono, Piptanthocereus jamacaru

cyaneus Riccobono e Piptanthocereus jamacaru glaucus Riccobono (BRITTON;

ROSE, 1920). Dentre os nomes vulgares mais comuns estão: mandacaru,

mandacaru-de-boi, manacaru, nhamandacaru, cardeiro, cardeiro-rajado, facheiro,

arumbeva e tuna. Do tupi “iamandaka-ru” – feixe de espinhos ou espinheiro

(SCHEINVAR, 1985).

Conhecido popularmente como Mandacaru, este cacto de porte arbóreo resiste

a longos períodos de seca e sempre cresce e frutifica. Pode chegar a dez metros de

altura, possui tronco lenhoso, fornecendo madeira de até trinta centímetros de

largura e muitas hastes eretas, formando topo compacto (BARBOSA, 1997). As

hastes novas são azuladas e possuem de quatro a seis costelas de ápices obtusos,

separados por sulcos profundos. Quando em áreas abertas podem apresentar-se

apenas com uma única haste. As aréolas são circulares distantes de dois a cinco

centímetros entre si, sendo maiores no tronco principal. Os espinhos são radiais,

podem ter de nove a trinta centímetros de comprimento, sendo os centrais maiores;

podem ter coloração amarela, avermelhada ou marrom (BRITTON; ROSE, 1920;

SCHEINVAR, 1985). As flores são solitárias, noturnas, laterais a subapicais,

19

brancas, de vinte a trinta centímetros de comprimento. O pericarpelo é cilíndrico, de

dois centímetros de comprimento, 1,6 centímetros de diâmetro, verde claro brilhante,

recoberto de escamas largas e oblongas de cor verde escura. O tubo receptacular

tem doze a catorze centímetros de comprimento, é estriado, possui bordos inteiros,

alcança até doze centímetros de comprimento, verde na base e marrom

avermelhado na parte superior (SCHEINVAR, 1985; LIMA, 1996; ANDERSON,

2001; MEIADO et al., 2010). Os frutos são elipsóides, de cinco a doze centímetros

de comprimento e sete a doze centímetros de diâmetro, alaranjado ou vermelho-

claro, com pericarpo de aproximadamente três centímetros de espessura, polpa

branca, aroma suave, comestível, doce (SCHEINVAR, 1985; ANDERSON 2001,

MEIADO et al., 2010). Por serem bastante atrativos em cor e sabor, os frutos são

consumidos in natura pela população. BARBOSA et al. (2007), em um estudo sobre

avaliação da composição química do fruto do mandacaru, apontam que o mesmo é

uma alternativa alimentar humana saudável do ponto de vista nutricional.

20

FIGURA 1 – Cereus jamacaru De Candolle (detalhe do fruto em corte transversal)

FONTE: Foto do próprio autor.

21

A espécie C. jamacaru é utilizada como forragem, como planta ornamental e na

medicina popular (ANDRADE et al., 2006). Devido às incertezas climáticas e o

fenômeno das secas periódicas que ocorrem no Nordeste do Brasil, as cactáceas,

graças às suas características fisiológicas de economia e uso de água, representam

uma fonte de água e uma alternativa alimentar. Para a região do semi-árido

nordestino. A presença de uma reserva de cactáceas durante períodos de seca

pode ser considerada como um “banco de água” e pode representar a diferença

entre a vida e os elevados índices de mortalidade registrados durante a ocorrência

de secas (RANGEL et al., 2009). Em épocas de estiagem são queimados os

espinhos para que as hastes de mandacaru sejam utilizadas como alimento para

bovinos, caprinos e ovinos (BRAGA, 1976).

Na medicina popular as raízes de C. jamacaru em infusão com pouco volume

de água são empregadas como diuréticas e no tratamento das afecções renais,

onde a ingestão da infusão substitui a ingestão de água até o desaparecimento dos

sintomas (AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007). Possui propriedade

emenagoga, anticonstipante, anti-hipertensiva, anti-reumática e antiemética.

Também há relatos da utilização desta espécie no tratamento de problemas uretrais,

sífilis, dores na coluna cervical, sendo indicado também no controle de albuminúria,

diabetes, no tratamento de pedras vesiculares, de afecções do aparelho respiratório

como tosses e bronquites, além de úlceras e no combate do escorbuto

(SCHEINVAR, 1985; ALBUQUERQUE et al., 2007; GUEDES et al., 2009). Mota

(1997) pesquisando dois grupos indígenas (Shokó, em Sergipe e Kariri-Shokó, em

Alagoas) cita a associação em forma de chá, de C. jamacaru com as leguminosas

Senna uniflora e Senna obtusifolia, para tratamento de febre, e o uso do cladódio

para problemas intestinais. Assim C. jamacaru possui uma ampla utilização em

diversas enfermidades, como ilustrado na Figura 2.

22

FIGURA 2 – Múltiplos usos de Cereus jamacaru na medicina popular. Adaptado de

ANDRADE et al., 2006.

A grande utilização dessa espécie vegetal, tanto na medicina popular, como na

alimentação da população e rebanhos torna relevante maiores estudos, já que a

caracterização do potencial medicinal, nutricional e tóxica de C. jamacaru é pouco

elucidada (DAVET, 2005).

Sabe-se que nos cactos, de uma maneira geral, são frequentemente

encontrados alcalóides, principalmente a tiramina, hordenina e lofoforina (Figura 3).

Algumas espécies possuem uma quantidade suficiente para afetar a fisiologia

humana, como é o caso do Lophophora williamsii, conhecido popularmente como

“peiote”, que possui mais de cinqüenta e cinco alcalóides, dentre os quais estão a

mescalina, lofoforina, analodina, analonidina, analonina, hordenina e pelotina

23

(Biblioteca digital de la medicina tradicional mexicana, acesso em 28/10/2009). Num

“screening” cromatográfico de plantas do gênero Pereskia, da família Cactaceae (P.

aculeata, P. autumnalis, P. corrugata, P. cubensis, P. godseffi ana, P. grandifolia, P.

grandifl ora, P. scandens, P. pititache e P. tampicana) foi detectada a presença de

alcalóides como mescalina e outras β-feniletilaminas (TURRA et al., 2007). Foram

isolados dois alcalóides - indicaxantina e neobetanina - em Opuntia ficus-indica var.

saboten Makino (Cactaceae) (SALEEM et al., 2006). STARHA (1996; 1999)

observou, por cromatografia gasosa (GC) e cromatografia gasosa acoplada ao

espectrômetro de massas (GC-MS) traços de tiramina, N-metiltiramina, hordenina,

mescalina, N-metilmesealine, analinina, analidina, analamina, analonidina, pelotina,

analonina, lofoforina em espécies dos gêneros Gymnocalycium e Turbinicarpus

(Cactaceae).

FIGURA 3 - Alcalóides feniletilamínicos encontrados em cactos. Tiramina (1),

Hordenina (2). Lofoforina (3). FONTE: DAVET, 2005.

(1) (2)

(3)

23

Em análises preliminares, DAVET (2005) comprovou que cladódios de C.

jamacaru são ricos em alcalóides, corroborando com o indicado pela literatura sobre

cactáceas. DAVET et al. (2009) confirmaram por cromatografia líquida de alta

eficiência acoplada a detector ultra-violeta (CLAE-UV) a presença de hordenina e

tiramina nas amostras. Alguns estudos revelaram taninos e flavonóides em C.

jamacaru (TAWFIK et al., 1978; ZAPATA et al., 2003; DAVET, 2005; NDHLALA et

al., 2007). É sabido que componentes fenólicos, especialmente taninos e

flavonóides, possuem atividade terapêutica, com propriedades antiinflamatória,

antifúngica e antioxidante (SANTOS; MELLO, 2004; ZUANAZZI; MONTANHA,

2004). No entanto, ARAÚJO et al. (2008), num estudo sobre a presença e

quantificação de taninos e flavonóides em plantas da Caatinga utilizadas na

medicina popular, mostraram que apesar de C. jamacaru ser uma planta muito

citada pela população por suas propriedades terapêuticas, não apresenta

quantidades importantes de taninos e flavonóides, sendo C. jamacaru uma das vinte

e oito espécies estudadas com menor conteúdo de taninos.

A tiramina é o primeiro alcalóide derivado da tirosina, sendo formada por

descarboxilação (Figura 4). A hordenina é resultado da metilação da tiramina; a

mescalina é derivada da dopamina obtida a partir da tirosina (MANN, 1987). Os

alcalóides encontrados em C. jamacaru são os feniletilamínicos, derivados da

tirosina (DAVET, 2005).

(1)

24

FIGURA 4 - Esquema da biossíntese dos alcalóides derivados da tirosina FONTE:

DAVET, 2005.

A tiramina e aminas relacionadas agem de forma indireta, modificando o

acúmulo e a liberação de norepinefrina nas terminações nervosas. Estas aminas

permitem que a norepinefrina interaja com seus receptores, pois retiram o

neurotransmissor das áreas de reserva nas vesículas sinápticas ou de locais de

ligação extravesicular (HOFFMAN; TAYLOR, 2005). A tiramina não possui usos

clínicos específicos e está presente em vários alimentos. Em situações normais é

destruída pela mono-amino oxidase (MAO) no intestino, não conseguindo atingir o

cérebro. As ações periféricas das aminas simpatomiméticas são semelhantes às da

noradrenalina, como broncodilatação, aumento da pressão arterial e aumento da

força de contração do miocárdio. Doses repetidas de tiramina (assim como ocorre

com as anfetaminas) produzem respostas gradualmente menores provavelmente por

depleção da noradrenalina de reserva (RANG et al., 2003).

Diante do que foi exposto sobre o cacto C. jamacaru, seu emprego bem

estabelecido na medicina popular e considerando que essa espécie possa

apresentar alcalóides feniletilamínicos como a tiramina e hordenina, que podem

atuar como agonistas das catecolaminas cerebrais dopamina e noradrenalina,

podendo promover alterações neurocomportamentais importantes no ser humano, é

relevante e necessário maiores estudos. Assim o presente estudo tem como objetivo

elucidar os efeitos tóxicos e comportamentais em ratos tratados por 30 dias com o

extrato etanólico bruto, obtido a partir da maceração de cladódios secos e moídos. O

estudo prolongado, de avaliação subcrônica, mostra-se pertinente, pois é possível

que ocorra o uso prolongado da planta, na forma de suco, decocto ou infuso, como

fitoterápico. Além disso, mostra-se importante também, pelo fato da espécie vegetal

ser administrada por tempo prolongado a animais como alimento.

25

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Identificar os princípios ativos presentes no extrato etanólico de cladódios de

Cereus jamacaru coletado em Natal – RN e estudar os possíveis efeitos tóxicos e/ou

comportamentais em ratos tratados por 30 dias com esse extrato.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Fazer a análise fitoquímica (LC-MS) do extrato etanólico de C. jamacaru;

Avaliar:

a toxicidade geral do extrato nos animais experimentais através da

observação diária do consumo de ração, ingestão hídrica, peso e ganho de

peso durante o período de tratamento;

a toxicidade hepática a partir das dosagens das enzimas AST e ALT no

soro dos ratos;

a toxicidade renal a partir das dosagens de creatinina e ureia no soro dos

ratos;

possíveis alterações histopatológicas na adrenal, baço, coração fígado,

pâncreas e rins dos animais;

a atividade geral de ratos no campo aberto;

o aprendizado e memória, com o emprego do labirinto em cruz elevado

modificado;

o comportamento estereotipado de ratos empregando o agonista

dopaminérgico femproporex;

a catatonia nos animais empregando o antagonista dopaminérgico

haloperidol.

26

3. MATERIAIS

3.1 EQUIPAMENTOS

Balança de precisão BEL Engineering, modelo M203;

Balança analítica OHAUS, modelo C305-S;

Banho de água Fisatom, modelo 802;

Banho de água GRANT, modelo Y28;

Bomba de vácuo hidráulica CIENTEC, modelo 618;

Campo aberto (arena de madeira, suspensa 50 cm do solo, pintada de

branco com 95,4 cm de diâmetro x 29,0 cm de altura subdividida por três círculos

concêntricos e 16 segmentos de reta de modo a apresentar 25 divisões);

Centrífuga Quimis, modelo 002 22 T216;

Centrífuga SIGMA, modelo 2-3;

Coluna de HPLC: Agilent Eclipse Plus C18 (RP18) 4,6*50mm 5µm;

Destilador de água Milli-Q (Millipore);

Espectrômetro de massas (MSMS), marca Applied Biosystem;

Estufa de ar circulante Hydrosan, modelo HY 480 SA;

Estufa de ar circulante Nova Ética, modelo 420/D;

HPLC Agilent, modelo 1200;

Labirinto em cruz elevado modificado (suspenso 50 cm do solo, construído

em madeira e pintado de branco, constituído por dois braços abertos opostos de 50

x 10 cm e dois braços fechados opostos de 50 x 10 x 40 cm dispostos em ângulo de

90º, onde um dos braços contém uma lâmpada elétrica);

Liofilizador (Christ, alpha 1-2);

Liquidificador (Arno®);

Pré coluna: Agilent Guard Column Eclipse XDB-C8 2.1x12.5,5µm;

Rotaevaporador Fisatom, modelo 802;

Sistema de análise bioquímica, BAYER, modelo RA-50.

27

3.2 REAGENTES

Acetonitrila grau HPLC (Merck);

Ácido Trifluoracético (TFA) grau HPLC (Merck);

Água destilada;

Água Milli-Q;

Etanol a 96º GL, Isofar;

Kit LABTEST ALT/GPT liquiform - Sistema para determinação da Alanina

Amino Transferase (ALT) ou Transaminase Glutâmico Pirúvica (GPT) em modo

cinético;

Kit LABTEST AST/GOT liquiform - Sistema para determinação da Aspartato

Amino Transferase (AST) ou Transaminase Glutâmico Oxalacética (GOT) em modo

cinético;

Kit LABTEST creatinina - determinação quantitativa da Creatinina em

amostra de soro, plasma e urina com reação de ponto final;

Kit LABTEST uréia - determinação quantitativa de Uréia em amostra de soro,

plasma e urina com reação de ponto final;

Solução água e álcool a 5%;

Solução água e formalina a 10%;

Solução salina 0,9%;

Nitrogênio líquido (para liofilização dos extratos).

3.3 FÁRMACOS

Femproporex, cloridrato de (Henrifarma), lote 7CG5006;

Haloperidol - Halo®, solução injetável 5,0 mg/mL (Cristália);

Tiopental sódico – Tiopentax® 1 g, pó para solução injetável (Cristália);

O femproporex foi diluído em solução salina, obtendo-se uma solução de

5 mg/mL, imediatamente antes de sua aplicação por via intraperitoneal;

O haloperidol, inicialmente numa concentração de 5 mg/mL, foi diluído em

solução salina (NaCl 0,9%) para obtenção da concentração de 1 mg/mL e injetado

por via intraperitoneal.

O tiopental foi diluído em água destilada, obtendo-se uma solução de

80 mg/mL. Foi administrado por via intraperitoneal.

28

3.4 VIDRARIAS

Balão de rotaevaporador (1000 mL);

Bastão de vidro;

Béquer (50 mL, 100 mL, 200 mL);

Erlenmeyer (50 mL, 100 mL);

Funil de vidro;

Proveta 500 mL.

3.5 MATERIAIS DIVERSOS

Agulhas 24 x 7 mm para seringa;

Bisturi nº 04 de INOX, Prata instrumentos cirúrgicos;

Cronômetros;

Fita crepe;

Flanela;

Gaiolas de arame (30 x 17 x 50 m) para o estudo do comportamento

estereotipado;

Gaze;

Lâminas de bisturi nº 22, Freebac;

Lâminas de bisturi nº 23, Solidor;

Lâminas de vidro;

Lâmpada de 100W;

Liquidificador (Arno®);

Microtúbulos (Ependorff®);

Papel de filtro de 40 cm de diâmetro com poros de 14µm (Qualy da

PROLAB);

Pêra de borracha;

Pinça anatômica para dissecação, ABC instrumentos cirúrgicos;

Pipetas de vidro graduadas

Pipetas semi-automáticas (100-200 mcL e 1000 mcL) GILSON;

Seringas descartáveis de 1 mL, 3 mL, 5 mL e 10 mL;

Softwares Graphpad Instat e Graphpad Prisma 5;

Sonda uretral nº 06 em silicone, EMBRAMED;

29

Tamiz GRANUTEST TYLER 12, malha de 1,41 mm;

Tesoura cirúrgica reta, ABC instrumentos cirúrgicos;

Termômetro;

Traves para catatonia (bastões de vidro apoiados em suporte de isopor –

10 cm).

30

4. PROCEDIMENTOS

4.1 MATERIAL VEGETAL

O cladódio de Cereus jamacaru foi coletado em campo nos municípios de São

Vicente, Macau e Natal do Rio Grande do Norte entre os meses de março a outubro

de 2009. No Laboratório de Toxicologia da UFRN, após retirada de seus espinhos, a

planta foi picada e mensurado o peso coletado. Em seguida, o material vegetal

obtido foi mantido em estufa de ar circulante para promover a perda total da

umidade, o que ocorreu após sete dias em média. Por fim, o material vegetal foi

triturado e reservado sob abrigo de luz. O período entre a coleta dos cladódios e

manipulação no Laboratório de Toxicologia não foi superior a três dias.

Um exemplar da planta foi autenticado pelo curador Jomardo Gomes Jardim do

Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (UFRN). A planta foi depositada no Herbário “Parque das Dunas”,

no Centro de Biociências da UFRN, sob número de registro 8203.

4.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE Cereus jamacaru

Ao material vegetal obtido, conforme descrito no item 4.1, foi adicionado etanol

96º GL e mantido em maceração por sete dias, numa proporção de 30 g da planta

seca triturada para 100 mL de etanol. Durante esse período foram realizadas

agitações (em média duas por dia) para garantir a extração dos princípios ativos pelo

solvente extrator. Após este período, o macerado foi filtrado em papel de filtro,

obtendo-se uma solução mãe na concentração de 30%. O filtrado foi submetido à

concentração parcial em evaporador rotativo, sob pressão reduzida, à 50º C, até

eliminação completa do etanol. O extrato obtido deu origem ao extrato etanólico. As

etapas da preparação do extrato, desde a coleta da planta até a diluição do extrato

para ser administrado nos animais estão ilustradas na Figura 5 e Quadro 1.

31

FIGURA 5 – Marcha analítica para a obtenção do extrato etanólico de C. jamacaru.

Tamização do pó (malha

1,41 mm)

Maceração em etanol 96º GL

por sete dias. Utilizou-se

uma proporção de 30 g de C.

jamacaru seco, triturado e

tamizado, para 100 mL de

etanol, obtendo-se assim

uma Solução Mãe a 30%

Filtração da Solução Mãe

em papel de filtro de

poros de 14 µm

Evaporação sob pressão

reduzida, a 50ºC, até

eliminação completa do

etanol

Diluição em água destilada

(Quadro I) e armazenamento

em frascos âmbar limpos

Congelamento a -20ºC

Trituração do material

vegetal seco

Coleta de Cereus

jamacaru

Retirada dos espinhos e

limpeza do cladódio

Corte do cladódio em

pedaços menores

Secagem em estufa de

ar circulante (50ºC) por

sete dias

32

QUADRO 01 – Diluição do extrato bruto de C. jamacaru

A diluição do extrato bruto após completa eliminação do etanol foi realizada baseada nos

seguintes cálculos:

Partindo da dose 14 g de planta seca / 1000 g / dia:

1000 g – 14 g

200 g (rato) – x

x = 2,8 g

Associa-se então o peso do extrato bruto com o peso da planta seca na maceração. Para

melhor entendimento assume-se a seguinte situação:

Após rotaevaporação da Solução Mãe obtida a partir de 586,2 g da planta seca, obteve-se 11,8

g de extrato bruto (E.B.). Então:

11,8 g de E.B. – 586,2 g planta seca

a – 2,8 g

a = 0,0564 g de E.B.

Partindo-se do pressuposto que é desejável que 0,0564 g, correspondente a 2,8 g de planta,

esteja num volume de 1 mL, calcula-se a diluição:

1 mL – 0,0564 g

b – 11,8 g de E.B.

b = 209,2 mL = volume da solução obtida APÓS acrescentar água destilada para a

diluição

Subtrai-se então os 9 mL de E.B. (equivalente a 11,8 g) obtido e tem-se o volume de água

destilada que deve ser adicionada na diluição para que 1 ml do extrato contenha 2,8 g de

planta.

209,2 mL – 9 mL de E.B. = 200,2 mL de água destilada

Para calcular a dose de extrato para que um animal receba 14 g de planta seca / 1000 g / dia:

586,2 g de planta seca – 11,8 g de extrato

33

4.3 ANÁLISE FITOQUÍMICA

4.3.1 Preparação dos extratos para a análise

Foram utilizados os extratos aquoso e etanólico. O aquoso foi obtido através da

trituração da planta fresca (50g) com água destilada (150mL). O extrato etanólico foi

preparado conforme descrito no item 4.2. Ambos os extratos foram liofilizados e

enviados ao Leibniz-Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisherie,

Berlim/Alemanha, aos cuidados do Dr. Stephan Pflugmacher.

4.3.2 Estudo Fitoquímico

O estudo fitoquímico foi realizado com a colaboração do Dr. Stephan

Pflugmacher, do Leibniz-Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisherie.

Alíquotas dos dois extratos foram analisadas por cromatógrafo de alta eficiência

(CLAE) acoplado a espectrômetro de massas (MS), aparelho de análise química que

combina as capacidades de separação física da cromatografia líquida (ou CLAE)

com a análise de recursos de massa da espectrometria de massas. Foi utilizada a

coluna “Agilente” de fase reversa, C-18 e pré-coluna “Agilent”, XDB-C8.

Os extratos foram diluídos (1:100) em água destilada grau Milli-Q e

centrifugados por 20 minutos a uma força centrífuga relativa de 12.000 x g,

equivalente a aproximadamente 13.250 r.p.m. Alíquotas de 10µL foram injetadas no

CLAE. O sistema solvente foi empregado no modo gradiente, conforme detalhado no

Quadro 2. A temperatura do forno foi de 40ºC durante toda a corrida. As amostras

em seguida, foram analisadas por MSMS, empregando o software “Light Sight

Program for Metabolite Identification” (Ver. 1.0; Applied Biosystems, Canada). As

condições da análise realizada pelo espectrômetro de massas estão descritas no

Quadro 3.

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=pt-BR&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/High_performance_liquid_chromatography&prev=/search%3Fq%3DLC-MS/MS%26hl%3Dpt-BR%26biw%3D1024%26bih%3D608%26prmd%3Dib&rurl=translate.google.com.br&twu=1&usg=ALkJrhiBiDP9g9BzaSFmuRujHvzTSj4C2Q

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=pt-BR&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Mass_spectrometry&prev=/search%3Fq%3DLC-MS/MS%26hl%3Dpt-BR%26biw%3D1024%26bih%3D608%26prmd%3Dib&rurl=translate.google.com.br&twu=1&usg=ALkJrhjlNWkYiQSUuQUg7ATjGT5GDCh_6Q

34

QUADRO 2 – Condições da corrida cromatográfica: Sistema solvente, modo

gradiente

Tempo (min) A% B%

0.0 15 85

12.1 100 0

14.1 15 85

20.0 5 95

A = Acetonitrila + 0,1% Ácido trifluoracético (TFA); B = H2O + 0,1% TFA.

QUADRO 3 – Parâmetros do espectrômetro de massas

Gás de arraste (Hélio) 20 cm/min

Gás de colisão Médio

Temperatura 600ºC

4.4. ANIMAIS

Foram utilizados ratos Wistar adultos, pesando inicialmente cerca de 180g, de

mesma linhagem, obtidos do biotério do Centro de Ciências da Saúde da UFRN. Os

animais foram alojados em gaiolas de polipropileno, com tampa de metal medindo

40 x 50 x 20 cm, por um período não inferior a cinco dias antes de serem colocados

nas diferentes situações experimentais. Os animais foram mantidos em sala com

temperatura ambiente aproximadamente constante (23 a 26º C), num ciclo de 12

horas de claro/escuro, sendo a luz acesa às 6:00h. Água e ração foram oferecidas

ad libitum durante todo o procedimento experimental.

Os experimentos foram conduzidos de forma a minimizar o sofrimento dos

animais e limitar o número de espécimes necessários às investigações, de acordo

com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research

Council, 1996). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa científica

do Hospital Onofre Lopes (número 170/07).

35

4.5 ADMINISTRAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE Cereus jamacaru EM

RATOS

No protocolo experimental, dividido em quatro etapas, foram empregados 240

ratos Wistar adultos, sendo 120 fêmeas e 120 machos, divididos quanto ao sexo em

grupos contendo dez animais. Em cada etapa foram empregados dois grupos

controle, um constituído por machos e outro por fêmeas, e quatro grupos

experimentais: dois constituídos por fêmeas e dois por machos. Um grupo de

fêmeas e outro de machos receberam diariamente, por gavagem, 210 mg/kg/dia e os

dois demais grupos receberam 420 mg/kg/dia do extrato etanólico de C. jamacaru

por 30 dias. Os dois grupos controle receberam água por gavagem durante o

período de tratamento. O procedimento adotado para calcular as doses e volumes

do extrato para o tratamento dos animais experimentais está descrito no Quadro 1.

Na primeira etapa do protocolo experimental, foram avaliados alguns

parâmetros que permitem investigar a toxicidade: peso, ganho de peso, ingestão

hídrica e consumo de ração. Ao final dos 30 dias os animais foram anestesiados

com tiopental (70 mg/kg; i.p.) para coleta de sangue e porções teciduais,

possibilitando as dosagens dos parâmetros bioquímicos aspartato transaminase

(AST), alanina transaminase (ALT), creatinina e uréia em soro, e estudo

histopatológico. Na segunda etapa, além da investigação da ação

ansiolítica/ansiogênica do extrato, foi realizado o estudo do aprendizado e memória,

ambos com o emprego do labirinto em cruz elevado, seguido do teste da catatonia.

Na terceira etapa foi observado o comportamento estereotipado e na quarta etapa

do protocolo experimental, foi realizado o campo aberto, para a avaliação da

atividade geral dos animais.

O delineamento de todas as etapas do protocolo experimental está ilustrado na

Tabela 1.

36

TABELA 1 – Protocolo experimental para a avaliação em ratos dos possíveis efeitos tóxicos e/ou comportamentais da exposição

prolongada do extrato etanólico de C. jamacaru.

1ª ETAPA abril-maio

2009

CONTROLE 10 MACHOS/10 FÊMEAS

EXPERIMENTAL 01 (210 mg/kg/dia)

10 MACHOS/10 FÊMEAS



Avaliação da toxicidade: observação diária do peso, ganho de peso, ingestão hídrica e consumo de ração dos animais;

Coleta de material para estudo histopatológico; Coleta de sangue e obtenção do soro para as análises bioquímicas (ALT, AST, uréia e creatinina).

2ª ETAPA maio-junho

2009






Avaliação da capacidade de aprendizado e memória com o emprego do labirinto em cruz modificado; Avaliação da catatonia induzida por haloperidol.

3ª ETAPA agosto-

setembro 2009






Medida do comportamento estereotipado induzido por femproporex.

4ª ETAPA setembro-outubro

2009






Medida da atividade geral no campo aberto.

37

4.6 COLETA DO SANGUE PARA AS DOSAGENS BIOQUÍMICAS

Após a análise do comportamento geral no campo aberto, os animais

foram anestesiados com tiopental (70 mg/kg; i.p.) para a coleta de sangue, que

foi realizada por punção cardíaca ou punção na veia hepática. Após

centrifugação o soro foi empregado para as dosagens das enzimas hepáticas

ALT e AST, e para as dosagens de creatinina e de ácido úrico. As razões

AST/ALT em seguida foram calculadas.

4.7 COLETA DE MATERIAL PARA ESTUDO HISTOPATOLÓGICO

Após a coleta de sangue (item 4.7) os animais anestesiados foram

submetidos à eutanásia por deslocamento cervical. Em seguida, a adrenal

esquerda, baço, coração, fígado, pâncreas e rim esquerdo foram coletados,

examinados macroscopicamente, mensurados seus pesos e, em seguida, foi

calculada a razão peso órgão/peso corporal. Porções teciduais foram fixadas

em formol 10% para a confecção de lâminas histológicas. No Departamento de

Patologia do Curso de Medicina da UFRN, os tecidos foram embebidos em

parafina, seccionados em fatias de espessura de 5 µm, processados com xilol

para possibilitar a confecção de lâminas que foram, por fim, coradas com

eosina:hematoxilina (HE). Foram calculadas as razões peso órgão / peso

corporal para cada um dos órgãos citados.

4.8 AVALIAÇÃO NEUROCOMPORTAMENTAL

4.8.1 Medida da atividade geral no campo aberto

A atividade geral foi realizada por observação direta dos animais no

campo aberto (Figura 8), por um período de 5 minutos no último dia do

tratamento (30º dia), sempre entre as 8:00 e 12:00 horas.

O campo aberto utilizado para o estudo do comportamento dos animais

adultos foi construído segundo modelo descrito por BROADHURST (1960), que

consiste de uma arena circular de madeira, com 95 cm de diâmetro e 29 cm de

altura, pintada de branco. O fundo desta arena é dividido em 25 áreas

38

aproximadamente iguais por meio de três círculos concêntricos e 16 segmentos

de reta convenientemente distribuídos.

Cada rato foi colocado individualmente no centro do campo aberto e

observado seu comportamento por 5 minutos, através dos parâmetros:

Freqüência de locomoção (LO): uma unidade de medida corresponde à

presença das quatro patas dentro do espaço delimitado pelas quatro linhas que

compõem uma subdivisão do chão da arena.

Freqüência de levantar (LE): uma unidade de medida corresponde ao

movimento do animal apoiar-se apenas nas patas posteriores, com a cabeça

dirigida para cima e com o corpo perpendicular em relação ao chão da arena,

tocando ou não as paredes laterais com as patas anteriores.

Duração de imobilidade (IMO): total ausência de movimentos do animal

com as quatro patas no piso do campo aberto; registra-se a duração desse

parâmetro em segundos.

Defecação (DEF): ao final dos cinco minutos conta-se o número de bolos

fecais.

O registro das freqüências dos parâmetros de locomoção e levantar foi

feito por intermédio de contador manual. Para a medida da duração de

imobilidade empregou-se um cronômetro. Entre as observações de cada

animal, a arena foi limpa com solução de álcool etílico 5%.

39

FIGURA 6- Campo aberto utilizado para a observação da atividade geral de

ratos (FONTE: KIRSTEN, 2008).

4.8.2 Estudo da capacidade de aprendizado e memória no labirinto

em cruz elevado modificado

A avaliação do aprendizado e memória foi realizada no labirinto em cruz

elevado modificado, com o emprego da metodologia de PATTI et al. (2006)

adaptada. O labirinto em cruz elevado é constituído de dois braços abertos

opostos, medindo 50 x 10 cm e dois braços fechados, também opostos,

medindo 50 x 10 x 40 cm, dispostos em um ângulo de 90o. O piso do labirinto é

de madeira, pintado de branco e distante 50 cm do chão (FILE; HYDE, 1978).

No aparato modificado, um dos braços fechados do labirinto foi equipado com

uma lâmpada de 100 W. No momento de entrada do animal no braço fechado

modificado a luz foi acesa tanto na sessão treino como na sessão teste.

Na sessão treino, que ocorreu 24 horas antes do teste propriamente dito,

o animal foi mantido no labirinto por um período de cinco minutos, onde foram

anotados os parâmetros: número de entradas no braço fechado modificado

(braço fechado claro), número de entradas no braço fechado não iluminado

40

(braço fechado escuro), número de entradas nos braços abertos, tempo de

permanência (s) no braço fechado modificado, tempo de permanência (s) no

braço fechado não iluminado e tempo de permanência nos braços abertos. Na

sessão teste o animal foi mantido pelo mesmo período de tempo no labirinto

em cruz elevado. Os mesmos parâmetros foram analisados.

Os parâmetros mensurados nas sessões treino e teste foram comparados

entre si para verificar se o animal apresentou aprendizado e memória ao fator

aversivo “luz”. O aprendizado e memória são verificados quando o animal

realiza menor número de entradas no braço fechado modificado durante a

sessão teste, quando comparado com o comportamento na sessão treino. Para

avaliar o aprendizado entre os grupos experimentais com o grupo controle foi

realizada a comparação (ANOVA) dos dados da sessão teste.

O registro do número de entradas nos braços abertos e fechados foi feito

por intermédio de contador manual. Para o tempo de permanência (segundos)

nos braços empregou-se cronômetros digitais. Entre as observações de cada

animal, a arena foi limpa com solução de álcool 5%. Com os dados obtidos

foram calculados a porcentagem de entradas e do tempo dispendido nos

braços abertos e fechados.

4.8.3 Medida do comportamento estereotipado (C.E.)

O C.E. foi induzido pela administração intraperitoneal de femproporex (5,0

mg/kg) no 30º dia do tratamento. Para o registro do C.E. os animais foram

alojados individualmente em gaiolas de arame por oito dias antes do teste

(Figura 7). O bebedouro e a ração das gaiolas foram retirados antes da

administração do femproporex. Este teste foi realizado entre 7:00 e 12:00

horas. O C.E. foi quantificado através de uma escala de escores proposta por

SETLER et al. (1976) (Tabela 2) que atribui valores crescentes em função do

comportamento estereotipado exibido por ratos após receberem algum

agonista dopaminérgico.

Dez minutos após a administração de femproporex foi feita a avaliação do

C.E., em intervalos de 10 minutos, durante 180 minutos consecutivos. Ao final

dos 90 e 180 minutos de observação somaram-se os escores atribuídos a cada

animal durante aquele período. Para a construção das curvas tempo-efeito, isto

41

é, a intensidade do C.E. em função do tempo decorrido, utilizou-se a média dos

escores obtidos em cada intervalo de observação para cada grupo.

TABELA 2- Escores atribuídos por SETLER et al. (1976) para mensurar o

comportamento estereotipado.

Escores Comportamento

0 Adormecido ou parado

1 Ativo

2 Predominantemente ativo, mas com curtos períodos

de farejar e/ou levantar-se estereotipado

3 Atividade estereotipada constante tal como farejar,

levantar ou balançar a cabeça, mas com atividade

locomotora ainda presente

4 Atividade estereotipada constante realizada em um

só local

5 Atividade estereotipada constante mas com curtos

períodos de lamber e/ou roer e morder

6 Lamber e/ou roer as barras da gaiola

FIGURA 7- Comportamento estereotipado induzido por femproporex (5,0

mg/kg; i.p.).

42

4.8.4 Medida da catatonia induzida por haloperidol

A catatonia foi quantificada através de um método baseado naquele

descrito por CARLINI (1973). Assim, utilizou-se uma trave construída com

bastão de vidro situado a 10 cm de uma superfície plana, apoiado nas

extremidades sobre suportes de isopor (Figura 6).

Foram feitas nove observações de catatonia, respectivamente aos 20, 40,

60, 80, 100, 120, 140, 160 e 180 minutos após a administração intraperitoneal

de haloperidol (1,0 mg/kg) realizada no 31º de tratamento. Cada observação foi

feita suspendendo o rato pelo dorso, apoiando as patas dianteiras sobre o

bastão de vidro e as patas posteriores do animal, rápida e suavemente, no

piso, permitindo que o mesmo permanecesse em posição vertical. As

observações foram repetidas por mais duas vezes, caso o animal não

permanecesse na posição imposta. Em cada observação foi considerado o

tempo de 1200 segundos como máximo de catatonia (permanência na barra).

A partir do momento em que o rato permaneceu na barra registrou-se o tempo

(em segundos) com auxílio de cronômetro. Caso o animal permanecesse

durante todos os 1200 segundos, o mesmo era retirado da posição de

catatonia e, em seguida, era novamente colocado na mesma posição, sendo

iniciada uma nova contagem. Os animais foram observados entre 8:00 e 12:00

horas. A partir dos valores obtidos, foram calculadas as médias e os erros

padrão em cada intervalo de observação para a construção das curvas tempo-

efeito.

FIGURA 8- Catatonia induzida por haloperidol (1,0 mg/kg; i.p.).

43

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Empregou-se o software GraphPad Instat versão 2.01 (GraphPad, 1993).

Inicialmente foi aplicado o teste de Bartlett para avaliar a homocedasticidade

dos dados. A análise de variância, ANOVA, para dados paramétricos, seguida

de teste de Tukey, quando necessário (para avaliar as diferenças entre os

grupos), foram usados. Para dados não paramétricos, o teste de Kruskal

Wallis, seguido do teste de Dunn, para comparações múltiplas, foram

empregados (ganho de peso das fêmeas no intervalo entre os dias 20-25 e

catatonia dos machos nos 100 min, 140 min e 180 min) por direcionamento

automático do software adotado.

Os dados obtidos nas sessões treino e teste no labirinto em cruz elevado

modificado foram analisados pelo teste “t” para dados paramétricos. Para o

parâmetro tempo de permanência no braço fechado claro (para as fêmeas),

empregou-se o teste não paramétrico de Mann Withney, como sugestão do

software adotado.

O nível de significância crítico admitido para a rejeição da hipótese de

nulidade foi de uma probabilidade de até 5% (p<0,05) em todas as análises

empregadas.

44

5. RESULTADOS

5.1 ANÁLISE FITOQUÍMICA

Os extratos etanólico e aquoso analisados por cromatografia de alta

eficiência (CLAE) acoplado ao espectrômetro de massas (MS) pelo Dr.

Stephan Pflugmacher do Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries

(Berlin-Alemanha), apresentam os alcalóides D-tiramina (m/z 137,2), hordenina

(m/z 165,2), N-metiltiramina (m/z 151) e ainda o aminoácido D-tirosina (m/z

181.2), precursor de diversos alcalóides. Os cromatogramas obtidos estão

ilustrados nas Figuras 9 e 10.

Outros compostos ativos como o ácido oléico (m/z 282,4), ácido acético

(m/z 60,1), cânfora (m/z 152,2), cisteína (m/z 121,2), geranilacetona (m/z 194),

foram identificados em ambos os extratos, como mostra a Tabela 3. Os

compostos corilagina, ácido benzóico, ácido cinâmico, 1,2-benzoquinona,

antraquinona, cloranil, hidroquinona, fenol e β-sisterol foram detectados apenas

no extrato etanólico (Tabela 3).

45

A B

C D

FIGURA 9 – Cromatogramas obtidos por LC-MS/MS após análise do extrato etanólico de C. jamacaru: D-tiramina (A), hordenina

(B), N-metiltiramina (C) e tirosina (D).

46

A B

C D

FIGURA 10 – Cromatogramas obtidos por LC-MS/MS após análise do extrato aquoso de C. jamacaru: D-tiramina (A), hordenina

(B), N-metiltiramina (C) e tirosina (D).

47

TABELA 3: Constituintes químicos detectados por LC-MS/MS nos extratos

etanólico e aquoso de C. jamacaru (Software Light Sight versão 1.0 - Applied

Biosystems, Canadá)

Composto Estrutura

molecular

m/z

Extrato

etanólico

Extrato

aquoso

Corilagina C27 H24O18 636.5 D ND

Ácido Benzóico C6H5COOH 122.1 D ND

Ácido araquídico C20H40O2 312.5 D D

Ácido palmítico C16H32O2 256 D D

Ácido oléico C18H34O2 282 D D

Ácido cinâmico C9H8O2 148.1 D ND

Ácido esteárico C18H36O2 284.5 D D

Ácido caprílico C8H16O2 144.2 D D

Ácido mirístico C14H28O2 228.4 D D

Ácido valérico C5H10O2 102.1 D D

Ácido propiônico C3H6O2 74.1 D D

Ácido acético C2H4O2 60.1 D D

1,2-Benzoquinona C6H4O2 108.1 D ND

Antraquinona C14H8O2 208.2 D ND

Cloranil C6Cl4O2 245.9 D ND

Hidroquinona C6H4(OH)2 110.1 D ND

Fenol C6H6O1 94.1 D ND

Cânfora C10H16O 152.2 D ND

48

Composto Estrutura

molecular

m/z

Extrato

etanólico

Extrato

aquoso

Cisteína C3H7NO2S 121.2 D D

Geranilacetona C13H22O 194 D D

Hordenina C10H15NO 165 D D

Tiramina C8H11NO 137 D D

N-metiltiramina C9H14NO 151 D D

Beta-sitosterol C29H50O 414 D ND

Tirosina C9H11NO3 181.2 D D

E-gugulsterona C21H28O2 313.3 D D

D= detectado; ND= não detectado.

49

5.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE NOS RATOS MACHOS

A Tabela 4 mostra e a Figura 11 ilustra o consumo de ração dos ratos

machos tratados com as diferentes doses do extrato etanólico de Cereus

jamacaru em relação ao grupo controle. A análise estatística revelou reduzido

consumo de ração pelos grupos experimentais em relação ao grupo controle

durante grande parte do tratamento. Assim, os animais tratados com a menor

dose do extrato etanólico apresentaram reduzido consumo de ração entre os

dias 09 e 17 e entre os dias 19 e 23 de tratamento. Já o grupo de animais

tratados com a maior dose do extrato apresentou redução do consumo de

ração entre os dias 19 e 30 de tratamento. A análise estatística revelou ainda

que ambos os grupos experimentais apresentaram reduzido consumo de ração

no intervalo que compreendeu os dias 3 e 5 e os dias 19 e 21 de tratamento.

A Tabela 5 mostra e a Figura 12 ilustra a ingestão hídrica dos ratos

machos tratados com as diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru

em relação ao grupo controle. A análise estatística revelou que os animais

experimentais de ambos os grupos apresentaram, em alguns momentos do

tratamento, maior ingestão hídrica quando comparado com os animais do

grupo controle. Dessa forma, conforme Tabela 5 e Figura 12, ambos os grupos

experimentais apresentaram maior ingestão hídrica no intervalo entre os dias 1

e 3 e entre os dias 15 e 19. Os animais tratados com a menor dose do extrato

apresentaram reduzida ingestão entre os dias 3 e 5 e maior ingestão entre os

dias 23 e 25; e os animais tratados com a maior dose do extrato apresentaram

maior ingestão hídrica no intervalo que compreende os dias 11 e 13 do

tratamento.

A Tabela 6 mostra e a Figura 13 ilustra o ganho de peso dos ratos

machos tratados com as diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru

em relação ao grupo controle. A análise estatística revelou que o tratamento

dos animais com a maior dose do extrato etanólico, causou reduzido ganho de

peso. O grupo experimental tratado com a menor dose do extrato apresentou

reduzido ganho de peso corporal entre os dias 15 e 25 do tratamento. Já os

animais tratados com a maior dose do extrato apresentaram reduzido ganho de

peso entre os dias 25 e 30 do tratamento, suficiente para causar menor ganho

de peso geral, calculado mensurando a diferença entre o peso corporal dos

animais no primeiro e último dias do tratamento.

50

TABELA 4 – Consumo de ração (g) de ratos machos tratados ou não (controle)

com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São

apresentadas as médias e os erros padrão (n=10/grupo)

Intervalo

de dias Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

01-03 39,65 ± 0,32 45,00 ± 0,33*** 46,00 ± 0,20*** 139,12 27/2

03-05 46,40 ± 1,40 39,00 ± 0,66*** 43,20 ± 0,73* 17,06 27/2

05-07 43,80 ± 1,40 41,60 ± 0,20 45,40 ± 0,70

07-09 39,15 ± 0,05 40,45 ± 0,55 40,25 ± 0,88

09-11 41,00 ± 0,73 35,90 ± 0,43*** 40,30 ± 0,30 28,12 27/2

11-13 40,55 ± 0,25 35,70 ± 0,07*** 41,15 ± 0,78 39,37 27/2

13-15 41,05 ± 0,38 37,45 ± 0,35*** 38,25 ± 0,08 38,77 27/2

15-17 39,70 ± 0,63 38,00 ± 0,00* 38,35 ± 0,22 5,40 27/2

17-19 40,10 ± 0,64 39,05 ± 0,58 39,60 ± 0,20

19-21 41,00 ± 0,53 39,45 ± 0,28* 37,85 ± 0,28*** 16,73 27/2

21-23 39,10 ± 0,10 40,10 ± 0,47* 39,95 ± 0,08 3,72 27/2

23-25 40,30 ± 0,03 40,30 ± 0,10 38,40 ± 0,33*** 29,54 27/2

25-27 41,00 ± 0,30 40,10 ± 0,20 37,05 ± 0,55*** 29,73 27/2

27-29 42,20 ± 0,40 41,40 ± 0,07 34,00 ± 1,57*** 23,42 27/2

*p<0,05; ***p<0,001 - ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

51

FIGURA 11 – Consumo de ração (g) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C.

jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - ANOVA

seguido do posthoc teste de Tukey.

1-3 3-5 5-7 7-9 9-11 11-13 13-15 15-17 17-19 19-21 21-23 23-25 25-27 27-290

20

40

60

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

********* ******* *

****

*************

consum

o d

e r

ação (

g)

52

TABELA 5 – Ingestão hídrica (mL) de ratos machos tratados ou não (controle)


apresentadas as médias e os erros padrão (n=10/grupo)

Intervalo


01-03 63,50 ± 0,50 72,50 ± 0,83*** 76,00 ± 0,33*** 43,74 27/2

03-05 68,00 ± 0,00 63,50 ± 0,50* 68,00 ± 0,67 29,16 27/2

05-07 68,50 ± 1,17 65,00 ± 1,33* 68,00 ± 0,00 3,43 27/2

07-09 64,00 ± 0,67 65,50 ± 0,50 65,00 ± 0,00

09-11 65,00 ± 0,67 60,50 ± 0,17* 71,00 ± 2,00** 18,62 27/2

11-13 64,70 ± 0,57 65,50 ± 0,50 69,50 ± 0,50*** 24,16 27/2

13-15 65,50 ± 1,17 68,00 ± 1,00 67,50 ± 1,83

15-17 65,00 ± 0,33 67,50 ± 0,50*** 70,00 ± 0,33*** 39,71 27/2

17-19 65,00 ± 0,00 68,50 ± 0,17*** 68,00 ± 0,67*** 22,77 27/2

19-21 68,00 ± 0,67 69,00 ± 0,33 67,00 ± 1,33

21-23 65,00 ± 0,00 70,50 ± 0,50 65,50 ± 0,50 55,50 27/2

23-25 67,00 ± 0,33 70,00 ± 0,00** 69,00 ± 1,00 6,30 27/2

25-27 69,00 ± 0,33 71,50 ± 0,50 65,00 ± 1,67 10,27 27/2

27-29 71,00 ± 1,00 70,00 ± 0,00 70,50 ± 1,17

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

53

1-3 3-5 5-7 7-9 9-11 11-13 13-15 15-17 17-19 19-21 21-23 23-25 25-27 27-290

20

40

60

80

100

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

** ****

************ *****

* *

*** ***

ingestã

o h

ídrica (

mL)

FIGURA 12 – Ingestão hídrica (mL) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C.



54

TABELA 6 – Ganho de peso (g) de ratos machos tratados ou não (controle)


apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo)

Intervalo


01-05 9,60 ± 1,25 10,47 ± 2,46 5,28 ± 4,35

05-10 7,96 ± 1,17 3,87 ± 2,23 6,18 ± 1,43

10-15 8,54 ± 1,65 2,62 ± 2,51 5,73 ± 1,35

15-20 8,34 ± 0,81 -2,46 ± 4,84* -1,59 ± 1,85 3,93 27/2

20-25 -0,02 ± 1,22 5,15 ± 1,14* -0,20 ± 1,74 4,76 27/2

25-30 6,46 ± 1,23 5,40 ± 1,09 -0,91 ± 2,00** 7,09 27/2

01-30 40,90 ± 3,58 30,87 ± 2,44 17,94 ± 2,42*** 16,14 27/2


55

1-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 1-30

0

20

40Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

*

***

***

ganho d

e p

eso (

g)

FIGURA 13 - Ganho de peso (g) de ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C.



56

5.3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE NAS RATAS FÊMEAS

A Tabela 7 mostra e a Figura 14 ilustra o consumo de ração das ratas

fêmeas tratadas com as diferentes doses do extrato etanólico de Cereus

jamacaru em relação ao grupo controle. Houve diferenças significantes e assim

como o ocorrido com os machos, de uma maneira geral, os grupos

experimentais tiveram um menor consumo de ração em comparação ao grupo

controle. Os animais que receberam a menor dose do extrato apresentaram

reduzido consumo de ração nos intervalos que compreenderam os dias 1 e 5, 9

e 17,19 e 21 e os dias 23 e 25 de tratamento, já os animais que receberam a

maior dose apresentaram menor consumo de ração nos dias 1 e 5 e dos dias 9

ao 23. Em nenhum momento foi observado maior consumo de ração por parte

dos animais experimentais quando comparados ao grupo controle.

A Tabela 8 mostra e a Figura 15 ilustra a ingestão hídrica das ratas

fêmeas tratadas com as diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru

em relação ao grupo controle. Observou-se menor ingestão hídrica nos dias 5 e

7, 11 e 27 por pelo grupo que recebeu a menor dose do extrato. O grupo que

recebeu a maior dose apresentou menor consumo nos intervalos que

compreenderam os dias 7 e 13, 17 e 19 e os dias 21 e 27. Foi constatada

maior ingestão de água pelo grupo que recebeu a menor dose do extrato nos

dias 13 e 15 e 21 e 23.

A Tabela 9 mostra e a Figura 16 ilustra o ganho de peso das ratas

fêmeas tratadas com as diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru

em relação ao grupo controle. A análise de variância constatou diferenças

significantes entre os grupos experimentais em relação ao grupo controle no

intervalo que compreendeu os dias 15 e 20, onde se observa uma diminuição

do ganho de peso nos grupos experimentais que receberam a menor e maior

dose do extrato. No entanto, ao final do tratamento, os animais experimentais

que receberam a menor dose conseguiram se recuperar, mesmo apresentando

uma tendência de menor ganho de peso, ao contrário dos animais que

receberam a dose maior, que apresentaram um menor ganho de peso final

quando comparado ao grupo controle.

57

TABELA 7 – Consumo de ração (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle)


apresentadas as médias e os erros padrão [(n=10/grupo); n=9 (420 mg/kg/dia)]

Intervalo


01-03 35,60 ± 0,98 33,00 ± 0,33* 31,50 ± 0,67** 8,69 27/2

03-05 41,09 ± 2,93 30,05 ± 0,55*** 27,10 ± 0,40*** 18,03 27/2

05-07 27,35 ± 2,12 30,05 ± 0,52 27,40 ± 0,16

07-09 29,95 ± 1,25 27,45 ± 0,68 27,39 ± 1,93

09-11 31,95 ± 0,02 28,45 ± 0,35*** 27,73 ± 0,84*** 20,68 26/2

11-13 31,25 ± 0,82 28,35 ± 0,15*** 26,22 ± 0,09*** 25,23 26/2

13-15 32,60 ± 1,47 24,70 ± 0,70*** 27,17 ± 0,56** 16,27 26/2

15-17 30,25 ± 0,28 29,05 ± 0,02*** 27,22 ± 0,07*** 74,84 26/2

17-19 30,05 ± 0,75 30,05 ± 0,35 25,71 ± 1,30** 8,29 26/2

19-21 30,10 ± 0,37 27,85 ± 0,52** 24,20 ± 0,47*** 41,44 26/2

21-23 30,85 ± 1,08 31,35 ± 0,48 26,74 ± 0,14** 12,08 26/2

23-25 32,50 ± 0,17 28,25 ± 0,02*** 31,14 ± 1,28 10,10 26/2

25-27 30,40 ± 1,13 30,20 ± 0,40 28,96 ± 1,56

27-29 30,55 ± 0,22 31,70 ± 1,40 30,74 ± 0,97


58

1-3 3-5 5-7 7-9 9-11 11-13 13-15 15-17 17-19 19-21 21-23 23-25 25-27 27-290

20

40

60

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

****** ***

*

****** ******

******** **

******

***

**

consum

o d

e r

ação (

g)

FIGURA 14 - Consumo de ração (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C.

jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão [(n=10/grupo); n=9 (420 mg/kg/dia)]. *p<0,05; **p<0,01;

***p<0,001 - ANOVA seguido do post hoc teste de Tukey.

59

TABELA 8 – Ingestão hídrica (mL) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle)



Intervalo


01-03 58,50 ± 2,50 59,00 ± 0,33 58,00 ± 1,00

03-05 55,00 ± 4,33 58,50 ± 0,17 52,50 ± 1,50

05-07 61,00 ± 3,33 52,50 ± 0,83* 55,33 ± 0,53 4,49 26/2

07-09 57,00 ± 0,00 56,50 ± 0,17 47,11 ± 1,23*** 67,49 26/2

09-11 56,00 ± 2,00 51,50 ± 0,50 48,56 ± 0,18*** 9,08 26/2

11-13 56,50 ± 1,67 52,50 ± 0,17*** 51,78 ± 0,70*** 40,39 26/2

13-15 51,50 ± 0,50 55,00 ± 1,33* 50,00 ± 0,00 9,03 26/2

15-17 56,00 ± 1,67 51,50 ± 0,50* 54,11 ± 1,23 3,48 26/2

17-19 58,00 ± 1,33 56,50 ± 0,17 47,78 ± 0,88*** 33,87 26/2

19-21 57,50 ± 3,17 49,50 ± 0,17* 54,11 ± 0,18 4,67 26/2

21-23 57,00 ± 0,67 60,50 ± 0,17*** 51,00 ± 0,00*** 105,24 26/2

23-25 61,00 ± 2,00 52,50 ± 0,50** 54,44 ± 1,76* 8,48 26/2

25-27 58,00 ± 0,67 53,50 ± 1,17*** 54,00 ± 0,00** 9,62 26/2

27-29 56,00 ± 1,33 54,50 ± 0,17 54,44 ± 0,18


60

1-3 3-5 5-7 7-9 9-11 11-13 13-15 15-17 17-19 19-21 21-23 23-25 25-27 27-290

20

40

60

80

Controle

210 mg/kg/dia

** **

****

****

******

*********

******

420 mg/kg/dia

ingestã

o h

ídrica (

mL)

FIGURA 15 – Ingestão hídrica (mL) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C.

jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão [(n=10/grupo); n=9 (420 mg/kg/dia)]. *p<0,05; **p<0,01;

***p<0,001 - ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

61

TABELA 9 – Ganho de peso (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle)



Intervalo

de dias Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F/KW df

01-05 6,44 ± 2,31 1,52 ± 1,44 0,97 ± 1,50

05-10 2,94 ± 1,71 1,14 ± 1,11 0,37 ± 1,95

10-15 3,66 ± 1,31 1,00 ± 1,20 1,13 ± 0,96

15-20 8,54 ± 0,81 -2,46 ± 4,84* -8,10 ± 1,61** F = 7,78 26/2

20-25 -2,1x10-6 ±

1,22 5,15 ± 1,14* 4,43 ± 2,23 KW = 7,64 26/2

25-30 6,46 ± 1,23 5,40 ± 1,09 3,54 ± 1,15

01-30 18,58 ± 2,38 12,59 ± 2,12 9,89 ± 2,12* F = 4,00 26/2

*p<0,05; **p<0,01 – 15-20, 01-30: ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey;

*p<0,05 - 20-25: ANOVA seguido do posthoc teste não paramétrico de Kruskall

Wallis.

62

1-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 1-30-20

-10

0

10

20

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

*

***

ganho d

e p

eso (

g)

*

FIGURA 16 - Ganho de peso (g) de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C.

jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão [(n=10/grupo); n=9 (420 mg/kg/dia)]. *p<0,05; **p<0,01 -

ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey. *p<0,05 - 20-25: ANOVA seguido do posthoc teste não paramétrico de Kruskall Wallis.

63

5.4 ANÁLISE DAS DOSAGENS BIOQUÍMICAS DOS MACHOS

A Tabela 10 e Figura 17 mostram os resultados das dosagens de ALT,

AST, creatinina e ureia obtidos a partir da análise do soro obtido dos ratos

machos após eutanásia. A análise estatística empregada revelou concentração

superior de ureia no soro dos animais tratados com a maior dose do extrato

etanólico quando comparado com o nível de ureia no soro dos animais do

grupo controle. Não foram observadas alterações nos níveis de creatinina no

soro dos animais tratados com as duas doses do extrato. Na avaliação da

toxicidade hepática, foi observado maior concentração sérica de ALT nos

animais que receberam a dose de 420 mg/kg/dia do extrato etanólico de

Cereus jamacaru e a análise estatística revelou, ainda, não haver alterações na

concentração de AST no soro dos animais experimentais. Não foi verificada

nenhuma alteração na razão AST/ALT quando comparado o valor dos grupos

experimentais com o valor do grupo controle.

64

TABELA 10 – Parâmetros bioquímicos mensurados no soro dos ratos machos

tratados ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de

C. jamacaru por 30 dias [(n=10/grupo); n=9 (210 mg/kg/dia e 420 mg/kg/dia)].

São apresentadas as médias e erros do desvio padrão

Dosagem Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

ALT(U/L) 59,35 ± 3,21 54,22 ± 2,76 99,67 ± 11,92*** 15,36 26/2

AST(U/L) 158,00 ± 14,79 148,00 ± 14,00 184,63 ± 20,72

AST/ALT 2,82 ± 0,64 2,53 ± 0,08 2,15 ± 0,41

Ureia

(mg/dL)

47,95 ± 1,87 42,33 ± 6,58 56,67 ± 1,68** 13,56 25/2

Creatinina

(mg/mL) 0,59 ± 0,01 0,67 ± 0,03 0,61 ± 0,02

*p<0,05; ***p<0,001 – ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

AST = Aspartato transferase; ALT = Alanina transferase.

65

FIGURA 17: Parâmetros bioquímicos mensurados no soro dos ratos machos

tratados ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de


*p<0,05; ***p<0,001 – ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.


Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia

UREIA0

10

20

30

40

50

60

70

**

mg/d

L

CREAT ININA0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

mg/m

L

ALT AST0

50

100

150

200

250

***U/L

AST /ALT0

1

2

3

4

66

5.5 ANÁLISE DAS DOSAGENS BIOQUÍMICAS DAS FÊMEAS

A Tabela 11 e a Figura 18 mostra os resultados das dosagens de ALT,

AST, creatinina e ureia obtidas a partir da análise do soro das ratas fêmeas. A

análise estatística não revelou diferenças significantes nas dosagens de ureia e

creatinina entre os grupos experimentais e o grupo controle. Por outro lado,

revelou concentração reduzida de AST nos animais que receberam a dose de

420 mg/kg/dia do extrato etanólico de Cereus jamacaru. Tal diminuição não foi

suficiente para alterar o valor da razão AST/ALT ao ponto de tornar o

parâmetro significativo ao se comparar os grupos experimentais com o grupo

controle.

67

TABELA 11 – Parâmetros bioquímicos mensurados no soro das ratas fêmeas

tratadas ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de


São apresentadas as médias e erros do desvio padrão

Dosagem Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

ALT(U/L) 47,50 ± 4,11 58,40 ± 7,42 35,75 ± 5,15

AST(U/L) 158,71 ± 10,95 165,86 ± 18,91 123,2 ± 7,63* 2,88 26/2

AST/ALT 3,32 ± 0,28 3,08 ± 0,34 3,02 ± 0,18

Ureia

(mg/dL)

50,40 ± 1,49 55,78 ± 2,82 53,22 ± 1,51

Creatinina

(mg/mL) 0,65 ± 0,03 0,66 ± 0,05 0,57 ± 0,02

*p<0,05 – ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.


68

FIGURA 18 - Parâmetros bioquímicos mensurados no soro das ratas fêmeas

tratadas ou não (grupo controle) com diferentes doses do extrato etanólico de


*p<0,05 – ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.



ALT AST0

50

100

150

200

*

U/L

UREIA0

10

20

30

40

50

60

70

mg/d

L

CREAT ININA0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

mg/m

L

AST /ALT0

1

2

3

4

69

5.6 RAZÕES PESO ÓRGÃO / PESO CORPORAL DOS RATOS

MACHOS E FÊMEAS

A análise estatística empregada revelou que o extrato etanólico, nas

doses empregadas, não foi capaz de provocar alterações no peso dos órgãos

adrenal esquerda, baço, coração, fígado, pâncreas e rim esquerdo dos ratos

machos, como demonstrado na Tabela 12. De forma semelhante, o extrato

etanólico também mostrou não ser capaz de provocar alterações no peso

(razões) dos órgãos nas ratas fêmeas (Tabela 13). Apenas a razão peso

adrenal/peso corporal das fêmeas tratadas com a maior dose do extrato foi

maior que a razão nos animais do grupo controle, conforme demonstrado na

Tabela 13.

70

TABELA 12 – Razão peso órgão / peso corporal dos órgãos coletados para o estudo histopatológico dos ratos machos tratados ou

não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias (x10-5) e os

erros padrão (x10-5) (n = 10/grupo)

Órgãos Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia

Adrenal 8,78 ± 1,23 12,90 ± 1,67 14,56 ± 1,97

Baço 276,30 ± 17,49 282,70 ± 10,95 237,90 ± 25,96

Coração 276,70 ± 0.000106 292,30 ± 11,39 292,00 ± 5.86

Fígado 3.439,00 ± 58,88 3.438,00 ± 70,81 3.456,00 ± 70,15

Pâncreas 144,10 ± 10,94 142,70 ± 12,05 170,10 ± 16,96

Rim 352,00 ± 10,22 326,50 ± 16,02 347,10 ± 9,60

p>0,05 – ANOVA.

71

TABELA 13 – Razão peso órgão / peso corporal dos órgãos coletados para o estudo histopatológico das ratas fêmeas tratadas ou

não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias (x10-5) e os

erros padrão (x10-5) (n = 10/grupo)

Órgãos Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

Adrenal 139,00 ± 1,60 242,00 ± 5,28 302,00 ± 3,57* 4,717 27/2

Baço 342,50 ± 15,62 362,80 ± 17,06 333,20 ± 11,69

Coração 329,50 ± 13,14 337,20 ± 12,43 356,80 ± 8,14

Fígado 3.504,00 ± 125,60 3.680,00 ± 138,40 3.675,00 ± 115,3

Pâncreas 215,1 ± 23,70 231,00 ± 13,95 247,10 ± 13,66

Rim 348,00 ± 11,62 362,90 ± 8,01 372,90 ± 9,05

* p<0,05 – ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

72

5.7 ESTUDO HISTOPATOLÓGICO

As Figuras 19, 20 e 21 se referem às fotos obtidas das lâminas

histológicas confeccionadas com porções teciduais de fígado, rim, pâncreas,

baço, adrenal e coração dos animais que foram tratados por 30 dias com o

extrato etanólico de Cereus jamacaru para possibilitar o estudo histopatológico.

A morfologia celular, bem como a presença de edema e hemorragia nos

tecidos foram estudadas e comparadas com o grupo controle. Nenhuma

alteração digna de nota foi constatada nas porções teciduais provenientes dos

animais que receberam as doses de 210 e 420 mg/kg/dia do extrato etanólico

de C. jamacaru.

73

74

75

76

5.8 AVALIAÇÃO NEUROCOMPORTAMENTAL DOS MACHOS

A Tabela 14 mostra e a Figura 22 ilustra os dados obtidos no teste do

campo aberto com ratos machos tratados ou não (controle) com as diferentes

doses do extrato etanólico de Cereus jamacaru. A análise de variância mostrou

diferenças significantes entre os grupos experimentais quando comparados ao

grupo controle. Os animais experimentais de ambos os grupos apresentaram

reduzidas freqüências de locomoção e levantar e aumento do tempo de

imobilidade. Não foi observado nada relevante com relação ao número de

bolos fecais ao término do experimento entre os grupos experimentais e grupo

controle.

A Tabela 15 mostra os dados obtidos no labirinto em cruz modificado,

para o estudo do aprendizado e memória nas sessões treino e teste, com ratos

machos tratados ou não (controle) com as diferentes doses do extrato etanólico

de C. jamacaru. Não foram observadas diferenças significantes entre as

sessões treino e teste para cada grupo pelo teste “t”. Entretanto, reduzido

número de entradas no braço fechado claro (NEBFC) foi detectado nos machos

que receberam a dose de 420 mg/kg/dia na sessão teste quando comparado à

sessão treino, conforme ilustra a Figura 23.


para o estudo do aprendizado e memória na sessão teste comparando os

grupos de ratos machos tratados com as diferentes doses do extrato etanólico

de C. jamacaru com o grupo controle. Não foram observadas diferenças

significativas nos parâmetros avaliados.

A Tabela 17 mostra e a Figura 24 ilustra os dados obtidos no estudo do

comportamento estereotipado induzido pelo cloridrato de femproporex (5,0

mg/kg) em ratos machos tratados ou não (controle) com as diferentes doses do

extrato etanólico de C. jamacaru. A análise de variância mostrou não haver

diferenças significantes entre os grupos avaliados.

A Tabela 18 e a Figura 25 mostram a duração (em segundos) da

catatonia induzida pelo haloperidol (1,0 mg/kg) observada em ratos machos

tratados ou não (controle) com as diferentes doses do extrato etanólico de C.

jamacaru. A análise estatística empregada mostrou haver diferenças

significantes entre o grupo que recebeu a dose de 210 mg/kg/dia e o grupo

77

controle nos seguintes tempos de observação de 40 minutos, 60 minutos, 100

minutos, 120 minutos, 140 minutos, 160 minutos e 180 minutos, onde se

observou uma diminuição (s) do estado catatônico desses animais. Os animais

tratados com a maior dose não apresentaram alterações.

78

TABELA 14 – Parâmetros analisados no teste do campo aberto nos ratos

machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de

C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão (n =

10/grupo)

Parâmetros

Campo Aberto Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

Freqüência de

Locomoção 68,7 ± 7,8 42,6 ± 9,5* 35,3 ± 3,23** 5,74 27/2

Freqüência de

Levantar 21,9 ± 3,3 14,4 ± 2,3* 12,2 ± 1,9* 3,97 27/2

Imobilidade (s) 63,6 ± 14,4 126 ± 17,7* 122,9 ± 13,4* 5,30 27/2

Bolos fecais 3,3 ± 0,7 2,8 ± 0,6 1,7 ± 0,6

*p<0,05; **p<0,01 - ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

79

FIGURA 22 - Parâmetros analisados no teste do campo aberto nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses

do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão (n=10/grupo). *p<0,05; *p<0,01 -

ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.


0

10

20

30

**

frequência

de leva

nta

r

0

50

100

150

200

Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia

**

imob

ilida

de (

s)

0

20

40

60

80

100Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia

*

**

frequência

de locom

oção

0

1

2

3

4

5

Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia

bolo

s f

ecais

80

TABELA 15 – Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado

nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as

sessões treino e teste. São apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo)

Parâmetros

LCM


Treino Teste Treino Teste Treino Teste

NEBA 2,5 ± 0,4 1 ± 0,5 2,4 ± 0,7 0,6 ± 0,3 1,4 ± 0,3 1,0 ± 0,4

NEBFC 1,8 ± 0,4 1,8 ± 0,5 1,6 ± 0,3 1,7 ± 0,4 2,1 ± 0,2 1,0± 0,3**

NEBFE 1,5 ± 0,5 2,0 ± 0,4 1,6 ± 0,4 1,8 ± 0,3 1,4 ± 0,4 1,1 ± 0,2

Bolos fecais 1,8 ± 0,6 1,9 ± 1,0 2,4 ± 0,8 2,1 ± 0,6 1,4 ± 0,4 1,5 ± 0,4

TBA (s) 67,5 ± 26,7 56,8 ± 23,4 58,0 ± 25,4 36,8 ± 22,7 98,0 ± 29,2 59,4 ± 27,0

TBFC (s) 104,5 ± 37,6 57,0 ± 24,7 91,0 ± 34,0 74,0 ± 29,4 105,7 ± 32,3 82,8 ± 38,8

TBFE (s) 128 ± 37,2 186,2 ± 34,26 151,0 ± 34,2 189,2 ± 35,4 96,3 ± 31,8 157,8 ± 41,5

**p<0,01 – Teste „t‟ – comparações dos dados da sessão treino com a sessão teste para cada grupo (t = 2,91; df = 18/1).

NEBA = número de entradas nos braços abertos; NEBFC = número de entradas no braço fechado claro; NEBFE = número de

entradas no braço fechado escuro; TBA = tempo de permanência nos braços abertos; TBFC = tempo de permanência no braço

fechado claro; TBFE = tempo de permanência no braço fechado escuro.

81

FIGURA 23 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado, para o estudo do aprendizado e memória, realizado

nos ratos machos tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as

sessões treino e teste para avaliação da memória e aprendizado. São apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo).

**p<0,01 – Teste „t‟ – comparações dos dados da sessão treino com a sessão teste para cada grupo.

NEBFC = número de entradas no braço fechado claro; TBFC = tempo de permanência, em segundos, no braço fechado claro.

0

25

50

75

100

125

150


TB

FC

(s)

0

1

2

3


**

NE

BF

C

Sessão treino Sessão teste

82

TABELA 16: Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado,

para o estudo do aprendizado e memória, realizado nos ratos machos tratados

ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por

30 dias, durante a sessão teste para avaliação da memória e aprendizado. São


Parâmetros

LCEM Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia

NEBFC 1,8 ± 0,51 1,7 ± 0,40 1,0 ± 0,30

TBFC 57,0 ± 24,71 84,0 ± 34,25 82,8 ± 38,76

NEBFE 2,0 ± 0,42 1,8 ± 0,33 1,1 ± 0,23

TBFE 182,3 ± 34,81 198,2 ± 35,38 157,8 ± 41,51

p>0,05 – ANOVA.

NEBA = número de entradas nos braços abertos; NEBFC = número de

entradas no braço fechado claro; NEBFE = número de entradas no braço

fechado escuro; TBA = tempo de permanência nos braços abertos; TBFC =

tempo de permanência no braço fechado claro; TBFE = tempo de permanência

no braço fechado escuro.

83

TABELA 17 – Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de

cloridrato de cloridrato de femproporex de ratos machos tratados ou não

(controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30

dias. São apresentadas as médias, os erros padrão e os respectivos limites

mínimo e máximo de escores ou da soma de escores (0-90 e 0-180);

n=10/grupo

Tempo Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia

(min) (n=10) (n=10) (n=10)

0-90 9,0 ± 1,3 12,1 ± 2,9 7,7 ± 1,4

(4-14) (0-30) (2-14)

0-180 14,4 ± 2,9 18,2 ± 5,2 10,4 ± 1,9

(6-34) (1-60) (3-19)

10 0,5 ± 0,7 0,4 ± 0,2 0,7 ± 0,2

(0-1) (0-1) (0-1)

20 0,4 ± 0,6 0,5 ± 0,2 0,6 ± 0,2

(0-1) (0-1) (0-1)

30 0,7 ± 0,2 1,2 ± 0,3 0,8 ± 0,2

(0-1) (0-3) (0-2)

40 0,7 ± 0,2 1,6 ± 0,5 0,9 ± 0,3

(0-1) (0-5) (0-2)

50 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,5 0,9 ± 0,3

(0-2) (0-5) (0-2)

60 1,1 ± 0,3 1,6 ± 0,5 1,0 ± 0,3

(0-2) (0-5) (0-2)

70 1,4 ± 0,2 2,0 ± 0,5 0,8 ± 0,3

(0-2) (0-5) (0-2)

80 1,5 ± 0,3 1,9 ± 0,5 0,8 ± 0,3

(0-2) (0-5) (0-2)

90 1,5 ± 0,4 1,7 ± 0,5 1,2 ± 0,3

(0-3) (0-5) (0-3)

100 1,5 ± 0,4 1,8 ± 0,5 1,0 ± 0,5

(0-4) (0-5) (0-5)

84

Tempo

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

(min) (n=10) (n=10) (n=10)

110 0,8 ± 0,4 1,1 ± 0,5 0,9 ± 0,4

(0-3) (0-5) (0-3)

120 1,2 ± 0,4 0,9 ± 0,5 0,4 ± 0,2

(0-3) (0-5) (0-2)

130 0,5 ± 0,3 0,7 ± 0,5 0,0 ± 0,0

(0-3) (0-5) (0-0)

140 0,5 ± 0,3 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1

(0-3) (0-1) (0-1)

150 0,6 ± 0,3 0,7 ± 0,5 0,1 ± 0,1

(0-3) (0-5) (0-1)

160 0,3 ± 0,3 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,2

(0-3) (0-1) (0-2)

170 0,0 ± 0,0 0,7 ± 0,5 0,0 ± 0,0

(0-0) (0-5) (0-0)

180 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1

(0-0) (0-0) (0-0)

p>0,05 – ANOVA.

85

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190-1

0

1

2

3

4

5

6

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

tempo (min)

escore

s

FIGURA 24 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de cloridrato de cloridrato de femproporex de ratos machos

tratados ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os

erros padrão (n = 10/grupo). p>0,05 – ANOVA.

86

TABELA 18 – Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratos machos tratados ou não (controle) com

diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias, os erros padrão, além dos valores

mínimo e máximo de cada momento da análise (n = 10/grupo)

Tempo Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F / KW df

(min) (n=10) (n=10) (n=10)

20 0,80 ± 0,61 0,60 ± 0,40 2,50 ± 1,37

(0-6) (0-3) (0-12)

40 124,70 ± 45,56 19,40 ± 17,21* 27,30 ± 12,18 F = 4,09 27/2

(0-418) (0-174) (0-123)

60 142,60 ± 52,44 15,70 ± 6,68* 165,60 ± 119,49 F= 61,59 27/2

(0-544) (0-68) (0-1200)

80 184,40 ± 57,44 68,90 ± 33,98 218,40 ± 125,91

(9-487) (0-300) (0-1200)

100 204,50 ± 57,07 49,50 ± 14,29* 230,10 ± 122,81 KW = 6,03

(21-660) (9-120) (2-1200)

120 304,20 ± 68,80 34,20 ± 10,04* 336,30 ± 128,83 F = 3,85 27/2

(50-830) (0-89) (4-1200)

140 389,80 ± 106,08 62,90 ± 14,19* 358,80 ± 154,00 KW = 7,14

(18-1200) (4-136) (6-1200)

87

Tempo Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F / KW df

min) (n=10) (n=10) (n=10)

160 371,40 ± 106,60 126,40 ± 45,61* 331,40 ± 121,38 F = 5,46 27/2

(49-1200) (7-461) (17-1200)

180 434,50 ± 91,91 118,70 ± 21,02** 390,90 ± 137,71 KW = 6,07

(92-922) (32-211) (25-1200)

*p<0,05; **p,0,01 – 40, 60, 120 e 160 min. ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey; *p<0,05; **p<0,01 - 100, 140 e 180 min:

ANOVA seguido do posthoc teste não paramétrico de Kruskall Wallis.

88

FIGURA 25 - Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratos machos tratados ou não (controle) com

diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo).

*p<0,05; **p,0,01 – 40 60, 120 e 160 min: ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey; *p<0,05; **p<0,01 - 100, 140 e 180 min:

ANOVA seguido do posthoc teste não paramétrico de Kruskall Wallis.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

100

200

300

400

500

600

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

**

**

*

***

tempo (min)

cata

tonia

(s)

89

5.9 AVALIAÇÃO NEUROCOMPORTAMENTAL DAS FÊMEAS

A Tabela 19 e a Figura 26 mostram os dados obtidos no teste do campo

aberto com ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com as diferentes doses do

extrato etanólico de Cereus jamacaru. A análise de variância revelou

freqüências de locomoção e levantar reduzidas para os grupos que receberam

o extrato etanólico de C. jamacaru nas duas doses (dados não significantes

estatisticamente). Foram observadas também diferenças significantes entre os

grupos experimentais quando comparados ao grupo controle, nos parâmetros

de tempo de imobilidade, com aumento (s) neste parâmetro e aumento da

defecação para o grupo que recebeu a menor dose do extrato.

A Tabela 20 mostra e a Figura 27 ilustra os dados obtidos no labirinto em

cruz modificado, nas sessões treino e teste, com ratas fêmeas tratadas ou não

(controle) com as diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru. Não

foram observadas diferenças significantes nas sessões treino e teste para cada

grupo. Foi constatado reduzido tempo de permanência no braço fechado claro

(TBFC) pelas fêmeas do grupo que recebeu a dose de 210 mg/kg/dia na

sessão teste quando comparado à sessão treino.


para o estudo do aprendizado e memória na sessão teste comparando os

grupos de ratas fêmeas tratadas com as diferentes doses do extrato etanólico

de C. jamacaru com o grupo controle. Não foram observadas diferenças

significativas nos parâmetros avaliados.

A Tabela 22 mostra e a Figura 28 ilustra os dados obtidos no estudo da

estereotipia induzida por cloridrato de femproporex (5,0 mg/Kg) em ratas

fêmeas tratadas ou não (controle) com as diferentes doses do extrato etanólico

de C. jamacaru. Os animais tratados com a menor dose do extrato

apresentaram reduzido comportamento estereotipado quando comparados ao

grupo controle aos 30 e 40 minutos. Aos 100 minutos observou-se maior

comportamento estereotipado entre o grupo que recebeu a dose de 210

mg/kg/dia e o grupo controle.

A Tabela 23 e a Figura 29 mostram a duração (em segundos) da

catatonia induzida pelo haloperidol (1,0 mg/kg) observada em ratas fêmeas

tratadas ou não (controle) com as diferentes doses do extrato etanólico de C.

90

jamacaru. A análise de variância mostrou não haver diferenças significantes

entres os grupos.

91

TABELA 19 – Parâmetros analisados no teste do campo aberto nas ratas

fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de

C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão (n =

10/grupo)

Parâmetros

Campo Aberto Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

Frequência de

Locomoção 88,6 ± 13,6 54,4 ± 8,6 61,2 ± 9,6

Frequência de

Levantar 28,2 ± 5,0 17,0 ± 2,5 18,3 ± 2,3

Imobilidade (s) 36,8 ± 10,5 86,6 ± 13,6* 83,4 ± 18,8* 3,83 26/2

Defecação 2,1 ± 0,7 5,6 ± 1,1* 3,0 ± 0,5 4,93 26/2

*p<0,05, ANOVA seguido do post hoc teste de Tukey.

92

FIGURA 26 - Parâmetros analisados no teste do campo aberto nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses

do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão [n=10/grupo; n=9 (420 mg/kg/dia)].

*p<0,05 - ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.


0

50

100

150

Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia

freq

uênc

ia d

e lo

com

oção

0

10

20

30

40

Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia

freq

uênc

ia d

e le

vant

ar

0

2

4

6

8

Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia*

defe

caçã

o

0

50

100

150

Controle

14g/kg/dia

28g/kg/dia

* *

imob

ilida

de (

s)

93

TABELA 20 – Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado realizado nas ratas fêmeas tratadas ou não

(controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as sessões treino e teste. São


Parâmetros

Labirinto


Treino Teste Treino Teste Treino Teste

NEBA 3,7 ± 1,1 3,3 ± 0,7 3,3 ± 0,8 3,9 ± 0,9 3,7 ± 0,3 3,2 ± 0,6

NEBFC 2,3 ± 0,5 3,4 ± 1,1 3 ± 0,6 2,8 ± 0,6 2,6 ± 0,4 2,6 ± 0,7

NEBFE 2,3 ± 0,7 3,8 ± 1,0 2,5 ± 0,4 2,5 ± 0,7 2,2 ± 0,5 2,7 ± 0,7

Bolos fecais 0,4 ± 0,4 0,3 ± 0,2 0,5 ± 0,4 0,3 ± 0,2 0,6 ± 0,4 0,2 ± 0,2

TBA 97,6 ± 28,6 55 ± 9,5 114,4 ± 24,7 111,3 ± 33,8 109,4 ± 24,7 75,7 ± 31,7

TBFC 53,5 ± 25,7 47 ± 24,9 56,7 ± 16,6 20,1 ± 8,4* 67,4 ± 27,9 22,6 ± 7,1

TBFE 148,9 ± 33,1 198,0 ± 25,3 128,9 ± 25,1 168,6 ± 35,2 123,2 ± 27,4 201,7 ± 32,3

*p<0,05 - Teste “t” seguido do teste não paramétrico de Mann Whitney (U = 79,5).

NEBA = número de entradas nos braços abertos; NEBFC = número de entradas no braço fechado claro; NEBFE = número de

entradas no braço fechado escuro; TBA = tempo de permanência, em segundos, nos braços abertos; TBFC = tempo de

permanência , em segundos, no braço fechado claro; TBFE = tempo de permanência, em segundos, no braço fechado escuro.

94

FIGURA 27 - Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado realizado nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle)

com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante as sessões treino e teste para avaliação da

memória e aprendizado. São apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo). *p<0,05 – Teste “t” seguido do teste não

paramétrico de Mann Whitney Análise estatística não paramétrica de Mann Whitney.

NEBFC = número de entradas no braço fechado claro; TBFC = tempo de permanência no braço fechado claro.

Sessão treino Sessão teste

0

1

2

3

4

5


NE

BF

C

0

20

40

60

80

100

Controle 210 mg/kg;dia 420 mg/kg/dia

*TB

FC

(s)

95

TABELA 21: Parâmetros analisados no teste do labirinto em cruz modificado

realizado nas ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do

extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias, durante a sessão teste para

avaliação da memória e aprendizado. São apresentadas as médias e os erros

padrão (n = 10/grupo)

Parâmetros

LCEM Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia

NEBFC 3,4 ± 1,07 2,8 ± 0,55 2,6 ± 0,70

TBFC 47,0 ± 24,87 20,1 ± 8,41 22,6 ± 7,06

NEBFE 3,8 ± 1,02 2,5 ± 0,67 2,7 ± 0,67

TBFE 198,5 ± 25,35 168,6 ± 35,21 201,7 ± 32,28

p>0,05 – ANOVA.

NEBA = número de entradas nos braços abertos; NEBFC = número de

entradas no braço fechado claro; NEBFE = número de entradas no braço

fechado escuro; TBA = tempo de permanência, em segundos, nos braços

abertos; TBFC = tempo de permanência , em segundos, no braço fechado

claro; TBFE = tempo de permanência, em segundos, no braço fechado escuro.

96

TABELA 22 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de

cloridrato de cloridrato de femproporex de ratas fêmeas tratadas ou não

(controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30

dias. São apresentadas as médias, os erros padrão e os respectivos limites

mínimo e máximo de escores ou da soma de escores (0-90 e 0-180);

n=10/grupo

Tempo Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia F df

(min) (n=10) (n=10) (n=10)

0-90 21,4 ± 3,1 23,7 ± 1,9 16,5 ± 3,1

(14-44) (13-34) (9-36)

0-180 43,6 ± 5,5 43,6 ± 4,4 33,7 ± 8,2

(12-60) (17-72) (6-87)

10 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,2 0,8 ± 0,1

(0-1) (0-2) (0-1)

20 1,7 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,0 ± 0,1

(0-3) (1-2) (0-2)

30 2,8 ± 0,4 2,4 ± 0,3 1,1 ± 0,3** 6,90

(2-6) (1-5) (0-2)

40 2,6 ± 0,5 2,7 ± 0,3 1,5 ± 0,2* 3,42 27/2

(0-6) (1-5) (0-2)

50 2,6 ± 0,5 3,0 ± 0,4 2,0 ± 0,5

(0-6) (2-5) (0-6)

60 2,7 ± 0,4 3,2 ± 0,4 2,3 ± 0,5

(1-6) (2-6) (1-6)

70 2,6 ± 0,5 3,2 ± 0,3 2,7 ± 0,6

(0-6) (2-5) (1-6)

80 2,8 ± 0,4 3,1 ± 0,3 2,6 ± 0,6

(1-6) (2-6) 0-6)

90 2,6 ± 0,5 3,3 ± 0,4 2,5 ± 0,7

(1-6) (2-6) (0-6)

100 2,1 ± 0,4 3,7 ± 0,4* 2,7 ± 0,7 1,66 27/2

(0-3) (2-6) (0-6)

97

Tempo

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

F

df (min) (n=10) (n=10) (n=10)

110 2,4 ± 0,6 2,9 ± 0,5 2,6 ± 0,7

(0-6) (0-6) (0-6)

120 2,3 ± 0,6 3,0 ± 0,5 2,4 ± 0,7

(0-6) (0-6) (0-6)

130 2,7 ± 0,7 2,4 ± 0,2 1,9 ± 0,6

(0-6) (1-3) (0-6)

140 2,8 ± 0,6 2,8 ± 0,5 1,8 ± 0,6

(0-6) (0-5) (0-6)

150 3,1 ± 0,7 1,8 ± 0,4 1,8 ± 0,6

(0-6) (0-3) (0-6)

160 2,6 ± 0,6 1,6 ± 0,3 1,3 ± 0,7

(0-6) (0-3) (0-6)

170 1,8 ± 0,7 1,1 ± 0,5 1,4 ± 0,7

(0-6) (0-3) (0-6)

180 1,8 ± 0,7 1,0 ± 0,4 1,1 ± 0,6

(0-6) (0-5) (0-6)

*p<0,05; **p,0,01 –ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey

98

FIGURA 28 - Comportamento estereotipado induzido por 5,0 mg/kg de cloridrato de cloridrato de femproporex das ratas fêmeas

tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os

erros padrão (n = 10/grupo). *p<0,05; **p,0,01 ANOVA seguido do posthoc teste de Tukey.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

-1

0

1

2

3

4

5

6

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia*

***

tempo (min)

escore

s

99

TABELA 23 – Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol

de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com diferentes doses do extrato

etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias, os erros

padrão, além dos valores mínimo e máximo de cada momento da análise (n =

10/grupo)

Tempo Controle 210 mg/kg/dia 420 mg/kg/dia

(min) (n=10) (n=10) (n=10)

20 9,80 ± 4,96 1,20 ± 1,00 1,10 ± 0,55

(0-45) (0-10) (0-5)

40 42,30 ± 27,63 13,60 ± 8,74 82,50 ± 58,60

(0-281) (0-88) (0-602)

60 105,20 ± 68,08 160,00 ± 86,05 334,90 ± 119,49

(0-666) (0-787) (4-961)

80 211,20 ± 95,67 312,50 ± 117,26 317,10 ± 122,73

(0-964) (1-969) (14-1200)

100 371,40 ± 126,73 414,80 ± 137,93 378,79 ± 117,26

(4-1200) (14-1149) (10-1200)

120 459,00 ± 140,37 578,90 ± 152,02 519,50 ± 98,72

(15-1200) (17-1178) (21-1200)

140 484,00 ± 125,69 470,00 ± 115,08 623,10 ± 154,96

(133-1200) (23-1200) (130-1200)

160 585,10 ± 137,84 690,60 ± 157,72 672,90 ± 127,28

(207-1200) (18-1200) (202-1200)

180 698,80 ± 156,55 686,90 ± 158,69 612,40 ± 126,42

(82-1200) (16-1200) (173-1200)

p>0,05 – ANOVA.

100

FIGURA 29 - Catatonia (em segundos) induzida por 1,0 mg/kg de haloperidol de ratas fêmeas tratadas ou não (controle) com

diferentes doses do extrato etanólico de C. jamacaru por 30 dias. São apresentadas as médias e os erros padrão (n = 10/grupo).

p>0,05 – ANOVA.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Controle

210 mg/kg/dia

420 mg/kg/dia

tempo (min)

cata

tonia

(s)

101

6. DISCUSSÃO

As análises fitoquímicas realizadas por LC-MS/MS com os extratos etanólico e

aquoso dos cladódios de Cereus jamacaru detectaram a presença de diversos

princípios ativos, entre eles alguns alcalóides feniletilamínicos como a tiramina,

hordenina, N-metiltiramina, além do aminoácido tirosina. Um estudo anteriormente

realizado (DAVET et al., 2009) detectou, por HPLC-UV, a presença dos alcalóides

hordenina, tiramina e N-metiltiramina em um extrato etanólico bruto de cladódios de

C. jamacaru. São parcos os estudos de caracterização química dessa espécie

vegetal, se destacando apenas o acima citado. Nosso estudo, além de detectar os

alcalóides feniletilamínicos citados, também detectou uma série de outros compostos

químicos que até então não haviam sido elucidados em C. jamacaru. Assim, após

análise química dos dois extratos, foi observado que o extrato etanólico apresentou

uma série de compostos ativos, alguns de sabida ação irritante, como a

geranilacetona, óleo volátil presente em diversas espécies vegetais, além da

antraquinona, benzoquinona e hidroquinona, que estão ausentes no extrato aquoso

(Tabela 3). Esse fato contribuiu para o emprego do extrato etanólico nos testes in

vivo realizados no presente estudo (SOUĈEK; GUT; STOPKA, 2000; TOPPING et

al., 2007; KONDROVA; STOPKA; SOUSEK, 2007; MIZUNO et al., 2010).

Os alcalóides feniletilamínicos, uma vez no SNC, sabidamente atuam sobre as

sinapses nervosas dopaminérgicas, noradrenérgicas e até serotoninérgicas,

alterando importantes processos comportamentais, de cognição e de memória

(SLOVITER et al., 1980; SULZER et al., 2005; HILL; THOMAS, 2009). Os cactos de

um modo geral por apresentarem em sua composição alguns desses alcalóides,

provocam, uma vez ingeridos ou inalados a fumaça de sua combustão, alterações

comportamentais como estimulação e alucinação no ser humano. É o que faz a

mescalina presente no cacto Lonchocarpun williamsii (NICHOLS, 2004),

popularmente conhecido como peiote e comumente empregado como ritual religioso

por tribos de indígenas mexicanos. Os alcalóides feniletilamínicos são bastante

conhecidos pelos seus efeitos alucinógenos desencadeados pela afinidade dos

102

mesmos com os receptores serotoninérgicos, principalmente os 5-HT2C

(FANTEGROSSI; MURNANE; REISSIG, 2008).

A serotonina (5-HT) é uma monoamina neurotransmissora com propriedades

vasoativas e atividade importante na depressão e ansiedade (CASTRO-SIERRA;

LEON; RIVERA, 2005; NISHIKAWA et al., 2010). Na atualidade são reconhecidos

sete tipos de receptores serotoninérgicos, dos quais os tipos 1 e 2 são ainda

subdivididos: 5-HT1A; 5-HT1B; 5-HT1D; 5-HT2A; 5-HT2B; 5-HT2C. Todos eles, com

exceção do 5-HT2B, que se localiza no fundo gástrico, estão localizados

majoritariamente no SNC e desempenham efeitos diversos como inibição neuronal,

efeitos comportamentais, contração do músculo liso e agregação plaquetária

(RANG, 2003). Os cinco subtipos de receptores 5-HT1 são inibidores da adenil

ciclase e são encontrados nos núcleos da raphe, hipocampo, striatum, subiculum,

substância nigra e reservatório sanguíneo do crânio e córtex. Os receptores do tipo

2, são divididos em 3 subtipos e são ativadores da fosfolipase, são encontrados nas

plaquetas, córtex cerebral, músculo liso, fundo do estômago e plexo coróide

(NEWMAN-TANCREDI et al., 2002; SANDERS-BUSH; MAYER, 2005; CARLSSON

et al., 2009).

A tiramina, monoamina derivada da tirosina, encontrada no sistema nervoso

central de organismos que variam de nematodos à mamíferos, provoca liberação de

noradrenalina dos neurônios simpáticos e da adrenal, aumentando a pressão arterial

sanguinea, em particular após a ingestão de inibidores da MAO e comidas que

contém essa amina, como o queijo, chocolate e produtos fermentados (KITAHAMA

et al., 2005; BONETTA et al., 2008; PIRRI et al., 2009). Assim, a ingestão de

alimentos ricos em tiramina pode causar aumento dos níveis pressóricos, no entanto

em condições normais, o organismo, com o auxílio das enzimas monoamina

oxidases (MAOs), consegue prevenir esse efeito tóxico (BUNKOVA et al., 2010).

Essa monoamina pode ser encontrada em alimentos mal conservados através do

resultado de descarboxilação microbiana, podendo causar reações alérgicas

importantes, como dificuldade em respirar, coceira, prurido e vômito (NAILA et al.,

2010). A tiramina está presente em concentrações nanomolares no cérebro dos

mamíferos e concentrações micromolares dessa catecolamina podem ser

encontradas na circulação (BERRY, 2004; ZUCCHI et al., 2006; FEHLER et al.,

2010). A função da tiramina é ser neurotransmissor e neuromodulador no sistema

103

nervoso central dos mamíferos. Seus efeitos periféricos são geralmente atribuídos à

sua ação em promover o efluxo de catecolaminas dos neurônios simpáticos e da

medula adrenal (ZHU; MUNHALL; JOHNSON, 2007; KHWANCHUEA; MULVANY;

JANSAKUL, 2008).

É sabido que a hordenina exerce leve ação estimulatória nos sistemas

respirátório e cardiovascular porém só evidente quando utilizada em elevadas doses

(KANIA; MAJCHER; KOWALSKA, 2000). Além disso, sabe-se que esse alcalóide

atua como neuromodulador por estimular a ação da noradrenalina, enquanto

neurotransmissor. Como consequência de sua ação, promove maior mobilização de

lipídeos resultando em menor ganho de peso corporal. Essa ação, já bastante

conhecida, explica a presença da hordenina em suplementos alimentares

empregados por praticantes de atividade física, com o intuito de evitar ganho de

peso corporal (HAAZ et al., 2006; NELSON et al., 2007). Esse alcalóide pode ser

encontrado em várias plantas e confere às mesmas proteção contra diversos tipos

de organismos que possam causar algum tipo de prejuízo (HOULT et al., 1994).

Pesquisas têm demonstrado que a hordenina não é tóxica para ruminantes e não

provoca efeitos psicomotores e comportamentais em camundongos (GOELZ et al.,

1980; LIN, 1991).

Como já comentado anteriormente, são raros os estudos fitoquímicos

realizados com a espécie C. jamacaru, destacando-se apenas um (DAVET et al.,

2009). Na literatura científica é apenas encontrado um trabalho publicado de um

estudo in vivo utilizando o extrato metanólico de C. jamacaru em ratas prenhes

(MESSIAS et al., 2010), no entanto, até o presente momento não foram realizados

estudos mais abrangentes em animais sobre a ação farmacológica ou potencial

tóxico dos cladódios de C. jamacaru, empregados frequentemente na medicina

popular, principalmente na região Nordeste do Brasil. Considerando esse contexto, o

presente estudo oferece informações importantes sobre a toxicidade de um extrato

etanólico de cladódios de C. jamacaru em ratos.

No presente estudo, realizado com ratos Wistar adultos de ambos os sexos,

foram observadas alterações importantes no consumo de ração, ingestão hídrica e

ganho de peso nos grupos de animais tratados com as diferentes doses do extrato

etanólico de C. Jamacaru em comparação aos grupos controle. Os ratos machos

experimentais, tratados por 30 dias com 210 ou 420 mg/kg/dia do extrato etanólico,

104

apresentaram reduzido consumo de ração e elevada ingestão hídrica quando

comparados com o grupo controle. Certamente o consumo reduzido de ração

favoreceu o reduzido ganho de peso corporal observado nos ratos machos tratados.

Não é possível atribuir esses dois aspectos, menor peso e ganho de peso, como

efeitos do extrato, entretanto possibilita suspeitar que o extrato seja capaz de inibir o

apetite. As fêmeas experimentais, assim como os machos, apresentaram reduzidos

consumo de ração e de água, colaborando para o reduzido ganho de peso corporal

observado nas fêmeas experimentais. É importante salientar que o menor consumo

de ração e reduzido ganho de peso corporal observados nos machos e nas fêmeas

contribuem na suposição desse extrato etanólico, obtido dos cladódios pode exercer

ação inibidora do apetite.

A ação inibidora do apetite observada ao longo do tratamento com o extrato de

C. jamacaru pode ser explicada pela presença da tiramina, hordenina e n-

metiltiramina (AVULA; UPPARAPALLI; KHAN, 2005; PELLATI; BENVANUTI, 2007).

A n-metiltiramina através de hidroxilação dá origem a sinefrina, amina fenólica que

em estudos com animais e testes clínicos em humanos mostrou ser capaz de

auxiliar na redução de peso (HAAZ et al., 2006; BARTLEY; BREKSA; ISHIDA, 2010).

A hordenina, como já descrito acima, promove maior mobilização de lipídeos

resultando em menor ganho de peso corporal (HAAZ et al., 2006). A tiramina

ocasiona uma ação antilipolítica, estimulando a captação de glicose e inibindo a

lipólise (MARTI et al., 1998; MEISSONNIER et al., 2003; CARPENE et al., 2008),

diminuindo o peso corporal, como foi observado num estudo com hamsters

siberianos expostos a curtos fotoperíodos (ATGIE et al., 2009). Sabe-se que os

alcalóides feniletilamínicos uma vez absorvidos sofrem biotransformação a produtos

mais ou menos tóxicos dependendo da estrutura original, por enzimas inespecíficas

do complexo P450 e por monoaminooxidases (MAOs), no intestino delgado, fígado e

SNC (HLAVICA, 2006).

Além do acompanhamento do peso corporal, ingestão de ração e água e

cálculo do ganho de peso, para uma avaliação mais completa da toxicidade foram

realizados também a mensuração de pesos de órgãos diversos (fígado, rim, adrenal,

baço, pâncreas e coração), lâminas histológicas e mensuração de parâmetros

bioquímicos, para avaliação da toxicidade hepática (ALT e AST) e renal (ureia e

105

creatinina). O extrato etanólico nas doses empregadas não foi capaz de provocar

diferenças nas razões peso órgão / peso corporal calculadas (Tabelas 12 e 13),

exceto na adrenal das ratas fêmeas tratadas com a maior dose do extrato etanólico.

A glândula adrenal fica situada sobre o pólo superior de cada rim e é formada pela

medula e córtex. Dentre os hormônios secretados por essa glândula temos a

aldosterona e cortisol, além das catecolaminas adrenalina e noradrenalina. A

glândula adrenal é reportada como o órgão endócrino mais associado com efeitos

tóxicos (GUYTON, 1988; ROSOL et al., 2001). A noradrenalina modula a atividade

do hormônio liberador de gonadotrofina (GNRH), a liberação do hormônio

luteinizante (LH) e secreção de estrogênio. Podemos sugerir que nas ratas fêmeas

tratadas com a maior dose do extrato etanólico de C. Jamacaru houve um possivel

aumento da síntese de noradrenalina, em decorrência da hipertrofia adrenal

encontrada, que pode ter levado ao maior aumento da produção de estrogênio.

Maiores níveis circulantes de estrogênio podem ter conferido às fêmeas proteção

contra a ação dos alcaloides feniletilamínicos presentes no extrato (PAU; SPIESA,

1986; SINGH; DYKENS; SIMPKINS, 2006; HERBISON, 2008). Não foram

observadas alterações nos níveis séricos das transaminases hepáticas (razão

AST/ALT), ureia e creatinina (Tabelas 10 e 11) e não foram encontradas também

alterações morfológicas e/ou degeneração dos tecidos dos diversos órgãos

analisados histopatologicamente (Figuras 19, 20 e 21). Considerando os dados

obtidos somados aos anteriores, o extrato etanólico não parece ser capaz de

provocar toxicidade subcrônica em ratos tratados por 30 dias com as doses de 210 e

420 mg/kg/dia. Entretanto, o extrato pode talvez inibir discretamente o apetite, já

que os animais experimentais apresentaram reduzido consumo de ração com

consequente perda de peso corporal.

A atividade geral, também chamada de atividade motora ou espontânea,

mensura a capacidade do animal de se movimentar numa área desconhecida

independente de estímulos ambientais. No experimento realizado no campo aberto,

fatores ambientais (aparelho, intensidade de luz) e fatores biológicos (idade, sexo,

horário), foram padronizados para uma correta determinação da atividade geral,

conforme sugerido por Reiter e Mc-Phail (1982). Em nosso estudo, os machos

experimentais tratados com ambas as doses do extrato etanólico apresentaram

menor locomoção e menor frequência de levantar, com a imobilidade aumentada. De

106

maneira semelhante, as fêmeas experimentais também apresentaram maior tempo

de imobilidade. Entretanto, os parâmetros de frequência de locomoção e levantar,

apesar de reduzidos, não foram estatisticamente significantes. A defecação é um

parâmetro empregado para avaliar a emocionalidade do animal, todavia pouco

explica alterações na atividade geral. Em nosso estudo mensuramos o número de

bolos fecais com o objetivo de auxiliar na investigação do possível efeito ansiogênico

decorrente da presença dos alcalóide feniletilamínicos no extrato etanólico

(KAMEYAMAA; SUZUKIA; NABESHIMAA, 1980; BORTOLATO et al., 2009). Apenas

as fêmeas experimentais tratadas com a dose de 210 mg/kg/dia apresentaram maior

número de bolos fecais após os cinco minutos de observação no campo aberto, em

relação ao grupo controle.

As alterações na atividade geral dos animais sugerem que o extrato etanólico

de C. jamacaru promova distúrbios no sistema nervoso central, como por exemplo o

sistema reticular ascendente, que inclui as regiões do bulbo, mesencéfalo e tálamo,

responsáveis pela atividade motora (BERNARDI; PALERMO NETO, 1980). Além

disso a possível ação ansiogênica que o extrato possa exercer, associada à

deficiência motora relatada anteriormente, podem explicar os resultados observados

no campo aberto. No entanto, a deficiência da atividade motora seria melhor

estabelecida com a aplicação de testes mais específicos para a avaliação da

motricidade, como por exemplo o teste de motricidade sobre grade ou o teste de

atividade rotacional induzida por drogas dopaminérgicas (SILVESTRIN et al., 2008;

CANINI et al., 2009; ABRAHAO; QUADROS; SOUZA-FORMIGONI, 2009).

Vale a pena ressaltar que neurônios serotoninérgicos facilitam a ativação

simpática que acompanha e inclusive antecipa a atividade motora, ou seja, a

serotonina modula a atividade do sistema neuromotor (VEASEY et al., 1995). No

mesmo sentido, o sistema dopaminérgico mesolímbico, particularmente o nucleus

accumbens, parece estar também relacionado com a modulação da atividade motora

(ZHU; STADLIN, 2000; BARIK; BEAUREPAIRE, 2005; DEL ARCO; SEGOVIA;

MORA, 2008). Mais da metade do teor de catecolaminas do SNC é composta pela

dopamina, e volumes extremamente maiores são encontrados nos gânglios basais,

mais especificamente no núcleo caudado. Além disso, pode ser encontrada no

tubérculo olfatório, núcleo central da amígdala e no nucleus accumbens (BLOOM,

107

2005). A dopamina é um neurotransmissor muito importante na regulação de

funções primordiais para a existência, como cognição, emoção e controle da

atividade motora, como falado anteriormente. Os receptores dopaminérgicos são

divididos de acordo com a ação farmacológica em duas famílias: “D1-like”,

representados por D1 e D5, e “D2-like”, representados por D2, D3 e D4

(KUZHIKANDATHIL; YU; OXFORD, 1998; MISSALE et al., 1998; RAMIREZ et al.,

2009). A família D1 está ligada à estimulação da adenilato ciclase, já a família D2

está associada à inibição dessa enzima. Os receptores da dopamina exercem

diversos papéis funcionais como reatividade e humor (D1, D2 e D4), emoção e

comportamento estereotipado (D1, D2, D3, D5), controle motor (D1, D2, D3, D4, D5) e

secreção de prolactina (D2, D3), além de mediar vários efeitos na periferia (D1), tal

qual vasodilatação renal e aumento da contratilidade do miocárdio (RANG et al.,

2003). Assim podemos especular que o tratamento com o extrato etanólico de C.

jamacaru possa interferir no bom funcionamento do sistema serotoninérgico e

dopaminérgico-mesolímbico, já que alguns parâmetros de atividade motora do

campo aberto mostraram-se alterados, tanto nos machos quanto nas fêmeas.

O labirinto em cruz elevado, proposto inicialmente como modelo para avaliar a

ação de drogas ansiolíticas em ratos (FILE; HYDE, 1978; HOGG, 1996) foi baseado

na aversão natural de roedores a espaços abertos e altos (VAN GAALEN;

STECKLER, 2000). Para o nosso estudo esse aparato sofreu alteração com a

adição de uma lâmpada de 100W, como fator aversivo, num dos braços fechados e

foi empregado com o intuito de analisar se o extrato etanólico, administrado por 30

dias nas doses de 210 e 420 mg/kg/dia, seria capaz de promover alterações na

memória e aprendizado de ratos. É sabido que ratos, por serem presas fáceis e

terem hábitos noturnos, tendem a permanecer nos braços fechados do labirinto em

cruz elevado convencional e a avaliação do aprendizado e memória aconteceu

através da observação de menor número de entradas e menor tempo de

permanência no braço fechado claro na sessão teste quando comparado com a

sessão treino. (BERTOGLIO; JOCA. GUIMARAES, 2006; JÜRGENSON; AONURM-

HELM; ZHARKOVSKY, 2010). Assim, na sessão treino, a luz era acesa sempre

quando o animal entrasse no braço fechado modificado e somente apagada quando

o rato saísse desse ambiente. No dia seguinte, na sessão teste, foi avaliado o

número de entradas e o tempo de permanência dos animais no braço fechado

108

iluminado. Por fim, análises estatísticas foram realizadas (teste “t”) comparando os

dados obtidos entre as sessões treino e teste. Os ratos machos experimentais

de nosso estudo apresentaram menor número de entradas no braço fechado claro

na sessão teste. Entretanto, o tempo de permanência dos ratos experimentais no

braço fechado claro, mesmo menor, não foi estatisticamente significante. As ratas

fêmeas experimentais permaneceram menor tempo no braço fechado claro do

labirinto em cruz elevado modificado (LCEM) na sessão teste quando comparado

com o tempo de permanência das mesmas na sessão treino. No entanto, esse

parâmetro foi significante estatisticamente apenas para o grupo de fêmeas tratadas

com a menor dose do extrato (210 mg/kg/dia). Não foram reveladas alterações no

número de entradas no braço fechado claro em ambas as sessões para essas ratas.

Para ambos os gêneros não foram reveladas alterações nos dois parâmetros:

número de entradas e tempo de permanência no braço fechado claro, ao mesmo

tempo. Assim, não podemos sugerir que o extrato etanólico dos cladódios, nas

doses empregadas, exerça ação na memória ou aprendizado de ratos.

Para investigar o efeito do extrato no estudo de aprendizado e memória no

labirinto em cruz elevado modificado, foi realizada uma análise estatística (ANOVA)

comparando os diversos parâmetros analisados e obtidos dos animais experimentais

com os parâmetros obtidos dos animais do grupo controle na sessão teste.

Nenhuma alteração foi observada, tanto para machos, como para fêmeas (Tabelas

15 e 20). Ao resultados obtidos sugerem que o extrato etanólico não foi capaz de

alterar a capacidade de memória e aprendizado dos animais tratados.

A análise fitoquímica realizada por LC-MSMS detectou a presença de alguns

alcalóides feniletilamínicos no extrato etanólico administrado nos ratos (Tabela 3).

Como comentado anteriormente, é sabido que alguns alcalóides feniletilamínicos,

uma vez no SNC são capazes de alterar o sistema de neurotransmissão central.

Assim, foram mensurados nesse estudo, o comportamento estereotipado e a

catatonia dos ratos, empregando respectivamente o agonista dopaminérgico

femproporex e o antagonista dopaminérgico haloperidol, para desafiar o sistema

dopaminérgico, tornando possível verificar a presença de alterações

comportamentais moduladas pelos alcalóides detectados no extrato.

109

O comportamento estereotipado (CE) consiste em movimentos repetitivos, sem

variações e aparentemente sem objetivo. É um comportamento relacionado com a

ativação progressiva de receptores dopaminérgicos da via nigroestriatal

(ELLENBROEK; COOLS, 1993). De fato este comportamento pode ser obtido pela

administração de um agonista dopaminérgico (ANDÉN; BÉPARD, 1971), como o

femproporex. Em 1997, num estudo para avaliar o papel da dopamina no

comportamento de ratos, Yeghiayan et al., observou que a infusão de tiramina

dentro do striatum ventrolateral provocou exacerbação da estereotipia orofacial nos

animais. Em nosso estudo, o extrato etanólico nas duas doses empregadas não

mostrou ser capaz de provocar alterações importantes no comportamento

estereotipado dos ratos machos (Tabela 17) e fêmeas (Tabela 22).

A catatonia ou catalepsia, caracterizada tanto pela imobilidade posicional,

como pela dificuldade de iniciar movimentos voluntários, pode ser obtida pela

administração de bloqueadores de receptores dopaminérgicos, indicando a

participação de sistemas dopaminérgicos centrais nas manifestações motoras

(FIELD; WHISHAW; PELLIS, 2000). O haloperidol bloqueia principalmente o sistema

dopaminérgico nigroestriatal, provocando desta maneira, a catatonia (BAZYAN et al.,

2000; PIRES; BONIKOVSKI; FUTURO-NETO, 2005). A catatonia induzida pelo

haloperidol não se mostrou alterada nas fêmeas experimentais tratadas com ambas

as doses (Figura 29). Entretanto, mostrou estar reduzida nos machos experimentais

tratados com a menor dose do extrato (Figura 25). O fato da ação do haloperidol ter

ocasionado diferentes ações em machos e fêmeas pode ser explicada pela ação

neuroprotetora do estrogênio no sistema nigroestriatal dopaminérgico, além das

diferenças nas estratégias motoras, particulares de cada gênero (FIELD; WISHAW;

PELLIS, 2000; KELADA et al., 2002).

A catatonia reduzida, observada nos machos tratados com a dose de 210

mg/kg/dia, possibilita sugerir que o sistema dopaminérgico desses animais possa ter

sofrido alguma alteração, em nível de sensibilidade de receptores pré- e/ou pós-

sinápticos, à antagonistas dopaminérgicos, resultando em tal efeito. Assim,

quantidades elevadas do antagonista seriam necessários para provocar a catatonia.

É possível que possa ter ocorrido leve destruição das sinapses nervosas

dopaminérgicas nos machos tratados com a maior dose e, esse fato associado á

110

uma via alternativa encontrada pela plasticidade neuronal, poderia explicar a

ausência de alterações nesse grupo de animais. Ou ainda, a dose menor pode ser a

dose farmacologicamente eficaz enquanto que a maior é tóxica e degenerativa.

Outra explicação seria a hipótese de interação antagonista funcional ou

farmacológica entre os alcalóides presentes no extrato com o haloperidol. Essa

interação, considerando a hipótese anterior, só ocorreria diante de uma dose

farmacologicamente ativa e não degenerativa do extrato etanólico. É sabido que a

ação e quantidade das enzimas monoaminoxidases (MAOs) variam quanto ao

gênero em mamíferos (KATO; YAMAZOE, 2002), o que poderia explicar o motivo

pelo qual ocorreram diferenças na catatonia entre ratos machos e fêmeas.

Por fim nosso estudo constatou alterações comportamentais importantes nos

animais tratados com o extrato etanólico de C. jamacaru, além de algumas

diferenças comportamentais entre machos e fêmeas. Considerando que essa planta

é empregada na medicina popular para o tratamento de males diversos e que são

escassos os estudos realizados com essa espécie até o momento, é provável que o

presente trabalho possa contribuir para o uso racional e até mesmo para o

desenvolvimento de um fármaco em potencial.

111

7. CONCLUSÃO

Foram detectados (LCMSMS), nos extratos etanólico e aquoso dos cladódios

de Cereus jamacaru, os alcalóides: tiramina, n-metil-tiramina e hordenina, além do

aminoácido tirosina;

Foram detectados (LCMSMS), apenas no extrato etanólico, os compostos

irritantes antraquinona, hidroquinona, fenol e geranilacetona, o que contribuiu para a

escolha do extrato etanólico para o estudo de toxicidade com os ratos;

Nosso estudo sugere que a administração por 30 dias do extrato etanólico de

C. jamacaru nas doses de 210 e 420 mg/kg/dia, não provoca toxicidade em ratos, já

que não foram observadas alterações em parâmetros bioquímicos analisados no

soro e no estudo histopatológico. As alterações observadas no ganho de peso foram

conseqüência do reduzido consumo de ração e água dos animais experimentais e

não do extrato etanólico. Entretanto, pode ser que o extrato atue inibindo o apetite;

O extrato etanólico foi capaz de alterar o comportamento geral dos animais, já

que no campo aberto, os parâmetros freqüências de locomoção e levantar e

imobilidade foram alterados em machos e fêmeas;

Não foram observadas diferenças no comportamento estereotipado induzido

pelo cloridrato de femproporex nos ratos machos e fêmeas experimentais quando

comparados aos animais do grupo controle;

Foram observadas alterações comportamentais importantes nos animais

tratados com o extrato etanólico de C. jamacaru, principalmente nos machos

tratados com a dose de 210 mg/kg/dia submetidos ao teste da catatonia induzida por

haloperidol;

Não foi observada alteração no aprendizado e memória nos animais

experimentais no labirinto em cruz elevado nas sessões treino e teste, e ao

comparar os diversos tratamentos. Propõe-se tendência de maior aprendizado e

memória pelos machos e fêmeas experimentais em relação aos respectivos controle

no teste do labirinto em cruz elevado modificado.

112

8. REFERÊNCIAS

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9. APÊNDICES

De: Editorial Office Arch Tox <[email protected]> Assunto: ATOX: Submission Confirmation for Phytochemical investigation and toxic effects of an ethanol and an aqueous extract from Cereus jamacaru Para: "Aline Schwarz" <[email protected]> Data: Segunda-feira, 14 de Março de 2011, 15:55 Dear Dr Schwarz, Your submission entitled "Phytochemical investigation and toxic effects of an ethanol and an aqueous extract from Cereus jamacaru" has been received by Archives of Toxicology You will be able to check on the progress of your paper by logging on to Editorial Manager as an author. The URL is http://atox.edmgr.com/. Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned. Thank you for submitting your work to our journal. Kind regards, Beate Graf Editorial Office Archives of Toxicology

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IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCÍPIOS ATIVOS PRESENTES NO … · pela constante contribuição no tratamento e manutenção do bem estar dos animais. À “equipe do Mandacaru” - Cássio,